JPH1132779A

JPH1132779A - 蛋白質の遺伝子クローニング法

Info

Publication number: JPH1132779A
Application number: JP9214074A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Ichihara; 慶和市原; Akira Awaya; 昭粟屋
Original assignee: FUNAKOSHI KK; Fujita Health University
Current assignee: FUNAKOSHI KK; Fujita Health University
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1999-02-09

Abstract

(57)【要約】【課題】膜蛋白質および分泌蛋白質のcDNAを効率よく
クローニングする新しい方法の提供。【解決手段】膜蛋白質の膜結合ドメインを除いた発現
ベクター、もしくは分泌蛋白の発現ベクターのC-末端側
にcDNAを挿入できるようにマルチクローニングサイト(M
CS)を導入した真核細胞発現ベクターを用いる方法であ
る。当該遺伝子のMCSに膜結合ドメインを含むcDNAが挿
入されると、分泌型に改変された膜蛋白質、もしくは分
泌蛋白質はcDNAにコードされた膜蛋白とキメラ膜蛋白質
として発現し、真核細胞の細胞膜上にトラップされ、そ
の細胞集団を単離し、プラスミドを抽出し、膜蛋白質お
よび分泌蛋白質のcDNAを単離できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はｃＤＮＡの単離法に
関する。更に詳細には新規な膜結合性蛋白もしくは分泌
蛋白のｃＤＮＡを選択的に単離するための新しい方法及
びこの方法に使用する新規なベクター並びにこれらの手
法・ツールを用いることにより得られた新規な膜結合性
蛋白もしくは分泌蛋白に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞膜表面にはイオン、細胞増殖因子、
臭いなどの外界のシグナルを受け取るための各種レセプ
ター分子、細胞相互の認識と選別に必要な細胞接着分子
をはじめ、多くの膜結合性蛋白が存在している。これら
の分子のあるものはレセプター型チロシンキナーゼのよ
うに外界の情報を受け取り、速やかに細胞内、とりわけ
核内のＤＮＡに伝え、適切な遺伝子の発現を誘導する情
報伝達カスケードの受信アンテナとして働く。またある
分子はそれぞれの細胞に特異的に発現し、他の細胞に認
識されるためのマーカーとしての役割を担っている。こ
れらの膜蛋白質には従来報告されているもの以外に、多
数の未知の分子が存在している。特に脳神経系の発達過
程においては、レセプター分子のみならず、リガンド分
子も膜結合型であるような例が次々と発見されている。
このような神経系における細胞間接着を介したシグナル
伝達は、神経細胞の分化や成長維持、突起伸展のガイダ
ンス等に重要であるとされている。これらの未だ未知で
ある神経系の発達や分化のしくみを明らかにするため、
あるいは広く心臓血管系、呼吸器系、内分泌系、造血
系、免疫リンパ系、消化器系など各組織細胞の発生、増
殖、分化、発達、老化のしくみを明らかにするために、
ＤＮＡプローブが存在しない未知の膜蛋白質のｃＤＮＡ
を網羅的にクローニングする方法が求められている。

【０００３】従来のｃＤＮＡ単離法はＤＮＡプローブを
用いて相同配列を有する遺伝子をコロニーあるいはプラ
ークハイブリダイゼーションで単離したり、特異抗体を
用いて大腸菌で発現している蛋白を検知する事による方
法がほとんどであった。また近年ゲノムプロジェクトに
代表されるように、ヒト、マウス、ショウジョウバエな
どの代表的な生物種に関して、各臓器、各発生段階にお
けるｃＤＮＡライブラリーを作製して、その全ｃＤＮＡ
について３’側の一部の塩基配列を解析するExpression
Sequence Tag(EST) という方法が用いられてきてい
る。さらに膜蛋白質のｃＤＮＡを特異的に単離する方法
はあるが、個々の蛋白に対する特異抗体が必要なこと
と、それを用いてポリゾームを単離した後、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作製するという複雑な操作が必要である。

【０００４】これに対し近年、分泌型蛋白質、および膜
結合型蛋白質の５’領域のシグナルペプチドを含むｃＤ
ＮＡを単離するためのベクターが報告された(Science,
261,600、1993)。この方法はＮ−末端側のシグナルペプ
チド部分を欠失したＩＬ２レセプターアルファを有する
ベクターでｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＣＯ
Ｓ細胞にトランスフェクトし、分泌蛋白、およびI型膜
蛋白質のシグナルペプチド部分を含む領域をコードする
ｃＤＮＡが融合蛋白質として発現したＣＯＳ細胞はその
細胞膜上にＩＬ２レセプターアルファを表出するので、
分泌型およびI型膜蛋白のｃＤＮＡの一部を単離するこ
とができるというものである。この方法によるとシグナ
ルペプチドを含む短いｃＤＮＡであれば単離可能である
が、膜結合ドメインを有したｃＤＮＡの場合はＩＬ２レ
セプター部分が細胞質側になり、ＩＬ２レセプターの特
異抗体で検出できない。またシグナルペプチドを持たな
いII型膜蛋白質のような遺伝子の単離は不可能である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は未だ未知である脳神経系、心臓血管系、、呼吸器系、
内分泌系、造血系、免疫リンパ系、消化器系等の発達や
分化のしくみを明らかにするため、ＤＮＡプローブが存
在しない未知の膜蛋白質のｃＤＮＡを網羅的にクローニ
ングするための新しい方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】膜蛋白質の多くは、細胞
膜外機能ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、さらに細胞
内ドメインからなる。膜貫通ドメインに共通の特徴は、
約２０ー３０残基の主に疎水性アミノ酸からなるドメイ
ンと、その両側がチャージを持ったアミノ酸、２残基ほ
どによって挟まれていることである。そこで、分泌蛋白
質をマーカーとして、そのＣ−末端側に膜タンパクのｃ
ＤＮＡをつないでキメラ蛋白として培養細胞で発現させ
ると、分泌蛋白部分を細胞膜表面にトラップすることが
出来ると考えた。しかる後に当該分泌蛋白に特異的な抗
体を用いて、マーカーとなる分泌蛋白を膜上に表出して
いる細胞を集め、プラスミドを回収する事により、目的
とする膜結合型もしくはシグナルペプチドをコードする
ｃＤＮＡを単離できる。当該分泌蛋白ｃＤＮＡの代わり
に、膜ドメインをコードする塩基配列部分から３’側を
欠失した可溶化膜蛋白ｃＤＮＡも用いることができる。
この部分に代わりに膜貫通ドメインを含まないｃＤＮＡ
が挿入されたとしても、マーカーとなる蛋白は分泌型と
なり、細胞膜上にトラップされないので膜結合ドメイン
を有するｃＤＮＡと区別することができる。

【０００７】本発明者等は上記の考えにもとずき、膜タ
ンパクのｃＤＮＡを網羅的にクローニングするための方
法を考案し、そのためのベクター群、および特異的なプ
ライマー群を作出することにより本発明を完成した。

【０００８】即ち、本発明は膜結合蛋白質の遺伝子ある
いはcDNAをクローニングする方法において、既知の分泌
蛋白質ｃＤＮＡの３’側、もしくは膜結合型蛋白質のす
べての膜貫通部分からＣ−末端側を除いたｃＤＮＡの
３’側にマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を導入し
たベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、し
かるのちＣＯＳ細胞等のほ乳類培養細胞、酵母、枯草
菌、昆虫細胞等の真核細胞にトランスフェクションし
て、各生物種のそれぞれにふさわしいプロモーターによ
り融合蛋白として発現させた上で、細胞膜上に融合膜蛋
白として発現した細胞集団を、Ｎ−末端側の蛋白に対す
る特異抗体を用いて濃縮、単離し、プラスミドを回収
し、得られたプラスミドを大腸菌にトランスフェクトす
ることによりｃＤＮＡのクローニングを達成することを
特徴とする膜結合蛋白質および分泌蛋白質の遺伝子クロ
ーニング方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は特殊な真核細胞発現ベク
ターを利用することにより可能となる。本ベクターはpC
I-neoを改変して作製されている。以下にその詳細につ
いて記述する。pCI-neoはサイトメガロウイルスのエン
ハンサー/プロモーター, intron, Multi cloning site
(MCS), SV40 late poly(A) site, f1 ori, Neo, Amp,
E.coli ori の各部分からなる。

【００１０】まずpCI-neoをBamHIで消化してしかる後、
T4DNA合成酵素、T4DNAリガーゼ処理をしてBamHIサイト
をつぶす(pCIneodBam)。同様の方法でBstXIサイトもつ
ぶす(pCIneodBamdBst)。次いで、pCIdBamdBstの一本鎖D
NAをヘルパーファージKO7とE.coli MV1184を用いて単離
する。これに燐酸化した74merの一本鎖合成DNA (pCIBNX74): （配列番号１） TCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCTCGAGGCTAGCGGATCC
AGTACTCTAGCCTTAAGAGCTGTA をアニールさせ、E.coli DNAリガーゼ、T4 DNA合成酵素
で２本鎖DNAにした後、MV1184に導入してクローンを単
離する。この操作により、T7からT3にいたる領域を欠失
させ、かわりにBamHI,NheI,XhoIサイトに置き換える(pC
IneoBNX)。本ベクターのBamHI, NheIサイトCMVプロモー
ターに対して正方向にマーカーとなる分泌蛋白もしくは
分泌型に改変した膜蛋白のcDNAを挿入する（図１）。

【００１１】一方、マーカー蛋白としてはマウスIL2レ
セプターアルファcDNAを用いる。ただし、本発明におい
ては何らIL2レセプターに限定されるものではく、分泌
型蛋白もしくは膜結合型蛋白を分泌型に改変してあるも
のならどのようなものでも差し支えない。

【００１２】まずマウスIL2レセプターアルファcDNAを2
種類のプライマー(MIL2RAdBX11: （配列番号２）GGGAGA
TCTGCCACCATGGAGCCACGCTTGCTGATGTTGG; MIL2RA3PBSSNH
E:（配列番号３） GGGCTAGCGCGCTTGTGAGCACAAATGTCTCCG
TCA)を用いてPCRで増殖する。このことによりN-末端側
のBstXIサイトをつぶしBglIIサイトを導入、C-末端側に
BssHII-NheIサイトを導入できる。またIL2レセプターア
ルファ本来の膜貫通ドメインは欠失させることができ
る。IL2レセプターアルファとして残っている領域はN-
末端の開始コドンのメチオニンから211残基目のトレオ
ニンまでである。得られたDNAをNheI,BglIIで消化し、
一本鎖DNAが得られるpUC119の改変ベクターのBglII/Nhe
Iサイトにクローニングする。次いで一本鎖DNAを上記の
方法で単離し、変異導入用プライマー(MIL2RAdBX2:（配
列番号４） GGAATCTTCATGTTTCCAAGGAGGAGGCTCCCTGC)で
BstXIサイトをつぶす。

【００１３】次いで、本改変IL2レセプターアルファcDN
AのNheIサイトにトリプレットの終始コドン 5'Ter: pCTAGATAACTGAG/3'Ter: pCTAGCTCAGTTAT を挿入する。このときBssHII側のNheIサイトがつぶれた
クローンを選択する。次いでBssHIIサイトにT3プロモー
ター配列,MCS,T7プロモーター配列を導入するために、
リン酸化後、アニールした合成DNA T3BXST7（配列番号５）: CGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGG
GATCCTCTAGAGTCGACCCTATAGTGAGTCGTATTACG T7SXBT3（配列番号６）: CGCGCGTAATACGACTCACTATAGGG
TCGACTCTAGAGGATCCCCCTTTAGTGAGGGTTAATTG をライゲーションした。最後にできた分泌型IL2レセプ
ターアルファcDNAをBglII/NheIで消化、断片を上記で作
製したpCIneoBNXのBamHI/NheIサイトに挿入する。図１
は以上に説明したpCIneomIL2R alpha M-BXES, pCIneomI
L2R alpha M-SEXBの作製方法を示したものであり、図２
は作成されたベクターの塩基配列である。

【００１４】cDNAライブラリー作製はcDNAがCMVプロモ
ーターにたいしてsense方向に挿入されるようにストラ
タジーンのcDNA作製キットを用いたが、本来どのような
作り方でも良い。ただし3'-側のpoly(A)配列は逆方向に
挿入されるとpoly(T)すなわちポリフェニルアラニンと
なり、疎水性ドメインとなって膜上にトラップされるよ
うになる。このような人工産物を作らないようにプライ
マーを工夫する必要がある。本発明においては一本鎖cD
NAを作製するプライマーに以下のような逆方向の終始コ
ドンを導入し、反対向きに挿入されたcDNAクローンはす
ぐにターミネーションにあたり、融合蛋白質を作らない
ように工夫した。

【００１５】(1)Name: (gA)₁₀XBNSTer(T)₁₈VN74（配列
番号７） 5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGGATCCGCTAGCGTCGACTGACT
AGATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTVN mRNAのpoly(A)から５’側にのばすためのプライマー
で、mRNAの比較的３’側に膜結合ドメインが存在する場
合及びGPI-アンカー型のcDNAの単離に向いている。 (2)Name: (gA)₁₀XBNSTerNNNNNN60（配列番号８） 5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGGATCCGCTAGCGTCGACTGACT
AGATAANNNNNN 標準的なcDNAライブラリー作製に用いるが、mRNAの比較
的上流に膜結合ドメインがある膜蛋白質のcDNA、分泌型
蛋白質のシグナルペプチド領域を含むcDNAの単離に向い
ている。 (3)Name: (gA)₁₀XBNSTerAATAAA60（配列番号９） 5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGGATCCGCTAGCGTCGACTGACT
AGATAATTTATT poly(A)付加シグナルの6merをプライマーに利用するも
のである。長いpoly(A)配列の合成を回避できるので使
用するメリットがある。 (4)Name: (gA)₁₀XBNSTereTNNNNNN67（配列番号１０） 5'GAGAGAGAGAGAGAGAGAGACTCGAGGATCCGCTAGCGTCGACTGACT
AGTTAATCAGCTANNNNNN (2)で用いるランダム6merプライマーには正方向の終始
コドンははいっていない。これを加えて両方向に終始コ
ドンがはいったプライマーであり、主にできるだけC-末
端に余分なペプチドがつかないようにする目的に用い
る。

【００１６】ここにあげたプライマーの配列は一本鎖cD
NA作製時に使うことを主な目的にデザインされている
が、最大の特徴は、本来cDNAの下流側（３’側）になる
べき上記のプライマー側が逆方向に挿入された場合はす
ぐに終始コドンにあたるように工夫してある点である。
生物学的に意味のあるcDNAを単離するためには本発明の
技術を用いることが必要である。上記のプライマー以外
に、それぞれの遺伝子ファミリーに共通の塩基配列もし
くはアミノ酸配列から予測される塩基配列をプライマー
としてcDNAライブラリーを作製することにより、種々の
生物種の各臓器、各発生段階に特異的に発現するような
遺伝子ファミリーを単離することができる。

【００１７】

【実施例】次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、以下の実施例は本発明にもとずいて行った例のほん
の一部を示したものであって、本発明は何らこれらに限
定されるものではない。

【００１８】実施例１ I型膜蛋白質であるマウスN-カドヘリンcDNAを本ベクタ
ーのXbaIサイトに挿入した。膜貫通ドメインを含む２種
類(pCIAmNcadM1+: 813bp-3053bp; pCIAmNcadM2+: 2442b
p-3053bp)と含まない１種類(pCIAmNcadM-: 2571bp-30
53bp)の融合遺伝子を作製した。COS細胞にこれらを導入
して、発現させ、FITC-抗マウスIL2Rアルファー抗体で
細胞膜表面のマウスIL2Rアルファーを染め、蛍光顕微鏡
とFACSで検出すると、膜ドメインのある２種類はIL2Rア
ルファーを表出したが、膜ドメインがないものはしなか
った。このことから本発明がI型膜蛋白質の膜ドメイン
を含むcDNAを単離するのに有効であることが結論づけら
れた。

【００１９】実施例２膜結合型蛋白質がII型膜蛋白質であるウシInvariant Ch
ain cDNAを本ベクターのXbaIサイトに挿入した。膜貫通
ドメインを含む1種類(pCIAbIcM+: 190bp-765bp)と含ま
ない１種類(pCIAbIcM-: 298bp-765bp)を作製した。COS
細胞にこれらを導入して、発現させ、FITC-抗マウスIL2
Rアルファー抗体で細胞膜表面のマウスIL2Rアルファー
を染め、蛍光顕微鏡とFACSで検出すると、膜ドメインの
あるものはIL2Rアルファーを表出したが、膜ドメインが
ないものはしなかった。このことから本発明がII型膜蛋
白質の膜ドメインを含むcDNAを単離するのに有効である
ことが結論づけられた。

【００２０】実施例３膜結合型蛋白質がP450型に属する膜蛋白質であるラット
P450d cDNAおよびマウスNADPH-P450 oxidoreductaseを
それぞれ本ベクターのXbaIサイトに挿入した。膜結合ド
メインを含むもの(pCIArP450M+: Ala2-Lys513; pCIAmNA
DPHORM+: 122bp-2066bp)と含まないもの(pCIArP450M-:
Ser443-Lys513; pCIAmNADPHORM-: 209bp-2066bp)を作製
した。COS細胞にこれらを導入して、発現させ、FITC-抗
マウスIL2Rアルファー抗体で細胞膜表面のマウスIL2Rア
ルファーを染め、蛍光顕微鏡とFACSで検出すると、NADP
H-P450 oxidoreductaseの膜ドメインのあるものはIL2R
アルファーを表出したが、膜ドメインがあってもP450d
は細胞の表面に検出できなかった。このことからNADPH-
P450 oxidoreductaseのように本来粗面小胞体にとどま
るべきP450型膜蛋白質および類似蛋白についても本発明
が有効であるものがあると結論づけられた。

【００２１】実施例４ N-末端のシグナルペプチドが膜貫通ドメインになりうる
分泌型蛋白質であるヒトガストリンcDNAを本ベクターの
XbaIサイトに挿入した。シグナルペプチドを含む1種類
(pCIAhGastSP+: 190bp-765bp)と含まない１種類(pCIAhG
astSP-: 298bp-765bp)を作製した。COS細胞にこれらを
導入して、発現させ、FITC-抗マウスIL2Rアルファー抗
体で細胞膜表面のマウスIL2Rアルファーを染め、蛍光顕
微鏡とFACSで検出すると、シグナルペプチドのあるもの
はIL2Rアルファーを検出できたが、シグナルペプチドが
ないものは検出できなかった。このことから本発明が分
泌型蛋白質のシグナルペプチドが膜結合ドメインの代わ
りになり、本発明がシグナルペプチドを含むcDNAを単離
するのに有効であることが結論づけられた。

【００２２】実施例５膜結合型蛋白質がGPI-アンカー型膜蛋白質であるマウス
Thy1.2 cDNAを本ベクターのXbaIサイトに挿入した。GPI
-アンカー付加シグナルと考えられているC-末端疎水性
領域を含む2種類(pCIAmThyM1+: Gln1-Leu143; pCIAmThy
M2+: Asn94-Leu143)と含まない１種類(pCIAmThyM-: Gln
1-Cys112)を作製した。COS細胞にこれらを導入して、発
現させ、FITC-抗マウスIL2Rアルファー抗体で細胞膜表
面のマウスIL2Rアルファーを染め、蛍光顕微鏡とFACSで
検出すると、C-末端疎水性領域のあるものはIL2Rアルフ
ァーを表出したが、C-末端疎水性領域がないものはしな
かった。またこれらのキメラ蛋白の細胞膜との結合はph
osphatidylinositol-specific phospholipase Cで阻害
されることからGPI-アンカー型であると結論される。以
上のことから本発明がGPI-アンカー型膜蛋白質のC-末端
疎水性領域を含むcDNAを単離するのに有効であることが
結論づけられた。

【００２３】実施例６膜結合型蛋白質が複数回膜貫通型に属する膜蛋白質であ
るラット・ニコチン依存性アセチルコリンレセプターal
pha 7 cDNAを本ベクターのXbaIサイトに挿入した。膜貫
通ドメインを含む2種類(pCIArAR7M1234+: Asp219-Ala50
2; pCIArAR7M4+: Glu459-Ala502)を作製した。COS細胞
にこれらを導入して、発現させ、FITC-抗マウスIL2Rア
ルファー抗体で細胞膜表面のマウスIL2Rアルファーを染
め、蛍光顕微鏡とFACSで検出すると、いずれもIL2Rアル
ファーを細胞膜表面に表出した。このことから本発明が
複数回膜貫通型に属する膜蛋白の膜結合ドメインを含む
cDNAを単離するのに有効であることが結論づけられた。

【００２４】実施例７マウス胎生期13日胚の脳のcDNAライブラリーをオリゴd
(T)プライマー：TerXNBS(T)18VN60:5'-GGGTGATGACTAGAT
AACTCGAGCTAGCGGATCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN（配
列番号１１）を用いて作製した。2本鎖cDNAはコーディ
ングの方向をセンス方向にベクターに入れるために、5-
methyl dCTPを用いるストラタジーンのcDNA合成キット
を使用した。アダプターにBamHIを用いた以外は仕様書
通りの操作を行った。作製したcDNAライブラリーはE. c
oli XL1Blue MRF'にトランスフェクトして増殖し、COS
細胞に導入した。作製したcDNAとのキメラIL2レセプタ
ーを発現している細胞集団の精製にはどのような方法を
用いても良いが、主に（１）蛍光標識-抗IL2レセプター
抗体とセルソーターを用いる方法（２）抗IL2レセプタ
ー抗体を用いたパニング法（３）ビオチン標識-抗IL2レ
セプター抗体とアビジン-マグネティックビーズを用い
る方法が考えられる。以下は（３）のマグネティックビ
ーズを用いる方法で細胞集団の単離を行った例である。
単離された細胞からプラスミドDNAを抽出し、大腸菌に
トランスフォームすることによりクローニングを行っ
た。各クローンのプラスミドを単離し、蛍光T3プライマ
ーを用いて塩基配列の決定をした結果、Expression Seq
uence Tag(EST）として報告されている機能不明のcDNA
以外にも、３’末端側に疎水領域を有する全く新しいク
ローンも得られた。このことから本発明がすでに構造の
明らかになっているcDNAばかりでなく、未知のcDNAの単
離にも有用に機能することが示された。

【００２５】

【発明の効果】本法を用いれば、I型、II型、P-450型、
GPI-アンカー型などの膜結合蛋白質のcDNAはもとより、
全く新しい膜結合様式を有するような膜結合蛋白質のcD
NAも単離できる可能性が高い。また従来は特異抗体がな
いと困難であった粗面小胞体および細胞膜に局在する蛋
白のcDNAも容易に網羅的に単離できる。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：７４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGCTCGAGGC TAGCGGATCC AGTACTCTAG CCTTAAGAGC TGTA

【００２７】配列番号：２配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GGGAGATCTG CCACCATGGA GCCACGCTTG CTGATGTTGG

【００２８】配列番号：３配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GGGCTAGCGC GCTTGTGAGC ACAAATGTCT CCGTCA

【００２９】配列番号：４配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGAATCTTCA TGTTTCCAAG GAGGAGGCTC CCTGC

【００３０】配列番号：５配列の長さ：６４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGCGCAATTA ACCCTCACTA AAGGGGGATC CTCTAGAGTC GACCCTATAG TGAGTCGTAT TACG

【００３１】配列番号：６配列の長さ：６４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGCGCGTAAT ACGACTCACT ATAGGGTCGA CTCTAGAGGA TCCCCCTTTA GTGAGGGTTA ATTG

【００３２】配列番号：７配列の長さ：７４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA CTCGAGGATC CGCTAGCGTC GACTGACTAG ATAATTTTTT TTTTTTTTTT TTVN

【００３３】配列番号：８配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA CTCGAGGATC CGCTAGCGTC GACTGACTAG ATAANNNNNN

【００３４】配列番号：９配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA CTCGAGGATC CGCTAGCGTC GACTGACTAG ATAATTTATT

【００３５】配列番号：１０配列の長さ：６７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA CTCGAGGATC CGCTAGCGTC GACTGACTAG TTAATCAGCT ANNNNNN

【００３６】配列番号：１１配列の長さ：６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴特長を表す記号：プライマー配列 GGGTGATGAC TAGATAACTC GAGCTAGCGG ATCCGTCGAC TTTTTTTTTT TTTTTTTTVN

【図面の簡単な説明】

【図１】pCIneomIL2R alpha M-BXES, pCIneomIL2R alph
a M-SEXBの作製方法

【図２】pCIneomIL2R alpha M-BXS, pCIneomIL2R alpha
M-SXB, pCIneomIL2R alpha M-BXES, pCIneomIL2R alp
ha M-SEXB のMCS近傍の塩基配列

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】膜結合蛋白質の遺伝子あるいはｃＤＮＡ
をクローニングする方法において、既知の分泌蛋白質ｃ
ＤＮＡの３’側、もしくは膜結合型蛋白質のすべての膜
貫通部分からＣ−末端側を除いたｃＤＮＡの３’側にマ
ルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を導入したベクター
を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、しかるのち真
核細胞にトランスフェクションして、各生物種のそれぞ
れにふさわしいプロモーターにより融合蛋白として発現
させた上で、細胞膜上に融合膜蛋白として発現した細胞
集団を、Ｎ−末端側の蛋白に対する特異抗体を用いて濃
縮、単離し、プラスミドを回収し、得られたプラスミド
を大腸菌にトランスフェクトすることによりｃＤＮＡの
クローニングを達成することを特徴とする膜結合蛋白質
および分泌蛋白質の遺伝子クローニング方法。
【請求項２】既知の分泌型蛋白もしくは膜結合型蛋白
がＩＬ２レセプターである請求項１の方法。
【請求項３】ベクターが、サイトメガロウイルスのエ
ンハンサー/プロモーター, intron, Multi cloning sit
e(MCS), SV40 late poly(A) site, f1 ori,Neo, Amp,
E.coli ori の各部分からなるｐＣＩ−ｎｅｏのＭＣＳ
をＴ７／Ｔ３プロモーターとともに除き、かわりにマウ
スＩＬ２−レセプターアルファーのシグナルペプチドか
ら膜貫通ドメインの直前までをいれ、ＩＬ２−レセプタ
ーの３’側にＴ３，Ｔ７プロモーターにはさまれたＭＣ
Ｓ（ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｓａｌ
Ｉ）を導入し、ついでその下流に終始コドンを導入して
得られるたものである請求項１または２の膜結合型蛋白
質および分泌蛋白質の遺伝子クローニング方法。
【請求項４】膜結合型蛋白質がI型膜蛋白質、II型膜
蛋白質またはＰ４５０型に属する膜蛋白質である請求項
１、２または３の遺伝子クローニング方法。
【請求項５】Ｎ−末端のシグナルペプチドが膜貫通ド
メインになりうる分泌型蛋白質である請求項１、２また
は３の遺伝子クローニング方法。
【請求項６】膜結合型蛋白質がＧＰＩ−アンカー型膜
蛋白質である請求項１、２または３の遺伝子クローニン
グ方法。
【請求項７】膜結合型蛋白質が複数回膜貫通型に属す
る膜蛋白質である請求項１、２もしくは３の遺伝子クロ
ーニング方法。
【請求項８】膜結合蛋白質が上記以外の新しい機構で
膜上にトラップされる膜蛋白質である請求項１、２また
は３の遺伝子クローニング方法。
【請求項９】ｃＤＮＡが逆方向に挿入された場合融合
蛋白質を合成できないように終始コドンが入れてある請
求項１、２もしくは３の遺伝子クローニング方法に用い
る一本鎖ｃＤＮＡ合成用のプライマー。
【請求項１０】配列番号７〜１０のいずれか１つの配
列のプライマー。
【請求項１１】サイトメガロウイルスのエンハンサー
/プロモーター, intron, Multi cloning site(MCS), SV
40 late poly(A) site, f1 ori, Neo, Amp,E.coli ori
の各部分からなるｐＣＩ−ｎｅｏのＭＣＳがＴ７／Ｔ３
プロモーターとともに除かれ、かわりにマウスＩＬ２
−レセプターアルファーのシグナルペプチドから膜貫通
ドメインの直前までが挿入され、ＩＬ２−レセプターの
３’側にＴ３，Ｔ７プロモーターにはさまれたＭＣＳ
（ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ）
を導入され、その下流に終始コドンが３回、それぞれの
ｆｒａｍｅに導入されてなるベクター。
【請求項１２】請求項１〜８のいずれか１項の方法に
より得られるｃＤＮＡによりコードされた蛋白質。