JP4964493B2 - 内部リボソーム結合部位を利用した遺伝子組換え全抗体の効率的生産法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリン分子を産生するための組換えベクター、及び、これを用いた免疫グロブリン分子の製造方法に関する。

近年上市され始めた抗体医薬品は、その抗原特異性および生体内での安定性のため、これまで治療が困難であった症例に対しても高い効能を示すものもあり、多くの関心が集められてきている。しかしその期待とは裏腹に、需要に対する供給量不足による高額な薬価が障害となり、抗体医薬の恩恵は十分に行き届いていない。例えば、抗体生産の宿主として通常用いられているＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）に代表される動物培養細胞は、培地や、添加する血清、増殖因子等について高額な生産コストがかかる一方、それに見合うだけの生産量が得られない。

抗原特異性を有する抗体は、生体内で機能を果たすために２種類のポリペプチドより４量体構造を形成するため、その異なる２種類の遺伝子をバランスよく発現させることが必須である。仮に１つの細胞で２種類の遺伝子を発現させる場合に、片方の発現のみ大きい場合には、４量体を構成した免疫グロブリン分子として細胞外に放出されず、細胞内に蓄積して毒性を示すことがあり、抗体生産の難しさが窺える。

通常ｍＲＮＡはリボソーム結合部位を１箇所保持するため、１つのｍＲＮＡで１つのポリペプチドが合成（翻訳）される。しかし、内部リボソーム結合配列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）と呼ばれる特殊な配列をそのｍＲＮＡ上にシスエレメントとして有する場合は、リボソーム結合部位が２箇所になるため、１本のｍＲＮＡから２種類のポリペプチドを合成することが可能となる。

特許文献１には、レトロウイルスベクターでのＩＲＥＳ発現カセットの使用および遺伝子治療への応用方法が開示される。しかし、該ＩＲＥＳを用いてバイシストニックな発現系を抗体分子生産に応用することは開示も示唆もしない。

特許文献２は、ＩＲＥＳを利用したバイシストニックおよびポリシストニック発現系による動物培養細胞での抗体分子を含む多量体機能性タンパク質の生産法を開示し、またＩＲＥＳの反復による下流遺伝子発現量調節方法を開示するが、ホメオドメインタンパク質Ｇｔｘ由来のＩＲＥＳが非常に有効にＩＲＥＳとして機能すること及び反復利用可能なことは開示も示唆もしない。

非特許文献１は、ＧｔｘをコードするｍＲＮＡの５′ＵＴＲの１９６塩基中で、１３３−１４１の領域がＩＲＥＳ能を有し、該ＩＲＥＳ領域の反復回数によるＩＲＥＳ下流遺伝子の発現量の増強を開示するが、該ＩＲＥＳの上流と下流に、免疫グロブリン分子を構成する重鎖と軽鎖をコードする配列を配置することによる免疫グロブリン分子の生産法は開示していない。
特表２００２−５４２８３４号公報 特表平０８−５０２６４４号公報 Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２０００年２月１５日，９７（４），１５３６−４１頁

本発明は、上記現状に鑑み、動物培養細胞を用いて免疫グロブリン分子を生産するにあたって、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖という２種類のポリペプチドをバランス良く生産させることによって、免疫グロブリン分子の生産量を向上させることを目的とするものである。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、ひとつのベクターに、免疫グロブリン分子を構成する重鎖及び軽鎖の遺伝子を導入し、重鎖の遺伝子と軽鎖の遺伝子のあいだに、内部リボソーム結合配列としてＧｔｘ ＩＲＥＳを配置することによって、両遺伝子がバランス良く発現し、免疫グロブリン分子の生産量が向上することを発見した。さらには、このＧｔｘ ＩＲＥＳを複数回繰り返し配置することによって免疫グロブリン分子をさらに効率的に生産できることを発見した。

よって、本発明が提供するのは以下のとおりである。
（１）免疫グロブリン分子を産生するための組換えベクターであって、
プロモーターの下流に、前記免疫グロブリン分子を構成する重鎖をコードする塩基配列（Ａ）、及び、前記免疫グロブリン分子を構成する軽鎖をコードする塩基配列（Ｂ）を配置し、前記塩基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を配置してなることを特徴とする組換えベクター。
（２）ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列は、前記ｍＲＮＡ中の５′ＵＴＲ又はその一部からなるものである上記（１）記載の組換えベクター。
（３）内部リボソーム結合配列は、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡ中の５′ＵＴＲにおいて転写開始点より１３３〜１４１番目の塩基配列である上記（１）又は（２）記載の組換えベクター。

（４）塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を２回以上反復させて配置してなる上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の組換えベクター。
（５）塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を２回以上５回以下反復させて配置してなる上記（４）記載の組換えベクター。
（６）塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を６回以上１０回以下反復させて配置してなる上記（４）記載の組換えベクター。
（７）塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を１１回以上反復させて配置してなる上記（４）記載の組換えベクター。

（８）免疫グリブリン分子は、哺乳類由来のものである上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の組換えベクター。
（９）免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子である上記（８）記載の組換えベクター。
（１０）免疫グロブリン分子は、マウス免疫グロブリン分子である上記（８）記載の組換えベクター。
（１１）免疫グロブリン分子は、異種動物間でのキメラ、又は、ヒト化に属するものである上記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の組換えベクター。

（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の組換えベクターで動物宿主細胞を形質転換してなることを特徴とする形質転換体。
（１３）動物宿主細胞がＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）由来細胞である上記（１２）記載の形質転換体。
（１４）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の組換えベクターを動物培養細胞に導入した後、当該動物培養細胞を培養して免疫グロブリン分子を産生させることを特徴とする、免疫グロブリン分子の製造方法。
以下に本発明を詳述する。

本発明は、免疫グロブリン分子を構成する重鎖と軽鎖を１つの組換えベクターに配置し、動物培養細胞において重鎖と軽鎖を同時またはバランス良く発現することを可能とさせる発現システムおよびそれによる免疫グロブリン分子の生産法に関する。

本発明で用いられる免疫グロブリン分子としては特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリに代表される脊椎動物（特に、哺乳類及び鳥類）が生体内で生合成可能な免疫グロブリン分子や、異なる動物間でのキメラ免疫グロブリン分子、及び、ヒト化に代表されるような人工的合成免疫グロブリン分子が含まれる。

ここで言うキメラ免疫グロブリン分子は、ある動物内で生産される免疫グロブリン分子の一部を、異種の動物が産生する免疫グロブリン分子の相当領域に置き換えた免疫グロブリン分子を示す。置き換える領域としては特に限定されないが、血中半減期の観点から、キメラ免疫グロブリン分子の定常領域は、これを投与する対象動物個体が通常生産する免疫グロブリン分子の定常領域であることが好ましい。

ここで言うヒト化免疫グロブリン分子とは、免疫グロブリン分子の抗原認識に機能するアミノ酸配列領域以外を、ヒトが通常産生する免疫グロブリン分子構成配列とした免疫グロブリン分子を指す。

免疫グロブリン分子は重鎖及び軽鎖からなるが、この２種類のポリペプチドをひとつのベクターに導入し、かつ、両者をバランス良く発現させるために、本発明においては、免疫グロブリン分子を産生するための組換えベクターとして、上流にプロモーターを配置し、その下流に、重鎖をコードする塩基配列（Ａ）又は軽鎖をコードする塩基配列（Ｂ）、少なくともＩＲＥＳを含む塩基配列、軽鎖をコードする塩基配列（Ｂ）又は重鎖をコードする塩基配列（Ａ）を、この順で配置してなる組換えベクターを用いる。

この組換えベクターを動物培養細胞に導入して得られた形質転換体を培養すると、導入したベクターは細胞の転写機構を利用して上流プロモーターよりｍＲＮＡを転写する。このｍＲＮＡが細胞の翻訳機構を利用して、ｍＲＮＡ上流からの重鎖−軽鎖連結ポリペプチド、及び、ＩＲＥＳからの重鎖又は軽鎖ポリペプチドを合成する。

上流に配置するプロモーター配列としては特に限定されないが、例えば、ウイルスＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、β−アクチンプロモーター等のユビキタスに発現するプロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、誘導可能なプロモーター等が挙げられる。

ベクターに挿入するホメオドメインタンパク質ＧｔｘのＩＲＥＳ配列は、非特許文献１に記載されているように、ＧｔｘをコードするｍＲＮＡ中の５′ＵＴＲを構成する１９６塩基中で転写開始点より１３３〜１４１番目の塩基配列に相当するものであり、９塩基と比較的短いために、反復回数を増減させるなどの遺伝子組換え操作が簡便なものである。

比較的短いＩＲＥＳは、複数回反復させて配置することでＩＲＥＳ下流のポリペプチドの発現量を調節することが可能であるため、ＩＲＥＳ上流のポリペプチドの発現量とのバランスを最適化することが可能である。反復回数は、目的とする免疫グロブリン分子を効率的に発現生産できる限り特に限定されないが、２回以上が好ましく、具体的には、２回以上５回以下や、６回以上１０回以下や、１１回以上の場合が挙げられる。上限は特に限定されないが、例えば、３０回以下、好ましくは２０回以下である。

本発明で用いられるベクターとしては特に限定されないが、複製能欠損型レトロウイルスベクターを用いることができる。複製能欠損型レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（ＭＥＳＶ）等が挙げられる。
宿主細胞への感染性を高めるため、複製能欠損型レトロウイルスベクターエンベロープを人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質に置換し、広範囲の哺乳類及び非哺乳類の細胞に対し感染可能にしているが、特にこれに限定はされない。

本発明の組換えベクターは、遺伝子工学的手法を用いて、宿主細胞内で導入遺伝子タンパク質が発現するように、ベクター上に、プロモーター、免疫グロブリン分子の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列、ＩＲＥＳ配列、免疫グロブリン分子の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列の順に配列した。
また、正しく遺伝子導入された細胞の同定及び単離の目印としてマーカー遺伝子を挿入することが好ましい。マーカー遺伝子としては特に限定されないが、例えば、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）、エンハンスド・ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、シアン・フルオレッセント・プロテイン（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質の遺伝子、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ^ｒ）等の薬剤耐性遺伝子、他にチミジンキナーゼ、ジヒドロフォレート・レダクターゼ、アミノグルコシド・ホスホトランスフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の遺伝子が挙げられる。マーカー遺伝子はプロモーター遺伝子等の発現に必要な要素を伴っていることが好ましい。

本発明の組換えベクターを動物培養細胞に導入する方法としては特に限定されることはなく、あらゆる公知の手法が可能である。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターによる感染法等が挙げられるが、これに限定されない。

本発明の組換えベクターを導入することができる動物培養細胞としては特に限定されず、ヒト由来、マウス由来、イヌ由来、ハムスター由来、マウス由来、ラット由来など、あらゆる動物由来の培養細胞を用いることができるが、生産した免疫グロブリン分子をヒトへの抗体医薬品とする場合、その安全性から、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が好まれる。

得られた形質転換体の培養法としては特に限定されず、あらゆる公知の手法が可能であり、細胞種に応じて好ましい培地、培養法を用いることが好ましい。

本発明で生産可能な免疫グロブリン分子は、細胞培養溶液中に分泌させることが回収効率の面から好ましく、そのため分泌の改善の観点からシグナル配列を変更、挿入、欠失変異導入することが可能であるが限定はしない。
細胞培養溶液中に分泌された免疫グロブリン分子は、細胞培養溶液を培養細胞と分離回収し、その後細胞残骸を取り除く等の前処理をし、分離精製することが好ましいが、これに限定されない。

生産した免疫グロブリン分子の回収および精製方法としては特に限定されないが、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティー精製が可能である。この手法により生産させた免疫グロブリン分子をさらに精製または調整し抗体医薬または抗体医薬品原料として用いることが可能である。

本発明は、上述の構成よりなるので、動物培養細胞を用いて極めて効率的に免疫グロブリン分子を生産することが可能となり、より高い治療効果が望める抗体医薬品の生産量が向上し、需要に見合った供給量の提供が可能となる。

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
以下、断りがない限り、ＰＣＲ反応にはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ライゲーションにはＬｉｇａＦａｓｔ（登録商標） Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌａｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）、ＰＣＲ反応液及び電気泳動により得たＤＮＡ断片精製にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ ｕｐ−（東洋紡社製）を使用した。操作は特に記載のない限り説明書の指示に従った。

（実施例１）免疫グロブリン分子発現用プラスミドベクターの構築（プロモーターはβ−アクチンプロモーターとした）
ニワトリβ−アクチンプロモーターを用いたプラスミドｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡを構築した。下記に構築方法を示す。
ｐＭＳＣＶｎｅｏ（クローンテック社製）から一連のミューリン・ポスポグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＮｅｏ^ｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーションによりプラスミドｐＭＳＣＶを構築した。

また、ＥＧＦＰ遺伝子を、ｐＩＲＥＳＩＩ−ＥＧＦＰ（クローンテック社製）を鋳型として、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１、下線部はＥｃｏＲＩ制限酵素部位）および５’−ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号２、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒、５５℃／３０秒、６８℃／１分；３０サイクル）により増幅し、得られた断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断した。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（東洋紡社製）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＥＧＦＰとした。
同様に、これをｐＭＳＣＶのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込み、ｐＭＳＣＶ／ｅＧとした。

ｐｍｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ；Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８６）を鋳型として、ニワトリβ−アクチンプロモーターを、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号３、下線部はＳａｌＩ制限酵素部位）、５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＣＧ−３’（配列番号４、下線部はＳａｌＩ制限酵素部位）をプライマーとして、ＰＣＲ（９４℃／１５秒、５０℃／３０秒、６８℃／１分；１０サイクル、９４℃／１５秒、６２℃／３０秒、６８℃／１分；３０サイクル）で増幅し、制限酵素ＳａｌＩで処理の後、ｐＭＳＣＶ／ｅＧのＸｈｏＩサイトへ挿入し、ＥＧＦＰ遺伝子と同方向にニワトリβアクチンプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡとした。

（実施例２）免疫グロブリン分子発現用プラスミドベクターの構築（プロモーターはＣＭＶプロモーターとした）
ＣＭＶプロモーターを用いたプラスミドｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖを構築した。
ＣＭＶプロモーターは、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）から制限酵素ＳａｌＩおよびＰｖｅＩＩで切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（東洋紡社製）のＳａｌＩ−ＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／Ｐｃｍｖとした。
このｐＢｌｕｅ／Ｐｃｍｖから制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩでＣＭＶプロモーターを切り出し、実施例１に記載のｐＢｌｕｅ／ＥＧＦＰから制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩでＥＧＦＰ遺伝子を切り出し、ｐＭＳＣＶｎｅｏ（クローンテック社製）から制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩでＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトを除き、これらの配列をつなぎ合わせてｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖとした。

（実施例３）抗ヒトＣＤ２キメラ抗体遺伝子クローニング
ヒト抗体（ＩｇＭ）産生ハイブリドーマ細胞Ｄ２５３−１５−６（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−８７８９）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧ−３’（配列番号５、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号６、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１分、５０℃／１分、７２℃／１分３０秒；２５サイクル）により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖κ定常領域（ｈＣκ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣκを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号７、下線部はＮｏｔＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番号８、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｌ鎖可変領域（ｈＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡ−３’（配列番号９、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）及び５’−ＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＧＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号１０、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖μ定常領域（ｈＣμ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１１、下線部はＮｏｔＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１２、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖可変領域（ｈＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣκからｈＣκ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、プラスミドｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）の制限酵素ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣκを作製した。

２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１３、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣ−３’（配列番号１４、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）を２１ｂｐｓにわたって相補的な末端でアニールさせ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いたＤＮＡ２重鎖合成反応によって上皮増殖因子受容体膜貫通領域（ＴＭ）の遺伝子断片を調製した。得られたＴＭ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって処理後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣμからｈＣμ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ＴＭの制限酵素ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＣμＴＭから一連のｈＣμ遺伝子及びＴＭ遺伝子を含む断片を制限酵素ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４の制限酵素ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを作製した。

ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭを制限酵素ＢａｍＨＩによって切断し、末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑処理後、セルフライゲーションによりプラスミドｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢを作製した。

化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴ−３’（配列番号１５、下線部はＮａｒＩ制限酵素部位）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＬが保有するｈＶＬの３’末端にアミノ酸の変更を伴わずに制限酵素ＮａｒＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮを作製した。

化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴ−３’（配列番号１６、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）を用いた部位特異的変異導入によりｐＢｌｕｅ／ｈＶＨが保有するｈＶＨの３’末端にアミノ酸の変更を伴わずに制限酵素ＢａｍＨＩサイトを導入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢを作製した。

抗ヒトＣＤ２マウス抗体産生ハイブリドーマ細胞ＴＳ２／１８．１．１（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション ＨＢ−１９５）からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１７、下線部はＮｏｔＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴ−３’（配列番号１８、下線部はＮａｒＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｌ鎖可変領域（ｍＶＬ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＮａｒＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅ／ｈＶＬＮのＮｏｔＩ、ＮａｒＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＬを作製した。

同様にして、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＭＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１９、下線部はＮｏｔＩ制限酵素部位）及び５’−ＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号２０、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲにより上記ｃＤＮＡライブラリからマウス抗体Ｈ鎖可変領域（ｍＶＨ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｍＶＨを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｍＶＬからｍＶＬ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣκのＮｏｔＩ、ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＬκを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｈＶＨＢからｈＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４／ｈＣμＴＭΔＢの制限酵素ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭを作製した。

ｐＢｌｕｅ／ｍＶＨからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって処理したｐＣＥＰ４／ｈＩｇＨμＴＭのベクター断片に連結し、プラスミドｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭを作製した。

ヒト抗体（ＩｇＧ１）産生ミエローマ細胞ＩＭ−９（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ ００２４）からｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴ−３’（配列番号２１）及び５’−ＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号２２）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／２分、５２℃／３０秒、７４℃／３分；３０サイクル）により上記ｃＤＮＡライブラリからヒト抗体Ｈ鎖γ１定常領域（ｈＣγ１）の遺伝子断片を増幅した。さらに、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧ−３’（配列番号２３、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）及び５’−ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ−３’（配列番号２４、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒、５８℃／３０秒、６８℃／１分；３０サイクル）により上記ＰＣＲ産物からｈＣγ１遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１を作製した。

ｐＣＥＰ４／ＩｇＨμＴＭからｍＶＨ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１からｈＣγ１遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって処理したプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のベクター断片に上記切り出した２断片を連結し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１を作製した。

（実施例４）ＩＲＥＳを利用したバイシストニック抗ＣＤ２キメラ抗体発現プラスミドベクターの構築
脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＥＭＣＶ））由来のＩＲＥＳ配列をｐＬＸＩＮ（クローンテック社製）を鋳型として、化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣ−３’（配列番号２５、下線部はＳａｌＩ制限酵素部位）、５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号２６、下線部はＸｈｏＩ制限酵素部位）をプライマーとして、ＰＣＲ（９４℃／１５秒、５０℃／３０秒、６８℃／１分；１０サイクル、９４℃／１５秒、６２℃／３０秒、６８℃／１分；３０サイクル）で増幅し、こうして得たＩＲＥＳを、制限酵素ＳａｌＩ、ＸｈｏＩで処理したｐＥＴＢｌｕｅ−２に挿入し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＩＲＥＳ（Ｓ−Ｘ）とした。

実施例３に記載のｐＥＴＢｌｕｅ／ＩｇＨγ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、Ｈ鎖を切り出し、実施例１記載のｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＨとした。

ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＩＲＥＳ（Ｓ−Ｘ）を制限酵素ＳａｌＩ、ＸｈｏＩで処理し、ＩＲＥＳを切り取り、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＨの制限酵素ＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＩＨとした。

ｐＣＥＰ４／ＩｇＬκを鋳型にしてＩｇＬκをＰＣＲ（９５℃／３０秒、５０℃／３０秒、７４℃／２分；１０サイクル、９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７４℃／２分；３０サイクル、７４℃／５分）により増幅した。プライマーは５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＣＧ−３’（配列番号２７、下線部はＳａｌＩ制限酵素部位）と５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＣＧ−３’（配列番号２８、下線部はＳａｌＩ制限酵素部位）を用いた。こうして得たＩｇＬκを、ｐＥＴＢｌｕｅ−２の制限酵素ＳａｌＩサイトに挿入し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＩｇＬκ（Ｓ−Ｓ）とした。また、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡの制限酵素ＳａｌＩサイトに得たＩｇＬκを挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬとした。

さらに、ｐＥＴＢｌｕｅ−２／ＩｇＬκ（Ｓ−Ｓ）を制限酵素ＳａｌＩで処理し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＩＨの制限酵素ＳａｌＩサイトに挿入し、これをｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＣＤ２）とした。

またＧｔｘ ＩＲＥＳ配列はオリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＧＡＣ−（ＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴ）_ｎ−ＧＡＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２９（ｎ＝３）、配列番号３０（ｎ＝５）、配列番号３１（ｎ＝７）、下線部はＳａｌＩ，ＮｏｔＩ制限酵素部位）およびこの相補鎖を化学合成した。これをそれぞれ制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断した。これをｐＥＴＢｌｕｅ−２の制限酵素ＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入しｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘｎとした。ここでｎは繰り返し配列数を示し、本発明ではｎ＝３，５，７であった。

また、上記のｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＣＤ２）より制限酵素ＮｏｔＩ，ＣｌａＩでＨ鎖を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＮｏｔＩ−ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／Ｈとした。これから制限酵素ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩでＨ鎖を切り出し、上記のｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘｎ（ｎ＝３，５，７）の制限酵素ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入し、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘｎＨ（ＣＤ２；ｎ＝３，５，７）とした。これを制限酵素ＣｌａＩで処理し、ＩＲＥＳＧｔｘｎＨ（ＣＤ２；ｎ＝３，５，７）配列を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ ＩＲＥＳ、ＣＤ２；ｎ＝３，５，７）とした。

また、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣ−（ＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＧＴ）_５−ＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号３２、下線部はＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ制限酵素部位）および相補鎖を化学合成しそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２に挿入し、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ５とした。

一方、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘｎＨ（ｎ＝５）から制限酵素ＳａｌＩおよびＣｌａＩでＩＲＥＳＧｔｘｎ（ｎ＝５）Ｈ配列を切り出し、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ５から制限酵素ＸｈａＩ，ＸｈｏＩでＩＲＥＳＧｔｘ５を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２の制限酵素ＸｈａＩ−ＣｌａＩサイトに挿入することでｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ１０Ｈを構築した。これを制限酵素ＣｌａＩで処理し、ＩＲＥＳＧｔｘ１０Ｈ（ＣＤ２）配列を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１０ ＩＲＥＳ、ＣＤ２）とした。

また、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ１０Ｈを制限酵素ＳａｌＩおよびＣｌａＩでＩＲＥＳＧｔｘｎ（ｎ＝１０）Ｈ配列を切り出し、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ５から制限酵素ＸｈａＩ，ＸｈｏＩでＩＲＥＳＧｔｘ５を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２の制限酵素ＸｈａＩ−ＣｌａＩサイトに挿入することでｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ１５Ｈを構築した。これを制限酵素ＣｌａＩで処理し、ＩＲＥＳＧｔｘ１５Ｈ（ＣＤ２）配列を切り出し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬの制限酵素ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１５ ＩＲＥＳ、ＣＤ２）とした。

（実施例５）抗ヒトＴＮＦαキメラ抗体遺伝子クローニングおよびＩＲＥＳを利用したバイシストニック抗ヒトＴＮＦαキメラ抗体発現プラスミドベクターの構築
抗ヒトＴＮＦαキメラ抗体のマウス由来可変領域であるｍＶＨおよびｍＶＬ（一般名；Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ：商品名；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）：Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ社製）を公開配列情報に基づいて全塩基配列を化学合成した。

ｍＶＨは末端に制限酵素ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩを加えてあるため、制限酵素ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩで処理し、実施例３に記載のｐＢｌｕｅ／ｈＣγ１の制限酵素ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＴＮＦＨとした。

ｍＶＬは末端に制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｂｅＩを加えてあるため、制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｂｅＩで処理し、実施例３に記載のｐＢｌｕｅ／ｈＣκの制限酵素ＮｏｔＩ−ＢｂｅＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＴＮＦＬとした。

一方、ＥＭＣＶ由来のＩＲＥＳ配列は実施例４に記載のｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＣＤ２）を鋳型として、化学合成オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣ−３’（配列番号３３、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素部位）、５’−ＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号３４、下線部はＰｓｔＩ制限酵素部位）をプライマーとしてＰＣＲ（９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分；３０サイクル）で増幅した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切り取り、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＩＲＥＳとした。

ｐＢｌｕｅ／ＴＮＦＬを制限酵素ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩでＬ鎖を切り出し、ｐＢｌｕｅ／ＩＲＥＳの制限酵素ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＬＩとした。

また、ｐＢｌｕｅ／ＴＮＦＨから制限酵素ＰｓｔＩ、ＣｌａＩでＨ鎖を切り出し、ｐＢｌｕｅ／ＬＩの制限酵素ＰｓｔＩ−ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＢｌｕｅ／ＴＮＦＬＩＨとした。これを制限酵素ＳａｌＩ，ＣｌａＩで処理し、ＴＮＦＬＩＨを切り出し、実施例１記載のｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡの制限酵素ＳａｌＩ−ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）とした。

実施例４に記載のｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘｎ（ｎ＝３，５，７）、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ１０Ｈ、ｐＥＴ／ＩＲＥＳＧｔｘ１５Ｈを制限酵素ＢａｍＨＩ，ＮｏｔＩで処理しＩＲＥＳＧｔｘｎ（ｎ＝３，５，７）、ＩＲＥＳＧｔｘ１０、ＩＲＥＳＧｔｘ１５を取り出し、一方、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）の制限酵素ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα；ｎ＝３，５，７）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１０ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１５ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）とした。

また、ｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖＬＩＨ（ＴＮＦα）に関しては、上記のｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα；ｎ＝３，５，７）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１０ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（Ｇｔｘ１５ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）を制限酵素ＳａｌＩ，ＣｌａＩで処理し、ＬＩＨ（ＴＮＦα）を切り取り、これを実施例２に記載のｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖの制限酵素ＳａｌＩ−ＣｌａＩサイトに挿入し、ｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖＬＩＨ（Ｇｔｘ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα；ｎ＝３，５，７）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖＬＩＨ（Ｇｔｘ１０ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）、ｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖＬＩＨ（Ｇｔｘ１５ ＩＲＥＳ、ＴＮＦα）とした。

（実施例６）動物培養細胞を用いた免疫グロブリン分子の産生
免疫グロブリン分子の産生をＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）で行った。培地は１０％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むグルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｄｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ；ギブコ社製）を用いた。培養は３７℃、ＣＯ_２５％で行った。
２４ｗｅｌｌプレート（底面積１．９ｃｍ^２）に細胞数１．２×１０^５細胞／ウェルになるように細胞を播種した（翌日９０％コンフルエントになるようにする）。翌日、培地を取り除き、新たに０．５ｍｌの培地を加えた。２．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００（インビトロジェ社製）を５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（ギブコ社製）に懸濁し、室温で５分おいた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液）。０．８μｇの実施例４および５で構築した免疫グロブリン分子発現プラスミドベクターを５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁した（プラスミドＤＮＡ溶液）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．２０００溶液とプラスミドＤＮＡ溶液を混合し、室温で２０分おいた。これを培養ディッシュに全量加え、４８時間培養した。
４８時間培養後、培養上清を０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（アドバンテック社製）に通し、１．５ｍｌチューブに集めた。２００００×ｇで１０分間遠心し、細胞片を沈降させたのち、上清を回収し、測定用サンプルとした。それぞれの条件に対して３ウェルづつ行った。

（実施例７）ＥＬＩＳＡによる免疫グロブリン分子濃度の定量
実施例６で回収した上清中の免疫グロブリン分子の発現量を測定するために、ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法を行った。抗体生産量は測定で用いた標準品より算出した。
測定方法は代表的な方法に従った（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８、８７１−８７４（１９７１））。
ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を一次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を二次抗体として用いた。検出基質としてｏ‐ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを用いて発色させ、吸光度をプレートリーダーで測定した。定量時のスタンダードとしてｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）を用いた。得られた結果を図１〜３に示す。

β−アクチンプロモーターを含む抗ヒトＣＤ２抗体発現ベクターｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＣＤ２）をＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した際の免疫グロブリン分子生産分泌量を示すグラフ。縦軸はＦｃ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。横軸において、「Ｅ」はＩＲＥＳ配列としてＥＭＣＶのＩＲＥＳを用いたベクターを示す。「３」、「５」、「７」、「１０」又は「１５」はそれぞれＩＲＥＳ配列としてＧｔｘ ＩＲＥＳを導入したベクターで、そのＧｔｘ ＩＲＥＳの反復回数がそれぞれ３、５、７、１０又は１５回のものを指す。「Ｅｍｐｔｙ」はベクターを導入しない細胞（コントロール）での測定結果を示す。 β−アクチンプロモーターを含む抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターｐＭＳＣＶ／ｅＧΔＡＬＩＨ（ＴＮＦα）をＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した際の免疫グロブリン分子生産分泌量を示すグラフ。縦軸及び横軸の表記は図１に同じ。 ＣＭＶプロモーターを含む抗ヒトＴＮＦα抗体発現ベクターｐＭＳＣＶ／ｅＧＰｃｍｖＬＩＨ（ＴＮＦα）をＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した際の免疫グロブリン分子生産分泌量を示すグラフ。縦軸及び横軸の表記は図１に同じ。

Claims (11)

1. 免疫グロブリン分子を産生するための組換えベクターであって、
   β−アクチンプロモーターの下流に、前記免疫グロブリン分子を構成する重鎖をコードする塩基配列（Ａ）、及び、前記免疫グロブリン分子を構成する軽鎖をコードする塩基配列（Ｂ）を配置し、前記塩基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を６回以上１０回以下反復させて配置してなることを特徴とする組換えベクター。
2. 塩基配列（Ａ）と塩基配列（Ｂ）のあいだに、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列を７回反復させて配置してなる請求項１記載の組換えベクター。
3. ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡに由来する内部リボソーム結合配列は、前記ｍＲＮＡ中の５′ＵＴＲ又はその一部からなるものである請求項１又は２に記載の組換えベクター。
4. 内部リボソーム結合配列は、ホメオドメインタンパク質ＧｔｘをコードするｍＲＮＡ中の５′ＵＴＲにおいて転写開始点より１３３〜１４１番目の塩基配列である請求項１〜３のいずれかに記載の組換えベクター。
5. 免疫グロブリン分子は、哺乳類由来のものである請求項１〜４のいずれかに記載の組換えベクター。
6. 免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子である請求項５記載の組換えベクター。
7. 免疫グロブリン分子は、マウス免疫グロブリン分子である請求項５記載の組換えベクター。
8. 免疫グロブリン分子は、異種動物間でのキメラ、又は、ヒト化に属するものである請求項１〜４のいずれかに記載の組換えベクター。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えベクターで動物宿主細胞を形質転換してなることを特徴とする形質転換体。
10. 動物宿主細胞がＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）由来細胞である請求項９記載の形質転換体。
11. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えベクターを動物培養細胞に導入した後、当該動物培養細胞を培養して免疫グロブリン分子を産生させることを特徴とする、免疫グロブリン分子の製造方法。
    

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