NO330269B1 - Peptid, DNA, vektor, celle, fremgangsmate for undersokelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, samt fremgangsmate for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne - Google Patents
Peptid, DNA, vektor, celle, fremgangsmate for undersokelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, samt fremgangsmate for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne Download PDFInfo
- Publication number
- NO330269B1 NO330269B1 NO20002670A NO20002670A NO330269B1 NO 330269 B1 NO330269 B1 NO 330269B1 NO 20002670 A NO20002670 A NO 20002670A NO 20002670 A NO20002670 A NO 20002670A NO 330269 B1 NO330269 B1 NO 330269B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cdna
- peptide
- cell
- vector
- secretory
- Prior art date
Links
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 55
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 18
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 12
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 5
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 101150001753 MPL gene Proteins 0.000 description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 17
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 15
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 7
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 7
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 210000000352 storage cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 101001033276 Mus musculus Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102100034196 Thrombopoietin receptor Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000445359 Mus haussa Species 0.000 description 1
- 101100261153 Mus musculus Mpl gene Proteins 0.000 description 1
- 241000714199 Myeloproliferative leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse angår peptid, DNA, vektor, celle, fremgangsmåte for undersøkelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, samt fremgangsmåte for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne.
Oppfinnelsens bakgrunn
Hittil er gener som koder for et hormon eller en vekstfaktor isolert og anvendt for å produsere mange rekombinante proteiner som er blitt kommersialisert som medisiner. De fleste av disse er sekretoriske proteiner. Isolering av et gen som koder for et nytt sekretorisk protein er derfor et ytterst viktig trinn ved utvikling av en ny medisin. Følgelig er det blitt utviklet metoder for isolering av et gen som koder for et sekretorisk protein. Honjo et al. utviklet for eksempel en metode (japansk patent-søknad nr Hei 6-315380) ved anvendelse av det karakteristiske trekk at sekretoriske proteiner har en signalsekvens som tillater translokasjon av intracellulært uttrykte proteiner til celleoverflaten. Ved denne metode blir signalsekvensen for a-kjeden av human IL-2-reseptor, et sekretorisk protein, erstattet med et kort cDNA-fragment som tilsvarer 5'-endesekvensen av mRNA fra en målcelle eller et vev, for å konstruere et bibliotek som deretter innføres i cellene. Blant klonene blir IL-2-reseptor uttrykt på celleoverflaten av kloner med en signalsekvens, men ikke de uten en signalsekvens. Tilstedeværelsen av signalsekvensen kan således påvises ved hjelp av anti-IL-2-reseptorantistoffet.
Genetics Institute, Inc., (Cambridge, MA) utviklet et mer sofistikert system ved anvendelse av et metabolsk gjærenzym U.S. patent 5 536 637). Invertase, et metabolsk gjærenzym, er et sekretorisk enzym som spalter sukrose i kulturmediet til glukose og fruktose for å overføre energi. En mutant stamme som ikke utskiller dette enzym kan ikke vokse i et medium inneholdende sukrose som den eneste karbonkilde, uten glukose. Ved denne metode som benytter dette fenomen blir invertasegenet ligert med cDNA for å konstruere et bibliotek som deretter innføres i en mutant gjærstamme som mangler invertasegenet. Kloner inneholdende signalpeptidet isoleres ved seleksjon av kloner som er i stand til å vokse i et medium som kun inneholder sukrose som karbonkilde.
Metoden ifølge Honjo et al. er imidlertid ufordelaktig ved at omstendelige trinn fordres for utvelgelse av positive kloner på grunn av anvendelse av et antistoff. Deteksjonsensitiveten er dessuten meget lav. Metoden ifølge Genetics Institute, Inc., har også et problem ved at en klon med dårlig sekresjonseffektivitet i gjær ikke kan isoleres. Disse metoder påviser dessuten kun kort DNA på grunn av det potensielle tap av antigenitet eller enzymatisk aktivitet når rapportørproteinet fusjoneres med et stort protein. Metodene kan dessuten ikke påvise type II-membranproteinene som har sine N-terminale ender inne i cellen og de C-terminale ender utenfor cellen.
WO A196/40904 beskriver en signalsekvensinnfangingsmetode med biologisk seleksjon.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for undersøkelse av hvorvidt et testet cDNA koder for et peptid med den sekretoriske evne eller ikke. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk aktivitet som tillater anvendelse av et cDNA som koder for et langt peptidkodingsområde.
Proteiner, slik som cytokinreseptorer, translokerer til celleoverflaten, dimeriserer ved binding av deres ligander og induserer celleproliferasjon. Transloka-sjonsevnen (sekretorisk evne) til celleoverflaten av proteinene er kjent for å avhenge av tilstedeværelsen av signalsekvensen. De foreliggende oppfinnere antok at det var mulig å undersøke hvorvidt et ønsket peptid har sekretorisk aktivitet ved å fjerne signalsekvensen (eller med ytterligere ekstracellulært område) fra proteinene og erstatte denne med et fusjonsprotein inneholdende et ønsket peptid, uttrykke fusjonsproteinet i cellene og undersøke cellenes proliferasjonsevne. Dersom peptidet har sekretorisk evne vil fusjonsproteinet translokere til celleoverflaten, dimerisere og indusere celleproliferasjon. I motsetning til dette, hvis peptidet ikke inneholder sekretorisk aktivitet, kan fusjonsproteinet ikke translokere til celleoverflaten og indusere celleproliferasjon. Den sekretoriske evne hos det fusjonerte peptid kan således testes ved kun å undersøke celleproliferasjon som en indeks. Oppfinnerne antok dessuten at det var mulig å utføre positiv screening for et peptid med sekretorisk evne ved å utvelge celler som prolifererer. De foreliggende oppfinnere anvendte således mpl (trombopoietinreseptor) som et protein som utløser celleproliferasjon gjennom translokering til celleoverflaten og dimerisering, og utviklet en metode for påvisning og isolering av et peptid med sekretorisk evne.
Nærmere bestemt ble det fremstilt et DNA som koder for humant mpl uten sekretorisk evne, ved å fjerne sekresjonssignalet og det meste av det ekstracellulære domene fra en konstitutivt aktiv form av mpl, som var funnet av de foreliggende oppfinnere (mpl endres til å være i stand til å overføre autonom proliferasjonsevne til en IL-3-avhengig cellelinje ved hjelp av transduksjonssignalet i fravær av ligand; Blood 88:1399-1406 (1996)). DNA ble deretter ligert med cDNA som skulle testes, et DNA som koder for et kjent sekretorisk protein, eller et DNA som koder for det sekretoriske peptid fra hvilket det sekretoriske signalområde var fjernet. De resulterende kimære gener ble uttrykt i celler og proliferasjonsevne ble undersøkt. Resultatene viser at DNA som koder for et kjent sekretorisk protein anvendt som et test-cDNA induserte celleproliferasjon, mens ingen celleproliferasjon ble påvist for DNA som koder for det sekretoriske protein fra hvilket det sekretoriske signalområde var fjernet. På denne måte fant de foreliggende oppfinnere at det således utviklede system kan benyttes for lett å påvise og isolere et DNA som koder for et peptid med sekretorisk aktivitet og som inneholder et langt peptidkodingsområde, ved anvendelse av celleproliferasjon som en indeks. Oppfinnerne utførte da også screening og lyktes med å påvise og isolere DNA som koder for sekretoriske proteiner, inkludert type I membranproteiner og type II membranproteiner.
Foreliggende oppfinnelse angår således:
(1) Peptid, kjennetegnet ved at det består av aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 4, for anvendelse ved isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne.
(2) DNA, kjennetegnet ved at det koder for peptidet ifølge (1).
(3) Vektor, kjennetegnet ved at den inneholder DNA ifølge (2) og et kloningssete for cDNA ved 5'-oppstrøms-området for DNA.
(4) Vektor ifølge (3), kjennetegnet ved at den er avledet fra et retrovirus.
(5) Vektor ifølge (3) eller (4), kjennetegnet ved at et cDNA er innføyd i 5'-oppstrøms-området for DNA ifølge (2).
(6) Celle, kjennetegnet ved at den inneholder vektoren ifølge (5).
(7) Celle ifølge (6), kjennetegnet ved at den er en pattedyrcelle.
(8) Fremgangsmåte for undersøkelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, kjennetegnet ved at den omfatter (a) ligering av test-cDNA med vektoren ifølge (3);
(b) innføring av vektoren fremstilt under (a) i en IL-3-avhenigig
hematopoetisk celle; og
(c) dyrking av transformanten fremstilt under (b) og påvisning av celleproliferasjonsevne, hvori celleproliferasjonsevnen angir sekretorisk
evne.
(9) Fremgangsmåte for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne, kjennetegnet ved at den omfatter
(a) ligering av et cDNA-bibliotek med vektoren ifølge (3); (b) innføring av vektoren fremstilt under (a) i en IL-3-avhenigig hematopoetisk celle; (c) dyrking av transformanten fremstilt under (b) og påvisning av celleproliferasjonsevnen; og (d) seleksjon av en positiv celle som bedømmes til å ha celleproliferasjonsevne i (c), og isolering av cDNA fra cellen, hvori celleproliferasjonsevnen angir sekretorisk evne. (10) Fremgangsmåte ifølge (8) eller (9), kjennetegnet ved at vektoren er avledet fra et retrovirus, og cellen som skal motta vektoren er en pattedyrcelle.
Det beskrives en fremgangsmåte for påvisning av et DNA som koder for et peptid med sekretorisk evne. Deteksjonsmetoden omfatter anvendelse av et DNA som koder for et peptid som er i stand til å indusere celleproliferasjon gjennom dimerisering på celleoverflaten og som mangler sekretorisk evne, for påvisning av et peptid med sekretorisk evne. "Peptidet som er i stand til å indusere celleproliferasjon gjennom dimerisering på celleoverflaten" inkluderer her mpl (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5640-5644 (1992)), alfa-kjeden eller beta-kjeden av GM-CSF (Blood 83:2802 (1994)), erytropoietinreseptor (Nature 348:647 (1990)) c-sett-reseptor (Blood 85:790 (1995)), og neu (Nature 339:230 (1989)), men er ikke begrenset til disse. Ved fremgangsmåten beskrevet heri blir et cDNA konstruert for å kode for de ovenfor angitte peptider hvis sekretoriske evne er eliminert. Den sekretoriske evne blir vanligvis fjernet ved å deletere et område inneholdende signalsekvensen. Signalsekvensen av det humane mpl er for eksempel området som tilsvarer posisjoner 1 til 25 i aminosyresekvensen av proteinet (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5640-5644
(1992)) og signalsekvensen av beta-kjeden av det humane GM-CSF er området som tilsvarer posisjoner 1 til 48. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:9655-9659 (1990)). Fortrinnsvis blir det ekstracelllulære domene også deletert fra peptidet.
Peptidet som kodes for av et konstruert cDNA er fortrinnsvis liganduavhengig (hvis peptidet er ligandavhengig kan det miste ligandbindingsevnen og bli inaktivt etter dannelse av et fusjonsprotein). En metode for dannelse av et liganduavhengig peptid er for eksempel å innføre en mutasjon i peptidet. I tilfelle mpl kan substitusjonen av Ser 498 til Asn oppheve avhengigheten av liganden, trombopoietin (Blood 88:1399-1406) (1996)). mpl anvendt ved den foreliggende fremgangsmåte omfatter fortrinnsvis aminosyresekvensen som beskrevet i SEQ ID NO: 4.
DNA fremstilt som beskrevet ovenfor innføyes i en passende ekspresjons-vektor. Ekspresjonsvektoren er ikke begrenset og er fortrinnsvis en retrovirusvektor som kan innføres i forskjellige celler med høy effektivitet gjennom virusinfeksjon, og uttrykker stabilt DNA innføyd i vektoren i cellen. Eksempler på en retrovirusvektor inkluderer den som er utformet for cDNA-bibliotekskonstruksjon, slik som pBabeX (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 92:9146-9150 (1995)) eller pMX (Exp. Hematol. 24:324-329 (1996)). Virusvektorer, slik som adenovirus, EB-virus og papillomavirus, eller plasmidvektorer som pEF-BOS (Nucleic Acid Res. 18 (17)) og pcD SR a296 (Mol. Cell. Biol. Jan. 466-472 (1988)) kan også anvendes. Ekspresjonsvektorene bør ha et kloningssete for et cDNA som skal testes for dets sekretoriske evne 5'-oppstrøms for den ovenfor angitte DNA-innføyelse, for å uttrykke et fusjonsprotein. Metoden for å danne et kloningssete for et cDNA er kjent for fagfolk.
Den fremstilte vektor blir deretter ligert med et cDNA som skal testes. Test-cDNA ligeres 5'-oppstrøms i "DNA som koder for et peptid som er i stand til å indusere celleproliferasjon gjennom dimerisering på celleoverflaten" som innføyes i vektoren. Test-cDNA kan være ethvert cDNA som koder for et peptid hvis sekretoriske evne skal testes. Test-cDNA kan ligeres med en vektor i overensstemmelse med standard metoder. Ligeringsmetoden anvender for eksempel T4 DNA-ligase via en adapter' linker. (Maniatis T., Molekular Cloning).
Den fremstilte vektor blir deretter innført i en celle. Celler hvori vektoren er innført er ikke begrenset og inkluderer cytokinavhengige prolifererende celler, slik som Ba/F3, OTT-1, FDCP-1 og TF-1 celler. Vektorer kan innføres i celler ved anvendelse av standard metoder, inkludert lipofeksjon, kalsiumfosfatmetoden, DEAE-dekstranmetoden og elektroporering. Ved retrovirusinfeksjonsformidlet innføring blir vektoren innført i oppbevaringscellene og integrert i viruspartiklene. Vektoren kan innføres ved anvendelse av standard metoder, slik som kalsiumfosfatmetoden og lipofeksjon. Celler som BOSC23, Bing (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:8392-8396 (1993)) NX-E, og NX-A celler (Nolan G.P. Immunity 8:461-471
(1998), kan for eksempel anvendes som oppbevaringsceller.
De således fremstilte transformanter dyrkes deretter og undersøkes for deres proliferasjonsevne. Når et protein kodet for av DNA innføyd i vektoren uttrykkes som et fusjonsprotein med en liganduavhengig, aktiv cytokinreseptor, dyrkes transformanten i mediet som mangler cytokinet (ligand) som cellen avhenger av. Dersom det påvises en betydelig celleproliferasjon blir test-cDNA bedømt som en "positiv klon" som koder for et peptid som inneholder den sekretoriske evne. Alternativt, dersom det ikke påvises noe signifikant celleproliferasjon, blir cDNA bedømt som en "negativ klon" som koder for et peptid som mangler den sekretoriske evne. Når et protein kodet for av det innføyde cDNA uttrykkes som et fusjonsprotein med en ligandavhengig cytokinreseptor, dyrkes transformanten i nærvær av liganden. Dersom det påvises en signifikant celleproliferasjon, hvis nødvendig etter sammen-ligning med en negativ kontroll i fravær av liganden, blir test-cDNA bedømt som en "positiv klon". Andre betingelser for dyrkning av transformanter kan passende utvelges av en fagperson, avhengig av hvilke celletyper som vektoren innføyes i og beskaffenheten av fusjonsproteinet som skal uttrykkes.
Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for isolering av et cDNA som koder for et peptid som inneholder den sekretoriske evne. Ved denne fremgangsmåte blir et cDNA-bibliotek ligert inn i vektoren istedenfor det ovenfor angitte test-cDNA som anvendes for påvisning av cDNA som koder for et peptid som inneholder den sekretoriske evne. I en spesifikk utførelsesform av oppfinnelsen blir cDNA fremstilt ved anvendelse av en vilkårlig primer ligert med BstXI-adapteren og innføyd mellom de to BstXI-seter; det ene er til vektoren og det andre innføyes i det ekstracellulære spaltningssete i det aktive mpl. Kilden for cDNA-biblioteket er ikke begrenset til en spesifikk kilde, men kan være en celle eller et vev som et ønsket peptid inneholdende den sekretoriske evne kan isoleres fra. Mange standardmetoder kan anvendes for å konstruere et cDNA-bibliotek. Ved den foreliggende fremgangsmåte blir celler bedømt til å være i stand til proliferasjon utvalgt fra de cDNA-biblioteksinnførte celler. cDNA inneholdt i de utvalgte celler antas å kode for et peptid med den sekretoriske evne. cDNA kan isoleres fra cellene hvis proliferasjon er blitt påvist ved for eksempel ekstraksjon av det genomiske DNA eller RNA, amplifisering av cDNA av interesse ved hjelp av PCR ved anvendelse av primere utformet til å omfatte kloningssetene (i tilfelle med RNA, etter omdannelse av dette til DNA ved anvendelse av revers transkriptase), og gjenvinning av produktene.
Hvorvidt det gjenvunne cDNA er full-lengdet eller et fragment, eller hvorvidt det er et cDNA som koder for et nytt sekretorisk peptid, kan analyseres ved å sammenligne cDNA-sekvensen med sekvensene av de kjente proteiner i databasen. Dersom cDNA ikke er full-lengdet anvendes det for å screene et sekundært cDNA-bibliotek for å isolere et full-lengdet cDNA. Det sekundære cDNA-bibliotek kan konstrueres ved hjelp av en metode kjent for fagfolk, slik som de beskrevet i litteraturen (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utgave. Sambrook J. et al.,
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne, isolert ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan anvendes for å produsere et rekombinant protein som er anvendelig som en medisin eller ved genterapi av beslektede sykdommer. Et rekombinant protein fra det isolerte cDNA kan produseres ved hjelp av metoder kjent i teknikken. cDNA blir for eksempel innføyd i en passende vektor, slik som pED (Kaufman et al. Nucleic Acids Res. 19:4484-4490
(1991)), pEF-BOS (Mizushima et al. Nucleic Acids Res. 18:5322 (1990 pXM, pJL4 (Gough et al. EMBO J. 4:645-653 (1985)), vektoren innføres i en vertcelle, den resulterende transformant dyrkes for å tillate den å uttrykke et rekombinant protein, og det rekombinante protein renses.
Kort beskrivelse av figuren
Figur 1 viser skjematisk peptidene anvendt for påvisning av sekretorisk evne, og resultatet fra påvisning av cytokinuavhengig proliferasjonsevne hos BAF/03-celler gjennom ekspresjon av peptidene.
Beste måte for utøvelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er illustrert i detalj nedenfor med referanse til eksempler, men skal ikke oppfattes som begrenset til disse.
Eksempel 1. Vektorkonstruksjon
I muse-myeloproliferative leukemivirus blir env ligert til muse-mpl som omfatter det ekstracellulære domene bestående av 56 aminosyrer fra det transmembrane domene mot N-terminalen, det transmembrane domene og det intracellulære domene. PCR ble utført for å oppnå et cDNA som koder for det tilsvarende område det humane mpl, som er fra Leu (449) til stoppkodonet (636), med Notl-setet umiddelbart før Leu (449) (en enkel nukleotidinnføyelse) og Sall-setet umiddelbart etter stoppkodonet, for å være i rammen for GM-CSF-cDNA vist nedenfor. "pBabeX MPL" (Blood 88:1399-1406. (1996)), i hvilket aktivt humant mpl-cDNA er klonet, ble anvendt som et templat. Anvendte primere er oppført i tabell 1.
PCR ble utført i en reaksjonsblanding inneholdende 10 (ig/ml templat-DNA, 1 pM av hver primer, 50 U/ml KOD DNA-polymerase (TOYOBO), 1 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 120 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM KC1, 6 mM (NH4)2S04, 0,1 % Triton X-100, og (ig/ml BSA ved anvendelse av GeneAmpPCR-systemet (Perkin Eimer) under de følgende betingelser: denaturering ved 98 °C i 60 sekunder, etterfulgt av 25 sykluser ved 98 °C i 15 sekunder, 60 °C i 10 sekunder og 74 °C i 30 sekunder. PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på en agarosegel og en gelbit inneholdende et 0,6 kb fragment av interesse ble utskåret for å ekstrahere DNA. DNA ble deretter fosforylert ved dets 5'-terminaler med T4-polynukleotidkinase (TOYOBO), og ligert ved anvendelse av T4-DNA-ligase (TOYOBO) med pBlueskript SK(-)vektoren (Stratagene) som var forhåndsbehandlet med Smal (TaKaRa Shuzo) og bakteriell alkalisk fosfatase (BAP; TaKaRa Shuzo). Nukleotidsekvensen av det aktive mpl cDNA innføyd i det resulterende plasmid ble verifisert med ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Eimer). Plasmidet ble spaltet med Noti (TaKaRa Shuzo) og Sali (TaKaRa Shuzo), og separert ved elektroforese på en agarosegel for å isolere et 0,6 kb fragment. Fragmentet ble ligert med pMX (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92:9146-9150. (1995)), som også ble spaltet med Noti og Sali, behandlet med BAP og renset ved agarosegelelektroforese ved anvendelse av T4 DNA-ligase for å oppnå pMX v-mpl<M>. Plasmidet pMX v-mpl<M>inneholder et cDNA som koder for et aktivt mpl som mangler den sekretoriske evne. Nukleotidsekvensen av cDNA-innføyelsen og aminosyresekvensen av peptidet kodet for av cDNA er vist i henholdsvis SEQ ID NO: 3 og NO: 4.
For å oppnå et humant GM-CFS cDNA hvori stoppkodonet er erstattet med et Notl-sete, ble deretter PCR utført ved anvendelse av pcDSRa 298 hGM-CSF (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:4360-4364 (1985)) inneholdende det humane GM-CSF cDNA som et templat. Anvendte primere er vist i tabell 2.
EcoGM ble utformet til å inneholde translasjonsinitieringskodonet ATG istedenfor Ser (17), og som i EcoGMss og EcoGM, EcoRI-setet og Kozak-konsensus-sekvensen (J. Cell Biol. 108:29. (1989)) umiddelbart før ATG-kodonet. Primerpar av EcoGMss og GM Not ble anvendt ved PCR for å amplifisere GM-CSF inneholdende signalsekvensen, og EcoGM og GM Not ble anvendt for å amplifisere GM-CSF som mangler signalsekvensen. PCR ble utført som beskrevet ovenfor, unntatt at 55 °C ble anvendt som annealingstemperatur, og produktene ble klonet i pBluescript SK(-). Nukleotidsekvensen av DNA-innføyelsene ble verifisert ved anvendelse av ABIPRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Eimer). Plasmidene ble deretter spaltet med EcoRI (TaKaRa) og Noti og innføyd i EcoRI-Notl-setet av pMX v-mpl<M>som beskrevet ovenfor, og "pMX GM(+)v-mpl<M>" og pMX GM(-)v-mpl<M>" ble oppnådd. "pMX GM(+)v-mpl<M>" og pMX GM(-)v-mpl<M>" koder for et fusjonsprotein mellom den C-terminale del av det aktive mpl med start fra Leu (449) og hele GM-CSF med eller uten signalsekvensen. Nukleotidsekvensene for deres cDNA-innføyelser er vist som SEQ ID NO: 8 og NO: 10, og aminsosyresekvensene av proteinene som kodes for av cDNA er vist som SEQ ID NO: 9 og NO: 11.
Eksempel 2. Virusinfeksjon
Hver av de ovenfor beskrevne plasmider ble innført i oppbevaringsceller, cellelinje BOSC23 (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:8392-8396. (1993)) ved anvendelse av lipofektamin (Life Technologies). BOSC23-celler ble utspredt i 6 cm skåler (coming) med Dulbeccos modifiserte eagle medium (DMEM; Nissui Pharmacutical) inneholdende 10 % kalveserum (FCS; JHR Biosciences). Etter 6 timers inkubasjon ble cellene vasket med OPTI-MEM I-redusert serummedium (Life Technologies). Separat ble lipofektamin (18fil) fortynnet i 200 (il OPTI-MEM I blandet med 3 (ig prøver av hvert plasmid fortynnet i 200 (il OPTI-MEM I. De resulterende blandinger ble hensatt ved romtemperatur i 15 minutter, blandet med 1,6 ml OPTI-MEM I, og deretter tilsatt til cellene. Etter 5 timer ble 2 ml DMEM inneholdende 20 % FCS tilsatt til cellene som ble inkubert i ytterligere 19 timer. Mediet ble deretter erstattet med 3 ml DMEM inneholdende 10 % FCS, og kultursupernatanten ble gjenvunnet etter 24 timer. Museinterleukin-3 (IL-3) og 10 (ig/ml polybren (heksadimetrinbromid, Sigma) ble tilsatt til kultursupernatanten inneholdende det rekombinante virus, og Ba/F3-celler ble suspendert deri for infeksjon. Etter infeksjon i 24 timer ble cellene vasket to ganger i RPMI1640 (Nissui Pharmaceutical) inneholdende 10 % FCS uten muse-IL-3, og dyrkningen ble fortsatt i det samme medium.
Cellene inneholdende fusjonsproteinet mellom hele GM-CSF inneholdende signalsekvensen og det aktive mpl (avledet fra pMX GM(+)v-mpl<M>) vokste i fravær av IL-3, så vel som de celler som inneholdt det aktive mpl med den sekretoriske evne. I motsetning til dette vokste cellene inneholdende fusjonsproteinet mellom GM-CSF som manglet signalsekvensen og det aktive mpl (pMX GM(-)v-mpl<M>) ikke så godt som kontroll-Ba/F3-celler hvori det ikke var innført noe fusjonsprotein-ekspresjonsvektor (figur 1).
Eksempel 3. Screening
De følgende oligonukleotider (tabell 3) ble syntetisert og deres 5'-terminale ender ble fosforylert ved anvendelse av T4-polynukleotidkinase. Oligonukleotidene ble blandet og denaturert ved 95 °C og deretter annealed ved gradvis avkjøling til 40 °C for å fremstille kassett-DNA.
pMX GM(-)v-mpl<M>, som var spaltet med Noti (TaKaRa) og behandlet med BAP, ble blandet med kassetten og ligert ved anvendelse av T4 DNA-ligase. Retningen av kassetten i det resulterende plasmid ble verifisert ved DNA-sekvensering til å være i rekkefølgen BstXI ig Noti (pMX GM(-)v-mpl<M2>). Totalt RNA ble preparert fra rotteneuroblastcellelinjen MNS70 ved anvendelse av trisol-reagenset (GIBCO BRL) og passert gjennom oligo dT-kolonnen (Pharmacia) for å preparere polyA(+) RNA. Dobbelt-trådet cDNA ble syntetisert med den vilkårlige heksamer inneholdt i SuperScript Choice-systemet (GIBCO BRL). cDNA ble butt-endet, ligert med BstXI-adapteren (invitrogen) og fraksjonert ved anvendelse av SizeSep 400 Spun-kolonne (Pharmacia). cDNA ble deretter blandet og ligert med pMX GM(-)v-mpl<M>som ble spaltet med BstXI (TaKaRa) og behandlet med BAP, ved anvendelse av T4 DNA-ligase. DNA ble innført i DH10B E. coli (GIBCO BRL) ved elektroforering ved anvendelse av Gene Pulser (BiaRad) for å konstruere et cDNA-bibliotek. Plasmider ble ekstrahert fra de rekombinante E. coli inneholdende et cDNA-bibliotek og renset ved anvendelse av JETstar-kolonnen (GENOMED). Biblioteks-plasmidene ble innført i BOSC23-oppbevaringsceller ved anvendelse av lipofektamin som beskrevet ovenfor. Mule-IL-3 (10fig/ml) og 10 (ig/ml polybren (heksadimetrinbromid, Sigma) ble tilsatt til kultursupernatanten inneholdende det rekombinante virus, og Ba/F3-celler ble suspendert deri for infeksjon. Etter infeksjon i 24 timer ble cellene vasket to ganger med fosfatbuffer og dyrket videre i RPMI1640 inneholdende 10 % FCS. Det genomiske DNA ble preparert fra klonene som vokste i fravær av IL-3, og PCR ble utført ved anvendelse av primere utformet til å omfatte cDNA-innføyelsessete, for å gjenvinne cDNA-fragmentene.
PCR ble utført i 50 (il av reaksjonsblandingen innholdende 500 ng genomisk DNA, 500 pM av hver primer, 2,5 U TaKaRa LA Taq (TaKaRa), 2,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP, og den medfølgende buffer, ved anvendelse av GenAmp PCR-system 2400 ved den følgende prosess: denaturering ved 98 °C i 60 sekunder, etterfulgt av 30 sykluser ved 98 °C i 20 sekunder og 68 °C i 120 sekunder. PCR-produkter ble separert ved elektroforese på en agarosegel, gelbitene inneholdende de amplifiserte fragmenter ble utskåret og DNA ble renset. Nukleotidsekvensen av DNA-fragmentene renset fra de resulterende 190 kloner ble bestemt, og 150 kloner ble funnet å være cDNA som koder for et kjent sekresjonsprotein eller et membranprotein, eller deler derav. De andre 40 kloner ble funnet å kode for ukjente sekresjonsproteiner. Noen av de således oppnådde kjente sekretoriske proteiner er vist i tabell 5, hvor "lengde" indikerer lengden av ORF av det oppnådde cDNA-fragment ved antall aminosyrerester. Den gjennomsnittlige lengde av klonene som koder for et kjent sekresjonsprotein var 273 aminosyrerester. "Aksesjonsummer" indikerer aksesjonsummeret i GenBank-proteindatabasen. Det skal anføres at bakgrunnen ved den foreliggende metode, slik som påvisning av et cDNA som koder for et protein foruten et sekresjonsprotein, eller cDNA som ble innføyd i den motsatte retning, var 1 % eller mindre.
Industriell anvendelighet
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for påvisning og isolering av et cDNA som koder for et sekretorisk peptid, ved anvendelse av et peptid som er i stand til å utløse celleproliferasjon gjennom dets dimerisering på celleoverflaten, men som mangler den sekretoriske evne. Fordi fremgangsmåten anvender celleproliferasjon som en indeks for påvisning, er den ytterst lett og sensitiv. Sammenlignet med de konvensjonelle metoder som muliggjør påvisning av et kort DNA-fragment, muliggjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen påvisning og isolering av et cDNA som inneholder et lengre peptidkodingsområde, og tilveiebringer mer informasjon fra de først isolerte kloner. Fremgangsmåten muliggjør dessuten påvisning og isolering av sekretoriske proteiner, inkludert type I- og type II-membranproteiner.
Claims (10)
1. Peptid,karakterisert vedat det består av aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 4, for anvendelse ved isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne.
2. DNA,karakterisert vedat det koder for peptidet ifølge krav 1.
Vektor,karakterisert vedat den inneholder DNA ifølge krav 2 og et kloningssete for cDNA ved 5'-oppstrøms-området for DNA.
4. Vektor ifølge krav 3,karakterisert vedat den er avledet fra et retrovirus.
5. Vektor ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat et cDNA er innføyd i 5'-oppstrøms-området for DNA ifølge krav 2.
6. Celle,karakterisert vedat den inneholder vektoren ifølge krav 5.
7. Celle ifølge krav 6,karakterisert vedat den er en pattedyrcelle.
8. Fremgangsmåte for undersøkelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne,karakterisert vedat den omfatter (a) ligering av test-cDNA med vektoren ifølge krav 3; (b) innføring av vektoren fremstilt under (a) i en IL-3-avhenigig hematopoetisk celle; og (c) dyrking av transformanten fremstilt under (b) og påvisning av celleproliferasjonsevne, hvori celleproliferasjonsevnen angir sekretorisk evne.
9. Fremgangsmåte for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne,
karakterisert vedat den omfatter (a) ligering av et cDNA-bibliotek med vektoren ifølge krav 3; (b) innføring av vektoren fremstilt under (a) i en IL-3-avhenigig hematopoetisk celle; (c) dyrking av transformanten fremstilt under (b) og påvisning av celleproliferasjonsevnen; og (d) seleksjon av en positiv celle som bedømmes til å ha celleproliferasjonsevne i (c), og isolering av cDNA fra cellen, hvori celleproliferasjonsevnen angir sekretorisk evne.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9,
karakterisert vedat vektoren er avledet fra et retrovirus, og cellen som skal motta vektoren er en pattedyrcelle.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32491297 | 1997-11-26 | ||
| PCT/JP1998/005326 WO1999026978A1 (fr) | 1997-11-26 | 1998-11-26 | Procede de piegeage de signal-sequence |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20002670D0 NO20002670D0 (no) | 2000-05-25 |
| NO20002670L NO20002670L (no) | 2000-07-25 |
| NO330269B1 true NO330269B1 (no) | 2011-03-14 |
Family
ID=18171016
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20002670A NO330269B1 (no) | 1997-11-26 | 2000-05-25 | Peptid, DNA, vektor, celle, fremgangsmate for undersokelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, samt fremgangsmate for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6866998B1 (no) |
| EP (1) | EP1033374B1 (no) |
| JP (1) | JP3499528B2 (no) |
| KR (1) | KR100452008B1 (no) |
| CN (1) | CN1214041C (no) |
| AU (1) | AU1260799A (no) |
| CA (1) | CA2311678C (no) |
| HK (1) | HK1032065A1 (no) |
| IL (2) | IL136310A0 (no) |
| NO (1) | NO330269B1 (no) |
| RU (1) | RU2230751C2 (no) |
| WO (1) | WO1999026978A1 (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7879318B2 (en) * | 2006-01-23 | 2011-02-01 | Mcw Research Foundation, Inc. | Method of reducing the effects of ischemia by administration of a thrombopoietin receptor ligand |
| KR20130080444A (ko) | 2010-05-25 | 2013-07-12 | 도쿠리츠교세이호진 고쿠리츠간켄큐센터 | 생체 외에서 자기 복제 가능한 유도 전암 간세포 또는 유도 악성 간세포, 이들의 제조 방법, 및, 이들 세포의 응용 |
| US20140137274A1 (en) | 2011-11-30 | 2014-05-15 | Lsip, Llc | Induced malignant stem cells |
| WO2020180694A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Allogene Therapeutics, Inc. | Constitutively active chimeric cytokine receptors |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2879303B2 (ja) | 1993-01-14 | 1999-04-05 | 佑 本庶 | ｃＤＮＡライブラリーの作製方法、および新規なポリペプチドとそれをコードするＤＮＡ |
| US5536637A (en) * | 1993-04-07 | 1996-07-16 | Genetics Institute, Inc. | Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast |
| US5675062A (en) * | 1994-07-18 | 1997-10-07 | President And Fellows Of Harvard College | Cellular basis of transplant arteriosclerosis in mice |
| AU6045196A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Zymogenetics Inc. | Secretion leader trap cloning method |
| JP2002238557A (ja) | 1996-07-23 | 2002-08-27 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | トランスメンブレントラップ法 |
| JPH1132779A (ja) | 1997-07-24 | 1999-02-09 | Fujita Gakuen | 蛋白質の遺伝子クローニング法 |
-
1998
- 1998-11-26 CA CA002311678A patent/CA2311678C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-26 KR KR10-2000-7005715A patent/KR100452008B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-26 US US09/555,165 patent/US6866998B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-26 IL IL13631098A patent/IL136310A0/xx active IP Right Grant
- 1998-11-26 RU RU2000116268/13A patent/RU2230751C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-11-26 JP JP2000522134A patent/JP3499528B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-26 EP EP98955942A patent/EP1033374B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-26 CN CNB988129698A patent/CN1214041C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-26 AU AU12607/99A patent/AU1260799A/en not_active Abandoned
- 1998-11-26 WO PCT/JP1998/005326 patent/WO1999026978A1/ja not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-05-23 IL IL136310A patent/IL136310A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-25 NO NO20002670A patent/NO330269B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-05 HK HK01101587.6A patent/HK1032065A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100452008B1 (ko) | 2004-10-08 |
| JP3499528B2 (ja) | 2004-02-23 |
| EP1033374A4 (en) | 2006-06-14 |
| CN1285847A (zh) | 2001-02-28 |
| CA2311678C (en) | 2006-09-19 |
| HK1032065A1 (en) | 2001-07-06 |
| US6866998B1 (en) | 2005-03-15 |
| NO20002670D0 (no) | 2000-05-25 |
| KR20010032473A (ko) | 2001-04-25 |
| EP1033374A1 (en) | 2000-09-06 |
| IL136310A0 (en) | 2001-05-20 |
| NO20002670L (no) | 2000-07-25 |
| WO1999026978A1 (fr) | 1999-06-03 |
| EP1033374B1 (en) | 2012-08-01 |
| AU1260799A (en) | 1999-06-15 |
| CA2311678A1 (en) | 1999-06-03 |
| CN1214041C (zh) | 2005-08-10 |
| IL136310A (en) | 2007-06-03 |
| RU2230751C2 (ru) | 2004-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1243650B1 (en) | Process for constructing a cDNA library | |
| US7968681B2 (en) | c-MET kinase binding proteins | |
| EP1009814B1 (en) | Human receptor tyrosine kinase, kdr | |
| KR20210019993A (ko) | Τ 세포 수용체 및 이를 발현하는 조작된 세포 | |
| JP2004000282A (ja) | 酵母におけるｇタンパク質結合受容体の発現 | |
| CN112375784A (zh) | 制备重组新型冠状病毒Spike蛋白的方法 | |
| AU2002222454B2 (en) | Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems | |
| CN111440244A (zh) | 靶向vegfr2的转移性癌疫苗 | |
| US20100184619A1 (en) | Method for analyzing organelle-localized protein and material for analysis | |
| CA2407872C (en) | Receptor-based interaction trap | |
| NO330269B1 (no) | Peptid, DNA, vektor, celle, fremgangsmate for undersokelse av hvorvidt et peptid som kodes for av et cDNA som skal testes inneholder sekretorisk evne, samt fremgangsmate for isolering av et cDNA som koder for et peptid med sekretorisk evne | |
| JP3678233B2 (ja) | 核移行蛋白質をコードする遺伝子の検索法 | |
| CN112877309B (zh) | 一种N端延长型PTEN亚型PTENζ蛋白及其编码基因和应用 | |
| WO1999053033A1 (en) | Methods and compositions for high yield production of eukaryotic proteins | |
| AU2002301561B2 (en) | Signal Sequence Trapping Method | |
| CN112867791A (zh) | 用于转导蛋白质-蛋白质相互作用的新方法 | |
| CN114703229B (zh) | 一种基于人源细胞的表面展示技术及靶向hbv受体的多肽及其应用 | |
| EP0939119A1 (en) | Transmembrane trapping methods | |
| CN115850441B (zh) | 一种特异性靶向降解egfr及其突变体的重组蛋白、制备方法及其应用 | |
| CN108191979B (zh) | 一种荧光互补检测人趋化因子生物学活性的方法 | |
| JP2003505043A (ja) | 血清アルブミンのキメラポリペプチド及びそれらに関する利用 | |
| CN102766202A (zh) | Phf14 c端蛋白、其多克隆抗体及应用 | |
| CN111329991A (zh) | TgCPC1在制备抑制炎症反应的药物中的应用 | |
| JP2000152792A (ja) | 新規ｇ蛋白質共役型受容体蛋白質、ｄｎａおよびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: TOSHIO KITAMURA, JP |
|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |