JP2003505043A - 血清アルブミンのキメラポリペプチド及びそれらに関する利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は血清アルブミンたんぱくを生物学的に活性化した一つ以上の異種ペプチド配列を含むように変化させたキメラポリペプチドに関連する。キメラポリペプチドは血清アルブミンたんぱく断片由来の、半減期が改善された血清と結合した異種ペプチド断片に関連する治療活性を示すと考えられる。異種ペプチド配列は血管形成阻害、抗ガン活性、アポトーシスの誘発などの生物学的効果を促進するように選択されてよい。治療効果はキメラポリペプチドの直接投与、またはこのようなキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを形質移入した細胞により実現されると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、その明細書全文を参照によってここに編入することとする、１９９
９年７月１９日出願の米国暫定出願６０／１４４，５３４号に基づくものである
。

【０００２】 発明の背景 近年における組換えＤＮＡ技術の進歩により、幅広い生物活性なペプチドが得
られるようになった。しかし、例えば連結遺伝子の融合又は部位指定変異誘発法
などの分子リモデリングによって、至適活性に適合性ある性質を、このようなタ
ンパク質にもたらすことができた事例もあるが、一般的には、送達系を利用して
初めて、これらの生成物を効果的に利用することができる。

【０００３】 ポリペプチド治療薬は、数多くの疾患の治療面での期待が高いが、ペプシン及
びトリプシンなどの胃液及び腸管蛋白分解酵素で簡単に分解されてしまう。その
結果、これらのポリペプチドを経口投与した場合、これらはほとんど吸収されず
、また何の効果的な薬理作用も生じない。所望の生物活性を得るため、現在では
通常、ポリペプチドを注射可能な投薬型に調剤している。しかしながら、注射経
路は患者にとって、特に投与を規則的かつ頻繁に行わねばならない場合に、不便
かつ苦痛である。従って、近年では、このようなポリペプチドを投与する代替的
な方法の研究に、力が注がれている。

【０００４】 このような治療薬は通常、血中での半減期が短く、腎臓で急速に排出されるか
、又は、細網内皮系（ＲＥＳ）及びその他の組織で取り込まれる。このような時
期尚早な薬剤喪失を補うためには、処置の必要な部位に充分な量の薬剤が集中す
るよう、大量の投薬が必要である。しかしながら、これは費用がかかるだけでな
く、毒性や、外来のタンパク質に対する免疫応答を引き起こす場合がある。持続
放出製剤(Putney, S.D. et al. Nature Biotechnology 1998, 16, 153-157) で
は、一般には必要な投薬量は少ないが、注射又はより不快感の大きい送達型に依
存している。体内での半減期がより長い治療用タンパク質であれば、持続放出製
剤と同じように血中レベルも安定し、持続放出製剤を調製する際の難しさもなく
、破壊される速度も遅いために必要な投薬量もより少なくなるであろう。例えば
、インターフェロン（IFN-ガンマ）及びインターロイキン−２（IL-2）などのサ
イトカインはより効果的で、より毒性が低く、またもしそれらの血中での存在時
間を延長できれば、より少量にして利用できるであろう。

【０００５】 発明の概要 本発明の一態様は、血清アルブミンたんぱく又はその相同体に挿入された生物
活性な異種のペプチドフラグメントを含むキメラポリペプチドを提供するもので
ある。この異種のペプチドフラグメントは、選択によっては、血清アルブミンた
んぱく配列の一部を置換していてもよい。血清アルブミンたんぱく配列の一部を
置換するペプチドフラグメントは、必ずしも、それが置換するフラグメントと同
じ長さでなくともよい。この態様に基づくキメラポリペプチドには、血清アルブ
ミンたんぱく配列の一部を置換する二つ以上の異種のペプチドフラグメントが含
まれていてもよい。この含まれたフラグメントは、同一でもよく、血清アルブミ
ンたんぱくに関係のない一タンパク質の別個の配列でもよく、又は、由来が無関
係である別個の配列でもよい。

【０００６】 この態様によるキメラポリペプチドは、例えば、構造A-B-Cを含んでいてもよ
く、但しこの式中、Aは一個の血清アルブミンたんぱく又はその相同体の第一フ
ラグメントを表し、Bは生物活性な異種のペプチド配列を表し、そしてCは一個の
血清アルブミンたんぱく又はその相同体の別のフラグメントを表す。同様に、キ
メラポリペプチドは構造A-B-C-D-Eを含んでいてもよく、但しこの式中、A、C、 及びEは一個の血清アルブミンたんぱくのいくつかのフラグメントを表し、そし
てB及びDは、同一の生物活性な異種のペプチド配列か、血清アルブミンたんぱく
に関係のない一タンパク質の二つの異なる生物活性な配列か、又は、血清アルブ
ミンたんぱくに関係のない二つの異なるタンパク質の二つの異なる生物活性な配
列、を表す。同様に、キメラポリペプチドは、構造A-B-C-D-E-F-Gを含んでいて
もよく、但しこの式中、A、C、E、及びGは一個の血清アルブミンたんぱくのいく
つかのフラグメントを表し、そしてB、D、及びFは、同一の生物活性な異種のペ
プチド配列か、血清アルブミンたんぱくに関係のない一タンパク質の少なくとも
二つの異なる生物活性な配列か、又は、血清アルブミンたんぱくに関係のない二
つの異なるタンパク質の少なくとも二つの異なる生物活性な配列、を表す。いく
つかの実施例では、血清アルブミンのペプチドフラグメント又は異種のペプチド
配列は、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、又は少なく
とも１８個のアミノ酸を含有する。

【０００７】 キメラポリペプチドは、例えば -HN-(A-B-C)_n-CO- 又はH₂N-(A-B-C)_n-CO₂H,な
ど、構造(A-B-C)_nを含んでいてもよく、但しこの式中、Aは、式中それぞれ個別
に、血清アルブミン(SA）の一フラグメントを表し、Bは、式中それぞれ個別に、
生物活性な異種のペプチド配列を表し、Cは、式中それぞれ個別に、第二の生物
活性な異種のペプチド配列か、又は、血清アルブミン（SA）の一フラグメントを
表し、そしてnは0より大きい整数である。いくつかの実施例では、血清アルブミ
ンの一ペプチドフラグメント、又は、異種のペプチド配列は、少なくとも６個の
アミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、又は少なくとも１８個のアミノ酸を含
有する。

【０００８】 代替的には、このようなキメラポリペプチドは、血清アルブミンたんぱく又は
その相同体のＮ末端フラグメントと、生物活性な異種のペプチド配列と、血清ア
ルブミンたんぱく又はその相同体のＣ末端フラグメントとを含んでいてもよい。
前記異種のペプチド配列は、約３から約５００残基長か、又は、約４から４００
残基長であってよいが、好ましくは約４から２００残基長、より好ましくは約４
から１００残基長、そして最も好ましくは約４から約２０残基長であるとよい。

【０００９】 一実施例では、当該のキメラポリペプチドは、１０日以上、好ましくは約１４
日以上、そして最も好ましくは天然のアルブミンたんぱく又はその相同体の半減
期の５０％以上である、血中半減期を有する。

【００１０】 別の実施例では、当該異種のペプチド配列は、細胞表面受容体タンパク質に結
合することができる。このような受容体タンパク質の例には、Ｇたんぱく共役受
容体、チロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、MIRR受容体、及びオーフ
ァン受容体がある。

【００１１】 別の実施例では、当該キメラポリペプチドは、細胞外受容体又はイオンチャン
ネルに結合することができる。該キメラポリペプチドは細胞外受容体又はイオン
チャンネルのアゴニストでも、又はアンタゴニストでもよい。この実施例のキメ
ラポリペプチドは、例えば、アポトーシスを誘導する、細胞増殖を変調する、又
は細胞種の分化を変調するであろう。

【００１２】 さらに本発明は、上記のキメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【００１３】 さらに本発明は、該キメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ウィル
ス又はレトロウィルスベクタなどの送達ベクタを含む。適したベクタには、例え
ばアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィ
ルス、又はワクシニアウィルスなどがあるであろう。

【００１４】 さらに本発明は、上記のキメラポリペプチドを含む薬剤組成物と、このような
薬剤組成物を生物に有効量投与することにより、前記生物の疾患を処置する方法
とを含む。現在好適な実施例では、本発明に基づくキメラポリペプチドは、アン
ジオスタチン又はエンドスタチンなどの脈管形成阻害たんぱくの一フラグメント
を異種のペプチド配列として含み、脈管形成を阻害することができる。例えば、
脈管形成を阻害し、かつ当該のポリペプチドに取り入れてもよいペプチドフラグ
メントは、RGD（Arg-Gly-Asp)か、又は、（例えば VRGDFなど）配列 RGDを含む
配列である。細胞増殖、細胞分化、及び細胞死などの状態を変調するのに同様な
方法を用いてもよい。

【００１５】 現在好適な実施例では、本発明は、導入した遺伝物質が、生物のトランスフェ
クトされた細胞で発現するよう、血清アルブミンたんぱく又はその数分節と、一
つ又はそれ以上の治療用タンパク質又はポリペプチド又はそのフラグメントとを
含むキメラポリペプチドタンパク質をコードする遺伝物質を生物の細胞に導入す
ることにより、前記生物の疾患を処置する方法を提供するものである。細胞増殖
、細胞分化、及び細胞死などの状態を変調するのに同様な方法を用いてもよい。

【００１６】 別の態様では、本発明は、血清アルブミンたんぱく又はその数分節と、一つ又
はそれ以上の治療用タンパク質又はポリペプチド又はそのフラグメントとを含む
キメラポリペプチドをコードする遺伝物質を、標的細胞に、この細胞に前記遺伝
物質を取り込ませるのに充分な条件下で、エクスビボで導入することで、前記タ
ンパク質又はポリペプチドをコードする前記遺伝物質をこの細胞に発現させるこ
とにより、生物の疾患を処置する方法を提供するものである。次に、前記タンパ
ク質又はポリペプチドをコードする、導入された遺伝物質が当該生物の標的細胞
によって発現されるよう、この標的細胞をホスト生物に導入する。標的細胞は、
血球、骨格筋細胞、平滑筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌腺細胞、造血
細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択することができる。

【００１７】 本発明の別の態様は、本発明のキメラタンパク質又はポリペプチドをコードす
る核酸を含む送達ベクタに暴露してある標的細胞を含むトランスフェクトされた
細胞を提供する。これらの細胞は、好ましくは、血球、骨格筋細胞、平滑筋細胞
、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌腺細胞、造血細胞、及び骨髄細胞からなる群
より選択されるとよい。

【００１８】 発明の詳細な説明 ここに開示した系及び方法は、血清アルブミン（SA）の数分節と、生物活性な
異種のペプチド配列の数分節とを含有するキメラポリペプチドを作製することに
より、血流中での治療用ポリペプチドの寿命を向上させることを狙いとしている
。SAは循環系の主要なタンパク質成分であり、約３週間という血中半減期を有し
(Rothschild, M.A. et al. Hepatology 1988, 8, 385-401)、多量に存在する(血
清中40 g/L )。また、正常な成人ヒト肝臓は一日当たり約１５グラム又は体重１
キログラム当たり約２００ｍｇのヒト血清アルブミン（HSA）を生産することが
知られている。血清アルブミンは何ら免疫活性又は酵素機能を有さず、多くの天
然及び治療的分子を輸送するのに用いられる天然の担体タンパク質である。治療
用ポリペプチドを血清アルブミンに共有結合させてある融合タンパク質が、治療
ペプチド自体の半減期よりも数倍長い血清半減期を有することが示唆されている
（Syed, S. et al. Blood 1997, 89, 3243-3252; Yeh, P. et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1992, 89, 1904-1908)。この引用文献の両方で、この融合タン
パク質の半減期は、治療用ポリペプチド自体のそれよりも１４０倍長く、融合さ
せていない血清アルブミンの半減期に達していた。さらに、血清アルブミンのア
ミノ末端は、真核細胞でその融合タンパク質を特に効率的に転位及び輸出させる
のに好都合であることが示されている(PCT 公報 WO 90/13653)。大まかに言って
、このことは、このようなタンパク質が、このようなタンパク質を産生する細胞
によって、遊離型の治療用ポリペプチド自体よりも効率的に分泌されることを意
味している。

【００１９】 薬剤送達という観点から見ると、血清アルブミンたんぱくのキメラポリペプチ
ドには大きな期待が持てるが、それはなぜなら、血清アルブミンは身体全体の組
織及び分泌物に見られるからである。例えば、血清アルブミンは、肝臓、腸管、
腎臓、及び脳などの臓器への、臓器−循環系界面を横切った化合物の輸送を担っ
ていることも公知である。従って、血清アルブミンのキメラタンパク質は、血液
脳関門ですらかいくぐって、身体内のあらゆる箇所でそれらの生物活性を発現で
きるであろう。

【００２０】 SAの三次元構造及び化学的作用がよく研究されている(Carter, D.C. et al. E
ur. J. Biochem. 1994, 226, 1049-1052; He, X.M. et al. Nature 1992, 358,
209-215; Carter, D.C. et al. Science 1989, 244, 1195-1198)。このように、
上記のような、簡単な、２成分の融合タンパク質に依拠するのではなく、SAタン
パク質のいくつかの部分を、戦略的かつコンビナトリアル的に、治療用ポリペプ
チドで置換してもよい。

【００２１】 コンビナトリアル変異誘発の技術を、構造を動機とした移植法と組み合わせて
用いれば、生物活性なペプチドフラグメントを持つと共に三次構造が血清アルブ
ミンに略同様である多くの関連するポリペプチドのライブラリをランダムに作製
することができる。例えば、本発明のキメラポリペプチドに、生物活性な異種の
ペプチド配列を、血清アルブミンたんぱくのペプチド配列に挿入した状態で含め
てもよい。この挿入された配列は、選択に応じ、血清アルブミン配列の一部を置
換していてもよく、この部分は同様な長さでも又は異なる長さであってもよい。
場合によっては、所望の生物活性を得るには二つ以上の挿入が必要なこともある
かも知れない。代替的には、生物活性な異種のペプチド配列が、一個の血清アル
ブミン配列のうちの二つのフラグメントの間に位置しているような、このような
キメラポリペプチドを形成してもよい。選択によっては、一つ又はそれ以上の更
なる生物活性なペプチド配列を、血清アルブミンたんぱくのフラグメントの間に
配置してもよい。さらに本発明のキメラポリペプチドを、一方の側で血清アルブ
ミンたんぱくのＮ末端フラグメントによって、そして他方の側で血清アルブミン
たんぱくのＣ末端フラグメントによって挟まれた、生物活性な異種のペプチド配
列であると記述してもよいであろう。

【００２２】 このようなキメラポリペプチドの利点は、構造が血清アルブミンたんぱくに似
ているために、外来のペプチドを分解する生物機序に対し、公知の融合タンパク
質よりも効果的にこれらのポリペプチドをカモフラージュできると考えられるこ
とであり、それはなぜなら、その外来のポリペプチドフラグメントが、生物体内
で広汎に存在するタンパク質に略同様な一個のタンパク質上に乗っているからで
ある。このようなタンパク質は、血清アルブミンの有利な性質（非免疫原性、高
レベルの発現、効率的な分泌、及び長い半減期）を残している一方、望ましい生
物学的機能をさらに有しているであろう。

【００２３】 このようなキメラポリペプチドの持つ多くの治療的用途が、当業者には明白で
あろう。例えば、細胞増殖を阻害するペプチドフラグメントを含めると、癌や、
当業者に公知である細胞増殖を特徴とする他の疾患の処置薬として役立つかも知
れない。未熟細胞の特定の細胞種への分化を変調するペプチドフラグメントを含
めると、例えば神経損傷及び神経変性疾患などの神経状態や、膵組織の過形成性
及び新形成性異常、及び、組織の望ましくない増殖及び分化を特徴とする他の状
態の処置薬として効果的であろうキメラポリペプチドが、作製されよう。アポト
ーシスを誘導するペプチドフラグメントを含めると、例えば癌や、アポトーシス
治療になじむものとして当業者に公知の他の状態など、望ましくない細胞増殖を
特徴とする疾患の処置に効果的なポリペプチドが得られるであろう。 例えばア
ンジオスタチン又はエンドスタチンの一フラグメントなど、抗脈管形成性ペプチ
ドフラグメントを含めると、癌や、脈管形成が原因で生ずる又は脈管形成で可能
となる他の状態の処置に有用なキメラポリペプチドが生成されるであろう。

【００２４】 定義 用語「ペプチド」とは、その単量体が、アミド結合を通じて相互に接合された
アミノ酸（多くの場合アルファアミノ酸）であるオリゴマを言う。ペプチドとは
、二つ又はそれ以上のアミノ酸単量体の長さであるが、より多くの場合、５から
１０個のアミノ酸単量体長であり、さらに長くて、即ち最長で２０個以上のアミ
ノ酸長であることもあるが、２０個のアミノ酸長を越えるペプチドは「ポリペプ
チド」と呼ばれる場合が多い。用語「タンパク質」は当業で公知であり、通常は
、いくつかの生物学的機能を有する、大変大型のポリペプチドか、又は、一組の
会合した相同の又は異種のポリペプチドを言う。本発明の目的のためには、用語
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、三つの種類すべてが
まとめてペプチドと呼ばれているため、概ね互換可能である。

【００２５】 タンパク質及びポリペプチドを記述するのにここで用いられた、互換可能であ
る用語「融合」及び「キメラ」は、二つの個々のポリペプチド又はその部分が融
合して一個のアミノ酸の鎖が形成されているようなポリペプチド又はタンパク質
に関するものである。このような融合は、組換えＤＮＡ技術により形成された一
個の連続したコーディング配列を発現させることで、起きるであろう。このよう
に、「融合」ポリペプチド及び「キメラ」ポリペプチドには、第一のポリペプチ
ドを、この第一のポリペプチドのいかなるドメインにとっても外来であり、かつ
略相同でないポリペプチドドメインを規定する一つ又はそれ以上のアミノ酸配列
に、一個のアミド結合を介して共有結合させて含む連続したポリペプチドが含ま
れる。

【００２６】 融合タンパク質をコードする遺伝子作製物も同様に「キメラ遺伝子」又は「融
合遺伝子」と言及する。

【００２７】 「相同性」及び「同一性」はそれぞれ、二つのポリペプチド配列間にある配列
の類似性を言い、同一性がより厳密な比較である。相同性及び同一性はそれぞれ
、比較を目的としてアライメントしてもよい各配列中の一カ所を比較することで
、決定することができる。比較の対照となった配列中の一カ所に同じアミノ酸残
基が来ている場合、これらポリペプチドはその位置において同一であると言うこ
とができ、同等な部位に同じアミノ酸（例えば同一）又は類似のアミノ酸（例え
ば立体化学的及び／又は電子的性質で類似であるなど）が来ている場合、それら
の分子はその位置において相同であると言うことができる。配列間の相同性又は
同一性のパーセンテージは、それら配列が共有する一致した又は相同な位置の数
の関数である。「関係のない」、「異種の」、又は「相同でない」配列は、比較
の対象となった配列に対して、４０パーセント未満の同一性を持つものであるが
、好ましくは２５パーセント未満の同一性を有するとよい。このように、「異種
のペプチド配列」とは、比較の対象となった配列に対して略異なるペプチド配列
である。

【００２８】 用語「血清アルブミン」（SA）には、生物の血清アルブミンたんぱく、好まし
くはほ乳類の血清アルブミン、さらにより好ましくは公知の又は未知の多型のヒ
ト血清アルブミン（HSA）、及びそれらの変異型が含まれる（しかし必ずしもこ
れらに限定されない）ものと、意図されている。例えば、ヒト血清アルブミンナ
スカピはGlu-372の代わりにLys-372を有し、そしてアルブミンクライストチャー
チは、変化したプロ配列を有する。用語「変異体」には、配列中に小さな人工的
変更を持たせたSAたんぱくの相同体（例えば、１個又は２、３個の残基がなかっ
たり、保存的置換があったり又は残基が僅かに挿入されていたり、又はアミノ酸
構造に小さな変更がしてある分子など）が含まれる（しかし必ずしもこれらに限
定されない）ものと、意図されている。このように、天然のSAに対して８０％、
８５％、９０％、又は９９％の相同性を有するポリペプチドは、「変異体」とみ
なされる。さらに、このような変異体が、天然SAと少なくとも一つの薬理学的実
用性を共有していることも好ましい。薬理学的利用を意図した推定上のいかなる
変異体も、処置しようとする動物（特にヒト）において非免疫原性でなければな
らない。数多くの考察された血清アルブミンの配列は、ヒト、ウシ、マウス、ブ
タ、ウマ、ヒツジ、及びニワトリ血清アルブミンを含め、ジェンバンク（ナショ
ナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション）から入手
できる。

【００２９】 用語「天然」は、生物で天然で発生するタンパク質を記述する際に用いられて
いる。従って、野生型タンパク質とは天然タンパク質である。天然でないタンパ
ク質とは、人工的な変異、組換えによる設計、又は他の研究室での改変で生じた
ものであり、天然集団内では知られていない。

【００３０】 「保存的置換」とは、ポリペプチド・ケミストリーの当業者が、当該ポリペプ
チドの少なくとも二次構造、そして好ましくは三次構造が大きく変化していない
と予測できる範囲で、一個又はそれ以上のアミノ酸が類似の性質を持つ他のもの
に置換されているものである。例えば、このような置換の典型には、グルタミン
のアスパラギンへの置換、アスパラギンのセリンへの置換、及びリシンのアルギ
ニンへの置換がある。用語「生理学的に機能的な等価物」はさらに、天然の配列
と、Ｎ末端に更なる配列とを含むより大型の分子（例えばプロ-HSA、プレ−プレ
-HSA及びメト-HSA）を包含するものである。

【００３１】 「三次構造」とは、タンパク質の三次元構造を言う。類似の三次構造を有する
タンパク質は、たとえそのアミノ酸配列（「二次構造」が同一でなくとも、類似
の形状及び表面を有すると予測できる。三次構造は、アミノ酸の鎖同士の折り畳
みやねじれが原因で生じ、例えば強酸又は塩基などの化学的手段や、又は加熱な
どの物理的手段によって、破壊することができる。

【００３２】 用語「生物活性な」とは、ある生物と、分子レベルで何らかの態様で相互作用
する物質を言う。生物活性な物質は、受容体を活性化したり、免疫反応を惹起し
たり、膜もしくはイオンチャンネルと相互作用したり、又は、生物又は生物の何
らかの部分の生物学的機能の変化を誘導したりする。

【００３３】 用語「リガンド」とは、受容体などのある特定のタンパク質によって認識され
る分子を言う。あるタンパク質と結合する又は反応するいかなる物質も「リガン
ド」と呼ばれ、従ってこの用語は、触媒反応における酵素の基質や反応物を包含
する。用語「リガンド」は、当該の物質が一個のタンパク質に結合できる又は相
互作用できる点以外では、いかなる特定の分子サイズ又は他の構造上もしくは組
成上の特徴を意味するものではない。「リガンド」は、タンパク質が結合する相
手である天然のリガンドか、又は、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用で
きる機能的類似体のいずれかとして働くものであろう。

【００３４】 用語「ベクタ」とは、ホストの細胞内で複製でき、組換えＤＮＡ分子を構築す
るために中に遺伝子を挿入することができるＤＮＡ分子を言う。ベクタの例には
、プラスミド、及びウィルスなどの感染性微生物や、又は、リガンド-ＤＮＡ共
役体、リポソーム、又は脂質−ＤＮＡ複合体などの非ウィルス性のベクタがある
。

【００３５】 ここで用いる「細胞表面受容体」とは、細胞表面上にあって、細胞外環境と相
互作用し、そして、細胞内のセカンド・メッセンジャの活動又は特定のプロモー
タの転写を変調することで特定の遺伝子の転写を起こさせるような態様で、この
環境に関する情報を細胞内で（直接又は間接的に）輸送又は伝達する分子を言う
。

【００３６】 ここで用いる「細胞外シグナル」には、シグナルと直接又は間接的に相互作用
する細胞表面たんぱくを介して細胞内を伝達される分子又は細胞外環境の他の変
化が含まれる。細胞外シグナル即ちエフェクタ分子には、細胞表面たんぱくの活
性を何らかの態様で変化させるあらゆる化合物又は物質が含まれる。このような
シグナルの例には、限定する訳ではないが、細胞表面受容体及び／又は細胞内受
容体及びイオンチャンネルに結合して、このような受容体及びチャンネルの活性
を変調するアセチルコリン、成長因子及びホルモンなどの分子、脂質、糖類及び
ヌクレオチドがある。

【００３７】 ここで用いる「細胞外シグナル」にはさらに、細胞受容体の活性を変調して細
胞内の機能に影響を与えるような未知の物質が含まれる。このような細胞外シグ
ナルは、特定の細胞表面受容体の活性を変調することにより、特定の疾患を処置
するのに利用できる潜在的な薬理学的物質である。

【００３８】 「オーファン受容体」とは、それに対して特異的な天然リガンドが解説された
ことがない、及び／又は、機能が何ら決定されていない受容体に与えられた名称
である。

【００３９】 ここで用いる用語「標的細胞」は、その内部に外生の遺伝物質を導入したいイ
ンビボ又はエクスビボの細胞を意味する。標的細胞は、血球、骨格筋細胞、幹細
胞、皮膚細胞、肝細胞、分泌腺細胞、造血細胞、及び骨髄細胞を含め、いかなる
種類の細胞であってもよい。

【００４０】 本発明の処置法に関して言う、融合ポリペプチドの「有効量」とは、所望の投
薬計画の一部に利用したときに、臨床上容認可能な標準に基づいた異常の軽減又
は治癒に至るような脈管形成の阻害を引き起こす、一製剤中の当該ポリペプチド
の量を言う。

【００４１】 ここで用いる「血清半減期」とは、血流中のあるペプチドの半分の量が分解す
るのに要する時間を言う。

【００４２】 例示 上述のように、本発明のキメラポリペプチドは、血清アルブミンの少なくとも
一部に相同な配列と、一つ又はそれ以上の異種のタンパク質の少なくとも一部分
とを含有するキメラポリペプチドを、一個の連続したポリペプチド鎖として発現
させることで、作製が可能である。該キメラポリペプチドを作製する際には、血
清アルブミンと、異種のタンパク質と、選択に応じ、該フラグメント間を埋める
ペプチドリンカー配列の、それぞれ少なくとも一つの配列をコードするＤＮＡを
含む融合遺伝子を作製する。二つ以上の異種の配列を該キメラポリペプチド内に
含める場合、それらは同一でも、関係があっても、又は関係がない配列でもよい
。同一の配列を含めて、当該配列の有効濃度を高めてもよい。関係のある配列を
含めて、由来となった天然タンパク質をより正確に模倣するものとしてもよい。
関係のない配列は、同じ応答を刺激する二つ又はそれ以上の別々の受容体を活性
化させたり、又は、該キメラポリペプチドに二つ又はそれ以上の異なる活性をも
たらすのに、有用であろう。例えば、該キメラポリペプチドに、抗脈管形成活性
を有する配列と、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する配列とを含めてもよいかも
知れない。

【００４３】 このキメラポリペプチドを作製するには、タンパク質全体をクローンし、この
タンパク質の一部として発現させてもよく、又は代替的には、生物活性な部分を
含有するその適したフラグメントを利用することもできる。翻訳産物が所望のキ
メラポリペプチドとなる融合遺伝子を作製する組換えＤＮＡ技術の利用は、当業
者に公知である。遺伝子のコーディング配列と、その調節領域の両方を設計し直
して、当該タンパク質生成物の機能的性質か、生成するタンパク質量か、又は、
当該タンパク質を産生させる細胞種を、変更することができる。遺伝子のコーデ
ィング配列は広汎な変更が可能であり、例えば、その一部を別の遺伝子のコーデ
ィング配列に融合させて、融合タンパク質をコードする新規なハイブリッド遺伝
子を生み出すなどができる。融合タンパク質を生成する方法の例は、そのすべて
を参照をもってここに編入することとするＰＣＴ出願PCT/US87/02968, PCT/US89
/03587 及びPCT/US90/07335や、Traunecker et al. (1989) Nature 339:68に説
かれている。

【００４４】 融合遺伝子を作製する技術は公知である。特に、異なるポリペプチド配列をコ
ードする多様なＤＮＡ断片の接合が、従来技術に基づいて行われており、平滑末
端又は付着末端を用いて連結を行う、制限酵素による消化を行って適当な末端を
得る、付着末端を適宜埋める、アルカリホスファターゼ処理を行って望ましくな
い接合を避ける、そして酵素による連結を行うといった方法が採られている。代
替的には、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によっても、融合遺伝子を合成
できる。別の方法では、遺伝子断片のＰＣＲ増幅をアンカー・プライマを用いて
行うことができ、こうして生じた、二つの連続した遺伝子断片間の相補な張り出
し部分を後でアニールすれば、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例え
ば Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wile
y & Sons: 1992を参照されたい）。

【００４５】 さらに本発明は、当該のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
、少なくとも一つの調節配列に機能可能なよう連結させて含む発現ベクタを提供
するものである。「機能可能なよう連結させて」とは、該ヌクレオチド配列が発
現されるような態様で、該ヌクレオチド配列が調節配列に連結してあることを意
味するものと、意図されている。調節配列は当業で認識されており、コードされ
たポリペプチドの発現を命令するように選択される。従って、調節配列という用
語には、プロモータ、エンハンサ及び他の発現制御因子が含まれる。調節配列の
例は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Ac
ademic Press, San Diego, CA (1990)に解説されている。例えば、機能可能なよ
う、あるＤＮＡ配列に連結したときに、このＤＮＡ配列の発現を制御する幅広い
発現制御配列−配列のいずれかを、本発明のキメラポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を発現させるために、これらのベクタに用いてもよい。このような有用
な発現制御配列には、例えば、SV40の初期及び後期プロモータ、アデノウィルス
又はサイトメガロウィルスの最初期プロモータ、lac系、trp系、TAC又はTRC系、
発現がT7 RNAポリメラーゼによって命令されるT7プロモータ、ファージラムダの
主要なオペレータ及びプロモータ領域、fdコートたんぱくの制御領域、3-ホスホ
グリセレートキナーゼ又は他の解糖控訴のプロモータ、酸ホスファターゼのプロ
モータ、例えばPho5、酵母α-接合因子のプロモータ、バキュロウィルス系の多
面体プロモータ及び、原核又は真核細胞又はそれらのウィルスの遺伝子発現を制
御することが判明している他の配列、及びこれらの多様な組合せ、がある。発現
ベクタの設計は、形質転換しようとするホスト細胞の選択、及び／又は、発現さ
せたいタンパク質の種類などの因子に左右されるであろうことは理解されたい。
さらに、ベクタのコピー数、このコピー数や、抗生物質マーカなど、当該ベクタ
にコードされた他のタンパク質の発現を制御する能力、も、考察せねばならない
。

【００４６】 明白なように、当該の遺伝子作製物を用いると、培養で増殖させた細胞中で当
該のキメラポリペプチドの発現を引き起こすことができ、こうして例えば精製用
のキメラポリペプチドを生成させることができる。これは、例えば研究用、臨床
用、及び薬学的用途などに向けて、当該ポリペプチドを大量に調製する方法とな
る。

【００４７】 いくつかの治療的用途では、エクスビボ由来の当該キメラポリペプチドを、一
般の治療に適した態様で用いる。このような治療のためには、本発明のポリペプ
チドを、全身及び局所又は局部的投与を含め、様々な投与形態に向けて調合する
ことができる。このような実施例では、当該ポリペプチドを、例えば非発熱性の
賦形剤など、薬学的に容認可能な賦形剤と配合してもよい。概略的な技術及び調
合法は、ペンシルバニア州イーストン、ミード・パブリッシング社のRemmington
's Pharmaceutical Sciencesに見ることができる。全身投与の場合、筋肉内、静
脈内、腹腔内及び皮下注射を含め、注射が好ましい。本発明のポリペプチドは、
溶液、好ましくは、例えばハンクス溶液又はリンガー溶液など、生理学的に適合
性の緩衝液中に調合することができる。加えて、当該ポリペプチドを、固体形で
調合し、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥型も含まれる。

【００４８】 また全身投与は経粘膜的又は経皮手段によって行うことができ、又は、化合物
を経口投与してもよい。経粘膜又は経皮投与の場合、透過させようとする障壁に
適した浸透剤を製剤中に用いる。このような浸透剤は当業で公知であり、例えば
、経粘膜投与の場合、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体がある。加えて、界面活性
剤を用いて透過を促してもよい。経粘膜投与は鼻孔スプレー又は座薬を用いて行
ってもよい。経口投与の場合、当該ペプチドを、例えばカプセル、錠剤、及び強
壮剤などの従来の経口投与型に調合する。局所投与の場合、特に美容製剤の場合
には、本発明のオリゴマを、軟膏、軟膏剤、ゲル、又はクリームなど、当業で広
く公知であるように調合する。

【００４９】 ペプチドを投与するための代替手段が開発されている。持続放出製剤（Putney
, et al. Nature Biotechnology 1998, 16, 153-157) が有利であり、投与回数
も少なく、またしばしば投薬量も少なくてすむ。ペプチドを経口送達する技術も
、ペプチドを送達するいくつかの部位特異的手段(Pettit, D.K. et al. Trends
in Biotechnology 1998, 16, 343-349)と同様、検討されている (Fasano, A. Tr
ends in Biotechnology 1998, 16, 152-157)。ペプチドを治療を目的として投与
するためのその他の技術は当業者に公知である。

【００５０】 本発明の遺伝物質は、例えば発現プラスミドなどとして送達することができ、
この遺伝物質が細胞内で転写されると、所望のキメラポリペプチドが生成される
。

【００５１】 別の実施例では、当該遺伝物質を、細胞内で転写させて当該キメラポリペプチ
ドを生成させることのできる「発現」作製物を利用することで、提供する。この
ような発現作製物は、キメラポリペプチドをコードする遺伝物質に、細胞をエク
スビボ又はインビボで効果的にトランスフェクトさせることのできる何らかの製
剤又は組成物など、いかなる生物学的に効果的な担体中に入れて投与してもよい
。その方法には、組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス
、ヒト免疫不全ウィルス、及び単純疱疹ウィルス-1、又は、組換え細菌性又は真
核性プラスミドを含むウィルスベクタにアンチセンス核酸を挿入する方法がある
。細胞を直接トランスフェクトするにはウィルスベクタを利用できる。プラスミ
ドＤＮＡは、例えば陽イオンリポソーム（リポフェクチン）又は誘導体化（例え
ば共役抗体）、ポリリシン共役体、グラマシジンＳ、人工ウィルスエンベロープ
又は他のこのような細胞内担体を用いたり、又は、遺伝子作製物を直接注射した
り、又は、リン酸カルシウム沈降法をインビボで行うなどして、送達することが
できる。適した標的細胞への形質導入は、遺伝子治療の重要な最初のステップで
あるため、特定の遺伝子送達系の選択は、意図する標的の表現型や、局所又は全
身などの投与経路といった因子で左右されることは、理解されよう。

【００５２】 目的のタンパク質の一つをコードする遺伝物質を細胞内へインビボで導入する
好適な方法は、その遺伝物質を含有するウィルスベクタを利用する方法である。
細胞をウィルスベクタに感染させる方法には、標的細胞の大部分にその核酸を受
け取らせることができるという利点がある。その上、ウィルスベクタが含有する
核酸など、ウィルスベクタ内の遺伝物質にコードされたキメラポリペプチドは、
ウィルスベクタ核酸を取り込んだ細胞によって効率的に発現される。このような
戦略は、、骨格筋細胞がベクタの標的である場合に特に有効であろう（Fisher,
K.J. et al. Nature Medicine 1997, 3, 306-312)。

【００５３】 レトロウィルスベクタ及びアデノ随伴ウィルスベクタは、一般的に、外生の遺
伝子を特にヒトにインビボで転移させるのに選択される組換え遺伝子送達系であ
ると、理解されている。これらのベクタは遺伝子を細胞に効率的に送達し、転移
された核酸はホストの染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。レトロウィルスを用
いる際の大きな注意点は、特に細胞集団内に野生型ウィルスが広がる可能性に関
して、それらの利用の安全性を確認することである。複製欠陥レトロウィルスだ
けを生む（「パッケージング細胞」と呼ばれる）特化細胞系が開発されたことで
、遺伝子治療へのレトロウィルスの実用性が高まり、また欠陥レトロウィルスも
、遺伝子治療を目的とした遺伝子転移術での利用についてよく性格付けられてい
る（レビューはMiller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照されたい)。このよう
に、レトロウィルスのコーディング配列の一部.(gag、pol、env)を、アンチセン
スE6AP作製物の一つをコードする核酸に置換することでそのレトロウィルスを複
製欠陥にしてある組換えレトロウィルスを作製することができる。 こうしてこ
の複製欠陥レトロウィルスをビリオン内に梱包し、このビリオンを用いて、標準
的な技術により、ヘルパウィルスを利用して標的細胞を感染させることができる
。組換えレトロウィルスを作製し、細胞をインビトロ又はインビボでこのような
ウィルスに感染させるためのプロトコルは、 Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989
), Sections 9.10-9.14、及び他の標準的な研究室用手引きに見ることができる
。適したレトロウィルスの例には、当業者にも公知であるpLJ、pZIP、pWE及びpE
Mがある。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系の両方を作製するのに適し
たパッケージング・ウィルス系の例には、ψCrip、ψCre、ψ2 及び ψAmがある
。レトロウィルスは、インビトロ及び／又はインビボで、神経細胞、上皮細胞、
内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞を含め、多くの異なる細胞種
に多様な遺伝子を導入するのに用いられてきた。（例えば、Eglitis, et al. (1
985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
5:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-
6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry
et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al.
(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-6
47; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et
al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; 米国特許第4,868,116号; 米国特許第4
,980,286号；PCT 出願WO 89/07136; PCT出願WO 89/02468; PCT 出願 WO 89/0534
5; 及びPCT 出願WO 92/07573を参照されたい）。

【００５４】 当該のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質のための遺伝子送達系として
レトロウィルスベクタを選ぶ際には、大半のレトロウィルスに標的細胞を成功裏
に感染させ、ひいては遺伝物質を安定に導入するのに必須な条件は、標的細胞が
分裂細胞でなければならない点に留意するのが重要である。一般的には、この要
件は、レトロウィルスベクタを用いる際の障害とはならないであろう。実際、こ
のような感染面での限界があることで、標的細胞の周囲の組織（例えば非形質転
換細胞）が広汎な細胞分裂を行わず、従ってレトロウィルスベクタによる感染に
抵抗性となる場合、有利なことがある。

【００５５】 さらに、ウィルス粒子の表面上にあるウィルス・パッケージングたんぱくを改
変すると、レトロウィルス、ひいてはレトロウィルスを基にしたベクタの感染範
囲を制限できることが、示されている（例えばPCT 公報WO93/25234、WO94/06920
、及びWO94/11524を参照されたい）。例えば、レトロウィルスの感染範囲を改変
するための戦略には： 細胞表面抗原に特異的な抗体をウィルス env たんぱくに
共役させる (Roux et al. (1989) PNAS 86:9079-9083; Julan et al. (1992) J
. Gen Virol 73:3251-3255; and Goud et al. (1983) Virology 163:251-254);
又は、細胞表面リガンドをウィルスenvたんぱくに共役させる (Neda et al. (19
91) J Biol Chem 266:14143-14146)、方法がある。共役は、タンパク質又は他の
種類（例えばラクトースを共役させると、envたんぱくがアシアロ糖たんぱくに
転化する）との化学的架橋結合の形であっても、キメラタンパク質（例えば一本
鎖抗体／envキメラタンパク質）を生成することによってもよい。この技術は、
特定の細胞種へ感染を制限する又は方向付けるのに有用である一方、環境栄養性
ベクタを両栄養性ベクタに変換するのにも用いることができる。

【００５６】 さらに、レトロウィルス遺伝子送達の利用法は、レトロウィルスベクタの遺伝
物質の発現を制御する組織又は細胞特異的転写調節配列を利用すると、さらに向
上させることができる。

【００５７】 本発明で有用なもう一つのウィルス遺伝子送達系は、アデノウィルス由来ベク
タを利用するものである。アデノウィルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコー
ドしてはいるが、正常な溶菌ウィルス生命周期で複製する能力という点で不活性
であるように、操作することができる（例えばBerkner et al. (1988) BioTechn
iques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; 及び Rosenfeld
et al. (1992) Cell 68:143-155を参照されたい）。アデノウィルス株Adタイプ
5のdl324又はアデノウィルスの他の株（例えばAd2、Ad3、Ad7、等々）を由来と
する適したアデノウィルスベクタが、当業者に公知である。組換えアデノウィル
スはいくつかの場合で有利であるが、それはなぜなら、それらは非分裂性の細胞
にも感染でき、また気道上皮(上で引用したRosenfeld et al. (1992))、内皮細
胞 (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486)、
肝細胞 (Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816)
及び筋細胞(Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584
)を含め、幅広い細胞種に感染させるのに利用できるからである。さらに、この
ウィルス粒子は比較的に安定であり、精製及び濃縮になじみ、そして上述したよ
うに、感染の範囲が変わるように改変することができる。加えて、導入されたア
デノウィルスＤＮＡ（及びそこに含まれた外来のＤＮＡ）はホスト細胞のゲノム
に組み込まれず、エピソームのままでいるため、導入されたＤＮＡがホストのゲ
ノム（例えばレトロウィルスＤＮＡ）に組み込まれた場合の挿入的変異誘発の結
果起き得る問題を避けることができる。さらに、アデノウィルスゲノムが外来の
ＤＮＡを乗せるキャパシティは、他の遺伝子送達ベクタに比較しても高い（最高
で８キロベース） (上記のBerkner et al.; Haj-Ahmand and Graham (1986) J.
Virol. 57:267)。現在用いられており、従って本発明でも好適である大半の複
製欠陥アデノウィルスベクタでは、ウィルスE1及びE3遺伝子の全部又は一部を欠
失させてあるが、アデノウィルスの遺伝物質の80%もが残っている（例えばJones
et al. (1979) Cell 16:683; 上記のBerkner et al., 及びGraham et al. in M
ethods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991
) vol. 7. pp. 109-127を参照されたい）。挿入された遺伝物質の発現を、例え
ばE1Aプロモータ、主要後期プロモータ(MLP) 及び関連するリーダ配列、E3プロ
モータ、又は外から加えられたプロモータ配列の制御下に置くこともできる。

【００５８】 当該のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を送達するのに有用なさらに
別のウィルスベクタ系は、アデノ随伴ウィルス（AAV）である。アデノ随伴ウィ
ルスは天然発生型の欠陥ウィルスであり、効率的な複製及び増殖的な生命環を営
むためには、アデノウィルス又は疱疹ウィルスなどの別のウィルスをヘルパウィ
ルスとして必要とする（レビューはMuzyczka et al. Curr. Topics in Micro. a
nd Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい）。さらにこれは、非分裂性細
胞にそのＤＮＡを組み込ませ、安定な組み込みを高頻度で見せることのできる数
少ないウィルスの一つである（例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Ce
ll. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828;
及び McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい)。３
００塩基対ほどのAAVを含有するベクタを梱包し、組み込ませることができる。
外来のＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られている。Tratschin et a
l. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 に説かれたようなAAVベクタを用いて
も、ＤＮＡを細胞に導入することができる。多様な核酸が、AAVベクタを用いて
様々な細胞種に導入されてきた（例えばHermonat et al. (1984) Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2
072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin e
t al. (1984) J. Virol. 51:611-619; 及びFlotte et al. (1993) J. Biol. Che
m. 268:3781-3790を参照されたい)。

【００５９】 遺伝子治療で用途があると考えられる他のウィルスベクタ系は、疱疹ウィルス
、ワクシニアウィルス、及びいくつかのRNAウィルスを由来とするものであった
。

【００６０】 上述したものなどのウィルス転移法に加え、ウィルス以外の方法を用いても、
当該のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を動物の組織で発現させること
ができる。ウィルス以外の遺伝子転移法の大半は、ほ乳類細胞が巨大分子の取り
込み及び細胞内輸送を行うのに通常用いる機序に依拠している。好適な実施例で
は、本発明の非ウィルス遺伝子送達系は、標的細胞が遺伝物質を取り込む際のエ
ンドサイトーシス経路に依拠している。この種類の遺伝子送達系の例には、リポ
ソーム由来系、ポリリシン共役体、及び人工のウィルスエンベロープがある。

【００６１】 ある代表的な実施例では、遺伝物質を、表面上にプラスの電荷を持ち、さらに
選択に応じて標的組織の細胞表面抗原に対する抗体のタグを付けたリポソーム中
に（例えばリポフェクチン）閉じこめることができる(Mizuno et al. (1992) No
Shinkei Geka 20:547-551; PCT 公報WO91/06309; 日本特許出願1047381; 及び
ヨーロッパ特許公報EP-A-43075)。例えば、乳頭腫感染細胞のリポフェクション
を、PV関連抗原に対するモノクローナル抗体のタグを付けたリポソームを用いて
行うことができる（Viac et al. (1978) J Invest Dermatol 70:263-266を参照
されたい; さらにMizuno et al. (1992) Neurol. Med. Chir. 32:873-876も参照
されたい)。

【００６２】 さらに別の例示的実施例では、前記遺伝子送達系は、ポリリシンなどの遺伝子
結合剤で架橋した抗体又は細胞表面リガンドを含む（例えばPCT公報WO93/04701
、WO92/22635、WO92/20316、WO92/19749、及びWO92/06180を参照されたい）。例
えば、当該のキメラポリペプチドをコードする遺伝物質を用いて、例えばポリリ
シンなど、ポリカチオンに共役させたアシアロ糖たんぱくを含む可溶性のポリヌ
クレオチド担体を利用して、肝細胞をインビボでトランスフェクトさせることが
できる（米国特許第5,166,320号を参照されたい）。さらに、媒介エンドサイト
ーシスを通じた当該核酸作製物の効果的な送達は、エンドソーム構造からの遺伝
子の脱出を高める物質を用いると、向上させることができることも、理解されよ
う。例えば、アデノウィルス全体又はインフルエンザHA遺伝子産物の融合生成性
ペプチドを、この送達系の一部として用いて、ＤＮＡ含有エンドソームの効率的
な破壊を誘導することができる(Mulligan et al. (1993) Science 260-926; Wag
ner et al. (1992) PNAS 89:7934; 及びChristiano et al. (1993) PNAS 90:212
2）。

【００６３】 臨床の場では、当該の遺伝子送達系を、それぞれ当業で公知である数多くの方
法のいずれを用いて患者に導入してもよい。例えば、遺伝子送達系の薬剤を、静
脈注射などによって全身に導入すると、遺伝子送達伝播体のもたらすトランスフ
ェクションの特異性や、当該遺伝子の発現を制御する転写調節配列が原因の細胞
種又は組織種発現や、又はこれらの組合せの結果、標的細胞の特異的な形質導入
が優先的に起きる。別の実施例では、動物への導入を極めて限局的に行うことで
、組換え遺伝子の最初の送達をより制限する。例えば、遺伝子送達伝播体をカテ
ーテルで導入しても（米国特許第5,328,470号を参照されたい）、又は定位注射
によって導入しても（例えば Chen et al. (1994) PNAS 91: 3054-3057)よい。

【００６４】 さらに、当該薬剤は、基本的に遺伝子送達系を容認可能な希釈剤中に入れたも
のから構成されていても、又は、遺伝子送達伝播体を埋め込んだ徐放マトリック
スを含んでいてもよい。代替的には、完全な遺伝子送達系をレトロウィルスパッ
ケージなどの組換え細胞からインタクトで生成できる場合、当該薬剤は、この遺
伝子送達系を生成する一つ又はそれ以上の細胞を含んでいてもよい。後者の場合
、ウィルスパッケージング細胞を導入する方法は、例えば、リチャージャブル（
原語rechargeable）又は生分解性のデバイスによって提供してもよい。多様な徐
放型ポリマデバイスが開発され、タンパク質様生物薬剤を含め、薬剤の制御送達
について近年、インビボでテストされており、ポリマーの組成及び形状を操作す
ることにより、ウィルス粒子を放出させるように適合させることができる。生分
解性及び非生分解性のポリマ（ヒドロゲルも含め）を含む多様な生体適合性ポリ
マを用いて、特定の標的部位に移植された細胞によってウィルス粒子を持続放出
させるインプラントを形成することができる。本発明のこのような実施例は、ポ
リマデバイスに組み込まれている外部で精製されたウィルスの送達や、又は、ポ
リマデバイス内に被包された細胞が生ずるウィルス粒子の送達に、利用できる。

【００６５】 単量体の組成又は重合技術を選択することで、水分量、多孔性、及びその結果
の透過性といった性質を調節することができる。形状、大きさ、ポリマ及び移植
方法の選択は、処置しようとする異常や、個々の患者の応答に基づいて、基本的
に個々に決定できる。このようなインプラントの作製法は当業で公知である。例
えば Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, ed. by David Wi
lliams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); 及び Sabel et al.の米国特許第4,
883,666号を参照されたい。インプラントの別の実施例では、組換えウィルスを
生ずる細胞の供給源は、移植の可能な中空のファイバー中に被包されている。こ
のようなファイバーは予め紡がれた後に、ウィルス源を充填されたものでも(Aeb
ischer et al. 米国特許第4,892,538号; Aebischer et al. 米国特許第5,106,62
7号; Hoffman et al. (1990) Expt. Neurobiol. 110:39-44; Jaeger et al. (19
90) Prog. Brain Res. 82:41-46; 及び Aebischer et al. (1991) J. Biomech.
Eng. 113:178-183)、又は、ウィルスパッケージング細胞の周囲にポリマコート
を形成する働きをするポリマと一緒に同時押出されたものでもよい(Lim 米国特
許第4,391,909号; Sefton 米国特許第4,353,888号; Sugamori et al. (1989) Tr
ans. Am. Artif. Intern. Organs 35:791-799; Sefton et al. (1987) Biotechn
ol. Bioeng. 29:1135-1143; 及びAebischer et al. (1991) Biomaterials 12:50
-55)。ここでも、ウィルス粒子が最適に放出されるように、ポリマを操作できる
。

【００６６】 本発明のキメラポリペプチドは、分子モデリングを用いて設計が可能である。
血清アルブミンのコンピュータモデルを変更して、所定の異種の配列が含まれる
ようにしてもよく、その結果得られる構造に、できたペプチドの形状がどのよう
に変化するか、その変更によりどれくらいの歪みがポリペプチドに導入されるか
、異種の配列が三次元ではどのように表示されるか、及び、得られるキメラポリ
ペプチドの構造に関する他のデータ、を判定するよう設計された計算にかけても
よい。あるいは、含めようとする配列の性質を、判明している受容体又は結合ポ
ケットに基づき、計算によって判定できるかも知れない。別の実施例では、この
計算によって、血清アルブミンの骨格の三次構造を維持するには所望の配列をど
のように挿入したらよいか、又は、適切な方向で挿入を表示するにはどのように
すればよいか、が判断できるかも知れない。他の計算上の戦略は当業者に公知で
あろう。これらなどの計算は、実際の合成及びスクリーニング技術を始める前に
、時間及び材料効率的な態様で本発明のキメラポリペプチドの合成を指示するの
に、有用であろう。

【００６７】 コンピュータモデリングの使用を離れて、本発明のキメラポリペプチドをスク
リーニングする方法は、当業者に公知である。ペプチドライブラリの利用は、一
度に多数のポリペプチドをスクリーニングする方法の一つである。スクリーニン
グ検定の一つでは、候補ペプチドを細胞又はウィルス粒子の表面上に展示させ、
この遺伝子産物を介して受容体たんぱくなどの標的分子に結合する上での特定の
細胞又はウィルス粒子の能力を、「パニング検定」で検出する。例えば、細菌細
胞の表面膜たんぱくの遺伝子内に、この遺伝子ライブラリをクローンし、できた
キメラポリペプチドをパニングによって検出することができる（Ladner et al.,
WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; 及び Gowar
d et al. (1992) TIBS 18:136-140)。

【００６８】 代替的な実施例では、該ペプチドライブラリを、ウィルス粒子の表面上でキメ
ラポリペプチドとして発現させる。例えば、糸状ファージ系では、外来のペプチ
ド配列を感染性ファージの表面上に発現させることで、二つの大きな利点をもた
らすことができる。第一に、これらのファージは親和性マトリックスに大変高い
濃度で付着させることができるため、多数のファージを一度でスクリーニングで
きる。第二に、各感染性ファージはコンビナトリアル遺伝子産物をその表面上に
展示するため、ある特定のファージの親和性マトリックスからの回収率が低い場
合、このファージをもう一度感染させることで増幅させることができる。ほとん
ど同一のＥ．コリ糸状ファージのグループ、M13、fd、及びf1 が、ファージ展示
ライブラリで最もよく用いられているが、それは、ファージgIII 又はgVIII コ
ートたんぱくのいずれを用いても、ウィルス粒子の最終的なパッケージングを破
壊せずにキメラポリペプチドを作製できるからである (Ladner et al. PCT 公報
WO 90/02809; Garrard et al., PCT 公報WO 92/09690; Marks et al. (1992) J.
Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734;
Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; 及びBarbas et al. (1992) PNA
S 89:4457-4461)。

【００６９】 コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリの分野は総説があり（(Gallop et a
l. J. Med. Chem. 1994, 37, 1233-1251)、ペプチドライブラリを作製し、スク
リーニングする更なる技術も当業で公知である(Gustin, K. Virology 1993, 193
, 653-660; Goeddel et al. 米国特許第5,223,408号; Markland et al. PCT公報
WO92/15679; Bass et al. Proteins: Structure, Function and Genetics 1990,
8, 309-314;Cunningham, B.C. Science 1990, 247, 1461-1465; Lowman, H.B.
Biochemistry 1991, 30, 10832-10838; Fowlkes et al. 米国特許第5,789,184号
; Houghton, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 5131-5135)。

【００７０】 １９９８年１０月１９日に出願された米国特許出願09/174,943号は、生物活性
なペプチドを単離する方法を開示している。そこに開示された技術を用いると、
所定の受容体と相互作用する、本発明のキメラポリペプチドを開発できよう。

【００７１】 代表的な例では、この方法を用いて、一つ又はそれ以上の細胞種に対して抗増
殖活性を有するポリペプチドを同定する。当業者であれば、所望の活性を持つポ
リペプチドを発見できるよう、以下に概略を述べた手法を容易に改良できよう。
この例では、展示状態にあるときに、標的細胞に結合するポリペプチドを濃縮す
るために、抗増殖性が望ましい標的細胞で、当該キメラポリペプチドをパニング
することができる。対照の細胞に結合するポリペプチドを除くには、この段階で
、一つ又はそれ以上の対照細胞株に対して当該ポリペプチドライブラリをさらに
パニングするとよい。この態様で、後で分泌状態でテストするポリペプチドライ
ブラリを、（対照細胞に比較して）標的細胞に選択的に結合するポリペプチドに
ついて濃縮してもよい。このように、例えば、展示状態では、正常細胞に比較し
て腫瘍細胞に優先的に結合するポリペプチドか、p53＋細胞に比較してp53−細胞
に優先的に結合するポリペプチドか、他の上皮細胞に比較して毛嚢細胞に優先的
に結合するポリペプチドか、又は他の差次的な結合特性を持つポリペプチドにつ
いて、濃縮されたポリペプチドライブラリができる。

【００７２】 分泌状態では、当該ポリペプチドを、当業で公知の多くの技術のいずれかを用
いて、標的細胞に対する抗増殖活性についてテストする。例えば、BrdU又は他の
ヌクレオチドの取り込みを、増殖の指標として計測してもよい。上述したように
、分泌状態には、特異的な抗増殖性活性を持つポリペプチドを選別できるよう、
陰性対照を含めてもよい。

【００７３】 同様な態様で、細胞選択的な態様などでアポトーシスを誘導又は細胞溶解を誘
導する能力に基づき、ライブラリからポリペプチドを単離することができる。

【００７４】 さらに、この方法を用いて、脈管形成活性又は抗脈管形成活性を持つポリペプ
チドを同定することもできる。例えば、ポリペプチドライブラリを、内皮細胞に
は結合するが線維芽細胞には結合しないポリペプチドについて、濃縮することが
できる。その結果得られるサブライブラリを、毛細内皮細胞の増殖及び／又は内
皮細胞の移動を阻害するポリペプチドについて、スクリーニングしてもよい。こ
れらの活性の一方又は両方でプラスを得点したポリペプチドを、さらに、平滑筋
細胞又は線維芽細胞などの他の細胞種に対する活性についてテストして、内皮細
胞だけに対して活性があるポリペプチドを選別してもよい。

【００７５】 さらに、この方法を用いて、例えば抗カビ又は抗菌剤などとして活性な抗感染
性ポリペプチドを同定できる。

【００７６】 その上、この検定は、受容体たんぱく又はその複合体のエフェクタを同定する
のにも用いることができる。概略的には、この検定は、細胞外シグナルとの相互
作用によってそのシグナル伝達活性が変調され、この伝達活性が検出可能なシグ
ナルを生ずるような、標的受容体又はイオンチャンネルたんぱくを持つテスト細
胞を利用することを特徴とする。

【００７７】 概略的には、このような検定は、試薬細胞で検出可能なシグナルを伝達するこ
とができる標的受容体たんぱく又はイオンチャンネルを発現している細胞の混合
物を利用することを特徴とする。この受容体／チャンネルたんぱくは内生のもの
でも、又は異種のものでもよい。開示した検出手段と組み合わせると、当該の試
薬細胞の培養物は、受容体機能のアゴニスト又はアンタゴニストを検出する手段
となるであろう。

【００７８】 特定のポリペプチドが、標的受容体又はチャンネルのシグナル伝達活性を変調
する上での能力は、検出シグナルの上方又は下方調節を検出することにより、採
点することができる。例えば、セカンドメッセンジャの生成（例えばGTPase活性
、ホスホリピドの加水分解、又はタンパク質のリン酸化パターン）を直接測定で
きる。代替的には、指標遺伝子を用いると、便利な読み取りを行うことができる
。別の実施例では、検出手段は指標遺伝子から構成される。いずれの場合も、検
出シグナルの統計上有意な変化を用いて、受容体又はイオンチャンネルの活性を
変調する化合物の同定を容易化することができる。

【００７９】 この方法により、特定の受容体又はチャンネルからのシグナル経路を誘導する
ポリペプチドを同定することができる。テストポリペプチドが受容体／チャンネ
ルたんぱくの活性を誘導しないように思われる場合は、上述のようにこの検定を
繰り返し、試薬細胞をまず標的受容体／チャンネルの既知の活性化物質に接触さ
せてシグナル伝達を誘導するステップを導入する改良を行い、テストペプチドを
、活性化した受容体／チャンネルを阻害する能力について検定することで、アン
タゴニストなどを同定することができる。さらに別の実施例では、受容体の既知
の活性化物質に対する応答を増強するものについて、ペプチドをスクリーニング
することができる。

【００８０】 特に、この検定を利用して、細胞表面に局在化した受容体及びチャンネルにつ
いて、機能的リガンド対受容体又はリガンド対イオンチャンネルの相互作用を調
べることができる。以下により詳細に説明するように、当該の検定を用いると、
例えばＧたんぱく共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体、
及びイオンチャンネルなどのエフェクタを同定することができる。いくつかの実
施例では、ここに説明した方法を用いて、相手のリガンドが未知である「オーフ
ァン受容体」のリガンドを同定する。

【００８１】 いくつかの例では、当該受容体は細胞表面受容体、例えば：受容体チロシンキ
ナーゼ、例えばEPH受容体；イオンチャンネル；サイトカイン受容体：マルチサ
ブユニット免疫認識受容体；ケモカイン受容体；成長因子受容体；又はＧたんぱ
く共役受容体、例えば化学誘因性ペプチド受容体、神経ペプチド受容体、光受容
体、神経伝達物質受容体、又はポリペプチドホルモン受容体、である。

【００８２】 好適なＧたんぱく共役受容体には、α1A-アドレナリン作動性受容体、α1B-ア
ドレナリン作動性受容体、 α2-アドレナリン作動性受容体、 α2B-アドレナリ
ン作動性受容体、 1-アドレナリン作動性受容体、 β2-アドレナリン作動性受
容体、 β3-アドレナリン作動性受容体、 m1アセチルコリン受容体 (AChR)、 m2
AChR、m3 AChR、m4 AChR、 m5 AChR、 D1 ドーパミン受容体、 D2 ドーパミン
受容体、 D3 ドーパミン受容体、 D4 ドーパミン受容体、 D5 ドーパミン受容体
、 A1 アデノシン受容体、 A2b アデノシン受容体、 5-HT1a受容体、 5-HT1b受
容体、 5HT1-様受容体、 5-HT1d 受容体、 5HT1d-様受容体、 5HT1d ベータ受容
体、 サブスタンス K (ニューロキニンA) 受容体、 fMLP 受容体、 fMLP-様受容
体、 アンジオテンシンII type 1 受容体、エンドセリンETA 受容体、 エンドセ
リンETB受容体、トロンビン受容体、成長ホルモン−放出ホルモン(GHRH) 受容体
、血管作用性小腸ペプチド受容体、オキシトシン受容体、ソマトスタチンSSTR1
及びSSTR2、SSTR3、カナビノイド受容体、卵胞刺激ホルモン(FSH) 受容体、 ロ
イトロピン(LH/HCG) 受容体、甲状腺刺激ホルモン(TSH) 受容体、トロンボキサ
ンA2受容体、 血小板活性化因子(PAF) 受容体、 C5aアナフィラトキシン受容体
、インターロイキン8 (IL-8) IL-8RA、IL-8RB、デルタオピオイド受容体、カッ
パオピオイド受容体、 mip-1/RANTES受容体、ロドプシン、レッドオプシン、グ
リーンオプシン、ブルーオプシン、代謝調節型グルタミン酸mGluR1-6、ヒスタミ
ンH2 受容体、ATP 受容体、神経ペプチド Y 受容体、アミロイドたんぱく前駆体
受容体、インシュリン様成長因子 II 受容体、ブラジキニン受容体、ゴナドトロ
ピン放出ホルモン受容体、コレシストキニン受容体、 メラノサイト刺激ホルモ
ン受容体、抗利尿ホルモン受容体、グルカゴン受容体、及び副腎皮質刺激ホルモ
ンII受容体、がある。

【００８３】 好適なEPH受容体には、eph、elk、 eck、 sek、 mek4、 hek、 hek2、 eek、 erk、 tyro1、 tyro4、 tyro5、 tyro6、 tyro11、 cek4、 cek5、 cek6、 cek7
、 cek8、 cek9、 cek10、 bsk、 rtk1、 rtk2、 rtk3、 myk1、 myk2、 ehk1、 ehk2、パグリアキオ（原語 pagliaccio）、 htk、 erk 及びnuk 受容体がある
。

【００８４】 A. サイトカイン受容体 ある実施例では、標的受容体はサイトカイン受容体である。サイトカインは細
胞間伝達における可溶性媒体の一族で、インターロイキン、インターフェロン、
及びコロニー刺激因子を含む。サイトカインの特徴は、機能の重複と多面発現性
である。異なるスーパーファミリを構成するサイトカイン受容体のほとんどは、
固有のたんぱく質チロシンキナーゼドメインを有さないが、受容体刺激は通常、
受容体自体を含む細胞内たんぱく質の迅速なチロシンリン酸化を引き起こす。サ
イトカイン受容体スーパーファミリのメンバーの多くは、Jakたんぱく質チロシ
ンキナーゼファミリを活性化させ、その結果STAT転写活性因子がリン酸化する。
IL-2、IL-7、IL-2及びインターフェロンgはすべてJakキナーゼを活性化すること
が明らかになっている(Frank et al (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:7779-7
783)、 Scharfe et al. (1995) Blood 86:2077-2085)、(Bacon et al. (1995) P
roc Natl Acad Sci USA 92:7307-7311)、 及び (Sakatsume et al (1995) J. Bi
ol Chem 270:17528-17534)。Jakリン酸化の下流イベントも明らかになっている
。例えば、Tリンパ球をIL-2に暴露すると、シグナル伝達及び転写活性化(STAT)
たんぱく質STAT1a、STAT2b、STAT3、及び２つのSTAT関連たんぱく質p94 及びp95
のリン酸化を引き起こすことが明らかになっている。STATたんぱく質は核に転位
して特定のDNA配列と結合することが明らかになっており、IL-2が免疫細胞機能
に関与する特異的遺伝子を活性化すると考えられる機序を示唆している(Frank e
t al. 同上)。Jak3はIL-2、IL-4、及びIL-7サイトカイン受容体のg鎖と会合して
いる(Fujii et al. (1995) Proc Natl Acad Sci 92:5482-5486) 及び (Musso et
al (1995) J Exp Med. 181:1425-1431)。Jakキナーゼは、成長ホルモン、エリ
スロポイエチンなどのサイトカイン受容体やIL-6を介して多種のリガンドにより
活性化されていることも明らかになっている(Kishimoto (1994) Stem cells Sup
pl 12:37-44)。

【００８５】 本アッセイにおいて記録用に用いてよい検出手段には、リン酸化の変化による
などの第二メッセンジャーの直接検出に加えて、STATたんぱく質に感受性のある
転写制御要素を含むレポータ作成物またはインジケータ遺伝子が含まれる。詳し
くは後述する。

【００８６】 B. 多サブユニット免疫認識受容体（MIRR) 別の実施例では、受容体は多サブユニット受容体である。受容体はサブユニッ
トと呼ばれる複数のたんぱく質を含んでよく、多サブユニット受容体と呼ばれる
カテゴリの一種が多サブユニット免疫認識受容体（MIRR)である。MIRRは多数の
非共有結合サブユニットを有する受容体を含み、srcファミリチロシンキナーゼ
と相互作用することができる。MIRRはB細胞抗原受容体、T細胞抗原受容体、Fc受
容体及びCD22をそれだけに限らずに含んでよい。MIRRの一例は、B細胞表面上の
抗原受容体である。さらに説明すると、B細胞表面上のMIRRは、抗原と結合した
ときにB細胞機能を調節する複雑な能力を形成するIg-a及びIg- またはIg-gサブ
ユニットと会合した膜結合免疫グロブリン(mIg) を含む。抗原受容体は、増幅分
子が遺伝子転写を調節できるように、増幅分子に機能的に結合していてよい。

【００８７】 srcファミリチロシンキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化すること
ができる酵素である。一般にsrcファミリチロシンキナーゼは一つ以上の結合ド
メインとキナーゼドメインを有する。srcファミリチロシンキナーゼの結合ドメ
インは標的分子に結合でき、キナーゼドメインはキナーゼに結合した標的分子を
リン酸化することができる。チロシンキナーゼのsrcファミリのメンバーは、フ
ァミリメンバーすべての中で異なる程度の相同性を有する３領域の前つながるN
末端固有領域を特徴とする。これら３領域はsrc相同領域１(SH1)、src相同領域
２(SH2)、及びsrc相同領域３(SH3) と呼ばれる。SH2及びSH3領域は、シグナル伝
達複合体を形成するために重要なたんぱく質の会合機能を有すると考えられてい
る。N末端固有領域のアミノ酸配列は各srcファミリチロシンキナーゼによって変
化する。N末端固有領域は、srcファミリチロシンキナーゼのN末端を先頭とした
少なくとも約４０アミノ酸残基であってよい。

【００８８】 sykファミリキナーゼは標的分子のチロシン残基をリン酸化することができる
酵素である。一般には、sykファミリキナーゼは一つ以上の結合ドメインとキナ
ーゼドメインを有する。sykファミリチロシンキナーゼの結合ドメインは標的分
子に結合することができ、キナーゼドメインはキナーゼに結合した標的分子をリ
ン酸化することができる。チロシンキナーゼのsykファミリメンバーはたんぱく
質会合機能を有する二つのSH2ドメイン及びチロシンキナーゼドメインを特徴と
する。

【００８９】 第一標的分子は、第二メッセンジャー分子を修飾することによりシグナル伝達
経路をさらに伸展させることができる。第一標的分子は、ホスファチジルイノシ
トール3キナーゼ(PI-3K)、P21rasGAPase活性化たんぱく質及び関連するP190及び
P62たんぱく質、PLCg1及びPLC2などのホスホリパーゼ、MAPキナーゼ、Shc及びVA
Vをこれらに限らず含んでよい。第一標的分子は伝達されたシグナルをさらに増
幅することができる第二メッセンジャー分子を産生することができる。第二メッ
センジャー分子は、ジアシルグリセロール及びイノシトール1,4,5-三リン酸(IP3
)をこれらに限らずに含んでいる。第二メッセンジャー分子は、遺伝子転写にお
ける変化を誘発する可能性のある生理学的イベントを惹起することができる。例
えばIP3産生の結果、細胞内カルシウムの放出が起こり、それがカルモジュリン
キナーゼIIの活性化を引き起こし、それがets-1癌原たんぱく質と呼ばれるDNA結
合たんぱく質のセリンリン酸化を引き起こす可能性がある。ジアシルグリセロー
ルはAP1 DNA結合たんぱく質複合体の活性化に影響するシグナル伝達たんぱく質
プロテインキナーゼCを活性化することができる。シグナル伝達経路はc-fos、eg
r-1、及びc-mycなどの遺伝子の転写活性を引き起こす可能性がある。

【００９０】 schはアダプタ分子として考えてもよい。アダプタ分子は、二つの異なるたん
ぱく質に複合体（例えば３分子複合体）を形成させることができるたんぱく質を
含む。shcたんぱく質は複合体を形成させることができ、Geb2及びSOSなどを含む
。shcはGrb2のSH2ドメインと会合することができるSH2ドメインを含む。

【００９１】 シグナル伝達経路の分子は認識配列を用いて相互に会合することができる。認
識配列は２分子を特異的に結合させることができる。認識配列は相互に会合する
分子の構造によって変化することがある。分子は一つ以上の認識配列を有してよ
く、従って一つ以上の異なる分子と会合することができる。

【００９２】 MIRR複合体のシグナル伝達経路は、細胞の生物学的機能を調節することができ
る。このような機能には、成長、分化、及び細胞産生物の分泌などの細胞の能力
が、これらに限定されずに含まれる。MIRR誘発シグナル伝達経路は、免疫応答、
炎症応答及びアレルギー応答などの動物による特定の応答に関与する、特殊な細
胞の生物学的機能を調節することができる。免疫応答に関与する細胞には、例え
ばB細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及び形質
細胞などが含まれる。炎症応答に関与する細胞には、例えば 好塩基球、マスト
細胞、好酸球、好中球、及びマクロファージなどが含まれる。アレルギー応答に
関与する細胞には、例えばマスト細胞、好塩基球、B細胞、T細胞、及びマクロフ
ァージなどが含まれる。

【００９３】 ある実施例では、検出シグナルは、血清応答要素(SRE)、12-O-テトラデカノイ
ルホルボール-13-酢酸応答要素、環状AMP応答要素、c-fosプロモータ、またはCR
EB応答要素などの転写調節要素を含むレポータ作成物またはインジケータ遺伝子
などのリン酸化src様たんぱく質などの第二メッセンジャーである。

【００９４】 C. 受容体チロシンキナーゼ さらに別の実施例では、標的受容体は受容体チロシンキナーゼである。受容体
チロシンキナーゼは細胞外ドメインの構造類似性と細胞質内ドメインのチロシン
キナーゼ触媒領域の構成に基づいて５サブグループに分けることができる。サブ
グループI（上皮成長因子(EGF)受容体様）、II（インスリン受容体様）、及びep
h/eckファミリはシステイン-リッチの配列を有する(Hirai et al., (1987) Scie
nce 238:1717-1720 及び Lindberg and Hunter, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:6
316-6324)。これら３グループの受容体チロシンキナーゼのキナーゼ領域の機能
ドメインは、連続した配列としてコード化されている(Hanks et al. (1988) Sci
ence 241:42-52)。サブグループIII（血小板由来成長因子(PDGF)受容体様）及び
IV（線維芽細胞成長因子(FGF)受容体）は、細胞外ドメインに免疫グロブリン(Ig
)様の折り畳みを有し、無関係のアミノ酸の可変伸展部分により２分割されたキ
ナーゼドメインを有することを特徴とする(Yanden and Ullrich (1988) 同上 及
び Hanks et al. (1988) 同上)。

【００９５】 メンバが非常に数多く既知であるファミリがEPHファミリである。プロトタイ
プEPH受容体(Hirai et al. (1987) Science 238:1717-1720)について記述されて
以降、このファミリについては２種以上の種に発見されている明らかにオルソロ
ガス受容体を除いても、少なくとも１０メンバーについて配列が報告されている
。部分配列の追加や新規メンバーが次々に報告されていることから、このファミ
リはさらに大きいものと示唆される(Maisonpierre et al. (1993) Oncogene 8:3
277-3288; Andres et al. (1994) Oncogene 9:1461-1467; Henkemeyer et al. (
1994) Oncogene 9:1001-1014; Ruiz et al. (1994) Mech Dev 46:87-100; Xu et
al. (1994) Development 120:287-299; Zhou et al. (1994) J Neurosci Res 3
7:129-143; and references in Tuzi and Gullick (1994) Br J Cancer 69:417-
421) 。特筆すべきは、EPHファミリのメンバは数が多いにもかかわらず、これら
の分子はすべてオーファン受容体として同定されていおりリガンドが不明なこと
である。

【００９６】 いくつかのEPHファミリ受容体について明らかにされた発現パターンは、初期
の脊椎動物においてこれらの分子が重要な役割を果たしていたことを示唆してい
る。特に、原腸胚形成期及び初期器官形成期中におけるsek、mek4及びその他の
いくつかの受容体の発現の時期及びパターンは、この時期における胚のパターン
形成に関与する重要な細胞相互作用におけるこの受容体の機能を示唆している(G
ilardi-Hebenstreit et al. (1992) Oncogene 7:2499-2506; Nieto et al. (199
2) Development 116:1137-1150; Henkemeyer et al., 同上; Ruiz et al., 同
上; and Xu et al., 同上)。例えばsekは明らかな分節を示すマウス胚の２領域
、つまり中葉胚の体節と後脳の菱脳節に顕著な初期発現を示し、それ故にsek、
すなわち分節性発現キナーゼと命名されている(Gilardi-Hebenstreit et al.,
同上、 Nieto et al., 同上)。ショウジョウバエと同様に、哺乳類におけるこの
胚の分節構造は体制プランの確立において重要な要素と示唆されている。Sek発
現が形態学的分節の発現に先行しているという観察は、これらの分節構造の形成
、または細胞系統の区画化などの分節特異細胞の特性の決定にsekがある役割を
果たしていることを示唆している(Nieto et al., 同上）。さらに、EPH受容体は
、その発現パターンにより、胚体及び成体のほぼすべての組織の発達及び維持に
関与が示唆されている。例えば、EPH受容体は神経系、精巣、骨格の軟骨モデル
、歯牙原基、下垂体の漏斗部、各種上皮組織、肺、膵、肝及び腎組織全体に検出
されている。このような観察は発達及び生理学におけるEPHファミリキナーゼの
重要でユニークな役割を示唆しているが、このEPHファミリキナーゼはそのリガ
ンドについての情報が欠落しているために、それらの作用の理解をさらに進める
のは非常に困難である。

【００９７】 ここで用いられる「EPH受容体」または「EPH型受容体」という術語は、受容体
チロシンキナーゼのある分類を意味し、少なくとも１１のパラロガス遺伝子を含
むが、異種のホモログなどのオルトログもさらに多くこの分類に存在する。EPH
受容体は一般に相同性により関連づけられた受容体の個別なグループであり、認
識が容易で、例えばこの受容体はN末端近傍のシステイン残基の特徴的スペーシ
ングと二つのフィブロネクチンタイプIII反復を有する細胞外ドメインを特徴と
する(Hirai et al. (1987) Science 238:1717-1720; Lindberg et al. (1990) M
ol Cell Biol 10:6316-6324; Chan et al. (1991) Oncogene 6:1057-1061; Mais
onpierre et al. (1993) Oncogene 8:3277-3288; Andres et al. (1994) Oncoge
ne 9:1461-1467; Henkemeyer et al. (1994) Oncogene 9:1001-1014; Ruiz et a
l. (1994) Mech Dev 46:87-100; Xu et al. (1994) Development 120:287-299;
Zhou et al. (1994) J Neurosci Res 37:129-143;及び Tuzi and Gullick (1994
) Br J Cancer 69:417-421中の参考文献)。 例示的なEPH受容体にはeph, elk, e
ck, sek, mek4, hek, hek2, eek, erk, tyro1, tyro4, tyro5, tyro6, tyro11,
cek4, cek5, cek6, cek7, cek8, cek9, cek10, bsk, rtk1, rtk2, rtk3, myk1,
myk2, ehk1, ehk2, pagliaccio, htk, erk 及び nuk 受容体が含まれる。「EHP
受容体」という術語は、膜状の受容体たんぱく質及び本発明のリガンドを結合す
る能力を有する可溶性細胞外断片を意味する。

【００９８】 ある実施例では、検出シグナルは、例えばMEKK、MEK、またはMapキナーゼなど
の細胞内たんぱく質のリン酸化の検出、またはc-fos及び／またはc-junに応答す
る転写調節要素を含むレポータ作成物またはインジケータ遺伝子の使用により得
られる。詳しくは後述する。

【００９９】 D. Gたんぱく質共役型受容体 真核細胞中に発見されたシグナル伝達カスケードの一族は、ヘテロ三量体「G
たんぱく質」を利用する。多種のGたんぱく質が受容体と相互作用することが知
られている。Gたんぱく質シグナル伝達系には３つの要素が含まれる。受容体自
体、GTP共役型たんぱく質（Gたんぱく質）及び細胞内標的たんぱく質である。

【０１００】 細胞膜はスイッチとして働く。異なる受容体を介して到達する情報は、受容体
が同型のGたんぱく質に作用する場合に単一の効果を生じることができる。反対
に、単一の受容体を活性化するシグナルは、その受容体が異種のGたんぱく質に
作用する場合、またはGたんぱく質が異なるエフェクタに作用する場合に、二つ
以上の効果を生じることができる。

【０１０１】 休止状態では、a、b、gサブユニットから成るGたんぱく質はヌクレオチドグア
ノシン二リン酸(GDP)と複合体形成し、受容体と接触する。ホルモンまたはその
他の第一メッセンジャーが受容体に結合すると、その受容体はコンホメーション
を変化させ、これがGたんぱく質との相互作用を変化させる。これが刺激となっ
てaサブユニットがGDPを放出し、さらに多量のヌクレオチドグアノシン三リン酸
(GTP)がGDPに取って代わり、Gたんぱく質を活性化させる。Gたんぱく質はその後
解離して、まだ複合体形成しているbおよびgサブユニットからaサブユニットを
分離させる。経路によりGaサブユニット、またはGbg複合体のいずれかがエフェ
クタと相互作用する。次にエフェクタ（酵素である場合が多い）が不活性前駆分
子を活性「第二メッセンジャー」に転換し、細胞質全体に拡散して代謝カスケー
ドを惹起すると考えられている。数秒後、GaがGTPをGDPに転換し、Ga自体を不活
性化する。不活性化したGaはGbg複合体と再び結合すると考えられる。

【０１０２】 何百、何千もの受容体がヘテロ三量体Gたんぱく質を介して情報を伝達してい
るが、そのGたんぱく質は少なくとも17の個別の種類が分離されている。可変性
が最も大きいのはaサブユニットであるが、いくつかの異なるb及びg構造も報告
されている。さらに、異なるGたんぱく質依存エフェクタもいくつか存在する。

【０１０３】 Gたんぱく質共役型受容体のほとんどには、細胞膜を7回貫通する一本のたんぱ
く質からなっている。このような受容体は7回膜貫通型受容体（STR）と呼ばれる
ことが多い。百種以上の異なるSTRが発見されており、それらの中には同じリガ
ンドに結合する異なる受容体も多く含まれ、まだ発見を待つSTRが数多く存在す
ると考えられる。

【０１０４】 さらに、STRは天然のリガンドが不明なまま同定されており、上述のようにこ
のような受容体は「オーファン」Gたんぱく質共役型受容体と呼ばれる。例にはN
eote et al. (1993) Cell 72, 415; Kouba et al. FEBS Lett. (1993) 321, 173
; Birkenbach et al.(1993) J. Virol. 67, 2209などによりクローニングされた
受容体も含まれる。

【０１０５】 本例の外因性受容体は、本発明のために遺伝子操作した細胞に対して外因性の
Gたんぱく質共役型受容体であってよい。この受容体は植物または動物細胞の受
容体であってよい。植物細胞受容体への結合のスクリーニングは、例えば除草剤
などの開発に有用である可能性がある。動物受容体の場合には無脊椎動物または
脊椎動物由来であってよい。無脊椎動物受容体の場合には昆虫受容体が好ましく
、殺虫剤の開発を促進する。受容体は脊椎動物、さらに好ましくは哺乳類、その
中でもさらに好ましくはヒト受容体であってもよい。外因性受容体も７回膜貫通
型セグメント受容体が好ましい。

【０１０６】 Gたんぱく質共役型受容体受容体の既知のリガンドには、アデノシン、cAMP、A
TP、UTP、ADP、及びメラトニンなどのプリンまたはヌクレオチド、5-ヒドロキシ
トリプトアミン、アセチルコリン、ドーパミン、アドレナリン、アドレナリン、
アドレナリン、ヒスタミン、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン、ノルアドレ
ナリン、チラミン／オクトパミン及びその他の関連化合物などの生体アミン（及
び関連する天然リガンド）、副腎皮質ホルモン(acth)、メラノサイト刺激ホルモ
ン(msh)、メラノコルチン、ニューロテンシン(nt)、ボンベシン及び関連するペ
プチド、エンドセリン、コレシストキニン、ガストリン、ニューロキニンb(nk3)
、無脊椎動物性タキキニン様ペプチド、サブスタンスk(nk2)、サブスタンスp(nk
1)、ニューロペプチドy(npy)、チロトロピン放出因子(trf)、ブラジキニン、ア
ンギオテンシンii、ベータエンドルフィン、c5aアナファラトキシン、カルシト
ニン、ケモカイン（インタークリンとも呼ばれる）、副腎皮質刺激ホルモン放出
ホルモン(crf)、ダイノルフィン、エンドルフィン、fmlp、及びその他のホルミ
ル化ペプチド、フォリトロピン(fsh)、真菌交配フェレモン、ガラニン、胃抑制
ペプチド受容体(gip)、グルカゴン様ペプチド(glps)、グルカゴン、ゴナドトロ
ピン放出ホルモン(gnrh)、成長ホルモン放出ホルモン(ghrh)、昆虫利尿ホルモン
、インターロイキン-8、ロイトロピン(lh/hcg)、metエンケファリン、オピオイ
ドペプチド、オキシトシン、パラチロイドホルモン(pth)、及びpthrp、下垂体ア
デニリルシクラーゼ活性化ペプチド(pacap)、セクレチン、ソマトスタチン、ト
ロンビン、チロトロピン(tsh)、血管作用性小腸ペプチド(vip)、バソプレシン、
バソトシンなどのペプチド、ip-プロスタシクリン、pg-プロスタグランジン、tx
-トロンボキサンなどのエイコサノイド、脊椎動物11-シス網膜、無脊椎動物11-
シス網膜及びその他の関連化合物などの網膜ベース化合物、カナビノイド、アナ
ンドアミド、リゾホスファチジン酸、血小板活性化因子、及びロイコトリエンな
どの脂質及び脂質ベース化合物、カルシウムイオン及びグルタメイトなどの興奮
性アミノ酸及びイオンが含まれる。

【０１０７】 Gたんぱく質共役型受容体の適切な例には、ドーパミン作動性受容体、ムスカ
リン様アセチルコリン受容体、a-アドレナリン作動性受容体、b-アドレナリン作
動性受容体、オピオイド受容体（d及びmを含む）、カンナビノイド受容体、セロ
トニン作動性受容体、及びGABA作動性受容体が含まれる。好ましい受容体には、
5HTファミリの受容体、ドーパミン受容体、C5a受容体及びFPRL-1受容体、シクロ
ヒスチジルプロリンジケトプルペラジン受容体、メラニン細胞刺激ホルモン放出
抑制因子受容体、及びニューロテンシン、チロトロピン放出ホルモン、カルシト
ニン、コレシトキニン-A、ニューロキニン-2、ヒスタミン-3、カンナビノイド、
メラノコルチン、またはアドレノモジュリンの受容体、ニューロペプチドY1また
はガラニンなどが含まれる。その他の適切な受容体は当業に掲載されている。こ
こで用いられる「受容体」という術語は、天然発生及び突然変異受容体の両方を
包含する。

【０１０８】 酵母菌a-及びa-因子受容体のようなこれらGたんぱく質共役型受容体の多くは
、細胞膜内に存在すると考えられている疎水性でアミノ酸リッチな７領域を有す
る。遺伝子が分離され発現ベクタを作成することが可能な特異的ヒトGたんぱく
質共役型STRには、ここに掲載したもの及び当業に知られるその他のものが含ま
れる。したがって、その遺伝子は、操作細胞内で機能していていて操作されるプ
ロモータ及び細胞内でも機能している単一配列にも動作可能な状態で結合してい
るであろう。例えば酵母菌の場合、適切なプロモータにはSte2、Ste3、及びga11 0 が含まれる。適切なシグナル配列には、Ste2、Ste3及び酵母細胞により分泌さ
れるたんぱく質をコードするその他の遺伝子が含まれる。好ましくは、酵母菌細
胞が用いられる場合には、遺伝子のコドンは酵母菌内に発現する様に最適化され
ている方がよいであろう。Hoekema et al.,(1987) Mol. Cell. Biol., 7:2914-2
4; Sharp, et al., (1986)14:5125-43を参照。

【０１０９】 STRの相同性はDohlman et al., Ann. Rev. Biochem., (1991) 60:653-88に考
察されている。STRが比較される場合、個別の相同性の空間パターンを識別する
ことができる。膜貫通ドメインはよく似ている場合が多いが、N及びC末端領域及
び細胞質ループ連結膜貫通セグメントV及びVIは多様である。

【０１１０】 異なるSTR領域の機能の重要性については、点変異（置換及び欠失の両方）の
導入と、異なるが関連するSTRのキメラ作成により研究されている。各セグメン
トに対応する合成ペプチドの活性度も試験されている。親和性ラベリングはリガ
ンド結合部位を鑑別するために用いられている。

【０１１１】 宿主細胞が酵母菌細胞である場合、外来性受容体が酵母菌膜に機能的に組み込
まれることができず、外因性酵母菌Gたんぱく質と相互作用するであろうと予測
される。さらに、受容体が修飾される必要があるか（例えばV-VIループを酵母ST
E2またはSTE3受容体のものに置換することによる）、互換性のあるGたんぱく質
が用意されなければならない。

【０１１２】 もし野生型外因性Gたんぱく質共役型受容体が酵母菌中で機能できない場合、
この目的のために受容体を変異させてよい。外因性受容体と酵母菌受容体のアミ
ノ酸配列を比較し、相同性が高い領域と低い領域を鑑別するとよいだろう。その
後、リガンドまたはGたんぱく質結合に関与する領域を膜中に機能的に組み込む
ために必要な領域から区別するために、試験的突然変異を行うとよいだろう。次
いで、酵母菌受容体によりよく似せるために、機能的組み込みが完了するまで外
因性受容体を後者の領域に変異させるとよいだろう。これが機能性の完成に不十
分である場合には、次にGたんぱく質結合に関与する領域に突然変異させるとよ
いだろう。突然変異をリガンド結合に関与する領域に行うのは最終手段であり、
その後可能な時に保存的置換をしてリガンドの結合を持続させるように努めると
よいだろう。

【０１１３】 好ましくは、酵母菌ゲノムを修飾して機能的に外因性受容体と相同な酵母菌受
容体の産生が不可能になるようにする。そうしないとアッセイの陽性判定に、対
象の受容体ではなく外因性Gたんぱく質共役型受容体を活性化させるペプチドの
能力が反映される可能性がある。

【０１１４】 (i) 化学誘引物質受容体 N-ホルミルペプチド受容体は、好中球及び哺乳類免疫システムのその他の食細
胞が発現するカルシウム動員たんぱく質共役型受容体の代表例である(Snyderman
et al. (1988) In Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlate
s, pp. 309-323)。細菌由来のN-ホルミルペプチドは受容体に結合し、その結果
定方向細胞運動、炎症性顆粒含有物の放出、及び酸素分子の代謝物の産生に重要
な潜在性NADPHオキシダーゼの活性化を引き起こす複雑な活性化プログラムに関
与する。受容体-リガンド相互作用により誘発されたこの経路は、宿主を化膿性
感染から保護するために重要である。類似のシグナル伝達は炎症性ペプチドC5a
及びIL-8に応答して生じる。

【０１１５】 その他の２種類のホルミルペプチド受容体様(FPRL)遺伝子が、NFPR cDNAをコ
ードする配列の断片にハイブリダイズする能力を用いてクローニングされている
。これらはFPRL1(Murphy et al. (1992) J. Biol Chem. 267:7637-7643) 及びFP
RL2(Ye et al. (1992) Biochem Biophys Res. Comm. 184:582-589)と命名されて
いる。FPRL2は、その遺伝子を形質移入してホルミルペプチドに暴露したマウス
線維芽細胞におけるカルシウム動員を媒介することが明らかになっている。反対
に、FPRL1のアミノ酸配列がNFPRのアミノ酸配列と69％一致していることが発見
されたが、異種の細胞種中に発現した場合にはプロトタイプN-ホルミルペプチド
リガンドに結合しなかった。このことからFPRL1オーファン受容体には未知のリ
ガンドがまだ存在するという仮説が導かれる(Murphy et al. 同上）。

【０１１６】 (ii) Gたんぱく質 外因性Gたんぱく質共役型受容体の場合、酵母菌細胞は、外因性受容体により
活性化されてから酵母菌エフェクタを活性化させることができるGたんぱく質を
産生可能でなければならない。この過程は、内因性酵母菌Gaサブユニット(例え
ばGPA)は、外因性受容体と天然に会合している「同族」Gaサブユニットに十分に
相同的であることが多いので結合を生じているのであろうということを示唆して
いる。さらに、酵母菌細胞を遺伝子操作して、外因性受容体と適切に相互作用す
ることができる外来性Gaサブユニットを産生する必要があるであろう。例えば、
酵母菌Gたんぱく質のGaサブユニットを外因性受容体と天然に会合しているGaサ
ブユニットに置換してよい。

【０１１７】 Dietzel and Kurjan, (1987) Cell, 50:1001)は、ラットGasが酵母菌Gbg複合
体と機能的に結合していることを明らかにした。しかし、ラットGai2は実質的に
過剰発現した場合にしか補完せず、Ga0は全く補完しなかった。Kang, et al., M
ol. Cell. Biol., (1990)10:2582)。したがって、いくつかの外来性Gaサブユニ
ットに関しては、単純に酵母菌Gaを置換することはできない。

【０１１８】 外因性Gたんぱく質共役型受容体が、その受容体と天然に会合しているGaサブ
ユニットにより酵母菌Gbgと十分に結合しない場合、結合を改善するためにGaサ
ブユニットを修飾してもよい。この修飾はGaサブユニットの酵母菌Gaとの類似性
を高める一方で受容体会合Gaとの類似性を減少させるような突然変異の形で行わ
れることが多いであろう。例えば、残基を変化させて対象の酵母菌Ga残基と同一
にしたり、また、少なくともその残基と同じ交換グループに属するようにしても
よい。修飾後、修飾されたGaサブユニットは外来性及び／または酵母菌Gaサブユ
ニットに実質的に相同になったりならなかったりする可能性がある。

【０１１９】 修飾は、好ましくはGbg結合に関与しやすいGa領域に集中する。いくつかの例
では、修飾は受容体会合Gaの一つ以上のセグメントをそれに対応する酵母菌Gaセ
グメントに置換してキメラGaサブユニットを形成することにより行われるであろ
う（特許請求の範囲の趣旨により、「セグメント」という術語は３つ以上連続し
たアミノ酸を意味する）。その他の例では、点変異でも十分である。

【０１２０】 このキメラGaサブユニットは外因性受容体及び酵母菌Gbg複合体と相互作用し
て、シグナル伝達を可能にするであろう。外因性酵母菌Gbgの使用が好ましいが
、外来性またはキメラGbgが酵母菌エフェクタにシグナルを伝達することができ
るなら、外因性酵母菌Gbgの代わりに外来性またはキメラGbgを用いてもよい。

【０１２１】 上述の技術の多くには、ある生物学的経路において活性である受容体について
の専門知識を必要とするが、当業者には本発明のキメラポリペプチドのライブラ
リのスクリーニングにこのような知識は必要ないと認識されるであろう。むしろ
、特定の発現型の細胞をある発現型の変化を引き起こすめのキメラペプチドをス
クリーニングするために用いることができる、細胞を用いたアッセイが当業に公
知である。このように、分子レベルで理解されていなくとも望ましい生物学的機
能を有するキメラポリペプチドを発見することが可能である。

【０１２２】

【実施例】

ここで概説された本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに容易に
理解されるであろうが、本発明のある態様及び実施態様を説明する目的のみで記
載されており、本発明を限定するものではない。

【０１２３】 血清アルブミンループ領域 ヒト血清アルブミン(HSA)の空間充填モデルを図
１に示す。HSAの三次元構造から、10箇所の隣接するへリックス領域及びループ
が存在し、それぞれが二硫化物が結合したシステイン対により連結されているこ
とがわかる。空間充填モデルはたんぱく質の表面上に露出しているループ領域を
予測するために用いられた。アミノ酸二セグメントを選択して表面露出領域とし
（ループ53-62、ループ360-369）、三つ目をたんぱく質内に埋没していると推測
される領域とした（ループ450-463）。

【０１２４】 MSAループ領域におけるMycエピトープの表出 予測されたループが実際にアル
ブミン分子の表面に露出しているのかを調べるために、マウス血清アルブミン（
MSA）をmycエピトープEQKLISEEDLに含まれるように修飾した。mycエピトープを
３つのアミノ酸セグメントの各々の中央、ループ53-62のアミノ酸57-58、ループ
360-369のアミノ酸364-365、ループ450-467のアミノ酸467-468に挿入した。Cos7
細胞に野生種MSAまたは各種mycを含有するMSA作成物のいずれかを形質移入した
。そのたんぱく質の培地中ににおける検出は、まず、MSA及びmycエピトープに特
異的な抗体を用いてウェスタンブロット法で行った。図２の左図に見られるよう
に、MSAまたはMSA-Mycを形質移入した細胞の培地から採取したサンプルにのみ、
アルブミンたんぱく質が検出された。さらに、MSA-Mycを形質移入した細胞から
採取したサンプルのみ、mycエピトープが陽性であった。サンプルはすべてSDS-P
AGEシステムのために変性しているため、この分析では表面に露出しているmycエ
ピトープとたんぱく質内に埋没しているmycエピトープを識別することはできな
い。この分析には、myc特異抗体を用いた免疫沈降法が用いられた。この実験で
は、調整培地を抗体と直接混合するか(N, 未変性）、またはまず0.1% SDS及び1m
M b-メルカプトエタノール存在下で変性させてから加熱（100℃、10分間）して
抗体を加えた（D、変性）。免疫沈降後、myc抗体で沈殿することができるたんぱ
く質を、MSA特異抗体を用いてウェスタンブロット法で検出した。図２の右図は
、予想の通り、ループ53-62及び360-369に挿入されたmycを有するアルブミンた
んぱく質が、たんぱく質が天然型か変性型かにかかわらずmyc抗体と結合してい
たことを示す。反対に、mycが、予測された埋没領域ループ450-463に挿入された
場合には、たんぱく質を最初に変性させた場合にのみ抗体と結合した。この実験
は、ループ53-62及び360-369がMSAたんぱく質の表面に露出しており、したがっ
て表出に適していることを明らかに示唆している。さらに、450-463のループは
埋没している。

【０１２５】 ウシ毛細血管上皮細胞(BCE)MSA-RGDの阻害 本実験の目的は、RGDペプチド(VR
GDF)を有するMSAの機能がループ53-58領域のたんぱく質(MSA-myc-RGD)の表面上
に表出していることを確認することである。RGDが選択されたのは、このペプチ
ドが上皮細胞上のavb3インテグリン受容体に効率的に結合し、その増殖を阻害す
るためである。Cos7細胞の三つのウェルに以下の作成物を形質移入した。その作
成物はMSA-myc（mycエピトープをMSAのC末端部に繰り返し加えた）、MSA-myc-RG
D、またはpAM7スタファである。このCos7細胞をトランスウェル^R組織培養プレー
トの下段のチャンバに入れ、上段のチャンバにはBCE細胞を入れて増殖した。BCE
細胞の増殖を刺激するために、FGFを下段のチャンバに加え、またFGFなしのコン
トロールの場合は加えず、細胞を72時間増殖させた。pAM7スタファの一組のウェ
ルには6.25mM c-RGDペプチドも加えた。細胞増殖はカルセイン結合蛍光アッセイ
で測定した。図３の左図は、それぞれの吸光度(OD)のグラフである。データから
、FGFの添加によりBCE細胞の増殖の刺激は２倍になることがわかる。この増殖は
c-RGDペプチド及びMSA-myc-RGDたんぱく質の分泌により阻害された。右図は同じ
データを異なる視点から見たものである。この例では、増殖の阻害度がそれぞれ
グラフになっている。データは、MSA-Myc-RGDたんぱく質がBCE細胞の増殖を53％
阻害し、阻害度はRGDペプチドを加えたときのものと等しかったことを示す。MSA
分子表面上に表出したRGDペプチドは、内因的に添加した遊離RGDペプチドと同程
度効果的にBCE細胞の増殖を阻害し、このペプチドはループ状の部位にその活性
を保持していることが示された。

【０１２６】 当業者は、ここに開示した発明の等価物を数多く認識するであろうが、それら
はすべて本発明の範囲内である。ここに引用したすべての文献、特許及び出願は
言及によりここに編入する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒト血清アルブミン(HSA)の三次元構造を示す。

【図２】 マウス血清アルブミン(MSA)-Myc融合作成物の細胞への形質移入及びそれに続
く融合たんぱく質の発現と、MSAたんぱく質の異種配列の位置によりMSA及びMyc
抗体がMSA-Myc融合たんぱく質に結合する様子を示す。

【図３】 ウシ毛細血管上皮細胞のFGF誘発増殖のRGDによる阻害及びMSA-myc-RGD融合た
んぱく質による阻害を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/36 Ａ６１Ｋ 35/407 35/407 35/76 35/76 48/00 38/00 Ａ６１Ｐ 35/00 48/00 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 35/00 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/705 １１１ 14/76 Ｃ０７Ｋ 14/705 19/00 14/76 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 Ａ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ランペール ルー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02465 ニュートン ルッセル ロード 112 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA07 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 HA08 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA16 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA41 BA44 CA53 DA37 NA03 NA12 NA14 ZA362 ZB212 ZB262 4C087 AA02 BB34 BB44 BB47 BB48 BB52 BB65 BC83 NA14 ZA36 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 BA54 CA40 DA50 DA51 EA20

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物活性な異種のペプチド配列を内部に挿入させて有する、血
   清アルブミンたんぱく（SA）を含むキメラポリペプチド。
2. 【請求項２】 Aが血清アルブミン（SA）の第一フラグメントを表し； Bが生物活性な異種のペプチド配列を表し； CがSAの第二ペプチドフラグメントを表す、 構造A-B-Cを有するキメラポリペプチド。
3. 【請求項３】 血清アルブミン（SA）たんぱくのＮ末端フラグメントを含む第
   一ペプチドフラグメントと、 生物活性な異種のペプチド配列を含む第二ペプチドフラグメントと、 SAのＣ末端フラグメントを含む第三ペプチドフラグメントと を含むキメラポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記異種のペプチド配列が、脈管形成阻害たんぱく又はポリペ
   プチドの一フラグメントを含む、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】 前記脈管形成阻害たんぱく又はポリペプチドが、アンジオスタ
   チン、エンドスタチン、及びこれらのペプチドフラグメントから成る群より選択
   される、請求項４に記載のキメラポリペプチド。
6. 【請求項６】 前記異種のペプチド配列が細胞表面受容体たんぱくに結合する
   、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
7. 【請求項７】 前記受容体たんぱくがＧたんぱく共役受容体である、請求項６
   に記載のキメラポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記受容体たんぱくがチロシンキナーゼ受容体である、請求項
   ６に記載のキメラポリペプチド。
9. 【請求項９】 前記受容体たんぱくがサイトカイン受容体である、請求項６に
   記載のキメラポリペプチド。
10. 【請求項１０】 前記受容体たんぱくがMIRR受容体である、請求項６に記載の
    キメラポリペプチド。
11. 【請求項１１】 前記受容体たんぱくがオーファン受容体である、請求項６に
    記載のキメラポリペプチド。
12. 【請求項１２】 前記キメラポリペプチドが細胞外受容体又はイオンチャンネ
    ルに結合する、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
13. 【請求項１３】 前記キメラポリペプチドが前記受容体又はイオンチャンネル
    のアゴニストである、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
14. 【請求項１４】 前記キメラポリペプチドが前記受容体又はイオンチャンネル
    のアンタゴニストである、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
15. 【請求項１５】 前記キメラポリペプチドがアポトーシスを誘導する、請求項
    １、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
16. 【請求項１６】 前記キメラポリペプチドが細胞増殖を変調する、請求項１、
    ２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
17. 【請求項１７】 前記キメラポリペプチドが細胞種の分化を変調する、請求項
    １、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
18. 【請求項１８】 前記異種のペプチド配列が４から４００個の間の残基を含む
    、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
19. 【請求項１９】 前記異種のペプチド配列が４から２００個の間の残基を含む
    、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
20. 【請求項２０】 前記異種のペプチド配列が４から１００個の間の残基を含む
    、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
21. 【請求項２１】 前記異種のペプチド配列が４から２０個の間の残基を含む、
    請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
22. 【請求項２２】 前記キメラポリペプチドの三次構造が、天然SAの三次構造に
    類似である、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
23. 【請求項２３】 前記挿入されたペプチド配列が、天然SA配列の一部を置換し
    ている、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
24. 【請求項２４】 前記挿入されたペプチド配列と、天然SA配列の置換された部
    分との長さが等しくない、請求項２３に記載のキメラポリペプチド。
25. 【請求項２５】 血中の前記ポリペプチドの半減期が１４日以上である、請求
    項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
26. 【請求項２６】 血中の前記ポリペプチドの半減期が１０日以上である、請求
    項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
27. 【請求項２７】 血中の前記ポリペプチドの半減期が天然SAの半減期の５０％
    以上である、請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチド。
28. 【請求項２８】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドをコード
    する核酸。
29. 【請求項２９】 請求項２８の核酸を含む送達ベクタ。
30. 【請求項３０】 前記送達ベクタがウィルス又はレトロウィルスを含む、請求
    項２９に記載の送達ベクタ。
31. 【請求項３１】 前記ウィルス又はレトロウィルスが、アデノウィルス、アデ
    ノ随伴ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、又はワクシニアウ
    ィルスから成る群より選択される、請求項３０に記載の送達ベクタ。
32. 【請求項３２】 請求項２９の送達ベクタに暴露してある標的細胞を含むトラ
    ンスフェクトされた細胞。
33. 【請求項３３】 前記細胞が、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝細胞
    、分泌腺細胞、造血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択される、請求項３２
    に記載のトランスフェクトされた細胞。
34. 【請求項３４】 薬学的に容認可能な賦形剤と、請求項１、２、又は３に記載
    のキメラポリペプチドとを含む製剤。
35. 【請求項３５】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドを製剤と
    して生物に投与するステップを含む、前記生物の疾患を処置する方法。
36. 【請求項３６】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドをコード
    する遺伝物質を含む送達ベクタを提供するステップと、 標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、前記
    ベクタをインビボで前記標的細胞に導入するステップと を含む、生物の疾患を処置する方法。
37. 【請求項３７】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドをコード
    する遺伝物質を含む送達ベクタを提供するステップと、 前記ベクタを標的細胞にエクスビボで導入するステップと、 前記標的細胞を誘導して前記ポリペプチドを発現させるのに充分な条件下で、
    前記導入されたベクタを含有する前記標的細胞を生物に導入するステップと を含む、生物の疾患を処置する方法。
38. 【請求項３８】 前記標的細胞が、血球、骨格筋細胞、幹細胞、皮膚細胞、肝
    細胞、分泌腺細胞、造血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択される、請求項
    ３６又は３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 Aが、式中それぞれ個別に、血清アルブミン（SA）の一フラ
    グメントを表し； Bが、式中それぞれ個別に、生物活性な異種のペプチド配列を表し； Cが、式中それぞれ個別に、第二の生物活性な異種のペプチド配列、又は、血
    清アルブミン（SA）の一フラグメントを表し； nが０より大きい整数である、 構造（A-B-C）nを有するキメラポリペプチド。
40. 【請求項４０】 B及びCが同一の配列を含む、請求項３９に記載のポリペプチ
    ド。
41. 【請求項４１】 B及びCが一個のタンパク質のフラグメントを含む、請求項３
    ９に記載のポリペプチド。
42. 【請求項４２】 B及びCが二つの異なるタンパク質のフラグメントを含む、請
    求項３９に記載のポリペプチド。
43. 【請求項４３】 少なくとも二つの生物活性な異種のペプチド配列を内部に挿
    入させて有する、血清アルブミンたんぱく（SA）を含むキメラポリペプチド。
44. 【請求項４４】 前記異種のペプチド配列が同一である、請求項４３に記載の
    ポリペプチド。
45. 【請求項４５】 前記異種のペプチド配列が一個のタンパク質の別個の配列を
    含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
46. 【請求項４６】 前記異種のペプチド配列が、少なくとも二つの異なるタンパ
    ク質を由来とする配列を含む、請求項４４に記載のポリペプチド。
47. 【請求項４７】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドを製剤と
    して生物に投与するステップを含む、前記生物において、細胞増殖、細胞分化、
    及び細胞死のうちの一つ又はそれ以上を変調する方法。
48. 【請求項４８】 請求項１、２、又は３に記載のキメラポリペプチドをコード
    する遺伝物質を含む送達ベクタを提供するステップと、 前記ポリペプチドを発現するように標的細胞を誘導するのに充分な条件下で、
    前記ベクタを前記標的細胞にインビボで導入するステップと を含む、生物において、細胞増殖、細胞分化、及び細胞死のうちの一つ又はそれ
    以上を変調する方法。