KR100452008B1

KR100452008B1 - 시그널 서열 트래핑법

Info

Publication number: KR100452008B1
Application number: KR10-2000-7005715A
Authority: KR
Inventors: 기타무라도시오; 고지마데쯔오
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 기타무라 도시오
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-26
Publication date: 2004-10-08
Also published as: WO1999026978A1; EP1033374B1; CA2311678A1; AU1260799A; NO330269B1; JP3499528B2; CN1214041C; NO20002670L; CN1285847A; RU2230751C2; IL136310A0; EP1033374A1; US6866998B1; KR20010032473A; HK1032065A1; NO20002670D0; EP1033374A4; IL136310A; CA2311678C

Abstract

항상적 활성형 mpl의 분비 시그널 및 세포외 영역의 대부분을 제거하여 분비능력을 잃은 인간 mpl을 코드하는 DNA를 제조했다. 이것에 검사대상 cDNA로서, 공지의 분비단백질을 코드하는 cDNA 및 그 분비단백질로부터 분비 시그널영역을 제거한 펩티드를 코드하는 cDNA를 각각 연결하고, 이들 키메라 유전자를 각각 세포 내에서 발현시켜 세포의 증식능력의 검토를 행한 결과, 검사대상 cDNA로서 공지의 분비단백질을 코드하는 cDNA를 사용한 경우에는 세포의 증식이 검출되는 한편, 분비 시그널영역을 제거한 펩티드를 코드하는 cDNA를 사용한 경우에는 세포의 증식이 검출되지 않는 것을 발견하였다. cDNA 라이브러리를 제작하고 본 발명의 방법에 의해 스크리닝을 행하여, I형 막단백질, II형 막단백질을 포함하는 분비단백질을 코드하는 cDNA를 검출, 단리할 수 있었다.

Description

시그널 서열 트래핑법{Signal sequence trapping method}

현재까지, 호르몬이나 성장인자 등의 단백질을 코드하는 유전자가 단리되고, 이를 토대로 제조한 많은 재조합 단백질이 의약품 등으로서 상품화되어 있지만, 그 대부분은 분비단백질이라 할 수 있다. 따라서, 신규한 분비단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 것은, 새로운 의약품을 개발하는데 있어서 상당히 중요한 단계이다. 이 때문에 지금까지 분비단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 방법에 대한 개발이 행해져 왔다. 그 하나로서, 본 발명자들의 방법(특개평6-315380호 공보)을 들 수 있다. 이 방법에서는, 분비단백질에는 세포 내에서 발현한 단백질을 세포 표면으로 이행시키기 위한 시그널 서열이 있는 것에 착안하여, 분비단백질인 인간 IL-2수용체의 α사슬의 시그널 서열을 제거하고, 그 부분에 표적 세포 내지는 표적 조직 유래 mRNA의 5'부분에 상당하는 짧은 cDNA 단편을 삽입한 라이브러리를 구축하여, 이 라이브러리를 세포에 도입했다. 그리고 세포 내에 도입된 클론 중, 시그널 서열이 삽입된 클론에서는 IL-2수용체가 세포 표면에 발현하지만, 역으로 시그널 서열이 삽입되어 있지 않은 클론에서는 IL-2수용체는 세포 표면으로 이행할 수 없는 것을이용하여 시그널 서열의 유무를 항IL-2수용체 항체에서 검출했다.

또한, GI사는 효모의 대사효소를 이용한 교묘한 시스템을 개발했다(미국특허 제5,536,637호 명세서). 대사효소인 인베르타아제는 분비효소로서 배지 중의 수크로오스를 포도당과 과당으로 분해하여 에너지로의 변환을 가능하게 한다. 이 때문에 이 효소를 분비할 수 없는 변이주는 탄소원으로서 포도당을 포함하지 않고 수크로오스만을 포함하는 배지에 있어서는 생육할 수 없다. 이 방법은 이러한 사실에 착안하여 인베르타아제 유전자에 cDNA를 연결한 라이브러리를 구축하여 인베르타아제 결손 효모에 도입하고, 수크로오스 배지에서 배양하여 생육하는 클론을 선발함으로써 시그널 펩티드를 갖는 클론의 단리를 행한다는 것이다.

그러나, 본 발명자들의 방법에서는 항체를 이용하여 검출하기 때문에 양성 클론의 선발이 번잡하고, 검출감도가 낮은 등의 결점이 있고, GI사의 방법에는 효모에 있어서 분비효율이 나쁜 클론을 단리할 수 없다는 문제점이 있었다. 또한 이들 방법에서는 너무 커다란 단백질을 융합하면 항원성을 잃거나, 또한 효소활성을 잃을 가능성이 있기 때문에 짧은 cDNA 밖에 검출에 사용할 수 없다는 문제점도 있었다. 또한 N말단이 세포 내에, C말단이 세포 외에 존재하여 시그널 앵커 서열을 갖는 Ⅱ형 막단백질을 검출할 수 없다는 문제도 있었다.

본 발명은 유전자공학 분야에 속하고, 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA를 검출하고, 단리하는 방법에 관한 것이다.

도 1은, 본 발명에 있어서 분비능력의 검출에 이용한 펩티드 및 그 펩티드를 발현한 BAF/03세포의 사이토카인 비의존적 증식능력을 검출한 결과를 나타낸다.

본 발명은 검사대상 cDNA가 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는지의 여부를 간편하게 검출하는 방법 및 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 간편하게 단리하는 방법이며, 긴 펩티드 코드영역을 갖는 cDNA를 이용할 수 있는 방법을 제공한다.

사이토카인 수용체 등의 단백질은 세포 표면으로 이행하여 리간드와의 회합에 의해 2량체화하여 세포증식을 유도한다. 또한 이들 단백질의 세포 표면으로의 이행능력(분비능력)은 단백질 중의 시그널 서열에 의존하고 있는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 이들 단백질의 분비 시그널(나아가서는 세포외 영역)을 제거하고, 그 대신에 목적으로 하는 펩티드를 융합한 융합 단백질을 세포 내에서 발현시켜 이 세포의 증식능력을 검출함으로써, 그 목적으로 하는 펩티드가 분비능력을 갖는지의 여부를 검출할 수 있다고 생각했다. 즉, 그 목적으로 하는 펩티드가 분비능력을 갖으면 발현시킨 융합 단백질이 세포 표면으로 이행하고 2량체화하여 세포증식을 유도하는 한편, 그 펩티드에 분비능력이 없으면 융합 단백질은 세포 표면으로 이행할 수 없어 세포증식을 유도할 수 없기 때문에, 세포증식이라는 간단한 지표에 의해 융합한 펩티드가 분비능력을 갖는지의 여부를 검출할 수 있다고 생각했다. 또한, 세포증식이 검출된 세포를 선발함으로써 분비능력을 갖는 펩티드를 양성 (positive) 선발할 수 있다고 생각했다. 따라서, 본 발명자들은 세포 표면으로 이행하여 2량체화함으로써 세포증식을 유도하는 단백질로서 mpl(트롬보포이에틴 수용체)을 선택하고, 이것을 이용한 분비능력을 갖는 펩티드의 검출, 단리방법의 구축을 행했다.

구체적으로는, 이전에 본 발명자들이 발견한 항상적 활성형 mpl(이 mpl은 리간드 비존재 하에서도 시그널을 전달함으로써 IL-3의존성 세포주에 자율증식성을 부여하도록 개변되어 있다;Blood 88,1399-1406,1996)의 분비 시그널 및 세포외 영역의 대부분을 제거하여 분비능력을 잃은 인간 mpl을 코드하는 DNA를 제조했다. 그리고, 이것에 검사대상 cDNA로서, 공지의 분비단백질을 코드하는 DNA 및 그 분비단백질로부터 분비 시그널 영역을 제거한 펩티드를 코드하는 DNA를 각각 연결하고, 이들 키메라 유전자를 각각 세포 내에서 발현시켜 세포의 증식능력의 검토를 행했다. 그 결과, 본 발명자들은 검사대상 cDNA로서 공지의 분비단백질을 코드하는 DNA를 사용한 경우에는 세포의 증식이 검출되는 한편, 분비 시그널영역을 제거한 펩티드를 코드하는 DNA를 사용한 경우에는 세포의 증식이 검출되지 않는 것을 발견했다. 이것으로 본 발명자들은 구축한 시스템이, 세포의 증식을 지표로서, 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA로서 긴 펩티드 코드영역을 갖는 DNA를 간편하게 검출하여 단리할 수 있다는 것을 발견했다. 또한, 실제로 스크리닝을 행하고 I형 막단백질이나 Ⅱ형 막단백질을 포함하는 분비단백질을 코드하는 DNA를 검출하고, 단리하는 것에 성공했다.

즉, 본 발명은,

(1) 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로서 분비능력을 갖지 않는 펩티드,

(2) 사이토카인 수용체에서 유래하는, (1)에 기재된 펩티드,

(3) mpl에서 유래하는, (1)에 기재된 펩티드,

(4) 리간드 비의존성인, (2) 또는 (3)에 기재된 펩티드.

(5) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는, (1)에 기재된 펩티드,

(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 코드하는 DNA,

(7) (6)에 기재된 DNA의 5' 상류에 cDNA 삽입부위를 갖는 벡터,

(8) 레트로바이러스에서 유래하는, (7)에 기재된 벡터,

(9) (6)에 기재된 DNA의 5' 상류에 cDNA가 삽입된 (7) 또는 (8)에 기재된 벡터,

(10) (9)에 기재된 벡터를 보유하는 세포,

(11) 포유동물세포인, (10)에 기재된 세포,

(12) 검사대상 cDNA가 코드하는 펩티드가 분비능력을 갖는지의 여부를 검출하는 방법으로,

(a) (7)에 기재된 벡터에 검사대상 cDNA를 연결하는 공정,

(b) 공정(a)에 의해 제조한 벡터를 세포에 도입하는 공정,

(c) 공정(b)에 의해 제조한 형질전환체를 배양하여 증식능력을 검출하는 공정,

을 포함하는 방법,

(13) 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 단리하는 방법으로,

(a) (7)에 기재된 벡터에 cDNA 라이브러리를 연결하는 공정,

(b) 공정(a)에 의해 제조한 벡터를 세포에 도입하는 공정,

(d) 공정(c)에 있어서 증식능력을 갖는 것으로 판정된 세포를 선택하여, 그 세포로부터 cDNA를 단리하는 공정,

을 포함하는 방법,

(14) 벡터가 레트로바이러스에서 유래하고 벡터가 도입된 세포가 포유동물세포인, (12) 또는 (13)에 기재된 방법,

(15) (13)에 기재된 방법에 의해 단리되는, 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA,

(16) (15)에 기재된 cDNA에 의해 코드되는 펩티드,

에 관한 것이다.

본 발명은 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 검출방법에 있어서는 분비능력을 갖는 펩티드를 검출하기 위해, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로서 분비능력을 갖지 않는 펩티드를 코드하는 DNA를 사용하는 것을 특징으로 한다. 「세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드」로서는, 예를 들면 mpl(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644,1992), GM-CSF 수용체 α사슬, GM-CSF 수용체 β사슬(Blood 83:2802,1994), 에리스로포이에틴 수용체(Nature 348:647, 1990), c-kit 수용체(Blood 85:790,1995), neu(Nature 339:230,1989) 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에 있어서는, 이들 펩티드의 분비능력이 제거된 펩티드를 코드하는 cDNA를 구축한다. 펩티드의 분비능력의 제거는 통상, 시그널 서열 영역의 제거에 의해 행한다. 이들 펩티드의 시그널 서열로서는, 예를 들면 인간 mpl의 경우에는 단백질의 아미노산 서열의 1번 위치에서 25번 위치의 영역(Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:5640-5644,1992), hGM-CSF 수용체 β의 경우에는 1번 위치에서 48번 위치(Proc.Natl.Acad.Sci USA 87:9655-9659,1990)의 영역이다. 바람직하게는, 또한 펩티드의 세포외 영역의 제거를 행한다.

구축된 cDNA가 코드하는 펩티드는 바람직하게는 리간드 비의존성이다(리간드의존성의 경우에는 융합 단백질을 형성함으로써 리간드 결합능력을 잃어 불활성화할 가능성이 있다). 리간드 비의존성으로 하기 위한 방법으로서는, 예를 들면 펩티드로의 변이의 도입을 들 수 있다. mpl에 있어서는 498위치의 Ser을 Asn으로 치환함으로써 리간드인 트롬보포이에틴에 대한 의존성을 소실시키는 것이 가능하다 (Blood 88:1399-1406,1996). 본 발명의 방법에 적용하는 mpl은, 바람직하게는 서열번호: 4의 아미노산 서열로 된다.

이것에 의해 제조한 DNA는, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 적당한 발현벡터에 삽입한다. 발현벡터로서는, 특별히 제한은 없지만 바이러스 감염을 이용하여 여러 가지 세포종에 높은 효율로 벡터의 도입이 가능하고, 벡터에 도입한 DNA를 세포 내에서 안정적으로 발현시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터가 바람직하다. 레트로바이러스 벡터로서는, 예를 들면 pBabeX(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92:9146-9150, 1995), pMX(Exp. Hematol.24:324-329,1996) 등의 cDNA 라이브러리 작성용으로 개변된 레트로벡터를 들 수 있다. 레트로바이러스 이외에도 아데노바이러스, EB바이러스, 파필로마바이러스 등의 바이러스 벡터, pEF-BOS(Nucleic Acids Research, Vol. 18,No.17), pcD SRα296(Molecular and Cellular Biology, Jan. p466-472,1988) 등의 플라스미드 벡터 등을 사용하는 것도 가능하다. 발현벡터는 융합 단백질을 발현시키기 위해, 삽입된 상기 DNA의 5' 상류에 분비능력을 검출하기 위한 cDNA의 삽입부위를 갖는다. cDNA의 삽입부위의 구축은 당업자에게 공지의 방법으로 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서는, 다음으로, 이것에 의해 제조한 벡터에 검사대상cDNA를 연결한다. 검사대상 cDNA는 벡터에 삽입한 「세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA」의 5' 상류에 연결한다. 검사대상 cDNA로서는, 특별히 제한은 없고 분비능력을 갖는 펩티드인지의 여부를 검출하고 싶은 목적으로 하는 펩티드를 코드하는 cDNA를 사용하는 것이 가능하다. 벡터로의 검사대상 cDNA의 연결은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 어댑터 링커 등을 개재시켜 T4 리가제를 사용하여 연결하는 방법이 알려져 있다 (Maniatis T:Molecular Cloning)

본 발명의 방법에 있어서는, 다음으로, 이것에 의해 제조한 벡터를 세포에 도입한다. 벡터를 도입하는 세포로서는, 예를 들면 Ba/F3,OTT-1,FDCP-1,TF-1 등의 사이토카인 의존성 증식세포를 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 벡터의 세포로의 도입은 공지의 방법, 예를 들면 리포펙션법, 인산칼슘법, DEAE-Dextran법, 전기천공법 등에 의해 행할 수 있다. 레트로바이러스의 감염을 이용하여 벡터의 도입을 행하는 경우에는 벡터를 팩키징 세포에 도입해서, 벡터를 바이러스입자로 팩키징한다. 벡터의 팩키징 세포로의 도입은 공지의 방법, 예를 들면 인산칼슘법, 리포펙션법 등에 의해 행할 수 있다. 팩키징세포로서는 예를 들면, BOSC23, Bing.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8392-8396,1993), NX-E, NX-A(G.P. Nolan, Immunity 8:461-471,1998) 등을 이용하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서는 다음으로, 이것에 의해 제조한 형질전환체를 배양하여 증식능력을 검출한다. 형질전환체의 배양은, 벡터에 삽입한 cDNA가 코드하는 단백질이 리간드 비의존성 활성형 사이토카인 수용체와의 융합 단백질로서 발현하는 경우에는, 본래 세포가 의존하는 사이토카인(리간드)을 포함하지 않는 배지에서 배양을 행한다. 그 결과, 두드러진 세포의 증식이 검출되면 검사대상 cDNA는 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하고 있다(양성 클론)고 판정할 수 있고, 두드러진 세포의 증식이 검출되지 않으면 검사대상 cDNA는 분비능력을 갖지 않는 펩티드를 코드하고 있다(음성 클론)고 판정된다. 한편, 삽입한 cDNA가 코드하는 단백질이 리간드 의존성 사이토카인 수용체와의 융합 단백질로서 발현하는 경우에는, 리간드 의존하에서 배양을 행한다. 리간드 비첨가 대조와의 비교를 필요에 따라 행해, 두드러진 세포의 증식이 검출되면 양성 클론으로 판정된다. 형질전환체 배양의 그 외의 조건은, 당업자라면 벡터가 도입되는 세포나 발현시키는 융합 단백질의 성질 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명은 또한, 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 단리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단리방법에 있어서는, 상기의 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 검출하는 방법에 있어서 사용한 검사대상 cDNA에 대신하여, cDNA 라이브러리를 벡터에 연결한다. 구체적인 일례로서는, 랜덤프라이머로 작성한 cDNA에 BstXI어댑터를 연결하고, 이것을 벡터의 BstXI사이트와 활성형 mpl의 세포외 절단부위에 삽입한 BstXI사이트의 사이에 삽입을 행한다. cDNA 라이브러리로서는, 그 기원에 특별히 제한은 없다. 분비능력을 갖는 펩티드를 단리하고 싶은 목적으로 하는 세포, 조직 등을 기원으로서 사용하는 것이 가능하다. cDNA 라이브러리의 구축에는 많은 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 단리방법에 있어서는 cDNA 라이브러리가 도입된 세포 중에서 증식능력을 갖는 것으로 판정된 세포를 선택한다. 선택된 세포에 도입된 cDNA는 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하고 있는 것으로 생각된다. 증식이 검출된 세포로부터의 cDNA의 단리는, 예를 들면 세포로부터 게놈 DNA 또는 RNA를 추출하고, 클로닝사이트를 사이에 두는 위치로 설정된 프라이머를 사용하여 PCR로(RNA를 사용하는 경우는 역전사효소로 DNA로 한 후에) 목적의 cDNA를 증폭시켜 회수함으로써 행할 수 있다.

회수된 cDNA가 전장(full-length)인지, 또는 그 단편인지, 나아가서는 신규한 분비 펩티드를 코드하는 cDNA인지는, 기존의 데이터베이스를 사용하여 cDNA의 서열을 비교함으로써 행할 수 있다. 회수된 cDNA가 완정장이 아닐 경우에는, 회수된 cDNA를 사용하여 2차 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 전장 cDNA를 단리할 수 있다. 2차 cDNA 라이브러리는 당업자에게 주지의 방법, 예를 들면 문헌 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, J. Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(New York, 1989)」에 기재된 방법에 의해 구축할 수가 있다.

본 발명의 방법에 의해 단리되는 분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA는, 관련된 질환의 유전자 치료나 의약품으로서 유용한 재조합 단백질의 생산 등에 이용된다. 단리한 cDNA로부터의 재조합 단백질의 생산은 당업자에게 공지의 방법, 예를 들면 그 cDNA를 적당한 발현 벡터, 예를 들면 pED(Kaufman, et al., Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490 (1991)), pEF-BOS(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. 18, 5322(1990)), pXM, pJ13 및 pJL4(Gough et al., EMBO J. 4, 645-653 (1985)) 등에 끼워 넣어 숙주세포에 도입하고, 이것에 의해 얻어진 형질전환체를배양하여 형질전환체에 발현시킨 재조합 단백질을 정제함으로써 행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예로 더욱 상세히 설명하지만 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 벡터의 구축

마우스 골수증식성 백혈병 바이러스는 env와 마우스 mpl의 막관통 도메인으로부터 N말단 측에 56아미노산 잔기분의 세포외 도메인과 막관통 도메인 및 세포 내 도메인이 융합해 있다. 이 영역에 대응하는 인간 mpl의 449번째의 류신으로부터 636번째의 정지코돈 사이를 코드하는 cDNA를, 하기의 GM-CSF와 프레임이 맞도록 Leu449 바로 앞에(1염기 삽입) NotI사이트를 갖고, 정지코돈의 바로 뒤에 SalI사이트를 갖는 형태로 얻기 위해 PCR을 행했다. 주형으로서 인간 활성형 mpl의 cDNA를 클론화한 「pBabeX MPL^M」(Blood 88:1399-1406, 1996)을 사용하고, 프라이머로서 하기 표1의 프라이머를 사용했다.

10㎍/ml 주형 DNA, 1μM 각 프라이머, KOD DNA 폴리머라제(TOYOBO) 50단위/ml, 1mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs, 120mM Tris-HCl(pH8), 10mM KCl, 6mM(NH₄)₂SO₄, 0.1% TritonX-100, 10㎍/ml BSA를 포함하는 반응액을 GeneAmpPCR System(PERKIN ELMER)으로 이하의 조건의 PCR에 제공했다. 98℃에서 60초의 변성 후, 98℃에서 15초, 60℃에서 10초, 74℃에서 30초의 주기를 25회 행했다. PCR 반응물을 아가로오스 전기영동에 걸어, 목적으로 하는 0.6kbp 단편을 포함하는 부분을 잘라내고, DNA를 추출했다. 또한 T4 polynucleotide kinase(TOYOBO)를 사용하여 5' 말단을 인산화했다. 이 DNA 단편과 별도로 SmaI(다까라주조) 및 Bacterial Alkaline Phosphtase(BAP, 다까라주조) 처리한 pBluescript SK(-)(Stratagene)와 T4 DNA ligase(TOYOBO)를 작용시켜 연결했다. 얻어진 플라스미드에 삽입되어 있는 활성형 mpl cDNA의 염기서열을 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PERKIN ELMER)로 확인했다. 이 플라스미드를 NotI(다까라주조)와 SalI(다까라주조) 처리한 후, 상기와 마찬가지로 아가로오스 전기영동으로 0.6kbp 단편을 정제하고, 별도 NotI, SalI 및 BAP 처리하여 아가로오스 전기영동으로 정제한 pMX(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,vol. 92, 9146-9150, 1995)와 T4 DNA ligase로 연결하여 pMX v-mpl^M을 얻었다. 이 플라스미드 내에는 분비능력을 갖지 않는 활성형 mpl을 코드하는 cDNA가 삽입되어 있다. 삽입된 cDNA의 염기서열을 서열번호: 3으로, 그 cDNA가 코드하는 펩티드의 아미노산 서열을 서열번호: 4로 나타낸다.

다음에 인간 GM-CSF의 정지코돈을 NotI사이트로 치환한 cDNA를 얻기 위해, 주형으로서 인간 GM-CSF의 cDNA를 클론 pcDSR α298 hGM-CSF(Proc. Natl. Sci. Acad. USA 82:4360-4364, 1985)를 사용하고, 프라이머로서 하기 표2의 프라이머를 사용하여 PCR을 행했다.

EcoGM은 17번째의 세린을 번역 개시코돈 ATG로 치환하고, EcoGMss, EcoGM 공히 번역 개시코돈 ATG의 바로 앞에 EcoRI사이트 및 Kozak의 공통서열(consensus sequence)(J. Cell Biol 108:29,1989)을 설정했다. 시그널 서열을 갖는 GM-CSF는 EcoGMss와 GM Not의 조합에서, 시그널 서열을 결한 GM-CSF는 EcoGM과 GM Not의 조합에서 PCR을 행했다. 어닐링 온도(annealing temperature)를 55℃로 한 것 외에는상기와 동일하게 PCR을 행하여, 얻어진 PCR 단편을 pBluescript SK(-)로 클론화 했다. 얻어진 플라스미드에 삽입되어 있는 DNA의 염기서열을 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(PERKIN ELMER)로 확인했다. 이들 플라스미드를 EcoRI(다까라주조)와 NotI 처리한 후, 각각을 상기와 동일하게 하여 pMX v-mpl^M의 EcoRI-NotI사이트 사이에 삽입하고, 시그널 서열을 갖는 GM-CSF의 전장과 활성형 mpl의 449번째의 류신 이후의 C말단 부분의 융합 단백을 코드하는 「pMX GM(+)v-mpl^M」과 이것의 시그널 서열을 결한 「pMX GM(-)v-mpl^M」을 얻었다. 또한, 「pMX GM(+)v-mpl^M」 및 「pMX GM(-)v-mpl^M」에 삽입한 cDNA의 염기서열을 각각 서열번호: 8 및 서열번호: 10으로, 그 cDNA가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열번호: 9 및 서열번호: 11로 나타냈다.

[실시예 2] 감염실험

팩키징세포 BOSC23(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396,1993)에 LipofectAMINE(LIFE TECHNOLOGIES)을 사용하여, 상기의 각각의 플라스미드를 도입했다. BOSC23을 10% 소 태아혈청(FCS, JRH BIOSCIENCES)을 포함하는 달벡크개변 이글 배지(DMEM, 닛스이제약)에서 6㎝ dish(Corning)에 뿌려 넣고, 6시간 후, OPTI-MEM I 감소 혈청 배지(LIFE TECHNOLOGIES)로 세척하고, 먼저 200㎕ OPTI-MEM I로 희석한 18㎕ LipofectAMINE과 200㎕ OPTI-MEM I로 희석한 각각의 플라스미드 3㎍을 섞어 15분간 온실에서 방치한 것에 1.6ml OPTI-MEM I를 섞어 세포에 가했다. 5시간후, 2ml의 20% FCS를 포함하는 DMEM을 가해 19시간 배양했다. 그 후, 3ml의 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 치환하고, 24시간 후에 그 배양상청을 회수했다. 재조합 바이러스를 포함하는 배양상청에 마우스 인터루킨-3(IL-3) 및 10㎍/ml 폴리플렌 (Hexadimethrine Bromide, Sigma)을 가하고, 이것에 Ba/F3을 현탁하여 감염시켰다. 감염시킨지 24시간 후, 마우스 IL-3을 포함하지 않는 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 (닛스이제약)으로 2회 세포를 세척하고, 동 배지에서 배양을 계속했다.

그 결과, 시그널 서열을 포함하는 GM-CSF의 전장과의 활성형 융합 mpl(pMX GM(+)v-mpl^M유래)에서는 분비능력을 제거하지 않은 활성형 mpl과 동일하게 IL-3 비존재하에서 증식을 나타내는 세포가 확인되었다. 한편, 시그널 서열을 결한 GM-CSF와의 활성형 융합 mpl(pMX GM(-)v-mpl^M)에서는 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 도입하지 않은 대조의 Ba/F3와 동일하게 증식을 나타내지 않았다(도 1).

[실시예 3] 스크리닝

하기(표3)의 올리고뉴클레오티드를 합성하고 T4 polynucleotide kinase를 사용하여 5' 말단을 인산화했다. 이들을 혼합 후 95℃에서 변성하고 40℃까지 천천히 식히고 어닐링(annealing)시켜 카셋트 DNA를 제조했다.

NotI(다까라주조) 및 BAP 처리한 pMX GM(-)v-mpl^M과 이 카셋트를 혼합하고 T4 DNA ligase를 작용시켜 연결했다. 얻어진 플라스미드에 삽입되어 있는 카셋트의 방향이 BstXI, NotI의 순으로 되어 있는 것을 그 염기서열에서 확인했다 (pMX GM (-)v-mpl^M2). 쥐 신경 간세포주 MNS70으로부터 TRIZOL(GIBCO BRL)을 사용하여 RNA를 추출하고, 또한 oligo dT Column(Pharmacia)에 연결함으로써 polyA(+)RNA를 제조했다. SuperScript Choice System(GIBCO BRL)의 랜덤 헥서머를 사용하여 이중 사슬 cDNA를 합성했다. cDNA의 말단 평활처리 후 BstXI 어댑터(Invitrogen)를 부가하고, SizeSep 400 Spun Column(Pharmacia)을 사용하여 cDNA를 분획했다. 별도로 BstXI (다까라주조) 및 BAP 처리한 pMX GM(-)v-mpl^M2와 혼합 후 T4 DNA ligase를 작용시켜 연결했다. 이것을 Gene Pulser(BioRad)를 사용하여 전기천공법으로 대장균 DH1OB (GIBCO BRL)에 도입하여 cDNA 라이브러리를 구축했다.

라이브러리 재조합 대장균으로부터 추출한 플라스미드를 JETstar Column (GENOMED)을 사용하여 정제했다. 상기와 동일하게 하여 팩키징세포 BOSC23에 Lipofect AMINE을 사용하여 라이브러리 플라스미드를 도입했다. 재조합 바이러스를 포함하는 배양상청에 10ng/ml 마우스 IL-3 및 10㎍/ml 폴리플렌(Hexadimethrine Bromide, Sigma)을 가하고, 이것에 Ba/F3을 현탁하여 감염시켰다. 24시간 감염 후 세포를 인산 완충액으로 2회 세척하고 10% FCS를 포함하는 RPMI1640에서 배양을 계속했다. IL-3 비존재하에서 증식해 온 클론으로부터 염색체 DNA를 추출하고, cDNA 삽입부위를 사이에 두도록 설정한 프라이머

를 사용하여 PCR을 행해 cDNA 단편을 회수했다. PCR은 500ng 염색체 DNA, 500pM 각 프라이머, TaKaRa LA Taq(다까라주조) 2.5단위, 2.5mM MgCl₂, 0.3mM dNTPs 및 효소첨부 완충액을 포함하는 반응액 50㎕에 대해서 GeneAmpPCR Syslem2400에서 이하의 조건으로 행했다. 98℃에서 60초의 변성 후, 98℃에서 20초, 68℃에서 120초의 주기를 30회 행했다. PCR 반응물을 아가로오스 전기영동에 걸어 증폭된 단편을 포함하는 부분을 잘라내고, DNA를 정제했다. 얻어진 190클론으로부터 정제된 DNA 단편의 염기서열을 결정한 바, 150클론이 기지의 분비단백질 또는 막단백질을 코드하는 cDNA 또는 그 단편이었다. 또한, 나머지 40클론은 미지의 분비단백질이었다. 얻어진 기지의 분비단백질 중 몇 가지를 표5에 나타내었다. 표 중, 「길이」는 얻어진 cDNA 단편에 코드되어 있는 ORF 부분의 길이를 아미노산 잔기수로 나타낸 것이다. 얻어진 기지의 분비단백질을 코드하는 클론의 평균 길이는, 아미노산 잔기수로 273이었다. 또한, 「수탁번호」는, GenBank의 단백질의 데이터 베이스의 수탁번호를 나타낸다. 또한, 본 방법에서는 분비단백질 이외의 단백질을 코드하는 cDNA나, 역방향으로 삽입된 cDNA를 검출하는 백그라운드는 1% 이하였다.

본 발명에 의해, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로서 분비능력을 갖지 않는 펩티드를 이용한, 분비펩티드를 코드하는 cDNA의 검출 및 단리방법이 제공되었다. 본 발명의 방법은 세포의 증식을 지표로서 검출하기 때문에 상당히 간편하고 검출감도가 높다. 또한, 보다 긴 펩티드 코드영역을 갖는 cDNA를 검출하고 단리할 수 있기 때문에, 짧은 cDNA 단편의 검출을 행하는 종래의 방법보다 최초로 얻어지는 클론으로부터의 정보가 많다. 또한, I형 막단백질에 더하여, II형 막단백질을 포함하는 분비단백질을 검출, 단리할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA KITAMURA, Toshio <120> SIGNAL SEQUENCE TRAPPING METHOD <130> C1-902PCT <150> JP 1997-324912 <151> 1997-11-26 <160> 15 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 1 tgcggccgcc ctggagctgc gcccgcgatc ctgctaccgt tta 43 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 2 gtatgtcgac tcaaggctgc tgccaatag 29 <210> 3 <211> 579 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially manipulated human mpl sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(573) <400> 3 gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 48 Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu 1 5 10 15 cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 96 Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly 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Thr 175 180 185 gag acc gcc tgg atc tcc ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc 627 Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly 190 195 200 ctc aac gcc gtc ctg ggc ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca 675 Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala 205 210 215 cac tac agg aga ctg agg cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg 723 His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu 220 225 230 cac cgg gtc cta ggc cag tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg 771 His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro 235 240 245 250 ccc aag gcc aca gtc tca gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc 819 Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu 255 260 265 ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt 867 Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys 270 275 280 tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg 915 Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln 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Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser 300 305 310 Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr 315 320 325 330 Trp Gln Gln Pro <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized casette sequence <400> 12 ggccccagca cagtggc 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized casette sequence <400> 13 ggccgccact gtgctgg 17 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 14 gggggtggac catcctcta 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 15 cgcgcagctg taaacggtag 20

Claims

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검사대상 cDNA가 코드하는 펩티드가 분비능력을 갖는지의 여부를 검출하는 방법으로,

(a) 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드를 코드하는 DNA의 5' 상류에 cDNA 삽입부위를 갖는 벡터에 검사대상 cDNA를 연결하는 공정,

(b) 공정 (a)에 있어서 제조한 벡터를 세포에 도입하는 공정,

(c) 공정 (b)에 의해 제조한 형질전환체를 배양하여 증식능력을 검출하는 공정

을 포함하는 방법.
분비능력을 갖는 펩티드를 코드하는 cDNA를 단리하는 방법으로,

(a) 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드를 코드하는 DNA의 5' 상류에 cDNA 삽입부위를 갖는 벡터에 cDNA 라이브러리를 연결하는 공정,

(b) 공정 (a)에 있어서 제조한 벡터를 세포에 도입하는 공정,

(c) 공정 (b)에 의해 제조한 형질전환체를 배양하여 증식능력을 검출하는 공정,

(d) 공정 (c)에 있어서 증식능력을 갖는 것으로 판정된 세포를 선택하고, 그 세포로부터 cDNA를 단리하는 공정

을 포함하는 방법.
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제12항 또는 제13항에 있어서, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드가, 사이토카인 수용체에서 유래하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드가, mpl, GM-CSF 수용체 β사슬, EPO 수용체, c-kit 수용체, neu 또는 FLT-3에서 유래하는 방법.
제18항에 있어서, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드가, 리간드 비의존성인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드가, 서열번호: 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
제20항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스에서 유래하는 방법.
제20항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스에서 유래하고, 벡터가 도입되는 세포가 포유동물세포인 방법.
제12항의 방법에 사용하기 위한, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드로서, 서열번호:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA.
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제12항의 방법에 사용하기 위한, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드로서, 서열번호:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA의 5' 상류에 cDNA 삽입부위를 갖는 벡터.
제12항의 방법에 사용하기 위한, 세포 표면에서 2량체화함으로써 세포의 증식을 유도하는 능력을 갖는 펩티드로부터 분비시그날 영역이 제거된 펩티드로서, 서열번호:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드하는 DNA의 5' 상류에 cDNA가 연결된 벡터.
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