KR102660336B1 - 절단된 nkg2d 키메라 수용체 및 자연 살해 세포 면역요법에서의 그의 용도 - Google Patents

절단된 nkg2d 키메라 수용체 및 자연 살해 세포 면역요법에서의 그의 용도 Download PDF

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엔카르타, 인크.
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Abstract

본원에 개시된 몇몇의 구현예는 키메라 수용체를 발현하는 엔지니어링된 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 키메라 수용체는 특정 세포, 예컨대 암 세포 또는 감염성 질환에 의해 이환된 세포를 표적화하기 위한 향상된 능력을 NK 세포에 부여한다. 몇몇의 구현예는 NKG2D의 천연 리간드를 발현하는 세포를 표적화하는 NK 세포에 관한 것이며, NK 세포는 NK 세포가 표적 세포에 결합하는 경우 세포독성 및/또는 세포용해 효과를 야기하는 막횡단 및/또는 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 질환을 치료하기 위한 NK 세포 조성물의 용도도 또한 제공된다.

Description

절단된 NKG2D 키메라 수용체 및 자연 살해 세포 면역요법에서의 그의 용도
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 27일자 출원된 미국 가출원 제62/477,335호 및 2018년 2월 9일자 출원된 미국 가출원 제62/628,774호의 이익을 주장한다. 상기 열거된 출원의 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 자료의 참조에 의한 포함
본 출원은 본원과 동시에 제출되는 하기 ASCII 텍스트 파일에 함유된 서열 목록을 참조에 의해 포함한다:
a) 파일명: 44591144002SequenceListing.txt; 2018년 3월 27일 생성됨, 186 KB 크기.
많은 질환의 출현 및 지속은 악성 및 바이러스 감염 세포를 포함하는 비정상 세포에 대한 불충분한 면역 반응을 특징으로 한다. 면역요법은 다양한 질환의 치료를 위한 환자의 면역계의 이용 및 조작이다.
면역요법은 질환의 치료에서 새로운 기술적 진전을 제시하며, 면역 세포는 이환되거나 손상된 세포를 특이적으로 식별하고 이에 반응하는 특정 표적화 및/또는 이펙터 분자를 발현하도록 엔지니어링된다. 이것은 적어도 부분적으로 모든 세포가 영향을 받는 화학요법과 같은 더욱 전통적인 접근법과 대조적으로, 이환되거나 손상된 세포를 특이적으로 표적화할 가능성으로 인해 유망한 진전을 나타내며, 원하는 결과는 환자가 생존하게 하기에 충분한 건강한 세포가 생존하는 것이다. 한 가지의 면역요법 접근법은 관심 비정상 세포의 표적화된 인식 및 파괴를 달성하기 위한 면역 세포에서의 키메라 수용체의 재조합 발현이다.
이환된 세포 또는 감염 세포를 특이적으로 표적화하고 파괴하거나, 불능화시키거나, 다르게는 비활성이 되게 하기 위한 이러한 요구를 처리하기 위하여, 세포, 예컨대 자연 살해 세포에 향상된 표적화 및 세포독성을 부여하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아미노산 및 벡터가 본원에 제공된다. 또한, 이환되거나 손상된 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 세포의 생성 방법, 및 세포의 이용 방법이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이다.
몇몇의 구현예에서, (a) 세포외 수용체 도메인 및 (b) 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며, 예를 들어, NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 본원에 개시된 바와 같이, 구현예에 따라, 추가의 NKG2D 단편도 또한 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3제타를 포함한다. 일 구현예에서, CD3제타는 SEQ ID NO. 13을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되지만, 본원에 개시된 바와 같이, CD3제타와 상이하지만, 유사한 기능을 공유하는 서열도 또한 구현예에 따라 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인의 막횡단 영역은 CD8a 막횡단 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이펙터 도메인의 막횡단 영역은 CD8a 힌지 영역을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 4-1BB는 SEQ ID NO. 12를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되지만, 본원에 개시된 바와 같이, 4-1BB와 상이하지만, 유사한 기능을 공유하는 서열도 또한 구현예에 따라 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a, 4-1BB 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 18의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 추가의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 108의 핵산 서열에 의해 인코딩되지만, 본원에 개시된 바와 같이 SEQ ID NO. 108과 상이하지만 유사한 기능을 공유하는 서열도 또한 구현예에 따라 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 19의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 중 임의의 것은 또한 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)와 동시-발현될 수 있다. 일부 구현예에서, mbIL15는 SEQ ID NO. 16을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, mbIL15는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함한다. 구현예에 따라, mbIL15에 대한 다른 서열도 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mbIL15는 키메라 수용체와 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 비시스트론적으로(bicistronically) 발현된다. 다른 구현예에서, mbIL15는 개별 작제물 상에 동시-발현된다. 몇몇의 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 그의 발현을 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)의 발현과 커플링시킴으로써 추가로 향상된다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 OX-40 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, OX-40 도메인은 mbIL15 대신에 또는 이에 더하여 존재한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX-40 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 mbIL15를 비시스트론적으로 동시-발현하도록 구성된다. 일부 이러한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 예를 들어, 시토졸 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 하나 이상의 절단 부위(예를 들어, T2A, P2A, E2A 및/또는 F2A 절단 부위(들))를 포함한다. 일부 구현예에서, mbIL15는 시토졸 프로테아제 절단 부위에 의해 키메라 수용체에 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 시토졸 프로테아제 절단 부위에 의해 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 mbIL15에 커플링되는 SEQ ID NO: 90의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 시토졸 프로테아제 절단 부위에 의해 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO: 109의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15와 동시-발현된다. 본원에 개시된 바와 같이, 구현예에 따라, SEQ ID NO: 90, 91, 109, 16 및/또는 16과 상이하지만, 유사한 기능을 공유하는 서열도 또한 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX-40 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 mbIL15를 키메라 수용체와 비시스트론적으로 동시-발현하도록 구성된다. 일부 이러한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 작제물은 시토졸 프로테아제에 의해 인식되고 절단되는 하나 이상의 절단 부위(예를 들어, T2A, P2A, E2A 및/또는 F2A 절단 부위(들))를 포함한다. 일부 구현예에서, mbIL15는 시토졸 프로테아제 절단 부위에 의해 키메라 수용체에 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 시토졸 프로테아제 절단 부위에 의해 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 mbIL15에 커플링되는 SEQ ID NO: 100의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하며, SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15와 동시-발현된다. 본원에 개시된 바와 같이, 구현예에 따라, SEQ ID NO: 100, 101 및/또는 16과 상이하지만, 유사한 기능을 공유하는 서열도 또한 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 키메라 수용체를 발현하는 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 조성물을 암을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다.
일 구현예에서, NK 세포는 암 또는 감염성 질환을 갖는 환자로부터 단리된 자가 세포이다. 추가의 구현예에서, NK 세포는 공여자로부터 단리된 동종이계 세포이다.
또한, NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위한 약제의 제조에서의 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 용도가 본원에 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공된다.
몇몇의 구현예에 따라, 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 키메라 수용체는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함한다. 본원에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 세포외 수용체 도메인은 표적 세포 상의 리간드를 인식하고, 이에 결합하는 역할을 한다. 이펙터 도메인은 (세포외 도메인에 의한 표적 세포의 결합 시에) 표적 세포에 대하여 세포독성 활성을 야기하는 신호 캐스케이드를 움직이게 하는 신호를 전달하는 역할을 한다. 몇몇의 구현예에 따라, 폴리뉴클레오티드는 비-엔지니어링된 NK 세포에 비하여 예기치 못하게 증가된 세포독성을 제공하는 키메라 수용체를 인코딩한다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함한다. 몇몇의 구현예에 따라, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 기능적 단편(예를 들어, 전장 NKG2D의 절단물, 단편 또는 부분)이다. 본원에 사용되는 용어 "단편", "절단물" 및 "부분"에는 그들의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 또한 서로 상호교환 가능하여야 한다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 단편은 SEQ ID NO: 1의 서열의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 단편은 SEQ ID NO: 2의 서열을 포함하는 한편, 추가의 구현예에서, NKG2D를 인코딩하는 단편은 코돈 최적화되며, 예를 들어, SEQ ID NO: 3의 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, NKG2D를 인코딩하는 단편은 코돈 최적화되며, 예를 들어, SEQ ID NO: 68의 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1BB, NKp80, CD3제타 및 2B4 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이들 이펙터 도메인은 CD8 알파에 커플링된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 커플링된은 그의 일상적인 의미가 제공될 것이며, 또한 예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템, 숙주 세포(예를 들어, 시험관 내 및/또는 생체 내)에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로의 뉴클레오티드 서열의 직접적인(예를 들어, 제1 뉴클레오티드 바로 다음에 제2 뉴클레오티드) 또는 간접적인(예를 들어, 서열이 서로 프레임 내에 존재하지만, 개재 뉴클레오티드에 의해 분리됨) 연결을 지칭할 것이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "연결된" 및 "커플링된"은 상호교환 가능하게 사용된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D/CD16 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D/CD16 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR1에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편은 NCR2에 커플링되며, 생성된 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 구현예는 NCR3에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 29의 핵산 서열에 의해 인코딩되며, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 30의 아미노산 서열을 포함한다.
하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 막횡단 및 세포내 도메인의 조합이 몇몇의 구현예에서 사용되며, 키메라 수용체의 성분 간의 상승적 상호작용을 제공하며, 향상된 세포독성 효과를 제공한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 생성된 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, NCR1은 NKG2D 단편과 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편은 단독의 NCR1에 연결된다. 추가의 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR1 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 20의 NCR1 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a, 4-1BB 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 NKG2D/CD8a/4-1bb/CD3z 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 18의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 19의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, NCR3은 키메라 수용체에 포함된다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서 NKG2D/NCR3 작제물이 제공된다. 그에 의해 생성된 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 22의 NCR3 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 NKG2D/NCR2/4-1BB 작제물 또는 NKG2D/NCR3/4-1BB 작제물을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 링커, 힌지 또는 다른 "이격" 요소가 키메라 수용체 작제물에서 제공된다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 링커를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 작제물의 부분 사이에서, 예컨대 4-1BB, CD16, NCR1, NCR3, 2B4 또는 NKp80 중 임의의 것 사이에서 GS 링커를 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 하나 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 GS 링커가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 특정 작제물 내의 위치에 따라, 힌지 영역은 링커 영역과 동의어일 수 있으며, 그 역도 그러하다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 요망되는 길이로 절단될 수 있으며, 이에 따라, SEQ ID NO: 5의 핵산 서열의 단편에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 글리신-세린 모티프는 힌지로서 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 (GGGGS)n(SEQ ID NO: 31)의 아미노산 서열을 갖는 글리신-세린 반복 모티프를 포함하며, n은 반복부의 수이다. 몇몇의 구현예에서, 9개의 반복부가 사용되어, SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역이 초래된다. 몇몇의 구현예에서, 3개의 반복부가 사용되어, SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 영역이 초래된다.
몇몇의 구현예에서, 2개의 개별 분자, 예컨대 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열(CD8a/GS3)이 힌지 또는 링커로서 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 베타 아드레날린성 수용체의 부분은 힌지 또는 링커로서 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 부분이 사용된다. 일 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 세포외 도메인이 사용되며, 이는 SEQ ID NO: 40의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선이 사용되며, 이는 SEQ ID NO: 42의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 구현예에 따라, 이들 2개의 베타-2 아드레날린성 수용체 부분이 키메라 수용체에서 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 신호 펩티드는 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열을 포함한다. 구현예에 따라, 다른 신호 펩티드가 선택적으로 사용된다. 일부 구현예에 따라, 신호 펩티드가 다량체 포맷으로 사용될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 하나 이상의 헤미-ITAM 서열을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 헤미-ITAM은 아미노산 모티프 DGYXXL(여기서, X는 임의의 아미노산임; SEQ ID NO: 14)을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중의 헤미-ITAM이 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 헤미-ITAM은 NKp80을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 하나 이상의 ITSM 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, ITSM 서열은 헤미-ITAM 모티프와 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, ITSM은 아미노산 모티프 S/TXYXXL/I(여기서, X는 임의의 아미노산임; SEQ ID NO. 15)를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터는 2B4 도메인을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 베타-아드레날린성 세포외 도메인, 베타-아드레날린성 막횡단 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, 베타-아드레날린성 세포외 도메인, 베타-아드레날린성 막횡단 도메인, 4-1BB, 추가의 GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, 상기 단편은 코돈 최적화된 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 추가의 GS3 링커 및 NKp80에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터는 4-1BB를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 이펙터는 선택적으로 NKp80, 2B4, CD3제타, Dap10, Dap12, CD28 또는 본원에 제공되는 다른 신호전달 도메인 중 하나 이상과 함께 4-1BB를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD3제타를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 2B4의 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 DAP10의 세포내 도메인을 추가로 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 58의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본원에 개시된 키메라 수용체 중 임의의 것은 또한 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)와 동시-발현될 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서 세포외 수용체 도메인으로서, 세포외 수용체 도메인이 NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편인 세포외 수용체 도메인, 막횡단 영역, 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 인코딩하는 추가의 작제물과 동시-발현된다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 논의된 바와 같은 키메라 수용체는 mbIL-15와 동시-발현된다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 및 CD3 제타를 포함하며, 막횡단 영역은 CD8a를 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 그들이 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10)을 포함하지 않도록 엔지니어링된다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 그들이 ITAM 모티프를 포함하지 않도록 엔지니어링된다.
몇몇의 구현예에서, (a) NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, (b) 막횡단 영역으로서, 막횡단 영역이 CD8a를 포함하는 막횡단 영역, 및 (c) 이펙터 도메인으로서, 이펙터 도메인이 4-1BB, 및 2B4 또는 DAP10의 세포내 도메인을 포함하는 이펙터 도메인 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 2B4에 이어서 4-1BB를 포함한다. 추가의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 2B4를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 DAP10에 이어서 4-1BB를 포함한다. 추가의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 DAP10을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 DAP10에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4 및 DAP10에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 DAP10에 이어서 2B4를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 2B4에 이어서 DAP10을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 64의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 세포내 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 코돈-최적화된 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 다수의 NKG2D의 단편이 사용되며, 예를 들어, (선택적으로 코돈 최적화된) 추가의 NKG2D 단편이 예를 들어, GS3 링커에 의해 제1 단편에 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3제타를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 66의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 인코딩하는 추가의 작제물과 동시-발현된다.
몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하며, SEQ ID NO: 1의 단편에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, CD3제타 막횡단 영역을 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하며, SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, CD3제타 막횡단 영역을 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하며, SEQ ID NO. 3에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, CD3제타 막횡단 영역을 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하며, SEQ ID NO. 68에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, CD3제타 막횡단 영역을 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO. 2, 3 또는 68 중 임의의 것에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편도 또한 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 영역은 SEQ ID NO: 69의 아미노산 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 69의 서열의 단편도 또한 사용되며, 몇몇의 구현예에서, 단편은 고유 CD3 제타 서브유닛(이량체 포함)의 신호 전달의 적어도 약 65%, 약 75%, 약 85% 또는 약 95%를 전달하는 능력을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD3제타 막횡단 영역에 인접한 추가의 잔기를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 추가의 아미노산은 고유 CD3제타 서열의 세포외 잔기이다. 다른 구현예에서, 추가의 아미노산은 무작위로 선택된다. 몇몇의 구현예에서, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 또는 20개의 추가의 아미노산이 존재한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 도메인은 힌지 영역을 포함하며, 이는 몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO: 5의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 CD8a 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열의 단편에 의해 인코딩되는 CD8a 힌지이다. 구현예에 따라, 단편은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열의 길이의 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%이다. 구현예에 따라, 단편은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열과 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 상동성이다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 이는 구현예에 따라, SEQ ID NO. 4의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD16 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 및 CD16(어느 하나의 모이어티는 작제물에서 "제1" 대 "제2"임)을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB 및/또는 CD16 중 하나 이상의 반복부가 사용된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 78의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16에 이어서 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 70의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB에 이어서 CD16을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 NKG2D의 단편을 포함하며, 선택적으로 GS3 링커에 의해 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 84의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 72의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 NKp80을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 NKp80이다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB 및 NKp80을 포함하고, 선택적으로 GS3 링커를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 74의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편(선택적으로 코돈 최적화됨), CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB 및 NKp80을 포함하고, 선택적으로 GS3 링커를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 76의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 NKp80을 포함하고, 선택적으로 GS3 링커를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 82의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD3제타를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 코돈 최적화되고, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 80의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 FcRγ를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 FcRγ를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD28을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD28 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 102의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS 링커를 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)와 동시-발현된다.
몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO: 1의, SEQ ID NO. 2의, SEQ ID NO. 3의 또는 SEQ ID NO. 68의 서열 중 임의의 것의 단편에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합할 수 있으며, (i) SEQ ID NO: 1의 서열의 단편, (ii) SEQ ID NO. 2의 서열, (iii) SEQ ID NO. 3의 서열, 또는 (iv) SEQ ID NO. 68의 서열에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO. 2의 서열에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO. 3의 서열에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합할 수 있으며, SEQ ID NO. 68의 서열의 단편에 의해 인코딩되는 NKG2D의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열 또는 선택적으로 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열의 단편(예를 들어, SEQ ID NO: 5와 약 75%, 약 85%, 약 95% 상동성을 갖는 단편)에 의해 인코딩되는 CD8a 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 104의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 면역글로불린 G4(IgG4) 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 104의 핵산 서열의 단편(예를 들어, SEQ ID NO: 104와 약 75%, 약 85%, 약 95% 상동성을 갖는 단편)에 의해 인코딩되는 면역글로불린 G4(IgG4) 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 신호 펩티드는 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 OX40(CD134), CD3제타, 4-1BB, CD28 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편에 (선택적으로 GS3 링커에 의해) 연결된 IL-15를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 88의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 96의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 OX40을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX40 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 90의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 109의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX40 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 100의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD28 막횡단/세포내 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 92의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 94의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 98의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS 링커를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 (동일한 폴리뉴클레오티드 또는 또 다른 폴리뉴클레오티드 상에서) 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)와 동시-발현되도록 구성된다.
키메라 수용체 중 임의의 것은 NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 제2 펩티드를 포함하는 세포외 수용체 도메인을 선택적으로 포함할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 제2 펩티드는 NKG2D와 상동성인 한편, 다른 구현예에서, 제2 펩티드는 NKG2D에 대하여 이종이다. 키메라 수용체가 이량체화 세포외 수용체 도메인을 포함하든지, 세포외 수용체 도메인은 적어도 하기의 NKG2D의 고유 리간드를 인식할 수 있다: MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 또는 ULBP6.
하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서 NKG2D 리간드 결합 도메인의 기능적 변이체가 사용된다. 예를 들어, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 몇몇의 구현예에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 68과 적어도 80% 상동성을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 68과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 갖는다.
또한, 몇몇의 구현예에서 키메라 수용체를 발현하는 벡터가 본원에 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 제공되는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이며, 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소로의 작동 가능한 연결을 포함할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스이다.
몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 작제물 중 임의의 것을 발현하는 엔지니어링된 자연 살해 세포도 또한 제공되며, 엔지니어링된 NK 세포는 표적 세포에 대하여 향상된 세포독성 효과를 나타낸다. 향상된 세포독성 효과는 정상(예를 들어, 비-암성) 세포에 비하여 표적(예를 들어, 암성) 세포에 대하여 더 큰 친화성, 표적 세포에 대하여 유도되는 더 큰 사멸 효과, 감소된 표적-외 효과, 증가된 세포독성 효과의 기간, 더욱 효율적인 세포독성 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 향상된 효과는 다양한 시험관 내 세포독성 검정(예를 들어, 사이토카인 생성의 측정 등)의 이용, 표적 세포사의 측정을 통해 또는 다양한 임상적 결과(예를 들어, 종양 크기의 감소)를 통해 확인될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 엔지니어링된 NK 세포는 환자로부터 단리된 자가 세포이다. 추가의 구현예에서, 엔지니어링된 NK 세포는 공여자로부터 단리된 동종이계 세포로부터 생성된다. 본원에 개시된 바와 같은 이러한 엔지니어링된 NK 세포는 몇몇의 구현예에서, NK 세포를 투여함으로써 NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위하여 사용된다. 이들 엔지니어링된 NK 세포는 몇몇의 구현예에서, 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위하여 사용된다. 또한, 본원에 개시된 다양한 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 보유하는 벡터, 및 이를 발현하는 NK 세포는 몇몇의 구현예에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위한(예를 들어, 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한) 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 작제물은 정상 세포에 대한 엔지니어링된 NK 세포의 세포독성을 유의미하게 증가시키지 않으며, 본원에 기재된 바와 같이, 비-엔지니어링된 NK 세포에 비하여 유리하게 개선된다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인, 막횡단 영역 및 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이다. 몇몇의 구현예는 (a) 세포외 수용체 도메인으로서, 상기 세포외 수용체 도메인이 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편이며, NKG2D의 단편이 (i) SEQ ID NO: 1의 서열의 단편, (ii) SEQ ID NO. 2의 서열, (iii) SEQ ID NO. 3의 서열, 또는 (iv) SEQ ID NO. 68의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 세포외 수용체 도메인, (b) 막횡단 영역 및 (c) 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
몇몇의 구현예에서, (a) 세포외 수용체 도메인으로서, 상기 세포외 수용체 도메인이 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편이며, NKG2D의 단편이 (i) SEQ ID NO: 1의 서열의 단편, (ii) SEQ ID NO. 2의 서열, (iii) SEQ ID NO. 3의 서열, (iv) 또는 SEQ ID NO. 68의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 세포외 수용체 도메인, (b) 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
몇몇의 구현예에서, 막횡단 영역은 CD3제타 막횡단 영역을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 영역은 SEQ ID NO: 69의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 영역은 CD8a를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB, 2B4의 세포내 도메인, NKp80, CD16 세포내 도메인, 자연 세포독성 촉발 수용체 1(NCR1), 자연 세포독성 촉발 수용체 2(NCR2), 자연 세포독성 촉발 수용체 3(NCR3) 및/또는 DAP10의 세포내 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 및 CD16을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB 및 CD3 제타를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB, 및 2B4 또는 DAP10의 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 2B4에 이어서 4-1BB를 포함하는 한편, 다른 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 2B4를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 DAP10에 이어서 4-1BB를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 DAP10을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 CD3제타를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 OX40(CD134), CD3제타, 4-1BB, CD28 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 하나 이상의 헤미-ITAM 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 헤미-ITAM은 SEQ ID NO. 14의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 헤미-ITAM은 SEQ ID NO. 37의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 하나 이상의 ITSM 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, ITSM은 SEQ ID NO. 15의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO. 35의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 58의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 DAP10에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열에 의해 인코딩되며, SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4 및 DAP10에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 DAP10에 이어서 2B4를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열에 의해 인코딩되며, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB에 이어서 2B4에 이어서 DAP10을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 64의 핵산 서열에 의해 인코딩되며, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 66의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 78의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16에 이어서 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 70의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB에 이어서 GS3 링커 및 CD16을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하고/포함하거나 SEQ ID NO: 84의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 72의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편에 GS3 링커에 의해 연결된 IL-15를 포함하며, SEQ ID NO: 88의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 96의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX40 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 90의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, OX40 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 100의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 92의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 94의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 IgG4 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 98의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 74의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 76의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 82의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 80의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에 따라, 이펙터 도메인은 또한 FcRγ를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 FcRγ를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에 따라, 이펙터 도메인은 또한 CD28을 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD28 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 102의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS 링커를 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함하며, 신호 펩티드는 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD3제타 막횡단 영역에 바로 인접한 CD3제타의 2개의 세포외 잔기를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 포함하며, 신호 펩티드는 SEQ ID NO. 4의 핵산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 하나 이상의 GS3 링커를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 한편, 일부 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열의 단편에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 CD8a 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 갖는 글리신-세린 반복 모티프를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하며, 일부 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 베타-아드레날린성 수용체의 일부를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 40의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 추가의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 42의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 104의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 면역글로불린 G4(IgG4) 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 104의 핵산 서열의 단편에 의해 인코딩되는 면역글로불린 G4(IgG4) 힌지이다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다.
일 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 23의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR1에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR3에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, 몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO. 29의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO. 30의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 25의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR1 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 20의 NCR1 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a, 4-1BB 및 CD3z에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO. 18의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/인코딩되거나 SEQ ID NO. 19의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 NCR3 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, NCR3은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 20의 NCR1 막횡단/세포내 도메인 또는 SEQ ID NO: 22의 NCR3 막횡단/세포내 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 43의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 44의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 45의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 46의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 베타-아드레날린성 세포외 도메인, 베타-아드레날린성 막횡단 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 47의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 2B4, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 48의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 49의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, 베타-아드레날린성 세포외 도메인, 베타-아드레날린성 막횡단 도메인, 4-1BB, 추가의 GS3 링커 및 NKp80에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 50의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 4-1BB, 추가의 GS3 링커 및 NKp80에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 51의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인 및 4-1BB에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 52의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB 및 2B4에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 53의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD16 막횡단/세포내 도메인, 4-1BB, GS3 링커 및 NKp80에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하며, SEQ ID NO: 54의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 작제물은 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되며, 세포외 수용체 도메인은 NKG2D의 고유 리간드(예를 들어, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 또는 ULBP6 중 하나 이상)에 결합하는 제2 펩티드를 포함한다. 구현예에 따라, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO. 3과 적어도 80% 상동성을 갖는다.
몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 인코딩하는 추가의 작제물과 동시-발현된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다.
몇몇의 구현예에 따라, 키메라 수용체는 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10)을 포함하지 않고/않거나 키메라 수용체는 면역수용체 티로신-기반 활성화(ITAM) 모티프를 인코딩하지 않는다.
몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
또한, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 몇몇의 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스이다.
또한, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 하나 이상을 포함하는 유전학적으로 엔지니어링된 자연 살해 세포가 본원에 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 자연 살해 세포는 자가 이용을 위한 것인 한편, 일부 구현예에서, 그들은 동종이계 이용을 위한 것이다.
또한, NK 세포를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서의 NK 세포 세포독성의 향상 방법이 본원에 제공되며, 상기 NK 세포는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 키메라 수용체를 발현한다.
또한, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서의 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료적 유효량의 NK 세포를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 NK 세포는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 키메라 수용체를 발현한다. 상기 개시된 바와 같이, NK 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다.
NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공된다. 추가로, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공된다.
또한, NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위한 약제의 제조에서의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 용도가 제공된다. 또한, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 용도가 제공된다.
또한, NK 세포 세포독성의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 NK 세포 세포독성을 향상시키기 위한 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 단리된 유전학적으로 엔지니어링된 자연 살해 세포의 용도가 제공된다. 또한, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 단리된 유전학적으로 엔지니어링된 자연 살해 세포의 용도가 제공된다.
상기 요약되고, 하기에 더욱 상세히 기재된 조성물 및 관련 방법은 실행자가 취하는 특정 행동을 기술하지만; 그들이 또 다른 관계자에 의한 이러한 행동의 지시를 또한 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, "키메라 수용체를 발현하는 NK 세포의 집단을 투여하는 것"과 같은 행동은 "키메라 수용체를 발현하는 NK 세포의 집단의 투여를 지시하는 것"을 포함한다.
하기의 도면의 설명은 본원에 개시된 본 발명의 비-제한적인 구현예를 나타내는 실험 및 결과에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따른 키메라 수용체의 개략도를 도시한 것이다. 도 1a는 내인성 NKG2D를 도시한 것이며, 도 1b는 NKG2D-DAP10-CD3ζ를 도시한 것이며, 도 1c는 NKG2D-41BB-CD3ζ를 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따른 키메라 수용체의 개략도를 도시한 것이다. 도 2a는 NKG2D-CD16을 도시한 것이며, 도 2b는 NKG2D-CD16-41BB를 도시한 것이다.
도 3a 및 도 3b는 몇몇의 구현예에 따른 특정 작제물의 플라스미드 내로의 삽입점을 예시한 플라스미드 맵을 도시한 것이며, 예시된 것은 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 플라스미드이다. 도 3a는 벡터 내의 IRES-GFP 서열의 제거와 함께, EcoRI 및 NotI 제한 부위 내로 삽입된 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 NKG2D-41BB-CD3ζ에 대한 유전자 작제물을 보여준다. 도 3b는 다중 클로닝 부위(MCS)에 위치한 EcoRI 및 XhoI 제한 부위 내로 삽입된 NKG2D-CD16 및 NKG2D-CD16-41BB에 대한 플라스미드를 도시한 것이다. 벡터 내의 IRES-GFP 서열은 형질도입 효율의 추적을 가능하게 한다.
도 4a 내지 도 4c는 NK 세포에서의 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 NKG2D-41BB-CD3ζ의 발현에 관한 데이터를 도시한 것이다. 도 4a는 형질도입 후의 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율을 예시한 유세포분석 데이터를 보여준다. 도 4b는 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율을 요약한 점 플롯을 보여준다. 도 4c는 형질도입 후의 상이한 NK 세포의 군에서의 평균 형광 세기(MFI)와 관련된 데이터를 보여준다.
도 5A 내지 도 5C는 배양된 REH 세포에 대한, 공여자 1, 공여자 2 및 공여자 3(각각 도 5A, 도 5B 및 도 5C)으로부터의 NK 세포로부터 생성된 다양한 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 6A 내지 도 6C는 배양된 U-2 OS 세포에 대한, 공여자 1, 공여자 2 및 공여자 3(각각 도 6A, 도 6B 및 도 6C)으로부터의 NK 세포로부터 생성된 다양한 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 REH 세포로의 자극의 존재 및 부재 하에서 다양한 NKG2D 작제물을 발현하는 NK 세포에 의한 인터페론-감마의 생성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 7a는 REH 세포에 의한 자극과 함께 또는 이것 없이, 상이한 NK 세포의 군에서의 상대적인 IFNγ의 양을 도시한 것이다. 도 7b는 자극 이후의 상이한 NK 세포의 군 간의 IFNγ의 수준을 도시한 것이다(중간값이 나타나 있음).
도 8a 내지 도 8c는 NK 세포에서의 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 NKG2D-CD16의 발현과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 8a는 형질도입 후의 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율을 예시한 유세포분석 데이터를 보여준다. 도 8b는 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율을 요약한 점 플롯을 보여준다. 도 8c는 형질도입 후의 상이한 NK 세포의 군에서의 평균 형광 세기(MFI)와 관련된 데이터를 보여준다.
도 9A 내지 도 9C는 배양된 REH 세포에 대한, 3명의 공여자(각각 도 9A, 도 9B 및 도 9C)로부터의 NK 세포로부터 생성된 다양한 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 10A 내지 도 10C는 배양된 U-2 OS 세포에 대한, 3명의 공여자(각각 도 10A, 도 10B 및 도 10C)로부터의 NK 세포로부터 생성된 다양한 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 11은 REH 세포로의 자극의 존재 및 부재 하에서 다양한 NKG2D 작제물을 발현하는 NK 세포에 의한 인터페론-감마의 생성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 NK 세포에서의 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 NKG2D-CD16-41BB의 발현과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 12a는 형질도입 후의 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율을 예시하는 유세포분석 데이터를 보여준다. 도 12b는 NK 세포 상의 다양한 작제물의 표면 발현의 상대적인 양과 관련된 히스토그램을 보여준다.
도 13A 및 도 13B는 다양한 NKG2d 작제물의 세포독성의 정도와 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 13A는 배양된 REH 세포에 대한 세포독성의 정도를 도시한 것이다. 도 13B는 배양된 U2OS 세포에 대한 세포독성의 정도를 도시한 것이다.
도 14는 본원에 개시된 일부 구현예에 따른 몇몇의 NKG2D 작제물의 작제물 맵을 개략적으로 도시한 것이다.
도 15는 본원에 개시된 일부 구현예에 따른 추가의 NKG2D 작제물의 작제물 맵을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16a 내지 도 16c는 NK 세포에서의 다양한 NKG2D 작제물의 발현과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 16a는 NK 세포에서의 다양한 NKG2D 작제물의 평균 형광 세기(MFI)와 관련된 데이터를 보여준다. 도 16b는 2명의 공여자(505 및 870)의 NK 세포 내로의 다양한 NKG2D 작제물의 형질도입 후의 NKG2D-양성 및 CD56-양성 NK 세포의 백분율을 예시한 유세포분석 데이터를 보여준다. 도 16c는 형질도입 7일 후의 2명의 공여자로부터의 NK 세포에서의 평균 형광 세기(MFI)와 관련된 데이터를 보여준다.
도 17은 1:1 E:T 비에서 NK 세포 내로의 형질도입 14일 후의 다양한 NKG2D 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 18a 및 도 18b는 NK 세포 내로의 형질도입 후의 다양한 NKG2D 작제물의 발현과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 18a는 형질도입 7일 후의 NK 세포에서의 평균 형광 세기(MFI)와 관련된 데이터를 보여준다. 도 18b는 모의-형질도입된 NK 세포에 비한 다양한 NKG2D 작제물의 MFI의 배수-변화와 관련된 데이터를 보여준다.
도 19a 및 도 19b는 다양한 NKG2D 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 도 19a는 1:1 E:T 비에서 NK 세포 내로 형질도입된 다양한 NKG2D 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 보여준다. 도 19b는 모의-형질도입된 NK 세포에 비한 다양한 NKG2D 작제물의 세포독성의 변화 백분율과 관련된 데이터를 보여준다.
도 20은 1:1 E:T 비에서 NK 세포 내로의 형질도입 14일 후의 다양한 NKG2D 작제물의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 분석 이전에, NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
도 21은 2시간 동안 1:1 및 1:2 E:T 비에서 공여자 238 NK 세포(2일마다 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서의 4일의 배양) 내로의 형질도입 10일 후의 다양한 NKG2D 작제물의, 배양된 REH 세포에 대한 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다.
도 22는 본원에 개시된 구현예에 따른 추가의 NKG2D 작제물의 작제물 맵을 개략적으로 도시한 것이다.
도 23a 내지 도 23b는 2명의 상이한 공여자(각각 도 23a 및 도 23b에서 공여자 61 및 공여자 103)로부터의 NK 세포로부터 생성된 다양한 NKG2D 작제물의 지속성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
도 24는 다양한 NKG2D 작제물의 발현과 관련된 데이터를 도시한 것이다. NK 세포를 4명의 건강한 공여자(224, 225, 362 및 363)의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 증량시키고, 표기된 작제물의 발현을 지시하는 바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 3일 후에, NK 세포를 형광 표지된 항-NKG2D 항체로 염색하고, 유세포분석을 사용하여 분석하였다. 상대적 NKG2D 발현을 표지된 세포의 평균 형광 세기(MFI)에 의해 평가하였다.
도 25a 및 도 25b는 다양한 NKG2D 작제물로 형질도입된 NK 세포의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. NK 세포를 4명의 공여자의 PBMC로부터 증량시키고; 형질도입 8일 후에, 배양된 REH 및 HL60 세포(각각 도 25a 및 도 25b)에 대한 NK 세포독성을 1:1 E:T 비에서 측정하였다. 분석 전에 NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
도 26a 내지 도 26c는 REH 종양 세포로의 하룻밤 자극 이후의 다양한 NKG2D 작제물을 발현하는 NK 세포에 의한 인터페론-감마(IFNγ), 종양 괴사 인자-알파(TNFα) 및 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)의 생성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 표기된 작제물로의 형질도입 8일 후에, 1 x 105개의 NK 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트의 개별 웰에서 1 x 105개의 REH 세포로 자극하였으며; 하룻밤 인큐베이션 후에, 상층액을 수거하고, 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) 디바이스를 사용하여 관련 표준물질에 대하여 사이토카인 수준을 측정하였다. 도 26a는 IFNγ의 누적된 수준을 도시한 것이며, 도 26b는 TNFα의 수준을 도시한 것이며, 도 26c는 자극 후의 상이한 NK 세포의 군에서의 GM-CSF의 수준을 도시한 것이다. 분석 이전에, NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
도 27a 및 도 27b는 형질도입 7, 14 및 21일 후의 다양한 NKG2D 작제물을 발현하는 2명의 공여자(각각 도 27a 및 도 27b에서 공여자 224 및 225)로부터의 NK 세포의 지속성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 분석 이전에, NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
도 28a 및 도 28b는 표기된 NKG2D 작제물이 형질도입된 NK 세포의 세포독성과 관련된 데이터를 도시한 것이다. 적색 형광 단백질을 발현하도록 안정적으로 형질도입된 U2OS 세포에 대하여 NK 세포독성을 측정하였으며; U2OS 세포를 1:4 및 1:2 E:T 비(각각 도 28a 및 도 28b)로 NK 세포와 함께 배양하였다. 살아 있는 U2OS 세포를 인큐사이트(Incucyte) S3 생-세포 분석 시스템을 사용하여 72시간 동안 60분마다 계수하였다. 분석 이전에, NK 세포를 40 IU의 IL-2/㎖이 보충된 배지에서 배양하였다.
일반
많은 질환의 기초가 되는 비정상 세포(바이러스 감염 및 악성 세포 포함)의 출현 및 지속은 상기 비정상 세포에 대한 불충분한 면역 반응에 의해 가능하게 된다. 면역요법의 목표는 환자의 면역계의 반응을 개시하거나 보강하는 것, 예를 들어, 손상되거나 이환된 세포를 손상시키거나, 사멸시키거나 또는 다르게는 억제하기 위한 면역 세포, 예컨대 자연 살해(NK) 세포의 능력을 증가시키는 것이다. 하나의 면역요법 접근법은 비정상 세포의 표적화된 인식 및 파괴를 위한 면역 세포에서의 키메라 수용체의 재조합 발현이다. 일반적으로, 키메라 수용체는 표적 세포 상의 리간드를 인식하는 세포외 수용체 도메인, 앵커링(anchoring) 막횡단 도메인 및 리간드 결합 시에 활성화 신호를 전달하는 이펙터 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 일부 구현예는 상기 일반적인 구조를 갖거나 또는 상기 일반적인 구조의 변형을 갖는 키메라 수용체를 사용한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인 및 이펙터 도메인은 함께 융합된 개별 펩티드이다. 몇몇의 다른 구현예에서, 막횡단 및 이펙터 도메인은 동일한 펩티드로부터 유래된다. 일부 이러한 구현예에서, 막횡단 및 이펙터 도메인은 단일의 펩티드(예를 들어, 막을 통과하고 신호전달 캐스케이드를 개시하도록 구성되는 하나의 펩티드)를 포함한다. 하기에 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 절단, 돌연변이, 추가의 링커/스페이서 요소, 이량체 등은 면역 세포(예를 들어, NK 세포)에서 원하는 발현 정도를 나타내며, 비-표적 세포에 대한 유해 효과를 회피하는 표적 결합력의 정도와 균형을 이루는, NK 세포로부터 세포독성 활성을 유도하는 키메라 수용체 작제물을 생성하는데 사용된다. 면역 세포의 표면 상의 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체의 재조합 발현은 관심 비정상 세포로의 면역 세포의 표적화를 재유도할 뿐 아니라, 결합 시에 면역 활성화를 증가시킬 수 있다.
면역요법을 위한 NK 세포
하나의 면역요법 접근법은 키메라 수용체를 발현하도록 엔지니어링된 T 세포를 환자에게 투여하여, 양성 면역 반응을 유도하는 것을 수반한다. 그러나, 이러한 접근법의 단점은 그것이 환자에서 이식편대숙주병의 유도를 예방하기 위하여 자가 세포의 이용을 필요로 한다는 점이다. 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 제공되는 바와 같이, 엔지니어링된 NK 세포를 포함하는 조성물은 몇몇의 이점을 지닌다. 예를 들어, 자가 또는 공여자-유래 동종이계 세포 중 어느 하나가 NK 세포 접근법에서 사용될 수 있다. 또한, 몇몇의 구현예에 따라, 본원에 제공된 바와 같은 엔지니어링된 NK 세포는 정상 세포에 대하여 세포독성을 유의미하게 증가시키지 않는다. 또한, NK 세포는 일단 활성화되면, 유의미한 세포독성 효과를 갖는다. 이를 고려하여, 본원에 제공되는 바와 같은 엔지니어링된 NK 세포가 상기 세포독성 효과를 추가로 증진시켜, 이환된 표적 세포를 선택적으로 사멸시키는 훨씬 더 효율적인 수단을 제공하는 것은 예상치 못한 것이다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체를 발현하는, 치료적 유효량의 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 투여되는 NK 세포는 자가 세포이다. 추가의 구현예에서, NK 세포는 공여자-유래(동종이계) 세포이다.
몇몇의 구현예에서, (예를 들어, 표적 세포 상의 리간드로의 결합에 의한) 키메라 수용체를 발현하는 재조합 NK 세포의 결합 및 활성화는 세포용해에 의하여 스트레스 및/또는 비정상 세포(예를 들어, 종양 세포, 바이러스-감염 세포 등)의 직접적인 사멸을 야기한다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체를 발현하도록 엔지니어링된 NK 세포를 투여하는 단계를 포함하는 NK 세포 세포독성의 향상 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 투여되는 NK 세포는 자가 세포이다. 추가의 구현예에서, NK 세포는 공여자-유래(동종이계) 세포이다. 몇몇의 구현예에서, 엔지니어링된 NK 세포는 스트레스 및/또는 비정상 세포(예를 들어, 종양 세포, 바이러스-감염 세포 등)의 간접적인 파괴 또는 억제를 야기한다.
리간드 결합 도메인
상기 언급된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서 NK 세포는 종양 세포 및 바이러스-감염 세포를 포함하는 비정상 세포를 인식하고 파괴한다. 이들 선천 면역 세포의 세포독성 활성은 각각 세포 표면 상에 존재하는 억제 및 활성화 수용체로부터의 신호전달의 균형에 의해 조절된다. 전자는 건강한 세포의 표면 상에 발현되는 자가-분자에 결합하는 한편, 후자는 비정상 세포 상에 발현되는 리간드에 결합한다. 억제 수용체에 비하여 증가된 활성화 수용체의 결합은 NK 세포 활성화 및 표적 세포 용해를 야기한다. 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)는 스트레스 및 비정상 세포 상에 발현되는 다수의 리간드를 인식하는 중요한 NK 세포 활성화 수용체이다. 다양한 NKG2D 리간드의 표면 발현은 건강한 세포에서는 일반적으로 낮지만, 악성 변환 또는 바이러스 감염 시에 상향조절된다. NKG2D에 의해 인식되는 리간드의 비-제한적인 예는 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 및 ULBP6, 및 NK 세포의 세포용해 또는 세포독성 기능을 제어하는 표적 세포 상에 발현되는 다른 분자를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
세포 스트레스 및 감염의 복수의 표면 마커를 인식하는 NKG2D의 능력은 그것을 키메라 수용체-기반의 면역요법 접근법의 잠재적으로 유용한 성분으로 만든다. 그러나, 키메라 수용체로서의 NKG2D의 이용을 복잡하게 하는 것은 파트너 DAP10과 그의 관계이다. NKG2D는 동종이량체를 형성하는 II형 막횡단 당단백질이며, DNAX-활성화 단백질 10(DAP10)의 2개의 동종이량체와 어셈블되어, 막 표면 상에 육량체 복합체를 제공한다. 이러한 NKG2D-DAP10 회합은 내인성 NKG2D의 표면막 발현 및 리간드 결합 시의 활성화 신호의 전달 둘 모두에 필요하다. 몇몇의 구현예에서, 전장 NKG2D가 사용된다. 일 구현예에서, 전장 NKG2D는 SEQ ID NO. 1의 핵산 서열을 갖는다. 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 세포외 수용체 도메인은 그의 고유 막횡단 또는 세포내 도메인이 결여되지만, 유리하게 NKG2D의 고유 리간드에 결합할 뿐 아니라, 리간드 결합시에 활성화 신호를 전달하는 그의 능력을 유지하는 NKG2D의 단편이다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드에 의해 인코딩되는 키메라 수용체는 DAP10을 포함하지 않는다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 단편은 전장 야생형 NKG2D와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성이다. 몇몇의 구현예에서, 단편은 SEQ ID NO. 2로부터 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있지만, 리간드-결합 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 리간드-결합 기능을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편은 이량체, 삼량체 또는 다른 연쇄체 형식으로서 제공되며, 이러한 구현예는 향상된 리간드-결합 활성을 제공한다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편을 인코딩하는 서열은 선택적으로 완전히 또는 부분적으로 코돈 최적화된다. 일 구현예에서, 코돈 최적화된 NKG2D 단편을 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO. 3의 서열을 포함한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 신호 펩티드가 사용된다. 신호 펩티드의 종 또는 서열은 작제물에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 몇몇의 구현예에서, CD8로부터 유래된 신호 펩티드가 사용된다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 CD8a 유래이며, SEQ ID NO. 4의 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 코돈 최적화된 NKG2D 단편을 인코딩하는 서열은 SEQ ID NO. 68의 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 단편은 SEQ ID NO. 68로부터 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있지만, 리간드-결합 기능을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 단편은 SEQ ID NO. 68로부터 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있지만, 개선된 리간드-결합 기능을 갖는다.
막횡단, 신호전달 및 조합 도메인
상기 언급된 바와 같이, 일반적인 키메라 항원 수용체 구조는 리간드 결합 도메인을 신호전달 도메인(들)에 연결하는 적어도 하나의 막횡단 도메인을 포함한다. 그러나, 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 신호전달 기능을 제공하는 역할을 할 수도 있다.
몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편은 그의 정상의 막횡단 도메인의 적어도 일부를 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 T 세포 및 NK 세포 둘 모두 상에서 정상적으로 발현되는 막횡단 당단백질인 CD8의 적어도 일부를 포함한다. 몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD8α를 포함하는 한편, 일부 구현예에서, CD8β가 사용된다. 몇몇의 구현예에서, CD8α의 "힌지"는 SEQ ID NO. 5의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD8α는 그것이 SEQ ID NO. 5의 서열을 갖는 CD8α와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD8β는 SEQ ID NO. 6의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD8β는 그것이 SEQ ID NO. 6의 서열을 갖는 CD8β와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD8α 및 CD8β의 이량체가 사용된다.
몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 신호전달 도메인으로서도 역할을 하는 CD16을 포함한다. CD16은 2개의 아이소폼, a 및 b(각각 Fc 감마 수용체 IIIa 및 IIIb로도 알려져 있음)로 존재한다. 이들 수용체는 보통 IgG 항체의 Fc 부분에 결합하며, 이는 차례로 NK 세포를 활성화시킨다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD16a를 포함하는 한편, 일부 구현예에서, CD16b가 사용된다. 몇몇의 구현예에서, CD16a는 SEQ ID NO. 7의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD16a는 그것이 SEQ ID NO. 7의 서열을 갖는 CD16a와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD16b는 SEQ ID NO. 8의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD16b는 그것이 SEQ ID NO. 8의 서열을 갖는 CD16b와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD16a 및 CD16b의 이량체가 사용된다. 몇몇의 구현예에서, CD16 막횡단 도메인에 대한 변형은 도메인의 길이를 증가시키기 위한 추가의 핵산 잔기를 포함한다. 대안적으로, CD16은 단축될 수 있다. CD16의 길이에 대한 변형은 유리하게 향상된 리간드-수용체 상호작용을 용이하게 할 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 신호전달 도메인으로서도 역할을 하는 자연 살해 수용체 2B4 도메인(본원에서 "2B4"로도 지칭되며, CD244로도 알려져 있음)을 포함한다. 2B4는 NK 세포 상에 발현되며, 이러한 수용체와 표적 세포 상의 그의 리간드 간의 상호작용을 통하여 비-주요 조직적합성 복합체(MHC) 제한된 사멸을 조절한다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 2B4를 포함하는 한편, 몇몇의 구현예에서 2B4 도메인은 세포내 신호전달 도메인이다. 몇몇의 구현예에서, 2B4는 SEQ ID NO. 9의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, 2B4는 그것이 SEQ ID NO. 9의 서열을 갖는 2B4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 2B4는 작제물에서 단독의 막횡단/신호전달 도메인으로서 사용되지만, 몇몇의 구현예에서, 2B4는 하나 이상의 다른 도메인과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD16, 4-1BB 및/또는 2B4의 조합이 이용된다.
일부 구현예에서, 신호전달은 상기 언급된 바와 같이 DAP10을 통해 달성된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 단편은 DAP10과 회합되어, 세포독성-유발(pro-cytotoxic) 신호를 NK 세포에 제공한다. 몇몇의 구현예에서, DAP10의 이량체가 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 DAP10을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, DAP10은 SEQ ID NO. 10의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, DAP10은 그것이 SEQ ID NO. 10의 서열을 갖는 DAP10과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, DAP12가 또한 이러한 신호를 전달할 수 있기 때문에, DAP12가 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, DAP12는 SEQ ID NO. 11의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, DAP12는 그것이 SEQ ID NO. 11의 서열을 갖는 DAP12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, DAP10 및 DAP12의 이종이량체가 사용된다.
몇몇의 구현예에서, 신호전달은 4-1BB(CD137 및 종양 괴사 인자 수용체 상과 구성원 9(TNFRSF 9)로도 알려져 있음)를 통해 제공된다. 4-1BB는 전형적으로 활성화된 T 세포를 위한 자극 분자로서 기능하는 동시-자극 면역 체크포인트 분자이다(예를 들어, 4-1BB의 교차결합은 T 세포 증식 및 세포용해 활성을 향상시킨다). 그러나, 몇몇의 구현예에서, 4-1BB의 기능은 유리하게 NK 세포와 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB는 SEQ ID NO. 12의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB는 그것이 SEQ ID NO. 12의 서열을 갖는 4-1BB와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB는 단독의 신호전달 도메인이지만, 상기 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서, 4-1BB는 예상치 못하게 본원에 개시된 다른 막횡단/신호전달 도메인 중 하나 이상과 조합하여 잘 기능한다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 4-1BB와 함께 CD16은 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB와 함께 DAP10은 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB 및/또는 2B4와 함께 DAP10은 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 다른 개선된 특징 결과, 예컨대 개선된 발현, 개선된 지속성 등.
몇몇의 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 T 세포 수용체 복합체의 적어도 일부를 포함한다. T 세포 수용체 복합체는 제타, 알파, 베타, 감마, 델타 및 엡실론 서브유닛을 포함하는 다수의 서브유닛을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라 엔지니어링된 NK 세포는 이들 서브유닛(또는 그의 단편) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타 서브유닛을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, CD3 제타는 SEQ ID NO. 13의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD3 제타는 그것이 SEQ ID NO. 13의 서열을 갖는 CD3 제타와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD3 제타는 도메인이 더 이상 정규 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 또는 ITAM 모티프와 일치하지 않도록 돌연변이된다(예를 들어, 아미노산 돌연변이, 삽입 또는 결실). 따라서, 몇몇의 구현예에서, NK 세포는 ITAM 모티프를 함유하지 않는 엔지니어링된 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 엔지니어링된 NK 세포는 제한된 또는 감소된 유해한 부작용과 함께, 표적 세포에 대하여 특히 향상된 세포독성을 나타낸다. 몇몇의 구현예에서, 이는 주어진 구현예에서 사용되는 키메라 수용체의 다양한 부분의 상승적 상호작용으로부터 초래된다. 몇몇의 구현예에서, 4-1BB와 함께 CD3제타는 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 2B4와 함께 CD3제타는 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 2B4 및 4-1BB와 함께 CD3제타는 상승적 자극 효과를 제공하여, 특히 효율적인(예를 들어, 세포독성) NK 세포를 초래한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 그의 막횡단 도메인을 통하여 CD3제타의 이량체화를 이용한다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD3제타 막횡단 도메인(또는 그의 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 세포외 CD3제타 잔기("막-근위 부분")는 CD3제타 막횡단 도메인에 바로 인접해 있다. 일부 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인은 SEQ ID NO. 69의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인은 그것이 SEQ ID NO. 69의 서열을 갖는 CD3제타 막횡단 도메인과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인에 대한 변형은 도메인의 길이를 증가시키기 위하여 추가의 핵산 잔기를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인 및 CD3제타 막-근위 부분은 전장 CD3제타 분자를 시냅스에 동원한다. 몇몇의 구현예에서, (CD3제타 막횡단 도메인이 없는 수용체에 비하여) 엔지니어링된 수용체로의 고유 CD3제타의 동원은 구현예에 따라, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50% 이상 증가된다. 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인은 CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1BB, NKp80, FcRγ, CD3제타 및 2B4 중 하나 이상을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD28 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28을 포함하는 한편, 몇몇의 구현예에서, CD28 도메인은 세포내 신호전달 도메인 도메인인 한편, 몇몇의 구현예에서, CD28 도메인은 막횡단/세포내 신호전달 도메인이다. 몇몇의 구현예에서, CD28 막횡단 도메인은 SEQ ID NO. 105의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD28 막횡단 도메인은 그것이 SEQ ID NO. 105의 서열을 갖는 CD28과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD28 세포내 신호전달 도메인은 SEQ ID NO. 106의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, CD28 세포내 신호전달 도메인은 그것이 SEQ ID NO. 106의 서열을 갖는 CD28과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, CD28은 작제물에서 단독의 막횡단/신호전달 도메인으로서 사용되지만, 몇몇의 구현예에서, CD28은 하나 이상의 다른 도메인과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 CD28, OX40, 4-1BB 및/또는 CD3제타의 조합이 사용된다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 OX40 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, OX40 도메인은 세포내 신호전달 도메인이다. 몇몇의 구현예에서, OX40 세포내 신호전달 도메인은 SEQ ID NO. 107의 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, OX40 세포내 신호전달 도메인은 그것이 SEQ ID NO. 107의 서열을 갖는 OX40과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, OX40은 작제물에서 단독의 막횡단/신호전달 도메인으로서 사용되지만, 몇몇의 구현예에서, OX40은 하나 이상의 다른 도메인과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 CD28, OX40, 4-1BB 및/또는 CD3제타의 조합이 사용된다.
추가의 구현예에서, 키메라 수용체의 신호전달 부분은 ITAM의 일부, 예를 들어, 헤미-tam을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이들 부분은 정규 ITAM 서열을 구성하지 않고, 오히려 여전히 NK 세포 세포독성에 필요한 신호를 전달할 수 있는 부분을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 헤미-tam은 SEQ ID NO. 14의 서열을 갖는다(X는 임의의 잔기일 수 있음). 몇몇의 구현예에서, 헤미-tam은 그것이 SEQ ID NO. 14의 서열을 갖는 헤미-tam과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 작제물은 SEQ ID NO. 14의 헤미-tam을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 다수의 헤미-tam이 예를 들어, 헤드 투 테일(head to tail), 테일 투 헤드(tail to head), 헤드 투 헤드(head to head) 또는 테일 투 테일(tail to tail) 배열로 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 적어도 하나의 헤미-tam의 존재는 적어도 하나의 헤미-tam을 사용하는 키메라 수용체를 포함하는 NK 세포에 향상된 신호전달 및 세포독성을 부여한다. 하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 몇몇에서, 키메라 수용체는 헤미-tam의 하나의 비-제한적인 예인 NKp80을 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 예를 들어, 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM) 과의 수용체로부터 유래된 신호전달 영역을 포함하는 추가의 신호전달 영역이 사용된다. 이들 수용체는 2B4(상기 논의됨)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. SLAM 과의 수용체는 그들의 세포질 테일 내에 티로신-기반인 컨센서스 모티프를 공유한다. 상기 모티프는 S/TxYxxL/I이며, 이는 면역수용체 티로신-기반의 스위치 모티프(ITSM)(SEQ ID NO. 15)로 지칭된다. 이들 수용체는 티로신 키나제 Fyn을 동원하는 SLAM-회합 단백질(SAP, 유전자　SH2D1A에 의해 인코딩)을 통해 활성화 신호를 전달한다. 따라서, 몇몇의 구현예에 따라, 신호전달 영역은 ITSM 모티프를 포함하는 폴리펩티드 서열(또는 이를 인코딩하는 핵산)을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, ITSM 모티프는 완전히 인코딩될 필요는 없지만, 신호전달 영역은 SAP(또는 또 다른 유사한 경로)를 통해 활성화 신호를 전달할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, ITSM 모티프는 SEQ ID NO. 15의 서열(X는 임의의 아미노산 잔기일 수 있음)을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, ITSM 모티프는 그것이 SEQ ID NO. 15의 서열을 갖는 ITSM 모티프와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, ITSM 모티프는 SEQ ID NO. 15의 서열을 포함한다.
NKG2D 수용체, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인(및 조합 막횡단/신호전달 도메인) 내의 이들 변형에 더하여, 몇몇의 구현예에서 추가의 동시-활성화 분자가 제공될 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, NK 세포는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하도록 엔지니어링된다. 이러한 구현예에서, NK 세포 상의 mbIL15의 존재는 NK 세포의 증식 및 지속성을 상승적으로 향상시킴으로써 NK 세포의 세포독성 효과를 추가로 향상시키는 기능을 한다. 몇몇의 구현예에서, mbIL15는 SEQ ID NO. 16의 핵산 서열을 갖는다. 몇몇의 구현예에서, mbIL15는 그것이 SEQ ID NO. 16의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 상동성이도록 절단되거나 변형될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, mbIL15는 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 갖는다. 본원에 개시된 키메라 수용체와 함께, 이러한 구현예는 특정 표적 세포를 표적화하고 파괴하기에 특히 효율적인 NK 세포 조성물을 제공한다.
키메라 수용체 작제물
본원에 제공된 개시내용을 고려하여, NK 세포에서 생성되고 발현되어 특정 표적 세포, 예컨대 이환 또는 암 세포를 표적화하고 파괴할 수 있는 다양한 키메라 수용체가 존재한다. 이러한 키메라 수용체의 비-제한적인 예는 하기에 더욱 상세히 논의되어 있다.
상기 논의된 바와 같이, T 세포 수용체 복합체의 부분, 특히 CD3제타는 면역 신호전달 캐스케이드의 강력한 활성화제로서 역할을 한다. 이와 같이, 수용체 4-1BB, 종양 괴사 인자 상과 구성원은 리간드 결합 시에 NK 세포를 활성화시킨다. 몇몇의 구현예에서, 이들 2개의 신호전달 성분은 상승적인 방식으로 작용하여, 키메라 수용체로의 리간드의 결합 시에 NK 세포를 활성화시킨다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 CD3제타의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 18의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 108의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, NKG2D-CD8a-4-1BB-CD3제타 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 NK 세포가 mbIL15를 동시 발현하고, mbIL15가 NK 세포의 활성화 및 세포독성 성질에 관하여 추가의 상승 효과를 제공하는 경우에 특히 유효하다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 18(예컨대 SEQ ID NO: 108)과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 18과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 18(예컨대 SEQ ID NO: 108)과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다.
수용체 2B4는 몇몇의 면역수용체 티로신-기반의 스위치 모티프(ITSM)를 보유하며, 활성화 신호를 전달하는 잠재력을 갖는다. 이와 같이, 수용체 4-1BB, 종양 괴사 인자 상과 구성원을 통한 신호전달은 또한, 리간드 결합 시에 NK 세포를 활성화시킨다. 따라서, 이들 신호전달 분자가 협력하여 예기치 않게 효과적으로 세포독성 NK 세포를 생성하는 능력을 이용하여, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 2B4의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/2B4/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 2B4와 CD3제타의 조합을 NK 세포와 사용하여, 표적 세포에 대하여 향상된 세포독성을 생성한다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 막횡단 영역, 및 CD3제타 및 2B4의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/2B4/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, CD3제타 및 2B4와 같이, 4-1BB는 면역 신호전달 캐스케이드의 강력한 활성화제로서 기능할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 이들 3개의 신호전달 성분은 상승적 방식으로 작용하여, 키메라 수용체로의 리간드의 결합 시에 NK 세포를 활성화시킨다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8 막횡단 영역, 및 4-1BB, 2B4 및 CD3제타의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/4-1BB/2B4/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 58의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, NKG2D-CD8a-4-1BB-CD3제타 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 NK 세포가 mbIL15를 동시 발현하고, mbIL15가 NK 세포의 활성화 및/또는 세포독성 성질에 관하여 추가의 상승 효과를 제공하는 경우에 특히 유효하다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 58과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 58과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 58과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다.
몇몇의 대안적인 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 DAP10의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/DAP10/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, NKG2D-CD8a-4-1BB-DAP10 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 NK 세포가 mbIL15를 동시 발현하고, mbIL15가 NK 세포의 활성화 및 세포독성 성질에 관하여 추가의 상승 효과를 제공하는 경우에 특히 유효하다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 60과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 60과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 60과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, DAP10 및 4-1BB와 같이, 2B4는 면역 신호전달 캐스케이드의 강력한 활성화제이다. 몇몇의 구현예에서, 이들 3개의 신호전달 성분은 상승적 방식으로 작용하여, 키메라 수용체로의 리간드의 결합 시에 NK 세포를 활성화시킨다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8 막횡단 영역, 및 4-1BB, 2B4 및 DAP10의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하며, 4-1BB에 이어서 DAP10이 존재하며, DAP10에 이어서 2B4가 존재하는 NKG2D/CD8a/4-1BB/DAP10/2B4 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, NKG2D-CD8a-4-1BB-CD3제타 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 NK 세포가 mbIL15를 동시 발현하고, mbIL15가 NK 세포의 활성화 및 세포독성 성질에 관하여 추가의 상승 효과를 제공하는 경우에 특히 유효하다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 62와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 62와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 62와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 몇몇의 다른 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8 막횡단 영역, 및 4-1BB, 2B4 및 DAP10의 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하며, 4-1BB에 이어서 2B4가 존재하며, 2B4에 이어서 DAP10이 존재하는 NKG2D/CD8a/4-1BB/2B4/DAP10 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 64의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, NKG2D-CD8a-4-1BB-CD3제타 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 NK 세포가 mbIL15를 동시 발현하고, mbIL15가 NK 세포의 활성화 및 세포독성 성질에 관하여 추가의 상승 효과를 제공하는 경우에 특히 유효하다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 64와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 64와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 64와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다.
몇몇의 추가의 구현예에서, 키메라 수용체의 막횡단 및 이펙터 도메인(및 관련 기능)은 동일한 펩티드로부터 유래된다. CD16은 NK 세포의 표면 상에 발현되는 강력한 활성화 수용체이다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 이펙터 도메인 둘 모두를 포함하는 CD16 펩티드를 포함하는 NKG2D/CD16 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 23과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 23과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 23과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D/CD16/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 4-1BB의 신호전달 도메인은 이펙터 도메인에서 활성화 신호의 제2 전달자로서 작용한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
CD3제타는 그의 막횡단 도메인을 통하여 이량체화한다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 전장 CD3제타 분자를 시냅스에 동원하는 키메라 수용체가 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 도메인에 바로 인접한 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 세포외 CD3제타 잔기("막-근위 부분"), 및 CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1BB, NKp80, FcRγ, CD3제타 및 2B4 중 하나 이상을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하든 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 4-1BB 및 CD16 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링되는 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 78의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 78과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 78과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 78과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16에 이어서 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/CD16/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 70의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 70과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 70과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 70과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 또한, 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB에 이어서 CD16을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/4-1BB/CD16 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS3 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GS3 링커는 4-1BB와 CD16 사이에 배치된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 84의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 84와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 84와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 84와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 또한, 몇몇의 구현예에서, GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16 및 4-1BB를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2Dx2/CD3제타TM/CD16/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 72의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 72와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 72와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 72와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D/CD3제타TM/CD16/4-1BB/NKp80 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 키메라 수용체는 CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS3 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GS3 링커는 4-1BB와 NKp80 사이에 배치된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 74의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 74와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 74와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 74와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 또한, 몇몇의 구현예에서, GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD16, 4-1BB 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 2xNKG2D/CD3제타TM/ CD16/4-1BB/NKp80 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS3 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GS3 링커는 4-1BB와 NKp80 사이에 배치된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 76의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 76과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 76과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 76과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 또한, 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 NKp80을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/4-1BB/NKp80 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 GS3 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GS3 링커는 4-1BB와 NKp80 사이에 배치된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 82의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 82와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 82와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 82와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/4-1BB/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 80의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 80과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 80과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 80과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 FcRγ를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 4-1BB 및 FcRγ를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/4-1BB/FcRγ 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 86과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 86과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 86과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, CD3제타 막횡단 도메인이 CD28을 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 힌지, CD3제타 막횡단 영역, 및 CD28 및 CD3제타를 포함하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD3제타TM/CD28/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 102의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 102와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 102와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 102와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 도메인이 IL15에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, IL-15에 연결된 NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 및 4-1BB 및 CD3z를 포함하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 IL15/NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인은 GS3 링커를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, GS3 링커는 IL15와 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인 사이에 배치된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 88의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 88과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 88과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 88과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 도메인이 IgG4 짧은 힌지에 커플링된 NKG2D의 단편을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, IgG4 짧은 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/IgG4/CD8a/4-1BB/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 96의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 96과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 96과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 96과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인이 OX40을 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 및 OX40 및 CD3z를 포함하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/CD8a/OX40/CD3z 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 90의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 90과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 90과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 90과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, IgG4 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 및 OX40 및 CD3제타를 포함하는 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 NKG2D/IgG4/CD8a/OX40/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 100의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 100과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 100과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 100과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 막횡단 영역 및 세포내 이펙터 도메인 둘 모두를 포함하는 CD28 펩티드를 포함하는 키메라 수용체가 제공된다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타를 포함하는 NKG2D/CD28/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 92의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 92와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 92와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 92와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 추가의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, CD8a 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 NKG2D/CD28/CD3제타/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 94의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 94와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 94와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 94와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다. 추가의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, IgG4 힌지, CD28 막횡단/세포내 도메인 및 CD3제타를 포함하는 NKG2D/IgG4/CD28/CD3제타 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 98의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 98과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 98과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 98과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
NCR1(NKp46), NCR2(NKp44) 및 NCR3(NKp30)은 리간드 결합 시에 활성화 신호를 전달하는 NK 세포 상의 수용체이다. 따라서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 이펙터 도메인 둘 모두를 포함하는 NCR1 펩티드를 포함하는 NKG2D/NCR1 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 30과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 27과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 27과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D/NCR1/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 4-1BB의 신호전달 도메인은 이펙터 도메인에서 활성화 신호의 제2 전달자로서 작용하여, 상승적으로 향상된 NK 세포 활성화 및 세포독성을 야기한다. 몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 이펙터 도메인 둘 모두를 포함하는 NCR2 펩티드를 포함하는 NKG2D/NCR2 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. NCR1에서와 같이, 몇몇의 구현예에서, 이들 작제물은 그들의 상대적으로 작은 크기 및 서열의 단순성으로 인하여, 키메라 수용체를 발현하는 NK 세포를 생성하는데 사용하기에 특히 적합하다. 그러나, 그들은 몇몇의 구현예에서, 작제물의 명백한 단순성에도 불구하고, 매우 효과적인 NK 세포를 제공하는 능력을 보유한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이들 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 NKG2D 단편 세포외 수용체 도메인, 및 막횡단 영역 및 세포내 이펙터 도메인 둘 모두를 포함하는 NCR3 펩티드를 포함하는 NKG2D/NCR3 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. NCR1 및/또는 NCR2에서와 같이, 몇몇의 구현예에서, 이들 작제물은 그들의 상대적으로 작은 크기 및 서열의 단순성으로 인하여, 키메라 수용체를 발현하는 NK 세포를 생성하는데 사용하기에 특히 적합하다. 그러나, 그들은 몇몇의 구현예에서, 작제물의 명백한 단순성에도 불구하고, 매우 효과적인 NK 세포를 제공하는 능력을 보유한다. 일 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 29의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 서열은 SEQ ID NO. 29와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 29와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 29와 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D/NCR2/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 4-1BB의 신호전달 도메인은 이펙터 도메인에서 활성화 신호의 제2 전달자로서 작용하여, 신호전달 도메인 간의 상승 효과, 및 예기치 않게 효율적으로 세포독성인 NK 세포를 야기한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
몇몇의 추가의 구현예에서, NKG2D/NCR3/4-1BB 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 4-1BB의 신호전달 도메인은 이펙터 도메인에서 활성화 신호의 제2 전달자로서 작용하여, 신호전달 도메인 간의 상승 효과, 및 예기치 않게 효율적으로 세포독성인 NK 세포를 야기한다. 또한, 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 선택적으로 mbIL15와 동시-발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체의 표면 발현 및 효능은 몇몇의 구현예에서, NKG2D 단편과 막횡단 도메인 사이의 세포외 도메인에 위치한 스페이서 영역(힌지)의 변이에 의해 향상된다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 키메라 수용체의 다른 부분 사이(예를 들어, 세포내와 막횡단 도메인 사이 또는 다중의 세포내 도메인 사이)에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원의 다른 곳에 개시된 바와 같은 특정 목적을 제공하는 도메인은 추가의 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, CD8a는 (몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO: 5의 핵산 서열에 의해 인코딩되는) 힌지 영역으로서 제공하도록 용도 변경된다. 또 다른 구현예에서, 힌지 영역은 CD8a의 N-말단 절단형 및/또는 CD8a의 C-말단 절단형을 포함한다. 구현예에 따라, 이들 절단물은 SEQ ID NO. 5에 의해 인코딩되는 힌지와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 상동성일 수 있다. 몇몇의 추가의 구현예에서, 힌지는 글리신 및 세린 잔기의 스팬(본원에 "GS 링커"로 명명됨)을 포함하며, GSn은 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO. 42)을 나타낸다. 일 구현예에서, 힌지는 CD8a 및 GS3 둘 모두를 포함하며, SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열에 의해 인코딩되며, 예를 들어, n=3이다. 추가의 구현예에서, n의 값은 구현예에 따라 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상일 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 힌지는 또한, GSn/CD8a로서 구조화될 수 있다. 대안적으로, GS 링커는 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 이러한 일 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 33의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 이러한 구현예에서, 힌지 영역은 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, IgG4는 (몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO: 104의 핵산 서열에 의해 인코딩되는) 힌지 영역으로서 용도 변경된다. 또 다른 구현예에서, 힌지 영역은 IgG4의 N-말단 절단형 및/또는 IgG4의 C-말단 절단형을 포함한다. 구현예에 따라, 이들 절단물은 SEQ ID NO. 104에 의해 인코딩되는 힌지와 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 상동성일 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 작제물은 2B4 세포내 신호전달 도메인을 사용한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 도메인은 SEQ ID NO. 35의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 2B4 도메인은 SEQ ID NO. 36의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체에서 사용되는 2B4 세포내 도메인의 서열은 SEQ ID NO. 36과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 36과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체의 신호전달 도메인이 SEQ ID NO. 36과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다. 이와 같이, 몇몇의 구현예에서, NKp80 세포내 도메인이 몇몇의 구현예에서 사용된다. 일부 구현예에서, NKp80 도메인은 단독의 세포내 신호전달 도메인이지만, 일부 구현예에서, 상기 도메인은 하나 이상의 추가의 도메인과 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, NKp80은 SEQ ID NO. 37의 아미노산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, NKp80 도메인은 SEQ ID NO. 38의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체에 사용되는 NKp80 세포내 도메인의 서열은 SEQ ID NO. 38과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 38과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체의 신호전달 도메인이 SEQ ID NO. 38과 달라질 수 있지만, 키메라 수용체는 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 유지하거나, 일부 구현예에서, 향상된 NK 세포 활성화 및/또는 세포독성 기능을 갖는다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 베타-아드레날린성 수용체의 부분을 막횡단 도메인으로서 사용한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 부분은 베타-아드레날린성 세포외 도메인의 부분을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 상기 부분은 베타-아드레날린성 수용체 막횡단 도메인의 부분이다. 몇몇의 구현예에서, 베타 아드레날린성 수용체의 세포외 도메인 및 막횡단 도메인의 조합이 사용된다. 구현예에 따라, 상기 부분은 베타-1 및/또는 베타-2 아드레날린성 수용체로부터의 것이다. 몇몇의 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 N-말단 세포외 영역의 부분이 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 상기 부분은 SEQ ID NO. 39의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포외 베타-2 아드레날린성 도메인은 SEQ ID NO. 40의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체에 사용되는 세포외 베타-2 아드레날린성 도메인의 서열은 SEQ ID NO. 39와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 39와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선은 선택적으로 세포외 베타-2 아드레날린성 도메인과 함께 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선은 SEQ ID NO. 41의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선은 SEQ ID NO. 42의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체에 사용되는 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선의 서열은 SEQ ID NO. 41과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 41과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
일 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8, 절단된 NKG2D, CD8a, 막횡단 도메인, CD16 세포내 도메인 및 4-1BB를 동시자극 분자로서 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 25에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 25와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 25와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, CD8 주변의 힌지 영역은 비-제한적인 예에 의해 GS 링커(본원에 개시됨), 예컨대 GS3의 첨가에 의해 증가된다. 이러한 구현예에서, 작제물은 SEQ ID NO. 43의 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 43과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 43과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, CD8 주변의 힌지 영역은 더 긴 GS 링커, 예컨대 GS12 또는 다른 링커의 첨가에 의해 증가된다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 CD8의 절단에 의해 감소된다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, CD8a의 N-말단 영역은 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50% 절단된다. 몇몇의 구현예에서, CD8 힌지는 GS 링커로 대체된다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 GS3 링커를 포함하여, 그에 의해 작제물은 NKG2D-GS3-CD16-4-1BB를 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 44의 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 44와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 44와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, CD8 또는 GSn 중 어느 것도 사용되지 않는다. 일 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 45의 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 45와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 45와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
상기 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서, 코돈 최적화된 서열이 사용된다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 코돈 최적화(완전 또는 부분)는 키메라 수용체의 NKG2D 도메인에서 수행된다. 그러나, 몇몇의 구현예에서, 코돈 최적화는 수행되지 않는다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 4-1BB 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 및 4-1BB 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 2B4 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 46의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 46과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 46과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, 베타-아드레날린성 유래 막횡단 도메인 및 4-1BB 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, 베타-2 아드레날린성 수용체의 세포외 영역 및 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선으로 구성된 베타-아드레날린성 유래 막횡단 도메인 및 4-1BB 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, 베타-2 아드레날린성 수용체의 세포외 영역 및 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 나선으로 구성된 베타-아드레날린성 유래 막횡단 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 2B4 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 47의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 47과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 47과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 2B4 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 및 2B4 및 4-1BB 신호전달 도메인 둘 모두가 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 2B4 신호전달 도메인, 및 NKp80 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, GS 링커, 예컨대 GS3 링커는 2B4 및 NKp80 도메인을 연결시킨다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 48의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 48과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 48과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 NKp80 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 및 NKp80 신호전달 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 최적화되지 않은 NKG2D 세포외 도메인, CD8a 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 NKp80 도메인이 있는 키메라 수용체 작제물이 제공된다. 몇몇의 구현예에서, GS 링커, 예컨대 GS3 링커는 4-1BB와 NKp80 도메인을 연결시킨다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 SEQ ID NO. 49의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 49와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 49와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
몇몇의 구현예에서, CD8 막횡단 도메인은 2B4 세포내 도메인과 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, CD8 막횡단 도메인은 막횡단 및 세포내인 2B4 도메인으로 대체된다. 몇몇의 구현예에서, CD8 막횡단 도메인은 2B4로 대체되며, 4-1BB는 근위 배치로 발현된다.
몇몇의 구현예에서, CD16 세포내 신호전달 도메인은 외인적으로 본원에 기재된 키메라 수용체에 트랜스로 발현되는 CD3제타 또는 감마 서브유닛과 커플링된다. 상기 논의된 바와 같이, 이러한 작제물은 예기치 않게 향상된 신호 전달 및 이에 따른 NK 세포의 세포독성 효과의 예기치 않은 증가를 초래할 수 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 본원에 추가로 상세히 논의된 바와 같이, 이량체화하도록 구성된다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따른 절단된 NKG2D 수용체는 선택적으로 이량체화된다. 이량체화는 구현예에 따라 동종이량체 또는 이종이량체를 포함할 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 이량체화는 유해한 독성 효과의 감소(또는 결여)의 동등한 균형과 함께, 더 나은 리간드 인식으로의 키메라 수용체(및 이에 따라, 수용체를 발현하는 NK 세포)의 결합력의 변화를 초래한다. 추가의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 내부 이량체 또는 하나 이상의 성분 서브유닛의 반복을 사용한다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 제2 NKG2D 세포외 도메인 및 막횡단/신호전달 영역(또는 개별 신호전달 영역과 함께 개별 막횡단 영역)에 커플링된 NKG2D 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D 세포외 도메인 중 하나 이상은 코돈 최적화된다. 몇몇의 구현예에서, 2개의 NKG2D 세포외 도메인은 링커, 예를 들어, GSn 링커에 의해 분리된다. 일 구현예에서, GS3 링커가 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인은 베타-아드레날린성 수용체의 세포외 영역을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 막횡단 도메인 막횡단 도메인은 베타-2 아드레날린성 수용체의 세포외 영역을 포함하며, 베타-2 아드레날린성 수용체의 제1 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 영역은 4-1BB를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 영역은 NKp80을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 영역은 CD16 막횡단-세포내 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 영역은 NKp80 또는 CD16 막횡단-세포내 도메인과 함께 4-1BB를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 50의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 50과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 50과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 51의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 51과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 51과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 52의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 52와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 52와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 힌지 영역을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, CD8a는 (몇몇의 구현예에서, SEQ ID NO: 5의 핵산 서열에 의해 인코딩되는) 힌지 영역으로서 제공하도록 용도 변경된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 CD8a 막횡단 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 신호전달 영역은 2B4 및 CD3제타와 함께 4-1BB를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 GS3 링커, 추가의 NKG2D 단편, CD8a 힌지, CD8a 막횡단 도메인, 및 4-1BB 및 CD3제타를 포함하는 이펙터 도메인에 커플링된, 코돈 최적화된 NKG2D의 단편을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 66의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 66과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 50과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 67의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 66과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 50과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 본원에 추가로 상세히 논의된 바와 같이, 이중특이적이도록 구성된다. 몇몇의 구현예에서, 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따른 절단된 NKG2D 수용체는 예를 들어, 비-NKG2D 리간드에 결합하는 제2 펩티드로 인하여 이중특이적이다. 몇몇의 구현예에서, 이중-특이성은 유해한 독성 효과의 감소(또는 결여)의 동등한 균형과 함께, 더 나은 표적 세포 인식으로의 키메라 수용체(및 이에 따라, 수용체를 발현하는 NK 세포)의 표적화의 변화를 초래한다. 추가의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 다른(비-NKG2D) 리간드에 결합하는 제2 세포외 도메인 및 막횡단/신호전달 영역(또는 개별 신호전달 영역과 함께 개별 막횡단 영역)에 커플링된 NKG2D 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 2개의 세포외 도메인은 링커, 예를 들어, GSn 링커에 의해 분리된다. 일 구현예에서, GS3 링커가 사용된다.
본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 코돈 최적화된 NKG2D 도메인을 사용하는 추가의 키메라 수용체가 제공된다(선택적으로, 이들 작제물은 또한 비-최적화된 또는 부분 최적화된 도메인으로 반복될 수 있다). 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, 코돈 최적화된 세포외 도메인은 힌지 및 적어도 2개의 막횡단/신호전달 도메인과 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 다수의 신호전달 도메인은 다수의 비-중복 신호 캐스케이드가 시행되기 때문에, NK 세포의 향상된 세포독성 효능을 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 다수의 경로가 단일의 신호전달 분자(예를 들어, IFNγ)에 집중될 수 있지만, 전체 세포독성 효과는 세포독성 종점을 유도하는 전체 신호전달 분자의 크기 때문에, 예기치 않게 증가된다. 비-제한적인 예로서, 몇몇의 구현예에서, NKG2D는 CD8a 힌지에 이어서 CD16 막횡단-세포내 신호전달 도메인 및 4-1BB 신호전달 도메인에 커플링된다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 2B4 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 53의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 53과 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 53과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다. 추가의 구현예에서, NKG2D-CD8a-CD16IC/TM 작제물은 NKp80 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 작제물은 4-1BB와 NKp80 도메인 사이에 GS3 링커를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이러한 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 54의 핵산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 SEQ ID NO. 54와 달라질 수 있지만, 구현예에 따라, SEQ ID NO. 54와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 상동성을 유지한다.
추가의 구현예에서, 키메라 수용체의 특정 성분은 향상된 효능(예를 들어, NK 세포의 활성화 또는 세포독성)을 야기하는 하나 이상의 추가의 서브유닛으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, CD16 세포내 신호전달 도메인은 DAP10의 4중-반복(예를 들어, 4xDAP10)으로 대체될 수 있다. 추가의 구현예에서, CD16 세포내 신호전달 도메인은 Zap70 서브유닛으로 대체될 수 있다. 이러한 특정 구현예는 예기치 않게 향상된 NK 세포 세포독성을 야기한다.
몇몇의 추가의 구현예에서, 이펙터 도메인은 리간드 결합 시에 활성화 신호전달의 전달을 향상시키도록 하나 이상의 컨센서스 헤미-ITAM 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 4-1BB, CD16, NCR1, NCR2 및/또는 NCR3의 신호전달 도메인 사이의 GS 링커의 포함은 신호 전달을 향상시킨다. 또한, 몇몇의 구현예에서, CD3ζ 및 FcRγ 중 하나 또는 둘 모두는 추가로 (동일한 또는 개별 작제물 상에서) 본원에 기재된 키메라 수용체와 함께 발현되며, 이는 예기치 않게 향상된 신호 전달 및 이에 따른 예기치 않은 NK 세포의 세포독성 효과의 증가를 초래한다. 구현예에 따라, CD3ζ 및 FcRγ 중 하나 이상의 엔지니어링된 발현은 NK 세포에 의한 이들 분자의 내인성 발현을 보충하여, 그에 의해, NK 세포의 신호전달 및 궁극적인 세포독성 효력을 추가로 향상시킨다.
선택적으로, 구현예에 따라, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 또한 키메라 수용체의 구성 서브유닛 중 하나 이상의 절단물 및/또는 변이체를 인코딩할 수 있지만, NK 세포를 표적 세포에 지향시키는 그들의 능력을 유지하고, 몇몇의 구현예에서 결합 시에 세포독성을 예기치 않게 향상시킨다. 또한, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것은 선택적으로 키메라 수용체의 다양한 구성 서브유닛을 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. 본원에 사용되는 용어 "단편" 및 "절단된"에는 그들의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 또한, 단백질의 N- 및 C-말단 결실 변이체를 포함하여야 한다.
본원에 기재된 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로 삽입하여, NK 세포에서 재조합 단백질 발현을 달성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 펩티드에 대하여 이종인 전사 조절 요소, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 또는 인핸서 요소를 사용하여 키메라 수용체의 전사를 유도한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 시토졸 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 시토졸 프로테아제에 의해 인식되고 절단된다. 일부 구현예에서, 이러한 절단 부위는 T2A 절단 부위, P2A 절단 부위, E2A 절단 부위 및 F2A 절단 부위를 포함하는 군으로부터 선택된다. 구현예에 따라, 키메라 수용체의 다양한 구성 부분이 단일의 벡터에서, 또는 대안적으로 다수의 벡터에서 NK 세포에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체 작제물은 단일의 벡터에서 전달되는 한편, 키메라 수용체의 효능을 향상시키는 또 다른 인자, 예컨대 mbIL15는 개별 벡터에서 전달된다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체 및 키메라 수용체의 효능을 향상시키는 인자(예를 들어, mbIL15)는 단일의 벡터에서 전달된다. 사용되는 벡터의 수와 관계 없이, 임의의 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 tag 서열을 포함하여, 작제물을 발현하는 NK 세포의 존재의 확인을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 구현예에서, FLAG 태그(DYKDDDDK, SEQ ID NO. 55)가 사용된다. 또한, 다른 tag 서열, 예컨대 폴리히스티딘 태그(His-태그)(HHHHHH, SEQ ID NO. 56), HA-태그 또는 myc-태그(EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 57)가 이용 가능하다. 대안적으로, 녹색 형광 단백질 또는 다른 형광 모이어티가 사용된다. 태그 유형의 조합을 사용하여, 키메라 수용체의 하위-성분을 개별적으로 인식할 수도 있다.
몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전기천공법에 의해 NK 세포 내로 도입될 수 있는 mRNA이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스, 바람직하게는 레트로바이러스이며, 이는 형질도입에 의해 NK 세포 내로 도입될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 벡터는 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)이다. 추가의 구현예에서, 다른 벡터가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 등이 사용될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 비-HIV-유래 레트로바이러스가 사용된다. 선택된 벡터는 제한 없이 전사 조절 요소의 세기 및 단백질을 발현하기 위해 사용될 세포를 포함하는 다수의 인자에 좌우될 것이다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 벡터, 파지, 인공 염색체 등일 수 있다. 추가의 구현예에서, 벡터는 에피솜, 비-상동성 또는 상동성 통합 벡터일 수 있으며, 이는 그들을 형질전환시키기 위한 임의의 적합한 수단(형질전환, 트랜스펙션, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 전기천공법, 인산칼슘-침전법, 직접 미세주입 등)에 의해 적절한 세포 내로 도입될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 예를 들어, SV40 초기 프로모터 영역, 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부 내에 함유된 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열, 아데노바이러스(ADV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 소 유두종 바이러스(BPV) 프로모터, 파르보바이러스 B19p6 프로모터, 베타-락타마제 프로모터, tac 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 영역 또는 콜리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터, 리불로스 비포스페이트 카복실라제의 프로모터, Gal 4 프로모터, ADC(알코올 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 골수증식 육종 바이러스 인핸서와 함께 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 MND 프로모터 및 알칼리성 포스파타제 프로모터를 포함하는 NK 세포에서 키메라 수용체의 발현을 유도하기 위한 다른 접근법이 사용된다.
자연 살해 세포는 본원에 개시된 키메라 수용체를 발현하도록 엔지니어링될 수 있다. 키메라 수용체 발현 작제물은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 기법 중 임의의 것을 사용하여 NK 세포 내로 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 키메라 수용체는 NK 세포에서 일시적으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, 키메라 수용체는 NK 세포에서 안정하게 발현된다. 추가의 구현예에서, NK 세포는 자가 세포이다. 또 다른 구현예에서, NK 세포는 공여자-유래(동종이계) 세포이다.
본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하도록 엔지니어링된 NK 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 키메라 수용체가 손상되거나 이환된 세포 또는 조직 상에서 차등적으로 발현되는(예를 들어, 정상 세포 또는 조직에 비하여 상이한 정도로 발현되는) 마커 또는 리간드를 표적화하도록 설계된 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 추가로 제공된다. 본원에 사용되는 용어 "발현한다", "발현되는" 및 "발현"에는 그들의 일상적인 의미가 제공되며, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 정보가 나타나게 하거나, 이것이 나타나게 야기하는, 예를 들어, 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역에 수반되는 세포 기능을 활성화시킴으로써 단백질을 생성하는 것을 지칭하여야 한다. 발현 생성물 그 자체, 예를 들어, 생성되는 단백질은 또한, 세포에 의해 "발현된다"고 할 수 있다. 발현 생성물은 세포내, 세포외 또는 막횡단으로 특성화될 수 있다. 용어 "세포내"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 세포 내측을 지칭하여야 한다. 용어 "새포외"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 세포 외측을 지칭하여야 한다. 용어 "막횡단"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 세포막에 매립된 폴리펩티드의 적어도 일부를 지칭하여야 한다. 용어 "세포질"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 세포막 내측, 핵 외측에 존재하는 것을 지칭하여야 한다. 대상체로의 요법제의 투여의 맥락에서 본원에 사용되는 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"에는 그들의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 대상체가 치료법으로부터 얻는 유리한 효과를 지칭하여야 한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 유전학적으로 엔지니어링된 세포(들)로의 대상체의 치료는 예를 들어, 하기를 포함하는 하기의 효과 중 1, 2, 3, 4개 이상을 달성한다: (i) 질환 또는 그와 연관된 증상의 중증도의 감소 또는 개선; (ii) 질환과 연관된 증상의 기간의 감소; (iii) 질환 또는 그와 연관된 증상의 진행에 대한 보호; (iv) 질환 또는 그와 연관된 증상의 퇴행; (v) 질환과 연관된 증상의 발생 또는 시작에 대한 보호; (vi) 질환과 연관된 증상의 재발에 대한 보호; (vii) 대상체의 입원의 감소; (viii) 입원 기간의 감소; (ix) 질환이 있는 대상체의 생존의 증가; (x) 질환과 연관된 증상의 수의 감소; (xi) 또 다른 치료법의 예방적 또는 치료적 효과(들)의 향상, 개선, 보충, 보완 또는 증가. 투여는 제한 없이 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 간내, 복강내 및/또는 이환 조직으로의 국소 전달을 포함하는 다양한 경로에 의해 이루어질 수 있다. NK 세포의 용량은 그들의 체중, 질환 유형 및 상태, 및 요망되는 치료 침해력에 기초하여 주어진 대상체에 대하여 용이하게 결정될 수 있지만, 구현예에 따라, ㎏당 약 105개의 세포 내지 ㎏당 약 1012개의 세포의 범위(예를 들어, 105 내지 107, 107 내지 1010, 1010 내지 1012 및 그 안의 중복 범위)일 수 있다. 일 구현예에서, 용량 증량 섭생법이 사용된다. 몇몇의 구현예에서, 소정의 범위, 예를 들어, 약 1 x 106개 세포/㎏ 내지 약 1 x 108개 세포/㎏의 NK 세포가 투여된다. 구현예에 따라, 다양한 유형의 암 또는 감염 질환이 치료될 수 있다. 본원에 제공되는 다양한 구현예는 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, 카포시 육종, 림프종, 위장암, 충수암, 중추신경계 암, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 종양(성상세포종, 척수 종양, 뇌간 교종, 두개인두종, 상의모세포종, 상의세포종, 수모세포종, 수질상피종을 포함하나 이들에 한정되지 않음), 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 자궁경부암, 결장암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수증식성 장애, 도관 암종, 자궁내막암, 식도암, 위암, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 백혈병, 신장 세포 암, 백혈병, 구강암, 비인두암, 간암, 폐암(비-소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암을 포함하나 이들에 한정되지 않음), 췌장암, 장암, 림프종, 흑색종, 안암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 뇌하수체암, 자궁암 및 질암을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 비-제한적인 예의 암의 치료 또는 예방을 포함한다.
또한, 본원에 제공되는 다양한 구현예는 예를 들어, 하기의 속 중 하나 이상으로부터의 박테리아로의 감염을 포함할 수 있는 박테리아 기원의 감염을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 비-제한적인 예의 감염성 질환의 치료 또는 예방을 포함한다: 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia) 및 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 해모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리아(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리켓시아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia), 및 그의 돌연변이체 또는 조합. 몇몇의 구현예에서, 다양한 바이러스 감염, 예컨대 하나 이상의 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 엡스테인-바 바이러스, a형 간염 바이러스, b형 간염 바이러스, c형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스, 1형, 단순 포진 바이러스, 2형, 사이토메갈로바이러스, 에볼라 바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 8형, HIV, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, 공수병 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 풍진 바이러스 및 수두-대상포진 바이러스에 의해 야기되는 것들을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 또한, SEQ ID NO. 1 내지 68의 각각의 핵산 또는 아미노산 서열과 비교하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%(및 그 안의 범위)의 상동성을 가지며, 또한, 각각의 SEQ ID NO. 1 내지 68과 비교하여 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 기능 중 하나 이상을 나타내는 핵산 및 아미노산 서열이 본원에 제공된다: (i) 향상된 증식, (ii) 향상된 활성화, (iii) 핵산 및 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 수용체를 갖는 NK 세포가 결합하는 리간드를 제시하는 세포에 대한 향상된 세포독성 활성, (iv) 종양 또는 감염 부위로의 향상된 귀소, (v) 감소된 표적외 세포독성 효과, (vi) 면역자극 사이토카인 및 케모카인(IFNg, TNFa, IL-22, CCL3, CCL4 및 CCL5를 포함하나 이들에 한정되지 않음)의 향상된 분비, (vii) 추가의 선천 및 적응 면역 반응을 자극하기 위한 향상된 능력, 및 (viii) 그의 조합.
또한, 몇몇의 구현예에서, 핵산 코드의 축퇴성을 고려하면서, 본원에 개시된 핵산 중 임의의 것에 상응하는 아미노산 서열이 제공된다. 또한, 본원에 명시적으로 개시된 것들과 달라지지만, 기능적 유사성 또는 등가성을 갖는 서열(핵산이든 아미노산이든)도 또한 본 개시내용의 범주 내에서 고려된다. 전술한 것은 돌연변이, 절단, 치환 또는 다른 유형의 변형을 포함한다.
몇몇의 구현예에 따라, 세포외 수용체 도메인으로서, 세포외 수용체 도메인이 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편인 세포외 수용체 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2 또는 3 또는 68의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 기능적 등가물에 의해 인코딩된다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 CD16을 포함하는 이펙터 도메인을 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NCR1을 포함하는 이펙터 도메인을 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NCR2를 포함하는 이펙터 도메인을 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NCR3을 포함하는 이펙터 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 4-1BB를 포함하는 추가의 이펙터 도메인 부분을 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D 및 CD16으로 구성된 키메라 수용체를 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D 및 NCR1로 구성된 키메라 수용체를 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 NKG2D 및 NCR2로 구성된 키메라 수용체를 인코딩한다. 추가의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 CD16 및 선택적으로 4-1BB에 커플링된 NKG2D로 구성된 키메라 수용체를 인코딩한다. 몇몇의 구현예에서, CD16은 구현예에 따라, NCR1에 의해, 일부 구현예에서, NCR2 또는 심지어 NCR3에 의해 대체된다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 예를 들어, 4-1BB와 CD16, NCR1, NCR2 또는 NCR3 중 하나 사이에 GS 링커를 추가로 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 힌지 영역은 CD8a를 포함한다. 그러나, 추가의 구현예에서, 힌지 영역은 일부 구현예에서, GS9, CD8a/GS3, 절단된 CD8a, GS3 등을 포함하는 하나 이상의 링커를 추가로 포함한다.
몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인은 CD8a 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 이펙터 도메인은 하나 이상의 헤미-ITAM 서열을 포함한다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 DNAX-활성화 단백질 10(DAP10)을 포함하지 않는다. 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체는 ITAM 모티프를 포함하지 않고, 오히려 대안적인 신호전달 영역, 예컨대 ITSM, 헤미-tam 또는 다른 동시-자극 영역을 사용한다.
일 구현예에서, 세포외 수용체 도메인으로서, 세포외 수용체 도메인이 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편인 세포외 수용체 도메인, 막횡단 영역으로서, 상기 막횡단 영역이 CD8a를 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인으로서, 상기 이펙터 도메인이 4-1BB 및 CD3 제타를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 인코딩하는 추가의 작제물과 동시-발현된다.
또한, 몇몇의 구현예에서, 세포외 수용체 도메인으로서, 세포외 수용체 도메인이 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드가 NKG2D의 단편인 세포외 수용체 도메인, 막횡단 영역으로서, 상기 막횡단 영역이 CD8a를 포함하는 막횡단 영역, 및 이펙터 도메인으로서, 상기 이펙터 도메인이 4-1BB 및 2B4 또는 DAP10의 세포내 도메인을 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 제2 펩티드를 포함한다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드는 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 또는 ULBP6을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 몇몇의 구현예에서, NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 키메라 수용체의 부분은 SEQ ID NO: 1, 2, 3 또는 68과 적어도 80% 상동성을 갖는다.
몇몇의 구현예에서, 제공되는 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용되는 용어 "핵산", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"에는 그들의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보핵산, 리보뉴클레오티드 및 리보핵산 및 그의 폴리머 형태를 포함하여야 하며, 단일- 또는 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산은 자연 발생 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA"), 및 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-천연 발생 염기, 천연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 뉴클레오티드와의 연결에 참여하는 뉴클레오티드, 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 연결을 통해 부착되는 염기를 포함하는 것들을 포함한다. 따라서, 핵산 유사체는 예를 들어, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA), 잠금-핵산(locked-nucleic acid; LNA) 등을 포함한다. 예를 들어, 이종 핵산 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 조절 핵산 서열이 이종 핵산 서열과 기능적 관계 내로 배치되는 것을 의미하여야 한다. IRES의 맥락에서, "에 작동 가능하게 연결된"은 이종 코딩 서열의 번역을 초래하는 mRNA 서열의 중간에서의 내부 리보솜 진입 부위를 함유하는 핵산 서열과 이종 코딩 서열 개시 간의 기능적 연결을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "벡터"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 유전학적으로 엔지니어링된 세포 내로 도입되어, 유전학적으로 엔지니어링된 세포를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및/또는 번역)을 촉진시킬 수 있는 비히클을 지칭하여야 한다. 벡터는 바이러스, 플라스미드, 파지 등을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "키메라 수용체"에는 그의 일상적인 의미가 제공되어야 하며, 천연적으로 단일의 단백질 상에서 함께 관찰되지 않는 적어도 2개의 폴리펩티드 도메인을 포함하는 세포-표면 수용체를 지칭하여야 한다. 본원에 사용되는 용어 "키메라 수용체 복합체"는 천연적으로 단일의 단백질 상에서 함께 관찰되지 않는 조합으로, 적어도 2개의 폴리펩티드 도메인을 포함할 수 있는 제1 폴리펩티드를 지칭하며, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드, 예를 들어, 어댑터 폴리펩티드, 신호전달 분자 또는 자극 분자와 회합된다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 생성 및 이용과 관련된 추가의 용어는 해당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 이해되며, 또한, 국제 공개 제WO 2014/117121호 및 미국 특허 제7,994,298호에서 찾을 수 있으며, 이의 각각은 본원에 그들 전문이 참조로 포함된다.
또한, 몇몇의 구현예에 따라, 본원에 제공되는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공되며, 폴리뉴클레오티드는 키메라 수용체의 발현을 위하여 적어도 하나의 조절 요소에 선택적으로 작동 가능하게 연결된다. 몇몇의 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 키메라 수용체를 포함하는 엔지니어링된 자연 살해 세포가 본원에 추가로 제공된다. 몇몇의 구현예에서, 이들 NK 세포는 질환, 예컨대 암 및/또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기에 적합하다.
실시예
방법
하기의 실험 방법 및 재료를 하기에 개시된 비-제한적인 실험예에서 사용하였다.
세포주 및 배양 조건
인간 급성 림프모구성 백혈병 세포주 REH, 인간 골육종 세포주 U-2 OS 및 인간 배아 신장 섬유모세포 293T(HEK 293T) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC; 미국 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 수득하였다. REH 세포를 10% 우태아혈청(FBS; 하이클론(Hyclone), 미국 유타주 로건 소재) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 시리즈(Roswell Park Memorial Institute series) 1640(RPMI-1640; 집코(Gibco), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 유지하고, 성장시켰다. HEK 293T 및 U-2 OS 세포 둘 모두를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 둘베코의 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagles Medium)(DMEM; 하이클론(Hyclone))에서 유지하고 성장시켰다. 모든 포유동물 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션시켰다.
DNA 플라스미드
키메라 수용체 NKG2D-DAP10-CD3ζ를 함유하는 DNA 플라스미드를 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Chang et al. Cancer Research, Vol. 73(6): 2013] 참조) 제조하였다. 중첩 연장 중합효소 연쇄 반응에 의한 스플라이싱(SOE-PCR)을 사용하여 개별 도메인을 융합시켜, NKG2D-41BB-CD3ζ 작제물을 형성하였다. 이어서, 상기 작제물을 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 레트로바이러스 벡터 내로 삽입하였다(도 3a). NKG2D-CD16 및 NKG2D-CD16-41BB에 대한 작제물을 코돈 최적화시키고, 진스크립트(GenScript)(중국 난징 소재)에 의해 MSCV 벡터(도 3b) 내로 삽입하였다. 작제물의 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
인간 NK 세포의 증량
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 성인 공여자로부터의 혈액 시료의 피콜(Ficoll) 밀도 원심분리에 의해 수득하였다. NK 세포를 증량시키기 위하여, PBMC를 막 결합된 IL-15 및 4-1BB 리간드로 유전학적으로 변형된 K562(K562-mb15-41BBL)와 함께 배양하였다. 세포를 2일마다 40IU의 IL-2/㎖를 보충하는 줄기 세포 성장 배지(SCGM; 셀 제닉스(Cell Genix), 독일 프라이부르크 소재)에서 배양하였다.
7일의 배양 후에, NK 세포를 항-CD3 다이나비즈(Dynabeads)(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 T-세포 고갈시켰다. 이어서, NK 세포를 2일마다 40 내지 200 IU의 IL-2/㎖을 보충하는 SCGM에서 배양하였다.
레트로바이러스의 생성 및 NK 세포의 형질도입
HEK 293T 세포를 레트로바이러스 패키징 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시킴으로써 레트로바이러스의 생성을 수행하였다. HEK 293T 세포를 먼저 트랜스펙션 18시간 전에 12 ㎖의 DMEM 중에 2.5Х106개 세포의 농도로 씨딩하였다. 이어서, 세포를 각각의 NKG2D 키메라 수용체를 함유하는 3.5 ㎍의 MSCV 벡터(비-제한적인 작제물이 도 1b, 도 1c, 도 2a 및 도 2b에 개략적으로 예시되어 있음), 3.5 ㎍의 pEQ-PAM3, 및 3.0 ㎍의 pRDF로 트랜스펙션시켰다. 대조군을 위하여, GFP를 함유하는 빈 MSCV 벡터를 사용하였다. X-tremeGENE 9 DNA 트랜스펙션 시약(로슈(Roche), 스위스 바젤 소재)을 트랜스펙션을 위해 사용하였다. DMEM을 트랜스펙션 24시간 후에 조정된 RPMI-1640으로 대체하였다.
NK 세포로의 NKG2D 키메라 수용체 트랜스유전자의 형질도입을 배지의 교환 18시간 후에 행하였다. NK 세포를 먼저 2 ㎖의 조정된 RPMI-1640 중에 0.25Х106개의 세포의 농도로 현탁화시켰다. 이후에, 세포를 레트로넥틴(RetroNectin)(다카라(TaKaRa), 일본 오츠 소재) 코팅된 튜브 내로 씨딩하였다. 레트로바이러스를 함유하는 RPMI-1640(바이러스 상층액)을 HEK 293T 세포 배양물로부터 수거하고, 신선한 조정 배지를 다시 배양물에 첨가하였다. 바이러스 상층액에 200 IU의 IL-2/㎖을 보충하고, 3 ㎖의 바이러스 상층액을 각각의 레트로넥틴 코팅된 튜브(씨딩된 NK 세포 함유) 내로 분배하였다. NK 세포의 생성의 특정 구현예에 따라, 씨딩된 NK 세포를 6회, 신선한 바이러스 배지를 사용하여 12시간마다 1회 형질도입하였다. 이어서, 형질도입된 NK 세포를 마지막 형질도입 48시간 후에 수거하고, 2일마다 200 IU의 IL-2/㎖을 첨가하여, SCGM 중에 배양하였다. 형질도입된 NK 세포를 증량 14 내지 28일 후에 실험을 위해 사용하였다.
유세포분석에 의한 키메라 수용체 발현의 검출
형질도입된 NK 세포를 알부민을 함유하는 인산염-완충 염수로 1회 세척하고, 2 ㎕의 토끼 혈청을 첨가하였다. 이어서, 세포를 암 중에 10분 동안 페리디닌 클로로필(PerCP)-컨쥬게이트된 항-인간 NKG2D 항체(클론 149810; 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미니애폴리스 소재)로 염색하였다. 대조군에 있어서, 형질도입된 NK 세포를 각각의 PerCP-컨쥬게이트된 IgG 아이소타입 항체로 염색하였다. 모든 NK 세포를 다시 세척하고, 300 ㎕의 0.5% 포름알데히드로 고정한 후, 아큐리(Accuri) C6 유세포분석기(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)를 사용하여 분석하였다. 데이터를 대응 t-검정을 사용하여 분석하였다.
세포독성 검정
REH 세포를 칼세인 AM 레드-오렌지(red-orange)(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월섬 소재)로 염색하였다. REH 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트(코스타(CoStar), 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내로 씨딩하였다. 이어서, 형질도입된 NK 세포를 다양한 이펙터:표적(E:T) 비로 첨가하였다. 세포 배양물을 37℃에서 CO2 5%로 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 염색된 생존 가능한 표적 세포를 아큐리 C6 유세포분석기를 사용하여 계수하였다. U-2 OS 세포를 96-웰 평편 바닥 백색 플레이트(코스타) 내로 씨딩하고, 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 형질도입된 NK 세포를 상이한 E:T 비에 따라 첨가하였다. 이어서, 세포 배양물을 또 다른 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 분석 이전에, 브라이트-글로(Bright-Glo) 기질(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 세포에 첨가하였다. 생존 가능한 표적 세포로부터의 발광의 세기를 FLx800 형광 판독기(바이오 테크(Bio Tek), 미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 측정하였다. 발광의 세기와 대조군 간의 차이를 세포독성 백분율로 전환시켰다.
인터페론 감마(IFNγ) 생성 검정
NK 세포에 의해 생성되는 IFNγ의 양을 결정하기 위하여, 이펙터 및 표적 세포를 먼저 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 REH와 함께(1:1의 E:T) 또는 이것 없이, 배양하였다. 세포를 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 골지플러그(GolgiPlug)(브레펠딘(brefeldin) A; 비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences))를 첨가하였다. 또 다시 5시간의 배양 후에, 세포를 피코에리트린(PE)-컨쥬게이트된 항-인간 CD56 항체(클론 MY31, 비디 바이오사이언스즈)로 표지하였다. 세포를 전매 투과화 시약을 사용하여 투과화시키고, 암 중에 40분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 전매 세척 완충제로 세척하였다. 세포내 IFNγ를 45분 동안 알로피코시아닌(APC)-컨쥬게이트된 IFNγ 항체(클론 25723.11; 비디 바이오사이언스즈)로 검출하였다. 이어서, 세포를 고정하고, 아큐리 C6 유세포분석기를 사용하여 분석하였다.
실시예 1 - CD3-제타 함유 NKG2D 작제물
본원에 개시된 바와 같이, 다양한 막횡단 및/또는 신호전달 도메인과 커플링된 NKG2D 및/또는 NKG2D 변이체를 포함하는 다양한 작제물이 제공된다. 본 실험을 행하여, CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 작제물의 발현 및 세포독성 활성을 평가하였다. 2개의 CD3-제타 작제물을 제조하고, 상기 기재된 방법 및 재료에 따라 시험하였다. 작제물에 따라, 사용되는 방법은 작제물을 생성하고, 발현시키고, 시험하기 위해 필요한 변화를 고려하기 위하여 용이하게 조정될 수 있다. 2개의 작제물은 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 NKG2D-41BB-CD3ζ였다. 참조를 위하여, 도 1a는 내인성 NKG2D를 개략적으로 도시한 것이다. NK 세포에서, NKG2D의 막횡단 영역 사이의 이온성 상호작용은 그의 어댑터 단백질 DAP10과의 회합을 가능하게 한다(문헌[Wu et al., 1999]). 리간드 결합 시에, NKG2D 신호는 DAP10 상에서 관찰되는 신호전달 모티프, YxNM을 통해 전달된다. CD3ζ는 그의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM; 문헌[Lanier, 2008])를 통해 신호를 전달한다. 2개의 실험적 작제물은 도 1b 및 도 1c에 각각 개략적으로 예시되어 있다. 도 1b는 NKG2D-DAP10-CD3ζ를 보여주며, 신호전달은 YxNM 및 ITAM 모티프 둘 모두를 통하여 발생한다. 도 1c는 NKG2D-41BB-CD3ζ 작제물을 보여주며, 이는 CD8a 힌지 영역을 막횡단 도메인으로서, 그리고 4-1BB 및 CD3ζ를 신호전달 도메인으로서 사용한다.
이들 작제물을 효율적으로 발현하는 NK 세포의 능력을 먼저 평가하였다. 건강한 성인 공여자의 PBMC로부터 증량된 NK 세포를 2개의 키메라 수용체 중 하나로 형질도입하였다. 모의-형질도입된 NK 세포를 대조군으로서 사용하였다(GFP만을 함유하는 빈 MSCV 벡터로 형질도입). 키메라 수용체의 존재 및 상대 존재비를 Per-CP 컨쥬게이트된 항-NKG2D 항체로의 NK 세포의 염색을 통해 결정하였다. 도 4a는 모의(좌측 패널), NKG2D-DAP10-CD3ζ(중앙 패널) 또는 NKG2D-41BB-CD3ζ(우측 패널) 작제물로의 형질도입 후의 NKG2D-양성 NK 세포의 백분율과 관련된 대표적인 유세포분석법 데이터를 도시한 것이다. 모의 형질도입된 NK 세포는 사용되는 항체로 NKG2D 발현을 보이지 않은 한편(활성화된 NK 세포 상에서의 천연적으로 높은 NKG2D 발현에도 불구하고, 아이소타입-일치된 비-반응성 항체를 초과하는 염색을 보이지 않음), NKG2D-DAP10-CD3ζ 작제물로 형질도입된 세포의 60% 미만, 및 NKG2D-41BB-CD3ζ로 형질도입된 NK 세포의 80% 초과가 아이소타입-일치된 비-반응성 항체 대조군을 초과하는 NKG2D 발현을 나타내었다. 모든 공여자로부터의 NKG2D 양성 NK 세포의 백분율에 대한 풀링된 데이터는 도 4b에 나타나 있다. 둘 모두의 엔지니어링된 NKG2D 작제물은 모의에 비하여, NKG2D 발현의 상당한 증가를 초래하지만, 2개의 작제물의 발현 백분율 간에는 유의미한 차이가 존재하지 않는다. 도 4c는 NKG2D 작제물을 발현하는 집단 내에서, 세포가 작제물을 발현하는 정도를 나타내는 평균 형광 세기(MFI)에 기초한 발현 데이터를 도시한 것이다(예를 들어, 세포당 다수의 카피의 작제물은 더 큰 MFI를 제공할 것이다). 이러한 척도에 의해, NKG2D-41BB-CD3ζ의 발현은 NKG2D-DAP10-CD3ζ 작제물의 발현보다 유의미하게 더 크다.
종합하여, 이들 데이터는 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 엔지니어링된 작제물이 NK 세포 상에서 성공적으로 발현될 수 있음을 입증한다. 몇몇의 구현예에서, 향상된 작제물의 발현은 특정 작제물로의 NK 세포의 반복된 형질도입에 의해 달성될 수 있다. 몇몇의 구현예에서, 작제물의 성분은 단일의 벡터에서, 또는 대안적으로, 다수의 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 구현예에 따라, 작제물 그 자체는 향상된 발현을 야기할 수 있으며, 예를 들어, 선형 또는 헤드 투 테일 작제물은 다수의 서브유닛 작제물이 필요로 하는 더 적은 정도의 세포-내 어셈블리 때문에, 증가된 발현을 제공할 수 있다.
또한, NK 세포 상에서 NKG2D 작제물을 성공적으로 발현시키기 위해, NK 세포의 효과적인 신호전달이 표적 세포에서 작용하는 것이 요구된다. 형질도입된 NK 세포의 두 집단의 효력을 평가하기 위해, NK 세포 활성에 민감성인 세포주, REH(현탁 세포) 및 U-2 OS(부착 세포)를 사용하여 세포독성 검정을 수행하였다. 2가지의 E:T 비에서, 독립적인 공여자에 걸친, REH 세포에 대한 상이한 군의 NK 세포의 세포독성 백분율을 요약한 데이터는 도 5A 내지 도 5C에 나타나 있다(오차 막대는 표준 편차를 나타내며; 모든 실험을 3벌로 행한다; n = 3(P <0.001)). 도 5A 내지 도 5C에 도시된 바와 같이, 어느 하나의 NKG2D 키메라 수용체((a) 표지된 화살표로 나타낸 NKG2D-DAP10-CD3ζ 및 (b) 표지된 화살표로 나타낸 NKG2D-41BB-CD3ζ)를 발현하는 NK 세포는 모든 3명의 공여자에 있어서, 모의 NK 세포((c) 표지된 화살표로 나타냄)에 비해 REH에 대하여 유의미하게 더 높은 세포독성을 가졌다. NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포의 평균 세포독성 백분율은 91.8% ± 5.8%(1:1 E:T 비) 및 83.9% ± 5.6%(1:2 E:T 비)였다. NKG2D-41BB-CD3ζ로 형질도입된 그들 NK 세포는 유사한 효력을 보였다 - 1:1 E:T 비에서 87.4% ± 6.1% 및 1:2 E:T 비에서 76.2% ± 4.8%. 키메라 수용체-발현 NK 세포는 또한 모의-형질도입된 NK 세포와 비교하는 경우 U-2 OS에 대하여 증가된 세포독성을 보였다(도 6A 내지 도 6C 참조, 도 6A는 (a) 표지된 화살표로 나타낸 NKG2D-DAP10-CD3ζ를 도시한 것이며, 도 6B는 (b) 표지된 화살표로 나타낸 NKG2D-41BB-CD3ζ를 도시한 것이며, 도 6C는 (c) 표지된 화살표로 나타낸 모의 NK 세포를 도시한 것이다).
이들 데이터는 NK 세포가 키메라 수용체 작제물을 발현하도록 엔지니어링될 수 있을 뿐 아니라, 키메라 수용체를 발현하는 그들 세포가 활성화되고, 표적 세포에 대하여 향상된 세포독성 효과를 성공적으로 생성할 수 있다는 증거를 제공한다. 중요한 것은, 이들 데이터가 또한 더 많은 수의 표적 세포(이 실험에서 배가됨)가 존재하는 경우에, 세포 효력의 오직 약간의 감소만이 존재하는 것을 보여준다는 것이다. 이는 임상적 이용의 경우일 것과 같이, 심지어 NK 세포가 표적 세포에 비하여 더 작은 수로 존재하는 경우에도 엔지니어링된 NK 세포의 요망되는 세포독성 효과가 여전히 실현될 수 있는 것을 뒷받침한다. 또한, 이들 데이터는 일부 구현예에 따라, 주어진 NK 세포 상에서의 키메라 수용체 발현의 더 적은 밀도 또는 정도가 반드시 대등하게 감소된 세포독성 효과를 초래하지 않으며, 그들의 더 적은 작제물 발현을 고려하여, NK 세포의 예기치 않은 효능과 연관될 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이들 데이터는 몇몇의 구현예에 따라 달성되는 예기치 않게 향상된 세포독성을 구현한다. 비-엔지니어링된 NK 세포가 세포독성이며, 활성화 시에 유의미한 양의 NKG2D를 발현하지만, 본원에 개시된 엔지니어링된 세포가 세포독성 효과를 이미 상승된 상한으로 고려될 수 있는 것(예를 들어, 고유 NK 세포 세포독성)을 유의미하게 넘어서게 할 수 있는 것은 예기치 못한 것이다.
세포독성 데이터에 추가하여, 다양한 NKG2D 작제물을 발현하는 NK 세포에 의한 인터페론-감마(IFNγ)의 생성을 평가함으로써 NK 세포가 이들 효과를 발휘하는 메커니즘을 시험하였다. IFNγ는 NK 세포에 의해 생성되고 방출되는 주요 사이토카인이며, 이는 대식구를 동원하며, 면역자극 효과를 갖는다. 도 7a는 REH 세포에 의한 자극과 함께 또는 이것 없이, 모의(좌측 패널), NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포(중앙 패널) 및 NKG2D-41BB-CD3ζ-발현 NK 세포(우측 패널)에서의 상대적인 IFNγ의 생성량(MFI에 의해 측정)을 보여준다. NK 세포를 세포내 IFNγ에 대한 APC-컨쥬게이트된 항-IFNγ 항체에 의해 염색하였다. 데이터를 대응 t 검정에 의해 분석하였다. 이들 데이터는 3개의 NK 세포의 군의 각각이 자극 없이 유사한 수준의 IFNγ 생성을 갖는 것으로 관찰되며, REH 세포에 의한 자극 후에 증가가 관찰되는 것을 보여준다. 몇몇의 구현예에 대하여 제공되는 바와 같이, NKG2D 작제물을 발현하는 엔지니어링된 NK 세포는 강력한 사이토카인 생성을 야기할 수 있다. 엔지니어링된 NK 세포가 반응하는 표적 세포(본원에서 REH 세포)의 존재는 생화학적 캐스케이드를 진행시키며, 이는 IFNγ 생성 및 궁극적으로 세포독성 효과를 야기한다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, NKG2D-41BB-CD3ζ-발현 NK 세포는 자극성 REH 세포의 존재 하에 강력한 IFNγ의 생성을 보여준다. 흥미롭게도, NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포는 유사한 정도의 반응을 보이지 못하였다. 이는 REH 세포로의 자극 후에 상이한 군의 NK 세포 간의 IFNγ의 수준을 평가한 도 7b(중간값이 나타나 있으며; 데이터를 비-대응 t 검정에 의해 분석하였음)에서 추가로 입증된다. 모든 IFNγ 실험을 3명의 독립적인 공여자, n = 9를 사용하여 3벌로 행하였다. 도 7b는 NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포에 의한 IFNγ 생성이 모의-형질도입된 NK 세포와 유의미하게 상이하지 않았음을 보여준다. 대조적으로, NKG2D-41BB-CD3ζ-발현 NK 세포는 모의-형질도입된 NK 세포에 비하여, IFNγ 생성의 유의미한 증가를 보인다. 그들이 본원에 논의된 바와 같이, 리간드 결합에 반응하는 키메라 수용체에 의한 신호전달이 관심 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 생성하는데 필수적인 단계임을 나타내기 때문에, 이들 데이터는 흥미로운 것이다. 그러나, 2개의 상이한 키메라 수용체로 형질도입된 NK 세포 둘 모두가 상대적으로 유사한 세포독성을 나타내지만 반영하는 IFNγ 생성 수준이 존재하지 않기 때문에, 다양한 작제물이 신호전달하는 단일의 경로는 존재하지 않는다. 따라서, 일부 구현예에 따라, 정상적인 NK 세포에 비하여, IFNγ 또는 다른 면역자극 사이토카인의 상승된 생성을 통하여 세포독성 효과를 달성하는 작제물이 제공된다. 그러나, 몇몇의 구현예에서, 증가된 IFNγ의 생성은 반드시 달성되거나 검출되지 않고, 오히려, 주어진 키메라 작제물에 의하여 또 다른 면역자극 경로가 이용되어, 상승된 세포독성 효과를 달성할 수 있다.
실시예 2 - CD16 및 CD16-4-1BB 함유 NKG2D 작제물
발현, 세포독성 및 사이토카인 생성을 평가하기 위하여 추가의 작제물을 생성하였다. 본원에 제공된 바와 같이, 몇몇의 구현예는 CD16 막횡단 및/또는 신호전달 도메인을 사용하는, 절단된 NKG2D(일부 구현예에서, 코돈 최적화됨)를 포함하는 작제물에 관한 것이다. 이러한 실험에서의 평가를 위하여 생성된 작제물은 도 2a 및 도 2b에 개략적으로 나타나 있으며, 이는 a) NKG2D-CD16 및 b) NKG2D-CD16-41BB 키메라 수용체의 구조를 보여준다. 두 키메라 수용체 모두는 CD3ζ 또는 FcRγ 중 어느 하나와 회합하기 위하여 CD16의 막횡단 영역에 의존한다. 이들 작제물을 생성하기 위해 사용되는 플라스미드는 도 3b에 나타나 있다. 상기 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서, 사용되는 작제물은 CD3ζ 또는 FcRγ의 내인성 발현에 의존하지만, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체를 인코딩하는 플라스미드(또는 개별 플라스미드)는 NK 세포에 의한 CD3ζ 및/또는 FcRγ의 발현을 상승시켜, 그에 의해, 세포의 효력을 향상시키도록 구성된다.
상기와 같이, 작제물의 발현 수준을 평가하였다. 도 8a는 모의(좌측 패널), NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포(중앙 패널) 및 NKG2D-CD16-발현 NK 세포에 대한 대표적인 유세포분석법 데이터를 도시한 것이다(상이한 기호로 나타낸 3명의 독립적인 공여자로부터의 세포를 사용하여 실험을 행하였다. 데이터를 대응 t 검정에 의해 분석하였다). 도 8b는 NKG2D(및 이에 따라 작제물)를 발현하는 세포의 백분율에 관한 요약 데이터를 보여준다. 예상되는 바와 같이, 모의-트랜스펙션된 NK 세포는 사용되는 항체와 함께, 낮은 수준의 NKG2D 발현을 보인다. 대조적으로, 엔지니어링된 작제물 둘 모두는 유의미하게 향상된 발현을 나타내었으며, NKG2D-CD16-형질도입된 NK 세포는 모의-형질도입된 NK 세포에 비하여 35.8% ± 6.9% 더 큰 발현을 발현하였다. 또한, MFI에 의해 평가되는 바와 같이(도 8c), NKG2D-CD16-형질도입된 NK 세포는 또한, 증가된 작제물의 발현을 나타내었다. 이들 데이터는 작제물이 NK 세포 내로 효율적으로 도입될 수 있으며 발현되는 것을 입증하는데 중요하다.
작제물의 발현이 확립되면, 세포독성 효과를 나타내는 그들의 능력을 평가하였다. 상기 논의된 바와 같이, 3명의 공여자로부터의 NK 세포를 각각 3가지의 E:T 비에서, REH 세포 및 U-2 OS 세포에 대한 세포독성 효과에 대하여 시험하였다(모든 실험을 3벌로 행하였다, n=3). 흥미롭게도, 모의 NK 세포에 비하여 향상된 NKG2D-CD16 작제물의 발현은 증가된 세포독성을 초래하지 않았다(도 9A 내지 도 9C 참조, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄). 이전의 실시예에서와 같이, NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포((a) 표지된 화살표로 나타냄)는 증가된 세포독성을 나타내지 않았다. U-2 OS 세포에 대한 세포독성에 관하여, NKG2D-CD16((b) 표지된 화살표로 나타냄)은 모의 NK 세포((c) 표지된 화살표로 나타냄)에 비하여 증가된 세포독성을 나타내지 않았다(도 10A 내지 도 10C 참조). 이들 데이터는 특정한 주어진 표적 세포 유형에 대한 세포독성 영향의 정도가 사용되는 NK 작제물과 함께 달라질 수 있는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 특정 작제물은 유효하지 않을 수 있지만, 몇몇의 구현예에서, NK 세포의 집단의 조합이 사용될 수 있으며, 상승적 효과를 나타낸다. 다시 말하면, 일부가 NKG2D-CD16을 발현하며, 일부가 NKG2D-DAP10-CD3ζ를 발현하는 NK 세포의 집단(또는 본원에 개시된 작제물 중 임의의 것의 다른 조합)은 단독의 어느 하나의 하위-집단에 비하여 예기치 않게 향상된 세포독성을 나타낼 수 있다.
다음으로, 인터페론-γ 생성을 측정하여, 트랜스펙션된 NK 세포의 작용 메커니즘을 확인하였다. 다양한 작제물을 발현하는 NK 세포를 REH 세포에 의해 자극하거나, 자극하지 않았으며, IFNγ의 생성을 측정하였다. 이들 데이터는 도 11에 나타나 있다(데이터를 대응 t 검정에 의해 분석하였다). 모든 NK 세포의 군은 자극 없이 유사한 수준의 IFNγ를 가졌으며, REH 세포와의 인큐베이션 후에 증가되었다. NKG2D-CD16-발현 NK 세포는 634 ± 211 MFI의 IFNγ 생성의 증가를 나타내었으며, 이는 모의-형질도입된 NK 세포에 의해 나타나는 증가(423 ± 70 MFI)보다 더 컸다. 그러나, 상기 증가는 2041 ± 411 MFI 증가된 NKG2D-DAP10-CD3ζ-발현 NK 세포에 대하여 관찰되는 증가보다 더 낮았다. 데이터와 일치하게, 몇몇의 구현예에 따라, IFNγ의 생성은 특정 작제물을 발현하는 NK 세포가 나타내는 세포독성 효과와 연관된다.
본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 다수의 신호전달 영역이 사용될 수 있다. 추가의 실험을 행하여, 증량된 NK 세포에서 NKG2D-CD16-41BB의 발현을 평가하였다(실험을 1명의 공여자로부터의 세포를 사용하여 행하였다). 발현 데이터는 도 12a 및 도 12b에 나타나 있다. 도 12a는 4-1BB 신호전달 영역의 첨가가 NKG2D-CD16 작제물에 비하여, NK 세포에 의한 작제물의 발현을 유의미하게 손상시키지 않는 것을 입증하는 유세포분석법 미가공 데이터를 보여준다. 이것은 또한, 시험되는 NK 세포 군의 각각의 표면 상에서의 상대적인 NKG2D 수용체의 양을 보여주는 도 12b의 요약 히스토그램에 반영된다. NKG2D-CD16-41BB는 NKG2D-CD16에 비하여 약간 감소된 MFI를 보이지만, 두 작제물 모두는 모의에 비하여 상승된 발현을 보인다.
세포독성 효과를 표적으로서 REH 및 U-2 OS 세포 둘 모두를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 평가하였다. 도 13A 및 도 13B는 생성된 데이터를 도시한 것이다(오차 막대는 표준 편차를 나타내며; 모든 실험을 3벌로 행하였다, n = 3). 도 13A는 REH 세포에 대한 작제물의 세포독성 효과를 보여준다. 상기 실험과 유사하게, (b) 표지된 화살표로 나타낸 NKG2D-CD16-발현 세포는 (a) 표지된 화살표로 나타낸 모의 NK 세포에 비하여 유의미하게 상승된 세포독성 효과를 보이지 않았다. 대조적으로, ((c) 표지된 화살표로 나타낸) NKG2D-CD16-41BB를 발현하는 NK 세포는 REH 세포에 대하여 향상된 세포독성을 보였다. U-2 OS 세포에 대한 효능에 관하여, NKG2D-CD16 및 NKG2D-CD16-41BB 발현 세포는 둘 모두 향상된 세포독성을 보였으며, NKG2D-CD16-41BB 발현 세포는 더욱 강력한 세포독성 효과를 나타내었다. 이는 몇몇의 구현예에 따라, 신호전달 도메인의 조합의 이용이 형질도입된 NK 세포의 효능의 예기치 않은 향상을 초래할 수 있음을 보여준다. 따라서, 상기 기재된 바와 같이, 몇몇의 구현예는 함께 상승적으로 작용하는 2개 이상의 막횡단/신호전달 도메인을 사용하여, 표적 세포에 대하여 향상된 세포독성을 제공한다.
실시예 3 - 추가의 NKG2D 작제물
다양한 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 이펙터 도메인이 있는 추가의 작제물을 생성하여, 그들의 발현 및 세포독성을 평가하였다. 이러한 실험에서의 평가를 위해 생성된 12개의 작제물은 도 14에 개략적으로 나타나 있다. 이들 변이체 키메라 수용체의 일부는 CD3ζ 또는 FcRγ 중 어느 하나와 회합하기 위하여 CD16 막횡단 영역에 의존한다. 상기 논의된 바와 같이, 몇몇의 구현예에서, 사용되는 작제물은 CD3ζ 또는 FcRγ의 내인성 발현에 의존하지만, 몇몇의 구현예에서, 키메라 수용체를 인코딩하는 플라스미드(또는 개별 플라스미드)는 NK 세포에 의한 CD3ζ 및/또는 FcRγ의 발현을 상승시켜, 그에 의해 세포의 효력을 향상시키도록 구성된다. 상기와 같이, 작제물의 발현 수준을 평가하였다. 모의-트랜스펙션된 NK 세포는 MFI에 의해 평가시 낮은 수준의 NKG2D 발현을 보여준다(도 16a). 대조적으로, 상기 기재된 변이체 NKG2D 작제물로 형질도입된 NK 세포는 다양한 수준의 NKG2D의 발현을 보였으며, 엔지니어링된 변이체 작제물 4 및 9는 NK 세포에서 유의미하게 향상된 발현을 나타내었다. 도 16b는 2명의 공여자의 NK 세포로의 형질도입 후의 변이체 NKG2D 작제물 1, 4, 8, 9에 대한 대표적인 유세포분석법 데이터를 도시한 것이다. 모의-형질도입된 NK 세포에 비하여, 변이체 8- 및 9-형질도입된 NK 세포는 특히 강력한 키메라 수용체의 발현을 보였다. 변이체 작제물 발현은 형질도입 7일 후에, 2명의 공여자의 NK 세포에서 지속되었으며, 변이체 8 및 9는 MFI에 의해 평가시 특히 향상된 수준을 보여준다(도 16c). 이들 데이터는 작제물이 NK 세포 내로 효율적으로 도입될 수 있고, 발현되는 것을 입증하는데 중요하다. 작제물의 발현이 확립되면, 형질도입된 NK 세포에서 세포독성 효과를 전달하는 그들의 능력도 또한 평가하였다. NKG2D 변이체 작제물 4, 8 및 9의 세포독성을 1:1 E:T 비에서의 NK 세포 내로의 형질도입 14일 후에 평가하였다(도 17).
추가의 변이체 작제물을 생성하고, 도 15에 개략적으로 나타내었으며, 이는 다양한 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 수용체의 구조를 보여준다. 이들 변이체 키메라 수용체의 일부는 리간드 결합 시에 신호전달을 전달하기 위하여 CD3제타 및/또는 또 다른 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인에 의존하지만, 다른 변이체 키메라 수용체는 이량체화를 통하여 전장 CD3제타 분자를 시냅스에 동원하는 CD3제타 막횡단 도메인을 포함한다. 상기와 같이, 작제물의 발현 수준을 평가하였다. MFI에 의해 평가되는 바와 같이(도 18a 및 도 18b), 엔지니어링된 작제물로 형질도입된 NK 세포는 모의 형질도입된 세포에 비하여 증가된 키메라 수용체의 발현을 나타내었다. 1:1의 이펙터:표적 비를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 세포독성 효과를 평가하였다. 도 19a 및 도 19b에 도시된 바와 같이, 엔지니어링된 작제물(특히 변이체 18)로 형질도입된 NK 세포는 모의 대조군에 비하여 향상된 세포독성을 갖는다.
변이체 18이 향상된 세포독성 효과를 동반하는 NK 세포에서 강력한 발현을 나타내기 때문에, CD3제타 막횡단 도메인을 포함하는 일련의 변이체 NKG2D 작제물을 생성하였다. 이들 변이체는 "NK39"로 명명되어 있고, 도 15에 개략적으로 나타나 있다. (낮은 IL-2 조건에서의 4일의 배양과 함께) 공여자 NK 세포로의 트랜스펙션 14일 후에, 형질도입된 NK 세포의 세포독성을 평가하였다. 도 21은 1:1 및 1:2 E:T 비에서, 배양된 REH 세포에 대한 작제물의 세포독성 효과를 보여준다. 엔지니어링된 NK39 작제물을 발현하는 모든 NK 세포는 1:1 E:T 비에서 대조군 NK 세포에 비하여 유의미하게 상승된 세포독성 효과를 나타내었다. 1:2 E:T 비에서 평가되는 경우, 키메라 작제물 16-7, 39-1, 39-2, 39-3 및 39-5는 각각 모의 대조군에 비하여 그들의 각각의 형질도입된 NK 세포의 세포독성 효과를 향상시켰다. 활성화 수용체의 외인성 발현이 NK 세포 아네르기 및 세포사를 야기할 수 있기 때문에, 엔지니어링된 작제물을 2개의 공여자 NK 세포 내로 형질도입하였으며, 21일 후에 생존을 평가하였다. 도 23a 및 도 23b에 도시된 바와 같이, NK39-5 및 NK39-10 형질도입된 세포는 2명의 시험된 공여자에서 NK16보다 더 나은 생존을 보인다.
실시예 4 - NK45 NKG2D 작제물의 평가
본원에 개시된 구현예에 따른 다양한 세포외 도메인, 힌지, 막횡단 도메인 및 세포내 이펙터 도메인을 갖는 추가의 작제물은 도 22에 개략적으로 나타나 있다. 이들 7가지의 작제물에 의해 매개되는 발현, 세포독성, 지속성 및 사이토카인 생성을 실시예 3에 기재된 NK39 작제물 중 3가지(NK39-5, NK39-6, NK39-10) 및 막-결합된 인터류킨 15를 비시스트론적으로 발현하는 NK16의 버전(NK26-8)과 비교하여 이러한 실시예에서 평가하였다. 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 다수의 신호전달 영역이 사용될 수 있다. 이들 변이체 키메라 수용체의 일부는 리간드 결합 시에 신호전달을 전달하기 위하여 CD3제타 및/또는 또 다른 신호전달 도메인(예를 들어, OX40, CD28 및/또는 4-1BB 동시자극 도메인)을 포함하는 이펙터 도메인에 의존하는 한편, 다른 변이체 키메라 수용체는 이량체화를 통하여 전장 CD3제타 분자를 시냅스에 동원하는 CD3제타 막횡단 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 이들 작제물은 추가로 막-결합된 IL15를 동시-발현하도록 구성된다.
상기와 같이, 이들 작제물을 효율적으로 발현하는 NK 세포의 능력을 먼저 평가하였다. 4명의 공여자의 PBMC로부터 증량된 NK 세포를 변이체 작제물(또는 GFP만을 함유하는 빈 MSCV 대조군 벡터)로 형질도입하였으며, NKG2D 발현을 3일 후에 MFI에 의해 평가하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 모의-트랜스펙션된 NK 세포는 상대적으로 낮은 수준의 NKG2D 발현을 보여준다. 대조적으로, 엔지니어링된 변이체 작제물은 유의미하게 향상된 발현을 나타내었으며, NK45-4(NKG2D-OX40-CD3ζ)는 모든 공여자에서 놀랍게도 강력한 발현을 보여준다. OX40는 활성화된 NK 세포에서 발현되지만, 그의 역할은 널리-확립되어 있지 않다. CD28 동시자극 도메인을 함유하는 이펙터 도메인이 있는 변이체 키메라 수용체(NK45-2; NKG2D-CD28-CD3ζ)는 또한, 형질도입 3일 후에 강력한 발현을 보여주었다.
변이체 작제물의 발현이 확립되면, 표적으로서 REH 및 HL60 세포를 사용하여, 상기와 같이 세포독성 효과를 발휘하는 그들의 능력을 평가하였다. 형질도입 14일 후에, 1:1 E:T 비에서 REH 세포(도 25a) 및 HL60 세포(도 25b)에 대하여 4명의 공여자로부터의 NK 세포의 효력을 시험하였다. 도 25a 및 도 25b에 도시된 바와 같이, 엔지니어링된 작제물은 모의 NK 세포에 비하여, 4명의 공여자 모두에서 REH 및 HL60 세포 둘 모두에 대하여 향상된 세포독성을 발휘하였다. 그의 두드러진 발현 프로파일에 더하여, NK45-4를 발현하는 세포(NKG2D-OX40-CD3ζ)는 또한, 모의 대조군 및 시험되는 다른 작제물에 비하여 놀랍게도 상승된 세포독성을 나타내었다. NK45-1 및 NK45-2를 발현하는 NK 세포는 또한, 이들 검정에서 두드러진 세포독성을 보였다. 이들 데이터는 몇몇의 구현예에 따라, 신호전달 도메인의 조합(특히 OX40 동시자극 도메인)의 이용이 형질도입된 NK 세포의 효능의 예기치 않은 향상을 초래할 수 있음을 보여준다. 도 28a 및 도 28b는 다양한 E:T 비(1:2 및 1:4)에서 몇몇의 변이체 작제물로 형질도입되고, 더욱 연장된 기간에 걸쳐 평가되는 NK 세포의 U2OS 세포에 대한 세포독성 활성을 도시한 것이다. 놀랍게도, 45-4 작제물로 형질도입된 NK 세포는 시간 경과를 통하여 세포독성 활성을 유지하는 것으로 보인다. 유리하게는, 이들 실험은 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, NKG2D 변이체 작제물이 구현예에 따라, 2 내지 3일, 3 내지 5일, 5 내지 7일, 7 내지 8일, 8 내지 10일, 10 내지 14일, 14 내지 21일 또는 21 내지 50일의 범위(및 종점을 포함하는 열거된 것들 사이의 임의의 범위)일 수 있는 연장된 기간에 걸쳐 예기치 않게 향상된 세포독성을 제공하는 것을 나타낸다. 몇몇의 구현예에서, 훨씬 더 긴 세포독성 효과의 기간이 달성된다.
세포독성 데이터에 추가로, REH 세포로의 자극 후에 그들의 IFNγ, TNFα 및 GM-CSF의 생성을 평가함으로써 NK 세포가 이들 효과를 발휘하는 메커니즘을 시험하였다. 도 26a 내지 도 26c에 도시된 바와 같이, 변이체 작제물의 각각의 발현은 GFP-발현 대조군 NK 세포에 의해 나타나는 IFNγ, TNFα 및 GM-CSF의 생성에 비하여 향상된 사이토카인 분비를 제공하였다. 키메라 수용체 NK45-1은 지속적으로 높은 사이토카인 생성을 매개하였으며, 이러한 작제물이 NK26-8(그것은 힌지 영역에 관해서만 상이함)보다 실질적으로 더 낮은 수준으로 발현하기 때문에 이는 놀라운 것이다. 따라서, 이들 데이터는 자극에 반응하여 강력한 사이토카인 생성을 매개하기 위한, 본원에 개시된 힌지 영역의 예기치 않은 중요성을 보여준다. 또한, NKG2D-OX40-CD3ζ-발현 NK 세포는 또한 IFNγ, TNFα 및 GM-CSF의 상승된 생성을 보여주었다.
활성화 수용체의 외인성 발현이 NK 세포 아네르기 및 세포사를 야기할 수 있기 때문에, 엔지니어링된 작제물을 2명의 공여자 NK 세포 내로 형질도입하였으며, 총 세포 계수를 형질도입 후 7, 14 및 21일에 평가하였다. 놀랍게도, 총 세포 계수가 GFP-발현 대조군 세포와 유사한 수준으로 유지되기 때문에, NK45-4의 예기치 않게 강력한 발현은 배양 중인 감소된 NK 세포 지속성을 희생시키지 않는다(도 27a 및 도 27b). 마찬가지로, 변이체 작제물을 높은 수준으로 발현하는 다른 NK 세포는 형질도입 후 적어도 3주 동안 2명의 공여자에서 계속 증식하였다. 종합하여, 이들 데이터는 본원에 개시된 몇몇의 구현예에 따라, 엔지니어링된 작제물이 NK 세포에서 높은 수준으로 성공적으로 발현되고, 세포독성 효과를 매개할 수 있으며, 추가로 이러한 향상된 발현이 감소된 NK 세포 증식 및/또는 생존을 손상시키지 않는 것을 보여준다.
상기 개시된 구현예의 특정 특징 및 양태의 다양한 조합 또는 하위조합이 이루어질 수 있고, 여전히 본 발명 중 하나 이상에 속하는 것으로 생각된다. 더욱이, 일 구현예와 연관되는 임의의 특정 특징, 양태, 방법, 성질, 특성, 품질, 속성, 요소 등의 본원의 개시내용은 본원에 제시된 모든 다른 구현예에서 사용될 수 있다. 따라서, 개시된 구현예의 다양한 특징 및 양태는 다양한 방식의 개시된 발명을 형성하기 위해 서로 조합되거나 치환될 수 있음을 이해하여야 한다. 이에 따라, 본원에 개시된 본 발명의 범위는 상기 기재된 특정 개시된 구현예에 의해 한정되지 않아야 하는 것으로 의도된다. 더욱이, 본 발명이 다양한 수정 및 대안의 형태에 영향을 받기 쉽지만, 그 특정 예가 도면에 도시되고 본원에 상세히 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 개시된 특정 형태 또는 방법으로 한정되는 것이 아니라, 반대로, 본 발명은 기재된 다양한 구현예 및 첨부된 청구범위의 취지 및 범위 내에 속하는 모든 수정, 균등물 및 대안을 망라하는 것임을 이해하여야 한다. 본원에 개시된 임의의 방법은 나열된 순서로 수행될 필요는 없다. 본원에 개시된 방법은 실행자가 취하는 특정 행동을 포함하지만; 그들은 명시적으로 또는 암시에 의해 그들 행동의 임의의 제3자의 지시를 포함할 수 있다. 예를 들어, "증량된 NK 세포의 집단을 투여하는 것"과 같은 행동은 "증량된 NK 세포의 집단의 투여를 지시하는 것"을 포함한다. 또한, 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹에 관하여 기재되는 경우, 해당 분야의 숙련자는 본 개시내용이 또한 그에 의해 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 그의 구성원의 하위그룹에 관하여 기재되는 것을 인식할 것이다.
본원에 개시된 범위는 또한 임의의 및 모든 중첩, 하위-범위, 및 그의 조합을 포함한다. "까지", "적어도", "초과", "미만", "사이" 등과 같은 언어는 나열된 수를 포함한다. "약" 또는 "대략"과 같은 용어가 선행하는 수는 나열된 수를 포함한다. 예를 들어, "약 90%"는 "90%"를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 95% 상동성은 참조 서열에 대한 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 상동성을 포함한다. 또한, 서열이 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 "포함하는" 것으로 개시되는 경우, 이러한 참조서열은 다르게 나타내지 않는 한, 서열이 언급된 서열을 "포함하거나", "이로 이루어지거나", 또는 "본질적으로 이로 이루어지는" 것을 포함하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore; Nkarta, Inc <120> TRUNCATED NKG2D CHIMERIC RECEPTORS AND USES THEREOF IN NATURAL KILLER CELL IMMUNOTHERAPY <130> 4459.1144002 <150> 62/477335 <151> 2017-03-27 <150> 62/628774 <151> 2018-02-09 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Full length NKG2D <400> 1 gggtggattc gtggtcggag gtctcgacac agctgggaga tgagtgaatt tcataattat 60 aacttggatc tgaagaagag tgatttttca acacgatggc aaaagcaaag atgtccagta 120 gtcaaaagca aatgtagaga aaatgcatct ccattttttt tctgctgctt catcgctgta 180 gccatgggaa tccgtttcat tattatggta acaatatgga gtgctgtatt cctaaactca 240 ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 300 aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 360 gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 420 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 480 acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 540 attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 600 aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 645 <210> 2 <211> 405 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Truncated NKG2D <400> 2 ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60 aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120 gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180 gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240 acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300 attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360 aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405 <210> 3 <211> 405 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Codon Optimized Truncated NKG2D <400> 3 ctgttcaatc aggaagtcca gatccccctg acagagtctt actgcggccc atgtcccaag 60 aactggatct gctacaagaa caattgttat cagttctttg acgagagcaa gaactggtat 120 gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 180 gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtcc tatcactgga tgggcctggt gcacatccct 240 acaaacggct cttggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctccaaatct gctgaccatc 300 atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagct ccttcaaggg ctatatcgag 360 aactgctcca cacccaatac ctacatctgt atgcagagga ccgtg 405 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD8 Signaling Sequence <400> 4 atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60 cca 63 <210> 5 <211> 135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD8 alpha hinge <400> 5 accacaaccc ctgcaccacg cccccctaca ccagcaccta ccatcgcaag ccagcctctg 60 tccctgcggc cagaggcatg tagaccagca gcaggaggag cagtgcacac aagaggcctg 120 gacttcgcct gcgat 135 <210> 6 <211> 1722 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD8 beta <220> <221> misc_feature <222> (674)..(773) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (859)..(958) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 atctaggtct tgctgcaccc gcacaaccta caaacagcgt cggggccttc tctgcacctc 60 cagttcccag ctcacctccc tcagtgtcac agccggttac ctttccttcc tccctggggg 120 agggcaagac ttggggcttg ctgactccag gcccagccca gcccggggca cccaggagcc 180 cctcaattgc tactcaaaca gacaagaagc ggcccgagtt agtggccagc tccaccatgc 240 actacacatc ctgacctctc tgagcctcta ctgtcactcg gggtcacaac cctttcctga 300 gcacctcccg gggcaggggg cgatgacaca catgcagctg cctgggggag gccggcggtg 360 tcccctcctt tctggaacgc ggagggtcct ggtgggctct ggaaacgcag cccagacctt 420 tgcaatgcta ggaggatgag ggcggagacc tcgcggtccc caacaccaga ctcccgcagc 480 caccgcgccc ggtcccgccc tccccactgc ccccccagct ccccgaccca ggcgccccgc 540 ccggccagct cctcacccac cccagccgcg actgtctccg ccgagccccc ggggccaggt 600 gtcccgggcg cgccacgatg cggccgcggc tgtggctcct cctggccgcg cagctgacag 660 gtaaggcggc ggcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttgcttt 780 cctcttccag gccggcggag gagagcccgg cttcgtttca tgaaacagta agtgtataac 840 ctgggtgtgg 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agtcccaggt taaagataac aaacgggtcc tg 1722 <210> 7 <211> 2415 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD16 alpha <400> 7 attcttggtg ctgggtggat ccaaatccag gagatggggc aagcatcctg ggatggctga 60 gggcacactc tggcagattc tgtgtgtgtc ctcagatgct cagccacaga cctttgaggg 120 agtaaagggg gcagacccac ccaccttgcc tccaggctct ttccttcctg gtcctgttct 180 atggtggggc tcccttgcca gacttcagac tgagaagtca gatgaagttt caagaaaagg 240 aaattggtgg gtgacagaga tgggtggagg ggctggggaa aggctgttta cttcctcctg 300 tctagtcggt ttggtccctt tagggctccg gatatctttg gtgacttgtc cactccagtg 360 tggcatcatg tggcagctgc tcctcccaac tgctctgcta cttctagttt cagctggcat 420 gcggactgaa gatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt acagggtgct 480 cgagaaggac agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg acaattccac 540 acagtggttt cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact tcattgacgc 600 tgccacagtc gacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca ccctcagtga 660 cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc ggtgggtgtt 720 caaggaggaa gaccctattc 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tcagtgggac caatgaaagc atggctgaga 1620 aatagcaggt agtccaggat agtctaaggg aggtgttccc atctgagccc agagataagg 1680 gtgtcttcct agaacattag ccgtagtgga attaacagga aatcatgagg gtgacgtaga 1740 attgagtctt ccaggggact ctatcagaac tggaccatct ccaagtatat aacgatgagt 1800 cctcttaatg ctaggagtag aaaatggtcc taggaagggg actgaggatt gcggtggggg 1860 gtggggtgga aaagaaagta cagaacaaac cctgtgtcac tgtcccaagt tgctaagtga 1920 acagaactat ctcagcatca gaatgagaaa gcctgagaag aaagaaccaa ccacaagcac 1980 acaggaagga aagcgcagga ggtgaaaatg ctttcttggc cagggtagta agaattagag 2040 gttaatgcag ggactgtaaa accacctttt ctgcttcaat atctaattcc tgtgtagctt 2100 tgttcattgc atttattaaa caaatgttgt ataaccaata ctaaatgtac tactgagctt 2160 cgctgagtta agttatgaaa ctttcaaatc cttcatcatg tcagttccaa tgaggtgggg 2220 atggagaaga caattgttgc ttatgaaaga aagctttagc tgtctctgtt ttgtaagctt 2280 taagcgcaac atttcttggt tccaataaag cattttacaa gatcttgcat gctactctta 2340 gatagaagat gggaaaacca tggtaataaa atatgaatga taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaa 2415 <210> 8 <211> 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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncact gagagctgag ctcccgggcc 660 tggggtgtct ctgtgtcttt caggctggct gttgctccag gcccctcggt gggtgttcaa 720 ggaggaagac cctattcacc tgaggtgtca cagctggaag aacactgctc tgcataaggt 780 cacatattta cagaatggca aagacaggaa gtattttcat cataattctg acttccacat 840 tccaaaagcc acactcaaag atagcggctc ctacttctgc agggggcttg ttgggagtaa 900 aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat gtgccaccct 960 ggaatgcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnttt ttcatctctc 1080 cacttctcct aataggtttg gcagtgtcaa ccatctcatc attctctcca cctgggtacc 1140 aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct 1200 ctgtgaagac aaacatttga agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa cttaaatgga 1260 gaaaggaccc tcaagacaaa tgacccccat cccatgggag taataagagc agtggcagca 1320 gcatctctga acatttctct ggatttgcaa ccccatcatc ctcaggcctc tctacaagca 1380 gcaggaaaca tagaactcag agccagatcc tttatccaac tctcgatttt tccttggtct 1440 ccagtggaag ggaaaagccc atgatcttca agcagggaag ccccagtgag tagctgcatt 1500 cctagaaatt gaagtttcag agctacacaa acactttttc tgtcccaacc attccctcac 1560 agtaaaacaa caatacaggc tagggatggt aatcctttaa acatacaaaa attgctcgta 1620 ttataaatta cccagtttag accggaaaaa agaaaataat tattcctaaa caaatggata 1680 agtagaatta atgattgagg caggacccta cagagtgtgg gaactgctgg ggatctagag 1740 aattcagtgg gaccaatgaa agcatggctg agaaatagca gggtagtcca ggagagtcta 1800 agggaggtgt tcccatctga gcccagagat aagggtgtct tcctagaaca ttagccgtag 1860 tggaattaac aggaaatcat gagggtgacg tagaattgag tcttccaggg gactctatca 1920 gaactggacc atttccaagt atataacgat gagccctcta atgctaggag tagcaaatgg 1980 tcctaggaag gggactgagg attggggtgg gggtggggtg gaaaagaaag tacagaacaa 2040 accctgtgtc actgtcccaa gttaagctaa gtgaacagaa ctatctcagc atcagaatga 2100 gaaagcctga gaagaaagaa ccaaccacaa gcacacagga aggaaagcgc aggaggtgaa 2160 aatgctttct tggccagggt agtaagaatt agaggttaat gcagggactg taaaaccacc 2220 ttttctgctt caatgtctag ttcctgtata gctttgttca ttgcatttat taaacaaatg 2280 ttgtataacc aatactaaat gtactactga gcttcactga gttacgctgt gaaactttca 2340 aatccttctt catgtcagtt ccaatgaggt ggggatggag aagacaattg ttgcttatga 2400 aaaaaagctt tagctgtctc tgttttgtaa gctttcagtg caacatttct tggttccaat 2460 aaagcatttt aca 2473 <210> 9 <211> 370 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> 2B4 <400> 9 Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val 1 5 10 15 Tyr Gln Gly Lys Gly Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Val Pro Leu Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val 35 40 45 Asp Ser Ile Ala Trp Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His 50 55 60 His Ile Leu Lys Trp Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Phe Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile 100 105 110 Ser Gly Lys Val Gln Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser 115 120 125 Leu Leu Pro Asp Lys Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys 130 135 140 Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys 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ctcaacacac agaggccgta ttacaaatga gcccgaatca tgacagtcag caacatgata 420 cctggatcca gccattcctg aagcccaccc tgcacctcat tccaactcct accgcgatac 480 agacccacag agtgccatcc ctgagagacc agaccgctcc ccaatactct cctaaaataa 540 acatgaagca caaaaacaaa aaaaaaaaaa aaaaa 575 <210> 12 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> 4-1BB <400> 12 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> CD3-zeta <400> 13 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 14 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taatgggaat 300 gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360 ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420 ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480 gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggtatca 600 ccctttactg ctaa 614 <210> 17 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Membrane-bound IL15 <400> 17 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr 35 40 45 Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile 65 70 75 80 His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu 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gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600 gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660 atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720 atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780 gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840 cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900 gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960 cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1020 attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080 agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1140 <210> 19 <211> 379 <212> PRT <213> Homo 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420 ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgggt 480 ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt ggcggcggat ctgtgagctt ttgtctggtc 540 atggtgctgc tgttcgccgt ggataccggc ctgtactttt ccgtgaagac aaatatcagg 600 tctagcaccc gcgactggaa ggatcacaag tttaagtggc ggaaggaccc tcaggataag 660 aagcggggca gaaagaagct gctgtatatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 720 acaacccagg aggaagacgg ctgctcatgt agatttcctg aagaagaaga agggggctgt 780 gaactgtaa 789 <210> 45 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> NK15_3 <400> 45 gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60 gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120 ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180 aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240 tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300 gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360 ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc 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1232 <210> 65 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence Variant 16 <400> 65 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 165 170 175 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 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gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720 tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780 ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840 ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900 tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 960 atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 1020 gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 1080 acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1140 aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1200 gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1260 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1320 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1380 gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1440 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1500 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1560 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1587 <210> 67 <211> 529 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence Variant 17 <400> 67 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asn Gln Glu 165 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tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300 cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360 atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420 gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480 gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540 gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600 gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660 gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 720 aagtggcgga aggaccctca ggataagaag cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc 780 aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga 840 tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa ctgtaa 876 <210> 71 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence Variant 18 (NK39) <400> 71 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys 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tatgttacaa aaataactgc 600 taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa 660 aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720 tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780 ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840 ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900 tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct gctcccagac cccctacacc tgcccctaca 960 atcgccagcc agcccctgag cctgagacct gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct 1020 gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc gaccccaaac tctgctacct gctggatgga 1080 atcctcttca tctatggtgt cattctcact gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct 1140 agcacccgcg actggaagga tcacaagttt aagtggcgga aggaccctca ggataagaag 1200 cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca 1260 acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa 1320 ctg 1323 <210> 73 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NK39_1 <400> 73 Met 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tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 720 aagtggcgga aggaccctca ggataagaag cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc 780 aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga 840 tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc 900 agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc 960 aagaagagga gcagcgccca gaccagccag ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg 1020 cactggtaca ag 1032 <210> 75 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NK39_2 <400> 75 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr 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taaaaactgg tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa 660 aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720 tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780 ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840 ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900 tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct gctcccagac cccctacacc tgcccctaca 960 atcgccagcc agcccctgag cctgagacct gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct 1020 gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc gaccccaaac tctgctacct gctggatgga 1080 atcctcttca tctatggtgt cattctcact gccttgttcc tgctttactg caagcggggc 1140 agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag 1200 gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct gaagaagaag aagggggctg tgaactgggc 1260 ggaggaggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcatgcagga tgaggacggc 1320 tacatgaccc tgaacgtgca gagcaagaag aggagcagcg cccagaccag ccagctgacc 1380 ttcaaggact acagcgtgac cctgcactgg tacaag 1416 <210> 77 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> 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atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540 gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600 gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660 gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720 cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780 gaagaagaag aagggggctg tgaactg 807 <210> 79 <211> 269 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NK39_4 <400> 79 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro 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cactggttat caccctttac 1140 tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1200 caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1260 tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1320 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1380 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1440 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1500 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1560 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1605 <210> 89 <211> 535 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NK39_9 <400> 89 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met 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gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600 gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660 atcacccttt actgccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 720 ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 780 aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122 <210> 91 <211> 341 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NKG2D-OX40-CD3z <400> 91 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp 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ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600 gatttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 660 gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 720 atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 780 ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 840 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 900 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 960 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1020 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1080 ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1140 cgc 1143 <210> 93 <211> 381 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NKG2D-CD28 - 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240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480 ggtcccccat gcccatcatg cccaatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 540 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 600 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 660 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 720 agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 780 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 840 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 900 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 960 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1020 caggccctgc cccctcgc 1038 <210> 97 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NKG2D(short hinge) - 41BB - CD3z <400> 97 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 165 170 175 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 180 185 190 Lys Arg Gly Arg 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tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480 ggtcccccat gcccatcatg cccattttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 540 tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 600 aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 660 cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 720 agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 780 aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 840 atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 900 gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 960 gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1020 cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1044 <210> 99 <211> 348 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NKG2D (SH)-CD28 - CD3z <400> 99 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 165 170 175 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 180 185 190 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 195 200 205 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 210 215 220 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe 225 230 235 240 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 245 250 255 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 260 265 270 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 275 280 285 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 290 295 300 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 305 310 315 320 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 325 330 335 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 340 345 <210> 100 <211> 1023 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA Sequence NKG2D (SH) - OX40 - CD3z <400> 100 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120 aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480 ggtcccccat gcccatcatg cccaatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 540 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgga gggaccagag gctgcccccc 600 gatgcccaca agccccctgg gggaggcagt ttccggaccc ccatccaaga ggagcaggcc 660 gacgcccact ccaccctggc caagatcaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 720 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 780 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 840 aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 900 agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 960 ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1020 cgc 1023 <210> 101 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Seqeunce NKG2D (SH) - OX40 - CD3z <400> 101 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 165 170 175 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 180 185 190 Phe Trp Val Arg Ser Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 195 200 205 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 210 215 220 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg 225 230 235 240 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 245 250 255 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 260 265 270 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 275 280 285 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 290 295 300 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 305 310 315 320 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 325 330 335 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 340 345 <210> 102 <211> 1125 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA Sequence NKG2D-CD3TM -CD28 - CD3z <400> 102 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120 aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600 gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660 gccttgttcc tgaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 720 cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 780 tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 840 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 900 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 960 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1020 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1080 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1125 <210> 103 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence NKG2D-CD3TM -CD28 - CD3z <400> 103 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 165 170 175 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 180 185 190 Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu 195 200 205 Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu 210 215 220 Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg 225 230 235 240 Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg 245 250 255 Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 260 265 270 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 275 280 285 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 290 295 300 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 305 310 315 320 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 325 330 335 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 340 345 350 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 355 360 365 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 370 375 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA Sequence IgG 4 hinge <400> 104 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgccca 36 <210> 105 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence CD28 Transmembrane domain <400> 105 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser 20 25 <210> 106 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence CD28 IC domain <400> 106 Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg 1 5 10 15 Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg 20 25 30 Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 <210> 107 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Amino Acid Sequence OX40 IC Domain <400> 107 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 20 25 30 Thr Leu Ala Lys Ile 35 <210> 108 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> NKG2D-P-frag/CD8a/4-1BB/CD3z <400> 108 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120 aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180 tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240 gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300 ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360 ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420 gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600 gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660 atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720 atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780 gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840 cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900 gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960 cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1020 attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1080 agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1140 <210> 109 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> NKG2D-V2-OX40-CD3z <400> 109 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr 20 25 30 Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn 35 40 45 Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln 50 55 60 Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly 85 90 95 Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser 100 105 110 Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp 115 120 125 Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser 130 135 140 Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro 145 150 155 160 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 165 170 175 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 180 185 190 Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu 195 200 205 Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 210 215 220 Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His 245 250 255 Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 260 265 270 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 275 280 285 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 290 295 300 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 305 310 315 320 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 325 330 335 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 340 345 350 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 355 360 365 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 370

Claims (132)

  1. (a) 세포외 수용체 도메인, 및
    (b) 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하는, 세포에 의해 발현되는 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며,
    NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 OX-40 도메인 및 CD3제타를 포함하며,
    CD3제타는 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    폴리뉴클레오티드는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 추가로 인코딩하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, CD8a 힌지 영역이 SEQ ID NO: 5에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, mbIL15가 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, mbIL15가 키메라 수용체와 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 비시스트론적으로(bicistronically) 발현되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, mbIL15가 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, OX-40 도메인이 SEQ ID NO. 107의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 16의 mbIL15를 인코딩하는 핵산 서열에 커플링된 SEQ ID NO: 90의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO: 100의 핵산 서열에 의해 인코딩되거나; 또는 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 여기서 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 면역 세포.
  12. (a) 세포외 수용체 도메인, 및
    (b) 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하는 키메라 수용체로서,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 NKG2D의 단편이며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    이펙터 도메인은 OX-40 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 CD3제타를 포함하는 것인,
    키메라 수용체.
  13. 제12항에 있어서, OX-40 도메인이 SEQ ID NO. 107의 아미노산 서열을 포함하며, CD3제타 도메인이 SEQ ID NO: 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 키메라 수용체.
  14. 제12항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 109의 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 수용체.
  15. 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 리간드를 표적화하는 키메라 수용체를 발현하는 단리된 면역 세포로서, 키메라 수용체는
    NKG2D 수용체의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인, 및
    막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 OX-40 도메인 및 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 CD3제타를 포함하며,
    세포는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하는 것인,
    단리된 면역 세포.
  16. 제15항에 있어서, CD8a 힌지 영역이 SEQ ID NO: 5에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  17. 제15항에 있어서, mbIL15가 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  18. 제15항에 있어서, mbIL15가 키메라 수용체와 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 비시스트론적으로(bicistronically) 발현되는 것인 단리된 면역 세포.
  19. 제15항에 있어서, mbIL15가 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  20. 제15항에 있어서, OX-40 도메인이 SEQ ID NO. 107의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 16의 mbIL15를 인코딩하는 핵산 서열에 커플링된 SEQ ID NO. 90의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 것인 단리된 면역 세포.
  22. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO. 109의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  23. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO. 100의 핵산 서열에 의해 인코딩되거나, 또는 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 17의 아미노산 서열을 포함하는 mbIL15에 커플링된 SEQ ID NO. 101의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 면역 세포.
  24. 제15항에 있어서, 자연 살해(NK) 세포인 단리된 면역 세포.
  25. 제15항에 있어서, T 세포인 단리된 면역 세포.
  26. 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 리간드를 표적화하는 키메라 수용체를 발현하는 단리된 면역 세포로서, 키메라 수용체는
    SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 NKG2D 수용체의 단편을 포함하는 세포외 수용체 도메인; 및
    막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 SEQ ID NO. 107의 아미노산 서열을 포함하는 OX-40 도메인 및 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 CD3제타를 포함하며,
    세포는 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 발현하는 것인,
    단리된 면역 세포.
  27. 암의 치료를 위해 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 집단을 생성하는 시험관 내 방법으로서, 방법은
    키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 면역 세포의 집단에 전달하는 단계, 및
    이에 의해 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 집단을 생성하는 단계
    를 포함하며, 키메라 수용체는
    세포외 수용체 도메인, 및
    막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며,
    NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 OX-40 도메인 및 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 CD3제타를 포함하는 것인,
    시험관 내 방법.
  28. 제27항에 있어서, 벡터가 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것이거나, 또는 mbIL15를 인코딩하는 추가의 벡터를 면역 세포의 집단에 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 시험관 내 방법.
  29. 제28항에 있어서, mbIL15가 SEQ ID NO. 16에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 시험관 내 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 90의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 것인 시험관 내 방법.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO. 109의 아미노산 서열을 포함하는 것인 시험관 내 방법.
  32. 제31항에 있어서, 면역 세포의 집단이 자연 살해 세포를 포함하며, 자연 살해 세포가 암을 갖는 대상체에 대하여 동종이계인 시험관 내 방법.
  33. 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 암의 치료를 위한 약제로서, 키메라 수용체는
    (a) 세포외 수용체 도메인, 및
    (b) 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며,
    NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 OX-40 도메인 및 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 CD3제타를 포함하는 것인,
    약제.
  34. 키메라 수용체를 포함하는, 암의 치료를 위한 약제로서, 키메라 수용체는
    세포외 수용체 도메인, 및
    막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며,
    NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    막횡단 영역은 CD8a 힌지 및 CD8a 막횡단 도메인을 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 OX-40 도메인 및 SEQ ID NO. 13에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 CD3제타를 포함하는 것인,
    약제.
  35. 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포의 집단을 포함하는, 암의 치료를 위한 약제로서, 키메라 수용체는
    세포외 수용체 도메인, 및
    막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 이펙터 도메인
    을 포함하며,
    여기서 상기 세포외 수용체 도메인은 자연 살해 그룹 2 구성원 D(NKG2D)의 고유 리간드에 결합하는 펩티드를 포함하며,
    NKG2D의 고유 리간드에 결합하는 펩티드는 NKG2D의 단편이며,
    NKG2D의 단편은 SEQ ID NO. 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하며,
    세포내 신호전달 도메인은 CD3제타 하위도메인 및 OX-40 하위도메인을 포함하는 것인,
    약제.
  36. 제33항 또는 제35항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 막-결합된 인터류킨 15(mbIL15)를 추가로 인코딩하거나, 또는 면역 세포가 mbIL15를 발현하며, mbIL15가 SEQ ID NO: 16에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 약제.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 수용체가 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제.
  38. 제37항에 있어서, 암이 백혈병인 약제.
  39. 제37항에 있어서, 암이 급성 골수성 백혈병인 약제.
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