JP6971319B2 - キメラ抗原受容体及びそれを発現するナチュラルキラー細胞 - Google Patents
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Description
28.前記項目27において、前記細胞外ドメインがFc受容体である場合、有効成分として抗体をさらに含む、腫瘍治療用の薬学組成物。
本発明に係るキメラ抗原受容体は、標的となるがんの種類によって、様々ながん標的抗体と共に使用することができる。
本発明のキメラ抗原受容体は、OX40リガンド(CD252)の全部または一部を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
また、本発明は、前述の免疫細胞を対象体に投与するステップを含む、腫瘍の治療方法を提供する。
細胞株
ヒトB−系細胞株Ramos、ヒト赤白血(erythroleukemic)細胞株K562、ヒト乳がん細胞株MCF−7、ヒト肺がん細胞株H1299とH1944細胞株およびNK−92MIは、ATCC(American Type Culture Collection、Manassas、VA、USA)から供給されたものを使用した。K562は、10%FBSを含むRPMI−1640(Gibco、Grand Island、NY、USA)で維持された。Ramosは、10%FBS(fetal bovine serum;Gibco、Grand Island、NY、USA)を含むRPMI−1640(ATCC)(Manassas、VA)で維持(maintain)された。MCF−7は、EMEM(ATCC)+ 10%FBS(Gibco)培地で維持され、H1299、H1944細胞株は、RPMI−1640(ATCC)+10%FBS(Gibco)で維持された。NK−92MIおよび形質転換されたNK−92MI細胞は、1%ヒト血漿を含むCellGro(登録商標)無血清培地で維持された。ヒト胚腎臓繊維芽細胞(Human embryonic kidney fibroblast)である293T細胞株は、ATCCから供給されたものを使用し、10%FBS(Gibco、Grand Island、NY、USA)を含むDMEM(Gibco、Grand Island、NY、USA)で維持された。
FCRG3A V158変異(CD16V)のシグナル配列(signal sequence)および細胞外ドメイン(extracellular domain);NKG2D細胞外ドメイン(extracellular domain);CD8αのシグナル配列、CD8αのヒンジ(hinge)および膜貫通ドメイン(transmembrane domain);CD28のヒンジ(hinge)および膜貫通ドメイン;4−1BB、OX40、OX40リガンド(OX40L)およびCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signaling domain)は、それぞれ人工的に合成された。これらはSOE−PCR(splicing by overlapping extension by PCR)を用いて、様々な組み合わせで組み立て(assemble)られた。PCR結果物は、直接配列分析(direct sequencing)により確認された。PCR結果物は、Nhe1およびEcoRIに切断された後、第3世代自己−不活性化レンチウイルス発現ベクター(third generation self−inactivating lentiviral expression vector)であるMSCV−EF1α−GFPベクターまたはEF1a−MCSベクターのNhe1およびEcoRIサイトに挿入(ligation)された。
VSVG−類似型(pseudotyped)レンチウイルスを製造するために、DMEM培地で培養された293T細胞が、様々なタイプのPCDH1−MSCV−CD16−construct−EF1−copGFPベクター、EF1a−NKG2D−constructベクター又はPCDH1−MSCV−EF1−copGFP対照群ベクター、またはEF1a−GFP対照群ベクター(空ベクターを用いたMock感染ウイルス製作用);とHIV−ベースのpPACKH1レンチウイルスパッケージキット(System Biosciences)で共に共形質感染され、そのために、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用した。様々なタイプのCD16Vコンストラクトは、次の通りである;CD16V−Z CAR、CD16V−BBZ CAR、CD16V−OX40Z CAR、CD16V−OX40LZ CAR、CD16V−ZOX40L、CD16V−28Z CAR、CD16V−28(H)Z CAR、CD16V−BBOX40Z CAR、CD16V−BBOX40LZ CAR、CD16V−OX40BBZ CAR、CD16V−28BBZ CAR、CD16V−28OX40Z CAR、CD16V−28OX40LZ CAR、CD16V−28(H)BBZ CAR、CD16V−28(H)OX40Z CAR、CD16V−28(H)OX40LZ CAR。様々なタイプのNKG2Dコンストラクトは、次の通りである;NKG2D−Z CAR、NKG2D−BBZ CAR、NKG2D−OX40Z CAR、NKG2D−ZOX40L CAR、NKG2D−28Z CAR、NKG2D−28(H)Z CAR、NKG2D−BBOX40Z CAR、NKG2D−BBOX40LZ CAR、NKG2D−OX40BBZ CAR、NKG2D−28BBZ CAR、NKG2D−28OX40Z CAR、NKG2D−28OX40LZ CAR、NKG2D−28(H)BBZ CAR、NKG2D−28(H)OX40Z CAR、NKG2D−28(H)OX40LZ CAR、NKG2D−AAA−28(H)OX40LZ。レンチウイルスは、フラスコに80%程度密集したHEK293T細胞に、様々なタイプのCD16Vコンストラクト発現ベクター、NKG2Dコンストラクト発現ベクター又は対照群プラスミド;をpPACKH1レンチウイルスパッケージングプラスミドと共に形質感染させることによって製造された。6時間後、培地は10%FBSを含むDMEM培地に入れ替えた。レンチウイルスを含むconditioned mediumは、形質感染後の48時間後に採集し、細胞片(cell debris)を除去するために、0.45μmのフィルターユニット(Milliopore、Billerica、MA、USA)を用いてフィルタリングされた。ウイルスを含む上清液(viral supernatant)は、Amicon Filter(Millipore)を用いて3000rpm及び4℃で20分間遠心分離することにより、約50倍濃縮された。濃縮されたウイルスは、−80℃で保管された。
CD16V CAR−形質導入されたNK92MI細胞、NKG2D CAR−形質導入されたNK92MI細胞、対照群ベクター−形質導入されたNK92MI(NK92MI−Mock)、またはNK92MI母細胞は、FACS緩衝液を用いて2回洗浄した。細胞は、7−AAD(Beckman coulter)、抗−CD3、抗−CD56および抗−CD16(BD Biosciences)mAbsを用いて染色した。染色された細胞の発現率および平均蛍光強度(mean fluorescence intensity、MFI)は、BD LSRFortessaを用いて測定した。
標的細胞は、30μMカルセインアセトキシメチルエステル(Calcein−acetoxymethyl ester、Calcein−AM;Molecular probes)を用いて、37℃で1時間標識(label)された。洗浄後、標識された標的細胞は、96−ウェルプレートに1x104cells per wellで分配された。NK92MI細胞は、収穫(harvest)され、洗浄された後、様々なE/T(effector−to−target)比および様々な濃度のリツキシマブ(rituximab)を含むか又は含まない条件にて添加された。対照群としては、リツキシマブと無関係な抗−ヒト抗体(Sigma aldrich)が使用された。2時間後、プレートは2000rpmで3分間遠心分離され、100μLの上清液が採取され、蛍光マイクロプレートリーダー(Victor3、PerkinElmer)により励起波長485nmおよび発光波長535nmでのカルセイン放出を測定した。具体的なカルセイン放出量は、次の式より計算した:percent specific lysis =(test release-spontaneous release)×100/(maximal release-spontaneous release)。Maximal lysisには、1%Triton X−100を使用した。
共同刺激モチーフと連結されたCD16Vを含むキメラ抗原受容体の形質導入及び発現
FCRG3A(CD16)のV158変異体(polymorphism)は、高親和度の免疫グロブリン(immunoglobulin)Fc受容体であり、抗体治療に良い効果を出すものと考えられている。本発明者らは、FCRG3A(CD16)のV158変異体(variant)を製造し、CD8αのヒンジおよび膜貫通ドメイン;T細胞刺激分子であるCD3ζ;及び、CD28、4−1BB、OX−40、およびOX−40リガンドを含む様々な共同刺激分子(costimulatory molecules)の細胞内ドメインを様々な組み合わせで結合(combine)した(表1)。このようにして製造されたCD16Vを含むキメラ抗原受容体(CD16V−Z CAR(第1世代)、CD16V−28Z CAR(第2世代)、CD16V−BBZ CAR(第2世代)、CD16V−OX40Z CAR(第2世代)、またはCD16V−28OX40LZ CAR(第3世代))は、MSCVプロモーターを含むレンチウイルスベクターを使用してNK92MI細胞で発現された。各々のCARがNK92MI細胞の表面で発現されるかどうかは、単クローンマウス抗−ヒト抗体を使用してヒトCD16を検出することにより確認された。流細胞分析を用いた反復実験によって、NK92MI細胞でCARが90%以上の効率で形質導入されたことが確認された(図1A)。このとき使用したレンチウイルスベクターの量は、感染倍数(MOI、multiple of infection)50以上を使用した。
本発明に係る遺伝的変形(genetic modification)が、がん細胞死滅の増加を誘導するかどうかを確認するために、空ベクターのみで形質導入されたNK92MI細胞およびCD16Vを含む受容体を発現するNK92MI細胞のCD20−陽性リンパ腫細胞(Ramos細胞)に対する細胞毒性をCalcein−AM放出アッセイを用いて評価した。
CD137(41BB)シグナル伝達ドメインを基盤とするCARにOX40リガンドを導入し、NK92MI細胞での発現および細胞毒性を評価した。CD16V−BBZ CAR(第2世代)とCD16V−BBOX40LZ CAR(第3世代)の両方ともNK92MI細胞で高いレベルで発現された(図2A)。イン・ビトロ細胞殺害能試験において、リツキシマブが存在しないときは、CD16V−Z、CD16V−BBZ、CD16V−BBOX40LZのすべてがRamos細胞に対して低い殺害能を示したが、リツキシマブが存在するときは、すべての作用細胞:標的細胞比においてOX40リガンドが組み合わされたCD16V−BBOX40LZが最も強い細胞殺害能を示した(図2B)。
次に、本発明者らは、CD16V−28OX40LZ CARを発現するNK92MI細胞と、これとは異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有する第3世代CARを発現するNK92MI細胞の細胞毒性を比較した。本実験に使用された第3世代CAR(CD16V−28OX40LZ CAR、CD16V−28OX40Z CAR、CD16V−28BBZ CAR)は、いれずもNK92MI細胞で高いレベルで発現されることを確認した(図3A)。
CAR発現ナチュラルキラー細胞ががん細胞抗原を最適化された状態と認識するためには、がん細胞抗原認識受容体その自体のみならず、抗原特異的受容体と細胞膜の間のヒンジの配列及び構成(hinge sequence and composition)もまた重要である。ヒンジの配列及び構成は、ターゲット分子によって異なるように設計する必要があり得る。
共同刺激モチーフと連結されたNKG2Dを含むキメラ抗原受容体の形質導入及び発現
本発明者らは、ヒトNKG2D遺伝子を合成し、それをCD8αのヒンジおよび膜横断ドメイン、T細胞刺激分子CD3ζ、およびTまたはNK細胞の活性を大幅に強化するCD28、4−1BB、OX−40およびOX−40リガンドを含む補助刺激分子の細胞内ドメインの様々な組み合わせと結合した(表3)。このNKG2D CARコンストラクトは、レンチウイルスベクターを使用してNK92MI細胞で発現された。本発明者らは、単クローンマウス抗ヒト抗体を使用して、ヒトNKG2Dの検出によりNK92M細胞での各NKG2D CARの表面発現を確認した。流細胞分析を用いた反復実験によって、NK92MI細胞においてCARが70%以上の効率で形質導入されたことが確認された。
遺伝子組み換えによる殺傷活性の変化有無を調べるために、NKG2D CARを発現するNK−92MI細胞のMCF7乳がん細胞に対する細胞毒性をCalcein−AM放出分析法により比較した。
第3世代CARは、抗腫瘍活性を増加させることが知られている。生理学的なT細胞反応において、最適のリンパ球活性化は、CD28のような共同刺激分子と結合した一つ以上の補助刺激受容体を必要とする。補助刺激受容体の中で最も重要なのが、腫瘍壊死因子(TNFR)の一員であるCD137(4−1BB)およびOX40(CD134)である。
CD252(OX−40リガンド)補助刺激の影響を評価するために、NKG2D−28Z CAR(第2世代)の骨格にOX−40リガンドのシグナル伝達領域を融合させてNKG2D−28(H)OX40LZ CAR(第3世代)を構築した。腫瘍細胞死滅の分析において、MCF7細胞に対するNKG2D−28(H)OX40LZ CAR(第3世代)によって誘導された特異的な細胞毒性は、NKG2D−Z CAR(第1世代)に比べて大幅に強化されたが、NKG2D−28Z CAR(第2世代)と類似していた(図7B)。
NKG2D−AAA−28(H)OX40LZ CAR(第3世代)で形質導入されたNK92MI細胞が肺がん細胞でNKG2Dリガンドを認識できるかどうかを評価するために、NKG2Dリガンド陽性腫瘍細胞(H1299およびH1944)をNKG2D−AAA−28(H)OX40L CAR(第3世代)が含まれたNK92MI細胞のターゲットとして使用した。形質導入されたNK92MI細胞は、NKG2D−Z CAR(第1世代)またはNKG2D−AAA−28(H)OX40L CAR(第3世代)を効率的に発現した(図8A)。次に、H1299及びH1944細胞でのNKG2Dリガンド発現を評価した。本発明者らは、NKG2Dリガンドの発現が流動細胞計測法によってH1299及びH1944細胞で検出されたことを確認した(図8B)。図8Cに示すように、NKG2D−AAA−28(H)OX40L CAR(第3世代)を含むNK92MI細胞は、対照群NK92MI細胞およびNKG2D−Z CAR(第1世代)発現NK92MI細胞よりもインビトロでNKG2Dリガンドを発現する標的細胞をより効率的に死滅させることができた。ターゲット細胞死滅特異性は、コントロールとして空ベクターで形質導入され、NKG2Dを発現しないNK92MI細胞がH1299およびH1944細胞を死滅させないことから明確に確認できた。
Claims (20)
- 細胞膜から細胞内の方向に順に位置する2つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン(intracellular signaling domain)を含むキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor)であって、前記2つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインのうちの細胞内側の細胞内シグナル伝達ドメインがOX40リガンド(CD252)を含むドメインである、キメラ抗原受容体。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインに連結された膜貫通ドメイン(transmembrane domain)と、
前記膜貫通ドメインに連結されたスペーサードメイン(spacer domain)と、
前記スペーサードメインに連結された細胞外ドメイン(extracellular domain)と、
をさらに含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor)。 - 前記細胞外ドメインに連結されたシグナル配列(signal sequence)をさらに含む、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記シグナル配列は、CD16またはCD8αを含むものである、請求項3に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞外ドメインは、抗体の抗原結合断片、Fc受容体、ナチュラルキラー受容体(Natural cytotoxicity receptor)、NKG2D、2B4およびDNAM−1からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記抗原結合断片は、Fab断片、F(ab’)断片、F(ab’)2断片またはFv断片である、請求項5に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記Fv断片は、一本鎖抗体切片(single−chain variable fragment、ScFv)である、請求項6に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記Fc受容体は、CD16、CD32、CD64、CD23、CD89、及びそれらの変異体からなる群より選択される、請求項5に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記Fc受容体は、CD16またはその変異体である、請求項8に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記ナチュラルキラー受容体(Natural cytotoxicity receptor)は、NKp46、NKp30、NKp44、NKp80およびNKp65受容体からなる群より選択される、請求項5に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記スペーサードメインは、CD8αおよびCD28からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記膜貫通ドメインは、CD8αおよびCD28からなる群より選択されるいずれか一つを含むものである、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3−zetaをさらに含むものである、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記CD3−zetaおよび前記OX40リガンドは、細胞膜から細胞内の方向に順に位置する、請求項13に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞外ドメインとスペーサードメインとの間にAAAリンカーをさらに含む、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞。
- 前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞(NK cell)である、請求項16に記載の免疫細胞。
- 請求項16に記載の免疫細胞を有効成分として含む腫瘍治療用の薬学組成物。
- 前記細胞外ドメインがFc受容体である場合、有効成分として抗体をさらに含む、請求項18に記載の腫瘍治療用の薬学組成物。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列。
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