JP2024513958A - Ｎｋ細胞およびｅｇｆｒ標的抗体を用いた癌治療 - Google Patents

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Abstract

本発明は、特に、ＥＧＦＲ＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。

Description

優先権主張
本出願は、２０２１年１２月１６日付の米国仮出願番号６３／１７２，４２３および２０２１年４月８日付の米国仮出願番号６３／２９０，３６１に対して優先権を主張する。これらの文献は全体内容として援用により本願に取り込まれる。
抗体療法をはじめとする標的療法は癌治療に革新を起こした。抗体療法が細胞毒性を誘発する一つの作用機序は、抗体依存的な細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）によるものである。多くの癌患者が強力なＡＤＣＣ反応を起こさないことがある。ＡＤＣＣ反応の低下は、任意の指定された単クローン抗体治療剤が前記患者への効果を著しく低下させて、前記患者が反応しなかったり、または再発することがある。そのため、ＡＤＣＣ反応の低下は臨床的な結果に否定的な影響を及ぼしかねない。
抗－ＥＧＦＲ抗体の使用は患者が最適な用量で抗体投与を受けられなかったり、または容認できない毒性を誘発することがある。ある場合には、患者が用量を減らしたり、投与を省略または遅らせたり、または治療を完全に中断しなければならないこともある。このように、抗－ＥＧＦＲ抗体の副作用は薬物の効能を低下させることがある。
最近、いくつかの抗癌剤の発見と開発にもかかわらず、ＥＧＦＲ＋癌などの多くの種類の癌の予後不良によって、依然として改善された方法と治療学的物質は要求されている。
本発明は、当該技術分野における上記の問題とその他の問題を解決する。
ＮＫ細胞は、その細胞表面受容体の複合アレイを介してのみならず、抗体依存的な細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍細胞とエンゲージング（ｅｎｇａｇｉｎｇ）できる免疫細胞である。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣを開始するために、自身の表面ＣＤ１６受容体を介して抗体とエンゲージングできる。ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法およびその他の細胞療法に用いられるＴ細胞のような他の免疫細胞より優れているという利点がある。一つの例示的な利点として、ＮＫ細胞は、同種異系療法として用いることができるが、ある供与体に由来するＮＫ細胞をＨＬＡマッチング、遺伝子編集またはその他の遺伝子操作なしに、１人または複数の患者に安全に使用可能である。抗－腫瘍活性を有する同種異系ＮＫ細胞は、重症サイトカイン放出症侯群（ＣＲＳ）および神経毒性または移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）のようなＴ細胞療法に関連する多くの危険性なく、患者への安全な投与が可能である。
同種異系ＮＫ細胞は癌患者に重大な治療オプションを提供することができる。一つの例示的な利点として、ＮＫ細胞は、他の細胞ベースの療法に関連する移植片対宿主疾患、神経毒性またはサイトカイン放出症侯群の発病なく、耐薬性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）に優れている。他の例示的な利点として、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を識別して溶解するのに事前の抗原露出または特異的な抗原の発現を必要としない。他の例示的な利点として、ＮＫ細胞は、先天的な免疫を連結し、多重－クローン性適応免疫反応を起こして長期間の抗癌免疫記憶を構築する固有の能力を有している。このような特徴はすべて癌治療オプションとして潜在的なＮＫ細胞の効果に寄与する。
例えば、ＮＫ細胞は、免疫システムの他の構成要素を動員して活性化することができる。活性化されたＮＫ細胞は、サイトカインおよびケモカイン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；およびシグナルを伝達してＴ細胞を腫瘍に動員するマクロファージ炎症性タンパク質１（ＭＩＰ１）を分泌する。ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞を直接殺すことにより、適応免疫システムによって認知されるように腫瘍抗原を露出する。
これとともに、多様な臍帯血バンクをＮＫ細胞の供給源として用いることにより、臨床活性を強化するのに好ましい特徴（例えば、高親和性ＣＤ１６およびキラー細胞免疫グロブリン－様受容体（ＫＩＲ）Ｂ－ハプロタイプ）を有する臍帯血を選別することができる。
本願に記載されているように、同種異系ＮＫ細胞の投与は、患者のＡＤＣＣ反応を、例えば、単クローン抗体療法を施す間に強化することができる。セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、典型的にＫＲＡＳ突然変異がある腫瘍には効果がほとんどまたは全くない。その理由は、セツキシマブが典型的にＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合して、ＥＧＦＲがそのリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）に結合できないように阻害するからである。これは一連の下流シグナル伝達現象を開始させる、ＥＧＦＲの二量体形成と活性化を阻害する。シグナル伝達経路はＫ－ｒａｓを含むことができる。あいにく、Ｋ－ｒａｓは、エクソン２に活性化突然変異を獲得することができ、これは構成的な活性型ＫＲＡＳシグナル伝達につながる。このような突然変異は、癌がセツキシマブに耐性を有するようにする。そのため、セツキシマブは、ＫＲＡＳ野生型癌を治療するための用途で承認されている。しかし、セツキシマブは、ＡＤＣＣを媒介することができる。一つの例示的な利点として、本願に記載のＮＫ細胞は、作用機序がＡＤＣＣに依存するが、これはＥＧＦＲおよびＫＲＡＳシグナル伝達とは独立している。このように、セツキシマブの単独使用に対して耐性でありうる腫瘍も、依然として本願に記載のＮＫ細胞とセツキシマブとの組み合わせに反応できる。
本発明は、何よりも、ＥＧＦＲ＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。
本発明は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の集団とヒトＥＧＦＲを標的とする抗体を投与する段階を含み、ＮＫ細胞が患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプ（ＫＩＲ－Ｂ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）であり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｆｏｒ ａ ＣＤ１６ １５８Ｖ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である、ＥＧＦＲ＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。
一部の実施形態において、癌は、膠芽腫、肺腺癌腫、非－小細胞性肺癌、低悪性度神経膠腫、結腸直腸腺癌腫、高悪性度神経膠腫、多発性骨髄腫、乳腺癌腫、毛様細胞性星細胞腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、患者は、抗－ＥＧＦＲ抗体を用いた治療後に再発した。一部の実施形態において、患者は、自家幹細胞移植またはキメラ抗原受容体Ｔ－細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた治療後に疾患の進行を経験したことがある。
一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を１×１０８～１×１０１０個投与する。一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を１×１０９～８×１０９個投与する。一部の実施形態において、患者にＮＫ細胞を４×１０８、１×１０９、４×１０９または８×１０９個投与する。
一部の実施形態において、患者に抗体を１００～５００ｍｇ／ｍ２で投与する。一部の実施形態において、抗体は、セツキシマブである。
一部の実施形態において、患者は、治療する前にリンパ球除去化学療法（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）を受ける。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、非－骨髄破壊性化学療法（ｎｏｎ－ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）である。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、シクロホスファミドおよびフルダラビンのうちの１つ以上を用いた治療を含む。一部の実施形態において、リンパ球除去化学療法は、シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた治療を含む。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００－５００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、５００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０－５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される。一部の実施形態において、本方法は、ＩＬ－２の投与を追加的に含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に１×１０６ＩＵ／ｍ２で投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に６，０００，０００ＩＵで投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２の投与は、ＮＫ細胞の投与時点から１－４時間以内に行われる。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＥＧＦＲ標的抗体の投与は、毎週行われる。一部の実施形態において、ＮＫ細胞およびヒトＥＧＦＲ標的抗体は、４－８週間毎週投与する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の投与は、毎週行われ、ヒトＥＧＦＲ標的抗体の投与は、隔週で行われる。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、遺伝子組換えされていない。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の少なくとも７０％がＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の少なくとも８５％がＣＤ５６＋およびＣＤ３－である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞中の１％以下がＣＤ３＋であり、ＮＫ細胞中の１％以下がＣＤ１９＋であり、ＮＫ細胞中の１％以下がＣＤ１４＋である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞の各投与は、ＮＫ細胞１×１０９～５×１０９個の投与である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞を１次投与する前、ＥＧＦＲ標的抗体の用量が患者に投与される。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、増幅された臍帯血ナチュラルキラー細胞である。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＣＤ１６＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫＧ２Ｄ＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４６＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ３０＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＤＮＡＭ－１＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４４＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１４＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ１９＋細胞を含む。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％でＣＤ３８＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞は、同一の臍帯血供与体に由来する。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億個含み、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を得る段階；（ｂ）種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し、これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階を含む方法により生産される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、（ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞を得る段階；（ｂ）種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；（ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を生産する段階；および（ｄ）膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第２の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階を含む方法により生産される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、段階（ｃ）の後に、（ｉ）増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を複数の容器で冷凍する段階；および（ｉｉ）増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液が収容された容器を解凍する段階を追加的に含む方法により生産され、ここで、段階（ｄ）において、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の増幅は、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液を増幅させることを含む。
一部の実施形態において、臍帯血は、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である供与体に由来する。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞の集団は、臍帯血からナチュラルキラー細胞を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増幅させることを含む方法により生産される。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮または分類しない。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＣＤ１６を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ３０を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４４を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＤＮＡＭ－１を発現するＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
他に断らない限り、本発明で使用されたすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野における通常の当業者が共通して理解する意味と同一の意味を有する。本発明で利用するための方法および材料が本願に記載され；当該技術分野で公知の他の適切な方法および材料も利用可能である。材料、方法および例は例示したものに過ぎず、制限するものではない。本願に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよびその他の参考文献は全体として援用により本願に取り込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書を優先する。
下記の詳細な説明および図面から、そして請求項から、本発明の他の特徴および利点が明確になるであろう。
援用による取り込み
本明細書に言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個別刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別的に援用により取り込まれるもので、意図するものと同じ程度に援用により本願に取り込まれる。
本発明の新規な特徴は、添付した請求項に詳細に記載される。特許または出願ファイルには有色で作成された１つ以上の図面が含まれている。有色の図面が含まれている本特許または特許出願公開公報の写本は、要求書と所定の手数料を支払えば特許庁から提供される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が適用された例示的な実施形態が記載された下記の詳細な説明と下記の添付した図面を参照してより良く理解されるであろう。
ＮＫ細胞の増幅および刺激方法に対する例示的な実施形態を示す図である。 前臨床実験において臍帯血－由来ＮＫ細胞（ＣＢ－ＮＫ）が末梢血－由来ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ）に比べて培養増幅力が約１０倍高いことを示す図である。 臍帯血－由来医薬品において腫瘍－エンゲージングＮＫ活性化免疫受容体の発現が末梢血起源と比較してより高くて一定であることを示す図である。 増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団の表現型を示す図である。 臍帯血－由来ＮＫ細胞増幅集団の一例としてＡＢ－１０１医薬品を製造する核心的な段階を示す図である。 ＡＢ－１０１の純度（ｎ＝９）を示す図である。 ＧＭＰ条件で製造したＣＤ３－枯渇細胞、ＭＣＢおよびＤＰの純度を示す図である。 ＧＭＰ条件で製造したＣＤ３－枯渇細胞、ＭＣＢおよびＤＰでのＮＫ細胞受容体の発現を示す図である。 フローサイトメトリー測定によるＮＫ純度（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－）を示す図である。 臍帯血供与体３種に由来する増幅されたＮＫ細胞のＣＤ３８＋発現を示す図である。 臍帯血供与体３種に由来するＣＤ３８＋ＮＫ細胞のＣＤ３８＋の平均蛍光強度を示す図である。 出発物質としてＮＫ細胞供給源での差別的な表面タンパク質発現をＡＢ－１０１細胞と比較して示す図である。 多様な頭頸部扁平細胞癌腫細胞株に対する短期細胞毒性を示す図である（Ｅ：Ｔ比率＝３：１）。 多様な頭頸部扁平細胞癌細胞株に対する短期細胞毒性を示す図である（セツキシマブ１μｇ／ｍｌ、ｎ＝２）。 多様な結腸直腸癌細胞株に対する短期細胞毒性を示す図である。 多様な結腸直腸癌細胞株に対する長期細胞毒性を示す図である。 乳癌細胞株に対する短期細胞毒性を示す図である。 処置した乳癌細胞株の細胞内染色を示す図である。 乳癌細胞株に対する長期細胞毒性を示す図である。
本発明は、特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、増幅および刺激されたＮＫ細胞、ＮＫ細胞の生産方法、ＮＫ細胞を含む薬学的組成物、および例えば、癌を患っている患者をＮＫ細胞を用いて治療する方法を提供する。
Ｉ．ナチュラルキラー細胞の増幅および刺激
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、例えば、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）を用いた培養および刺激によって、増幅および刺激する。
ＮＫ細胞は、例えば、ＵＳ２０２０／０１０８０９６またはＷＯ２０２０／１０１３６１に記載されているように、増幅および刺激可能であり、これら２つの文献とも全体として援用により本明細書に取り込まれる。簡略に、供給源細胞（ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ）は、ＵＳ２０２０／０１０８０９６に記載されているように、４－１ＢＢＬ、膜結合型ＩＬ－２１および突然変異ＴＮＦαを発現するように操作された、組換えられたＨｕＴ－７８（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＴＩＢ－１６１ＴＭ）細胞上で培養することができる。
適切なＮＫ細胞はまた、本願に記載されているように、増幅および刺激可能である。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、（ａ）ＮＫ細胞、例えば、ＮＫ細胞を含む組成物、例えば、ＣＤ３（－）枯渇した細胞を提供する段階；および（ｂ）フィーダー細胞および／または刺激因子を含む培地で培養して、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を生産する段階を含む方法により、増幅および刺激される。
Ａ．ナチュラルキラー細胞供給源
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、末梢血、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄまたはｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、単離されたＮＫ細胞、誘導された万能性幹細胞に由来するＮＫ細胞、胚幹細胞に由来するＮＫ細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、臍帯血単一ユニット（ｓｉｎｇｌｅ ｕｎｉｔ）である。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞（ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌ）を１×１０７または約１×１０７～１×１０９または約１×１０９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０８または約１×１０８～１．５×１０８または約１．５×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を約１×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を１×１０９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、総有核細胞を約１×１０９個含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を約２０％～約８０％含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を２０％または約２０％～８０％または約８０％、約２０％～７０％または約７０％、約２０％～６０％または約６０％、約２０％～５０％または約５０％、約２０％～４０％または約４０％、約２０％～３０％または約３０％、約３０％～８０％または約８０％、約３０％～７０％または約７０％、約３０％～６０％または約６０％、約３０％～５０％または約５０％、約３０％～４０％または約４０％、約４０％～８０％または約８０％、約４０％～７０％または約７０％、約４０％～６０％または約６０％、約４０％～５０％または約５０％、約５０％～８０％または約８０％、約５０％～７０％または約７０％、約５０％～６０％または約６０％、約６０％～８０％または約８０％、約６０％～７０％または約７０％、または約７０％～８０％または約８０％含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＣＤ１６＋細胞を８０％以下含む。代案的に、一部のＮＫ細胞供給源は、ＣＤ１６＋細胞を８０％より高い濃度で含んでもよい。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、ＭＬＧ２Ａ＋細胞を４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下で含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫＧ２Ｃ＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫＧ２Ｄ＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ４６＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ３０＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＤＮＡＭ－１＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＮＫｐ４４＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ２５＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ６２Ｌ＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ６９＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＸＣＲ３＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源、例えば、臍帯血ユニットは、４０％以下、例えば、３０％以下、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下でＣＤ５７＋細胞を含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源中のＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子を含む。例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ：Ｇｅｎｅ－Ｏｒｄｅｒ，Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ１９０：４０－５２（２００２）；およびＰｙｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｇ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｃｕｓ」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５：ｅ１５１１５（２０１０）を参照する。
一部の実施形態において、ＮＫ供給源中のＮＫ細胞は、ＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体（すなわち、ホモ接合性ＣＤ１６ １５Ｖ多形成）を含む。例えば、Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，「ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ,Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｂｌｏｏｄ９０：１１０９－１４（１９９７）を参照する。
一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含む。
一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、遺伝子操作されていない。
一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含まない。
一部の実施形態において、細胞供給源中のＮＫ細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、ＣＤ３（＋）枯渇する。一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞供給源においてＣＤ３（＋）細胞を枯渇処理することを含む。一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源におけるＣＤ３（＋）細胞の枯渇処理は、ＮＫ細胞供給源をＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａ、およびこれらの断片からなる群より選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３またはその抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ビーズ、例えば磁気ビーズに付着する。一部の実施形態において、組成物におけるＣＤ３（＋）細胞の枯渇は、組成物をビーズに付着したＣＤ３標的抗体またはその抗原結合断片と接触させて、ビーズ－結合したＣＤ３（＋）細胞を組成物から除去することを含む。組成物は、免疫磁気選別（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｔ細胞枯渇セット（ＬＳ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｓｅｔ（１６２－０１）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ３を枯渇処理することができる。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、例えば、ＣＤ５６発現に対するゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）によってＣＤ５６＋濃縮される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現細胞を選別することにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３（＋）枯渇が行われる。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞供給源は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現細胞を選別することにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３（＋）枯渇が達成される。
Ｂ．フィーダー細胞
本発明は、ＮＫ細胞を増幅させるためのフィーダー細胞を開示する。これらのフィーダー細胞は、有利には、ＮＫ細胞を本願に記載の薬学的組成物を製造するのに適した個数に増幅可能にする。場合によっては、フィーダー細胞は、ＣＤ１６の発現減少なく、よく他のタイプのフィーダー細胞上で細胞増幅を伴ったり、または他の方法を用いたＮＫ細胞の増幅を許容する。場合によっては、フィーダー細胞は、冷凍／解凍サイクルの後、ＮＫ細胞がより高い比率で生存可能な状態で残っているように、または細胞が凍結中により長期間生存可能な状態で残っているように、増幅されたＮＫ細胞を冷凍により良く耐えられるようにする。場合によっては、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞がＡＤＣＣなどの細胞毒性を高いレベルに維持し、生存を延長し、存続性を高め、ＣＤ１６を高いレベルに強化または維持できるように許容する。場合によっては、フィーダー細胞は、疲労（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）または老化を有意なレベルに誘発することなくＮＫ細胞を増幅できるように許容する。
フィーダー細胞は、ＮＫ細胞を刺激し、この細胞がより速く増幅するように、例えば、基質、成長因子および／またはサイトカインを供給することにより補助するために用いることができる。
ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、エプスタイン・バール・ウイルス－形質転換されたＢ－リンパ芽球細胞（例えば、ＥＢＶ－ＬＣＬ）、骨髄性白血病細胞（例えば、Ｋ５６２）およびＣＤ４（＋）Ｔ細胞（例えば、ＨｕＴ）、およびこれらの派生物を含むが、これらに限定されない、多様なタイプのフィーダー細胞を用いて刺激することができる。
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、例えば、γ－放射線照射またはマイトマイシン－ｃ処理によって不活性化される。
本願に記載の方法での使用に適したフィーダー細胞は、例えば、ＵＳ２０２０／０１０８０９６に記載されており、この文献は全体内容として援用により本明細書に取り込まれる。
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞である。一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、ＨｕＴ－７８細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＴＩＢ－１６１ＴＭ）、またはその変異体または派生物である。一部の実施形態において、ＨｕＴ－７８誘導体は、Ｈ９（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＨＴＢ－１７６ＴＭ）である。
一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、ＯＸ４０Ｌを発現する。一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）、またはその変異体を発現するＨｕＴ－７８細胞、またはその変異体または派生物である。
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作されたＨｕＴ－７８細胞である。
一部の実施形態において、不活性化されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、ＨｕＴ－７８（ＡＴＣＣ（Ｒ） ＴＩＢ－１６１ＴＭ）細胞またはＯＸ４０Ｌのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、またはその変異体を発現する変異体または派生物である。一部の実施形態において、フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬオルソログ、またはその変異体、膜－結合型ＩＬ－２１オルソログ、またはその変異体、および突然変異ＴＮＦαオルソログ、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作されたＨｕＴ－７８細胞である。
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、ＯＸ４０Ｌ（配列番号４）を発現し；４－１ＢＢＬ（配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体または派生物を発現するように操作された、ＨｕＴ－７８細胞である。
一部の実施形態において、フィーダー細胞は、例えば、実施例２に記載されているように、ＮＫ細胞とともに培養する前に、例えば、冷凍原液から増幅する。
Ｃ．刺激因子
ＮＫ細胞はまた、フィーダー細胞に加えて、またはフィーダー細胞の代わりに、フィーダー細胞以外の他の１つ以上の刺激因子、例えば、シグナル伝達因子を用いて刺激することができる。
一部の実施形態において、刺激因子、例えば、シグナル伝達因子は、本願に記載されているように、培養培地の構成成分である。一部の実施形態において、刺激因子、例えば、シグナル伝達因子は、本願に記載されているように、培養培地に対する補充剤である。
一部の実施形態において、刺激因子は、サイトカインである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２である。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２とＩＬ－１５との組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせである。一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１の組み合わせである。
Ｄ．培養
ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞供給源をフィーダー細胞および／またはその他の刺激因子と共培養することにより、増幅および刺激可能である。好適なＮＫ細胞供給源、フィーダー細胞および刺激因子は本願に記載されている。
場合によっては、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮するか、および／または分類する。場合によっては、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮および／または分類しない。
また、本発明は、本願に記載の多様な培養組成物を含む、例えば、ＮＫ細胞を含む、組成物を記載する。例えば、ＫＩＲ－ＢハプロタイプおよびＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対するホモ接合体を含む増幅された臍帯血－由来ナチュラルキラー細胞の集団と、複数の操作されたＨｕＴ７８細胞とを含む組成物を記載する。
また、本発明は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が収容された容器（ｖｅｓｓｅｌ）、例えば、バイアル、クライオバッグなどを記載する。場合によっては、複数の容器は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団の一部を含み、容器を少なくとも１０個、例えば、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個または１２００個含む。
また、本発明は、本願に記載の多様な培養組成物を収容する、例えば、ＮＫ細胞を収容するバイオリアクタを記載する。例えば、本願に記載のようなナチュラルキラー細胞供給源に由来するナチュラルキラー細胞と、例えば、本願に記載のようなフィーダー細胞とを含む培養物を収容する。また、本発明は、得られた増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を含むバイオリアクタを記載する。
１．培養培地
本発明は、ＮＫ細胞を増幅するための培養培地を開示する。これらの培養培地は、有利には、ＮＫ細胞が本願に記載の薬学的組成物を製造するのに適した細胞数に増幅可能にする。場合によっては、培養培地は、よく他のヘルパー細胞上でまたは他の培地中に細胞増幅を伴って、ＣＤ１６発現の低下なく、ＮＫ細胞を増幅させることができる。
一部の実施形態において、培養培地は、基本培養培地（ｂａｓａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）であり、選択的に、例えば、本願に記載されているように、追加的な構成成分が添加された基本培養培地である。
一部の実施形態において、培養培地、例えば、基本培養培地は、無－血清培養培地である。一部の実施形態において、培養培地、例えば、基本培養培地は、ヒト血漿および／または血清が添加された無血清培養培地である。
適切な基本培養培地としては、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（Ｒ）、２０８０２－０５００または２０８０６－０５００）、ＬＧＭ－３ＴＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２１１）、ＴｅｘＭＡＣＳＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９７－１９６）、ＡＬｙＳＴＭ ５０５ＮＫ－ＡＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、０１６００Ｐ０２）、ＡＬｙＳＴＭ ５０５ＮＫ－ＥＸ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、０１４００Ｐ１０）、ＣＴＳＴＭ ＡＩＭ－ＶＴＭ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ３８３０８０１）、ＣＴＳＴＭ ＯｐＴｍｉｚｅｒＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１０４８５０１、ＡＢＳ－００１、ＳｔｅｍＸｘＶｉｖｏ）、およびこれらの組み合わせなどがあるが、これらに限定されるものではない。
培養培地は、追加的な構成成分を含むか、または成長因子、シグナル伝達因子、営養分、抗原結合剤などのような追加的な構成成分が添加されてもよい。培養培地への添加は、培地を培養容器に投入する前に、投入と同時にまたは投入した後、それぞれの追加的な構成成分または構成成分を培養容器に投入することにより、行われる。追加的な構成成分または構成成分はともにまたは分離して添加されてもよい。分離して添加する場合、追加的な構成成分を同時に添加する必要はない。
一部の実施形態において、培養培地は、血漿、例えば、ヒト血漿を含む。一部の実施形態において、培養培地に血漿、例えば、ヒト血漿を添加する。一部の実施形態において、血漿、例えば、ヒト血漿は、抗－凝固剤、例えば、トリソジウムシトレートを含む。
一部の実施形態において、培地は、血漿、例えば、ヒト血漿を０．５％または約０．５％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培地は、０．５％または約０．５％～９％または約９％、０．５％または約０．５％～８％または約８％、０．５％または約０．５％～７％または約７％、０．５％または約０．５％～６％または約６％、０．５％または約０．５％～５％または約５％、０．５％または約０．５％～４％または約４％、０．５％または約０．５％～３％または約３％、０．５％または約０．５％～２％または約２％、０．５％または約０．５％～１％または約１％、１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～９％または約９％、１％または約１％～８％または約８％、１％または約１％～７％または約７％、１％または約１％～６％または約６％、１％または約１％～５％または約５％、１％または約１％～４％または約４％、１％または約１％～３％または約３％、１％または約１％～２％または約２％、２％または約２％～１０％または約１０％、２％または約２％～９％または約９％、２％または約２％～８％または約８％、２％または約２％～７％または約７％、２％または約２％～６％または約６％、２％または約２％～５％または約５％、２％または約２％～４％または約４％、２％または約２％～３％または約３％、３％または約３％～１０％または約１０％、３％または約３％～９％または約９％、３％または約３％～８％または約８％、３％または約３％～７％または約７％、３％または約３％～６％または約６％、３％または約３％～５％または約５％、３％または約３％～４％または約４％、４％または約４％～１０％または約１０％、４％または約４％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、４％または約４％～７％または約７％、４％または約４％～６％または約６％、４％または約４％～５％または約５％、５％または約５％～１０％または約１０％、５％または約５％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、５％または約５％～７％または約７％、５％または約５％～６％または約６％、６％または約６％～１０％または約１０％、６％または約６％～９％または約９％、６％または約６％～８％または約８％、６％または約６％～７％または約７％、７％または約７％～１０％または約１０％、７％または約７％～９％または約９％、７％または約７％～８％または約８％、８％または約８％～１０％または約１０％、８％または約８％～９％または約９％、または９％または約９％～１０％または約１０％ｖ／ｖで血漿、例えば、ヒト血漿で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を０．８％～１．２％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を１．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ヒト血漿を約１．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。
一部の実施形態において、培養培地は、血清、例えば、ヒト血清を含む。一部の実施形態において、培養培地は、血清、例えば、ヒト血清で補充される。一部の実施形態において、血清は不活性化され、例えば、熱によって不活性化される。一部の実施形態において、血清は濾過し、例えば、滅菌－濾過（ｓｔｅｒｉｌｅ－ｆｉｌｔｅｒｅｄ）する。
一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを含む。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを２．０または約２．０～６．０または約６．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを２．０または約２．０～５．５または約５．５、２．０または約２．０～５．０または約５．０、２．０または約２．０～４．５または約４．５、２．０または約２．０～４．０または約４．０、２．０または約２．０～３．５または約３．５、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、２．５または約２．５～６．０または約６．０、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．０または約５．０、２．５または約２．５～４．５または約４．５、２．５または約２．５～４．０または約４．０、２．５または約２．５～３．５または約３．５、２．５または約２．５～３．０または約３．０、３．０または約３．０～６．０または約６．０、３．０または約３．０～５．５または約５．５、３．０または約３．０～５．０または約５．０、３．０または約３．０～４．５または約４．５、３．０または約３．０～４．０または約４．０、３．０または約３．０～３．５または約３．５、３．５または約３．５～６．０または約６．０、３．５または約３．５～５．５または約５．５、３．５または約３．５～５．０または約５．０、３．５または約３．５～４．５または約４．５、３．５または約３．５～４．０または約４．０、４．０または約４．０～６．０または約６．０、４．０または約４．０～５．５または約５．５、４．０または約４．０～５．０または約５．０、４．０または約４．０～４．５または約４．５、４．５または約４．５～６．０または約６．０、４．５または約４．５～５．５または約５．５、４．５または約４．５～５．０または約５．０、５．０または約５．０～６．０または約６．０、５．０または約５．０～５．５または約５．５、または５．５または約５．５～６．０または約６．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを３．２ｍＭ～４．８ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを４．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルタミンを約４．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。
一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上のサイトカインを含む。一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上のサイトカインで補充される。
一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびこれらの組み合わせから選択される。
一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を１５０または約１５０～２，５００または約２，５００ＩＵ／ｍｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を２００または約２００～２，２５０または約２，２５０、２００または約２００～２，０００または約２，０００、２００または約２００～１，７５０または約１，７５０、２００または約２００～１，５００または約１，５００、２００または約２００～１，２５０または約１，２５０、２００または約２００～１，０００または約１，０００、２００または約２００～７５０または約７５０、２００または約２００～５００または約５００、２００または約２００～２５０または約２５０、２５０または約２５０～２，５００または約２，５００、２５０または約２５０～２，２５０または約２，２５０、２５０または約２５０～２，０００または約２，０００、２５０または約２５０～１，７５０または約１，７５０、２５０または約２５０～１，５００または約１，５００、２５０または約２５０～１，２５０または約１，２５０、２５０または約２５０～１，０００または約１，０００、２５０または約２５０～７５０または約７５０、２５０または約２５０～５００または約５００、５００または約５００～２，５００または約２，５００、５００または約５００～２，２５０または約２，２５０、５００または約５００～２，０００または約２，０００、５００または約５００～１，７５０または約１，７５０、５００または約５００～１，５００または約１，５００、５００または約５００～１，２５０または約１，２５０、５００または約５００～１，０００または約１，０００、５００または約５００～７５０または約７５０、７５０または約７５０～２，２５０または約２，２５０、７５０または約７５０～２，０００または約２，０００、７５０または約７５０～１，７５０または約１，７５０、７５０または約７５０～１，５００または約１，５００、７５０または約７５０～１，２５０または約１，２５０、７５０または約７５０～１，０００または約１，０００、１，０００または約１，０００～２，５００または約２，５００、１，０００または約１，０００～２，２５０または約２，２５０、１，０００または約１，０００～２，０００または約２，０００、１，０００または約１，０００～１，７５０または約１，７５０、１，０００または約１，０００～１，５００または約１，５００、１，０００または約１，０００～１，２５０または約１，２５０、１，２５０または約１，２５０～２，５００または約２，５００、１，２５０または約１，２５０～２，２５０または約２，２５０、１，２５０または約１，２５０～２，０００または約２，０００、１，２５０または約１，２５０～１，７５０または約１，７５０、１，２５０または約１，２５０～１，５００または約１，５００、１，５００または約１，５００～２，５００または約２，５００、１，５００または約１，５００～２，２５０または約２，２５０、１，５００または約１，５００～２，０００または約２，０００、１，５００または約１，５００～１，７５０または約１，７５０、１，７５０または約１，７５０～２，５００または約２，５００、１，７５０または約１，７５０～２，２５０または約２，２５０、１，７５０または約１，７５０～２，０００または約２，０００、２，０００または約２，０００～２，５００または約２，５００、２，０００または約２，０００～２，２５０または約２，２５０、または２，２５０または約２，２５０～２，５００または約２，５００ＩＵ／ｍｌ含むか、および／またはそれで補充される。
一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を６４μｇ／ｌ～９６μｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を８０μｇ／ｌ（約１，３３３ＩＵ／ｍｌ）含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２を約８０μｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。
一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１の組み合わせを含むか、および／またはそれで補充される。
一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを含むか、および／またはグルコースで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを０．５または約０．５～３．５ｇ／ｌまたは約３．５ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．５または約０．５～３．０または約３．０、０．５または約０．５～２．５または約２．５、０．５または約０．５～２．０または約２．０、０．５または約０．５～１．５または約１．５、０．５または約０．５～１．０または約１．０、１．０または約１．０～３．０または約３．０、１．０または約１．０～２．５または約２．５、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．５または約１．５、１．５または約１．５～３．０または約３．０、１．５または約１．５～２．５または約２．５、１．５または約１．５～２．０または約２．０、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、または２．５または約２．５～３．０または約３．０ｇ／ｌでグルコースを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを１．６～２．４ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、グルコースを約２．０ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを含むか、および／またはソジウムピルベートで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを０．１または約０．１～２．０または約２．０ｍＭ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．１または約０．１～１．８または約１．８、０．１または約０．１～１．６または約１．６、０．１または約０．１～１．４または約１．４、０．１または約０．１～１．２または約１．２、０．１または約０．１～１．０または約１．０、０．１または約０．１～０．８または約０．８、０．１または約０．１～０．６または約０．６、０．１または約０．１～０．４または約０．４、０．１または約０．１～０．２または約０．２、０．２または約０．２～２．０または約２．０、０．２または約０．２～１．８または約１．８、０．２または約０．２～１．６または約１．６、０．２または約０．２～１．４または約１．４、０．２または約０．２～１．２または約１．２、０．２または約０．２～１．０または約１．０、０．２または約０．２～０．８または約０．８、０．２または約０．２～０．６または約０．６、０．２または約０．２～０．４または約０．４、０．４または約０．４～２．０または約２．０、０．４または約０．４～１．８または約１．８、０．４または約０．４～１．６または約１．６、０．４または約０．４～１．４または約１．４、０．４または約０．４～１．２または約１．２、０．４または約０．４～１．０または約１．０、０．４または約０．４～０．８または約０．８、０．４または約０．４～０．６または約０．６、０．６または約０．６～２．０または約２．０、０．６または約０．６～１．８または約１．８、０．６または約０．６～１．６または約１．６、０．６または約０．６～１．４または約１．４、０．６または約０．６～１．２または約１．２、０．６または約０．６～１．０または約１．０、０．６または約０．６～０．８または約０．８、０．８または約０．８～２．０または約２．０、０．８または約０．８～１．８または約１．８、０．８または約０．８～１．６または約１．６、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．２または約１．２、０．８または約０．８～１．０または約１．０、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．８または約１．８、１．０または約１．０～１．６または約１．６、１．０または約１．０～１．４または約１．４、１．０または約１．０～１．２または約１．２、１．２または約１．２～２．０または約２．０、１．２または約１．２～１．８または約１．８、１．２または約１．２～１．６または約１．６、１．２または約１．２～１．４または約１．４、１．４または約１．４～２．０または約２．０、１．４または約１．４～１．８または約１．８、１．４または約１．４～１．６または約１．６、１．６または約１．６～２．０または約２．０、１．６または約１．６～１．８または約１．８、または１．８または約１．８～２．０または約２．０ｍＭでソジウムピルベートを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを０．８～１．２ｍＭ含む。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを１．０ｍＭ含む。一部の実施形態において、培養培地は、ソジウムピルベートを約１．０ｍＭ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを０．５または約０．５～３．５または約３．５ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、０．５または約０．５～３．０または約３．０、０．５または約０．５～２．５または約２．５、０．５または約０．５～２．０または約２．０、０．５または約０．５～１．５または約１．５、０．５または約０．５～１．０または約１．０、１．０または約１．０～３．０または約３．０、１．０または約１．０～２．５または約２．５、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．５または約１．５、１．５または約１．５～３．０または約３．０、１．５または約１．５～２．５または約２．５、１．５または約１．５～２．０または約２．０、２．０または約２．０～３．０または約３．０、２．０または約２．０～２．５または約２．５、または２．５または約２．５～３．０または約３．０ｇ／ｌで炭酸水素ナトリウムを含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを１．６～２．４ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、炭酸水素ナトリウムを約２．０ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、例えば、本願に記載のヒトアルブミン溶液を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を０．５％または約０．５％～３．５％または約３．５％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を０．５または約０．５％～３．０または約３．０％、０．５％または約０．５％～２．５または約２．５％、０．５％または約０．５％～２．０または約２．０％、０．５％または約０．５％～１．５または約１．５％、０．５％または約０．５％～１．０または約１．０％、１．０または約１．０％～３．０または約３．０％、１．０または約１．０％～２．５または約２．５％、１．０または約１．０％～２．０または約２．０％、１．０または約１．０％～１．５または約１．５％、１．５または約１．５％～３．０または約３．０％、１．５または約１．５％～２．５または約２．５％、１．５または約１．５％～２．０または約２．０％、２．０％または約２．０％～３．０または約３．０％、２．０％または約２．０％～２．５または約２．５％、または２．５％または約２．５％～３．０または約３．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を１．６％～２．４％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を２．０％ｖ／ｖ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、２０％アルブミン溶液、例えば、２０％ヒトアルブミン溶液を約２．０％ｖ／ｖ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２または約２～６または約６ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２または約２～５．５または約５．５、２または約２～５．０または約５．０、２または約２～４．５または約４．５、２または約２～４または約４、２または約２～３．５または約３．５、２または約２～３または約３、２または約２～２．５または約２．５、２．５または約２．５～６または約６、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．５または約５．５、２．５または約２．５～５．０または約５．０、２．５または約２．５～４．５または約４．５、２．５または約２．５～４．０または約４．０、２．５または約２．５～３．５または約３．５、２．５または約２．５～３．０または約３．０、３または約３～６または約６、３または約３～５．５または約５．５、３または約３～５または約５、３または約３～４．５または約４．５、３または約３～４または約４、３または約３～３．５または約３．５、３．５または約３．５～６または約６、３．５または約３．５～５．５または約５．５、３．５または約３．５～５または約５、３．５または約３．５～４．５または約４．５、３．５または約３．５～４または約４、４または約４～６または約６、４または約４～５．５または約５．５、４または約４～５または約５、４または約４～４．５または約４．５、４．５または約４．５～６または約６、４．５または約４．５～５．５または約５．５、４．５または約４．５～５または約５、５または約５～６または約６、５または約５～５．５または約５．５、または５．５または約５．５～６または約６ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを３．２～４．８ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを４ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを約４ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．１または約０．１～２．０または約２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．１または約０．１～１．８または約１．８、０．１または約０．１～１．６または約１．６、０．１または約０．１～１．４または約１．４、０．１または約０．１～１．２または約１．２、０．１または約０．１～１．０または約１．０、０．１または約０．１～０．８または約０．８、０．１または約０．１～０．６または約０．６、０．１または約０．１～０．４または約０．４、０．１または約０．１～０．２または約０．２、０．２または約０．２～２．０または約２．０、０．２または約０．２～１．８または約１．８、０．２または約０．２～１．６または約１．６、０．２または約０．２～１．４または約１．４、０．２または約０．２～１．２または約１．２、０．２または約０．２～１．０または約１．０、０．２または約０．２～０．８または約０．８、０．２または約０．２～０．６または約０．６、０．２または約０．２～０．４または約０．４、０．４または約０．４～２．０または約２．０、０．４または約０．４～１．８または約１．８、０．４または約０．４～１．６または約１．６、０．４または約０．４～１．４または約１．４、０．４または約０．４～１．２または約１．２、０．４または約０．４～１．０または約１．０、０．４または約０．４～０．８または約０．８、０．４または約０．４～０．６または約０．６、０．６または約０．６～２．０または約２．０、０．６または約０．６～１．８または約１．８、０．６または約０．６～１．６または約１．６、０．６または約０．６～１．４または約１．４、０．６または約０．６～１．２または約１．２、０．６または約０．６～１．０または約１．０、０．６または約０．６～０．８または約０．８、０．８または約０．８～２．０または約２．０、０．８または約０．８～１．８または約１．８、０．８または約０．８～１．６または約１．６、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．４または約１．４、０．８または約０．８～１．２または約１．２、０．８または約０．８～１．０または約１．０、１．０または約１．０～２．０または約２．０、１．０または約１．０～１．８または約１．８、１．０または約１．０～１．６または約１．６、１．０または約１．０～１．４または約１．４、１．０または約１．０～１．２または約１．２、１．２または約１．２～２．０または約２．０、１．２または約１．２～１．８または約１．８、１．２または約１．２～１．６または約１．６、１．２または約１．２～１．４または約１．４、１．４または約１．４～２．０または約２．０、１．４または約１．４～１．８または約１．８、１．４または約１．４～１．６または約１．６、１．６または約１．６～２．０または約２．０、１．６または約１．６～１．８または約１．８、または１．８または約１．８～２．０または約２．０ｇ／ｌ含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を０．８～１．２ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を１．０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、培養培地は、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８を約１．０ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、培養培地は、１つ以上の抗生剤を含むか、および／またはそれで補充される。
例示的な第１培養培地を表１に示す。
例示的な第２培養培地を表２に言及する。
２．ＣＤ３結合抗体
一部の実施形態において、培養培地は、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａ、またはその変異体からなる群より選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片は、ＯＫＴ３またはその抗原結合断片である。
一部の実施形態において、ＣＤ３結合抗体またはその抗原結合断片とフィーダー細胞は、ＮＫ細胞および／または培養培地を添加する前に培養容器に投入される。
一部の実施形態において、培養培地は、５または約５ｎｇ／ｍｌ～１５または約１５ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、５または約５～１２．５または約１２．５、５または約５～１０または約１０、５または約５～７．５または約７．５、７．５または約７．５～１５または約１５、７．５または約７．５～１２．５または約１２．５、７．５または約７．５～１０または約１０、１０または約１０～１５または約１５、１０または約１０～１２．５または約１２．５、または１２．５または約１２．５～１５または約１５ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、１０ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。一部の実施形態において、培養培地は、約１０ｎｇ／ｍｌでＯＫＴ３を含むか、および／またはそれで補充される。
３．培養容器
様々な容器が本発明の内容に符合する。一部の実施形態において、培養容器は、フラスコ、ボトル、ディッシュ、マルチウェルプレート、ローラーボトル、バッグおよびバイオリアクタからなる群より選択される。
一部の実施形態において、培養容器は、親水性になるように処理される。一部の実施形態において、培養容器は、付着および／または増殖を促進するように処理される。一部の実施形態において、培養容器の表面は、血清、コラーゲン、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、フィブロネクチン、細胞外マトリックスタンパク質、およびこれらの組み合わせでコーティングされる。
一部の実施形態において、様々な培養段階に様々なタイプの培養容器が用いられる。
一部の実施形態において、培養容器は、１００ｍｌまたは約１００ｍｌ～１，０００ｌまたは約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、培養容器は、１２５ｍｌまたは約１２５ｍｌ、２５０ｍｌまたは約２５０ｍｌ、５００ｍｌまたは約５００ｍｌ、１ｌまたは約１ｌ、５ｌまたは約５ｌ、１０ｌまたは約１０ｌ、または２０ｌまたは約２０ｌの体積を有する。
一部の実施形態において、培養容器は、バイオリアクタである。一部の実施形態において、バイオリアクタは、ロッキングベッド（ｒｏｃｋｉｎｇ ｂｅｄ）（波動運動）バイオリアクタである。一部の実施形態において、バイオリアクタは、撹拌型タンクバイオリアクタ（ｓｔｉｒｒｅｄ ｔａｎｋ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、回転壁容器（ｒｏｔａｔｉｎｇ ｗａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、灌流バイオリアクタ（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、単離／増幅自動システム（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）である。一部の実施形態において、バイオリアクタは、自動または半自動バイオリアクタである。一部の実施形態において、バイオリアクタは、使い捨てバッグバイオリアクタである。
一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１００ｍｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０ｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１００ｌ～約９００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０ｌ～約８００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約１０ｌ～約７００ｌ、約１０ｌ～約６００ｌ、約１０ｌ～約５００ｌ、約１０ｌ～約４００ｌ、約１０ｌ～約３００ｌ、約１０ｌ～約２００ｌ、約１０ｌ～約１００ｌ、約１０ｌ～約９０ｌ、約１０ｌ～約８０ｌ、約１０ｌ～約７０ｌ、約１０ｌ～約６０ｌ、約１０ｌ～約５０ｌ、約１０ｌ～約４０ｌ、約１０ｌ～約３０ｌ、約１０ｌ～約２０ｌ、約２０ｌ～約１，０００ｌ、約２０ｌ～約９００ｌ、約２０ｌ～約８００ｌ、約２０ｌ～約７００ｌ、約２０ｌ～約６００ｌ、約２０ｌ～約５００ｌ、約２０ｌ～約４００ｌ、約２０ｌ～約３００ｌ、約２０ｌ～約２００ｌ、約２０ｌ～約１００ｌ、約２０ｌ～約９０ｌ、約２０ｌ～約８０ｌ、約２０ｌ～約７０ｌ、約２０ｌ～約６０ｌ、約２０ｌ～約５０ｌ、約２０ｌ～約４０ｌ、約２０ｌ～約３０ｌ、約３０ｌ～約１，０００ｌ、約３０ｌ～約９００ｌ、約３０ｌ～約８００ｌ、約３０ｌ～約７００ｌ、約３０ｌ～約６００ｌ、約３０ｌ～約５００ｌ、約３０ｌ～約４００ｌ、約３０ｌ～約３００ｌ、約３０ｌ～約２００ｌ、約３０ｌ～約１００ｌ、約３０ｌ～約９０ｌ、約３０ｌ～約８０ｌ、約３０ｌ～約７０ｌ、約３０ｌ～約６０ｌ、約３０ｌ～約５０ｌ、約３０ｌ～約４０ｌ、約４０ｌ～約１，０００ｌ、約４０ｌ～約９００ｌ、約４０ｌ～約８００ｌ、約４０ｌ～約７００ｌ、約４０ｌ～約６００ｌ、約４０ｌ～約５００ｌ、約４０ｌ～約４００ｌ、約４０ｌ～約３００ｌ、約４０ｌ～約２００ｌ、約４０ｌ～約１００ｌ、約４０ｌ～約９０ｌ、約４０ｌ～約８０ｌ、約４０ｌ～約７０ｌ、約４０ｌ～約６０ｌ、約４０ｌ～約５０ｌ、約５０ｌ～約１，０００ｌ、約５０ｌ～約９００ｌ、約５０ｌ～約８００ｌ、約５０ｌ～約７００ｌ、約５０ｌ～約６００ｌ、約５０ｌ～約５００ｌ、約５０ｌ～約４００ｌ、約５０ｌ～約３００ｌ、約５０ｌ～約２００ｌ、約５０ｌ～約１００ｌ、約５０ｌ～約９０ｌ、約５０ｌ～約８０ｌ、約５０ｌ～約７０ｌ、約５０ｌ～約６０ｌ、約６０ｌ～約１，０００ｌ、約６０ｌ～約９００ｌ、約６０ｌ～約８００ｌ、約６０ｌ～約７００ｌ、約６０ｌ～約６００ｌ、約６０ｌ～約５００ｌ、約６０ｌ～約４００ｌ、約６０ｌ～約３００ｌ、約６０ｌ～約２００ｌ、約６０ｌ～約１００ｌ、約６０ｌ～約９０ｌ、約６０ｌ～約８０ｌ、約６０ｌ～約７０ｌ、約７０ｌ～約１，０００ｌ、約７０ｌ～約９００ｌ、約７０ｌ～約８００ｌ、約７０ｌ～約７００ｌ、約７０ｌ～約６００ｌ、約７０ｌ～約５００ｌ、約７０ｌ～約４００ｌ、約７０ｌ～約３００ｌ、約７０ｌ～約２００ｌ、約７０ｌ～約１００ｌ、約７０ｌ～約９０ｌ、約７０ｌ～約８０ｌ、約８０ｌ～約１，０００ｌ、約８０ｌ～約９００ｌ、約８０ｌ～約８００ｌ、約８０ｌ～約７００ｌ、約８０ｌ～約６００ｌ、約８０ｌ～約５００ｌ、約８０ｌ～約４００ｌ、約８０ｌ～約３００ｌ、約８０ｌ～約２００ｌ、約８０ｌ～約１００ｌ、約８０ｌ～約９０ｌ、約９０ｌ～約１，０００ｌ、約９０ｌ～約９００ｌ、約９０ｌ～約８００ｌ、約９０ｌ～約７００ｌ、約９０ｌ～約６００ｌ、約９０ｌ～約５００ｌ、約９０ｌ～約４００ｌ、約９０ｌ～約３００ｌ、約９０ｌ～約２００ｌ、約９０ｌ～約１００ｌ、約１００ｌ～約１，０００ｌ、約１００ｌ～約９００ｌ、約１００ｌ～約８００ｌ、約１００ｌ～約７００ｌ、約１００ｌ～約６００ｌ、約１００ｌ～約５００ｌ、約１００ｌ～約４００ｌ、約１００ｌ～約３００ｌ、約１００ｌ～約２００ｌ、約２００ｌ～約１，０００ｌ、約２００ｌ～約９００ｌ、約２００ｌ～約８００ｌ、約２００ｌ～約７００ｌ、約２００ｌ～約６００ｌ、約２００ｌ～約５００ｌ、約２００ｌ～約４００ｌ、約２００ｌ～約３００ｌ、約３００ｌ～約１，０００ｌ、約３００ｌ～約９００ｌ、約３００ｌ～約８００ｌ、約３００ｌ～約７００ｌ、約３００ｌ～約６００ｌ、約３００ｌ～約５００ｌ、約３００ｌ～約４００ｌ、約４００ｌ～約１，０００ｌ、約４００ｌ～約９００ｌ、約４００ｌ～約８００ｌ、約４００ｌ～約７００ｌ、約４００ｌ～約６００ｌ、約４００ｌ～約５００ｌ、約５００ｌ～約１，０００ｌ、約５００ｌ～約９００ｌ、約５００ｌ～約８００ｌ、約５００ｌ～約７００ｌ、約５００ｌ～約６００ｌ、約６００ｌ～約１，０００ｌ、約６００ｌ～約９００ｌ、約６００ｌ～約８００ｌ、約６００ｌ～約７００ｌ、約７００ｌ～約１，０００ｌ、約７００ｌ～約９００ｌ、約７００ｌ～約８００ｌ、約８００ｌ～約１，０００ｌ、約８００ｌ～約９００ｌ、または約９００ｌ～約１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、約５０ｌの体積を有する。
一部の実施形態において、バイオリアクタは、１００ｍｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１００ｌ～９００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～８００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、１０ｌ～７００ｌ、１０ｌ～６００ｌ、１０ｌ～５００ｌ、１０ｌ～４００ｌ、１０ｌ～３００ｌ、１０ｌ～２００ｌ、１０ｌ～１００ｌ、１０ｌ～９０ｌ、１０ｌ～８０ｌ、１０ｌ～７０ｌ、１０ｌ～６０ｌ、１０ｌ～５０ｌ、１０ｌ～４０ｌ、１０ｌ～３０ｌ、１０ｌ～２０ｌ、２０ｌ～１，０００ｌ、２０ｌ～９００ｌ、２０ｌ～８００ｌ、２０ｌ～７００ｌ、２０ｌ～６００ｌ、２０ｌ～５００ｌ、２０ｌ～４００ｌ、２０ｌ～３００ｌ、２０ｌ～２００ｌ、２０ｌ～１００ｌ、２０ｌ～９０ｌ、２０ｌ～８０ｌ、２０ｌ～７０ｌ、２０ｌ～６０ｌ、２０ｌ～５０ｌ、２０ｌ～４０ｌ、２０ｌ～３０ｌ、３０ｌ～１，０００ｌ、３０ｌ～９００ｌ、３０ｌ～８００ｌ、３０ｌ～７００ｌ、３０ｌ～６００ｌ、３０ｌ～５００ｌ、３０ｌ～４００ｌ、３０ｌ～３００ｌ、３０ｌ～２００ｌ、３０ｌ～１００ｌ、３０ｌ～９０ｌ、３０ｌ～８０ｌ、３０ｌ～７０ｌ、３０ｌ～６０ｌ、３０ｌ～５０ｌ、３０ｌ～４０ｌ、４０ｌ～１，０００ｌ、４０ｌ～９００ｌ、４０ｌ～８００ｌ、４０ｌ～７００ｌ、４０ｌ～６００ｌ、４０ｌ～５００ｌ、４０ｌ～４００ｌ、４０ｌ～３００ｌ、４０ｌ～２００ｌ、４０ｌ～１００ｌ、４０ｌ～９０ｌ、４０ｌ～８０ｌ、４０ｌ～７０ｌ、４０ｌ～６０ｌ、４０ｌ～５０ｌ、５０ｌ～１，０００ｌ、５０ｌ～９００ｌ、５０ｌ～８００ｌ、５０ｌ～７００ｌ、５０ｌ～６００ｌ、５０ｌ～５００ｌ、５０ｌ～４００ｌ、５０ｌ～３００ｌ、５０ｌ～２００ｌ、５０ｌ～１００ｌ、５０ｌ～９０ｌ、５０ｌ～８０ｌ、５０ｌ～７０ｌ、５０ｌ～６０ｌ、６０ｌ～１，０００ｌ、６０ｌ～９００ｌ、６０ｌ～８００ｌ、６０ｌ～７００ｌ、６０ｌ～６００ｌ、６０ｌ～５００ｌ、６０ｌ～４００ｌ、６０ｌ～３００ｌ、６０ｌ～２００ｌ、６０ｌ～１００ｌ、６０ｌ～９０ｌ、６０ｌ～８０ｌ、６０ｌ～７０ｌ、７０ｌ～１，０００ｌ、７０ｌ～９００ｌ、７０ｌ～８００ｌ、７０ｌ～７００ｌ、７０ｌ～６００ｌ、７０ｌ～５００ｌ、７０ｌ～４００ｌ、７０ｌ～３００ｌ、７０ｌ～２００ｌ、７０ｌ～１００ｌ、７０ｌ～９０ｌ、７０ｌ～８０ｌ、８０ｌ～１，０００ｌ、８０ｌ～９００ｌ、８０ｌ～８００ｌ、８０ｌ～７００ｌ、８０ｌ～６００ｌ、８０ｌ～５００ｌ、８０ｌ～４００ｌ、８０ｌ～３００ｌ、８０ｌ～２００ｌ、８０ｌ～１００ｌ、８０ｌ～９０ｌ、９０ｌ～１，０００ｌ、９０ｌ～９００ｌ、９０ｌ～８００ｌ、９０ｌ～７００ｌ、９０ｌ～６００ｌ、９０ｌ～５００ｌ、９０ｌ～４００ｌ、９０ｌ～３００ｌ、９０ｌ～２００ｌ、９０ｌ～１００ｌ、１００ｌ～１，０００ｌ、１００ｌ～９００ｌ、１００ｌ～８００ｌ、１００ｌ～７００ｌ、１００ｌ～６００ｌ、１００ｌ～５００ｌ、１００ｌ～４００ｌ、１００ｌ～３００ｌ、１００ｌ～２００ｌ、２００ｌ～１，０００ｌ、２００ｌ～９００ｌ、２００ｌ～８００ｌ、２００ｌ～７００ｌ、２００ｌ～６００ｌ、２００ｌ～５００ｌ、２００ｌ～４００ｌ、２００ｌ～３００ｌ、３００ｌ～１，０００ｌ、３００ｌ～９００ｌ、３００ｌ～８００ｌ、３００ｌ～７００ｌ、３００ｌ～６００ｌ、３００ｌ～５００ｌ、３００ｌ～４００ｌ、４００ｌ～１，０００ｌ、４００ｌ～９００ｌ、４００ｌ～８００ｌ、４００ｌ～７００ｌ、４００ｌ～６００ｌ、４００ｌ～５００ｌ、５００ｌ～１，０００ｌ、５００ｌ～９００ｌ、５００ｌ～８００ｌ、５００ｌ～７００ｌ、５００ｌ～６００ｌ、６００ｌ～１，０００ｌ、６００ｌ～９００ｌ、６００ｌ～８００ｌ、６００ｌ～７００ｌ、７００ｌ～１，０００ｌ、７００ｌ～９００ｌ、７００ｌ～８００ｌ、８００ｌ～１，０００ｌ、８００ｌ～９００ｌ、または９００ｌ～１，０００ｌの体積を有する。一部の実施形態において、バイオリアクタは、５０ｌの体積を有する。
４．細胞増幅および刺激
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットをフィーダー細胞と共培養して、増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産する。
一部の実施形態において、共培養は、本願に記載の培養培地、例えば、培養培地の例＃１（表１）または培養培地の例＃２（表２）で行われる。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０７または約１×１０７～１×１０９または約１×１０９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０８または約１×１０８～１．５×１０８または約１．５×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を約１×１０８個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を１×１０９個含む。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットは、増幅する前に、総有核細胞を約１×１０９個含む。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットとフィーダー細胞との共培養に由来する細胞は回収および冷凍し、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物中に回収および冷凍する。一部の実施形態において、共培養物に由来する冷凍細胞は、注入用－完成医薬品（ｉｎｆｕｓｉｏｎ－ｒｅａｄｙ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。一部の実施形態において、共培養物に由来する冷凍細胞は、注入用－完成医薬品を生産するための、例えば、本願に記載されているように、１つ以上の追加的な共培養段階により生産するためのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）として用いられる。このため、例えば、ナチュラルキラー細胞供給源は、本願に記載されているように増幅および刺激して、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞をいかなる中間産物も作らずに生産可能である。ナチュラルキラー細胞供給源はまた、本願に記載されているように増幅および刺激して、中間産物、例えば、１次マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を生産することができる。１次ＭＣＢは、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産するか、または代案的に、他の中間産物、例えば、２次ＭＣＢを生産するのに用いることができる。２次ＭＣＢは、注入用－完成医薬品への使用に適した増幅および刺激されたＮＫ細胞を生産するか、または代案的に、他の中間産物、例えば、３次ＭＣＢなどを生産するのに用いることができる。
一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、１：１または約１：１～４：１または約４：１である。一部の実施形態において、フィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、１：１または約１：１～３．５：１または約３．５：１、１：１または約１：１～３：１または約３：１、１：１または約１：１～２．５：１または約２．５：１、１：１または約１：１～２：１または約２：１、１：１または約１：１～１．５または約１．５：１、１．５：１または約１．５：１～４：１または約４：１、１．５：１または約１．５：１～３．５：１または約３．５：１、１．５：１または約１．５：１～３：１または約３：１、１．５：１または約１．５：１～２．５：１または約２．５：１、１．５：１または約１．５：１～２：１または約２：１、２：１または約２：１～４：１または約４：１、２：１または約２：１～３．５：１または約３．５：１、２：１または約２：１～３：１または約３：１、２：１または約２：１～２．５：１または約２．５：１、２．５：１または約２．５：１～４：１または約４：１、２．５：１または約２．５：１～３．５：１または約３．５：１、２．５：１または約２．５：１～３：１または約３：１、３：１または約３：１～４：１または約４：１、３：１または約３：１～３．５：１または約３．５：１、または３．５：１または約３．５：１～４：１または約４：１である。一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、２．５：１である。一部の実施形態において、共培養物に接種されるフィーダー細胞：ナチュラルキラー細胞供給源またはＭＣＢ細胞の比率は、約２．５：１である。
一部の実施形態において、共培養は、使い捨て培養バッグで、例えば、１ｌ使い捨て培養バッグで行われる。一部の実施形態において、共培養は、バイオリアクタで、例えば、５０ｌバイオリアクタで行われる。一部の実施形態において、１次接種した後、共培養物に培養培地を添加する。
一部の実施形態において、共培養は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、またはそれより長期間行う。一部の実施形態において、共培養は、最大１６日間行う。
一部の実施形態において、共培養は、３７℃または約３７℃で行われる。
一部の実施形態において、共培養は、ｐＨ７．９または約ｐＨ７．９で行われる。
一部の実施形態において、共培養は、５０％以上の溶存酸素（ＤＯ）レベルで行われる。
一部の実施形態において、例示的な培養培地＃１（表１）は、ＭＣＢを生産するために使用され、培養培地＃２（表２）は、注入用－完成医薬品に適した細胞を生産するために使用される。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、例えば、臍帯血単一ユニットとフィーダー細胞との共培養で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞５０×１０８または約５０×１０８～５０×１０１２または約５０×１０１２個が作られる。一部の実施形態において、このような増幅で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞５０×１０８または約５０×１０８～２５×１０１０または約２５×１０１０、１０×１０８または約１０×１０８～１×１０１０または約１×１０１０、５０×１０８または約５０×１０８～７５×１０９または約７５×１０９、５０×１０８または約５０×１０８～５０×１０９または約５０×１０９、５０×１０８または約５０×１０８～２５×１０９または約２５×１０９、５０×１０８または約５０×１０８～１×１０９または約１×１０９、５０×１０８または約５０×１０８～７５×１０８または約７５×１０８、７５×１０８または約７５×１０８～５０×１０１０または約５０×１０１０、７５×１０８または約７５×１０８～２５×１０１０または約２５×１０１０、７５×１０８または約７５×１０８～１×１０１０または約１×１０１０、７５×１０８または約７５×１０８～７５×１０９または約７５×１０９、７５×１０８または約７５×１０８～５０×１０９または約５０×１０９、７５×１０８または約７５×１０８～２５×１０９または約２５×１０９、７５×１０８または約７５×１０８～１×１０９または約１×１０９、１×１０９または約１×１０９～５０×１０１０または約５０×１０１０、１×１０９または約１×１０９～２５×１０１０または約２５×１０１０、１×１０９または約１×１０９～１×１０１０または約１×１０１０、１×１０９または約１×１０９～７５×１０９または約７５×１０９、１×１０９または約１×１０９～５０×１０９または約５０×１０９、１×１０９または約１×１０９～２５×１０９または約２５×１０９、２５×１０９または約２５×１０９～５０×１０１０または約５０×１０１０、２５×１０９または約２５×１０９～２５×１０１０または約２５×１０１０、２５×１０９または約２５×１０９～１×１０１０または約１×１０１０、２５×１０９または約２５×１０９～７５×１０９または約７５×１０９、２５×１０９または約２５×１０９～５０×１０９または約５０×１０９、５０×１０９または約５０×１０９～５０×１０１０または約５０×１０１０、５０×１０９または約５０×１０９～２５×１０１０または約２５×１０１０、５０×１０９または約５０×１０９～１×１０１０または約１×１０１０、５０×１０９または約５０×１０９～７５×１０９または約７５×１０９、７５×１０９または約７５×１０９～５０×１０１０または約５０×１０１０、７５×１０９または約７５×１０９～２５×１０１０または約２５×１０１０、７５×１０９または約７５×１０９～１×１０１０または約１×１０１０、１×１０１０または約１×１０１０～５０×１０１０または約５０×１０１０、１×１０１０または約１×１０１０～２５×１０１０または約２５×１０１０、または２５×１０１０または約２５×１０１０～５０×１０１０または約５０×１０１０個が生産される。
一部の実施形態において、増幅で、細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞をそれぞれ６億または約６億～１０億または約１０億個ずつ収容する、バイアル６０または約６０～１００または約１００個が作られる。一部の実施形態において、増幅で細胞、例えば、ＭＣＢ細胞または注入用－完成医薬品細胞をそれぞれ８億または約８億個含むか、またはそれらで構成された、バイアル８０または約８０個が生産される。
一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞数、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍、１００倍または約１００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３００倍または約３００倍、１００倍または約１００倍～２００倍または約２００倍、２００倍または約２００倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３５０倍または約３５０倍、２００倍または約２００倍～３００倍または約３００倍、２００倍または約２００倍～２５０倍または約２５０倍、２５０倍または約２５０倍～５００倍または約５００倍、２５０倍または約２５０倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、２５０倍または約２５０倍～３５０倍または約３５０倍、２５０倍または約２５０倍～３００倍または約３００倍、３００倍または約３００倍～５００倍または約５００倍、３００倍または約３００倍～４５０倍または約４５０倍、３００倍または約３００倍～４００倍または約４００倍、３００倍または約３００倍～３５０倍または約３５０倍、３５０倍または約３５０倍～５００倍または約５００倍、３５０倍または約３５０倍～４５０倍または約４５０倍、または３５０倍または約３５０倍～４００倍または約４００倍増加させる。
一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～７０，０００倍または約７０，０００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、ナチュラルキラー細胞供給源中の細胞、例えば、ＮＫ細胞の細胞数に対して細胞、例えば、ＭＣＢ細胞の細胞数を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増加させる。
一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を５億または約５億～１５億または約１５億個生産する。一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を５億または約５億～１５億または約１５億、５億または約５億～１２億５千または約１２億５千、５億または約５億～１０億または約１０億、５億または約５億～７億５千または約７億５千、７億５千または約７億５千～１５億または約１５億、５億または約５億～１２億５千または約１２億５千、７億５千または約７億５千～１０億または約１０億、１０億または約１０億～１５億または約１５億、１０億または約１０億～１２億５千または約１２億５千、または１２億５千または約１２億５千～１５億または約１５億個生産する。
一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞をそれぞれ７億５千または約７億５千～１２億５千または約１２億５千個ずつ含む、細胞、例えば、注入型－完成医薬品細胞のバイアルを５０または約５０～１５０または約１５０個生産する。一部の実施形態において、ＭＣＢ細胞とフィーダー細胞との共培養は、細胞を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞をそれぞれ１０億または約１０億個含むか、またはそれらで構成された、バイアル１００個または約１００個を生産する。
一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適した細胞数、例えば、ＮＫ細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、細胞数を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞の細胞数を１００倍または約１００倍～５００倍または約５００倍、１００倍または約１００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３００倍または約３００倍、１００倍または約１００倍～２００倍または約２００倍、２００倍または約２００倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、１００倍または約１００倍～３５０倍または約３５０倍、２００倍または約２００倍～３００倍または約３００倍、２００倍または約２００倍～２５０倍または約２５０倍、２５０倍または約２５０倍～５００倍または約５００倍、２５０倍または約２５０倍～４５０倍または約４５０倍、２００倍または約２００倍～４００倍または約４００倍、２５０倍または約２５０倍～３５０倍または約３５０倍、２５０倍または約２５０倍～３００倍または約３００倍、３００倍または約３００倍～５００倍または約５００倍、３００倍または約３００倍～４５０倍または約４５０倍、３００倍または約３００倍～４００倍または約４００倍、３００倍または約３００倍～３５０倍または約３５０倍、３５０倍または約３５０倍～５００倍または約５００倍、３５０倍または約３５０倍～４５０倍または約４５０倍、３５０倍または約３５０倍～４００倍または約４００倍増加させる。
一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、細胞数を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞の細胞数を１００または約１００～７０，０００～約７０，０００倍増加させる。一部の実施形態において、増幅は、初期ＭＣＢ細胞数と比較して、細胞数を、例えば、ＭＣＢおよび／または注入用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞の細胞数を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増加させる。
本願に記載されているように増幅および刺激中に細胞を操作する実施形態において、増幅および刺激されたすべての細胞が必ずしもうまく操作されるわけではなく、例えば、うまく形質導入されるわけではなく、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入されたわけではない。このため、本願に記載の方法は、操作された細胞、例えば、本願に記載の操作された細胞を非－操作細胞から分類することを追加的に含むことができる。
一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、操作された細胞の抗原に特異的な試薬、例えば、操作された細胞の抗原を標的化するが、非－操作細胞を標的化しない抗体を用いて、非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。一部の実施形態において、操作された細胞の抗原は、ＣＡＲの構成成分、例えば、本願に記載のＣＡＲの構成成分である。
細胞を抗原に基づいて細胞分離するためのシステムは、商業的に入手可能であり、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）分類システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）がある。
一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、フローサイトメトリー測定を用いて非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。
一部の実施形態において、分類した操作された細胞は、ＭＣＢとして用いられる。一部の実施形態において、分類した操作された細胞は、注入用－完成医薬品の構成成分として用いられる。
一部の実施形態において、操作された細胞、例えば、形質導入された細胞は、微細流体細胞分類方法を用いて非－操作細胞、例えば、非－形質導入細胞から分類する。微細流体細胞分類方法は、例えば、Ｄａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｏｒｔｉｎｇ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」，Ａｎａｌｙｓｔ１４４：８７（２０１９）に言及されている。
一部の実施形態において、増幅および刺激された細胞の１％または約１％～９９％または約９９％がうまく操作され、例えば、うまく形質導入され、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入される。一部の実施形態において、増幅および刺激された細胞の１％または約１％～９０％または約９０％、１％または約１％～８０％または約８０％、１％または約１％～７０％または約７０％、１％または約１％～６０％または約６０％、１％または約１％～５０％または約５０％、１％または約１％～４０％または約４０％、１％または約１％～３０％または約３０％、１％または約１％～２０％または約２０％、１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～５％または約５％、５％または約５％～９９％または約９９％、５％または約５％～９０％または約９０％、５％または約５％～８０％または約８０％、５％または約５％～７０％または約７０％、５％または約５％～６０％または約６０％、５％または約５％～５０％または約５０％、５％または約５％～４０％または約４０％、５％または約５％～３０％または約３０％、５％または約５％～２０％または約２０％、５％または約５％～１０％または約１０％、１０％または約１０％～９９％または約９９％、１０％または約１０％～９０％または約９０％、１０％または約１０％～８０％または約８０％、１０％または約１０％～７０％または約７０％、１０％または約１０％～６０％または約６０％、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～９９％または約９９％、２０％または約２０％～９０％または約９０％、２０％または約２０％～８０％または約８０％、２０％または約２０％～７０％または約７０％、２０％または約２０％～６０％または約６０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～９９％または約９９％、３０％または約３０％～９０％または約９０％、３０％または約３０％～８０％または約８０％、３０％または約３０％～７０％または約７０％、３０％または約３０％～６０％または約６０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～９９％または約９９％、４０％または約４０％～９０％または約９０％、４０％または約４０％～８０％または約８０％、４０％または約４０％～７０％または約７０％、４０％または約４０％～７０％または約７０％、４０％または約４０％～６０％または約６０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、５０％または約５０％～９９％または約９９％、５０％または約５０％～９０％または約９０％、５０％または約５０％～８０％または約８０％、５０％または約５０％～７０％または約７０％、５０％または約５０％～６０％または約６０％、６０％または約６０％～９９％または約９９％、６０％または約６０％～９０％または約９０％、６０％または約６０％～８０％または約８０％、６０％または約６０％～７０％または約７０％、７０％または約７０％～９９％または約９９％、７０％または約７０％～９０％または約９０％、７０％または約７０％～８０％または約８０％、８０％または約８０％～９９％または約９９％、８０％または約８０％～９０％または約９０％、または９０％または約９０％～９９％または約９９％がうまく操作され、例えば、うまく形質導入され、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載されているように、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を含むベクターでうまく形質導入される。
一部の実施形態において、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの冷凍細胞を解凍して培養する。一部の実施形態において、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの１つの冷凍細胞バイアル、例えば、細胞、例えば、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢ細胞を８億または約８億個ずつ含む１つのバイアルを解凍して培養する。一部の実施形態において、冷凍した１次または２次ＭＣＢ細胞は、追加的なフィーダー細胞とともに培養して、２次または３次ＭＣＢとしてまたは注入型－完成医薬品への使用に適した細胞を生産する。一部の実施形態において、１次または２次ＭＣＢの共培養物から細胞を回収して冷凍する。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞供給源、１次ＭＣＢまたは２次ＭＣＢの共培養物から細胞を回収し、冷凍保存組成物、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物中に冷凍する。一部の実施形態において、細胞は、収穫した後に洗浄する。すなわち、本発明は、活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、例えば、本願に記載の方法により生産された活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、例えば、本願に記載の方法により生産された収獲および洗浄した活性化および刺激されたＮＫ細胞を含む、薬学的組成物、および冷凍保存組成物、例えば、本願に記載の冷凍保存組成物を提供する。
一部の実施形態において、細胞は、冷凍保存組成物と、例えば、本願に記載されているように、冷凍する前に、混合する。一部の実施形態において、細胞は、クライオバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）で冷凍する。一部の実施形態において、細胞は、クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）で冷凍する。
一部の実施形態において、本方法は、増幅および刺激したＮＫ細胞の集団からＮＫ細胞を単離することを追加的に含む。
ＮＫ細胞を増幅および刺激する工程の一例を図１に示す。
５．操作
一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞を、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載の異種のタンパク質、例えば、ＣＡＲおよび／またはＩＬ－１５を含む異種のタンパク質を発現するように操作することを追加的に含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を発現するように操作することは、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を暗号化するポリ核酸を含むベクターで形質転換、例えば、安定的に形質転換することを含む。適切なベクターは本願に記載される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞を本願に記載の異種のタンパク質を発現するように操作することは、異種のタンパク質を遺伝子編集（例、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、ＡＲＣＵＳ遺伝子編集、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集またはｍｅｇａＴＡＬ遺伝子編集）によりアデノ－随伴ウイルス（ＡＡＶ）技術と組み合わせて導入することを含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、本願に記載の異種のタンパク質を発現するように、例えば、フィーダー細胞を含む培地で組成物を培養する間、または培養した後に、操作される。
一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞を、例えば、遺伝子または遺伝子産物を発現するか、過剰発現、ノックアウトまたはノックダウンするように操作することを追加的に含む。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない。
Ｅ．増幅および刺激されたＮＫ細胞の特性
例えば、本願に記載されているように、生体外増幅および刺激した後、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、人体で自然的に生じ得ない数／密度（例、前述の通り）を有するだけでなく、その表現型特徴（例、遺伝子発現および／または表面タンパク質発現）も出発供給物質またはその他のＮＫ細胞の自然生成集団とは異なる。
場合によっては、出発ＮＫ細胞供給源は、ただ１つの個体、例えば、生体外増幅しない単一の臍帯血ユニットに由来するサンプルである。このため、場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、共通系統を共有し、すなわち、これらがすべて出発ＮＫ細胞供給源の増幅から生成され、よって、それ自体が単一有機体に由来する細胞集団のクローン増幅により遺伝子型を共有する。しかし、これらの細胞は、自然的には生体外増幅で達成される密度で発生できず、また、出発ＮＫ細胞供給源とは表現型特徴に差が存在する。
場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞を少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、遺伝子操作されていない。一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない。一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない。
増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、表面発現を、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ３８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ－１およびＮＫｐ４４のうちの１以上の表面発現を特徴とする。
本願で言及される表面タンパク質の発現レベルは、場合によっては、言及された特定のタンパク質に対して陽性選別しなくても、達成される。例えば、場合によっては、ＮＫ細胞供給源、例えば、単一臍帯血ユニットは、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、例えば、ＣＤ５６＋ＣＤ３－発現に対してゲーティングすることにより、ＣＤ５６＋濃縮およびＣＤ３（＋）枯渇処理されるが、増幅および刺激を行う間に他の表面タンパク質発現に対する選別は行わない。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４６＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ３０＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＤＮＡＭ－１＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＮＫｐ４４＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％でＣＤ９４＋（ＫＬＲＤ１）細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％でＣＤ３＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％でＣＤ１４＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％でＣＤ１９＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％でＣＸＣＲ＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％でＣＤ１２２＋（ＩＬ２ＲＢ）細胞を含む。
本願に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、本願に記載の方法により増幅および刺激したＮＫ細胞が増幅および刺激工程によりＣＤ１６を高いレベルに発現して、ＣＤ１６発現レベルが高い細胞集団が構築されることを知るようになった。ＣＤ１６の高い発現性は、増幅された細胞がＡＤＣＣを開示するのに重要なＣＤ１６を発現するように操作する必要性を省き、これは本願に記載の増幅および刺激方法の驚くべき予想外の利点である。このため、一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１６を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、ＮＫＧ２Ｄを発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、ＮＫｐ３０を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、ＤＮＡＭ－１を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４４を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
一部の実施形態において、ＮＫｐ４６を発現する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する、増幅および刺激されたＮＫ細胞の百分率は、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い。
本願に記載されているように、本発明者らは、驚くべきことに、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞がＣＤ３８を低いレベルに発現するということを知るようになった。ＣＤ３８は、特定の癌療法で（例えば、多発性骨髄腫および急性骨髄性白血病）有効な標的である。例えば、Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．，「ＣＤ３８：Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｃａｎｃｅｒｒｓ」，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ２９（１１）：１２９５－１３０８（２０２０）を参照する。しかし、抗－ＣＤ３８抗体をＮＫ細胞とともに投与する場合には、ＮＫ細胞が天然的にＣＤ３８を発現するので、フラトリサイド（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）が高くなる危険がある。しかし、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８を低いレベルに発現するので、よって、予想したフラトリサイドが解消する。他のグループでは、ＣＤ３８発現を低下させるためにゲノム編集のような操作方法に依存しているが（例、Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，「ＣＤ３８ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＤ３８ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｗｉｔｈ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ」，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ｄｏｉ：１０．３３２４／ｈａｅｍａｔｏｌ．２０２０．２７１９０８（２０２０）参照）、本願に記載の方法により増幅および刺激されたＮＫ細胞は、遺伝子操作しなくてもＣＤ３８を低いレベルに発現し、これは、本願に記載されているように増幅および刺激されたＮＫ細胞を、例えば、ＣＤ３８抗体と組み合わせて用いて、例えば、ＣＤ３８＋癌を治療するのに驚くべき予想外の利点を提供する。
このため、一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＣＤ３８＋細胞を８０％以下で、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下でＣＤ３８＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、８０％以下でＣＤ３８＋細胞を、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下でＣＤ３８＋細胞を含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、ＣＤ３８＋細胞を８０％以下で、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下で、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞を５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含む。
一部の実施形態において、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、前述のように、例えば、ただ１つの臍帯血ユニットの増幅および刺激に由来する増幅および刺激されたＮＫ細胞は、ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子およびＣＤ１６の１５８Ｖ／Ｖ変異体を両方とも含み、以下を含む：ｉ）５０％以上、例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のＣＤ１６＋ＮＫ細胞；および／またはｉｉ）８０％以下のＣＤ３８＋細胞、例えば、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下または２０％以下のＣＤ３８＋細胞；および／またはｉｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫＧ２Ｄ＋細胞；および／またはｉｖ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ４６＋細胞；および／またはｖ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ３０＋細胞；および／またはｖｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＤＮＡＭ－１＋細胞；および／またはｖｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＮＫｐ４４＋細胞；および／またはｖｉｉｉ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のＣＤ９４＋（ＫＬＲＤ１）細胞；および／またはｉｘ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ３＋細胞；および／またはｘ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１４＋細胞；および／またはｘｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１９＋細胞；および／またはｘｉｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＸＣＲ＋細胞；および／またはｘｉｉｉ）２０％以下、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下または０％のＣＤ１２２＋（ＩＬ２ＲＢ）細胞。
一部の実施形態において、フィーダー細胞の残留シグネチャー（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が、例えば、残留細胞の存在によって（例えば、特定の表面タンパク質発現を示す細胞を検出することにより）またはフィーダー細胞によって発現した残留核酸および／またはタンパク質によって検出されてもよいが、フィーダー細胞が増幅および刺激されたＮＫ細胞に存続するものではない。
例えば、場合によっては、本願に記載の方法は、操作されたフィーダー細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞などのナチュラルキラー細胞供給源中の細胞によって発現しない配列を発現するように操作された、前述のｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞を用いて、ナチュラルキラー細胞を増幅および刺激することを含む。例えば、操作されたフィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作できる。
これらのフィーダー細胞が増幅および刺激されたＮＫ細胞で存続しなくてもよいが、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、フィーダー細胞に由来する細胞、タンパク質および／または核酸を検出可能な残留量で保有することができる。したがって、増幅および刺激されたＮＫ細胞においてこのような残留物の存在は、例えば、細胞自体（例えば、フローサイトメトリー測定によって）、これらの細胞によって発現したタンパク質、および／またはこれらの細胞によって発現した核酸を検出することにより、検出することができる。
このため、本発明はまた、残留フィーダー細胞（生存細胞または死滅細胞）または残留フィーダー細胞の細胞性不純物（例えば、残留フィーダー細胞のタンパク質またはその一部、および／または核酸のような遺伝物質またはその一部）を含む増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を記載する。場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、残留フィーダー細胞、例えば、ｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞を０％より高くかつ０．３％以下のレベルで含む。
場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、残留４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）、および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）、またはこれらの一部を暗号化する残留フィーダー細胞を含む。場合によっては、膜－結合型ＩＬ－２１は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。
場合によっては、増幅および刺激されたＮＫ細胞は、例えば、サンプルにおいてフィーダー細胞特異的なタンパク質または核酸配列（すなわち、ナチュラルキラー細胞によって発現しないタンパク質または核酸配列）の相対的な比率によって、例えば、ｑＰＣＲによって、例えば、本願に記載されているように測定したことによって、０％超過および０．２％以下のフィーダー細胞の残留率％を含む。
一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞である。一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、操作されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞である。一部の実施形態において、残留フィーダー細胞は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および突然変異ＴＮＦα（配列番号３）（「ｅＨｕｔ－７８細胞」）、またはこれらの変異体からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を発現するように操作される。このため、場合によっては、フィーダー細胞特異的なタンパク質は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）である。したがって、フィーダー細胞特異的な核酸は、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４１２７３、配列番号１）、膜－結合型ＩＬ－２１（配列番号２）および／または突然変異ＴＮＦα（配列番号３）、またはその一部を暗号化する核酸である。場合によっては、膜－結合型ＩＬ－２１は、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。
非常に多様な種々の方法を用いて、生物学的サンプルにおいて核酸またはタンパク質遺伝子産物の存在を分析および検出することができる。本願に使用されているように、「検出」は、化合物および／または基質（例、細胞、タンパク質および／または核酸）の共存または存在を発見、確認または検証するために使用する方法を指すことができる。一部の実施形態において、検出方法を用いてタンパク質を検出することができる。一部の実施形態において、検出は、化学発光または蛍光手法を含むことができる。一部の実施形態において、検出は、抗体を用いてタンパク質全体またはタンパク質の特異的なエピトープと特異的に反応する免疫学に基づく方法（例えば、定量的酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティングまたはドットブロッティング）を含むことができる。一部の実施形態において、検出は、タンパク質の免疫沈降を含むことができる（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１；４１（２－３）：１１１－２０（１９９５）；Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ．３９（１）：３－２５（２００１））。一部の実施形態において、検出方法を用いて核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を検出することができる。一部の実施形態において、検出は、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護分析（ＮＰＡ）、インサイチュー混成化または逆転写－重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を含むことができる（Ｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５，８７７－８７９（２００８）；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ａｎａｌ．１１（１）：２－９（１９９７）；Ａｈｍｅｄ，Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｈｅａｌｔｈ Ｃ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇ Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ Ｒｅｖ．２０（２）：７７－１１６（２００２））。
このため、本発明はまた、操作されたフィーダー細胞、例えば、本願に記載のｅＨｕＴ－７８フィーダー細胞と共培養した、増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団、例えば、本願に記載の方法を用いて増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団を検出する方法を記載する。
ＩＩ．ナチュラルキラー細胞の操作
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、ＣＡＲ－ＮＫおよび／またはＩＬ－１５を発現するＮＫを生産するように操作される。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する間に、例えば、本願に記載の増幅および刺激する間に操作、例えば、形質導入される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する間に、例えば、本願に記載されているように、ＭＣＢを生産する間に、操作される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は増幅および刺激する間に、例えば、注射用－完成医薬品への使用に適したＮＫ細胞を生産する間に、および／または前述のようにＭＣＢを生産する間に、操作される。このため、一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、宿主細胞であり、本発明は、異種のタンパク質、例えば、前述のような異種のタンパク質を発現するＮＫ宿主細胞を提供する。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激する前に操作される。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、増幅および刺激した後に操作される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ベクターを用いた形質導入によって操作される。好適なベクターは本願に記載されており、例えば、レンチウイルスベクター、例えば、異種のタンパク質、例えば、本願に記載の異種のタンパク質を含むレンチウイルスベクターがある。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、本願に記載されているように、第１ＭＣＢを生産する間に形質導入される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１または約１～４０または約４０ウイルス粒子数／細胞で形質導入される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１または約１、５または約５、１０または約１０、１５または約１５、２０または約２０、２５または約２５、３０または約３０、３５または約３５、または４０または約４０ウイルス粒子数／細胞の感染多重度で形質導入される。
Ａ．キメラ抗原受容体
一部の実施形態において、異種のタンパク質は、融合タンパク質であり、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む融合タンパク質は、ＮＫ細胞に、例えば、増幅および刺激工程中に導入される。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、以下の１つ以上を含む：シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列。一部の実施形態において、ＣＡＲは、スペーサ配列を追加的に含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、スペーサ、膜貫通ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン配列、第２シグナル伝達ドメイン配列および第３シグナル伝達ドメイン配列を含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）シグナル配列、細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、第１シグナル伝達ドメイン配列、第２シグナル伝達ドメイン配列および第３シグナル伝達ドメイン配列を含む。
一部の実施形態において、細胞外ドメインは、抗体またはその抗原－結合部分を含む。
一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列である。一部の実施形態において、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列は、配列番号５を含むか、または配列番号５で構成される。
一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＯＸ４０Ｌシグナル伝達配列である。一部の実施形態において、ＯＸ４０Ｌシグナル伝達配列は、配列番号８を含むか、または配列番号８で構成される。
一部の実施形態において、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン配列は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン配列である。一部の実施形態において、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列は、配列番号１１を含むか、または配列番号１１で構成される。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列（配列番号５）、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達配列（配列番号８）およびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列（配列番号１１）を含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１９を含むか、または配列番号１９で構成された細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達ドメイン配列を含まない。
一部の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達配列（配列番号５）とＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達配列（配列番号１１）を含むが、ＯＸ４０Ｌ細胞内シグナル伝達ドメイン配列は含まない。
Ｂ．ＩＬ－１５
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５、例えば、ヒトＩＬ－１５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ＃Ｐ４０９３３；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ＃３６００）、例えば、溶解性ヒトＩＬ－１５またはそのオルソログ、または前述の任意のものの変異体を発現するように操作される。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、切断部位を追加的に含む融合タンパク質の一部として発現する。一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列部位（時々、自己－切断部位と言及される）を含むポリタンパク質の一部として発現する。
一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、配列番号１６を含むか、またはそれで構成される。
一部の実施形態において、Ｔ２Ａ切断部は、配列番号１４を含むか、または配列番号１４で構成される。
一部の実施形態において、ＩＬ－１５は、ＣＡＲ、例えば、本願に記載のＣＡＲを含む融合タンパク質の一部として発現する。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、（Ｎ－末端からＣ－末端方向に）ＣＡＲ、切断部位およびＩＬ－１５を含む。
一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２０を含む。
Ｃ．阻害性受容体
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１つ以上の阻害性受容体遺伝子の発現を変更するように、例えば、低下させるように操作される。
一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＨＬＡ－特異的な阻害性受容体である。一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＨＬＡ－非特異的な阻害性受容体である。
一部の実施形態において、阻害性受容体遺伝子は、ＫＩＲ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＬＩＬＲＢ１、ＰＤ－１、ＩＲｐ６０、Ｓｉｇｌｅｃ－７、ＬＡＩＲ－１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
Ｄ．ポリ核酸、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、融合タンパク質またはその一部を暗号化するポリ核酸、例えば、本願に提供された配列の表に示しているように、本願に記載のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を提供する。
さらに、本発明は、ポリ核酸を含むベクター、およびこのようなベクターを含む細胞、例えば、ＮＫ細胞を提供する。
一部の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」，Ｌｅｕｋｅｍｉａ３２：１５２９－４１（２０１８）を参照する。一部の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ガンマレトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、非－ウイルス性ベクター、例えば、ピギーバック非－ウイルスベクター（ＰＢトランスポゾン、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，「ｐｉｇｇｙｂａｃｋ ｉｓ ａ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ａｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ，Ｔｏｌ２，ａｎｄ Ｍｏｓ１ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」，ＰＮＡＳ１０３（４１）：１５００８－１３（２００６））、スリーピングビューティー非－ウイルス性ベクター（ＳＢ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｏｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ：ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｒｅａｋｓ ｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｄｅ」，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５２（４）：３５５－３８０（２０１７）参照）、またはｍＲＮＡベクターである。
ＩＩＩ．冷凍保存
Ａ．冷凍保存組成物
本発明は、冷凍保存組成物、例えば、静脈内投与に、例えば、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を静脈内投与するのに適した冷凍保存組成物を提供する。一部の実施形態において、薬学的組成物は、冷凍保存組成物および細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を含む。
１．アルブミン
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ０２７８、配列番号２１）、またはその変異体を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質のオルソログ、またはその変異体を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンの生物学的活性部分、またはその変異体を含む。
一部の実施形態において、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンは、溶液として提供され、これはまた、本願においてアルブミン溶液またはヒトアルブミン溶液と称される。このため、一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミン溶液、例えば、ヒトアルブミン溶液であるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、無血清アルブミン溶液である。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、静脈内使用に適合する。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミンを４０または約４０～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを４０または約４０～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、アルブミン、例えば、ヒトアルブミンを２００ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、９５％以上がアルブミンタンパク質、例えば、ヒトアルブミンタンパク質であるタンパク質組成物を含む。一部の実施形態において、タンパク質の９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上がアルブミン、例えば、ヒトアルブミンである。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを追加的に含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを１００または約１００～２００または約２００ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ソジウムを１３０または約１３０～１６０または約１６０ｍｍｏｌ含む。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを追加的に含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを３ｍｍｏｌ以下含む。一部の実施形態において、アルブミン溶液は、ポタシウムを２ｍｍｏｌ以下で追加的に含む。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、１つ以上の安定化剤を追加的に含む。一部の実施形態において、安定化剤は、ソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、１つ以上の安定化剤をそれぞれ０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、溶液中のタンパク質１ｇあたり、安定化剤をそれぞれ０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、溶液は、溶液中のタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。
一部の実施形態において、アルブミン溶液は、水中の、アルブミンタンパク質が９５％以上のタンパク質組成物、ソジウム、ポタシウムおよびソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される１つ以上の安定化剤で構成される。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、アルブミン溶液、例えば、本願に記載のアルブミン溶液を１０％ｖ／ｖまたは約１０％ｖ／ｖ～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｖ／ｖで本願に記載のアルブミン溶液を含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０または約２０～１００または約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０または約２０～１００または約１００、２０または約２０～９０または約９０、２０または約２０～８０または約８０、２０または約２０～７０または約７０、２０または約２０～６０または約６０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、３０または約３０～１００または約１００、３０または約３０～９０または約９０、３０または約３０～８０または約８０、３０または約３０～７０または約７０、３０または約３０～６０または約６０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４０または約４０、４０または約４０～１００または約１００、４０または約４０～９０または約９０、４０または約４０～８０または約８０、４０または約４０～７０または約７０、４０または約４０～６０または約６０、４０または約４０～５０または約５０、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～９０または約９０、５０または約５０～８０または約８０、５０または約５０～７０または約７０、５０または約５０～６０または約６０、６０または約６０～１００または約１００、６０または約６０～９０または約９０、６０または約６０～８０または約８０、６０または約６０～７０または約７０、７０または約７０～１００または約１００、７０または約７０～９０または約９０、７０または約７０～８０または約８０、８０または約８０～１００または約１００、８０または約８０～９０または約９０、または９０または約９０～１００または約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、２０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、４０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、７０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約２０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約４０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約７０ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１００ｇ／ｌでアルブミン、例えば、ヒトアルブミンを含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、安定化剤、例えば、アルブミン安定化剤を追加的に含む。一部の実施形態において、安定化剤は、ソジウムカプリレート、カプリル酸、（２Ｓ）－２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（本願においてまた、次のように称される：アセチルトリプトファン、Ｎ－アセチル－Ｌ－トリプトファンおよびアセチル－Ｌ－トリプトファン）、２－アセトアミド－３－（１Ｈ－インドール－３－イル）プロパン酸（また、次のように称される：Ｎ－アセチルトリプトファン、ＤＬ－アセチルトリプトファンおよびＮ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン）からなる群より選択される。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、１つ以上の安定化剤をそれぞれ０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、安定化剤をそれぞれ０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、冷凍保存組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．１ｍｍｏｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、冷凍保存組成物中のタンパク質、例えば、アルブミンタンパク質１ｇあたり、全体安定化剤を０．０５または約０．０５～０．１または約０．１、例えば、０．０６４または約０．０６４～０．０９６または約０．０９６ｍｍｏｌ含む。
２．デキストラン
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストランまたはその誘導体を含む。
デキストランは、約９５％がα－Ｄ－（１－６）連結で構成されたアンハイドログルコースポリマー（（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎと名付けられる）である。デキストラン分画は、分子量約１，０００ダルトン～約２，０００，０００ダルトンで提供される。これは番号（デキストランＸ）で、例えば、デキストラン１、デキストラン１０、デキストラン４０、デキストラン７０などで表示し、ここで、Ｘは、平均分子量を１，０００ダルトンで割ったものである。そのため、例えば、デキストラン４０は、平均分子量が４０，０００ダルトンまたは約４０，０００ダルトンである。
一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、１，０００ダルトンまたは約１，０００ダルトン～２，０００または約２，０００，０００ダルトンである。一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、４０，０００ダルトンまたは約４０，０００ダルトンである。一部の実施形態において、デキストランの平均分子量は、７０，０００ダルトンまたは約７０，０００ダルトンである。
一部の実施形態において、デキストランは、デキストラン４０、デキストラン７０、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態において、デキストランは、デキストラン４０である。
一部の実施形態において、デキストラン、例えば、デキストラン４０は、溶液として、また、本願で言及されるように、デキストラン溶液としてまたはデキストラン４０溶液として提供される。したがって、一部の実施形態において、組成物は、デキストラン溶液、例えば、デキストラン４０溶液を含む。
一部の実施形態において、デキストラン溶液は、静脈内使用に適合する。
一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約５％～約５０％ｗ／ｗ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、５％または約５％～５０％または約５０％、５％または約５％～４５％または約４５％、５％または約５％～４０％または約４０％、５％または約５％～３５％または約３５％、５％または約５％～３０％または約３０％、５％または約５％～２５％または約２５％、５％または約５％～２０％または約２０％、５％または約５％～１５または約１５％、５％または約５％～１０％または約１０％、１０％または約１０％～５０％または約５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｗ／ｗでデキストラン、例えば、デキストラン４０を含む。
一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を２５または約２５ｇ／ｌ～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を３５または約３５～２００または約２００、２５または約２５～１７５または約１７５、２５または約２５～１５０または約１５０、２５または約２５～１２５または約１２５、２５または約２５～１００または約１００、２５または約２５～７５または約７５、２５または約２５～５０または約５０、５０または約５０～２００または約２００、５０または約５０～１７５または約１７５、５０または約５０～１５０または約１５０、５０または約５０～１２５または約１２５、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～７５または約７５、７５または約７５～２００または約２００、７５または約７５～１７５または約１７５、７５または約７５～１５０または約１５０、７５または約７５～１２５または約１２５、７５または約７５～１００または約１００、１００または約１００～２００または約２００、１００または約１００～１７５または約１７５、１００または約１００～１５０または約１５０、１００または約１００～１２５または約１２５、１２５または約１２５～２００または約２００、１２５または約１２５～１７５または約１７５、１２５または約１２５～１５０または約１５０、１５０または約１５０～２００または約２００、１５０または約１５０～１７５または約１７５、または１７５または約１７５～２００または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約１００ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコース（また、次のように称される：デキストロース）を追加的に含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０または約１０ｇ／ｌ～１００または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０または約１０～１００または約１００、１０または約１０～９０または約９０、１０または約１０～８０または約８０、１０または約１０～７０または約７０、１０または約１０～６０または約６０、１０または約１０～５０または約５０、１０または約１０～４０または約４０、１０または約１０～３０または約３０、１０または約１０～２０または約２０、２０または約２０～１００または約１００、２０または約２０～９０または約９０、２０または約２０～８０または約８０、２０または約２０～７０または約７０、２０または約２０～６０または約６０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、３０または約３０～１００または約１００、３０または約３０～９０または約９０、３０または約３０～８０または約８０、３０または約３０～７０または約７０、３０または約３０～６０または約６０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４０または約４０、４０または約４０～１００または約１００、４０または約４０～９０または約９０、４０または約４０～８０または約８０、４０または約４０～７０または約７０、４０または約４０～６０または約６０、４０または約４０～５０または約５０、５０または約５０～１００または約１００、５０または約５０～９０または約９０、５０または約５０～８０または約８０、５０または約５０～７０または約７０、５０または約５０～６０または約６０、６０または約６０～１００または約１００、６０または約６０～９０または約９０、６０または約６０～８０または約８０、６０または約６０～７０または約７０、７０または約７０～１００または約１００、７０または約７０～９０または約９０、７０または約７０～８０または約８０、８０または約８０～９０または約９０、８０または約８０～１００または約１００、８０または約８０～９０または約９０、または９０または約９０～１００または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、デキストラン溶液は、グルコースを５０ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、デキストラン溶液は、水中の、デキストラン、例えば、デキストラン４０、およびグルコースで構成される。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、本願に記載のデキストラン溶液を１０％または約１０％ｖ／ｖ～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を１０％または約１０％～５０％、１０％または約１０％～４５％または約４５％、１０％または約１０％～４０％または約４０％、１０％または約１０％～３５％または約３５％、１０％または約１０％～３０％または約３０％、１０％または約１０％～２５％または約２５％、１０％または約１０％～２０％または約２０％、１０％または約１０％～１５または約１５％、１５％または約１５％～５０％または約５０％、１５％または約１５％～４５％または約４５％、１５％または約１５％～４０％または約４０％、１５％または約１５％～３５％または約３５％、１５％または約１５％～３０％または約３０％、１５％または約１５％～２５％または約２５％、１５％または約１５％～２０％または約２０％、２０％または約２０％～５０％または約５０％、２０％または約２０％～４５％または約４５％、２０％または約２０％～４０％または約４０％、２０％または約２０％～３５％または約３５％、２０％または約２０％～３０％または約３０％、２０％または約２０％～２５％または約２５％、２５％または約２５％～５０％または約５０％、２５％または約２５％～４５％または約４５％、２５％または約２５％～４０％または約４０％、２５％または約２５％～３５％または約３５％、２５％または約２５％～３０％または約３０％、３０％または約３０％～５０％または約５０％、３０％または約３０％～４５％または約４５％、３０％または約３０％～４０％または約４０％、３０％または約３０％～３５％または約３５％、３５％または約３５％～５０％または約５０％、３５％または約３５％～４５％または約４５％、３５％または約３５％～４０％または約４０％、４０％または約４０％～５０％または約５０％、４０％または約４０％～４５％または約４５％、または４５％または約４５％～５０％または約５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン溶液、例えば、本願に記載のデキストラン溶液を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％ｖ／ｖ含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０または約１０～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０または約１０～５０または約５０、１０または約１０～４５または約４５、１０または約１０～４０または約４０、１０または約１０～３５または約３５、１０または約１０～３０または約３０、１０または約１０～２５または約２５、１０または約１０～２０または約２０、１０または約１０～１５または約１５、１５または約１５～５０または約５０、１５または約１５～４５または約４５、１５または約１５～４０または約４０、１５または約１５～３５または約３５、１５または約１５～３０または約３０、１５または約１５～２５または約２５、１５または約１５～２０または約２０、２０または約２０～５０または約５０、２０または約２０～４５または約４５、２０または約２０～４０または約４０、２０または約２０～３０または約３０、２０または約２０～２５または約２５、２５または約２５～５０または約５０、２５または約２５～４５または約４５、２５または約２５～４０または約４０、２５または約２５～３５または約３５、２５または約２５～３０または約３０、３０または約３０～５０または約５０、３０または約３０～４５または約４５、３０または約３０～４０または約４０、３０または約３０～３５または約３５、３５または約３５～５０または約５０、３５または約３５～４５または約４５、３５または約３５～４０または約４０、４０または約４０～５０または約５０、４０または約４０～４５または約４５、または４５または約４５～５０または約５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を１０、１５、２０、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、デキストラン、例えば、デキストラン４０を約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ｇ／ｌ含む。
３．グルコース
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを含む。
一部の実施形態において、本願に記載されているように、冷凍保存組成物は、グルコースを含むデキストラン溶液を含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを含まないデキストラン溶液を含む。一部の実施形態において、例えば、デキストラン溶液にグルコースが含まれない場合、グルコースは、冷凍保存組成物に別途に添加される。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５または約５～２５または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５または約５～２５または約２５、５または約５～２０または約２０、５または約５～１５または約１５、５または約５～１０または約１０、１０または約１０～２５または約２５、１０または約１０～２０または約２０、１０または約１０～１５または約１５、１５または約１５～２５または約２５、１５または約１５～２０または約２０、または２０または約２０～２５または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５または２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを１２．５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを約５、約７．５、約１０、約１２．５、約１５、約１７．５、約２０、約２２．５、または約２５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを約１２．５ｇ／ｌ含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２．７５％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２７．５ｇ／ｌ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを２％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを１．５％ｗ／ｖ未満で含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、約１．２５％ｗ／ｖ以下含む。
４．ジメチルスルホキシド
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、メチルスルホキシドおよびメチルスルフィニルメタンともいう）を含む。
一部の実施形態において、ＤＭＳＯは、本願においてＤＭＳＯ溶液とも言及される溶液として提供される。このため、一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を含む。
一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、静脈内使用に適合する。
一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、ＤＭＳＯを１．１ｇ／ｍｌ含む。一部の実施形態において、ＤＭＳＯ溶液は、ＤＭＳＯを約１．１ｇ／ｍｌ含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％または約１％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％または約１％～１０％または約１０％、１％または約１％～９％または約９％、１％または約１％～８％または約８％、１％または約１％～７％または約７％、１％または約１％～６％または約６％、１％または約１％～５％または約５％、１％または約１％～４％または約４％、１％または約１％～３％または約３％、１％または約１％～２％または約２％、２％または約２％～１０％または約１０％、２％または約２％～９％または約９％、８％または約８％、２％または約２％～７％または約７％、２％または約２％～６％または約６％、２％または約２％～５％または約５％、２％または約２％～４％または約４％、２％または約２％～３％または約３％、３％または約３％～１０％または約１０％、３％または約３％～９％または約９％、３％または約３％～８％または約８％、３％または約３％～７％または約７％、３％または約３％～６％または約６％、３％または約３％～５％または約５％、３％または約３％～４％または約４％、４％または約４％～１０％または約１０％、４％または約４％～９％または約９％、４％または約４％～８％または約８％、４％または約４％～７％または約７％、４％または約４％～６％または約６％、４％または約４％～５％または約５％、５％または約５％～１０％または約１０％、５％または約５％～９％または約９％、５％または約５％～８％または約８％、５％または約５％～７％または約７％、５％または約５％～６％または約６％、６％または約６％～１０％または約１０％、６％または約６％～９％または約９％、６％または約６％～８％または約８％、６％または約６％～７％または約７％、７％または約７％～１０％または約１０％、７％または約７％～９％または約９％、７％または約７％～８％または約８％、８％または約８％～１０％または約１０％、８％または約８％～９％または約９％、または９％または約９％～１０％または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を５％含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％ｖ／ｖ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯ溶液を約５％含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１または約１１～１１０または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１または約１１～１１０または約１１０、１１または約１１～９９または約９９、１１または約１１～８８または約８８、１１または約１１～７７または約７７、１１または約１１～６６または約６６、１１または約１１～５５または約５５、１１または約１１～４４または約４４、１１または約１１～３３または約３３、１１または約１１～２２または約２２、２２または約２２～１１０または約１１０、２２または約２２～９９または約９９、２２または約２２～８８または約８８、２２または約２２～７７または約７７、２２または約２２～７７または約７７、２２または約２２～６６または約６６、２２または約２２～５５または約５５、２２または約２２～４４または約４４、２２または約２２～３３または約３３、３３または約３３～１１０または約１１０、３３または約３３～９９または約９９、３３または約３３～８８または約８８、３３または約３３～７７または約７７、３３または約３３～６６または約６６、３３または約３３～５５または約５５、３３または約３３～４４または約４４、４４または約４４～１１０または約１１０、４４または約４４～９９または約９９、４４または約４４～８８または約８８、４４または約４４～７７または約７７、４４または約４４～６６または約６６、４４または約４４～５５または約５５、５５または約５５～１１０または約１１０、５５または約５５～９９または約９９、５５または約５５～８８または約８８、５５または約５５～７７または約７７、５５または約５５～６６または約６６、６６または約６６～１１０または約１１０、６６または約６６～９９または約９９、６６または約６６～８８または約８８、６６または約６６～７７または約７７、７７または約７７～１１９または約１１９、７７または約７７～８８または約８８、８８または約８８～１１０または約１１０、８８または約８８～９９または約９９、または９９または約９９～１１０または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを１１、２２、３３、４４、５５、６６、７７、８８、９９または１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを５５ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを約１１、約２２、約３３、約４４、約５５、約６６、約７７、約８８、約９９、または約１１０ｇ／ｌ含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、ＤＭＳＯを約５５ｇ／ｌ含む。
５．緩衝剤
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、緩衝剤溶液、例えば、静脈内投与に適した緩衝剤溶液を含む。
緩衝剤溶液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、Ｔｙｒｏｄｅの緩衝剤、Ｈａｎｋの平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｅａｒｌｅの平衡塩溶液、塩水およびトリスなどがあるが、これらに限定されるものではない。
一部の実施形態において、緩衝剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
６．例示的な冷凍保存組成物
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、以下の構成成分を含むか、またはそれらで構成される：１）アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２）デキストラン、例えば、デキストラン４０、３）ＤＭＳＯ、および４）緩衝剤溶液。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、グルコースを追加的に含む。一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２）デキストラン、例えば、デキストラン４０、３）グルコース、４）ＤＭＳＯ、および５）緩衝剤溶液で構成される。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）本願に記載のアルブミン溶液、２）本願に記載のデキストラン溶液、３）本願に記載のＤＭＳＯ溶液、および４）緩衝剤溶液を含む。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、１）本願に記載のアルブミン溶液、２）本願に記載のデキストラン溶液、３）本願に記載のＤＭＳＯ溶液、および４）緩衝剤溶液で構成される。
一部の実施形態において、冷凍保存組成物は、細胞培養培地を含まない。
一実施形態において、冷凍保存組成物は、約４０ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む。
一実施形態において、冷凍保存組成物は、水中の、約４０ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコース、５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ、および０．５ｍｌ／ｍｌの１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、またはそれらで構成される。
一実施形態において、冷凍保存組成物は、約３２ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む。
一実施形態において、冷凍保存組成物は、水中の、約３２ｍｇ／ｍｌヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコース、５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ、および０．５４ｍｌ／ｍｌの１００％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むか、またはそれらで構成される。
冷凍保存組成物の例を表３に示す。
Ｂ．冷凍保存法
本願に記載の冷凍保存組成物は、細胞、例えば、治療学的細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞を冷凍保存するために用いることができる。
一部の実施形態において、細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞は、好塩球、好酸球、好中球、肥満細胞、単核球、大食細胞、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびこれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、本願に記載の方法により増幅および刺激される。
一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞を本願に記載の冷凍保存組成物またはその構成成分と混合して組成物、例えば、薬学的組成物を製造する段階；および混合物を冷凍する段階を含む。
一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞を含む組成物を、本願に記載の冷凍保存組成物またはその構成成分と混合して組成物、例えば、薬学的組成物を製造する段階；混合物を冷凍する段階を含む。一部の実施形態において、細胞を含む組成物は、細胞および緩衝剤を含む。好適な緩衝剤は本願に記載されている。
一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物を、アルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯを、例えば、本願に記載されているように含む組成物と混合する段階；混合物を冷凍する段階を含む。
一部の実施形態において、細胞の冷凍保存は、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを１：１で含む組成物を４０ｍｇ／ｍｌアルブミン、例えば、ヒトアルブミン、２５ｍｇ／ｍｌデキストラン、例えば、デキストラン４０、１２．５ｍｇ／ｍｌグルコースおよび５５ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯを含む組成物と混合する段階を含む。
一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、細胞を２×１０７または約２×１０７～２×１０９または約２×１０９細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、２×１０８細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、細胞および緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含む組成物は、約２×１０８細胞／ｍｌを含む。
一部の実施形態において、細胞冷凍保存は、細胞、緩衝剤、例えば、ＰＢＳ、アルブミン、例えば、ヒトアルブミン、デキストラン、例えば、デキストラン４０およびＤＭＳＯを混合する段階；混合物を冷凍する段階を含む。
一部の実施形態において、混合物は、１×１０７または約１×１０７～１×１０９または約１×１０９細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、混合物は、１×１０８細胞／ｍｌを含む。一部の実施形態において、混合物は、約１×１０８細胞／ｍｌを含む。
適切なアルブミン、デキストランおよびＤＭＳＯの範囲は上記に記載される。
一部の実施形態において、組成物は、－１３５℃以下で冷凍する。
一部の実施形態において、組成物は、制御された速度で冷凍する。
ＩＶ．抗体
一部の実施形態において、ＥＧＦＲ標的抗体は、表６から選択されるＥＧＦＲ標的抗体、またはこれらの組み合わせである。
一部の実施形態において、ＥＧＦＲ標的抗体は、セツキシマブ（またはそのバイオシミラー）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（またはそのバイオシミラー）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）（またはそのバイオシミラー）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、ＥＧＦＲ標的抗体は、セツキシマブまたはそのバイオシミラーから選択される。一部の実施形態において、ＥＧＦＲ標的抗体は、セツキシマブである。
一部の実施形態において、セツキシマブのバイオシミラーは、ＣＤＰ１（Ｄｒａｇｏｎｂｏａｔ Ｂｉｏｐｈａｒｍｃａｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０４７３９１１１（２０２１），ＮＣＴ０４１５１８１０（２０１９），ＮＣＴ０３８８１７８７（２０１９）およびＮＣＴ０３４９１７０９（２０１８），ＣＭＡＢ００９（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＢｉｏＭａｂ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０３２０６１５１（２０１７），ＮＣＴ０１５５００５５（２００９）；ＷＯ２０１６１１０２２６；ＵＳ２０１８００３０１３９；ＵＳ１０１１８９６６；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，「ＣＭＡＢ００９ ｐｌｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｖｅｒｓｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ－ｏｎｌｙ ａｓ ｓｅｃｏｎｄ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ＫＲＡＳ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，ｏｐｅｎ－ｌａｂｅｌ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ」，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍ（Ｌｏｎｄ）３９：２９（２０１９）），ＫＬ－１４０（Ｓｉｃｈｕａｎ Ｋｅｌｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ；ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０３４２６３７１），ＡＢＰ４９４（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．；Ａｍｇｅｎ），ＨＬＸ０５（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｌｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．；ＷＯ２０１５１８４４０３；ＵＳ２０１７０２１８０７３），およびＳＴＩ－００１（Ｍａｂｔｅｃｈ；Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＷＯ２０１７１２０６１３；ＵＳ２０１７０２４７４５８）からなる群より選択される。
Ｖ．薬学的組成物
本発明は、本願に記載のナチュラルキラー細胞を含む薬学的組成物および本願に記載の薬学的組成物の投薬単位（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ）を提供する。
場合によっては、投薬単位は、細胞を１億～１５億、例えば、１億、２億、３億、４億、５億、６億、７億、８億、９億、１０億、１１億、１２億、１３億、１４億または１５億個含む。
薬学的組成物は、典型的に薬剤学的に許容可能な担体を含む。本願に使用されているように、用語「薬剤学的に許容可能な担体」は、薬学的投与に適した、食塩水、溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などがある。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、ａ）本願に記載のナチュラルキラー細胞；およびｂ）冷凍保存組成物を含む。
好適な冷凍保存組成物は本願に記載される。
一部の実施形態において、組成物は、冷凍する。一部の実施形態において、組成物は、少なくとも３ヶ月間、例えば、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１５ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間または少なくとも３６ヶ月間冷凍保存する。
一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞の少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％が解凍後に生存する。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、ａ）本願に記載の冷凍保存組成物；およびｂ）治療学的細胞を含む。
一部の実施形態において、治療学的細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、治療学的細胞は、ヒト細胞である。
一部の実施形態において、治療学的細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞は、好塩球、好酸球、好中球、肥満細胞、単核球、大食細胞、好中球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびこれらの組み合わせから選択される。
一部の実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態において、ナチュラルキラー細胞は、本願に記載の方法により増幅および刺激される。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、ｃ）緩衝剤溶液を追加的に含む。適切な緩衝剤溶液は、例えば、冷凍保存組成物について本願に記載された通りである。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を１×１０７細胞／ｍｌまたは約１×１０７～１×１０９細胞／ｍｌまたは約１×１０９細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を１×１０８細胞／ｍｌ含む。一部の実施形態において、薬学的組成物は、細胞を約１×１０８細胞／ｍｌ含む。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、本願に記載の抗体を追加的に含む。
薬学的組成物は、典型的に意図した投与経路に合わせて剤形化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、真皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与などがある。
適切な薬学的組成物を剤形化する方法が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ ｅｄ．，２００５；およびｔｈｅ ｂｏｏｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）を参照する。例えば、非経口、真皮内または皮下用途に使用される溶液剤または懸濁剤は、以下のような成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水、固定オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート、および緊張度調節剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを滴定可能である。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは多重投薬バイアル内に封入することができる。
注射用途に適した薬学的組成物は、無菌注射溶液剤または分散剤を即席製造するための無菌酸剤および無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液を網羅することができる。静脈内投与する場合、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などがある。いずれの場合も、組成物は無菌性でなければならず、容易に注射できるほど流動性でなければならない。これは製造および保管条件で安定的でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒質であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いることにより、分散剤の場合、必要な粒子サイズを維持することにより、そして界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物作用の防止は、多様な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に添加することが好ましい。組成物に、吸収を遅延する物質、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含有させることにより、注射用組成物の吸収を遅らせることができる。
無菌注射用溶液は、活性化合物を必要な量で適切な溶媒に前記列挙した成分の１つまたはその組み合わせとともに投入し、必要に応じて濾過滅菌を行うことにより、製造することができる。一般的に、分散剤は、活性化合物を基本分散媒質と前記列挙されたものに由来する他の必須成分を含む無菌ビヒクルに投入することにより製造する。無菌注射用溶液剤を製造するための無菌酸剤の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって活性成分と以前に滅菌－濾過した溶液に由来する任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる。
ＶＩ．治療方法
本願に記載のＮＫ細胞は、癌またはその他の増殖性障害の治療用途を有する。
このため、また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＥＧＦＲ標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、障害、例えば、癌関連障害、例えば、ＥＧＦＲ＋癌を患っている患者を治療する方法を提供する。
また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＥＧＦＲ標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において癌細胞または癌細胞集団の再発、生長、増殖、移動および／または転移を防止、減少および／または阻害する方法を提供する。
さらに、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＥＧＦＲ標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において抗癌療法に対する反応を強化、改善および／または高める方法を提供する。
抗－ＥＧＦＲ抗体の使用は、患者が抗体の最適な用量の投与を受けたり、または容認できないように妨げる毒性を誘発することがある。場合によっては、患者が用量を減らしたり、投与を省略または遅らせたり、または治療を完全に中断しなければならないこともある。このように、抗－ＥＧＦＲ抗体の副作用は、薬物の効能を減少させることがある。本願に記載のＮＫ細胞と抗－ＥＧＦＲ抗体との組み合わせは、抗体のＡＤＣＣ効果を強化することにより、所定量の抗体の効能を高めることができる。このように、患者はより少ない用量で抗体を投与しながらも、依然として最適または強化された効能を達成することができる。これは患者がセツキシマブをはじめとする抗－ＥＧＦＲ抗体に関連する一部の副作用を回避できるようにする。患者は治療サイクルを完了できたり、そのまたはそれとは異なり、ＮＫ細胞なしに完了できないことがある。これとともに、抗－ＥＧＦＲ抗体は、患者が深刻な副作用を経験するまで投与する場合が多いので、より少ない用量の抗体とＮＫ細胞を投与することにより、抗体の単独使用時、深刻な副作用がある時にのみ可能な水準の効能の利点を患者に提供することができる。
また、本発明は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、およびＥＧＦＲ標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を投与することを含む、必要な個体において免疫システムを誘発する方法を提供する。
本願に記載の方法は、異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する障害、例えば、細胞増殖性障害または細胞性分化障害、例えば、固形腫瘍および造血癌のような癌を治療する方法を含む。一般的に、本方法は、本願に記載されているような治療剤を治療学的有効量で必要な個体または治療が必要と決定された個体に投与することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞およびＥＧＦＲ標的抗体、例えば、本願に記載の抗体を含む治療剤を治療学的有効量で投与することを含む。
本願に使用されているように、用語「治療」、「治療する」および「治療する」は、異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する障害の退行、緩和、開始遅延または進行阻害を意味する。例えば、治療は、腫瘍サイズまたは生長速度の減少を達成することができる。本願に記載の化合物を異常なアポトーシス工程または分化工程に関連する病態を治療するために治療学的有効量で投与すれば、特に腫瘍サイズの低下または生長速度の減少、再発危険または頻度減少、再発遅延、転移減少、生存性増加および／または罹患率および死亡率の減少が達成されるであろう。一部の実施形態において、治療剤は、１つ以上の症状が発現した後に投与することができる。他の実施形態において、治療剤は、症状がない状態で投与してもよい。例えば、治療剤は、症状が開始される前に（例えば、症状の病歴に照らしておよび／または遺伝学的またはその他の感受性要因に照らして）感受性個体に投与してもよい。治療剤はまた、症状が解消した後も、例えば、再発を防止または遅延するために引き続き投与可能である。
本願に使用されているように、用語「阻害」は、癌および／または癌細胞の増殖に関連して、細胞毒性、営養分の枯渇またはアポトーシスの誘導によって、個別的にまたは他の癌細胞と集合的に癌細胞の生長、分裂、成熟または生存性の阻害および／または癌細胞の死滅誘発を意味する。
本願に使用されているように、疾患または障害、またはその１つ以上の症状の進行「遅延」は、疾患、障害またはその症状の発生を遅らせたり、妨げたり、遅くしたり、遅滞させたり、安定化したりおよび／または延期することを意味する。遅延は、疾患の病歴および／または治療中の個体によって多様な時間の長さであってもよい。当該技術分野における当業者に自明なように、十分なまたは著しい遅延は、事実上、個体において疾患、障害またはその症状が発生しないという点で、予防を包括する。例えば、癌発生を「遅延する」方法は、当該方法を利用しない場合と比較して、所定の時間範囲の間疾患の発生確率を低下させたり、および／または所定の時間範囲の間疾患の程度を低下させる方法である。このような比較は、統計学的に有意な個体数を用いた臨床実験に基づくことができる。
本願に使用されているように、「予防」または「予防する」は、疾患の臨床症状が発生しないように疾患または障害が開始されないように防止する用法を指す。したがって、「予防」は、疾患の兆候が個体から検出可能になる前に、および／または疾患の特定の病期に到達する前に（例えば、癌がまだ転移していない患者に治療学的物質の投与）個体に療法（例えば、治療学的物質の投与）を実施することに関連がある。個体は、疾患または障害発生の危険があったり、または疾患進行の危険がある、例えば、癌転移危険がある個体、例えば、疾患または障害の発生または開始に関連することが知られた１つ以上の危険因子を有する個体であってもよい。例えば、個体は、癌の発生または進行に関連する突然変異を保有することができる。さらに、予防は、疾患または障害の開始に対して完璧な防止が達成されないことが理解される。場合によっては、予防は、疾患または障害の発病危険の低下を含む。危険の低下は、疾患または障害の発病危険の完璧な消滅を達成しなくてもよい。
（例えば、抗腫瘍反応、癌細胞の転移に関連して）「増加した」または「強化された」程度は、本願に言及された量または水準に対して１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれより高い倍数（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）の増加を指す（言及された整数間の１より大きいすべての整数および少数値を網羅する、例えば、２．１、２．２、２．３、２．４など）。これはまた、本願に言及された量または水準に対する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％の増加を網羅することができる。
（例えば、腫瘍サイズ、癌細胞の増殖または生長に関連して）「減少した」または「低下した」または「より少ない」量は、本願に言及された量または水準に対して１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれより高い倍数（例えば、１００倍、５００倍、１０００倍）の減少を指す（言及された整数間の１より大きいすべての整数および少数値を網羅する、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）。これはまた、本願に言及された量または水準に対する少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％の減少を網羅することができる。
Ａ．障害
本願に開示された方法および製造された組成物は、細胞増殖性障害のような多数の障害を標的化する用途を有する。本発明において、このようなアプローチの利点は、同種異系細胞を、外因性抗体によって標的化される特定の増殖性細胞を標的とするために、外因性抗体の投与と組み合わせて用いることである。本発明のこのようなアプローチおよび薬学的組成物を用いることにより、化学療法または放射線療法のような既存の療法とは異なり、増殖性細胞に無差別的に影響を及ぼす全身薬物または毒素を投与しなくても、潜在的に有害な増殖活性を示す細胞を特異的に標的とすることができる。
細胞増殖性障害および／または分化障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血新生物障害、例えば、白血病などがある。転移性腫瘍は、非－制限的に前立腺、結腸、肺、乳房および肝起源などの多様な原発性腫瘍タイプに起源することができる。
本願に使用されているように、用語「癌」、「過増殖性」および「新生物」は、自律的な生長能力、すなわち急速に増殖する細胞生長を特徴とする異常状態または病態を有する細胞を指す。過増殖性および新生物疾患状態は病的に、すなわち疾患状態が特徴的であるかまたは疾患状態であるものに分類することができるか、または非－病的であって、すなわち正常状態ではないが、疾患状態とは関連のないものに分類することができる。この用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲段階に関係なく、すべてのタイプの癌性生長または発癌過程、転移性組織または悪性に転換された細胞、組織、または臓器を網羅することを意味する。「病的過増殖性」細胞は、悪性腫瘍生長を特徴とする疾患状態で生ずる。非－病的過増殖性細胞に対する例としては、傷の回復に関連する細胞増殖を含む。
用語「癌」または「新生物」は、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸および泌尿生殖器で発生するなどの多様な臓器システムの悪性のみならず、腺癌腫、例えば、大部分の大腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または睾丸腫瘍、非－小細胞性肺癌腫、小腸癌および食道癌のような悪性を網羅する。
用語「癌腫」は、当該技術分野で理解され、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖器系癌腫、睾丸癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫などの上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。一部の実施形態において、疾患は、腎臓癌または黒色腫である。癌腫の例としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織に起因する癌腫などがある。この用語はまた、例えば、癌腫組織および肉腫組織で構成された悪性腫瘍を含む、癌肉腫症を網羅する。「腺癌腫」は、腺組織に由来したり、または腫瘍細胞が認知可能な腺構造に起源する癌腫を指す。
用語「肉腫」は、当該技術分野で理解され、間葉由来悪性腫瘍を指す。
増殖性障害に対する追加的な例としては、造血新生物障害がある。本願に使用されているように、用語「造血新生物障害」は、造血起源の、例えば、骨髄、リンパ系または赤血球系統またはこれらの前駆細胞に起源する、過形成／新生物細胞を伴う疾病を含む。好ましくは、疾患は、ほとんど未分化された急性白血病（ｐｏｏｒｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、例えば、赤血球芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から発生する。付加的な骨髄性障害の例としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）があるが、これらに限定されるものではなく（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７－９７）；リンパ系悪性としては、Ｂ－系急性リンパ芽性白血病（ＡＬＬ）およびＴ－系ＡＬＬをはじめとするＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ芽性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）があるが、これらに限定されるものではない。悪性リンパ腫の追加的な形態としては、非－ホジキンリンパ腫およびその変形形態、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン疾患およびリード・シュテルンベルグ疾患があるが、これらに限定されるものではない。
一部の実施形態において、癌は、以下からなる群より選択される：急性リンパ芽性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ－関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、典型的な奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド、心臓腫瘍、髄芽腫、生殖細胞腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、胎児腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外生殖細胞腫、性腺外生殖細胞腫、眼癌（例えば、眼内黒色腫または網膜芽腫）、卵管癌、骨の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫、妊娠性絨毛性疾患、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞癌、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、島細胞腫、膵神経内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）癌腫、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇および口腔癌、肝臓癌、肺癌（例えば、非－小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、胸膜肺芽腫および気管気管支腫瘍）、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌腫、中皮腫、転移性癌、転移性扁平上皮癌、正中線癌腫（ｍｉｄｌｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口腔癌、多発性内分泌腺腫症症侯群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非－ホジキンリンパ腫、口腔癌、口唇および口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、脳下垂体部腫瘍、形質細胞新生物、多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、姙娠性乳癌（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、中枢神経系原発悪性リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発癌、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（例えば、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症侯群、皮膚癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平細胞癌腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、Ｔ－細胞リンパ腫、睾丸癌、咽喉癌、鼻咽頭癌、口咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、気管気管支腫瘍、腎盂と尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍、外陰部癌およびウィルムス腫瘍。
一部の実施形態において、癌は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、癌は、転移性である。
一部の実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ＋癌である。一部の実施形態において、ＥＧＦＲ＋癌は、膠芽腫、肺腺癌腫、非－小細胞性肺癌、低悪性度神経膠腫、結腸直腸腺癌腫、高悪性度神経膠腫、多発性骨髄腫、乳腺癌腫、毛様細胞性星細胞腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
Ｂ．患者
本発明において、組成物および方法に適した患者は、細胞増殖性および／または分化性障害、例えば、癌を患っているか、診断されたか、または患っていると疑われる患者を含む。本発明に言及された施術を受けた患者は、一般的に本発明の方法および組成物により良く反応するが、その理由は部分的に薬学的組成物が同種異系であり、一般的に増殖する細胞を標的化するよりは抗体によって標的細胞を識別するからである。そのため、オフ－標的効果がほとんどなく、患者は実質的に有害なオフ－標的効果なしに治療用法を完了する可能性がより大きい。
一部の実施形態において、本発明に提供された治療方法を用いて、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌と診断されたか、または患っていると疑われる個体（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス）を治療することができる。一部の実施形態において、個体は、哺乳類である。一部の実施形態において、個体は、ヒトである。
本願に使用されているように、個体は、例えば、ヒトをはじめとする哺乳類を指す。
一部の実施形態において、哺乳類は、アルマジロ、ロバ、コウモリ、クマ、ビーバー、ネコ、チンパンジー、ウシ、コヨーテ、シカ、イヌ、イルカ、ゾウ、キツネ、パンダ、テナガザル、キリン、ヤギ、ホリネズミ、ハリネズミ、カバ、ウマ、ザトウクジラ、ジャガー、カンガルー、コアラ、ヒョウ、シシ、リャマ、オオヤマネコ、モグラ、サル、マウス、イッカク、オランウータン、サカマタ、カワウソ、牡ウシ、ブタ、シロクマ、ヤマアラシ、ピューマ、ウサギ、ラクーン、ラット、サイ、ヒツジ、リス、トラ、セイウチ、イタチ、オオカミ、シマウマ、ヤギ、ウマ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、哺乳類は、ヒトである。
個体、例えば、ヒト個体は、子供、例えば、０歳または約０歳～１４歳または約１４歳であってもよい。個体は、若者、例えば、１５歳または約１５歳～２４歳または約２４歳であってもよい。個体は、成人、例えば、２５歳または約２５歳～６４歳または約６４歳であってもよい。個体は、高齢者、例えば、６５歳以上であってもよい。
一部の実施形態において、個体は、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌、例えば、腫瘍に関連する１つ以上の症状が発生したヒトであってもよい。本発明に提供された任意の治療方法を用いて多様な病期の癌を治療することができる。例えば、癌病期は、初期、進行した、局所進行、寛解、不応性、寛解後再発および進行性（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、個体は、癌の初期病期である。他の実施形態において、個体は、癌の進行した病期である。多様な実施形態において、個体は、１期、２期、３期または４期癌を患っている。本発明に記載の治療方法は、腫瘍の減少または縮小を促進したり、腫瘍生長または癌細胞の増殖を減少または阻害したり、および／または腫瘍細胞の殺傷を誘導、増加または促進することができる。一部の実施形態において、個体は、癌寛解状態である。本発明に記載の治療方法は、癌の転移または再発を防止したり、または遅延することができる。
一部の実施形態において、個体は、診断されたか、または診断されていない細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌の発病危険があるか、または遺伝学的にまたは他のもの（例えば、危険因子）が存在する。
本願に使用されているように、「危険がある」個体は、治療する病態、例えば、細胞増殖性障害および／または分化障害、例えば、癌の発病危険がある個体である。一般的に、「危険がある」個体は、検出可能な疾患があるか、または検出可能な疾患がなくてもよいし、本発明に記載の治療方法の前に検出可能な疾患が発現したか、または発現しなくてもよい。「危険がある」とは、個体が、疾患または病態の発病と関連性がある測定可能な媒介変数および当該技術分野で公知の、いわゆる１つ以上の危険因子を有することを意味する。例えば、危険がある個体は、癌の発病に関連する測定可能な媒介変数である１つ以上の危険因子を有することができる。このような１つ以上の危険因子を有する個体は、このような危険因子がない個体より癌発病確率がより高い。一般的に、危険因子は、例えば、年齢、性別、人種、規定食、以前疾患の病歴、前駆疾患の存在、遺伝学的（例、遺伝性）考慮事項および環境露出を含むことができる。一部の実施形態において、癌発病危険がある個体は、例えば、親戚の中で疾患を患ったことのある個体、および遺伝子または生化学マーカー分析により決定された危険を有する個体を網羅する。
これとともに、個体は、化学療法、放射線療法、免疫療法、手術、またはこれらの組み合わせのような１つ以上の標準療法を施していてもよい。このため、化学療法、放射線療法、免疫療法、手術、またはこれらの組み合わせを施す前、施す間にまたは施した後に、１つ以上のキナーゼ阻害剤が投与されてもよい。
特定の実施形態において、個体は、（ｉ）１つ以上の化学療法治療剤に対して実質的に不応性であるか、または（ｉｉ）化学療法で治療された後に再発した状態であるか、または（ｉ）および（ｉｉ）両方であるヒトであってもよい。一部の実施形態において、個体は、（標準または実験的化学療法をはじめとする）化学療法治療剤２種以上、３種以上または４種以上に対して不応性である。
一部の実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ＋癌と診断されたか、ＥＧＦＲ＋癌と診断されたことがある。一部の実施形態において、患者は、癌の生検または外科的サンプルに対する免疫組織化学的染色によってＥＧＦＲ＋癌と診断されたことがあるか、またはＥＧＦＲ＋癌と診断された。一部の実施形態において、患者は、発色性インサイチュー混成化によってＥＧＦＲ＋癌と診断されたことがあるか、またはＥＧＦＲ＋癌と診断された。一部の実施形態において、患者は、癌の生検または外科的サンプルに対する蛍光インサイチュー混成化によってＥＧＦＲ＋癌と診断されたことがあるか、またはＥＧＦＲ＋癌と診断された。一部の実施形態において、患者は、遺伝子分析によって、例えば、ＥＧＦＲ突然変異癌、例えば、ＥＧＦＲ遺伝子内体細胞突然変異の識別によってＥＧＦＲ＋癌と診断されたことがあるか、またはＥＧＦＲ＋癌と診断された。
一部の実施形態において、患者は、表７に記載された１つ以上の突然変異セット、ＥＧＦＲ遺伝子での挿入または欠損多形成、ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数変異、ＥＧＦＲ遺伝子のメチル化突然変異、またはこれらの組み合わせを含む癌を有している。
一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＥＧＦＲ＋癌に関連する染色体転座を有している。一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＥＧＦＲ＋癌に関連する融合遺伝子を有している。
一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＥＧＦＲ＋癌に関連する染色体転座を有している。一部の実施形態において、患者は、癌、例えば、ＥＧＦＲ＋癌に関連する融合遺伝子を有している。
一部の実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療後に不応性であるか、または再発したものである。一部の実施形態において、患者は、化学療法剤で治療した後に不応性であるか、または再発したものである。
一部の実施形態において、化学療法薬物は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療後に不応性であるか、または再発したものである。一部の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｎｔｉｎｉｂ）、アファチニブ（ａｆａｔｉｎｉｂ）、オシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ特異抗体（例えば、本願に記載されているように）に対して耐性の癌を患っている。場合によっては、ＥＧＦＲ特異抗体は、セツキシマブのようなＥＧＦＲ拮抗剤である。場合によっては、ＥＧＦＲ特異抗体は、セツキシマブのようにＡＤＣＣ機序をさらに有するＥＧＦＲ拮抗剤である。
セツキシマブ耐性は、例えば、Ｒａｓ経路突然変異と関係がある（例えば、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ／ＨＲＡＳ／ＢＲＡＦＩ／ＰＩＫ３ＣＡ。例として、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｒａｓ Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｃｅｔｉｘｕｍａｂ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ」，Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ２８７：５２３６－４８（２０２０）；およびＲａｍｐｉａｓ ｅｔ ａｌ．，「ＲＡＳ／ＰＩ３Ｋ Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ａｎｄ Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｑｕａｍｏｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２０（１１）：２９３３－４６（２０１４）参照する；これらの文献は全体として援用により本願に取り込まれる）。このため、一部の実施形態において、患者は、Ｒａｓ－活性化された癌を患っている。例えば、一部の実施形態において、患者は、Ｒａｓ経路野生型患者ではない（例えば、患者は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳまたはＰＩＫ３ＣＡのうちの１つ以上に突然変異が存在するか、またはその発現に影響を及ぼす突然変異を有する）。
Ｃ．リンパ球除去
一部の実施形態において、患者は、治療する前にリンパ球除去される。
例示的なリンパ球除去性化学療法用法は、関連する有用なバイオマーカーに加えて、ＷＯ２０１６／１９１７５６およびＷＯ２０１９／０７９５６４に記載されており、これらの文献は全体として援用により本明細書に取り込まれる。特定の実施形態において、リンパ球除去化学療法用法は、患者にシクロホスファミド投与（２００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ～２０００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）およびフルダラビン投与（２０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ～９００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）を含む。一部の実施形態において、リンパ球除去は、シクロホスファミド２５０または約２５０～５００または約５００ｍｇ／ｍ２の投与、例えば、シクロホスファミド２５０または約２５０～５００または約５００、２５０、４００、５００、約２５０、約４００または約５００ｍｇ／ｍ２の投与を含む。一部の実施形態において、リンパ球除去は、フルダラビン２０または約２０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ～４０または約４０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ、例えば、３０または約３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙの投与を含む。
一部の実施形態において、リンパ球除去は、シクロホスファミドとフルダラビン両方の投与を含む。一部の実施形態において、患者は、シクロホスファミド（２５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）の静脈内投与によってリンパ球除去処理される。一部の実施形態において、患者は、シクロホスファミド（５００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）およびフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙ）の静脈内投与によってリンパ球除去処理される。
一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する前の最大５日以内に行われる。一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する前の最大７日以内に行われる。一部の実施形態において、リンパ球除去は、ＮＫ細胞を１次投与する５日前から始まり、連続３日間毎日（すなわち、－５日から－３日）行われる。一部の実施形態において、リンパ球除去は、－５日、－４日および－３日目に行われる。
Ｄ．投与
１．ＮＫ細胞
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、薬学的組成物、例えば、本願に記載の薬学的組成物の一部として投与される。細胞は解凍した後、場合によっては、その凍結防止剤が即席投与に適した場合には、何らかの追加的な操作なく、投与する。所定の個体に対して、治療用法はよく共通バッチまたは供与体に由来するＮＫ細胞の分液または用量を複数個経時的に投与することを含む。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞は、投与あたり、ＮＫ細胞１×１０８または約１×１０８～８×１０９または約８×１０９個投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、投与あたり、細胞１×１０８または約１×１０８、１×１０９または約１×１０９、４×１０９または約４×１０９、または８×１０９または約８×１０９個投与される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、毎週投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１週または約１週間投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、８週間または約８週間投与される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、注入用－対応媒質（ｉｎｆｕｓｉｏｎ－ｒｅａｄｙ ｍｅｄｉａ）、例えば、本願に記載されているように、静脈内投与に適した冷凍保存組成物中に冷凍保存される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、バイアルあたり、細胞が１×１０８または約１×１０８～８×１０９または約８×１０９個収容されたバイアルで冷凍保存される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１回用量を収容するバイアルで冷凍保存される。
一部の実施形態において、細胞は、投与する前、例えば、３７℃の水槽で解凍する。
一部の実施形態において、解凍したバイアルのＮＫ細胞は、１回投与容器、例えば、投与バッグに、例えば、バイアルアダプダおよび無菌シリンジを用いて無菌的に移す。ＮＫ細胞は、容器からＹ型血液／溶液セットフィルタによりＩＶ注入として、重力によって患者に投与することができる。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、解凍後できるだけ早く、好ましくは、９０分以内に、例えば、８０分以内、７０分以内、６０分以内、５０分以内、４０分以内、３０分以内、２０分以内または１０分以内に投与する。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、解凍後３０分以内に投与する。
一部の実施形態において、薬学的組成物は、シリンジを通して静脈内投与する。
一部の実施形態において、患者に医薬品１ｍｌ、４ｍｌまたは１０ｍｌをシリンジを通して静脈内投与する。
２．抗体
一部の実施形態において、本願に記載のＮＫ細胞、例えば、本願に言及されたＮＫ細胞を含む薬学的組成物は、抗体、例えば、本願に記載の抗体、例えば、ＥＧＦＲ抗体と組み合わせて投与される。一部の実施形態において、抗体は、薬学的組成物の一部としてＮＫ細胞とともに投与される。一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞と分離して、例えば、個別薬学的組成物の一部として投与される。抗体は、ＮＫ細胞を投与する前、投与した後、または投与と同時に投与されてもよい。
一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞を投与する前に投与される。一部の実施形態において、抗体は、ＮＫ細胞を投与した後に投与される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、抗体投与を完了した後、少なくとも３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分または２４０分に投与される。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、抗体を投与した後、翌日に投与される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、各投与時に投与され、抗体は、投与の一部でのみ投与される。例えば、一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、１週あたり１回投与され、抗体は、１ヶ月あたり１回投与される。
一部の実施形態において、抗体は、８週間毎週投与される。一部の実施形態において、抗体は、８週間２週ごとに投与される。
一部の実施形態において、抗体の用量は、細胞を１次投与する前に提供される。一部の実施形態において、抗体の減量された用量が細胞を１次投与する前に提供される。
３．サイトカイン
一部の実施形態において、サイトカインを患者に投与する。
一部の実施形態において、サイトカインは、薬学的組成物の一部としてＮＫ細胞とともに投与される。一部の実施形態において、サイトカインは、ＮＫ細胞とは別に、例えば、別の薬学的組成物の一部として投与される。
一部の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－２である。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、皮下投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を終了した後、１－４時間または約１～約４時間で投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、少なくとも１時間の時点で投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、最大４時間以内に投与する。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞の投与を完了した後、最小１時間経過時から最大４時間以内に投与する。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、最大１０，０００，０００ＩＵ／ｍ２、例えば、最大１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、５，０００，０００、６，０００，０００、７，０００，０００、８，０００，０００、９，０００，０００または１０，０００，０００ＩＵ／ｍ２で投与される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、１，０００，０００または約１，０００，０００、２，０００，０００または約２，０００，０００、または３，０００，０００または約３，０００，０００、または４，０００，０００または約４，０００，０００、または５，０００，０００または約５，０００，０００、または６，０００，０００または約６，０００，０００、または７，０００，０００または約７，０００，０００、または８，０００，０００または約８，０００，０００、または９，０００，０００または約９，０００，０００、または１０，０００，０００または約１０，０００，０００ＩＵ／ｍ２で投与される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、１×１０６ＩＵ／ｍ２または約１×１０６ＩＵ／ｍ２で投与される。一部の実施形態において、ＩＬ－２は、２×１０６ＩＵ／ｍ２または約２×１０６ＩＵ／ｍ２で投与される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に１×１０６ＩＵ／ｍ２未満で投与される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、均一用量（ｆｌａｔ ｄｏｓｅ）で患者に投与される。一部の実施形態において、均一用量６，０００，０００ＩＵまたは約６，０００，０００ＩＵが患者に投与される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２は、患者に投与しない。
Ｅ．投与
「有効量」は、有利なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。例えば、治療学的含有量は、所望の治療学的効果を達成する量である。このような量は、疾患または疾患症状の開始を防止するのに必要な量、すなわち予防学的有効量と同一であるか、または異なっていてもよい。有効量は、１回以上の投与、適用または投与量で投与される。治療学的化合物の治療学的有効量（すなわち、有効な投与量）は、選択した治療学的化合物によって決定される。組成物は、２日間隔で１回を含めて、１日あたり１回以上～１週間あたり１回以上投与することができる。当該技術分野における当業者であれば、非－制限的に疾患または障害の重症度、以前の治療、個体の一般的な健康状態および／または年齢および存在するその他の疾患を含めて、一部の因子が個体を効果的に治療するのに要求される投与量および時間に影響を及ぼしうることが分かるであろう。これとともに、本発明に記載の治療学的化合物を治療学的有効量で用いて個体を治療することは、単一治療または一連の治療を含むことができる。
治療学的化合物の投与量、毒性および治療学的効能は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％で致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療学的に有効な用量）を決定するための標準薬学的手順によって決定可能である。毒性と治療学的効果との間の用量比率が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表現することができる。治療指数が高い化合物が好ましい。毒性副作用がある化合物を使用してもよいが、非－感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化して副作用を低減するために、このような化合物が発病した組織部位に標的伝達するシステムを設計するのに注意しなければならない。
ヒトに使用するための投与量範囲を公式化するのに細胞培養分析および動物実験から得られたデータを用いることができる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であってもよい。投与量は、採用された投薬形態および活用された投与経路によってこのような範囲内で異なっていてもよい。本発明の方法に用いられる任意の化合物の場合、治療学的有効量は、まず、細胞培養分析で推定することができる。用量は、細胞培養で決定されたように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の１／２を達成する試験化合物の濃度）を含む循環性血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで公式化することができる。このような情報を用いてヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿内レベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定可能である。
Ｆ．組み合わせ療法
一部の実施形態において、本方法は、本願に記載のＮＫ細胞およびＥＧＦＲ標的抗体を他の療法、例えば、付加的な抗体、ＮＫ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、抗体薬物接合体（ＡＤＣ）、化学療法薬物、例えば、小分子薬物、免疫チェックポイント阻害剤、およびこれらの組み合わせと組み合わせ投与することを含む。
１．小型分子／化学療法薬物
一部の実施形態において、追加的な療法は、小分子薬物である。一部の実施形態において、追加的な療法は、化学療法薬物である。一部の実施形態において、追加的な療法は、小分子化学療法薬物である。このような小分子薬物は、適応ＮＫ細胞療法が追加される現行の標準管理治療用法を含むことができる。場合によっては、本願に記載のＮＫ細胞の使用は、所望の効果を達成するのに必要な小分子薬物の効能を強化したり、小分子薬物の量を低減したり、または小分子薬物の毒性減少などによって、小分子薬物の効果を強化することができる。
一部の実施形態において、薬物は、以下からなる群より選択される：
一部の実施形態において、薬物は、［（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，７Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ）－４－アセチルオキシ－１，９，１２－トリヒドロキシ－１５－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－［（２－メチルプロパン－２－イル）オキシカルボニルアミノ］－３－フェニルプロパノイル］オキシ－１０，１４，１７，１７－テトラメチル－１１－オキソ－６－オキサテトラシクロ［１１．３．１．０３，１０．０４，７］ヘプタデス－１３－エン－２－イル］ベンゾエート（ドセタキセル）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、［（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，７Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ）－４，１２－ジアセチルオキシ－１５－［（２Ｒ，３Ｓ）－３－ベンズアミド－２－ヒドロキシ－３－フェニルプロパノイル］オキシ－１，９－ジヒドロキシ－１０，１４，１７，１７－テトラメチル－１１－オキソ－６－オキサテトラシクロ［１１．３．１．０３，１０．０４，７］ヘプタデス－１３－エン－２－イル］ベンゾエート（パクリタキセル）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、６－Ｎ－（４，４－ジメチル－５Ｈ－１，３－オキサゾール－２－イル）－４－Ｎ－［３－メチル－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－７－イルオキシ）フェニル］キナゾリン－４，６－ジアミン（ツカチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、ペンチルＮ－［１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－メチルオキソラン－２－イル］－５－フルオロ－２－オキソピリミジン－４－イル］カルバメート（カペシタビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、アザニド；シクロブタン－１，１－ジカルボン酸；プラチナ（２＋）（カルボプラチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、メチル（１Ｒ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ，１９Ｒ）－１１－アセチルオキシ－１２－エチル－４－［（１２Ｓ，１４Ｒ）－１６－エチル－１２－メトキシカルボニル－１，１０－ジアザテトラシクロ［１２．３．１．０３，１１．０４，９］オクタデカ－３（１１），４，６，８，１５－ペンタエン－１２－イル］－１０－ヒドロキシ－５－メトキシ－８－メチル－８，１６－ジアザペンタシクロ［１０．６．１．０１，９．０２，７．０１６，１９］ノナデカ－２，４，６，１３－テトラエン－１０－カルボキシレート（ビノレルビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［３－クロロ－４－［（３－フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］－６－［５－［（２－メチルスルホニルエチルアミノ）メチル］フラン－２－イル］キナゾリン－４－アミン（ラパチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（Ｅ）－Ｎ－［４－［３－クロロ－４－（ピリジン－２－イルメトキシ）アニリノ］－３－シアノ－７－エトキシキノリン－６－イル］－４－（ジメチルアミノ）ｂｕｔ－２－エンアミド（ネラチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－［（５－ピペラジン－１－イルピリジン－２－イル）アミノ］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オン（パルボシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、７－シクロペンチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－［（５－ピペラジン－１－イルピリジン－２－イル）アミノ］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－カルボキサミド（リボシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［５－［（４－エチルピペラジン－１－イル）メチル］ピリジン－２－イル］－５－フルオロ－４－（７－フルオロ－２－メチル－３－プロパン－２－イルベンズイミダゾール－５－イル）ピリミジン－２－アミン（アベマシクリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｅ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１２－［（２Ｒ）－１－［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）－４－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メトキシシクロヘキシル］プロパン－２－イル］－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３，２９，３５－ヘキサメチル－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－２，３，１０，１４，２０－ペントン（エベロリムス）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（２Ｓ）－１－Ｎ－［４－メチル－５－［２－（１，１，１－トリフルオロ－２－メチルプロパン－２－イル）ピリジン－４－イル］－１，３－チアゾール－２－イル］ピロリジン－１，２－ジカルボキサミド（アルペリシブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、４－［［３－［４－（シクロプロパンカルボニル）ピペラジン－１－カルボニル］－４－フルオロフェニル］メチル］－２Ｈ－フタラジン－１－オン（オラパリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（１１Ｓ，１２Ｒ）－７－フルオロ－１１－（４－フルオロフェニル）－１２－（２－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）－２，３，１０－トリアザトリシクロ［７．３．１．０５，１３］トリデカ－１，５（１３），６，８－テトラエン－４－オン（タラゾパリブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エチル－メチルアミノ］－４－メトキシ－５－［［４－（１－メチルインドール－３－イル）ピリミジン－２－イル］アミノ］フェニル］プロプ－２－エンアミド（オシメルチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－（３－クロロ－４－フルオロフェニル）－７－メトキシ－６－（３－モルホリン－４－イルプロポキシ）キナゾリン－４－アミン（ゲフィチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ－（３－エチニルフェニル）－６，７－ビス（２－メトキシエトキシ）キナゾリン－４－アミン（エルロチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（Ｅ）－Ｎ－［４－（３－クロロ－４－フルオロアニリノ）－７－［（３Ｓ）－オキソラン－３－イル］オキシキナゾリン－６－イル］－４－（ジメチルアミノ）ｂｕｔ－２－エンアミド（アファチニブ）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、アザン（ａｚａｎｅ）；ジクロロプラチナ（シスプラチン、プラチノール）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、アザニド；シクロブタン－１，１－ジカルボン酸；プラチナ（２＋）（カルボプラチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、４－アミノ－１－［（２Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３，３－ジフルオロ－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］ピリミジン－２－オン（ゲムシタビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（２Ｓ）－２－［［４－［２－（２－アミノ－４－オキソ－３，７－ジヒドロピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）エチル］ベンゾイル］アミノ］ペンタン二酸（ペメトレキセド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ，Ｎ－ビス（２－クロロエチル）－２－オキソ－１，３，２λ５－オキサザホスフィナン－２－アミン（シクロホスファミド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）－２－（６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル）－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３，４－ジオール（フルダラビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（７Ｓ，９Ｓ）－７－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）－４－アミノ－５－ヒドロキシ－６－メチルオキサン－２－イル］オキシ－６，９，１１－トリヒドロキシ－９－（２－ヒドロキシアセチル）－４－メトキシ－８，１０－ジヒドロ－７Ｈ－テトラセン－５，１２－ジオン（ドキソルビシン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、メチル（１Ｒ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ，１９Ｒ）－１１－アセチルオキシ－１２－エチル－４－［（１３Ｓ，１５Ｓ，１７Ｓ）－１７－エチル－１７－ヒドロキシ－１３－メトキシカルボニル－１，１１－ジアザテトラシクロ［１３．３．１．０４，１２．０５，１０］ノナデカ－４（１２），５，７，９－テトラエン－１３－イル］－８－ホルミル－１０－ヒドロキシ－５－メトキシ－８，１６－ジアザペンタシクロ［１０．６．１．０１，９．０２，７．０１６，１９］ノナデカ－２，４，６，１３－テトラエン－１０－カルボキシレート（ビンクリスチン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－ヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３－ジメチル－６，７，８，９，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３，１１－ジオン（プレドニゾン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、Ｎ，３－ビス（２－クロロエチル）－２－オキソ－１，３，２λ５－オキサザホスフィナン－２－アミン（イホスファミド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（５Ｓ，５ａＲ，８ａＲ，９Ｒ）－５－［［（２Ｒ，４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＳ）－７，８－ジヒドロキシ－２－メチル－４，４ａ，６，７，８，８ａ－ヘキサヒドロピラノ［３，２－ｄ］［１，３］ジオキシン－６－イル］オキシ］－９－（４－ヒドロキシ－３，５－ジメトキシフェニル）－５ａ，６，８ａ，９－テトラヒドロ－５Ｈ－［２］ベンゾフロ［６，５－ｆ］［１，３］ベンゾジオキソール－８－オン（エトプシド）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３，１６－トリメチル－６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（デキサメタゾン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、薬物は、（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３，１６－トリメチル－６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オン（シタラビン）またはその薬剤学的に許容可能な塩である。
一部の実施形態において、ＮＫ細胞、例えば、本願に記載のＮＫ細胞、例えば、ＡＢ－１０１細胞は、ＥＧＦＲ標的抗体だけでなく、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される療法と組み合わせて投与される。
一部の実施形態において、化学療法薬物は、シスプラチン、ドセタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、シスプラチン、ペメトレキセド、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、患者は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療後、不応性であるか、または再発した。一部の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
２．ＮＫ細胞エンゲージャー
一部の実施形態において、追加的な療法は、ＮＫ細胞エンゲージャー（ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）、例えば、二重特異性または三重特異性抗体である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ１６と、疾患－関連抗原、例えば、癌－関連抗原、例えば、本願に記載の癌抗原、例えば、ＥＧＦＲに対する二重特異性抗体である。一部の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャーは、ＣＤ１６と、疾患－関連抗原２種、例えば、癌－関連抗原、例えば、本願に記載の抗原に対する三重特異性抗体である。
３．チェックポイント阻害剤
一部の実施形態において、追加的な療法は、免疫チェックポイント阻害剤である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ－９６阻害剤、ＳＩＲＰα阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）阻害剤、ＴＩＭ－３阻害剤、Ｂ７－Ｈ３阻害剤、Ｂ７－Ｈ４阻害剤、Ａ２ａＲ阻害剤、ＣＤ７３阻害剤、ＮＫＧ２Ａ阻害剤、ＰＶＲＩＧ／ＰＶＲＬ２阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ１阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ５阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ６阻害剤、ＦＡＫ阻害剤、ＣＣＬ２阻害剤、ＣＣＲ２阻害剤、ＬＩＦ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＳＩＲＰα阻害剤、ＣＳＦ－１阻害剤、Ｍ－ＣＳＦ阻害剤、ＣＳＦ－１Ｒ阻害剤、ＩＬ－１阻害剤、ＩＬ－１Ｒ３阻害剤、ＩＬ－ＲＡＰ阻害剤、ＩＬ－８阻害剤、ＳＥＭＡ４Ｄ阻害剤、Ａｎｇ－２阻害剤、ＣＥＬＶＥＲ－１阻害剤、Ａｘｌ阻害剤、ホスファチジルセリン阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、表８に列挙された物質、またはこれらの組み合わせから選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。
一部の実施形態において、ＰＤ－１ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、セミプリマブ－ｒｗｌｃ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ－ｒｗｌｃ）、シンチリマブ（ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
一部の実施形態において、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）である。
一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、表９に示した阻害剤の群より選択される。
一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、表１０に示した阻害剤の群より選択される。
一部の実施形態において、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、表１１に示した阻害剤の群より選択される。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、小分子薬物である。小分子チェックポイント阻害剤は、例えば、ＷＯ２０１５／０３４８２０Ａ１、ＷＯ２０１５／１６０６４１Ａ２、ＷＯ２０１８／００９５０５Ａ１、ＷＯ２０１７／０６６２２７Ａ１、ＷＯ２０１８／０４４９６３Ａ１、ＷＯ２０１８／０２６９７１Ａ１、ＷＯ２０１８／０４５１４２Ａ１、ＷＯ２０１８／００５３７４Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７５Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７３Ａ１、ＷＯ２０１７／２０２２７６Ａ１、ＷＯ２０１８／００６７９５Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８５２Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８９４Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３３０１Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３２９９Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８８６Ａ２、ＷＯ２０１６／１４２８３３Ａ１、ＷＯ２０１８／０５１２５５Ａ１、ＷＯ２０１８／０５１２５４Ａ１、ＷＯ２０１７／２０５４６４Ａ１、ＵＳ２０１７／０１０７２１６Ａ１、ＷＯ２０１７／０７００８９Ａ１、ＷＯ２０１７／１０６６３４Ａ１、ＵＳ２０１７／０１７４６７９Ａ１、ＵＳ２０１８／００５７４８６Ａ１、ＷＯ２０１８／０１３７８９Ａ１、ＵＳ２０１７／０３６２２５３Ａ１、ＷＯ２０１７／１９２９６１Ａ１、ＷＯ２０１７／１１８７６２Ａ１、ＵＳ２０１４／１９９３３４Ａ１、ＷＯ２０１５／０３６９２７Ａ１、ＵＳ２０１４／０２９４８９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３４０３９１Ａ１、ＷＯ２０１６／０３９７４９Ａ１、ＷＯ２０１７／１７６６０８Ａ１、ＷＯ２０１６／０７７５１８Ａ１、ＷＯ２０１６／１００６０８Ａ１、ＵＳ２０１７／０２５２４３２Ａ１、ＷＯ２０１６／１２６６４６Ａ１、ＷＯ２０１５／０４４９００Ａ１、ＵＳ２０１５／０１２５４９１Ａ１、ＷＯ２０１５／０３３３０３Ａ１、ＷＯ２０１６／１４２８３５Ａ１、ＷＯ２０１９／００８１５４Ａ１、ＷＯ２０１９／００８１５２Ａ１およびＷＯ２０１９０２３５７５Ａ１に言及されている。
一部の実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、２－［［４－アミノ－１－［５－（１－アミノ－２－ヒドロキシプロピル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル］－４－オキソブチル］カルバモイルアミノ］－３－ヒドロキシプロパン酸（ＣＡ－１７０）である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、（Ｓ）－１－（３－ブロモ－４－（（２－ブロモ－［１，１’－ビフェニル］－３－イル）メトキシ）ベンジル）ピペリジン－２－カルボン酸である。
一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ペプチドである。例えば、Ｓａｓｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ８：１０００７３（２０２０）を参照する。
ＶＩＩ．変異体
一部の実施形態において、本願に記載の融合タンパク質またはその構成要素、または本願に記載のＮＫ細胞遺伝子型は、（例、本願に提供された）例示的な配列のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一であり、例えば、本願に記載の突然変異を含み、またはこれに加えて、例えば、保存的な突然変異で置換された例示的な配列の残基として最大１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％の差を有する。好ましい実施形態において、変異体は、親配列の所望の活性を維持する。
核酸配列２種の配列同一性を確認するために、配列を最適に比較するために整列する（例えば、最適に整列するために第１アミノ酸または核酸配列および第２アミノ酸または核酸配列のいずれか１つまたは両方にギャップが導入され、非－相同的な配列は比較の目的では無視できる）。比較の目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でヌクレオチドを比較する。第１配列の一位置に第２配列の対応する位置と同一のヌクレオチドが存在すれば、その分子はその位置で同一である（本願に使用されているように、核酸の「同一性」は、核酸の「相同性」と同一である）。配列２種間の同一性％は、配列２個を最適に整列するために導入されるべき各ギャップの長さとギャップの個数を考慮した、配列に共有された同一の位置個数に対する関数である。
対象ポリペプチドまたは核酸配列（すなわち、クエリ）および第２ポリペプチドまたは核酸配列（すなわち、標的）間の同一性％は、当該技術分野の技術内で多様な方式で、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ整列（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１４７：１９５－７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ ＰｌｕｓＴＭ、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ，ｐｐ３５３－３５８に取り込まれているような「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２－４８９（１９８１））；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２１５：４０３－１０）、ＢＬＡＳＴ－２、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、ＢＬＡＳＴ－Ｎ、ＢＬＡＳＴ－Ｘ、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのように公開的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて決定する。これとともに、当該技術分野における当業者は、比較中の配列の長さ全体に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムなどの、整列を決定するための適切な媒介変数を決定することができる。一般的に、標的タンパク質または核酸の場合、比較の長さは、標的の任意の長さ、最大で、および標的の全長長さなど（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）であってもよい。本発明の目的において、同一性％は、クエリ配列の全長長さを基準とする。
本発明の目的において、配列２種の配列比較および同一性％の決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスを用い、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５を適用して達成することができる。
保存的な置換は、典型的に下記の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
ＶＩＩＩ．定義
他に断らない限り、本願に使用されたすべての技術用語、表記法およびその他の技術および科学用語または用語法は、請求内容の属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同じ意味があると意図される。場合によっては、通常理解される意味を有する用語が明確性および／または容易な参照のために本願で定義されるが、本発明においてこのような定義を含むことが必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものと実質的な差異を意味すると解釈されてはならない。
本出願全体において、多様な実施形態が範囲形式で提示される。範囲形式の記述は、主に便宜性および簡潔性のためのものに過ぎず、開示内容の範囲に変更できない制限として解釈されてはならない。このため、範囲の記述はできるだけすべての下位範囲のみならず、その範囲に属する個々の数値を具体的に言及するものと見なさなければならない。例えば、１～６のような範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような下位範囲のみならず、その範囲に属する個々の数値、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に言及するものと見なさなければならない。これは範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書および請求項に使用されているように、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈上、他に明示されない限り、複数の参照を包括する。例えば、用語「サンプル」は、サンプルの混合物をはじめとする複数のサンプルを包括する。
用語「確認」、「測定」、「評価」、「判定」、「検定」および「分析」は、本発明において相互互換的にしばしば測定タイプを指すために使用される。これらの用語は、要素の存在または不在を決定（例、検出）することを含む。これらの用語は、定量的な、定性的なまたは定量および定性的な決定を網羅することができる。評価は、相対的または絶対的であってもよい。「の存在の検出」は、それが文脈によって存在の有無を確認すること以外にも、存在する何らかの量を決定することを包括することができる。
用語「個体」、「個人」または「患者」は、本発明においてしばしば相互互換的に使用される。
用語「生体内」は、個体の身体で行われる現象を示すために使用される。
用語「生体外」は、個体の身体外部で行われる現象を示すために使用される。生体外分析は、個体で行われない。むしろ、これは個体から分離されたサンプルに対して行われる。サンプルに対して行われる生体外分析の一例が「試験管内」分析である。
用語「試験管内」は、物質が得られる生物学的供給源から分離されるように実験試薬を収容するための容器内で行われる現象を指すために使用される。試験管内分析は、生きている細胞または死滅細胞を用いた細胞ベースの分析を網羅することができる。また、試験管内分析は、無傷の細胞を用いない無－細胞性分析を網羅することもできる。
本願に使用されているように、数字の用語「約」は、当該数字の１０％がその数字から追加または控除されることを意味する。範囲の用語「約」は、その範囲から最低値の１０％を引いた値から最大値の１０％を加えた値までを意味する。
本願に使用されているように、用語「緩衝剤溶液」は、弱酸とその対塩基、またはその逆で構成された混合物からなる水性溶液を指す。
本願に使用されているように、用語「細胞培養培地」は、糖、アミノ酸、多様な営養分、無機物質などのように細胞の生長および増殖に必須な因子を含む、試験管内細胞生長および増殖のための混合物を指す。
本願に使用されているような緩衝剤溶液は、細胞培養培地ではない。
本願に使用されているように、用語「バイオリアクタ」は、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、ｐＨおよび温度などの細胞培養に影響を及ぼす一連の条件を引き続き統制可能な培養装置を指す。
本願に使用されているように、用語「ベクター」は、これに連結された他の核酸を増幅させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己－複製性核酸構造としてベクターのみならず、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを網羅する。一部のベクターは、本発明の核酸分子またはポリヌクレオチドを伝達するのに適合する。一部のベクターは、それに作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において発現ベクターと言及される。
用語「作動可能に連結された」は、２以上の核酸配列またはポリペプチド要素が通常物理的に連結されており、互いに機能的な関係で存在することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現を開始または調節できれば、そのプロモーターは、コーディング配列に作動するように連結されたものであり、この場合、コーディング配列は、プロモーター「の統制下」にあると理解されなければならない。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互互換的に使用され、このような細胞の子孫を含めて外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞は、継代培養回数とは関係なく１次操作された（例、形質転換された）細胞およびこれに由来する子孫を網羅する、「操作された細胞」、「形質転換体」、および「形質転換された細胞」を包括する。子孫は、親細胞と核酸の構成が完全に同一でなくてもよいし、突然変異を含むことができる。本来形質転換された細胞から選別または選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異子孫も本発明に含まれる。
適切な場合、宿主細胞は、本願に記載されているような融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドで安定的にまたは一時的に形質感染できる。
本発明に使用されたセクションの見出しは単なる構成上の理由に過ぎず、記述した発明の内容を制限すると解釈されてはならない。
ＩＸ．実施例
以下の実施例は単に例示的な目的として含まれるに過ぎず、本発明の範囲を制限すると意図されない。
実施例１：規格品ＮＫ細胞療法プラットフォーム
ＮＫ細胞を増幅および刺激する方法の一例を図１に示す。受容体ＣＤ１６の高親和性変異体（１５８Ｖ／Ｖ変異体、例えば、Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，「ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｂｌｏｏｄ９０：１１０９－１４（１９９７）参照）およびＫＩＲ－Ｂ遺伝子型（ＫＩＲ受容体系のＫＩＲ Ｂ対立遺伝子、例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＩＲ）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ：Ｇｅｎｅ－Ｏｒｄｅｒ，Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ１９０：４０－５２（２００２）；およびＰｙｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｇ－ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｏｃｕｓ」，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ５：ｅ１５１１５（２０１０）参照）を有するＦＤＡ－許可された冷凍臍帯血単一ユニットをＮＫ細胞供給源として選択した。
臍帯血ユニットを解凍し、遠心分離して冷凍媒質を除去した。その後、細胞調製物においてＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）およびＣＤ３（Ｔ細胞）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いてＴ細胞を枯渇処理した。総有核細胞（ＴＮＣ）６×１０８個の集団をＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで標識し、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ装置および緩衝剤を用いて分離した。Ｔ細胞を枯渇処理した後、主に単核球とＮＫ細胞である残りの細胞を洗った後、抗生剤－非含有媒質（ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ）中に収集した。細胞調製物は、以後、総有核細胞数、生存性およびＣＤ３＋細胞％に対して分析した。図１に示されるように、臍帯血ＮＫ細胞はＣＤ３枯渇処理された。
ＣＤ３－細胞調製物を増殖培地入りの気体透過性細胞増幅バッグに接種した。細胞は、複製不完全操作されたＨｕＴ－７８（ｅＨＵＴ－７８）フィーダー細胞と共培養してマスター細胞バンク（ＭＣＢ）集団に対して増幅を強化した。ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ培養培地を最初に抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、ヒト血漿、グルタミンおよびＩＬ－２で補充した。
図１に示すように、共培養段階のいずれかの段階中に、選択的にＮＫ細胞を、例えば、レンチウイルスベクターを用いてＮＫ細胞にＣＡＲを導入するように操作した。
細胞は、静置培養として、５％ＣＯ２平衡空気雰囲気下、３７℃で１２－１６日間、２－４日間隔で培地を追加的に交換しながら、培養した。培養物が１００倍以上に増幅されれば、培養された細胞を回収した後、冷凍媒質に懸濁してクライオバッグに充填した。この場合、このような共培養中にバッグまたはバイアルあたり細胞１０８個のバッグまたはバイアル８０個が作られた。クライオバッグを速度制御型凍結器（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒａｔｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）を用いて－１５０℃以下の気相液体窒素（ＬＮ２）タンクで冷凍した。ＦＤＡ－許可された臍帯型ユニットに由来するこのような冷凍保存したＮＫ細胞をマスター細胞バンク（ＭＣＢ）として用いた。
医薬品を製造するために、ＭＣＢから得られた冷凍細胞バッグを解凍した後、冷凍媒質を除去した。解凍した細胞は使い捨て培養バッグに接種し、フィーダー細胞、例えば、ｅＨＵＴ７８フィーダー細胞と共培養して医薬品を生産した。この場合、臍帯血ユニット１つあたり医薬品ロット数千個を生産するために細胞を５０ｌバイオリアクタで培養し（例えば、冷凍バイアル４，０００－８，０００個、それぞれ１０９細胞／バイアル）、これを冷凍保存組成物と混合した後、冷凍バイアルのような複数の保管容器に入れて冷凍した。この医薬品は直接注入用に利用可能な規格品注入用完成製品（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒｅａｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。各医薬品ロット１つは患者数百～数千人に注入可能である（例えば、患者１００－１，０００人、例として、標的用量４×１０９細胞）。
実施例２：フィーダー細胞の増幅
一例として、適切なフィーダー細胞、例えば、ｅＨｕｔ－７８細胞を冷凍ストックから解凍し、１２５ｍｌフラスコでＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）８９％ｖ／ｖ、不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１０％ｖ／ｖ）およびグルタミン（ｈｙｃｌｏｎｅ）（２ｍＭ）を含む培養培地中に、３７℃または約３７℃で、３－７％ＣＯ２または約３－７％ＣＯ２下、１８－２４日または約１８－２４日間増幅および培養した。細胞は２－３日ごとに１２５ｍｌ－２ｌフラスコに分けた。細胞を遠心分離により回収し、ガンマ線を照射した。回収および放射線処理された細胞を２ｍｌ冷凍バイアルで冷凍保存媒質（Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０）と混合した後、速度制御型凍結器で５分あたり約１５℃の冷却速度で最終温度－９０℃または約－９０℃まで冷凍し、以後、液体窒素タンクまたは冷凍庫に移して、最終温度－１５０℃または約－１５０℃まで冷却した。
冷凍した後、細胞生存率はオリジナル細胞数の７０％以上であり（ここで、少なくとも１．０×１０８生存細胞／ｍｌ）、細胞の８５％以上がｍＴＮＦ－αを発現し、細胞の８５％以上がｍｂＩＬ－２１＋を発現し、細胞の８５％以上が４－１ＢＢＬを発現した。
実施例３：ＮＫ細胞の増幅および刺激
一例として、好適なＮＫ細胞は４－１ＢＢＬ、膜結合型ＩＬ－２１および突然変異ＴＮＦα（「ｅＨｕｔ－７８Ｐ細胞」）を発現するように形質導入されたＨｕＴ－７８細胞をフィーダー細胞として用いて製造することができる。フィーダー細胞を１％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＧｒｏ媒質に懸濁し、ガンマ線放射線装置で２０，０００ｃＧｙで照射した。種細胞（例えば、ＣＤ３－枯渇したＰＢＭＣまたはＣＤ３－枯渇した臍帯血細胞）をフィーダー細胞上でヒト血漿、グルタミン、ＩＬ－２およびＯＫＴ－３を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地中に静置培養として３７℃で培養した。２－４日間隔で細胞を分けた。総培養時間は１９日である。ＮＫ細胞を遠心分離により回収して冷凍保存した。解凍したＮＫ細胞を以下で構成された注入媒質中に患者に投与する：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １ｘ、ＦｕｊｉＦｉｌｍ Ｉｒｖｉｎｅ）（５０％ｖ／ｖ）、アルブミン（ヒト）（２０％ｖ／ｖ ＯｃｔａＰｈａｒｍａアルブミン溶液：ヒトアルブミン≧９６％のタンパク質２００ｇ／ｌ、ソジウム１３０－１６０ｍｍｏｌ；≦２ｍｍｏｌポタシウム、０．０６４－０．０９６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質Ｎ－アセチル－ＤＬ－トリプトファン、０．０６４－０．０９６ｍｍｏｌ／ｇタンパク質、カプリル酸、ａｄ．１０００ｍｌの水）、デキストラン４０／デキストロース（２５％ｖ／ｖ Ｈｏｓｐｉｒａデキストラン４０／デキストロース注射液、以下を含むＵＳＰ：１０ｇ／１００ｍｌデキストラン４０および５ｇ／１００ｍｌ含水デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｈｙｄｒｏｕｓ）水溶液）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５％ｖ／ｖ Ａｖａｎｔｏｒ ＤＭＳＬ溶液、密度１．１０１ｇ／ｃｍ３、２０℃）。
ある場合には、種細胞はＣＤ３－枯渇した臍帯血細胞である。細胞分画は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｔ細胞枯渇セット（（ＬＳ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｓｅｔ（１６２－０１）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた免疫磁気選別によって、ＣＤ３細胞を枯渇させることができる。
好ましくは、臍帯血種細胞はＦ１５８でＶ／Ｖ多形成（Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩａ－１５８ Ｖ／Ｖ遺伝子型）（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．２００８Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２６：１７８９）を有するＣＤ１６を発現するように選別する。好ましくは、臍帯血種細胞はＫＩＲ－Ｂハプロタイプである。
実施例４：ＮＫ細胞供給源としての臍帯血
ＮＫ細胞は末梢血リンパ球の５－１５％を構成する。伝統的に、末梢血は治療学的用途のためのＮＫ細胞供給源として用いられてきた。しかし、本願に言及されているように、臍帯血由来ＮＫ細胞は、末梢血に由来する方法と比較して、本願に記載の培養システムでの増幅潜在性がほぼ１０倍より高く、細胞の早期疲労または老化がない。腫瘍細胞のエンゲージングにおいてＮＫ細胞の活性化に参加する受容体などのＮＫ細胞表面における対象受容体の発現は、末梢血ＮＫ細胞に比べて、臍帯血ＮＫ細胞で供与体の間でより一定であることが確認された。本願に記載の製造工程の利用は、供与体独立した方式で臍帯血中のＮＫ細胞を一定に活性化して、大規模の活性かつ一定のＮＫ細胞の生産を達成する。
図２に示すように、前臨床研究において、臍帯血－由来ＮＫ細胞（ＣＢ－ＮＫ）は、末梢血－由来ＮＫ細胞（ＰＢ－ＮＫ）より培養増殖力が約１０倍より高い。図３に示すように、腫瘍－エンゲージングＮＫ細胞活性化免疫受容体の発現は、末梢血エンゲージングの場合と比較して、臍帯血－由来医薬品においてより優れ、より一定であった。
実施例５：増幅および刺激されたＮＫ－細胞の表現型
一例として、臍帯血ユニットに由来するＮＫ細胞は、実施例１に記載の増幅および刺激工程によりｅＨｕｔ－７８細胞を用いて増幅および刺激した。図４に示すように、得られた増幅および刺激されたＮＫ細胞の集団は、一貫して高いＣＤ１６（１５８Ｖ）および活性化ＮＫ細胞受容体発現性を示した。
実施例６：ＡＢ－１０１
ＡＢ－１０１は、患者、例えば、単クローン抗体またはＮＫ細胞エンゲージャーを用いて治療した患者においてＡＤＣＣ抗－腫瘍反応を強化するように考案された生体外増幅および活性化されたエフェクター細胞を含む、普遍的で、規格品の、冷凍保存された、同種異系臍帯血由来ＮＫ細胞療法製品である。ＡＢ－１０１は、Ｔリンパ球の枯渇処理によりＮＫ細胞に対して濃縮され、ＩＬ－２および抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）が補充された操作済みの複製不完全性Ｔ細胞フィーダー細胞を用いて共培養された、臍帯血由来単核細胞（ＣＢＭＣ）で構成される。
ＡＢ－１０１は、ＦＤＡ許可された臍帯血に由来する、特に治療学的単クローン抗体（ｍＡｂ）と組み合わせ使用して血液および固形腫瘍を治療するために考案された、同種異系ＮＫ－細胞製品である。ＡＢ－１０１製造工程は、以下の属性を有するＮＫ細胞生産物を作製する：
・一貫性あるＮＫ細胞プロファイル。抗体が結合するＣＤ１６および腫瘍抗原－結合性／活性化受容体、例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、Ｎｋｐ３０およびＮＫｐ４４のような表面受容体の高い発現性。
・ＫＩＲ－Ｂ－ハプロタイプ。ＫＩＲ－Ｂハプロタイプは、ハプロ同種移植状況（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）で臨床成果の改善および同種異系の状況でより高い治療学的潜在性に関連性がある。
・ＣＤ１６ Ｆ１５８Ｖ多形成。ｍＡｂ Ｆｃ－結合する高親和性ＣＤ１６ Ｆ１５８Ｖ変異体は、改善された抗体依存的な細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を促進すると見られる。
・非－変形のＮＫ細胞。遺伝子強化または遺伝子編集は、ＡＢ－１０１医薬品に必要でないか、またはその一部である。
ＡＢ－１０１の構成成分および組成物を表１２に列挙する。ＡＢ－１０１は、成熟したＮＫ細胞を意味する自然細胞毒性受容体ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞（ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋）で構成される。ＡＢ－１０１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および大食細胞（≦０．２％ＣＤ３＋、≦１．０％ＣＤ１９＋、≦１．０％ＣＤ１４＋）を極少量含む。ＡＢ－１０１の培養に使用したｅＨｕＴ－７８Ｐフィーダー細胞の残留率はこの医薬品の≦０．２％である。
初期安定性実験は、ＡＢ－１０１が、気相液体窒素下、最大６ヶ月間安定的であることを示す。６ヶ月後の期間で製品安定性を評価するための長期安定性実験は進行中であり、最新安定性情報は分析認証書に収録される。
ＡＢ－１０１医薬品の作製は、以下のような核心的な段階で構成される（図５）：
・ＦＤＡ許可された臍帯血ユニット（Ｈｅｍａｃｏｒｄ、ＢＬＡ１２５９３７）解凍。
・臍帯血ユニット（ＣＢＵ）から冷凍－保存媒質の除去
・ＦＤＡ許可されたＶａｒｉｏ ＭＡＣＳ細胞選別システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたＣＤ３枯渇
・操作されたフィーダー細胞（ｅＨｕＴ－７８細胞）を用いたバッグでの増幅および共培養
・ＡＢ－１０１マスター細胞バンク（約バッグ２００個）に対する検査および冷凍保存
・解凍（バッグ１個）、増幅および操作されたＨｕＴ－７８細胞を用いた共培養
・バイオリアクタで追加的な増幅
・回収および充填（１×１０９ＮＫ細胞／バイアル）
・ＡＢ－１０１医薬品の冷凍保存（バイアル約１５０個）
・濃度、純度、効力および安定性を確認するための広範囲な特性究明。
表１３に示すように、このような作製工程は高純度および活性のＡＢ－１０１医薬品ＮＫ細胞を大量に再現可能に生産する。データポイントは独立した臍帯血ユニット３個から得られた結果を示す。
同一性（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）
ＣＤ３－、ＣＤ５６＋細胞の頻度を用いてＡＢ－１０１医薬品の同一性を分析する。ＡＢ－１０１医薬品サンプルを解凍して、染色緩衝剤に再び懸濁する。ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋表面抗原に結合する蛍光団で標識された抗体に再懸濁したサンプルを添加する。フローサイトメトリー測定を用いて、ＣＤ３－、ＣＤ５６＋集団％を製品の同一性の尺度として確認する。
同一性（ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）
ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋細胞の頻度を用いてＡＢ－１０１医薬品の同一性を分析する。ＡＢ－１０１医薬品サンプルを解凍して、染色緩衝剤に再び懸濁する。ＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋表面抗原に結合する蛍光団で標識された抗体に再懸濁したサンプルを添加する。フローサイトメトリー測定を用いて、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋集団％を製品の同一性の尺度として確認する。
純度（ＣＤ３＋）
ＣＤ３＋を発現する細胞の測定結果を用いてＡＢ－１０１医薬品の純度を評価する。フローサイトメトリー測定方法を用いて医薬品でＣＤ３＋を発現する細胞の純度を決定する。ＣＤ３＋細胞の集団の％を製品の純度の尺度として用いる。
純度（ＣＤ１４＋）
ＣＤ１４＋を発現する細胞の測定結果を用いてＡＢ－１０１医薬品の純度を評価する。フローサイトメトリー測定方法を用いて医薬品でＣＤ１４＋を発現する細胞の純度を決定する。ＣＤ１４＋細胞の集団の％を製品の純度の尺度として用いる。
純度（ＣＤ１９＋）
ＣＤ１９＋を発現する細胞の測定結果を用いてＡＢ－１０１医薬品の純度を評価する。フローサイトメトリー測定方法を用いて医薬品でＣＤ１９＋を発現する細胞の純度を決定する。ＣＤ１９＋細胞の集団の％を製品の純度の尺度として用いる。
純度：ｅＨｕＴ－７８Ｐ残留物（ｅＨｕＴ－７８Ｐ細胞残留物）
ＡＢ－１０１医薬品においてｅＨｕＴ－７８Ｐ細胞残留物をフローサイトメトリー測定（ＦＡＣＳ）によって測定する。ＦＡＣＳを用いて生きているＣＤ３＋４－１ＢＢＬｈｉｇｈ＋ ｅＨｕＴ－７８Ｐを定量することにより、ＡＢ－１０１ ＤＰ内のｅＨｕＴ－７８残留物を検出する。ｅＨｕＴ－７８は、皮膚Ｔリンパ球としてＣＤ３を発現するＨｕＴ－７８細胞株に由来するものであるので、順次に、一重項、７－ＡＡＤおよびＣＤ３＋４－１ＢＢＬ＋をゲーティングするＦＡＣＳゲーティング戦略（図１参照）を利用する。ＨｕＴ－７８細胞株に４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）、膜腫瘍壊死因子－α（ｍＴＮＦ－α）および膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）を形質導入した。遺伝子３種を強く発現するｅＨｕＴ－７８単一細胞を選別し、研究、マスターおよびワーキング細胞バンクを順次に設立した。これら遺伝子３種のうち、４－１ＢＢＬがＡＢ－１０１細胞バンクおよび最終医薬品において最も強く発現すると確認されたことから、ＦＡＣＳゲーティング戦略にこれを用いた。
効力（ＡＢ－１０１ ＤＰ細胞：Ｋ５６２細胞１０：１での細胞毒性）
Ｋ５６２腫瘍細胞に対する細胞性細胞毒性能力を評価してＡＢ－１０１医薬品の効力を決定する。医薬品の細胞毒性は、蛍光測定分析で評価する。Ｋ５６２腫瘍細胞を３０μＭカルセイン－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ）で３７℃で１時間染色する。医薬品サンプルと標識された腫瘍細胞を９６ウェルプレートで、３セットで３７℃および５％ＣＯ２下、４時間光遮断下に共培養する。自発的な最大放出を提供するために、標的に１０％ＦＢＳまたは２％トリトン－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を添加する。バックグラウンド蛍光を決定するために、それぞれのウェルに１０％ＦＢＳまたは２％トリトン－Ｘ１００が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を添加する。蛍光リーダーを用いて励起４８５ｎｍおよび放出５３５ｎｍで蛍光を測定する。特異的な細胞毒性％を下記式によって計算する。
効力（ＡＢ－１０１ ＤＰ細胞：Ｒａｍｏｓ細胞１０：１での細胞毒性）
前述の同一の方法および計算を用いてＲａｍｏｓ腫瘍細胞に対する細胞性細胞毒性能力を評価してＡＢ－１０１医薬品の効力を決定する。この検査に対する詳細事項は確認中である。
実施例７：ＡＢ－１０１表現型特性の究明
様々なＡＢ－１０１バッチにおいて抗体－エンゲージングＣＤ１６および活性化、阻害性およびケモカイン受容体の発現だけでなく、純度をフローサイトメトリー測定により決定した。
ＡＢ－１０１純度は細胞表面マーカーを用いて測定した：ＡＢ－１０１バッチは＞９９％ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と＜０．１％ＣＤ３＋、ＣＤ１４＋およびＣＤ１９＋細胞を含むことが観察された。ＡＢ－１０１でＣＤ１６発現を測定した。ＡＢ－１０１細胞のうち９５．１１±２．５１％がＣＤ１６＋であり、ＣＤ１６のＭＦＩ平均および中央値はそれぞれ１５３１１±６１８６および１３０９７±５５９２であった。ＮＫ細胞は多様なＮＫ特異的な活性化および阻害性受容体を発現することが知られている。検査した多様なＡＢ－１０１バッチにおいて、細胞の＞８０％がＣＤ１６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、ＮＫｐ３０、２Ｂ４、Ｔｉｍ－３、ＣＤ４４を発現し、細胞の４０～７０％はＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１を発現し、細胞の約３０％はＣＤ１６１およびＣＤ９６を発現し、細胞の１５％はＣＸＣＲ３を発現し、細胞の５％未満はその他の活性化阻害受容体を発現した。
作製工程の互いに異なる３つの段階で細胞の表現型特徴を評価するために、本実験にＡＢ－１０１のＧＭＰバッチ２個を含めた：ＣＤ３＋細胞枯渇処理した後の臍帯血細胞；中間産物としてマスター細胞バンク（ＭＣＢ）、およびＡＢ－１０１最終医薬品（ＤＰ）。ＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰそれぞれで純度およびＮＫ細胞受容体を測定した。その結果によれば、まず、ＣＢに由来するＮＫ細胞は未成熟ＮＫ表現型を示すことが確認された。ＮＫ表現型は作製工程中に成熟した。ＭＣＢ段階では細胞の９０％以上がすでに成熟したＮＫ細胞で現れる表現型特徴を発現し、その他の細胞タイプマーカーは＜０．１％であった。ＣＤ３枯渇した細胞から、ＭＣＢまで、そして最終的にＤＰまで作製工程を通してＮＫ細胞－特異的な受容体のほとんどは発現レベルが増加した。
ＡＢ－１０１の純度は、ＮＫ細胞に対してはＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞、Ｔ細胞に対してはＣＤ３＋細胞、単核球に対してはＣＤ１４＋細胞、Ｂ細胞に対してはＣＤ１９＋細胞として表示する。ＡＢ－１０１バッチ計９個で純度を測定した。その結果、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞は９９．２７±０．５９％（平均±ＳＤ）、ＣＤ３＋細胞は０．０２±０．０３％、ＣＤ１４＋細胞は０．１０±０．１２％、そしてＣＤ１９＋細胞は０．０２±０．０４％であった（図６）。したがって、ＡＢ－１０１は高純度のＮＫ細胞で構成され、不純物として他のタイプの細胞はほとんど存在しないことが検証された。
ＧＭＰ条件で作製したＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰの純度の比較
ＡＢ－１０１のＧＭＰバッチ２個を用いてＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）、中間産物（マスター細胞バンク、ＭＣＢ）および最終医薬品（ＤＰ）の純度を分析した。ＣＤ３枯渇した細胞分画において細胞の５０～６０％はＮＫ細胞であり、その百分率はＭＣＢおよびＤＰで９０％以上に増加した。ＣＤ３枯渇した細胞分画の２０～３０％はＣＤ１４＋細胞およびＣＤ１９＋細胞であり、このような細胞百分率はＭＣＢおよびＤＰで０．１％未満に減少し、これはＡＢ－１０１ ＭＣＢおよびＡＢ－１０１の最終医薬品の純度を示す（図７、表１４）。
ＧＭＰ条件で作製したＣＤ３枯渇した細胞、ＭＣＢおよびＤＰでのＮＫ細胞受容体の比較
ＡＢ－１０１のＧＭＰバッチをさらに用いて、ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）、中間産物（マスター細胞バンク、ＭＣＢ）および最終医薬品（ＤＰ）で多様なＮＫ細胞受容体の発現を分析した。ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）と比較した場合、いくつかのＮＫ細胞およびＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６およびＤＮＡＭ－１のような活性化受容体がＭＣＢおよび最終医薬品においてより高いレベルに発現したことが観察された。ＣＤ５７発現は、ＡＢ－１０１出発材料（ＣＤ３枯渇した細胞）と比較して、ＭＣＢおよび最終医薬品でより低かった（図８、表１５）。全般的に、データはＭＣＢおよび最終医薬品においてＮＫ細胞活性化受容体の発現増加を示し、これはＡＢ－１０１が腫瘍に対して効果的であることを意味する。
結び
表面マーカー分析の使用で、ＡＢ－１０１製品の同一性および純度とバッチ間の一貫性が立証された。さらに、ＮＫ－特異的な活性化および阻害細胞表面マーカーに対する広範囲な評価により作製増幅工程後、ＡＢ－１０１製品の一貫したプロファイルが確立された。ＣＢ由来ＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）由来ＮＫ細胞と比較して、ＮＫＧ２Ａの高発現およびＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５７、ＩＬ－２Ｒ、ＣＤ１６、ＤＮＡＭ－１の低発現のような未成熟表現型を有するものであり、また、未成熟表現型を有するＣＢ由来ＮＫ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞毒性が低いことが知られている。本実験のデータは、同種異系臍帯血（ＣＢ）に由来するＮＫ細胞製品、すなわちＡＢ－１０１が腫瘍細胞に対して潜在的により優れた細胞毒性を意味する主要活性化受容体を高いレベルに発現することを立証する。
実施例８：ＡＢ－１０１薬物動態学および生体分布
ＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスモデルを用いてＡＢ－１０１の生体分布および薬物動態学（ＰＫ）を確認した。ビヒクル（ＰＢＳ、デキストラン、アルブミン（ヒト）ＤＭＳＯ）とＡＢ－１０１細胞（０．５×１０７細胞／マウス、２×１０７細胞／マウス）を静脈内（０．２５ｍｌ／マウス）で計８回投与した。最後の用量を注入した後、４時間、１日、３日、７日、１４日および７８日（時点別、マウス雄ｎ＝３、雌ｎ＝３）にビヒクル群とＡＢ－１０１群の動物を犠牲にした。
ＡＢ－１０１は、投与後４時間から始めて、ＡＢ－１０１を最後に投与した後、３日（５３日）まで、主に高度に灌流する組織（肺、脾臓、心臓および肝）と注射部位から主に検出された。最後の投与後７日目（５７日）に、肺（サンプル６個中３個）、脾臓（サンプル６個中５個）および注射部位（サンプル６個中５個）からＡＢ－１０１が検出された。最後の投与後１４日および２８日目（それぞれ６４日および７８日）に、ＡＢ－１０１はそれぞれ注射部位サンプル２個および１個から検出された。６４日および７８日目に注射部位サンプルから観察された散発的な結果と低い濃度はＡＢ－１０１検査物の全身持続性を意味しないであろう。
生体分布実験から入手した結果は、生体内ＡＢ－１０１分布が静脈内投与経路と一致し、細胞が７日後に組織クリアランス（ｔｉｓｓｕｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を示し、永久生着の証拠がない、長期持続の可能性がないことを示す。
実施例９：ＡＢ－１０１毒性学
ＮＳＧマウスのＧＬＰ実験においてＡＢ－１０１の非－臨床的な毒性を評価した。本実験はＡＢ－１０１の急性および遅延性毒性プロファイルを評価するように設計した。ＡＢ－１０１を２つの用量水準、すなわち０．５×１０７および２×１０７細胞／動物で本実験で検査した。提案された検査用量範囲は最初のヒト実験（４×１０９細胞／用量）で提供することを計画したヒト等価最高用量よりも多く露出する水準に製品を提供するように設計した。相対成長率（Ｎａｉｒ２０１６）に基づいて、０．５×１０７細胞／マウスは１４×１０９細胞／ヒトに相応し、２×１０７細胞／マウスは５６×１０９細胞／ヒトに相応するが、これは体重７０ｋｇの患者に対して推定したものである。ＡＢ－１０１は８週間毎週１回尾静脈を通して静脈内投与した。８次（すなわち、最後の投与）投与した後、３日目にＡＢ－１０１の急性毒性を評価した。８次投与後２８日の回復期間終了時点で遅延性毒性を評価した。各動物において生存性、体重、臨床観察結果および促進（ｐａｌｐａｔｉｏｎ）を本実験の生涯期間に記録した。すべての動物において安楽死の時点で肉眼剖検し、血液分析のためのサンプル収集、臨床化学および組織病理学的分析を行った。
各群は、両性での所見を評価し、統計的検証力分析（ｐｏｗｅｒｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）のために、各性別あたり１０匹ずつ動物計２０匹で構成した。ＡＢ－１０１処理群と比較するために、ビヒクル処理対照群も含めた。処置の偏りを最小化するために、動物はコンピュータ－生成された（体重の順）ランダムな手順によって用量群に割り当て、雌および雄を別途にランダム割り当てた。本実験はデータ記録などを含めてＧＬＰ指針を守った。
評価した用量水準のどの用量でもＡＢ－１０１の投与に関連する死亡および有害な臨床的な観察結果は記録されなかった。現れたすべての軽微な観察結果はマウスで一般的な結果であり、ＡＢ－１０１の投与に関連するものとは見なされなかった。体重および臓器重量の変化は用量群の間で類似しており、処置後評価した日付でも類似していた（急性毒性群の場合に５３日、遅延毒性群の場合に７８日）。急性または遅延性毒性群において安楽死の時点で動物から確認された血液学および臨床化学媒介変数または肉眼剖検所見でＡＢ－１０１－関連の変化はなかった。統計的有意性に関係なく、個体間および平均臨床化学数値間ですべての変動は散発的であり、生物学的および手順－関連偏差と一貫性があり、および／またはそのサイズがわずかであると見なされ、よって、ＡＢ－１０１の投与とは関係ないと見なされた。ＡＢ－１０１－関連の顕微鏡的所見はなかった。結論的に、ＧＬＰ毒性実験の結果は、最大２×１０７細胞／投与／動物で繰り返し投与したＮＳＧマウスでＡＢ－１０１が十分な耐薬性であることを示唆する。
実施例１０：ＮＫ細胞の冷凍保存
図５に示された工程によりＡＢ－１０１細胞を準備した。培養期間終了時点で、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｋＳｅｐ（Ｒ）４００の使い捨て自動遠心分離システムを用いて、相対遠心力（ＲＣＦ）：８００－１２００ｇ下、流速６０～１２０ｍｌ／ｍｉｎで細胞を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗った。洗った後、（１）アルブミン（ヒト）；（２）デキストラン４０；（３）ＤＭＳＯ；および（４）ＰＢＳを用いて、標的濃度１×１０８細胞／ｍｌで、ＡＢ－１０１細胞を剤形化した（冷凍保存組成物の例＃１、表４）。懸濁物剤形を１０ｍｌ ＡＴ－Ｃｌｏｓｅｄ ｖｉａｌ（Ｒ）に目標体積１１ｍｌで充填した後、表示し、速度制御型冷凍庫に入れて、≦－１３５℃で冷凍保存した。
初期放出検査データとして時間＝０に安定性実験を行った。安定性保存冷凍庫は温度を≦－１３５℃に維持するように設定された検証済みの気相ＬＮ２保存冷凍庫である。無菌性時点で、バッチサイズの１０％または４個のバイアルのうちより大きい方を検査した。検査物は臨床的な解凍条件を模倣するために３７℃で解凍した。
表１６に示すように、冷凍保存したＡＢ－１０１の生存性および活性が少なくとも９ヶ月間保存されることが確認された。
投与する直前までの取扱時、ＡＢ－１０１の安定性特徴を把握するために、「ベッドサイド（ｂｅｄｓｉｄｅ）」短期安定性実験を行った。サンプルを解凍した後、１０ｍｌシリンジに移して濾過し、内容物はファルコン試験管で保管し、表示された指定時間に所定の温度でおいた。採取した産物を分析した。ＡＢ－１０１ロット２種に対する短期安定性データを表１７に示す。
実施例１１：ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８Ｖ／Ｖに対して選別した臍帯血ＮＫ細胞は増幅後にＣＤ３８発現性が低い
ＫＩＲ－ＢおよびＣＤ１６ １５８ｖ／ｖに対して選別した互いに異なる供与者から得られた２種の臍帯血を用いて、実施例６に記載されているようにＮＫ細胞を増幅して、ＡＢ－１０１細胞を構築し、そして、１つの非－選別供与者臍帯血（対照群）でも構築した。フローサイトメトリー測定により得られた細胞純度（ＣＤ５６＋ＣＤ３－％）を図９に示す。図１０および図１１に示すように、ＣＤ３８発現は、非－選別ＮＫ細胞と比較して、ＫＩＲ－Ｂ／１５８ ｖ／ｖ ＮＫ細胞で集団（陽性％、図１０）、そして個別的（陽性細胞の平均蛍光強度、図１１）にもより低かった。
実施例１２：ＡＢ－１０１の表面タンパク質発現
実施例６に記載されているように、ＮＫ細胞を増幅させた。出発物質としてＮＫ細胞供給源（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－発現に対してゲーティングした臍帯血、ｎ＝３）の表面タンパク質発現を、増幅して得られたＮＫ細胞（ｎ＝１６）と比較した。図１２に示すように、ＣＤ１６発現は得られた細胞で高く、出発細胞に比べて増加した。ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ９４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６の発現も増加したのに対し、ＣＸＣＲ４およびＣＤ１２２の発現は減少した。
実施例１３：ＡＢ－１０１とセツキシマブとの組み合わせ
多様な癌細胞株タイプに対するＡＢ－１０１とセツキシマブとの組み合わせの短期および長期細胞毒性を測定した。
頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）短期細胞毒性（４時間）を多様なＥ：Ｔ比率および抗体濃度を適用して検査した。図１３に示しているように、Ｅ：Ｔ比率３：１で、セツキシマブとＡＢ－１０１（ＣＴＸ）との組み合わせは、細胞株３種（ＣＡＬ－２７、ＣＡＬ－３３およびＳＡＴ）に対して用量－依存的な細胞溶解を示し、細胞溶解％の面でＡＢ－１０１単独（Ｎｏ）およびＡＢ－１０１とＩｇＧとの組み合わせ（ＩｇＧ）より優れていた。また、これは抗体単独１μｇ／ｍｌ（ＣＴＸ単独）より性能に優れていた。図１４に示しているように、多様なＥ：Ｔ比率（ｎ＝２）でセツキシマブを１μｇ／ｍｌで投与した場合、ＡＢ－１０１とセツキシマブとの組み合わせ（ＮＫ＋ＣＴＸ）は、ＡＢ－１０１単独（ＮＫ単独）およびＡＢ－１０１＋ＩｇＧ（ＮＫ＋ｈＩｇＧ）より効果に優れていた。
結腸直腸癌（ＣＲＣ）：ＥＧＦＲ遺伝子増幅が存在する多様なＥＧＦＲ＋細胞株に対する短期細胞毒性（４時間）および長期細胞毒性（７２時間）を、Ｅ：Ｔ比率３：１（短期および長期）または１：１（短期）およびセツキシマブ濃度１μｇ／ｍｌを適用して、検査した（短期細胞毒性：ＳＷ４８、ＨＣＴ－１１６、ＳＷ４８０およびＨＴ－２９、長期細胞毒性：ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９）。図１５に示しているように、ＡＢ－１０１とセツキシマブとの組み合わせの短期細胞毒性は、ＡＢ－１０１単独または対照群ＩｇＧの短期細胞毒性に類似していた。同一のパターンは長期細胞毒性でも同様であったが（図１６）、検査したすべての細胞株に対して細胞溶解が全くまたはほとんど観察されないセツキシマブ単独に比べて、ＡＢ－１０１単独またはＩｇＧ／セツキシマブでより有意に高かった。
乳癌：短期および長期細胞毒性（４時間）のみならず、細胞内ＣＤ１０７ａおよびサイトカイン染色をＥＧＦＲ＋陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対して調べた。図１７に示しているように、１μｇ／ｍｌ濃度で、ＡＢ－１０１とセツキシマブとの組み合わせ（ＣＴＸ）は、ＡＢ－１０１単独（Ｎｏ）およびＡＢ－１０１＋ＩｇＧ（ＩｇＧ）と比較して、細胞溶解％の面でややより高い細胞溶解を示した。図１８に示しているように、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞＋セツキシマブ（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８＋ＣＴＸ）と共培養した後、ＡＢ－１０１細胞で、ＡＢ－１０１単独（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）または非－処理（－）と比較して、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの発現レベルも増加した。図１９に示しているように、長期殺傷（１２０時間、ｎ＝３）は、ＡＢ－１０１＋ＩｇＧ（ＡＢ－１０１＋ＩｇＧ）、ＡＢ－１０１単独（ＡＢ－１０１）、セツキシマブ単独（ＣＴＸ）、ＩｇＧ単独（ＩｇＧ）および無処理（Ｎｏ（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８単独））と比較して、ＡＢ－１０１およびセツキシマブ（ＡＢ－１０１＋ＣＴＸ）処理細胞で増加した。
その他の実施形態
本発明が詳細な説明とともに記述されたが、上述した説明は例示のためのものに過ぎず、添付した特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されなければならない。他の側面、利点および修正も添付した特許請求の範囲に属する。

Claims (59)

  1. ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の集団およびヒトＥＧＦＲを標的とする抗体を投与する段階を含み、前記ＮＫ細胞が、患者に対して同種異系であり、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である、ＥＧＦＲ＋癌患者を治療する方法。
  2. 前記癌が、膠芽腫、肺腺癌腫、非－小細胞性肺癌、低悪性度神経膠腫、結腸直腸腺癌腫、高悪性度神経膠腫、多発性骨髄腫、乳腺癌腫、毛様細胞性星細胞腫、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記患者は、抗－ＥＧＦＲ抗体を用いた治療後に再発した、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記患者は、自家幹細胞移植またはキメラ抗原受容体Ｔ－細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）を用いた治療後に疾患の進行に移行した、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記患者は、ＮＫ細胞１×１０８～１×１０１０個が投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記患者は、ＮＫ細胞１×１０９～８×１０９個が投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記患者は、ＮＫ細胞４×１０８、１×１０９、４×１０９または８×１０９個が投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記患者は、抗体を１００～５００ｍｇ／ｍ２で投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記抗体が、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記患者は、治療する前にリンパ球除去化学療法が施される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記リンパ球除去化学療法が、非－骨髄破壊性化学療法である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記リンパ球除去化学療法が、シクロホスファミドおよびフルダラビンのうちの１つ以上を用いた治療を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記リンパ球除去化学療法が、シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた治療を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記シクロホスファミドは、１００－５００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記シクロホスファミドは、５００ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記フルダラビンは、１０－５０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記フルダラビンは、３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙで投与される、請求項１７に記載の方法。
  19. ＩＬ－２の投与を追加的に含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記患者は、ＩＬ－２を１×１０６ＩＵ／ｍ２で投与される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記患者は、ＩＬ－２を６，０００，０００ＩＵで投与される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記ＩＬ－２の投与は、ＮＫ細胞の投与から１－４時間以内に行われる、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ＮＫ細胞とヒトＥＧＦＲを標的とする抗体の投与が、毎週行われる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ＮＫ細胞とヒトＥＧＦＲを標的とする抗体は、４－８週間毎週投与する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記ＮＫ細胞は、毎週投与し、前記ヒトＥＧＦＲを標的とする抗体は、隔週で投与する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記ＮＫ細胞は、遺伝子組換えされていない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＮＫ細胞は、少なくとも７０％がＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記ＮＫ細胞は、少なくとも８５％がＣＤ５６＋およびＣＤ３－である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＮＫ細胞は、１％以下がＣＤ３＋であり、ＮＫ細胞は、１％以下がＣＤ１９＋であり、ＮＫ細胞は、１％以下がＣＤ１４＋である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ＮＫ細胞の各投与が、ＮＫ細胞１×１０９～５×１０９個の投与である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記患者は、ＮＫ細胞を１次投与する前、ＥＧＦＲを標的とする抗体の用量が投与される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞が、増幅された臍帯血ナチュラルキラー細胞である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ１６＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ４６＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ３０＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＤＮＡＭ－１＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＮＫｐ４４＋細胞を少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ３＋細胞を２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ１４＋細胞を２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ１９＋細胞を２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団が、ＣＤ３８＋細胞を２０％未満、例えば、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下または０％含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６トランス遺伝子を含まない、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記ナチュラルキラー細胞は、外因性ＣＤ１６タンパク質を発現しない、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞は、遺伝子操作されていない、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞は、同一の臍帯血供与体に由来する、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＮＫ細胞の集団が、増幅されたナチュラルキラー細胞を少なくとも１億個含み、例えば、２億、２億５千万、３億、４億、５億、６億、７億、７億５千万、８億、９億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１５０億、２００億、２５０億、５００億、７５０億、８００億、９００億、１０００億、２０００億、２５００億、３０００億、４０００億、５０００億、６０００億、７０００億、８０００億、９０００億、１兆、２兆、３兆、４兆、５兆、６兆、７兆、８兆、９兆または１０兆個含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＮＫ細胞の集団が、以下を含む方法により生産された、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を得る段階；
    （ｂ）前記種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；
    （ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；
    これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階。
  49. 前記ＮＫ細胞の集団が、以下を含む方法により生産された、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）臍帯血からナチュラルキラー細胞を含む種細胞を得る段階；
    （ｂ）前記種細胞でＣＤ３＋細胞を枯渇処理する段階；
    （ｃ）枯渇処理された種細胞を膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第１の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、ナチュラルキラー細胞を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を生産する段階；および
    （ｄ）膜結合型ＩＬ－２１、ＴＮＦα突然変異および４－１ＢＢＬ遺伝子を発現するように操作された第２の複数のＨｕｔ７８細胞とともに培養することにより、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を増幅させて、増幅されたナチュラルキラー細胞を生産し；
    これによって増幅されたナチュラルキラー細胞の集団を生産する段階。
  50. 前記ＮＫ細胞の集団が、段階（ｃ）の後に、
    （ｉ）前記増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団を複数の容器で冷凍する段階；および
    （ｉｉ）前記増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液が収容された容器を解凍する段階を追加的に含む方法により生産され、
    段階（ｄ）において、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の増幅が、増幅されたナチュラルキラー細胞のマスター細胞バンク集団の分液を増幅させることを含む、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. 前記臍帯血が、ＫＩＲ－Ｂハプロタイプであり、ＣＤ１６ １５８Ｖ多形成に対してホモ接合性である供与体に由来する、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ＮＫ細胞の集団が、臍帯血からナチュラルキラー細胞を少なくとも１０，０００倍、例えば、１５，０００倍、２０，０００倍、２５，０００倍、３０，０００倍、３５，０００倍、４０，０００倍、４５，０００倍、５０，０００倍、５５，０００倍、６０，０００倍、６５，０００倍または７０，０００倍増幅することを含む方法により生産された、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団は、増幅後に濃縮または分類しない、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＣＤ１６を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ３０を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４４を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記増幅されたナチュラルキラー細胞の集団中のＤＮＡＭ－１を発現するＮＫ細胞の百分率が、臍帯血に由来する種細胞中のナチュラルキラー細胞の百分率と同一であるか、またはそれより高い、請求項４８～５８のいずれか１項に記載の方法。

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