ES2742528T3

ES2742528T3 - Receptores de antígenos quiméricos

Info

Publication number: ES2742528T3
Application number: ES15775814T
Authority: ES
Inventors: Attilio Bondanza; Monica Casucci; Maria Chiara Bonini
Original assignee: MolMed SpA
Current assignee: AGC Biologics SpA
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2035-09-14
Also published as: IL251030B; US20170247428A1; RU2017112882A; KR20170054505A; PL3194434T3; ZA201701344B; IL251030A0; CA2958807C; AU2015316480A1; ES2933352T3; WO2016042461A1; PT3194434T; SG11201701309SA; LT3194434T; HRP20191468T1; EP3575315A1; MX2017003421A; UA123764C2; EP3194434B1; EP4159752A1

Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un espaciador extracelular que comprende al menos parte del dominio extracelular del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad humano (LNGFR), en donde dicho al menos parte de LNGFR es adecuado para facilitar la inmunoselección e identificación de células transducidas con dicho CAR, en donde el espaciador extracelular comprende los tres primeros dominios TNFR-Cys de LNGFR.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígenos quiméricos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CARs) que comprenden espaciadores basados en receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR).

Antecedentes a la invención

La inmunoterapia basada en transferencia adoptiva de células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos T) en un paciente puede desempeñar una función importante en el tratamiento de la enfermedad, en particular cáncer. Entre los muchos tipos diferentes de agentes inmunoterapéuticos, uno de los métodos terapéuticos más prometedores implica el uso de receptores de antígenos quiméricos (CARs). Los CARs son receptores genéticamente manipulados que se diseñan para direccionar un antígeno específico tal como un antígeno de tumor (Sadelain et al., Cancer Discovery.

2013. 3(4):388-98). Por ejemplo, los linfocitos T se transducen con CARs de forma que los linfocitos T que expresan CARs destruyan los tumores mediante el antígeno diana.

Los CARs comprenden un dominio de unión a ligando extracelular, lo más comúnmente un fragmento variable monocatenario de un anticuerpo monoclonal (scFv) enlazado a componentes de señalización intracelular, lo más comúnmente CD3Z solo o combinado con uno o más dominios coestimulantes. Se añade frecuentemente un espaciador entre el dominio extracelular de unión al antígeno y el resto transmembranario para optimizar la interacción con la diana.

Lo más comúnmente, se usa el dominio Fc CH2-CH3 de la bisagra de la inmunoglobulina constante IgG1 como dominio de espaciador. Este espaciador se usa para seleccionar y seguir células que expresan el CAR. Sin embargo, el espaciador de IgG1 también se puede unir a receptores de Fc gamma IgG de superficie expresados sobre células inmunitarias innatas, como macrófagos y linfocitos citolíticos espontáneos (Hombach et al, Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75). Esta unión activa tanto los linfocitos T manipulados como las células inmunitarias innatas independientes de la especificidad del dominio de unión a CAR que conduce a una respuesta inmunitaria inespecífica no deseada.

Existe una necesidad de CARs que no generen respuestas inmunitarias inespecíficas y no se clarifiquen prematuramente por el sistema inmunitario del hospedador. También existe la necesidad de CARs que comprendan unidades espaciadoras que facilitan la selección de células genéticamente manipuladas para expresar CARs. La presente invención trata estas necesidades.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un espaciador extracelular que comprende al menos parte del dominio extracelular de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) humano, en donde dicho al menos parte del LNGFR es adecuado para facilitar la inmunoselección e identificación de células transducidas con dicho CAR, en donde el espaciador extracelular comprende los tres primeros dominios TNFR-Cys de LNGFR.

Preferentemente, el espaciador carece del dominio intracelular de LNGFR.

En una realización, el espaciador comprende los cuatro dominios TNFR-Cys de LNGFR o fragmentos o derivados de los mismos.

En otra realización, el espaciador comprende los cuatro dominios TNFR-Cys (TNFR-Cys 4), pero en donde los siguientes aminoácidos se retiran de dicho dominio: NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW. Preferentemente, la secuencia NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW se sustituye por la siguiente secuencia de aminoácidos ARA. En otra realización, el espaciador comprende el tallo rico en serina/treonina de LNGFR.

En otra realización, el espaciador carece del tallo rico en serina/treonina de LNGFR.

El espaciador puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o una secuencia al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a las mismas.

En otra realización, el espaciador puede consistir en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o una secuencia al menos 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a las mismas.

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 son elementos espaciadores preferidos.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

(i) un dominio diana específico de antígeno;

(ii) un dominio de espaciador extracelular como se define en el presente documento;

(iii) un dominio transmembranario;

(iv) opcionalmente al menos un dominio coestimulante; y

(v) un dominio de señalización intracelular.

Preferentemente, el dominio diana específico de antígeno comprende un anticuerpo o fragmento del mismo, más preferentemente un fragmento variable monocatenario.

Preferentemente, el dominio diana específico de antígeno se dirige a un antígeno tumoral. Los ejemplos de dichos antígenos incluyen CD44, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, mesotelina, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, CEA, MAGE A3 TCR.

Preferentemente, el antígeno tumoral es la isoforma 6 de CD44 (CD44v6).

Los ejemplos de dominios transmembranarios incluyen un dominio transmembranario de una cadena zeta de un complejo de receptor de linfocitos T, CD28 y CD8a.

Los ejemplos de dominios coestimulantes incluyen un dominio coestimulante de CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 y CD40.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelular incluyen cadena zeta de CD3 humano, FcyRIII, FcsRI, una cola citoplásmica de un receptor de Fc y un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) que lleva receptores citoplásmicos.

En una realización preferida, el dominio diana específico de antígeno del CAR se dirige a CD44v6, el dominio transmembranario del CAR comprende un dominio transmembranario de CD28, el dominio de señalización intracelular del CAR comprende un dominio de señalización intracelular de cadena zeta de CD3 humano y el dominio coestimulante del CAR comprende un dominio endo-coestimulante de CD28.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR de la invención y como se define en el presente documento.

Preferentemente, el polinucleótido codifica un dominio de espaciador que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a las mismas.

En una realización, el polinucleótido codifica un dominio de espaciador que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a la misma.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la invención. En una realización, el vector es un vector viral.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula que comprende un CAR, un polinucleótido, o un vector de la presente invención. Preferentemente, la célula es un linfocito T.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula de la invención.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un CAR, un polinucleótido, un vector o una célula de la invención para su uso en terapia, preferentemente terapia del cáncer.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un CAR de la presente invención en donde el dominio diana específico de antígeno se dirige a CD44v6 para su uso en el tratamiento de tumores que expresan CD44.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de tratamiento que comprende administrar un CAR, un polinucleótido, un vector o una célula de la invención a un sujeto en necesidad de los mismos.

Los CARs a modo de ejemplo se muestran en las Figuras 10 a 17.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Fundamento de la generación de diferentes construcciones CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR. A. Esquema que explica las limitaciones de linfocitos T de CAR que llevan el espaciador CH2CH3 de IgG1. B. Estructura de la porción extracelular del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) y de las 4 nuevas construcciones de CAR que se han generado. También están incluidos CD44v6-CAR.28z que llevan el espaciador CH2CH3 de IgG1 natural o mutado (mCH2CH3). CHW: CD44v6-CAR.28z que lleva el espaciador CH2CH3 natural. CHM: CD44v6-CAR.28z que lleva el espaciador CH2CH3 mutado. NWL: CD44v6-^cA^r.28^zque lleva el espaciador natural largo LNGFR (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys y los tallos). NWS: CD44v6-CAR.28z que lleva el espaciador natural corto LNGFR (incluyendo solo los 4 dominios TNFR-Cys). NML: CD44v6-CAR.28z que lleva el espaciador mutado largo LNGFR (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys con una deleción en el cuarto dominio y el tallo). NMS: CD44v6-CAR.28z que lleva el espaciador mutado corto LNGFR (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys con una deleción en el cuarto dominio y el tallo). Las llaves indican que la longitud del espaciador se expresó en aminoácidos. Gris: scFv. Blanco: dominio coestimulante CD28; negro: CD3Z.

Figura 2. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se pueden clasificar con mAbs anti-LNGFR, expandir eficientemente in vitro y mantener un fenotipo de diferenciación temprana. Se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28, se transdujeron con vectores retrovirales (RVs) que codifican las diferentes CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR y se cultivaron con IL-7/IL-15. A. Identificación de CAR sobre la superficie de linfocitos T usando el mAb específico de LNGFR C40-1457 (gráficos superiores). Identificación de CAR sobre la superficie de linfocitos T usando el mAb específico de LNGFR ME20.4 (gráficos inferiores) B. Izquierda: Linfocitos T que expresan las diferentes CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR después de clasificar con el mAb C40-1457 y perlas anti-PE. Derecha: Cinética de expansión de linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 y separadas por LNGFR clasificados expresados como aumento en veces. C. Fenotipo de diferenciación funcional de las diferentes CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR 15 días después de la activación. Linfocitos T madre de memoria de CD45RA+/CD62L+, linfocitos T de memoria central de CD45RA-/CD62L+, linfocitos T de memoria efectora CD45RA-/CD62L-, de CD45RA+/CD62L- RA. Los gráficos y diagramas son representativos de n=4 experimentos independientes.

Figura 3. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR reconocen específicamente células tumorales CD44v6+vas in vitro. A. Después de la clasificación, se cultivaron los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, NWS, NML, NMS), linfocitos T de CD44v6-CAR separadas por CH2CH3 (CHW, Ch M) y linfocitos T que llevan un CAR irrelevante con células de mieloma MM1.S CD44v6+vas, células de leucemia THP-1 CD44v6+vas o células linfoblastoides BV-173 CD44v6-vas a diferentes relaciones E:D. Después de 4 días, se contaron las células tumorales residuales y se analizaron por FACS. Se muestra el índice de eliminación (véase Métodos de ejemplo) para linfocitos T de CD44v6-CAR.28z a diferente relación E:D. B. Se cargaron linfocitos T de CD44v6-CAR.28z con el colorante CFSE y se estimularon con líneas de células tumorales irradiadas a la relación E:D 1:5. Después de 6 días, se analizó la proliferación de linfocitos T por FACS expresada como células que diluyen CFSE. Los gráficos y diagramas son representativos de n=4 experimentos independientes.

Figura 4. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR carecen de reconocimiento mediado por FcRg. A. Después de la clasificación, los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, NWS, NML, NMS), linfocitos T de CD44v6-CAR separadas por CH2CH3 (CHW, CHM) y linfocitos T que llevan un CAR irrelevante de n=4 donantes sanos se cultivaron con células de leucemia THP-1 CD44v6+vas/FcRg+vas o células de leucemia HL-60 CD44v6-vas/FcRg+vas a diferentes relaciones E:D. Después de 4 días, se contaron las células tumorales residuales y se analizaron por FACS. Se muestra el índice de eliminación (véase Métodos de ejemplo) para los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z a diferentes relaciones E:D. B. Se cargaron linfocitos T de CD44v6-CAR.28z con el colorante CFSE y se estimularon con células linfoblastoides THP1, HL60 o BV-173 CD44v6-vas/FcRg-vas irradiadas. Después de 6 días, se analizó la proliferación de linfocitos T por FACS y se expresó como células que diluyen CFSE. Los gráficos y diagramas son representativos de n=4 experimentos independientes.

Figura 5. CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR no se estimulan mediante NGF soluble. A. Después de 24 horas de exposición a NGF recombinante humano a diferentes concentraciones, se analizaron células neuronales PC-12 LNGFR+vas para la formación de dendritas por microscopía óptica. B. Después de la clasificación, los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, NWS, n Ml , NMS) y los linfocitos T CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (C^hW, CHM) se cargaron con el colorante CFSE y se expusieron a diferentes concentraciones de NGF. Después de 4 días, se analizó la proliferación de linfocitos T por FACS y se expresó como células que diluyen CFSE. Se muestra la dilución de CFSE después del co-cultivo con células de mieloma MM1.S CD44v6+vas o células linfoblastoides BV-173 CD44v6-vas para comparación. Los gráficos y diagramas son representativos de n=2 experimentos independientes. Los gráficos representan media ± DE de los dos experimentos.

Figura 6. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se expanden, persisten y median mejor en los efectos antileucémicos superiores en un modelo de enfermedad residual mínima. Se infundieron ratones NSG con células de leucemia THP-1 CD44v6+vas y, después de 3 días, se trataron con los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, nWs , NML, NMS), linfocitos T de CD44v6-CAR separadas por CH2CH3 (CHW) o con linfocitos T que expresan un CAR irrelevante (CTR), todos clasificados hasta >95 % de pureza. A. Gráficos representativos (izquierda) y gráfico todo incluido (derecha) que muestran linfocitos T circulantes de CD44v6-CAR.28z de cada ratón tres días después de la infusión. Se siguieron por FACS las CD44v6-CAR.28z separadas de diferente forma después de la tinción con un anticuerpo policlonal anti-IgG (CTR y CHW) o el mAb específico de LNGFR, mAb C40-1457. B. Cinética de la expansión y persistencia de linfocitos T de CD44v6-CAR28z con el tiempo. C. Peso de hígado infiltrado con THP1 de ratones tratados en el momento del sacrificio (7 semanas). La zona discontinua representa el intervalo de peso normal del hígado de ratones NSG normales de la misma edad / sexo. Se muestran los resultados de una prueba de ANOVA unilateral cuando son estadísticamente significativos (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001).

Figura 7. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se expanden, persisten y median mejor en efectos antimieloma superiores en un modelo de enfermedad bien establecido. Se infundieron ratones NSG con células MM1.S CD44v6+vas y, después de 5 semanas, se trataron con diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LN^gF^r(ⁿW^l, NWS, NMS), linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (CHW) o con linfocitos T que expresan un CAR irrelevante (CTR), todos clasificados hasta >95 % de pureza. A Gráfico todo incluido (derecha) que muestra linfocitos T circulantes de CD44v6-CAR.28z de cada ratón tres días después de la infusión. Se siguieron por FACS las CD44v6-CAR.28z separadas de diferente forma después de la tinción con un anticuerpo policlonal anti-IgG (CTR y CHW) o el mAb específico de LNGFR, mAb C40-1457. B. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer de ratones tratados. Se muestran los resultados de una prueba del orden logarítmico que compara las diferentes condiciones (ns: no significativo, *P<0,05, ***P<0,001).

Figura 7 BIS. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR median en efectos antimieloma superiores en un modelo de enfermedad bien establecido. Se infundieron ratones NSG con células MM1.S CD44v6+ que expresan luciferasa y, después de 26 días, se trataron con linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (NMS), linfocitos T CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (CHW) o con linfocitos T que expresan un CAR irrelevante (CTR), todos clasificados hasta >95 % pureza. A. Se evalúo la cantidad circulante de células tumorales como unidades relativas de luz (URL) en los momentos de tiempo indicados. B. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer de ratones tratados. Se muestran los resultados de una prueba del orden logarítmico que compara las diferentes condiciones (**P<0,01).

Figura 8. Secuencia de LNGFR humano.

Figura 9. Secuencia de CD44v6CAR.28z. Se muestran las secuencias de SCFV, CH2CH3, CD28 y de la cadena zeta.

Figura 10. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6CAR.28z con espaciador LNGFR natural largo (NWL) (SEQ ID NO: 21)

Figura 11. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR natural corto (NWS) (SEQ ID NO: 22)

Figura 12. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR mutado largo (NML) (SEQ ID NO: 23)

Figura 13. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR mutado corto (NMS) (SEQ ID NO: 24)

Figura 14. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6CAR.28z con espaciador LNGFR natural largo (NWL) (SEQ ID NO: 25)

Figura 15. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR natural corto (NWS) (SEQ ID NO: 26)

Figura 16. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR mutado largo (NML) (SEQ ID NO: 27)

Figura 17. Secuencia a modo de ejemplo de una CD44v6-CAR28z con espaciador LNGFR mutado corto (NMS) (SEQ ID NO: 28)

Figura 18. Secuencia de CD44v6-4GS2-CAR28z, con espaciador LNGFR natural largo (NWL) (SEQ ID NO: 32) Figura 19. Secuencia de CD44v6-4GS2-CAR28z, con espaciador LNGFR natural corto (NWS) (SEQ ID NO: 33) Figura 20. Secuencia de CD44v6-4GS2-CAR28z con espaciador LNGFR mutado largo (NML) (SEQ ID NO: 34) Figura 21. Secuencia de CD44v6-4GS2-CAR28z con espaciador LNGFR corto mutado (NMS) (SEQ ID NO: 35) Figura 22. Generación de diferentes CARs separados por LNGFR. Estructura de la porción extracelular del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) y de las diferentes construcciones de CAR que se dirigen a CD19 y CEA, que han sido generadas. También están incluidas CD19/CEA-CAR.28z que lleva el espaciador CH2CH3 de IgG1 natural (CH2CH3). NWL: CD19/CEA-CAR.28z que llevan el espaciador largo natural de LNGFR (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys y el tallo). NMS: CD19/CEA-CAR.28z que lleva el espaciador mutado corto de LNGFR (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys con una deleción en el cuarto dominio). Las llaves indican la longitud del espaciador expresada en aminoácidos. Gris: scFv.

Figura 23. Se pueden teñir linfocitos T de CD19/CEA-CAR.28z separadas por LNGFR por el mAb anti-LNGFR. Se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28, se transdujeron con vectores retrovirales (RVs) que codifican las diferentes CD19/CEA.CAR28z separadas por LNGFR, se cultivaron con IL-7/IL-15 y se seleccionaron con el mAb C40-1457 y perlas anti-PE. Como control positivo, se produjeron linfocitos T de CD44v6-4GS2.CAR28z en las mismas condiciones. Se muestra la identificación de CAR sobre la superficie de linfocitos T usando el mAb específico de LNGFR C40-1457.

Figura 24. Linfocitos T de CD19/CEA-CAR.28z separadas por LNGFR reconocen específicamente células tumorales que expresan antígeno in vitro. A. Después de la clasificación, los diferentes linfocitos T de CD19/CEA/CD44v6-4GS2-CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, NMS) y los linfocitos T de CD19/CEA-CAR separadas por CH2CH3 (CHW) se cultivaron con células de leucemia ALL-CM y HL60, células linfoblastoides BV-173 y células de carcinoma BXPC3 a una relación E:D de 1:10. Después de 4 días, se contaron las células tumorales residuales y se analizaron por FACS. Se muestra el índice de eliminación (véase Métodos de ejemplo) por los diferentes linfocitos T de CAR.28z. B. Los sobrenadantes de los co-cultivos descritos en A se recogieron después de 24 horas y se analizaron para la producción de citocinas con el ensayo de CBA (Biolegend). Se muestra la liberación de IFNy, IL-2 y TNFa tras el reconocimiento de células diana.

Figura 25. Los linfocitos T de CD19-CAR.28z separadas por LNGFR median en efectos antileucémicos. Se infundieron ratones NSG con células de leucemia ALL-CM CD19+ y, después de 3 días se trataron con los diferentes linfocitos T de CD19-CAR.28z separadas por LNGFR (19 NWL y 19 NMS). Se infunden como control los linfocitos T que expresan la CD44v6-4GS2-CAR.28z sin relacionar (v6 Nw L y v6 NMS). Se clasificaron todos los linfocitos T de ^cA^rhasta >95 % pureza antes de la infusión. El gráfico muestra la presencia de células tumorales ALL-CM en la médula ósea (BM) de cada ratón en el momento del sacrificio. Se siguieron por FACS las células tumorales después de la tinción con un mAb anti-hCD45 y anti-hCD19. Se muestran los resultados de una prueba de la t cuando son estadísticamente significativos (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001).

Figura 26. Secuencia de polinucleótidos de CD44v6-4GS2-CAR28z, con espaciador LNGFR natural largo (NWL) (SEQ ID NO: 37)

Figura 27. Secuencia de polinucleótidos de CD44v6-4GS2-CAR28z, con espaciador LNGFR natural corto (NWS) (SEQ ID NO: 38)

Figura 28. Secuencia de polinucleótidos de CD44v6-4GS2-CAR28z con espaciador LNGFR mutado largo (NML) (SEQ ID NO: 39)

Figura 29. Secuencia de polinucleótidos de CD44v6-4GS2-CAR28z con espaciador LNGFR mutado corto (NMS) (SEQ ID NO: 40)

Descripción detallada de la invención

Ahora se describirán a modo de ejemplos no limitantes diversas características y realizaciones preferidas de la presente invención.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, bioquímica, biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto habitual en la técnica. Dichas técnicas se explican en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Ch.

9, 13 y 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J., y Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M., y McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; y Lilley, D.M., y Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press.

Receptores de antígenos quiméricos

"Receptor de antígeno quimérico" o "CAR" o "CARs", como se usan en el presente documento, se refiere a receptores manipulados que pueden conferir una especificidad por antígenos sobre células (por ejemplo, linfocitos T tales como linfocitos T intactos, linfocitos T de memoria central, linfocitos T de memoria efectora o combinaciones de los mismos). Los CARs también se conocen como receptores de linfocitos T artificiales, receptores de linfocitos T quiméricos o inmunorreceptores quiméricos. Preferentemente, los CARs de la invención comprenden una región diana específica de antígeno, un dominio extracelular, un dominio transmembranario, opcionalmente uno o más dominios coestimulantes, y un dominio de señalización intracelular.

Dominio diana específico de antígeno

El dominio diana específico de antígeno proporciona al CAR la capacidad para unirse al antígeno diana de interés. El dominio diana específico de antígeno se dirige preferentemente a un antígeno de interés clínico contra el cual sería deseable desencadenar una respuesta inmunitaria efectora que da como resultado la destrucción de tumor. El dominio diana específico de antígeno puede ser cualquier proteína o péptido que posea la capacidad para reconocer y unirse específicamente a una molécula biológica (por ejemplo, un receptor de la superficie celular o proteína tumoral, o un componente de los mismos). El dominio diana específico de antígeno incluye cualquier componente de unión que existe de forma natural, sintético, semi-sintético, o recombinantemente producido, para una molécula biológica de interés.

Los dominios diana específicos de antígeno ilustrativos incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o derivados, dominios extracelulares de receptores, ligandos para moléculas/receptores de la superficie celular, o dominios de unión a receptor de los mismos, y proteínas de unión a tumor.

En una realización preferida, el dominio diana específico de antígeno es, o deriva de, un anticuerpo. Un dominio diana derivado de anticuerpo puede ser un fragmento de un anticuerpo o un producto genéticamente manipulado de uno o más fragmentos del anticuerpo, fragmento que participa en la unión con el antígeno. Los ejemplos incluyen una región variable (Fv), una región determinante de la complementariedad (CDR), un Fab, un anticuerpo monocatenario (scFv), una región variable de la cadena pesada (VH), una región variable de la cadena ligera (VL) y un anticuerpo de camélido (VHH). En una realización preferida, el dominio de unión es un anticuerpo monocatenario (scFv). El scFv puede ser scFv murino, humano o humanizado.

"Región determinante de la complementariedad" o "CDR" con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se refiere a un bucle altamente variable en la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera de un anticuerpo. Las CDRs pueden interaccionar con la conformación de antígeno y determinar en gran medida la unión al antígeno (aunque se conocen algunas regiones estructurales que están implicadas en la unión). La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera contienen cada una 3 CDRs.

"Región variable de la cadena pesada" o "VH" se refiere al fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo que contiene tres CDRs interpuestas entre tramos flanqueantes conocidos como regiones estructurales, que están más altamente conservadas que las CDRs y forman un armazón para soportar las CDRs.

"Región variable de la cadena ligera" o "VL" se refiere al fragmento de la cadena ligera de un anticuerpo que contiene tres CDRs interpuestas entre regiones estructurales.

"Fv" se refiere al fragmento más pequeño de un anticuerpo que posee el sitio de unión al antígeno completo. Un fragmento Fv consiste en la región variable de una única cadena ligera unida a la región variable de una única cadena pesada.

"Anticuerpo Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a un anticuerpo modificado que consiste en una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada conectadas entre sí directamente o mediante una secuencia de conector peptídico.

Los anticuerpos que se unen específicamente a una molécula de la superficie de células tumorales se pueden preparar usando métodos bien conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen presentación en fagos, métodos para generar anticuerpos humanos o humanizados, o métodos usando un animal transgénico o planta manipulado para producir anticuerpos humanos. Están disponibles bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpos parcialmente o completamente sintéticos y se pueden cribar para un anticuerpo o fragmento del mismo que se puede unir a la molécula diana. También están disponibles bibliotecas de presentación en fagos de los anticuerpos humanos. Una vez identificada, se puede aislar y/o determinar la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos que codifica el anticuerpo.

Los ejemplos de antígenos que pueden ser dirigidos por el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, antígenos expresados sobre células cancerosas y antígenos expresados sobre células asociadas a diversas enfermedades hematológicas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas.

Con respecto a los dominios diana que dirigen antígenos de cáncer, la selección del dominio diana dependerá del tipo de cáncer que se va a tratar, y pueden dirigir antígenos de tumor. Una muestra tumoral de un sujeto se puede caracterizar por la presencia de ciertos biomarcadores o marcadores de la superficie celular. Por ejemplo, las células de cáncer de mama de un sujeto pueden ser positivas o negativas para cada uno de Her2Neu, receptor de estrógenos y/o el receptor de progesterona. Se selecciona un antígeno de tumor o molécula de la superficie celular que se encuentra en las células tumorales individuales del sujeto. Preferentemente, el dominio diana específico de antígeno dirige una molécula de la superficie celular que se encuentra sobre células tumorales y no se encuentra sustancialmente sobre tejidos normales, o se limita en su expresión a tejidos normales no vitales.

Los antígenos adicionales específicos para cáncer que se pueden dirigir por el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno específico de la próstata, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrina B2, ROR1, mesotelina, c-Met, GD-2 y MAGE A3 TCR, 4-1BB, 5T4, antígeno de adenocarcinoma, alfa-fetoproteína, BAFF, linfocito B de linfoma, antígeno C242, CA-125, anhidrasa carbónica 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (receptor de IgE), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, extra dominio-B de fibronectina, receptor 1 de folato, GD2, GD3 gangliósido, glucoproteína 75, GPNMB, HGF, cinasa de receptor del factor de dispersión humano, receptor de IGF-1, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I, integrina a5p1, integrina avp3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, CanAg de mucina, ácido N-glicolilneuramínico, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, tenascina C, TGF beta 2, TGF-p, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno de tumor CTAA16,88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 o vimentina.

Los antígenos específicos para enfermedades inflamatorias que se pueden dirigir por el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de AOC3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (eotaxina-1), CD125, CDl47 (basigina), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (receptor de IgE), CD25 (una cadena de receptor de IL-2), CD3, CD4, CD5, IFN-a, IFN-^y, IgE, región Fc de IgE, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, receptor de IL-6, integrina a4, integrina a4p7, Lama glama, LFA-1 (CD11a), MEDI-528, miostatina, OX-40, rhuMAb p7, escleroscina, SOST, TGF pi, TNF-a o VEGF-A.

Los antígenos específicos para trastornos neuronales que se pueden dirigir por el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de amiloide beta o MABT5102A.

Los antígenos específicos para diabetes que se pueden dirigir por el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de L-1p o CD3. Otros antígenos específicos para diabetes u otros trastornos metabólicos serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los antígenos específicos para enfermedades cardiovasculares que se pueden dirigir por los CARs de la invención incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de C5, miosina cardíaca, CD41 (integrina alfa-IIb), fibrina II, cadena beta, ITGB2 (CD18) y esfingosina-1-fosfato.

Preferentemente, el dominio específico de unión a antígeno se une específicamente a un antígeno de tumor. En una realización específica, el polinucleótido codifica un Fv monocatenario que se une específicamente a CD44v6.

Un dominio diana específico de antígeno a modo de ejemplo es un fragmento monocatenario específico de CD44v6 (scFV) tal como se describe en Casucci M et al, Bloood, 20l3, Nov 14;122(20):3461-72. Dicha secuencia se muestra a continuación:

Fragmento monocatenario específico de CD44v6 (scFv)

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAP

RILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIK

RGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSW

VRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA

RQGLDYWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)

En una realización, el fragmento monocatenario específico de CD44v6 comprende al menos 85, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 17.

En una realización preferida adicional, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del fragmento monocatenario específico de CD44v6 están conectadas entre sí por un conector peptídico que tiene la siguiente secuencia GGGGSGGGGS (4GS2). Dicho fragmento monocatenario específico de CD44v6 (CD44v64GS2) tiene la siguiente secuencia:

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAP

RILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIK

RGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEW

VSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGT

LVTVSS (SEQ ID NO: 31)

Dominio coestimulante

El CAR de la invención también puede comprender uno o más dominios coestimulantes. Este dominio puede potenciar la proliferación celular, supervivencia celular y desarrollo de células de memoria.

Cada dominio coestimulante comprende el dominio coestimulante de uno cualquiera o más de, por ejemplo, miembros de la superfamilia de TNFR, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, o combinaciones de los mismos. También se pueden usar los dominios coestimulantes de otras proteínas con el CAR de la invención. Los dominios coestimulantes adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica.

En una realización, el dominio transmembranario y coestimulante derivan ambos de CD28. En una realización, el dominio coestimulante transmembranario e intracelular comprenden la siguiente secuencia:

Porción transmembranaria e intracelular de CD28 humano (UNIPROT: P10747, CD28_HUMANO, posición 153-220) FW VLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFW VRSKRSRLLHSDYM NM TPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO:18)

En una realización, el dominio transmembranario y de señalización intracelular comprende al menos 85, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 18.

En una realización, el dominio transmembranario de CD28 comprende la secuencia FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 29).

En una realización, el dominio coestimulante intracelular de CD28 comprende la secuencia RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 30).

Dominio de señalización intracelular

El CAR de la invención también puede comprender un dominio de señalización intracelular. Este dominio puede ser citoplásmico y puede transducir la señal de la función efectora y dirigir la célula para realizar su función especializada. Los ejemplos de dominios de señalización intracelular incluyen, pero no se limitan a, cadena Z del receptor de linfocitos T o cualquiera de sus homólogos (por ejemplo, cadena n, cadenas FceR1y y P, cadena MB1 (Iga), cadena B29 (Igp), etc.), polipéptidos CD3 (A, 8 y ^e), tirosina cinasas de la familia syk (Syk, ZAP 70, etc.), tirosina cinasas de la familia src (Lck, Fyn, Lyn, etc.) y otras moléculas implicadas en la transducción de linfocitos T, tales como CD2, CD5 y CD28. El dominio de señalización intracelular puede ser la cadena zeta de CD3 humano, FcyRIII, FcsRI, colas citoplásmicas de receptores de Fc, motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) que lleva receptores citoplásmicos, o combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, el dominio de señalización intracelular comprende el dominio de señalización intracelular de cadena zeta de CD3 humano.

En una realización, el dominio de señalización intracelular de cadena zeta de CD3 humano comprende la siguiente secuencia:

UNIPROT: P20963, CD3Z_HUMANO, posición 31-143 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO:20)

En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende al menos 85, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 20.

Los dominios de señalización intracelular adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica y se pueden usar a propósito de realizaciones alternativas de la invención.

Dominio transmembranario

El CAR de la invención también puede comprender un dominio transmembranario. El dominio transmembranario puede comprender la secuencia transmembranaria de cualquier proteína que tenga un dominio transmembranario, que incluye cualquiera de las proteínas transmembranarias de tipo I, tipo II o tipo III. El dominio transmembranario del CAR de la invención también puede comprender una secuencia hidrófoba artificial. Los dominios transmembranarios de los CARs de la invención se pueden seleccionar de manera que no dimericen. Los dominios transmembranarios adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica. Los ejemplos de regiones transmembranarias (TM) usadas en construcciones de CAR son: 1) La región TM de CD28 (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al, Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72 ); 2) La región TM de OX40 (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41); 3) La región TM de 41BB (Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) La región TM de CD3 zeta (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402.); 5) La región TM de CD8a (Maher et al, Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al, Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64).

En una realización, el dominio transmembranario y de señalización intracelular derivan ambos de CD28. En una realización, el dominio transmembranario y de señalización intracelular comprenden la siguiente secuencia:

Porción transmembranaria e intracelular de CD28 humano (UNIPROT: P10747, CD28_HUMANO, posición 153-220) FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPR DFAAYRS (SEQ ID NO: 18)

Dominio de espaciador - Factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR)

El CAR de la invención comprende un dominio de espaciador extracelular. El dominio de espaciador extracelular se une a la región diana específica de antígeno y el dominio transmembranario.

El CAR de la presente invención comprende un espaciador extracelular que comprende al menos parte del dominio extracelular de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad humano (LNGFR) o un derivado del mismo.

LNGFR no se expresa en la mayoría de las células hematopoyéticas humanas, permitiendo así el análisis cuantitativo de la expresión génica transducida por inmunofluorescencia, con resolución de una única célula. Así, se puede realizar análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia de la expresión de LNGFR en células transducidas para estudiar la expresión génica. Más detalles sobre el análisis usando LNGFR se pueden encontrar en Mavilio 1994, Blood 83, 1988-1997.

Una secuencia de LNGFR humano se muestra en la Figura 8 (SEQ ID NO: 14).

La presente invención en una realización hace uso de una LNGFR truncada (también conocida como ALNGFR). Preferentemente, el LNGFR usado en la presente invención está truncado en su dominio intracitoplásmico. Dicha truncación se describe en Mavilio 1994.

Así, preferentemente, el espaciador de LNGFR de la presente invención comprende al menos parte del dominio extracelular o un derivado del mismo, pero carece del dominio intracelular de LNGFR. El dominio extracelular puede comprender los aminoácidos 29-250 de LNGFR o un derivado del mismo.

Dominio extracelular de LNGFR humano (UNIPROT # P08138, TNR16_HUMANO, posición 29-250) KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTE CVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCE ECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDS TAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN (SEQ ID NO: 19) Preferentemente, el LNGFR carece del péptido señal.

En una realización, el espaciador comprende al menos parte de una proteína que tiene al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con el dominio extracelular de LNGFR (por ejemplo, SEQ ID NO: 19). En una realización, el espaciador comprende al menos parte de una proteína que tiene al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con los aminoácidos 29-250 de la proteína de LNGFR.

LNGFR comprende 4 dominios TNFR-Cys (TNFR-Cys 1, TNFR-Cys 2, TNFR-Cys 3 y TNFR-Cys 4). Las secuencias de los dominios se ejemplifican a continuación:

TNFR-Cys 1, SEQ ID NO: 9

ACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVC TNFR-Cys 2, SEQ ID NO: 10

PCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVC TNFR-Cys 3, SEQ ID NO: 11

RCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVC TNFR-Cys 4, SEQ ID NO: 12

ECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC

El espaciador comprende 1, 2 y 3 dominios TNFR-Cys. En otra realización, el espaciador comprende los 1, 2, 3 y 4 dominios TNFR-Cys o fragmentos o derivados de los mismos.

En una realización, el espaciador comprende una secuencia que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % de identidad o 100 % de identidad con TNFR-Cys 1(SEQ ID NO: 9), una secuencia que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % de identidad o 100 % de identidad con TNFR-Cys 2 (SEQ ID NO: 10), o una secuencia que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % de identidad o 100 % de identidad con TNFR-Cys 3 (SEQ ID NO: 11). El espaciador puede comprender además una secuencia que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % de identidad o 100 % de identidad con TNFR-Cys 4 (SEQ ID NO: 12).

En vez de comprender el dominio TNFR-Cys 4 completo, el espaciador puede comprender un dominio TNFR-Cys 4 con los siguientes aminoácidos delecionados de dicho dominio: NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW. En una realización, los aminoácidos NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW se sustituyen por el siguiente aminoácido ARA. En una realización, el espaciador carece del tallo rico en serina/treonina de LNGFR. En otra realización, el espaciador comprende el tallo rico en serina/treonina de LNGFR.

El espaciador puede comprender o consistir en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1.

El espaciador puede comprender o consistir en una secuencia de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 3.

El espaciador puede comprender o consistir en una secuencia de SEQ ID NO: 5 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 5.

El espaciador puede comprender o consistir en una secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 7.

El espaciador confiere propiedades al CAR de forma que permita la inmunoselección de células, preferentemente linfocitos T, que expresan dicho CAR.

El CAR de la presente invención (que comprende el espaciador al que se hace referencia en el presente documento) permite preferentemente que los linfocitos T que expresan el CAR proliferen en presencia de células que expresan el antígeno para el que se diseña el CAR.

El CAR de la presente invención (que comprende el espaciador al que se hace referencia en el presente documento) permite preferentemente que los linfocitos T que expresan el CAR medien terapéuticamente en efectos anticancerígenos significativos contra un cáncer para el que está diseñado el CAR a direccionar.

El CAR de la presente invención (que comprende el espaciador al que se hace referencia en el presente documento) es preferentemente adecuado para facilitar la inmunoselección de células transducidas con dicho CAR.

El CAR de la presente invención que comprende el espaciador basado en LNGFR evita la activación de respuestas inmunitarias inespecíficas no deseadas y posiblemente tóxicas y permite que los linfocitos que expresan CAR persistan in vivo sin ser prematuramente depurados por el hospedador sistema inmunitario.

Como se menciona más adelante, la presente invención también engloba el uso de variantes, derivados, homólogos y fragmentos de los elementos de espaciador descritos en el presente documento.

Derivados y fragmentos

Además de las proteínas específicas, péptidos y nucleótidos mencionados en el presente documento, la presente invención también engloba el uso de derivados y fragmentos de los mismos.

El término "derivado", como se usa en el presente documento en relación con proteínas o polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución de, variación de, modificación de, sustitución de, deleción de y/o adición de uno (o más) restos de aminoácidos de o a la secuencia proporcionando que la proteína o polipéptido resultante retenga la función deseada.

Normalmente, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10 o 20 sustituciones, a condición de que la secuencia modificada retenga la actividad o capacidad requerida. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no existen de forma natural.

Las proteínas o péptidos usados en la presente invención pueden también tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones involuntarias de aminoácidos basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos, en tanto que se retenga la función endógena. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina.

Se pueden hacer sustituciones conservativas, por ejemplo según la siguiente tabla. Se pueden sustituir entre sí los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna:

El derivado puede ser un homólogo. El término "homólogo", como se usa en el presente documento, significa una entidad que tiene una cierta homología con la secuencia de aminoácidos natural y la secuencia de nucleótidos natural. El término "homología" puede ser equiparado con "identidad".

Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferentemente al menos 95 % o 97 % o 99 % idéntica, a la secuencia objeto. Normalmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque también se puede considerar homología en términos de similitud (es decir, restos de aminoácidos que tienen propiedades /funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Una secuencia homóloga puede incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 50 %, 55 %, 65 %, 75 %, 85 % o 90 % idéntica, preferentemente al menos 95 % o 97 % o 99 % idéntica, a la secuencia objeto. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud, en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Se pueden realizar comparaciones de homología a ojo, más normalmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercialmente disponibles pueden calculan el porcentaje de homología o identidad entre dos o más secuencias.

Se puede calcular el porcentaje homología con respecto a secuencias contiguas, es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se denomina un alineamiento "sin huecos". Normalmente, dichos alineamientos sin huecos se realizan solo con respecto a un número relativamente corto de restos.

Aunque esto es un método muy simple y coherente, fracasa en tener en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción en la secuencia de nucleótidos puede provocar que los siguientes codones se saquen fuera del alineamiento, dando así posiblemente como resultado una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se realiza un alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta las posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación de homología global. Esto se logra insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que ocurre en el alineamiento de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con tan pocos huecos como sea posible, que refleja una mayor vinculación entre las dos secuencias comparadas, conseguirá una puntuación más alta que una con muchos huecos. Normalmente se usan los "costes de hueco afín", que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente usado. Las altas penalizaciones por hueco producirán, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

El cálculo del máximo porcentaje de homología, por tanto, requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Los ejemplos de otro software que puede realizar las comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al. (1999) íbidem - Cap. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) y el paquete G^eN^eWORKS de herramientas de comparación. Tanto B^lA^sT como FASTA están disponibles para búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al. (1999) íbidem, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Otra herramienta, llamada BLAST 2 Sequences, también está disponible para comparar secuencias de proteínas y de nucleótidos (véanse FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).

Aunque el porcentaje final de homología se puede medir en términos de identidad, el propio proceso de alineamiento no se basa normalmente en una comparación de pares todo o nada. En su lugar, se usa generalmente una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación de pares basándose en similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz comúnmente usada es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el paquete de programas BLAST. Los programas de GCG Wisconsin generalmente usan o bien los valores por defecto públicos o bien una tabla de comparación de símbolos a medida si se suministra (véase el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefieren usar los valores por defecto públicos para el paquete de GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el porcentaje de homología, preferentemente el porcentaje de identidad de secuencia. El software hace esto normalmente como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Fragmentos se refiere normalmente a una región seleccionada del polipéptido o polinucleótido que es funcionalmente de interés. "Fragmento" se refiere así a una secuencia de aminoácidos que es una porción de un polipéptido de longitud completa o una secuencia de ácidos nucleicos que es una porción de un polinucleótido de longitud completa. Puesto que los fragmentos son funcionalmente de interés, por ejemplo, retienen la funcionalidad deseada, por tanto, excluirán, por ejemplo, un único aminoácido o un único ácido nucleico.

Dichos derivados y fragmentos se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante convencionales tales como mutagénesis dirigida al sitio. Donde se van a hacer inserciones, se puede preparar el ADN sintético que codifica la inserción junto con regiones flanqueantes de 5' y 3' correspondientes a la secuencia que existe de forma natural en cualquier lado del sitio de inserción. Las regiones flanqueantes contendrán sitios de restricción convenientes correspondientes a los sitios en la secuencia que existen de forma natural, de manera que la secuencia se pueda cortar con la(s) enzima(s) apropiada(s) y ligar el ADN sintético en el corte. Entonces se expresa el ADN según la invención para preparar la proteína codificada. Estos métodos son solo ilustrativos de las numerosas técnicas convencionales conocidas en la técnica para la manipulación de secuencias de ADN y también se pueden usar otras técnicas conocidas.

Polinucleótidos

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Se entenderá por un experto que los numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, se debe entender que el experto puede hacer, usando técnicas rutinarias, sustituciones de nucleótidos que no afectan la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedador particular en el que se van a expresar los polipéptidos de la invención.

Los polinucleótidos se pueden modificar por cualquier método disponible en la materia. Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo para potenciar la actividad in vivo o vida de los polinucleótidos de la invención.

Los polinucleótidos tales como los polinucleótidos de ADN se pueden producir recombinantemente, sintéticamente, o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También se pueden clonar por técnicas convencionales.

Generalmente se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esto implicará hacer que un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) flanquee la secuencia diana que se desea clonar, poner en contacto los cebadores con ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provocan la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción con un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de manera que el ADN amplificado se pueda clonar en un vector adecuado.

Optimización de codones

Los polinucleótidos usados en la presente invención pueden ser de codones optimizados. La optimización de codones se ha descrito previamente en los documentos de patente WO 1999/41397 y WO 2001/79518. Diferentes células se diferencian en su uso de codones particulares. Esta preferencia codónica corresponde a un sesgo en la abundancia relativa de ARNt particulares en el tipo de célula. Alterando los codones en la secuencia de manera que sean adaptados para coincidir con la abundancia relativa de ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresión. De la misma manera, es posible reducir la expresión eligiendo deliberadamente codones para los que se conocen ARNt correspondientes que son raros en el tipo de célula particular. Así, está disponible un grado adicional de control traduccional.

Vectores

Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Según la presente invención, y a modo de ejemplo, algunos vectores usados en técnicas de ácido nucleico recombinante permiten que entidades, tales como un segmento de ácido nucleico (por ejemplo, un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo), se transfieran a una célula diana. Los vectores pueden ser no virales o virales. Los ejemplos de vectores usados en las técnicas de ácido nucleico recombinante incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, moléculas de ARNm (por ejemplo, ARNm transcritos in vitro), cromosomas, cromosomas artificiales y virus. El vector también puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico desnudo (por ejemplo, ADN). En su forma más simple, el vector puede ser él mismo un nucleótido de interés.

Los vectores usados en la invención pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, ARNm o de virus y pueden incluir un promotor para la expresión de un polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.

Los vectores que comprenden polinucleótidos de la invención se pueden introducir en células usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como transformación y transducción. Se conocen en la técnica varias técnicas, por ejemplo, infección con vectores virales recombinantes, tales como vectores retrovirales, lentivirales, adenovirales, virales adeno-asociados, baculovirales y virales del herpes simple; inyección directa de ácido nucleicos y transformación biolística.

Los sistemas de administración no viral incluyen, pero no se limitan a, métodos de transfección de ADN. Aquí, la transfección incluye un proceso usando un vector no viral para administrar un gen a una célula diana.

Los métodos de transfección típicos incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, transfección mediada por agentes catiónicos, anfífilos faciales catiónicos (CFAs) (Nat. Biotechnol. (1996) 14: 556) y sus combinaciones.

Vectores retrovirales

En una realización, el vector usado en la presente invención es un vector basado en retrovirus que se ha manipulado genéticamente de manera que no se pueda replicar y producir partículas de virus infecciosos de progenie una vez el virus ha entrado en la célula diana. Existen muchos retrovirus que se usan ampliamente para la administración de genes tanto en condiciones de cultivo de tejido como en organismos vivos. Los ejemplos incluyen y no se limitan a virus de la leucemia murina (VLM), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), virus del tumor mamario de ratón (VTMR), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus del sarcoma de Fujinami (VSF), virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-Mo), virus del osteosarcoma murino de FBR (VOM FBR), virus del sarcoma murino de Moloney (MSM-Mo), virus de la leucemia murina de Abelson (VLM-A), virus-29 de la mielocitomatosis aviar (MC29) y virus de la eritroblastosis aviar (VEA) y todos los otros retroviridiae que incluyen lentivirus. Se puede encontrar una lista detallada de retrovirus en Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763.

La estructura básica de un genoma del retrovirus es una 5' LTR y una 3' LTR, entre o dentro de las que se localizan una señal de encapsidación para permitir encapsidar el genoma, un primer sitio de unión, sitios de integración para permitir la integración en un genoma de célula hospedadora y genes gag, pol y env que codifican los componentes de encapsidación - estos son los polipéptidos requeridos para el ensamblaje de partículas virales. Los retrovirus más complejos tienen características adicionales, tales como secuencias de rev y RRE en VIH, que permiten la eficiente exportación de transcritos de ARN del provirus integrado desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula diana infectada.

En el provirus, estos genes están flanqueados en ambos extremos por regiones llamadas repeticiones terminales largas (LTRs). Las LTRs son responsables de la integración proviral, y transcripción. Las LTRs también sirven de secuencias potenciadoras-promotoras y pueden controlar la expresión de los genes virales. La encapsidación de los ARN retrovirales ocurre en virtud de una secuencia psi localizada en el extremo 5' del genoma viral.

Las propias LTRs son secuencias idénticas que se pueden dividir en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 deriva de la secuencia única para el extremo 3' del ARN. R deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 deriva de la secuencia única para el extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

En un genoma de vector retroviral defectuoso, gag, pol y env pueden estar ausentes o ser no funcionales. Las regiones R en ambos extremos del ARN son secuencias repetidas. U5 y U3 representan secuencias únicas en los extremos 5' y 3' del genoma de ARN, respectivamente.

Más preferentemente, el vector viral es un vector diana, es decir, tiene un tropismo de tejido que está alterado en comparación con el virus nativo, de manera que el vector se dirige a particular células. Esto se puede lograr modificando la proteína Env retroviral. Preferentemente, la proteína de la envoltura es una envoltura no tóxica o una envoltura que se puede producir en cantidades no tóxicas dentro de la célula diana primaria, tal como, por ejemplo, una envoltura anfotrópica MMLV o una envoltura anfotrópica modificada.

Preferentemente, la envoltura es una que permite la transducción de células humanas. Los ejemplos de genes env adecuados incluyen, pero no se limitan a, VSV-G, env anfotrópico de VLM tal como env de 4070A, el virus de la leucemina felina RD114 env o hemaglutinina (HA) de un virus de la gripe. La proteína Env puede ser una que es capaz de unirse a un receptor en un número limitado de tipos de células humanas y puede ser una envoltura modificada que contiene restos diana. Las secuencias de env y gag-pol codificantes se transcriben de un promotor y opcionalmente un potenciador activo en la línea celular de encapsidación elegida y la unidad de transcripción se termina por una señal de poliadenilación. Por ejemplo, si la célula de encapsidación es una célula humana, una combinación adecuada de promotor-potenciador es la del gen inmediato-temprano principal del citomegalovirus humano (hCMV-MIE) y se puede usar una señal de poliadenilación del virus SV40. Se conocen en la técnica otros promotores y señales de poliadenilación adecuados.

VLM

Preferentemente, el vector retroviral usado en la presente invención es un vector de virus de la leucemia murina (VLM). Los vectores retrovirales derivados del virus anfotrópico de la leucemia murina de Moloney (VLM-A) se usan comúnmente en protocolos clínicos en todo el mundo. Estos virus usan receptores del transportador de fosfato de la superficie celular para la entrada y luego se integran permanentemente en cromosomas de células en proliferación. Los genes se mantienen entonces durante toda la vida de la célula. La actividad génica en construcciones basadas en VLM es fácil de controlar y puede ser eficaz durante un largo tiempo. Los ensayos clínicos realizados con estos sistemas basados en VLM han mostrado que son bien tolerados sin efectos secundarios adversos.

Un ejemplo de un vector de VLM para su uso en la presente invención es un vector derivado de SFCMM-3, que lleva tanto el gen suicida HSV-tk como el gen marcador ALNGFR (Verzeletti 98, Human Gene Therapy 9:2243). El vector original usado en la preparación de SFCMM-3 es LXSN (Miller et al. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques 7:980-990, 1989) (acceso de Genebank N° 28248). Se modificó el vector LXSN por la inserción del gen HSV-tk en el sitio único Hpa I ("corte romo"), retirada del gen neo por digestión con Hind III y Nae I, e inserción del ADNc que codifica ALNGFR en este sitio.

Vector lentiviral

En una realización, el vector de la presente invención puede ser un vector lentiviral. Los vectores de lentivirus son parte de un grupo más grande de vectores retrovirales. Una lista detallada de lentivirus se pueden encontrar en Coffin et al ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763). En resumen, los lentivirus se pueden dividir en grupos de primate y no primate. Los ejemplos de lentivirus de primate incluyen, pero no se limitan a: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA) y el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS). El grupo lentiviral no de primate incluye el prototipo de "virus lento" el virus Maedi/Visna (VMV), así como el relacionado virus de la artritis-encefalitis caprina (VAEC), virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) y los más recientemente descritos el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) y el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV).

Una distinción entre la familia de lentivirus y otros tipos de retrovirus es que los lentivirus tienen la capacidad de infectar tanto células en división como no en división. A diferencia, otros retrovirus - tales como VLM - son incapaces de infectar células no en división o lentamente en división, tales como las que constituyen, por ejemplo, tejido de músculo, cerebro, pulmón e hígado. Como los lentivirus son capaces de transducir terminalmente células diferenciadas/primarias, el uso de una estrategia de cribado lentiviral permite la selección de bibliotecas en una célula hospedadora diana primaria no en división o lentamente en división.

Vectores de adenovirus

En otra realización, el vector de la presente invención puede ser un vector de adenovirus. El adenovirus es un virus de ADN lineal bicatenario que pasa a través de un producto intermedio de ARN. Existen más de 50 serotipos humanos diferentes de adenovirus divididos en 6 subgrupos basados en la homología genética de secuencias. La diana natural del adenovirus es los epitelios respiratorios y gastrointestinales, que generalmente dan lugar a solo síntomas leves. Los serotipos 2 y 5 (con 95 % de homología de secuencias) son los más comúnmente usados en los sistemas de vector adenoviral y normalmente están asociados con infecciones de las vías respiratorias superiores en la juventud.

Los adenovirus son icosaedros reguladores no envueltos. Un adenovirus típico comprende un virus de ADN encapsidado de 140 nm. La simetría icosaédrica del virus está compuesta por 152 capsómeros: 240 hexones y 12 pentones. El núcleo de la partícula contiene el ADN de dúplex lineal de 36 kb que está covalentemente asociado en los extremos 5' con la proteína terminal (TP) que actúa de cebador para la replicación de ADN. El ADN tiene repeticiones terminales invertidas (ITR) y la longitud de estas varía con el serotipo.

El adenovirus es un virus no envuelto de ADN bicatenario que es capaz de transducir in vivo e in vitro una amplia variedad de tipos de células de origen humano y no humano. Estas células incluyen células epiteliales de las vías respiratorias, hepatocitos, células musculares, miocitos cardíacos, sinoviocitos, células epiteliales mamarias primarias y células post-mitóticamente terminalmente diferenciadas tales como neuronas.

Los vectores adenovirales también son capaces de transducir células no en división. Esto es muy importante para las enfermedades, tales como fibrosis quística, en la que las células afectadas en el epitelio pulmonar tienen una lenta velocidad de renovación. En realidad, están en curso varios ensayos que utilizan una transferencia mediada por adenovirus de transportador de fibrosis quística (CFTR) en los pulmones de pacientes adultos afectados con fibrosis quística.

Los adenovirus se han usado como vectores para terapia génica y para la expresión de genes heterólogos. El genoma grande (36 kilobases) puede acomodar hasta 8 kb de ADN de inserción extraño y es capaz de replicarse eficientemente en líneas celulares complementarias para producir títulos muy altos de hasta 1012. El adenovirus es así uno de los mejores sistemas para estudiar la expresión de genes en células primarias no replicativas.

La expresión de genes virales o extraños del genoma del adenovirus no requiere una célula en replicación. Los vectores adenovirales entran en las células por endocitosis mediada por receptor. Una vez dentro de la célula, los vectores de adenovirus raramente se integran en el cromosoma hospedador. En su lugar, funciona episomalmente (independientemente del genoma hospedador) como un genoma lineal en el núcleo hospedador. Por tanto, el uso de adenovirus recombinante alivia los problemas asociados a la integración al azar en el genoma hospedador.

Vectores virales de la viruela

Se pueden usar vectores virales de la viruela según la presente invención, ya que los fragmentos de ADN grandes se clonan fácilmente en su genoma y se han descrito variantes de variolovacuna atenuadas recombinantes (Meyer, et al., 1991; Smith y Moss, 1983).

Los ejemplos de vectores virales de la viruela incluyen, pero no se limitan a, leporipoxvirus: Upton, et al., 1986, (virus del fibroma de Shope); capripoxvirus: Gershon, et al., 1989, (oveja-1 de Kenia); orthopoxvirus: Weir, et al., 1983, (variolovacuna); Esposito, et al.,1984, (viruela simia y virus de la viruela); Hruby, et al., 1983, (variolovacuna); Kilpatrick, et al., 1985, (virus del tumor del mono de Yaba); avipoxvirus: Binns, et al., (1988) (viruela aviar); Boyle, et al., 1987, (viruela aviar); Schnitzlein, et al., 1988, (viruela aviar, viruela de la perdiz); entomopox (Lytvyn, et al., 1992. Los vectores virales de la viruela son ampliamente usados como vehículos de expresión para genes de interés en células eucariotas. Su facilidad de clonación y propagación en una variedad de células hospedadoras ha conducido, en particular, al uso generalizado de los vectores virales de la viruela para la expresión de proteína extraña y como vehículos de administración para antígenos de vacuna.

Vectores virales de la variolovacuna

El vector de la presente invención puede ser un vector de virus de la variolovacuna tal como MVA o NYVAC. El más preferido es la cepa de la variolovacuna el virus Ankara modificado (MVA) o una cepa derivada del mismo. Alternativas a los vectores de la variolovacuna incluyen vectores avipox tales como viruela aviar o canarypox conocido como ALVAC y cepas derivadas de los mismos que pueden infectan y expresar las proteínas recombinantes en células humanas, pero son incapaces de replicarse.

Células

La invención también proporciona células genéticamente manipuladas que comprenden y expresan establemente el CAR de la invención.

El dominio diana específico de antígenos puede ser capaz de unirse específicamente, en un modo no restringido de MHC, a un antígeno que normalmente no se une por un receptor de linfocitos T en esa manera. En una realización, las regiones diana específicas de antígeno comprenden anticuerpos específicos de diana o equivalentes funcionales o fragmentos o derivados de los mismos. El anticuerpo específico de antígeno puede ser el fragmento Fab del anticuerpo o el fragmento variable monocatenario (scFv) del anticuerpo.

Las células genéticamente manipuladas que pueden comprender y expresar los CARs de la invención incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, linfocitos T intactos, linfocitos T de memoria de células madre, linfocitos T de memoria central, linfocitos T de memoria efectora, linfocitos citolíticos espontáneos, células madre hematopoyéticas y/o células capaces de dar lugar a progenie terapéuticamente relevante. En una realización, las células genéticamente manipuladas son células autólogas. A modo de ejemplo, los linfocitos T individuales de la invención pueden ser CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- o CD4+/CD8+. Los linfocitos T pueden ser una población mixta de células CD4+/CD8- y CD4-/CD8+ o una población de un único clon.

Las células genéticamente modificadas se pueden producir por células que se transfectan establemente con ADN que codifica el CAR de la invención.

Los diversos métodos producen transfectantes estables que expresan los CARs de la invención. En una realización, un método de transfección estable y redireccionamiento de células es por electroporación usando ADN desnudo. Usando ADN desnudo, el tiempo requerido para producir las células redigiridas puede ser significativamente reducido. Los métodos adicionales para manipular genéticamente células usando ADN desnudo que codifica el CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación química (por ejemplo, usando fosfato de calcio, dendrímetros, liposomas y/o polímeros catiónicos), métodos de transformación no química (por ejemplo, electroporación, transformación óptica, electrotransferencia génica y/o administración hidrodinámica) y/o métodos basados en partículas (por ejemplo, impalefección, usando una pistola de genes y/o magnetofección). Se pueden expandir ex vivo las células transfectadas que demuestran la presencia de un único vector no reordenado integrado y expresión del CAR. En una realización, las células seleccionadas para expansión ex vivo son CD8+ y demuestran la capacidad de reconocer y lisar específicamente las células diana específicas de antígeno.

También se pueden usar métodos transducción viral para generar células redirigidas que expresan el CAR de la invención.

La estimulación de los linfocitos T por un antígeno en condiciones apropiadas da como resultado la proliferación (expansión) de las células y/o producción de IL-2. Las células que comprenden el CAR de la invención se expandirán en número en respuesta a la unión de uno o más antígenos a las regiones diana específicas de antígeno del CAR. La invención también proporciona un método de preparación y expansión de células que expresan un CAR. El método puede comprender transfectar o transducir las células con el vector que expresa el CAR después de estimular las células con: 1) estímulos policlonales tales como armazones sin células, preferentemente perlas óptimamente dimensionadas, que contienen al menos un polipéptido activante, preferentemente un anticuerpo, específico para CD3 y un polipéptido activante, preferentemente un anticuerpo, específico para CD28; 2) células tumorales que expresan el antígeno diana; 3) células presentadoras de antígenos artificiales naturales, y cultivarlas con citocinas que incluyen IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, solas o en combinación.

Métodos terapéuticos y composiciones farmacéuticas

Se proporcionan en el presente documento métodos de tratamiento de una enfermedad asociada al antígeno dirigido por el CAR de la invención en un sujeto en necesidad de los mismos. El método comprende administrar una cantidad eficaz del CAR, polinucleótido o vector que codifica el CAR, o una célula que expresa dicho CAR de manera que trate la enfermedad asociada al antígeno en el sujeto.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un CAR de la invención. El CAR de la invención en la composición puede ser uno cualquiera o más de un polinucleótido que codifica el CAR, un vector que codifica el CAR, una proteína que comprende el CAR o células genéticamente modificadas que comprenden el CAR.

Una composición farmacéutica es una composición que comprende o consiste en una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente farmacéuticamente activo. Incluye preferentemente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo combinaciones de los mismos). Se conocen bien en la técnica farmacéutica los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección de vehículo farmacéutico, excipiente o diluyente se puede seleccionar con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como - o además de - el vehículo, excipiente o diluyente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento o agente solubilizante adecuado.

Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, y similares.

Ejem plos

Ejemplo 1 - Métodos

Generación de construcciones CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR

Las secuencias de los espaciadores basados en LNGFR derivaron de la porción extracelular del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR), excluyendo el péptido señal (P08138, TNR16_H^uMANO). El diseño natural largo (NWL) contiene tanto los cuatro dominios ricos en cisteína de TNFR como el tallo rico en serina/treonina. El diseño natural corto (NWS) comprende solo los cuatro dominios ricos en cisteína de TNFR. El diseño mutado largo (NML) contiene los cuatro dominios ricos en cisteína de TNFR, el tallo rico en serina/treonina e incluye una modificación específica en el cuarto dominio para evitar la unión a NGF (Yan et al, J Biol Chem, 1991, Jun 25;266(18):12099-104). El diseño mutado corto (NMS) contiene solo los cuatro dominios ricos en cisteína de TNFR que incluyen la modificación específica en el cuarto dominio. Los espaciadores se sintetizaron por GENEART, flanqueados por sitios de restricción específicos (BamH1 y PflMI) para permitir la clonación en la construcción original de CAR de segunda generación específica de CD44v6 de los presentes inventores (Figura 9; SEQ ID NO: 15) en lugar del espaciador de CH2CH3 de IgG1. Todas las construcciones han sido optimizadas en los codones para la expresión en seres humanos. Todas las construcciones se expresaron en esqueletos de SFG-RV (un vector retroviral de corte y empalme basado en VLM-Mo comúnmente usado (Riviere et al, PNAS, 1995, Jul 18;92(15):6733-7)).

Espaciador LNGFR natural largo (NWL):

Secuencia de proteínas (SEQ ID NO: 1)

KEACPTGLYTHSGECCKACMLGEGVAQPCGANQTVCE PCLDS VTFS D V VS ATEPCK PCTECVG LQSMSAPCVEADDAVCRC AYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGrySDEANWPPCLPCTyCEDrEflQLñECrñWADAECEE IPGRWiTRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDUASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDN.

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCC

c a g c c t t g c g g c g c c a a t c a g a c c g t g t g g g a g c c c t g c c t g g a c a g c g t g a c c t t c a g c g a c g t g g t g t c c g c c a c c GAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGT GTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCA GCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAAGACAAGCAGAATACCGTGTGTGAAGAGrGCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAGG CCAACCACGTGGACCCCTGCCTGCCCTGCACTGTGTGCGAGGACACCGAGCGGCAGCTGCGCGAGTGCACAAGATGGG CCGACGCCGAGTGCGAAGAGATCCCCGGCAGATGGATCACCAGAAGCACCCCCCCTGAGGGCAGCGACAGCACCGCCC CTAGCACCCAGGAACCTGAGGCCCCTCCCGAGCAGGACCTGATCGCCTCTACAGTGGCCGGCGTGGTGACAACCGTGAT GGGCAGCTCTCAGCCCGTGGTGACACGGGGCACCACCGACAAT.

Espaciador LNGFR natural corto (NWS):

Secuencia de proteínas (SEQ ID NO: 3):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFS DVVSATEPCK PCTECVG LQSMSAPCVEAD DAVCRC AYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCE ECPDG TYSDEANHVDPCL PC TVCEDTERQLRECTRWADAECEE

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 4):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCC CAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACC GAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGT GTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCA GCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGTGAA GAGTGCCCCGACGGCA CCTACA GCGA CGAGG CCAACCACGTGGACCCCTGCCTGCCCTGCACTGTGTGCGAGGACACCGAGCGGCAGCTGCGCGAGTGCACAAGATGGG CCGACGCCGAGTGCGAGGAA.

Espaciador LNGFR mutado largo (NML):

Secuencia de proteínas (SEQ ID NO: 5):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDWSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRC AYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPPG7YSPEA4PAAPA£CEE/PGflWTflSTPP£GSPSTAPSTQ EPEAPPEQDUASTVAGWTTVMGSSQPVVTRGTTDN.

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCC CAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACC GAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGT GTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCA GCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAAGACAAGCAGAATACCGTGTGTGAA GAGTGGCCCGACGGCACC TACA GCGA CGAA G CCGCCAGAGCCGCCGACGCCGAGTGCGAAGAGATCCCCGGCAGATGGATCACCAGAAGCACCCCCCCTGAGGGCAGCG ACAGCACCGCCCCTAGCACCCAGGAACCTGAGGCCCCTCCCGAGCAGGACCTGATCGCCTCTACAGTGGCCGGCGTGGT GACAACCGTGATGGGCAGCTCTCAGCCCGTGGTGACACGGGGCACCACCGACAAT.

Espaciador LNGFR mutado corto (NMS):

Secuencia de proteínas (SEQ ID NO: 7):

KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRC AYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPPGTySPEAAñAAPAECEE.

Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8):

AAAGAGGCCTGCCCCACCGGCCTGTACACCCACAGCGGAGAGTGCTGCAAGGCCTGCAACCTGGGAGAGGGCGTGGCC CAGCCTTGCGGCGCCAATCAGACCGTGTGCGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACCTTCAGCGACGTGGTGTCCGCCACC GAGCCCTGCAAGCCTTGCACCGAGTGTGTGGGCCTGCAGAGCATGAGCGCCCCCTGCGTGGAAGCCGACGACGCCGT GTGTAGATGCGCCTACGGCTACTACCAGGACGAGACAACCGGCAGATGCGAGGCCTGTAGAGTGTGCGAGGCCGGCA GCGGCCTGGTGTTCAGTTGTCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGTGAAGAG7GCCCCGACGGCACCTACAGCGACGAGG CCGCCCGGGCCGCCGACGCCGAGTGCGAGGAA.

Leyenda:

Subrayado: Dominio rico en cisteína de TNFR número 1.

Negrita: Dominio rico en cisteína de TNFR número 2.

Negrita y subrayado: Dominio rico en cisteína de TNFR número 3.

Cursiva: Dominio rico en cisteína de TNFR número 4.

Cursiva y subrayado: Tallo rico en serina/treonina

Transducción y condiciones de cultivo.

Se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28 de tamaño de célula (ClinExVivo, Invitrogen) más IL-7/IL-15 (5 ng/ml, Peprotech) y se transdujeron los RV por dos rondas de espinoculación en el día 2 y 3 después de la estimulación. En el día 6, se retiraron perlas y se cultivaron los linfocitos T en RPMI 1640 (Gibco-Brl) 10 % de FBS (BioWhittaker) en presencia de IL-7 e IL-15. Se detectó la expresión superficial de construcciones de CAR específicas de CD44v6 separadas por CH2CH3 (CHW y CHM) con mAbs específicos para el espaciador CH2CH3 de IgG1 (Jackson Laboratories), mientras que la expresión superficial de las construcciones de CAR específicas de CD44v6 separadas por LNGFR (NWL, NWS, NML y NMS) se analizaron usando los mAbs específicos de LNGFR de BD Bioscience (Clon: C40-14579) o de Miltenyi (Clon: ME20.4). Entre el día 9 y el día 15 desde la activación, se clasificaron por FACS los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 usando los mAbs policlonales IgG1 específicos de CH2CH3, mientras que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se tiñeron con el mAb específico de LNGFR conjugado con PE C40-14579 y se clasificó con columnas usando perlas paramagnéticas anti PE (Miltenyi). Se ha expresado la expansión de linfocitos T posterior a la clasificación como el aumento en veces: número de linfocitos T en el día x/ número de linfocitos T después de la clasificación.

Ensayos in vitro para analizar el reconocimiento específico

En ensayos de co-cultivo, se cultivaron linfocitos T clasificados por CAR con células diana a diferentes relaciones E:D. Después de 4 días, se contaron las células supervivientes y se analizaron por FACS. Los linfocitos T transducidos con un CAR irrelevante (CD19) se usaron siempre como control. Se calculó el índice de eliminación del siguiente modo: 1 -(número de células diana residuales en presencia de linfocitos T CD44v6.CAR28z+) / (número de células diana residuales en presencia de linfocitos T CTR.CAR28z+). En ensayos de dilución de CFSE, se cargaron linfocitos T clasificados con CFSE y se estimularon con células tumorales irradiadas (10.000 rad) a la relación E:D de 1:5 o con concentraciones biológicamente activas de NGF. Después de 6 días, se midió la proliferación de linfocitos T por FACS analizando el porcentaje de células que habían diluido el colorante CFSE.

Modelos de xenoinjerto de eficacia antitumoral

Se autorizaron protocolos experimentales por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Para el modelo de enfermedad residual mínima, se infundieron i.v. ratones NSG (Jackson) con 1,5x106 células de leucemia/ratón. Tres días después, los ratones se trataron i.v con 5x106 linfocitos T clasificados de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR, linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 o linfocitos T que llevan un CAR irrelevante (CD19). Se monitorizó semanalmente el injerto de linfocitos T por toma de muestras de sangre y análisis de FACS. Después de 7 semanas, se sacrificaron los ratones y se analizó su hígado por histopatología y FACS para la presencia de células THP-1. Para el modelo de enfermedad bien establecido, se infundieron i.v. ratones NSG con 2x106 células de mieloma MM1.S/ratón. Cinco semanas después, los ratones se trataron i.v con 5x106 linfocitos T clasificados de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR, linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 o linfocitos T que llevan un CAR irrelevante (CD19). Se monitorizó semanalmente el injerto de linfocitos T y la progresión del mieloma por toma de muestras de sangre y análisis de FACS (las células de mieloma se distinguirán de linfocitos T según el diferente fenotipo CD45/CD3 humano). Cuando las células MM1.S en circulación superaron las 30 células/pl y/o los ratones manifestaron claros signos de sufrimiento relacionado con el tumor (parálisis o >10 % pérdida de peso), se sacrificaron los ratones.

Citometría de flujo.

Para análisis de FACS, los presentes inventores usaron anticuerpos conjugados con FITC, PE, PerCP, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 y Pacific Blue dirigidos a CD44v6 humano, CD4 (e-Bioscience), CD123, CD19, CD14, CD3, CD8, CD45RA, CD62L, CXCR4, CD127, CD33, CD38, CD45, LNGFR, CD45 de ratón, 7AAD (BD Biosciences) y CH2CH3 de IgG1 (Jackson laboratories). Se incubaron células (2 * 105) con anticuerpos durante 15 minutos a 4 °C y se lavaron con PBS 1 % de FBS. Se hicieron correr muestras a través de un citómetro de flujo FACS Canto II (BD Biosciences), y los datos se analizaron con el software Flow Jo (Tree star Inc). Se calculó la intensidad relativa de fluorescencia (IRF) del siguiente modo: intensidad media de fluorescencia de la muestra / intensidad media de fluorescencia del isotipo de control correspondiente.

Ejemplo 2 - Generación de construcciones CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR.

Los presentes inventores construyeron recientemente un CAR específico de CD44v6 basado en la cadena CD3Z combinado con un dominio endo-coestimulante de CD28 (Casucci e al, Blood 2013, Nov 14;122(20):3461-72). En la región de espaciador extracelular de este CAR, se insertó un espaciador CH2CH3 de IgG1 para mejorar el direccionamiento del antígeno de CD44v6 y para permitir la selección y el seguimiento in vivo de linfocitos T transducidos. Es, sin embargo, un grave inconveniente de los CARs separados por CH2CH3 su interacción con receptores de Fcy (FcyRs) (Hombach et al, Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75), que conduce posiblemente a direccionamiento no específico de células que expresan estos receptores (por ejemplo, monocitos/macrófagos) y/o la eliminación in vivo de linfocitos T transducidos (Figura 1A). Para evadir este problema, los presentes inventores sustituyeron el CH2CH3 original con dominios extracelulares diferentes del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR). Ya se ha usado en la clínica una versión truncada del LNGFR que carece de componentes de señalización intracelular para el marcado de genes de linfocitos T (Bonini et al, Nat Med, 2003, Apr;9(4):367-9; Ciceri et al, Lancet Oncol, 2009, May;10(5):489-500). La porción extracelular de LNGFR está compuesta por 4 regiones ricas en cisteína de TNFR y un tallo rico en serina/treonina (Figura 1B). En primer lugar, los presentes inventores generaron dos construcciones CD44v6-CAR.28z: una separada con la porción extracelular entera de LNGFR (LNGFR natural largo o NWL) y la otra con solo las 4 regiones ricas en cisteína de TNFR (LNGFR natural corto o NWS). Para excluir la posibilidad de activación independiente de antígeno de la construcción separada por LNGFR mediante el ligando natural NGF, los presentes inventores generaron dos construcciones CD44v6-CAR.28z que llevan una deleción específica del cuarto dominio rico en cisteína de TNFR, que se sabe que suprime la señalización de NGF (Yan et al, J Biol Chem, 1991, Jun 25;266(18):12099-104), creando una isoforma mutada larga de LNGFR o NML y una isoforma mutada corta de LNGFR o NMS, respectivamente. Como control, los presentes inventores también generaron una construcción de CD44v6-CAR.28z que incluía una versión mutada del espaciador CH2CH3 original (CHM), que es incapaz de reconocer FcyRI (Hombach et al, Gene Ther 2000, Jun;7(12):1067-75). Sorprendentemente, ambos de FcyRIl y FcyRIII pueden usar restos, además de este conjunto común, sugiriendo que esta mutación no suprime completamente la unión (Shields et al, J Biol Chem, 2001, Mar 2;276(9):6591-604. Armour et al, Mol Immunol, 2003, Dec;40(9):585-93).

Ejemplo 3 - Las construcciones CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se pueden usar para seleccionar y seguir linfocitos T transducidos

Se clonaron en vectores retrovirales (RV) las diferentes construcciones CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR para transducir linfocitos T primarios. Para la transducción, se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28 más IL-7/IL-15, según el protocolo que preserva mejor su fenotipo funcional (Kaneko et al, Blood, 2009, Jan 29;113(5):1006-15. Bondanza et al, Blood 2011, Jun 16;117(24):6469-78. Cieri et al, Blood, 2013, Jan 24;121(4):573-84). Después de la transducción, todas las construcciones se pudieron identificar sobre la superficie de linfocitos T usando el mAb anti-LNGFR C40-1457 (Figura 2A), que indica que se procesaron correctamente, se montaron sobre la membrana celular y, lo que es más importante, fueron reconocidas por mAbs anti-NGFR. Como consecuencia, los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR podrían ser clasificados con perlas inmunomagnéticas (Figura 2B). De cerca, los presentes inventores encontraron que solo la isoforma separada por NWL se unió a otro mAb anti-LNGFR, ME20.4, sugiriendo que los cambios conformacionales impuestos por los espaciadores de LNGFR de diferentes longitudes pueden controlar la accesibilidad del epítope de ME20.4. Y, lo que es más importante, la cinética de expansión de las diferentes células separadas por LNGFR fue similar a la de los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (Figura 2B), descartando una posible ventaja proliferativa inducida por secuencias de LNGFR extracelular montadas en un CAR. Al final del cultivo, la población resultante se enriqueció en linfocitos T de diferenciación temprana (Figura 2C), que indica que no hay interferencia con la trayectoria de diferenciación funcional de perla-linfocitos T activados en presencia de IL-7/IL-15.

Ejemplo 4 - Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR retienen el reconocimiento específico de CD44v6, mientras que pierden el reconocimiento no específico mediado por la interacción con F^cyR^s.

Para verificar la preservación del reconocimiento específico de CD44v6 después de sustituir el espaciador CH2CH3 original con espaciadores de LNGFR, se probaron linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR en experimentos de co-cultivo con células tumorales que expresan CD44v6. Similarmente a las separadas por CH2CH3, los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR eliminaron eficientemente células tumorales CD44v6+vas (líneas celulares MM1S y THP-1), pero no CD44v6-vas (líneas celulares BV173) (Figura 3A). Además, el reconocimiento específico de CD44v6 se asoció a la vigorosa expansión de linfocitos T (Figura 3B), que sugiere la preservación completa de su potencial terapéutico de linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR. Por tanto, los CARs separados por LNGFR según la presente invención resultaron ser eficaces contra modelos de tumor que expresan el antígeno específico al que se dirigen.

Para demostrar la ausencia de reconocimiento específico mediado por la interacción con F^cR^y, se co-cultivaron linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR con células de leucemia THP1 CD44v6+vas/FcYRs+vas o con células de leucemia HL-60 CD44v6-vas/FcYRs+vas. En este sistema, mientras que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 eliminaron tanto las células THP1 CD44v6+vas como HL-60 CD44v6-vas, los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR de CAR eliminaron específicamente células THP-1 CD44v6+vas, pero no HL-60 CD44v6-vas (Figura 4A). Correspondientemente, los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR de CAR proliferaron en respuesta a células THP-1 CD44v6+vas, pero no a HL-60 CD44v6-vas (Figura 4B). En ambos sistemas, el comportamiento de las células separadas por LNGFR fue superponible a la de los linfocitos T de CAR de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 mutados, que demuestra la supresión de los efectos mediados por FcyR.

Por tanto, debido a la ausencia del dominio Fc CH2-CH3 de la bisagra de inmunoglobulina constante IgG1 como espaciador, CARs que contienen un espaciador derivado de LNGFR según la presente invención no se unen a receptores gamma de Fc de IgG, evitando así la activación de la respuesta inmunitaria inespecífica no deseada y posiblemente tóxica. Por consiguiente, los CARs separados por LNGFR son más seguros que los que contienen CH2-CH3 de la bisagra de IgG.

Finalmente, para descartar la estimulación independiente de antígeno mediante NGF soluble, se cultivaron in vitro linfocitos T de CD44v6-CAR28.z separadas por LNGFR con NGF. Incluso a concentraciones supra-fisiológicas de NGF, que se sabe que fuerzan la diferenciación de la línea celular neuronal PC12 que expresa LNGFR (Figura 5A), no se indujo la proliferación de los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (Figura 5B), que indica la ausencia de señalización mediante NGF soluble.

Ejemplo 5 - Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR persisten mejor in vivo y median en efectos antitumorales superiores

Después de demostrar el reconocimiento eficaz y específico in vitro, los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR se expusieron para actividad antitumoral in vivo, primero en un modelo de enfermedad residual mínima y luego en uno de enfermedad bien establecida (WED). En el primer modelo, se infundieron ratones NSG con células THP-1 de leucemia y después de tres días se trataron con linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 o separadas por LNGFR diferentes. Los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR diferentes se expandieron (Figura 6A) y persistieron (Figura 6B) mejor que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3. Por consiguiente, parece que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR median en efectos antitumorales superiores, como se demuestra por la mejor normalización del peso de hígado infiltrado por THP1 en comparación con ratones infundidos con linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (Figura 6C). En el segundo modelo de enfermedad bien establecido, se infundieron ratones NSG con células MM1.S de mieloma que expresan CD44v6, y después de 5 semanas, cuando el tumor ya había colonizado la médula ósea, se trataron con linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 o separadas por LNGFR diferentes. No se incluyeron linfocitos T de CD44v6-CAR.28z que llevan la isoforma NML. En este modelo más riguroso, mientras que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 apenas se injertaron y no mediaron en ningún efecto antitumoral significativo, se expandieron los diferentes linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR (Figura 7A), persistieron y produjeron una notable actividad antitumoral (Figura 7B).

Se confirmó adicionalmente la capacidad de linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por LNGFR para mediar en actividad antitumoral superior usando un modelo de mieloma bien establecido con células MM1.S CD44v6+ que expresan una luciferasa secretada. La presencia de esta luciferasa permite monitorizar día a día la cantidad de células tumorales MM1.S en circulación en ratones tratados con los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 (v6 CHW) o separadas por LNGFR NMS (v6 NMS). En este modelo exigente, mientras que los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por CH2CH3 mostraron la misma actividad antitumoral de los linfocitos T de CAR (CTR) sin relacionar, los linfocitos T de CD44v6-CAR.28z separadas por NMS son capaces de mantener bajo control el número de células tumorales en circulación hasta 21 días (Figura 7BIS A) y de prolongar significativamente la supervivencia global (Figura 7BIS B).

Ejemplo 6 - Métodos

Generación de construcciones CD19-CAR.28z y CEA-CAR.28z separadas por LNGFR

Se usó una estrategia similar a la descrita en el Ejemplo 1 para generar construcciones de CAR específicas de CD19 y específicas de CEA (Figura 22). Se han generado las siguientes construcciones:

CD19-CAR.28z: que lleva un dominio diana específico de CD19, cadena CD3Z combinada con un dominio endocoestimulante de CD28 y el espaciador natural CH2CH3 de IgG1 (CH2CH3)

NWL: CD19-CAR.28z que lleva el espaciador LNGFR natural largo (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys y el tallo)

NMS: CD19-CAR.28z que lleva el espaciador LNGFR mutado corto (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys con una deleción en el cuarto dominio)

CEA-CAR.28z: que lleva un dominio diana específico de CEA, cadena CD3Z combinada con un dominio endocoestimulante de CD28 y el espaciador natural CH2CH3 de IgG1 (CH2CH3)

NWL: CEA-CAR.28z que lleva el espaciador LNGFR natural largo (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys y el tallo)

NMS: CEA-CAR.28z que lleva el espaciador LNGFR mutado corto (incluyendo los 4 dominios TNFR-Cys con una deleción en el cuarto dominio)

Transducción y condiciones de cultivo.

Se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28 de tamaño de célula (ClinExVivo, Invitrogen) más IL-7/IL-15 (5 ng/ml, Peprotech) y se transdujeron los RV por dos rondas de espinoculación en el día 2 y 3 después de la estimulación. En el día 6, se retiraron perlas y se cultivaron los linfocitos T en RPMI 1640 (Gibco-Brl) 10 % de FBS (BioWhittaker) en presencia de IL-7 e IL-15. Se detectó la expresión superficial de construcciones de CAR específicas de CD19 y CEA separadas por CH2CH3 (CHW) con mAbs específicos para el espaciador CH2CH3 de IgG1 (Jackson Laboratories), mientras que la expresión superficial de las construcciones de CAR separadas por LNGFR (NWL y NMS) se analizó usando mAbs específicos de LNGFR de BD Bioscience (Clon: C40-14579). Entre el día 9 y el día 15 desde la activación, se clasificaron por FACS los linfocitos T de CAR.28z separadas por CH2CH3 usando los mAbs policlonales IgG1 específicos de CH2CH3, mientras que los linfocitos T de CAR.28z separadas por LNGFR se tiñeron con el mAb específico de LNGFR conjugado con PE C40-14579 y se clasificaron con columnas usando perlas paramagnéticas anti-PE (Miltenyi).

Ensayos in vitro para analizar reconocimiento específico.

En ensayos de co-cultivo, se cultivaron linfocitos T clasificados por CAR con células diana en una relación E:D de 1:10. Después de 4 días, se contaron las células supervivientes y se analizaron por FACS. Se calculó el índice de eliminación del siguiente modo: 1 -(número de células diana residuales en presencia de linfocitos T de CD44v6-4GS2.CAR28z+, linfocitos T de CD19.CAR28z+ y linfocitos T de CEA.CAR28z+) / (número de células diana residuales en presencia de linfocitos T de CTR.CAR28z+). Se recogió el sobrenadante de los co-cultivos después de 24 horas de incubación y se analizaron para la producción de citocinas (IFNy, IL-2 y TNFa) con el ensayo CBA (BD Biolegend).

Modelos de xenoinjerto de eficacia antitumoral

Para el modelo de enfermedad residual mínima, se infundieron i.v. ratones NSG (Jackson) con 1,5x106 células de leucemia ALL-CM/ratón. Tres días después, los ratones se trataron i.v con 5x106 linfocitos T clasificados de CD19-CAR.28z o CD44v6-4GS2.CAR.28z separadas por LNGFR (NWL, NMS). Se monitorizó semanalmente el injerto de linfocitos T por toma de muestras de sangre y análisis de FACS. Después de 7 semanas, los ratones se sacrificaron y se analizaron sus médulas óseas (BM) por FACS para la presencia de células ALL-CM con un mAb anti-hCD45 y anti-hCD19.

Ejemplo 7 - Se pueden usar construcciones de CAR.28z separadas por LNGFR para seleccionar y seguir linfocitos T transducidos

Se clonaron las diferentes construcciones de CAR.28z separadas por LNGFR en vectores retrovirales (RV) para la transducción de linfocitos T primarios. Para la transducción, se activaron linfocitos T con perlas CD3/CD28 más IL-7/IL-15, según el protocolo que preserva mejor su fenotipo funcional (Kaneko et al, Blood, 2009, Jan 29;113(5):1006-15. Bondanza et al, Blood 2011, Jun 16;117(24):6469-78. Cieri et al, Blood, 2013, Jan 24;121(4):573-84). Después de la transducción, se pudieron clasificar linfocitos T con perlas inmunomagnéticas (Figura 23) que indica que, como se muestra con CARs dirigidos a antígeno CD44v6, los espaciadores derivados de LNGFR se procesaron correctamente y se montaron sobre la membrana celular, también en el contexto de otros dos CARs específicos para los antígenos CD19 y CEA.

Ejemplo 8 - Linfocitos T de CD19-CAR.28z, T de CEA-CAR.28z y linfocitos T de CD44v6-4GS2.CAR.28z separadas por LNGFR retienen el reconocimiento específico de antígeno, mientras que no pierden el reconocimiento específico mediado por la interacción con FcyRs.

Para verificar la preservación de CD19 y el reconocimiento específico de CEA después de sustituir el espaciador CH2CH3 original con espaciadores de LNGFR, se probaron linfocitos T de ^cD19-CAR.28^zy CEA-CAR.28z separadas por LNGFR en experimentos de co-cultivo con células tumorales que expresan antígeno. Similarmente a los linfocitos T de CD19-CAR.28z, CEA-CAR.28z y linfocitos T CD44v6-4GS2.CAR.28z separadas por CH2CH3, los separadas por LNGFR eliminaron eficientemente las células tumorales CD19+, CEA+ y cD44v6+, respectivamente, ahorrando células tumorales negativas para antígeno (Figura 24 A). En particular, los linfocitos T de CAR de CD19-CAR.28z separadas por LNGFR eliminaron específicamente células ALL-CM y BV-173 CD19+, pero no células HL-60 y BXPC3 CD19-(Figura 24A). Similarmente, los linfocitos T CEA-CAR.28z separadas por LNGFR eliminaron específicamente células BXPC3 CEA+, pero no células HL-60, ALL-CM y BV-173 CEA-(Figura 24 A) y los linfocitos T de CD44v6-4GS2.CAR.28z eliminaron específicamente células BXPC3 CD44v6+, pero no células A^lL-CM, BV173 y HL-60 CD44v6-(Figura 24 A). Se obtuvieron resultados comparables cuando se evaluó la liberación de citocinas específicas de antígeno (IFNy, IL2 y TNFa) (Figura 24 B).

CARs que contienen LNGFR como espaciador según la presente invención dan como resultado la retención de especificidad y efecto antitumoral con diferentes dominios diana específicos de antígeno

Para demostrar la ausencia de no reconocimiento específico mediado por la interacción con F^cR^y, se co-cultivaron linfocitos T de CD19-CAR.28z, linfocitos T de CEA-cAr .28z y linfocitos T de CD44v6-4GS2.CAR.28z separadas por LNGFR con células HL-60 F^cyR^s+, CD19- CEA-. En este sistema, solo los linfocitos T de CD19-CAR.28z y ^cE^a-CAR.28z separadas por CH2CH3 son capaces de eliminar las células diana HL-60, confirmando así que el uso de espaciador basado en LNGFR evita la activación de respuesta inmunitaria innata no deseada.

Ejemplo 12 - Linfocitos T de CD19-CAR.28z separadas por LNGFR median en los efectos antitumorales in vivo

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un espaciador extracelular que comprende al menos parte del dominio extracelular del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad humano (LNGFR), en donde dicho al menos parte de LNGFR es adecuado para facilitar la inmunoselección e identificación de células transducidas con dicho CAR, en donde el espaciador extracelular comprende los tres primeros dominios TNFR-Cys de LNGFR.

2. Un CAR según la reivindicación 1, en donde el espaciador carece del dominio intracelular de LNGFR.

3. Un CAR según la reivindicación 1 o 2, en donde el espaciador comprende los cuatro dominios TNFR-Cys de LNGFR.

4. Un CAR según cualquier reivindicación precedente, en donde el espaciador comprende el cuarto dominio TNFR-Cys (TNFR-Cys 4), pero en donde la siguiente secuencia de aminoácidos se retira de dicho dominio: NHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRW y se sustituye con la siguiente secuencia de aminoácidos: ARA.

5. Un CAR según cualquier reivindicación precedente, en donde el espaciador comprende el tallo rico en serina/treonina de LNGFR.

6. Un CAR según las reivindicaciones 1 a 4, en donde el espaciador carece del tallo rico en serina/treonina de LNGFR.

7. Un CAR según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho espaciador comprende todo el dominio extracelular de LNGFR.

8. Un CAR según la reivindicación 1 o 2, en donde el espaciador comprende el dominio extracelular de LNGFR con la excepción del tallo rico en serina/treonina de dicho dominio.

9. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un espaciador extracelular, en donde el espaciador comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o una secuencia al menos 90 % idéntica a las mismas.

10. Un CAR según la reivindicación 9, en donde el espaciador consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 o una secuencia al menos 90 % idéntica a las mismas.

11. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende

(i) un dominio diana específico de antígeno;

(ii) un dominio de espaciador extracelular como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; (iii) un dominio transmembranario;

(iv) opcionalmente al menos un dominio coestimulante; y

(v) un dominio de señalización intracelular.

12. Un CAR según la reivindicación 11, en donde el dominio diana específico de antígeno comprende un anticuerpo o fragmento del mismo.

13. Un CAR según la reivindicación 12, en donde el dominio diana específico de antígeno es un fragmento variable monocatenario.

14. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el dominio diana específico de antígeno se dirige a un antígeno tumoral.

15. Un CAR según la reivindicación 14, en donde el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en CD44, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, mesotelina, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, CEA, MAGE A3 TCR y combinaciones de los mismos.

16. Un CAR según la reivindicación 14, en donde el antígeno tumoral es la isoforma 6 de CD44 (CD44v6).

17. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde el dominio transmembranario comprende uno cualquiera o más de un dominio transmembranario de una cadena zeta de un complejo de receptor de linfocitos T, CD28, CD8a, y combinaciones de los mismos.

18. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en donde el dominio coestimulante comprende un dominio coestimulante de uno cualquiera o más de CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DapIO, CD27, C^d2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 y combinaciones de los mismos.

19. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en donde el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de uno o más de una cadena zeta de CD3 humano, FcyRMI, FcsRI, una cola citoplásmica de un receptor de Fc, un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) que lleva receptores citoplásmicos, y combinaciones de los mismos.

20. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19, en donde el dominio diana específico de antígeno se dirige a CD44v6, el dominio transmembranario comprende un dominio transmembranario de CD28, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de cadena zeta de CD3 humano y el dominio coestimulante comprende un dominio endo-coestimulante de CD28.

21. Un polinucleótido que codifica un CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

22. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 21.

23. Un vector según la reivindicación 22, en donde el vector es un vector viral.

24. Una célula que comprende un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, un polinucleótido según la reivindicación 21 o un vector según la reivindicación 22 o 23.

25. Una célula según la reivindicación 24, en donde la célula es un linfocito T.

26. Una composición farmacéutica que comprende la célula de la reivindicación 24 o 25.

27. Un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, o un polinucleótido según la reivindicación 21, un vector según la reivindicación 22 o 23 o una célula según la reivindicación 24 o 25, para su uso en el tratamiento de cáncer.

28. Un CAR según la reivindicación 20, un polinucleótido que codifica dicho CAR, un vector que comprende dicho polinucleótido o una célula hospedadora que comprende dicho CAR, polinucleótido o vector, para su uso en el tratamiento de tumores que expresan CD44.