UA123764C2 - Химерний рецептор антигену та його застосування при лікуванні пухлин, які експресують cd44 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується химерного рецептора антигену (CAR), що включає екстраклітинний спейсер, який включає щонайменше частину екстраклітинного домену рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (LNGFR) людини, де екстраклітинний спейсер включає перші три TNFR-Cys домени LNGFR, та застосування такого рецептора при лікуванні пухлин, які експресують CD44.

Description

Галузь техніки

Наданий винахід належить до химерних рецепторів антигенів (САК), що включають спейсери на основі рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (ГМО).

Рівень техніки

Імунотерапія на основі адоптивного перенесення імунних клітин (наприклад, Т-клітин) у організм пацієнта може відігравати важливу роль у лікуванні захворювань, зокрема раку. Серед множини різних типів імунотерапевтичних агентів, один з самих перспективних терапевтичних методів передбачає використовування химерних рецепторів антигенів (САК). САК являють собою сконструйовані за допомогою генної інженерії рецептори, які призначені для націлювання на специфічний антиген, такий як пухлинний антиген (зЗааеїаїп еї аї., Сапсег Оізсомегу 2013. 3(4):388-98). Наприклад, Т-клітини трансдукують з використовуванням САК, так що Т- клітини, що експресують САК, знищують пухлини через антиген-мішень.

САК включають екстраклітинний лігандзв'язувальний домен, звичайно одноланцюговий варіабельний фрагмент моноклонального антитіла (5СЕм), зв'язаний з внутрішньоклітинними компонентами, що передають сигнали, звичайно СОЗСЄ окремо або у комбінації з одним або більше костимулювальних доменів. Між екстраклітинним антигензв'язувальним доменом і трансмембранним фрагментом часто додають спейсер для оптимізації взаємодії з мішенню.

Звичайно Ес-домен, до складу якого входять шарнірна ділянка - СН2-СНЗ константної дялнки імуноглобуліну дс, використовується як спейсерний домен. Цей спейсер використовується для відбирання і відстеження клітин, що експресують САК. Однак спейсер на основі ДСї може також зв'язуватися з поверхневими Ес-гамма- рецепторами для Ідо, наведеними на вроджених імунних клітинах, що подібні до макрофагів і клітин природним кілерам (Нотрасп еї аі, Сепе Тпег 2000, дип;7(12):1067-75). Це зв'язування активує як сконструйовані Т-клітини, так і вроджені імунні клітини незалежно від специфічності зв'язувального домену САКЕ, призводячи до небажаної, нецільової імунної реакції.

Існує потреба у САК, які не викликають нецільові імунні реакції, і не усуваються передчасно імунною системою хазяїна. Існує також потреба у САК, що включають спейсерні одиниці, які полегшують відбір клітин, сконструйованих за допомогою генної інженерії для експресії САК.

Наданий винахід спрямований на задоволення цих потреб.

Зо Суть винаходу

Відповідно до першого аспекту наданого винаходу забезпечується химерний рецептор антигену (САК), що включає екстраклітинний спейсер, який включає принаймні частину екстраклітинного домену рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (ГМО) людини або її похідну.

САК може включати принаймні фрагмент екстраклітинного домену рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (І МОЕК) людини або його похідну.

Переважно, коли принаймні частина І МОЕК придатна для полегшення імуноселекції клітин, трансдукованих вказаним САК.

Переважно, коли у спейсері відсутній внутрішньоклітинний домен І МО.

Переважно, коли екстраклітинний спейсер включає перші три ТМЕВ-су5 домени І МОЕК або їх фрагменти або похідні.

В одному варіанті здійснення спейсер включає всі чотири ТМЕК- су5 домени І МОЕК або їх фрагменти або похідні.

В іншому варіанті здійснення спейсер включає четвертий домен ТМЕК-суз (ТМЕВ-суз 4), але при цьому наступні амінокислоти вилучені З вказаного домену:

МНМОРСІ РСТМСЕОТЕКОЇ КЕСТЕМУ. Переважно послідовність

МНМОРСІГ РСТМСЕОТЕКОЇ КЕСТЕМУ замінена наступною амінокислотною послідовністю АКА.

В іншому варіанті здійснення спейсер включає багату серином/гтреоніном ніжку ГМО.

В іншому варіанті здійснення у спейсері відсутня багата серином/гтреоніном ніжка ГМО.

Спейсер може включати послідовність, що вибрається з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ

МО:1, 5ЕО ІЮО МО:З3, 5ЕО ІЮО МО:5 або 5ЕО ІЮО МО:7, або послідовність, яка щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентична до неї.

В іншому варіанті здійснення спейсер може складатися з послідовності, що вибирається з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:1, 5ЗЕО ІЮ МО:3, 5ЕО ІЮ МО:5 або 5ЕО ІЮ МО:7, або послідовності, яка щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентична до неї.

ЗЕО ІЮ МО:1, БЕО ІЮ МО:З і БЕО ІЮ МО:5 є переважними спейсерними елементами.

Відповідно до одного аспекту наданого винаходу забезпечується химерний рецептор антигену (САК), що включає () антигенспецифічний таргетуючий (такий, що націлює) домен; бо (її) екстраклітинний спейсерний домен, визначений тут; (ії) трансмембранний домен;

(ім) необов'язково принаймні один костимулювальний домен; і (м) внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали.

Переважно, коли антигенспецифічний таргетуючий домен включає антитіло або його фрагмент, більш переважно одноланцюговий варіабельний фрагмент.

Переважно, коли мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену є пухлинний антиген.

Приклади таких антигенів включають СО44, СОр19, с020, 2022, с023, Ср123, С5-1, ВОВІ, мезотелін, с- Меї, РОМА, Нег2, й0-2, СЕА, МАСЕ АЗ ТОВ.

Переважно, коли пухлинним антигеном є ізоформа 6 СО044 (СО44м6).

Приклади трансмембранних доменів включають трансмембранний домен дзета-ланцюга Т- клітинного рецепторного комплексу, СО28 і СОва.

Приклади костимулювальних доменів включають костимулювальний домен з СО28, СО137 (4-188), СО134 (0Х40), БбаріО, С027, 02, СО5, ІСАМ-1, І ГА-1, І ск, ТМЕВ-Ї, ТМЕВ-Ї, Раз, СОЗО і 6040.

Приклади внутрішньоклітинних доменів, що передають сигнали, включають дзета-ланцюг

СОЗ людини, ЕсукіІй, Ес5КІ, цитоплазматичний хвіст Ес-рецептора і цитоплазматичні рецептори, що несуть імунорецепторний тирозиновий активуючий мотив (ІТАМ).

У переважному варіанті здійснення мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену

САК є СО44уб6, трансмембранний домен САК включає трансмембранний домен СОа28, внутрішньоклітинний домен САК, що передає сигнали, включає внутрішньоклітинний домен дзета-ланцюга СОЗ людини, що передає сигнали, а костимулювальний домен САК включає ендо-костимулювальний домен СО28.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується полінуклеотид, що кодує САК наданого винаходу і визначений тут.

Переважно, коли полінуклеотид кодує спейсерний домен, який включає послідовність 5Е0

ІО МО:2, ЗЕО ІЮО МО:4, 5ЕО ІО МО:б або 5ЕО ІЮО МО:8, або послідовність, яка щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентична до неї.

В одному варіанті здійснення полінуклеотид кодує спейсерний домен, який складається з послідовності 5ЕО ІЮ МО:2, ЗЕО ІЮО МО:4, 5ЕО ІЮО МО:6 або 5ЕО ІО МО:8, або послідовності, яка щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентична до неї.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується вектор, що включає полінуклеотид наданого винаходу.

В одному варіанті здійснення вектор являє собою вірусний вектор.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується клітина, що включає САКЕ, полінуклеотид або вектор наданого винаходу. Переважно, коли клітина являє собою Т-клітину.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується фармацевтична композиція, що включає клітину наданого винаходу.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується САК, полінуклеотид, вектор або клітина наданого винаходу для застосування у терапії, переважно терапії раку.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується САК наданого винаходу, мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену якого є СО44мб для застосування при лікуванні пухлин, які експресують СО44.

В іншому аспекті наданого винаходу забезпечується спосіб лікування, що включає введення

САК, полінуклеотиду, вектора або клітини наданого винаходу суб'єкту, що потребує такого введення.

Приклади САК наведені на фіг. 10-17.

Опис креслень

Фіг. 1. Обгрунтування створення конструкцій СО44у6-САК.287 з різними спейсерами на основі ЇМОЕК. А. Схема, що пояснює обмеження Т-клітин, що експресують САКЕ, який містить спейсер СН2СНЗ ІдС1. В. Структура екстраклітинної частини рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (МОМ) і 4-х нових конструкцій САКЕ, які були створені. Також включені

СбОр44у6- САНК.287, що містять спейсер СН2СНЗ ІдДС1 дикого типу або мутований (тСсН2СНЗ).

СНМ: С0О44у6-САК.287, що містить спейсер СН2СНЗ дикого типу. СНМ: СО44у6-САК.287, ЩО містить мутований спейсер СН2СНЗ. МУМ: СО44ум6-САК.287, що містить довгий спейсер на основі ЇГМОЕК дикого типу (що включає 4 ТМЕК-су5 домени і ніжку). ММУ5: СО44у6-САК.287, що містить короткий спейсер на основі ЇМО дикого типу (що включає тільки 4 ТМЕК-су5 домени).

ММ: 2044у6-САК.287, що містить мутований довгий спейсер на основі І МОЕК (що включає 4

ТМЕВ-суз домени з делецією у четвертому домені і ніжку). ММ5: СО44уи6-САК.287, що містить мутований короткий спейсер на основі ГМОЕК (що включає 4 ТМЕК- су5 домени з делецією у бо четвертому домені і ніжку). Фігурні дужки вказують довжину спейсера, наведену у амінокислотах. Сірий колір: 5сЕм. Білий колір: костимулювальний домен СО28; Чорний колір: созс.

Фіг. 2. Експресуючі СЮО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі ГМО Т-клітини можуть бути відсортовані з використовуванням мАт проти ГМОЕК, ефективно розмножуватися іп міїго і зберігати рано диференційований фенотип. Т-клітини активували з використовуванням брз/Сра2г8-сфер, трансдукували ретровірусними векторами (КМ), що кодують СО44у6.САК287 з різними спейсерами на основі І МОЕК, і культивували з 1--7/ЛІ-15. А. Ідентифікація САК на поверхні Т-клітин з використовуванням специфічного для І МОЕК мАт С40-1457 (верхні графіки).

Ідентифікація САК на поверхні Т- клітин з використовуванням І МОЕК-специфічного мАт МЕ20О.4 (нижні графіки) В. Ліворуч: Т-клітини, що експресують СО44м6б6-САК.287 з різними спейсерами на основі ГМО, після сортування з використовуванням мАт С40-1457 і анти-РЕ сфер. Праворуч: кінетика збільшення кількості відсортованих експресуючих СО44у6-САК.287 зі спейсером

СН2СНЗ і спейсерами на основі МОГ Т-клітин, наведена як кратне збільшення. С. Фенотип функціонального диференціювання Т-клітин, що експресують СО44мб6- САК.287 з різними спейсерами на основі І МОЕК, через 15 днів після активації. СО45КАч/СОб62І я стовбурові Т- клітини пам'яті, СО45КА-/СО621І ї- центральні Т-клітини пам'яті, СО45КА-/С20О621 - ефекторні Т- клітини пам'яті, СО45КАч/СОб2І - ефекторні Т-клітини пам'яті КА. Графіки і криві відповідають п-4 незалежним експериментам.

Фіг. 3. Експресуючі СО44умб-САК.287 зі спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітини специфічно розпізнають СО44мби пухлинні клітини іп міго. А. Після сортування експресуючі СО44мб6-

САК.287 з різними спейсерами на основі І МОЕК Т-клітини (МУМ, МУУ5, ММ, ММ5), експресуючі

СОр44у6-САБК зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини (СНУУ, СНМ) і Т-клітини, що несуть нерелевантний

САК, культивували з СО44мб-- клітинами мієломи ММ1.5, СО44мб-- лейкозними клітинами ТНР- 1 або СО44у6- лімфобластоїдними клітинами ВМУ-173 при різних співвідношеннях Е:Т. Через 4 дні, залишкові пухлинні клітини підраховували і аналізували за допомогою ГАС5. Наведений індекс елімінації (дивиться приклад «Методи») за допомогою експресуючих СО44мб-САК.287 Т- клітин при різних співвідношеннях Е:Т. В. У експресуючі СО44уб6-САК.287 Т-клітини вводили барвник СЕБЕ, і їх стимулювали з використовуванням ліній опромінених пухлинних клітин у співвідношенні Е:Т-1:5. Через 6 днів, проліферацію Т- клітин аналізували за допомогою ЕАС5,

Зо виражаючи у вигляді клітин, що розбавляють СЕБЕ. Графіки і криві відповідають п-4 незалежним експериментам.

Фіг. 4. У експресуючих СО44уб6-САК.287 зі спейсерами на основі І МОЕК Т-клітин відсутнє

ЕсНд-опосередковане розпізнавання. А. Після сортування експресуючі СО44м6-САК.287 з різними спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітини (МУМ, МУУ5, ММ, ММ5), експресуючі СО44у6-

САК зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини (СНУМ, СНМ) і Т-клітини, що несуть нерелевантний САК, від п-4 здоровим донорам культивували з СО44мбя/Рсдж лейкозними клітинами ТНР-1 або бр44у6-/Естд» лейкозними клітинами НІ-6О0 при різних співвідношеннях Е:Т. Через 4 дні, залишкові пухлинні клітини підраховували і аналізували за допомогою ЕАС5. Наведений індекс елімінації (дивиться приклад «Методи») за допомогою експресуючих СО44у6-САК.287 Т-клітин при різних співвідношеннях ЕТ. В. В експресуючі СО44мб6-САК.287 Т-клітини вводили барвник

СЕЗЕ, і їх стимулювали з використовуванням ліній опромінених клітин ТНРІ1, НІ 60 або СО44мб- /ЕсВа-лімфобластоїдних клітин ВМ-173. Через б днів проліферацію Т-клітин аналізували за допомогою ЕБАСЗ5 і наводили у вигляді клітин, що розбавляють СЕБЕ. Графіки і криві відповідають п-4 незалежним експериментам.

Фіг. 5. С044м6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕК нестимулюються за допомогою розчинного МОР. А. Після піддавання протягом 24 годин впливу людського рекомбінантного

МОБ у різних концентраціях, І МОСК нервові клітини РО-12 аналізували відносно утворювання дендритів за допомогою оптичної мікроскопії. В. Після сортування у експресуючі СО44м6-

САК.287 з різними спейсерами на основі ГМОБЕК Т-клітини (ММУМ, МУУ5, ММ, ММ5) і експресуючі СО44умб-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини (СНМУ, СНМ) вводили барвник

СЕЗЕ, і їх піддавали впливу різних концентрацій МОБ. Через 4 дні проліферацію Т-клітин аналізували за допомогою ЕБАС5 і наводили у вигляді клітин, що розбавляють СЕБЕ.

Розведення СЕБЕ після співкультивування з СО44мб- клітинами мієломи ММ1.5 або СО44у6- лімфобластоїдними клітинами ВУ-173 наведено для порівняння. Фотографії і криві відповідають п-2 незалежним експериментам. Графіки показують середнє значення - стандартне відхилення від двох експериментів.

Фіг. 6.3. Експресуючі СО44умб6-САК.287 зі спейсерами на основі Ї/МОЕК Т-клітини краще розмножуються, зберігаються і опосередковують чудові протилейкозні ефекти у моделі мінімальної залишкової хвороби. Мишам М5С вводили шляхом інфузії СО44уб- лейкозні бо клітини ТНР-1, і через З дні їх піддавали лікуванню експресуючими СО44ум6-САК.287 з різними спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітинами (МУМІ, МУУ5, ММ, ММ5), експресуючими СО44м6-

САК зі спейсером СН2СНЗ Т-клітинами (СНММ) або Т-клітинами, що експресують нерелевантний

САК (СТЕК), усіх їх сортували до ступеня чистоти, що становить 29595. А. Репрезентативні графіки (ліворуч) і графік, що включає все (праворуч), на якому наведені циркулюючі, експресуючі СО44мб-САК.287 Т-клітини у кожної миші через три дні після інфузії. СО44мб-

САК.287 з різними спейсерами відслідковувалися за допомогою БАС5 після забарвлювання поліклональним антитілом проти дос (СТЕ і СНУМ) або І МОЕК- специфічним мАт, С40-1457 мАт.

В. Кінетика збільшення кількості і персистенції з часом експресуючих СО44у6-САК287 Т-клітин.

С. Вага печінки з інфільтруючими клітинами Тер! у підданих лікуванню мишей при умертвінні (7 тижнів). Пунктирна зона зображує діапазон нормальної ваги печінки від підібраних за віком/статтю нормальних мишей МБО. Результати однофакторного дисперсійного аналізу наведені у випадку статистичної значущості (Р«0,05, РО 01, ра, 001).

Фіг. 7. Експресуючі СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі

ІМОБК о Т-клітини краще розмножуються, зберігаються і опосередковують чудові протимієломні ефекти у моделі стійкого захворювання. Мишам МО вводили шляхом інфузії

Сра44уб- клітини ММ'І1.5, і через 5 тижнів їх піддавали лікуванню експресуючими СО44м6-

САК.287 з різними спейсерами на основі ГМО Т-клітинами (МУМІ, МУУ5, ММ5), експресуючими

СОр44у6-САН.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітинами (СНМУ) або Т-клітинами, що експресують нерелевантний САК (СТЕ), усіх їх сортували до ступеня чистоти, що становить 29595. А. Графік, що включає все (праворуч), на якому наведені циркулюючі, експресуючі СО44м6-САК.287 Т- клітини у кожної миші через три дні після інфузії. СО44мб6-САК.287 з різними спейсерами відслідковувалися за допомогою ЕАС5 після забарвлювання поліклональним антитілом проти

Іо (СТЕК і СНМУ) або І Маг В-специфічним мАт, С40-1457 мАт. В. Криві виживаності Каплана-

Мейєра підданих лікуванню мишей. Наведені результати перевірки за критерієм Кокса, що порівнює різні умови (по: незначуще, "Р«0,05, Р«О0,001).

Фіг. 7 ВІ5. 3. Експресуючі СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕК Т-клітини опосередковують чудові протимієломні ефекти у моделі стійкого захворювання. Мишам МО вводили шляхом інфузії СО44мб-- клітини ММ1.5, що експресують люциферазу, і через 26 днів їх піддавали лікуванню експресуючими СО44у6- експресуючими

Зо СбО44у6-САК зі спейсером СН2СНЗ Т-клітинами (СНМУ) або Т-клітинами, що експресують нерелевантний САК (СТЕК), усіх їх сортували до ступеня чистоти, що становить 29595. А.

Циркулюючу кількість пухлинних клітин оцінювали у вигляді відносних світлових одиницях (КІ) у вказані моменти часу. В. Криві виживаності Каплана-Мейєра підданих лікуванню мишей.

Наведені результати перевірки за критерієм Кокса, що порівнює різні умови ("Ре0,01).

Фіг. 8. Послідовність | МОЕК людини.

Фіг. 9. Послідовність СО44УбСАВ.287. Наведені послідовності 5сЕм, СН2СНЗ, СО28 і дзета- ланцюги.

Фіг. 10. Послідовність СО44уУбСАК.287 зі спейсером ГМОЕК дикого типу довгим (МУМІ) (ЗЕО

ІО МО:21), що наводиться як приклад/

Фіг. 11. Послідовність СО44у6-САК.287 зі спейсером ГМОЕК дикого типу коротким (МУУБ5) (ЗЕО ІО МО:22), що наводиться як приклад.

Фіг. 12. Послідовність СЮО44м6-САК.287 зі спейсером ЇМОЕК мутованим довгим (ММ) (5ЕО

ІО МО:23), що наводиться як приклад.

Фіг. 13. Послідовність СО44мб-САК.287 зі спейсером | МОРЕ мутованим коротким (ММ5) (ЗЕО ІО МО:24), що наводиться як приклад.

Фіг. 14. Послідовність СО44уУбСАК.287 зі спейсером ГМОЕК дикого типу довгим (МУМІ) (ЗЕО

ІО МО:25), що наводиться як приклад.

Фіг. 15. Послідовність СО44мб-САК.287 зі спейсером ГМОЕК дикого типу коротким (МУУ5) (ЗЕО ІО МО:26), що наводиться як приклад.

Фіг. 16. Послідовність СЮО44уУбСАК.287 зі спейсером ГМОЕК мутованим довгим (ММІ) (5ЕО

ІО МО:27), що наводиться як приклад.

Фіг. 17. Послідовність СО44мб6-САК.287 зі спейсером ЇМОЕК мутованим коротким (ММ5) (ЗЕО ІЮО МО:28), що наводиться як приклад.

Фіг. 18. Послідовність СО44у6-4452-САН287 зі спейсером І МОВ дикого типу довгим (МУМІ) (ЗЕО ІЮО МО:32), що наводиться як приклад.

Фіг. 19. Послідовність СО44мб-4(352-САК287 зі спейсером ЇМО дикого типу коротким (ММУ5) (ЗЕО ІЮО МО:33), що наводиться як приклад.

Фіг. 20. Послідовність СЮО44м6-40552-САК287 зі спейсером І! МОЕК мутованим довгим (ММ) (ЗЕО 1О МО:34), що наводиться як приклад. бо Фіг 21. Послідовність СО44мб-4(352-САК287 зі спейсером ЇМОЕК мутованим коротким

(ММ5) (ЗЕО ІО МО:35), що наводиться як приклад.

Фіг. 22. Створення САК з різними спейсерами на основі І МО.

Структура екстраклітинної частини рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (МОН) і різних конструкцій САР, мішенню яких є СО19 і СЕА, які були створені. Також включені СО19/СЕА-САК.287, що містять спейсер СН2СНЗ 191 дикого типу (СН2СНЗ). МУМІ:

СО19/СЕА-САК.287, що містить довгий спейсер на основі | МОРЕ дикого типу (що включає 4

ТМЕВ-суз домени і ніжку). ММ5: СО19/СЕА-САК.287, що містить мутований короткий спейсер на основі ГМОЕК (що включає 4 ТМЕК-су5 домени з делецією у четвертому домені). Фігурні дужки вказують довжину спейсера, наведену в амінокислотах. Сірий колір: 5сгм.

Фіг. 23. Експресуючі СО19/СЕА-САК.287 зі спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітини можуть бути забарвлені мАт проти ЇМОЕК. Т- клітини активували з використовуванням СОЗ3/С028- сфер, трансдукували ретровірусними векторами (КМ), що кодують СО19/СЕА.САК287 з різними спейсерами на основі І МОР, культивували з ЇЇ -7/І-15 і відбирали з використовуванням мАт

С40-1457 і анти-РЕ сфер. Як позитивний контроль, експресуючі СО44у6-4552.САК287 Т-клітини були одержані у таких же самих умовах. Наведена ідентифікація САК на поверхні Т-клітин з використовуванням І МОЕК-специфічного мАт С40-1457.

Фіг. 24. Експресуючі СО19/СЕА-САК.2857 зі спейсерами на основі

ІГМОЕК Т-клітини специфічно розпізнають антигенекспресуючі пухлинні клітини іп міїго. А.

Після сортування експресуючі СО19/СЕА/СО44у6-40252-САК.287 з різними спейсерами на основі ЇМОЕК Т-клітини(МУМ, МУУЗ) | експресуючі СО19/СЕА-САВ зі спейсером СН2СНЗ Т- клітини (СНММ) Т-клітини культивували з лейкозними клітинами АГЇ-СМ і НІб0, лімфобластоїдними клітинами ВМ-173 і клітинами карциноми ВХРОСЗ при співвідношенні

Е:Т-1:10. Через 4 дні, залишкові пухлинні клітини підраховували і аналізували за допомогою

ЕАСЗ5. Наведений індекс елімінації (дивиться приклад «Методи») за допомогою різних САК.2в2

Т- клітин. В. В. Супернатанти від співкультур, описаних у А, збирали через 24 години і аналізували на продукування цитокінів за допомогою аналізу СВА (Віоіедепа). Наведений викид

ІЕМа, 1-2 ї ТМЕРа при розпізнаванні клітин-мішеней.

Фіг. 25. Експресуючі СО19-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕЖК Т-клітини опосередковують протилейкозні ефекти. Мишей МО піддавали інфузії СО19-- лейкозних клітин

Зо АЇІ-СМ і через три дні піддавали лікуванню експресуючими СО19-САК.287 з різними спейсерами на основі ЇМОЕК Т-клітинами (19 МУМІ ї 19 ММ5). Т- клітини, що експресують неспоріднену конструкцію СО44у6-4052- САК.287 (мб МУМІ і мб ММ5), використовували для інфузії як контроль. Усі САКж Т-клітини сортували до ступеня чистоти, що становить 29595, перед інфузією. Графік показує наявність пухлинних клітин АЇЇ-см у кістковому мозку (ВМ) кожної миші у момент умертвіння. Пухлинні клітини відслідковували за допомогою ЕБАС5 після забарвлювання з використовуванням мАт проти пПСО45 і пСО19. Результати перевірки за критерієм Стьюдента наведені у випадку статистичної значущості (Р«е0,05, "Р«б,01, пхр«0,001).

Фіг. 26. Полінуклеотидна послідовність СО44у6-4552-САК287, зі спейсером МОГ дикого типу довгим (МУМІ) (ЗЕО ІЮ МО: 37)

Фіг. 27. Полінуклеотидна послідовності СО44у6-4(352-САК287, зі спейсером МОГ дикого типу коротким (МУУ5) (ЗЕО 1О МО:38)

Фіг. 28. Полінуклеотидна послідовність СО44м6-40552-САК287 зі спейсером ІМС мутованим довгим (ММІ) (5ЕО 1О МО:39)

Фіг. 29. Полінуклеотидна послідовність СО44м6-40552-САК287 зі спейсером ІМС мутованим коротким (ММ5) (ЗЕО ІЮ МО:40)

Докладний опис винаходу

Різні переважні ознаки і варіанти здійснення наданого винаходу будуть тепер описані як приклади, що необмежують.

При здійсненні на практиці наданого винаходу будуть використовуватися, якщо не зазначене інше, звичайні методи хімії, біохімії, молекулярної біології, мікробіології і імунології, які знаходяться у границях можливостей фахівця з середнім рівнем компетентності у даній галузі техніки. Такі методи пояснені у літературі. Дивиться, наприклад, Затрбгоок, «)., Еніївси,

Е.Р., апі Мапіаїї5, Т. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгту Мапиаї!, 2па Еайіоп, Соїд Бргіпд

Нарог І арогаїогу Ргез5; А!зибеї, Е.М. еї аї. (1995 і додатки до періодичного видання) Сигтепі

Ргоїосоїв іп МоІесшіаг Віоіоду, Сп. 9, 13 апа 16, дхонп М/йєу в опе; Воє, В., Старігее, .., апа Канп,

А. (1996) ОМА Ізоїайоп апа 5едиепсіпд: Евзепійа! Тесппіднев, Чоп УМіеу б 5опв; Роїак, У.М., апа

Мсдее, 9.00. (1990) Іп 5йци Нубгіаіганоп: Ргіпсірієх апа Ргасіїсе, Охіога Опімегейу Ргезв; Саїї,

М... (1984) Оіїдописіеоїіде Зупіпевів: А Ргасіїса! Арргоаси, ІВ! Ргезв5; і ПШеу, О.М., апа Обапібего, 60 У.Е. (1992) Меїнодз іп Еплутоіоду: ОМА 5ігисіигез Рай А: Зупіпезіз апа РНузіса! Апаїувів ої ОМА,

Асадетіс Ргез55. Кожний із цих загальних текстів включений сюди за допомогою посилання.

Химерні рецептори антигенів «Химерний рецептор антигену» або «САК», як тут використовується, належить до сконструйованих рецепторів, які можуть забезпечувати специфічність відносно антигену клітинам (наприклад, Т-клітинам, такими як ненавчені Т-клітини, центральні Т-клітини пам'яті, ефекторні Т-клітини пам'яті або їх комбінації). САК. також відомі як штучні Т-клітинні рецептори, химерні Т-клітинні рецептори або химерні імунорецептори. Переважно, коли САК наданого винаходу включають антигенспецифічний таргетуючий район, екстраклітинний домен, трансмембранний домен, необов'язково один або більше костимулювальних доменів і внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали.

Антигенспецифічний таргетуючий домен

Антигенспецифічний таргетуючий домен забезпечує САК здатністю до зв'язування з антигеном-мішенню, що викликає інтерес. Переважно мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену є антиген, який викликає клінічний інтерес, проти якого був би бажаним виклик ефекторної імунної відповіді, яка призводить до знищення пухлини.

Антигенспецифічним таргетуючим доменом може бути будь-який білок або пептид, який має здатність до специфічного розпізнавання і зв'язування з біологічноїою) молекули(ою) (наприклад, рецептора клітинної поверхні або пухлинного білка, або його компонента).

Антигенспецифічний таргетуючий домен включає будь-який, що зустрічається у природі, синтетичний, напівсинтетичний або рекомбінантно одержаний партнер по зв'язуванню для біологічної молекули, що викликає інтерес.

Ілюстративні антигенспецифічні таргетуючі домени включають антитіла або фрагменти або похідні антитіл, екстраклітинні домени рецепторів, ліганди для молекул/рецепторів клітинної поверхні або їх домени, що зв'язуються з рецепторами, і білки, що зв'язуються з пухлиною.

У переважному варіанті здійснення аАнтигенспецифічний таргетуючий домен являє собою, або є таким, що походить 3, антитіло(а). Таргетуючий домен, що походить з антитіла, може бути фрагментом антитіла або одержаним методами генної інженерії продуктом одного або більше фрагментів антитіла, при цьому фрагмент бере участь у зв'язуванні з антигеном. Приклади включають варіабельну ділянку (Ем), визначальну комплементарність ділянку (СОК), Раб,

Зо одноланцюгове антитіло (5сЕм), варіабельну ділянку важкого ланцюга (МН), варіабельну ділянку легкого ланцюга (МІ) і антитіло сімейства верблюдові (УНН). У переважному варіанті здійснення зв'язувальний домен являє собою одноланцюгове антитіло (5СЕм). ЗСЕм може бути мишиним, людським або гуманізованим 5сгУ. «Визначальний комплементарність район» або «СОК», відносно антитіла або його антигензв'язувального фрагмента, належить до високого ступеня варіабельної петлевої ділянки у варіабельній ділянці важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла. СОМ може взаємодіяти з конформацією антитіла і у значній мірі визначати зв'язування з антигеном (хоча деякі каркасні ділянки, як відомо, беруть участь у зв'язуванні). Кожна з варіабельної ділянки важкого ланцюга і варіабельної ділянки легкого ланцюга містить З СОВ. "Варіабельна ділянка важкого ланцюга" або "УН" належить до фрагмента важкого ланцюга антитіла, який містить три СОК, розташовані між фланкуючими ділянками, відомими як каркасні ділянки, які є у більш високому ступені консервативними, ніж СОК, і утворюють каркас для підтримки СОК. "Варіабельна ділянка легкого ланцюга" або "МІ" належить до фрагмента легкого ланцюга антитіла, який містить три СОК, розташовані між каркасними ділянками. "Ру" належить до найменшого фрагмента антитіла, який несе повний антигензв'язувальний сайт. Ем-фрагмент складається з варіабельної ділянки одного легкого ланцюга, зв'язаної з варіабельною ділянкою одного важкого ланцюга. "Одноланцюгове Ем-антитіло" або "5сЕм" належить до сконструйованого антитіла, яке складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга, які з'єднані одна з одною безпосередньо або через послідовність пептидного лінкера.

Антитіла, які специфічно зв'язуються з молекулою на поверхні пухлинних клітин, можуть бути одержані, використовуючи методи, добре відомі у даній галузі техніки. Такі методи включають фаговий дисплей, методи одержання людських або гуманізованих антитіл, або методи з використовуванням трансгенної тварини або рослини, створеної для продукування антитіл людини. Бібліотеки фагового дисплея частково або повністю синтетичних антитіл доступні і можуть бути піддані скринінгу на антитіло або його фрагмент, яке(ий) може зв'язуватися з молекулою-мішенню. Бібліотеки фагового дисплея антитіл людини також доступні. Після ідентифікації амінокислотна послідовність або полінуклеотидна послідовність, 60 що кодує антитіло, може бути ізольована і/або визначена.

Приклади антигенів, на які можуть бути націлені САКЕ наданого винаходу, включають, але без обмеження ними, антигени, наведені на ракових клітинах, і антигени, наведені на клітинах, пов'язаних з різними гематологічними захворюваннями, аутоїмунними захворюваннями, запальними захворюваннями і інфекційними захворюваннями.

Що стосується таргетуючих доменів, мішенню яких є ракові антигени, вибір таргетуючого домену буде залежати від типу раку, що підлягає лікуванню, і він може бути націлений на пухлинні антигени. Зразок пухлини від суб'єкта може бути охарактеризований відносно наявності визначених біомаркерів або маркерів клітинної поверхні. Наприклад, клітини раку молочної залози у суб'єкта можуть бути позитивними або негативними за будь-яким з Нег2Меи, естрогенового рецептора і/або рецептора прогестерону. Вибирають молекулу пухлинного антигену або клітинної поверхні, яка зустрічається на пухлинних клітинах окремого суб'єкта.

Переважно, коли мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену є молекула клітинної поверхні, яка зустрічається на пухлинних клітинах і по суті не зустрічається у нормальних тканинах, або її експресія обмежується нормальними тканинами, які не є необхідними для життя.

Додаткові специфічні для раку антигени, на які може бути націлений САК наданого винаходу, включають, але без обмеження, будь-який один або більше з карциноембріонального антигену (СЕА), специфічного для простати антигену, РОМА, Негг/пеи, естрогенового рецептора, рецептора прогестерону, ефрину В2, КОК'І, мезотеліну, с-Меї, 20-2, і МАСЕ АЗ

ТСВ, 4-188, 574, антигену аденокарциноми, альфа-фетопротеїну, ВАЕЕ, клітини В- лімфоми, антигену С242, СА-125, карбоангідрази 9 (СА-ІХ), ССВ4, Ср152, 00200, 0022, С0р19, Срг2, с0р123, 260221, С0О23 (рецептора ЧЕ), 2028, СО30 (ТМЕКБЗЕ8), СО033, 204, 26040, С044, Ср44 мб, СО51, 6052, С056, 0074, СО80, С5-1, СЕА, СМТО0888, СТІ А-4, ОВО, ЕСЕВ, ЕРСАМ, СО,

ЕАР, додаткового домену-В фібронектину, рецептора 1 фолієвої кислоти, 502, гангліозиду

СО3, глікопротеїну 75, ОРММВ, НОР, рецепторної кінази фактора росту гепатоцитів людини, рецептора ІСЕ-1, ІСЕ-1, ІДС, Її 1-САМ, 1-13, І -6, рецептора інсуліноподібного фактора 1 росту, інтегрину «581, інтегрину см83, МОКАБ-009, М54А1, МОСІ, муцинового СапАд, М- гліколіллоейрамінової кислоти, МРОС-1С, РОСЕ-Ка, РОЇ192, фосфатидилсерину, клітин карциноми простати, ВАМКІ, ВОМ, 5СН 900105, 50С1, 5І АМЕ7, ТАС-72, тенасцину С, ТО бета 2, ТОБ-В, ТЕАЇШ-ВІ, ТВА -К2, пухлинного антигену СТАА16.88, МЕСЕ-А, МЕСЕНІ,

МЕСЕНаЗ або віментину.

Специфічні для запальних захворювань антигени, на які може бути націлений САК наданого винаходу, включають, але без обмеження, будь-який один або більше із ЛОСЗ (МАР-1), САМ- 3001, ССІ111 (еотаксину-1), СО125, СО147 (басигіну), СО154 (С20401), СсО2, 6020, С023 (рецептора ЧЕ), СО25 (а-ланцюги рецептора 1-2), СО3, 004, СО5, ІЄМ-а, ІЕМ-у, ЧЕ, ІДЕ, Ес- фрагмента І9ЗЕ, 1-1, 11-12, 1-23, 1-13, 11-17, 11-17А, ІІ -22, І -4, 1. -5, 11 -5, 1-6, рецептора ІІ -6, інтегрину а4, інтегрину «4р7, вовни лами, І РА-1 (СО11а), МЕ0І-528, міостатину, ОХ-40, піпиМАБ

В7, склеросцину, ЗО5Т, ТОЕВІ, ТМЕ-а або МЕСБ-А.

Специфічні для нейрональних порушень антигени, на які може бути націлений СА наданого винаходу, включають, але без обмеження, будь-який один або більше із бета-амілоїду або МАВТ510О2А.

Специфічні для діабету антигени, на які може бути націлений САК наданого винаходу, включають, але без обмеження, будь-який один або більше із Ї-18 або СО3. Інші антигени, специфічні для діабету або інших порушень обміну речовин, будуть очевидні кваліфікованим фахівцям у даній галузі.

Специфічні для серцевосудинних захворювань антигени, на які може бути націлений СА наданого винаходу, включають, але без обмеження, будь-який один або більше із С5, серцевого міозину, СО41 (інтегрину альфа-ІІр), фібрину ІІ, бета-ланцюги, ІТОВ2 (СО18) ії сфінгазин-1- фосфату.

Переважно антигенспецифічний зв'язувальний домен специфічно зв'язується з пухлинним антигеном. У конкретному варіанті здійснення полінуклеотид кодує одноланцюговий Ем, який специфічно зв'язується з СО44У6.

Ілюстративним антигенспецифічним таргетуючим доменом є

Сра44у6-специфічний одноланцюговий фрагмент (5сЕм), наприклад, описаний у Сазиссі М еї а!ї, Віосій, 2013, Мом 14; 122(20):3461-72). Така послідовність наведена нижче:

Сра44у6-специфічний одноланцюговий фрагмент (5сЕм)

МЕАРАОІ ТР УМ РОТТО,Е МІ ТО5РАТІ 5І ЗРОЕВАТІ ЗСЗАБЗЗБІМУТ МУМІ ООКРОЮ

АРВАШМІ ТЗ5МІ АБЕИМРАНЕЗИаЗаБаТтОвТтТІ ТЗІ ЕРЕОБАМУМСІ ОМУЗЗМРІ ТРОСІВТКМЕЇ квнасаазасаазавасзасайеЕМОЇ МЕЗССаСИЇ МКРОСБІ ВІ БСААЗаєТтЕ55УОМЗУМВОАР 60 акагеЕмУзтІіззаавм Ум О5ІКОВЕТІЗАОМАКМ5І МІ ОММ5І ВАЕОТАУУУСАНОСІЇ УМ,

СТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО:17)

В одному варіанті здійснення СО44уб-специфічний одноланцюговий фрагмент щонайменше на 85, 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:17.

У ще одному переважному варіанті здійснення варіабельна ділянка легкого ланцюга і варіабельна ділянка важкого ланцюга СО44мб-специфічного одноланцюгового фрагмента з'єднані одна з одною через пептидний лінкер, що має наступну послідовність СОССОС5О5ОО5 (4552). Такий СО44мб-специфічний одноланцюговий фрагмент (СО44м6-40552) має наступну послідовність:

МЕАРАОСІ ТР ШУМ РОТТОЕ МІ ТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ 5СЗАБЗЗБІМУ ММ ООКРОЮ

АРВАШМІ ТЗ5МІ АБЕИМРАНЕЗИаЗаБаТтОвТтІ ТЗІ ЕРЕОБАМУМСІ ОМ/5ЗМРІ ТРОСІВТКМЕЇ квасавазассасйеЗЕМОЇ МЕЗСаСИЇ МКРОСБІ ВІ ЗСААБаєТЕЗ5МОМЗУУВОАРаКаі ЕМУ5ТІВ заавуУтУм р5ІКаВЕТІЗАОМАКМ5І М ОММ5І ВАЕОТАУУУСАВОСІ ОММСВОСТІ МТУ55 (5ЕО

ІО МО:З1)

Костимулювальний домен

САК наданого винаходу може також включати один або більше костимулювальних доменів.

Цей домен може підсилювати проліферацію клітин, виживаність клітин і розвиток клітин пам'яті.

Кожний костимулювальний домен включає костимулювальний домен будь-якого одного або більше з, наприклад, членів суперсімейства ТМЕРЕ, СО28, 20137 (4-188), СО134 (0Х40), барію,

СбОр27, 002, 005, ІСАМ-1, ГЕА-1, ск, ТМЕВ-1, ТМЕВ-ЇЇ, Раз, СОЗО, СО40 або їх комбінацій.

Костимулювальні домени з інших білків можуть бути також використані з САК наданого винаходу. Додаткові костимулювальні домени будуть очевидні кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки.

В одному варіанті здійснення як трансмембранний, так і костимулювальний домени одержані з СО28. В одному варіанті здійснення трансмембранний і внутрішньоклітинний костимулювальний домени включають послідовність, наведену нижче:

Трансмембранна і внутрішньоклітинна частина СО28 людини (ОМІРВОТ: Р1І10747, сбО028 НООМАМ, положення 153-220)

РУМІ МУМаСМІ АСУ МТМАРІЕУУВЗКАЗАВИ НЗОУМММТРАЕАВРОЕРТАКНМОРМАРРВАВОБА

АУНВ5 (ЗЕО ІЮ МО:18)

Зо В одному варіанті здійснення трансмембранний і внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, щонайменше на 85, 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентичний послідовності зЗЕО ІЮ МО:18.

В одному варіанті здійснення трансмембранний домен СО28 включає послідовність

РМУМІ МУМаСМІ АСУБІ І МТМАРІТЕМУМ (5ЕО ІЮ МО:29).

В одному варіанті здійснення внутрішньоклітинний костимулювальний домен СО28 включає послідовність КЗЕКАЗКО. НЗОУМММТРКЕКРОРТККНУОРУАРРКОЕААМНКЗ (5ЕО ІО МО:30).

Внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали

САВ наданого винаходу може також включати внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали. Цей домен може бути цитоплазматичним і може передавати ефекторний функціональний сигнал і спрямовувати клітини на виконання своєї спеціальної функції.

Приклади внутрішньоклітинних доменів, що передають сигнали, включають, але без обмеження ними, б-ланцюг Т-клітинного рецептора або будь-який з його гомологів (наприклад, п-ланцюг,

ЕсеєКтТу ії ВД-ланцюги, МВ1 (да) ланцюг, В29 (948) ланцюг і т.д.), поліпептиди СОЗ (А, 6 і є), сімейство 5УК тирозинкіназ (ЗУК, 2АР 70 і т.д.), сімейство 5сг тирозинкіназ (І СК, Руп, Гуп, і т.д.) і інші молекули, що беруть участь у перетворенні сигналів у Т- клітинах, такі як СО2, СО5 і СО28.

Внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, може бути дзета-ланцюгом СОЗ людини,

ЕсСУКІ, Ес5КІ, цитоплазматичними хвостами Ес-рецепторів, цитоплазматичними рецепторами, що несуть імунорецепторний тирозиновий активуючий мотив (ІТАМ), або їх комбінаціями.

Переважно, коли внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, включає внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, дзета-ланцюга СОЗ людини.

В одному варіанті здійснення внутрішньоклітинний домен дзета- ланцюга СОЗ людини, що передає сигнали, включає наступну послідовність:

ОМІРКОТ: Р20963, 20327 НОИМАМ, положення 331-143

ВУКЕЗАЗАВАРАМООСОМОЇ УМЕЇ М 2А!АВЕЕМ ОМ ОКАВАВОРЕМОаСКРОВАКМРОЕСІ МЕ

ГОКОКМАЕАУЗЕІСМКОСЕНАНОКИаНОрИТї МОсІ ЗТАТКОТМВАІ НМОАГРРА (5ЕО 10 МО:20)

В одному варіанті здійснення внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, щонайменше на 85, 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентичний послідовності ЗЕО ІЮ МО:20.

Додаткові внутрішньоклітинні домені, що передають сигнали, будуть очевидні кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки і можуть бути використані у зв'язку з альтернативними варіантами здійснення наданого винаходу. 60 Трансмембранний домен

САК наданого винаходу може також включати трансмембранний домен. Трансмембранний домен може включати трансмембранну послідовність із будь-якого білка, який має трансмембранний домен, у тому числі будь-якого із трансмембранних білків типу І, типу ІЇ або типу Ш. Трансмембранний домен САК наданого винаходу може також включати штучну гідрофобну послідовність. Трансмембранні домени САК наданого винаходи можуть бути вибрані таким чином, щоб не піддаватися димеризації. Додаткові трансмембранні домени будуть очевидні кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки. Приклади трансмембранних (ТМ) районів, що використовуються у конструкціях САК, є: 1) ТМ-район СО28 (Рше еї аї, Мої

Тнег, 2005, Мом;12(5):933-41; Вгепуепвз єї ані, ССВ, 2007, зер 15;19(18 РІ 1):5426-35; Савзиссі еї аї,

Віооа, 2013, Мом 14:и122(20):3461-72.); 2) ТМ-район ОХ40 (Рше еї а), Мої Тег, 2005,

Мом;12(5):933-41); 3) ТМ-район 4188 (Вгепуепз еї аії, ССВ, 2007, бер 15;13(18 РІ 1):5426-35); 4)

ТМ-район СОЗ дзета (Риїє єї аЇ, Мої Тнег, 2005, Мом; 12(5):933-41; Замоїдо В, Віоса, 2009, дип 18:и113(25):6392-402); 53 ТМ-район СОва (Манег евї аї, Маї Віоїєснпої, 2002, дап; 20(1):70-5.; Ітаї

С, ГешКетіа, 2004, Арг18(4):676-84; Вгепієп5 еї а, ССВ, 2007, бер 15;:13(18 Рі 1):5426-35;

Мііопе еї аї, Мої! Тег, 2009, А!йа;17(8):1453-64).

В одному варіанті здійснення як трансмембранний, так і внутрішньоклітинний домени, що передає сигнали, одержані з СО28. В одному варіанті здійснення трансмембранний і внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, включає послідовність, наведену нижче:

Трансмембранна і внутрішньоклітинна частина СО28 людини (ОМІРВОТ: Р1І10747, 6028 НОМАМ, положення 153-220)

РУМІ МУМаСМІ АСУ МТМАРІЕУУВЗКАЗАВИ НЗОУМММТРАЕАВРОЕРТАКНМОРМАРРВАВОБА

АУВ5 (ЗЕО ІЮ МО':18)

В одному варіанті здійснення трансмембранний і внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, щонайменше на 85, 90, 95, 97, 98 або 99 95 ідентичний послідовності зЗЕО ІЮ МО:18.

Спейсерний домен - рецептор фактора росту нервів з низькою спорідненістю (ГМО)

САК наданого винаходу включає екстраклітинний спейсерний домен. Екстраклітинний спейсерний домен приєднаний до антигенспецифічного таргетуючого району «ї трансмембранного домену.

САК наданого винаходу включає екстраклітинний спейсер, який включає принаймні частину

Зо екстраклітинного домену рецептора фактора росту нервів людину з низькою спорідненістю (МОР) або її похідну.

ІМОБК не експресується у більшості гемопоетичних клітин людини, так що робиться можливим кількісний аналіз експресії трансдукованих генів за допомогою імунофлуоресценції, З розрізнювальною здатністю-одній клітині. Таким чином, аналіз експресії ІМОЕК з використовуванням сортера клітин з активацією флуоресценції може бути виконаний на трансдукованих клітинах для вивчення експресії гена. Більш докладну інформацію про аналіз із використовуванням І МОЕК можна знайти в Маміїо 1994, Віоса 83, 1988-1997.

Послідовність | МОЕК людини наведена на фіг. 8 (ЗЕО ІО МО:14). У наданому винаході в одному варіанті здійснення використовується зрізаний ГМОЕК (також відомий як ЛІ МОЕК).

Переважно, коли І МОЕК, що використовується у наданому винаході, є зрізаним у його внутрішньоцитоплазматичному домені. Таке зрізання описано в Маміїо 1994.

Таким чином, переважно спейсер ГМОЕК наданого винаходу включає принаймні частину екстраклітинного домену, або її похідну, але в ньому відсутній внутрішньоклітинний домен

ГМО. Екстраклітинний домен може включати амінокислоти 29-250 з | МОЕК або його похідної.

Екстраклітинний домен ЇМОЕК людини (ШМІРКОТ ЖРО8138, ТМК16 НОМАМ, положення 29- 250)

КЕАСРТаЇ УТНЗаЕССКАСМІ аЕСМАОРСЯАМОТУМСЕРСІ О5МТЕЗОМУЗАТЕРСКРСТЕСУЄ

ГОЗМ5ЗАРСУЕАВрРАУСАСАУаУМОРЕТТОВАВСЕАСАУСЕАДИаЗаї МЕЗЄСОЮСКОМТУСЕЕСРОСТУВО

ЕАМНМОРСІ РСТУСЕОТЕВОЇ ВЕСТАМАВАЕСЕЕІРИРУМ ІТ АЗТРРЕСЗОЗТАРЗТОЕРЕАРРЕОЮ

ПАБТУАдаУУтТтУМОа5БОРУМТВИаттТОМ (5ЕО ІО МО:19)

Переважно, коли в І МО відсутній сигнальний пептид.

В одному варіанті здійснення спейсер включає принаймні частину білка, ідентичного щонайменше на 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 до екстраклітинного домену ГМО (наприклад,

ЗЕБЕО ІО МО:19). В одному варіанті здійснення спейсер включає принаймні частину білка, ідентичного щонайменше на 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 до амінокислот 29-250 білка | МОГ.

ІМОРГК включає 4 ТМЕК-суз домени (ТМЕК-суз 1, ТМЕВ-суб5 2, ТМЕН-суз З ії ТМЕК-сув 4).

Послідовності доменів проілюстровані нижче:

ТМЕВ-суз 1, БЕО ІЮ МО:9

АСРТОЇ УТНЗСЕССКАСМІ ДЕСМАОРССАМОТУС бо ТМЕВ-суз 2, БЕО І МОЛ0

РСОГОБМТЕЗОМУМУЗАТЕРСКРСОТЕСМОаЇ ОБМ5АРСМЕАВРАМС

ТМЕВ-суз 3, БЕО 10 МО:11

ВСАУСУМОрЕТТаАВСЕАСАУСЕАД,аЗаї МЕЄСОЮСКОМТУС

ТМЕВ-суз 4. БЕО ІЮ МОЛ

ЕСРОСТУЗОЕАМНМОРСІ РСОТМСЕОТЕВОЇ ВЕСТАУМАРАЕС

В одному варіанті здійснення спейсер включає ТМЕРБ-суз 1, 2 і З домени або їх фрагменти або похідні. В іншому варіанті здійснення спейсер включає ТМЕК-суз 1, 2, З і 4 домени або їх фрагменти або похідні.

В одному варіанті здійснення спейсер включає послідовність, ідентичну щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 9995 або 10095 ТМЕВ-суз 1 (ЗЕО ІЮ МО:9), послідовність, ідентичну щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 95 або 100 95 ТМЕВ-суз 2 (5ЕО ІО МО:10), або послідовність, ідентичну щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 95 або 100 95 ТМЕВ-суз З (ЗЕО ІО МО:11). Спейсер може, крім того, включати послідовність, ідентичну щонайменше на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 95 або 100 95 ТМЕВ-суз 4 (5ЕО 10 МО-12).

Замість того, щоб містити в собі повний ТМЕБК-су5 4 домен, спейсер може включати ТМЕК- сухє 4 домен з наступними вилученими з вказаного домену амінокислотами:

МНМОРСГРСТУМСЕОСТЕКОЇ КЕСТЕУМУ. В одному варіанті здійснення амінокислоти

МНМОРСГРСТУМСЕОТЕКОЇ КЕСТЕМУ замінені наступними амінокислотами АКА.

В одному варіанті здійснення у спейсері відсутня багата серином/гтреоніном ніжка ГМО. В іншому варіанті здійснення спейсер включає багату серином/греоніном ніжку ГМО.

Спейсер може включати або складатися з послідовність(ості) ЗЕО І МО: 1 або послідовність(ості), ідентичну(0ої) щонайменше на 85 95, 90 Фо, 95 9», 96 9», 97 95, 98 9о або 99 95

ЗЕО І МО-1.

Спейсер може включати або складатися з послідовність(ості) ЗЕО І МО:3 або послідовність(ості), ідентичну(0ої) щонайменше на 85 95, 90 9, 95 9», 96 9», 97 У, 98 9о або 99 95

ЗЕО І МОЗ.

Спейсер може включати або складатися з послідовність(ості) ЗЕО І МО:5 або послідовність(ості), ідентичну(0ої) щонайменше на 85 95, 90 9, 95 9», 96 9», 97 У, 98 9о або 99 95

ЗЕО ІЮ МО:5.

Зо Спейсер може включати або складатися з послідовність(ості) ЗЕО І МО:7 або послідовність(ості), ідентичну(ої) щонайменше на 85 95, 90 9, 95 9», 96 9», 97 У, 98 9о або 99 95

ЗЕО І МО:7.

Спейсер може надавати САК властивості за умови, щоб робилася можливою імуноселекція клітин, переважно Т-клітин, що експресують вказаний САК.

САК наданого винаходу (що включає спейсер, який згадується тут) переважно дає можливість Т-клітинам, що експресують САК, проліферуватися у присутності клітин, що експресують антиген, для якого розроблений САК.

САК наданого винаходу (що включає спейсер, який згадується тут) переважно дає можливість Т-клітинам, що експресують САК, опосередковувати терапевтично значущі протиракові ефекти проти раку, який САК призначено робити мішенню.

САК наданого винаходу (що включає спейсер, який згадується тут) переважно придатний для полегшення імуноселекції клітин, трансдукованих вказаним САК.

САК наданого винаходу, що включає спейсер на основі І МОРЕ, дозволяє уникнути активації небажаних і потенційно токсичних нецільових імунних реакцій і дозволяє САК-експресуючим Т- клітинам продовжувати існувати іп мімо, не будучи передчасно усунутими імунною системою хазяїна.

Як згадано нижче, наданий винахід також охоплює застосування варіантів, похідних, гомологів і фрагментів спейсерних елементів, описаних тут.

Похідні і фрагменти

Крім специфічних білків, пептидів і нуклеотидів, згаданих тут, наданий винахід також охоплює застосування їх похідних і фрагментів.

Термін "похідна", що використовується тут, відносно білків або поліпептидів наданого винаходу, включає будь-яке заміщення, зміну, модифікацію, заміну, делецію і/або додавання одного (або більше) амінокислотних залишків з або у послідовності за умови, що одержаний у результаті білок або поліпептид зберігає бажану функцію.

Як правило, амінокислотні заміни можуть бути складені, наприклад, з 1, 2 або від З до 10 або 20 замін за умови, що модифікована послідовність зберігає необхідну активність або здатність. Заміни амінокислот можуть включати використовування аналогів, що не бо зустрічаються у природі.

Білки або пептиди, що використовуються у наданому винаході, можуть також мати делеції, вставки або заміни амінокислотних залишків, які викликають зміни, що мовчать, і дають у результаті функціонально еквівалентний білок. Навмисні амінокислотні заміни можуть бути здійснені на основі подібності полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності іМабо амфіпатичної природи залишків, поки зберігається ендогенна функція. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту; позитивно заряджені амінокислоти включають лізин і аргінін; і амінокислоти з незарядженими полярними кінцевими групами, що мають подібні величини гідрофільності, включають аспарагін, глутамін, серин, треонін і тирозин.

Консервативні заміни можуть бути здійснені, наприклад, відповідно до наведеної нижче таблиці. Амінокислоти в тому ж самому блоці у другому стовпці і переважно у тому ж рядку у третьому стовпці можуть бути замінені одна на одну:

АРОМАТИЧНІ Ї 77111111

Похідна може бути гомологом. Термін "гомолог", що використовується тут, означає структуру, що має визначений ступінь гомології з амінокислотною послідовністю дикого типу і нуклеотидною послідовністю дикого типу. Термін "гомологія" може бути прирівняний до "ідентичності".

Гомологічна послідовність може включати амінокислотну послідовність, яка може бути щонайменше на 50 95, 55 9», 65 95, 75 У, 85 9Уо або 90 95 ідентична, переважно щонайменше на 95 95 або 97 95 або 99 95 ідентична до послідовності, що розглядається. Як правило, гомологи будуть включати такі ж активні центри і т.д., як і розглянута амінокислотна послідовність. Хоча гомологію можна також розглядати з точки зору подібності (тобто амінокислотні залишки, що мають подібні хімічні властивості/функції), у контексті наданого винаходу переважно виражати гомологію у термінах ідентичності послідовності.

Гомологічна послідовність може включати нуклеотидну послідовність, яка може бути щонайменше на 50 95, 55 9», 65 95, 75 У, 85 9Уо або 90 95 ідентична, переважно щонайменше на 95 95 або 97 95 або 9995 ідентична до послідовності, що розглядається. Хоча гомологію також можна

Зо розглядати з точки зору подібності, у контексті наданого винаходу переважно виражати гомологію у термінах ідентичності послідовності.

Порівняння гомології можуть проводитися на око або, найчастіше, за допомогою легкодоступних програм порівняння послідовностей. Ці комерційно доступні комп'ютерні програми можуть розрахувати відсоток гомології або ідентичності між двома або більше послідовностями.

Відсоток гомології може бути розрахований протягом прилеглих послідовностей, тобто одну послідовність суміщають з іншою послідовністю, і кожну амінокислоту в одній послідовності безпосередньо порівнюють із відповідною амінокислотою в іншій послідовності, один залишок за один раз. Це називається суміщенням, "що не містить розриви". Як правило, такі суміщення, що не містять розриви, виконують тільки протягом відносно короткого числа залишків.

Незважаючи на те, що це дуже простий метод, і такий, що узгоджується, він не в змозі взяти до уваги, що, наприклад, в ідентичній у всьому іншому парі послідовностей одна вставка або делеція у нуклеотидній послідовності може призвести до того, що наступні кодони будуть виведені з суміщення, що таким чином може потенційно призвести до значного зменшення відсотка гомології при виконанні загального суміщення. Отже, більшість методів порівняння послідовностей розроблені для одержання оптимальних суміщень, які беруть до уваги можливі вставки і делеції без невиправданого погіршення загальної оцінки гомології. Це досягається за рахунок вставки "розривів" при суміщенні послідовностей, щоб спробувати максимізувати локальну гомологію.

Однак ці більш складні методи призначають "штрафи за розриви" кожному розриву, який виникає при суміщенні, так що, для того ж самого числа ідентичних амінокислот, суміщення послідовностей з найменшою по можливості кількістю розривів, що відображає більш високий ступінь спорідненості між двома послідовностями, що порівнюють, одержить більш високу оцінку, ніж суміщення з множиною розривів. Як правило, використовуються "афінні штрафи за розриви", які стягують відносно високий штраф за існування розриву і менший штраф за кожний наступний залишок у розриві. Це є системою підрахування балів за розриви, що найбільш часто використовується. Високі штрафи за розриви будуть, звичайно, давати оптимізовані суміщення з меншою кількістю розривів. Більшість програм для суміщень дозволяє коректувати штрафи за розриви. Однак переважно використовувати значення за замовчуванням при використовуванні такого програмного забезпечення для порівняння послідовностей. Наприклад, при використовуванні пакета програм СО Ууізсопзіп ВезнНії штраф за розрив за замовчуванням для амінокислотних послідовностей становить -12 за розрив і -4 за кожне розширення.

З цієї причини для розрахунків максимального відсотка гомології насамперед потрібно одержання оптимального суміщення, беручи до уваги штрафи за розриви. Придатною комп'ютерною програмою для проведення такого суміщення є пакет програм СО Ууізсопвіп

Везнії (Опімегейу ої М/ізсопвзіп, ОБА; Юемегеєих 6ї а!. (1984) Мисівїс Асіах Вев. 12: 387). Приклади іншого програмного забезпечення, яке може виконувати порівняння послідовностей, включають, але без обмеження ними, пакет програм ВІ АТ (дивиться А!йзирбеї еї аї. (1999) там же главу 18),

ЕАБТА (Аївспи!Ї єї а). (1990) У. Мої. ВіоІї. 403-410) ії набір інструментів для порівняння

СЕМЕУ/ОВКЗ5. Як ВІ А5Т, так і ЕАЗТА доступні для пошуку в режимі оффлайн (поза Інтернетом) і онлайн (дивиться А!йзиреї єї аІ. (1999) там же, сторінки з 7-58 до 7-60). Однак для деяких застосувань переважно використовувати програму СО Ве. Ще один інструмент, що називається ВАЗТ 2 Зедиепсе5, також доступний для порівняння білкових і нуклеотидних послідовностей (дивиться РЕМ5 Місгобіо! І ей (1999) 174: 247-50; ЕЕМ5 Місгобіо! І ен (1999) 177: 187-8).

Хоча кінцевий відсоток гомології можна виміряти в термінах ідентичності, сам процес суміщення звичайно не грунтується на попарному порівнянні за принципом "все або нічого".

Замість цього, звичайно використовується матриця диференційованих оцінок подібності, яка присвоює оцінки кожному попарному порівнянню на основі хімічної подібності або еволюційної відстані. Прикладом такої матриці, що звичайно використовується, є матриця ВГОЗИОМб2 - матриця за замовчуванням для пакета програм ВГА5БТ. Програми СО УмМізсопбзіп звичайно використовують або загальні значення за замовчуванням або таблицю порівняння

Зо користувацьких символів, якщо надається (дивиться інструкцію для одержання більш докладної інформації). Для деяких застосувань переважно використовувати загальні значення за замовчуванням для пакета програм СО або, у випадку іншого програмного забезпечення, матрицю за замовчуванням, таку як В ОБИМб2.

Після того як програма зробила оптимальне суміщення, можна обчислити відсоток гомології, переважно відсоток ідентичності послідовностей. Програмне забезпечення, як правило, робить це як частину порівняння послідовностей і видає числовий результат.

Фрагменти звичайно належать до вибраної ділянки поліпептиду або полінуклеотиду, яка викликає інтерес функціонально. "Фрагмент", таким чином, належить до амінокислотної послідовності, яка являє собою частину повнорозмірного поліпептиду, або послідовності нуклеїнової кислоти, яка являє собою частину повнорозмірного полінуклеотиду. Оскільки фрагменти викликають інтерес функціонально, наприклад, зберігають бажану функціональність, вони, отже, виключають наприклад, одну амінокислоту або одну нуклеїнову кислоту.

Такі похідні і фрагменти можуть бути одержані, використовуючи стандартні методи рекомбінантної ДНК, такі як сайт-спрямований мутагенез. Якщо вставки повинні бути зроблені, синтетична ДНК, що кодує вставку разом з 5'ї 3 фланкуючими районами, що відповідають послідовності, що зустрічається у природі, з того або іншого боку від місця вставки, можуть бути створені. Фланкуючі райони будуть містити зручні сайти рестрикції, що відповідають сайтам у послідовності, що зустрічається у природі, так що послідовність може бути розрізана за допомогою відповідного ферменту(ів), і синтетична ДНК лігована у місце розрізу. Потім ДНК експресують відповідно до наданого винаходу для вироблення білка, що кодується. Ці методи є тільки ілюстрацією численних стандартних методів, відомих у даній галузі техніки для маніпулювання послідовностями ДНК, і інші відомі методи можуть бути також використані.

Полінуклеотиди

Полінуклеотиди наданого винаходу можуть включати ДНК або РНК. Вони можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими. Кваліфікованому фахівцеві буде зрозуміло, що численні різні полінуклеотиди можуть кодувати той самий поліпептид у результаті виродженості генетичного коду. Крім того, слід розуміти, що кваліфікований фахівець може, використовуючи звичайні методи, зробити заміни нуклеотидів, які не впливають на послідовність поліпептиду, 60 що кодується полінуклеотидами наданого винаходу, щоб відобразити частоту використовування кодонів будь-якого конкретного організму хазяїна, в якому поліпептиди наданого винаходу повинні бути експресовані.

Полінуклеотиди можуть бути модифіковані будь-яким способом, доступним у даній галузі техніки. Такі модифікації можуть бути виконані для того, щоб збільшити іп мімо активність або тривалість існування полінуклеотидів наданого винаходу.

Полінуклеотиди, такі як ДНК-полінуклеотиди, можуть бути одержані рекомбінантним способом, синтетично або будь-якими способами, доступними кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки. Вони також можуть бути клоновані за допомогою стандартних методів.

Більш довгі полінуклеотиди, як правило, одержують, використовуючи рекомбінантні способи, наприклад, використовуючи методи клонування з використовуванням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Вони будуть включати в себе одержання пари праймерів (наприклад, приблизно від 15 до 30 нуклеотидів), що фланкують послідовність-мішень, яку бажано клонувати, приведення праймерів у контакт із МРНК або кДНК, одержаної з клітини тварини або людини, виконання полімеразної ланцюгової реакції в умовах, які викликають ампліфікацію бажаного району, виділення ампліфікованого фрагмента (наприклад, шляхом очищення реакційної суміші з використовуванням агарозного гелю) і виділення ампліфікованої ДНК. Можуть бути розроблені праймери, які містять придатні сайти впізнавання ферментами рестрикції, так що ампліфікована

ДНК може бути клонована у придатний вектор.

Оптимізація частоти використовування кодонів

Полінуклеотиди, що використовуються у наданому винаході, можуть бути оптимізовані відносно частоти використовування кодонів. Оптимізація частоти використовування кодонів раніше була описана у УМО 1999/41397 і МО 2001/79518. Різні клітини відрізняються використовуванням в них окремих кодонів. Ця перевага кодонів відповідає зміщенню відносної чисельності окремих тРНК у цьому типі клітин. Змінюючи кодони у послідовності таким чином, щоб підігнати їх до відповідності з відносним вмістом відповідних тРНК, можна збільшити експресію. До того ж, можна зменшити експресію шляхом навмисного вибору кодонів, для яких відповідні ТРНК, як відомо, є рідкісними у конкретному типі клітин. Таким чином, доступний додатковий ступінь трансляційного контролю.

Вектори

Зо Вектор являє собою інструмент, який робить можливим або полегшує перенесення структури з одного середовища у інше. Відповідно до наданого винаходу, і як приклад, деякі вектори, що використовуються у методах рекомбінантних нуклеїнових кислот, роблять можливим перенесення таких структур, як сегмент нуклеїнової кислоти (наприклад, сегмент гетерологічної ДНК, такий як сегмент гетерологічної кДНК), у клітини-мішені. Вектори можуть бути невірусними або вірусними. Приклади векторів, що використовуються у методах рекомбінантних нуклеїнових кислот, включають, але без обмеження ними, плазміди, молекули

МРНК (наприклад, іп міго транскрибовані мРНК), хромосоми, штучні хромосоми і віруси. Вектор може також бути, наприклад, "голою" нуклесновою кислотою (наприклад, ДНК). У своїй найпростішій формі, сам вектор може бути нуклеотидом, що викликає інтерес.

Вектори, що використовуються у наданому винаході, можуть являти собою, наприклад, плазміди, мРНК або вірусні вектори і можуть включати промотор для експресії полінуклеотиду і необов'язково регулятор промотору.

Вектори, що включають полінуклеотиди наданого винаходу, можуть бути введені у клітини з використовуванням різних методів, відомих у даній галузі техніки, таких як трансформація і трансдукція. У даній галузі техніки відомо кілька методів, наприклад, інфікування рекомбінантними вірусними векторами, такими як ретровірусні, лентивірусні, аденовірусні, аденоасоційовані вірусні, бакуловірусні вектори і вектори на основі вірусу простого герпесу; пряма ін'єкція нуклеїнових кислот і балістична трансформація.

Невірусні системи доставки включають, але без обмеження ними, методи трансфекції ДНК.

Тут, трансфекція включає процес з використовуванням невірусного вектора для доставки гена у клітину-мішень.

Типові способи трансфекції включають електропорацію, балістичну трансфекцію ДНК, трансфекцію з використовуванням ліпідів, трансфекцію з використовуванням упакованої ДНК, ліпосоми, імуноліпосоми, ліпофектин, трансфекцію з використовуванням катіонних агентів, катіонні поверхневі амфіфіли (СЕА) (Маї Віоїеснпо! (1996) 14: 556) і їх комбінації.

Ретровірусні вектори

В одному варіанті здійснення вектор, що використовується у наданому винаході, являє собою вектор на основі ретровірусу, який був сконструйований з використовуванням методів генної інженерії таким чином, що він не може реплікуватися і давати потомство інфекційних бо вірусних частинок, як тільки вірус увійшов у клітину-мішень. Існує множина ретровірусів, які широко використовуються для доставки генів як в умовах культивування тканин, так і в живі організми. Приклади включають, і не обмежуються ними, вірус лейкозу мишей (МІМ), вірус імунодефіциту людини (ВІЛ-1), вірус інфекційної анемії коней (ЕІАМ), вірус пухлини молочної залози мишей (ММТУМ), віруси саркоми Рауса (К5М), вірус саркоми Фудзинамі (Ри5М), вірус лейкозу Молоні мишей (Мо-МІМ), вірус остеосаркоми ЕВК мишей (ЕВК МеВ), вірус саркоми

Молоні мишей (Мо-МСВ), вірус лейкозу Абельсона мишей (А- МІМ), вірус-29 мієлоцитоматозу птахів (МС29) і вірус еритробластозу птахів (АЕМ) і всі інші віруси сімейства Кеїгомігідіає, включаючи лентивіруси. Докладний список ретровірусів можна знайти у Сойіп єї аї., 1997, "тейгомігизевз", бод ріпа Нагроишг І арогаїюгу Ргезв Едев: УМ Сойіп, 5М Ниднез, НЕ Маптив рр 758-763.

Основною структурою геному ретровірусів є 5 І1ТА ії 3 І ТА, між або всередині яких розташовані сигнальна послідовність упаковки, яка робить можливим упаковку геному, сайт зв'язування праймера, сайти інтеграція, які роблять можливим інтеграцію у геном клітини- хазяїна, і гени дад, рої і епу, що кодують компоненти упаковки - вони являють собою поліпептиди, необхідні для складання вірусних частинок. Більш складні ретровіруси мають додаткові ознаки, такі як послідовності гем і АВЕ у ВІЛ, які роблять можливим ефективний експорт РНК-транскриптів з інтегрованого провірусу з ядра у цитоплазму інфікованої клітини- мішені.

У провірусі, ці гени фланковані на обох кінцях ділянками, що називаються довгими кінцевими повторами (ІТК). ГТК відповідальні за інтеграцію провірусу і транскрипцію. ГТК також служать як енхансерні-промоторні послідовності і можуть контролювати експресію вірусних генів. Інкапсулювання ретровірусних РНК відбувається завдяки послідовності рві, розташованої на 5'-кінці вірусного геному.

Самі ТЕ являють собою однакові послідовності, які можна розділити на три елементи, які називаються ШЗ, К і ШБ5. ОЗ походить від послідовності, унікальної для 3' кінця РНК. К походить від послідовності, що повторюється на обох кінцях РНК, і 05 походить від послідовності, унікальної для 5' кінця РНК. Розміри трьох елементів можуть значно варіювати серед різних ретровірусів.

У геномі дефектного ретровірусного вектора дад, рої і епл можуть бути відсутніми або не

Зо бути функціональними. ЮК-райони на обох кінцях РНК являють собою послідовності, що повторюються. ОБ і 0З являють собою унікальні послідовності на 5' і 3'-кінцях РНК-геному, відповідно.

Більш переважно, коли вірусний вектор є таргетуючим вектором, тобто він має тканинний тропізм, який змінений у порівнянні з вірусом, що зустрічається у природі, так що вектор є націленим на конкретні клітини. Це може бути досягнено шляхом зміни білка Епм ретровірусу.

Переважно білок оболонки являє собою нетоксичну оболонку або оболонку, яка може продукуватися у нетоксичних кількостях у первинних клітинах-мішенях, таку як, наприклад, амфотропна оболонка ММІ М або модифікована амфотропна оболонка.

Переважно, коли оболонкою є оболонка, яка робить можливим трансдукцію клітин людини.

Приклади придатних генів епу включають, але без обмеження ними, У5М-с, амфотропний епу

МІУ, такий як епм 4070А, епм вірусу лейкозу кішок ВО114 або гемаглютинін (НА) з вірусу грипу.

Білок Епу може бути таким, який здатний зв'язуватися з рецептором на обмеженій кількості типів клітин людини, і може бути сконструйованим білком оболонки, що містить таргетуючі складові. Кодуючі послідовності епм і дад-рої! транскрибуються з промотору і необов'язково енхансера, що виявляється активним у вибраній лінії клітин, що пакує, і одиниця транскрипції термінується сигналом поліаденілювання. Наприклад, якщо клітина, що пакує, являє собою клітину людини, придатною комбінацією промотор-енхансер є така з основного негайно- раннього гену цитомегаловірусу людини (ПСММУ-МІЕ), і може бути використаний сигнал поліаденілювання з вірусу 540. Інші придатні промотори і сигнали поліаденілювання відомі у даній галузі техніки.

МІ М

Переважно, коли ретровірусний вектор, що використовується у наданому винаході, являє собою вектор у вигляді вірусу лейкозу мишей (ММ). Ретровірусні вектори, одержані виходячи з амфотропного вірусу лейкозу Молоні мишей (МІМ-А), звичайно використовуються у клінічних протоколах у всьому світі. Ці віруси використовують рецептори-транспортери фосфату на клітинній поверхні для входження, а потім надовго інтегруються у хромосоми клітин, що проліферуються. Ці гени потім зберігаються протягом часу існування клітини. Активність генів у конструкціях на основі МІ М легко контролюється і може бути ефективною протягом тривалого часу. Клінічні випробування, проведені з цими системами на основі МІ М, показали, що вони 60 добре переносяться без яких-небудь несприятливих побічних ефектів.

Приклад вектора МІ М для використовування у наданому винаході являє собою вектор, що походить від БЕСММ-3, який несе як ген "самогубства" НЗМ-їК, так і маркерний ген ДІ МОЕК (МеглеІені 98, Нитап Сепе ТПегару, 9:2243). Початковим вектором, використаним для одержання ЗЕСММ-3, є ХМ (МіПег еї аїЇ. Ітргомей геїгомігаиІ месіог5 їог депе ігапеіег апа ехргезвіоп. Віотеснпідневз 7:980-990, 1989) (номер доступу у сеперапк 28248). Вектор І ХОМ був модифікований шляхом вставки гена Н5М-їК в унікальний сайт Нраї! (розщеплення з утворенням "тупих кінців"), вилучення гена пео шляхом розщеплення Ніпайі їі Має! і вставки кКДНК, що кодує

АІ МОВ, у цей сайт.

Лентивірусний вектор

В одному варіанті здійснення вектор наданого винаходу може являти собою лентивірусний вектор. Лентивірусні вектори є частиною великої групи ретровірусних векторів. Докладний список лентивірусів можна знайти у Сойіп єї а! ("Веїгомігизез" 1997 Соїй З5ргіпд Нагроишг

І арогайїогу Ргез5 Ед»: УМ Сойіп, «М Ниднез, НЕ Маптив рр 758-763). Коротенько, лентивіруси можна розділити на групи лентивірусів приматів і не приматів. Приклади лентивірусів приматів включають, але без обмеження ними: вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), збудник синдрому набутого імундефіциту людини (СНІД) і мавпячий вірус імунодефіциту (5ІМ). Група лентивірусів не приматів включає вірус вісна-маєді (ММУ) прототипу "повільний вірус", а також споріднений вірус артриту- енцефаліту кіз (САЕМ), вірус інфекційної анемії коней (ЕІАМ) і недавно описаний вірус імунодефіциту котячих (РЕМ), і вірус імунодефіциту великої рогатої худоби (ВІМ).

Відмінність між сімейством лентивірусів і іншими типами ретровірусів полягає в тому, що лентивіруси володіють здатністю інфікувати клітини, що як діляться, так і не діляться. На противагу цьому, інші ретровіруси - такі як МІ М - не здатні інфікувати клітини, що не діляться або повільно діляться, такі як ті, що складають, наприклад, м'язову тканину, тканину головного мозку, легень і печінки. Оскільки лентивіруси здатні до трансдукції остаточно диференційованих/первинних клітин, використовування стратегії скринінгу лентивірусів дозволяє вибрати бібліотеку у первинній, цільовій клітині-хазяїні, що не ділиться або повільно ділиться.

Аденовірусні вектори

В іншому варіанті здійснення вектором наданого винаходу може бути аденовірусний вектор.

Зо Аденовірус являє собою вірус, що містить дволанцюгову, лінійну ДНК, який не проходить через стадію РНК-посередника. Існує більш 50 різних серотипів аденовірусу людини, які діляться на 6 підгруп на основі гомології генетичних послідовностей. Природньою мішенню аденовірусу є епітелій дихальних шляхів і шлунково-кишкового тракту, як правило, породжуючи лише легкі симптоми. Серотипи 2 і 5 (з 95 95 гомологією послідовності) частіше за все використовуються у аденовірусних векторних системах і, як правило, пов'язані з інфекціями верхніх дихальних шляхів у молодих.

Аденовіруси являють собою правильні ікосаєдри без оболонки.

Типовим аденовірусом є вірус із замкненою у капсид ДНК діаметром 140 нм. Ікосаедральна симетрія вірусу складається з 152 капсомерів: 240 гексонів і 12 пентонів. Ядро частинки містить лінійну дуплексну ДНК розміром 36 т.п.о., яка ковалентно зв'язана на 5'-кінцях з термінальним білком (ТР), який діє як праймер для реплікації ДНК. ДНК містить інвертовані кінцеві повтори (ІТК), і їхня довжина міняється залежно від серотипу.

Аденовірус являє собою вірус без оболонки, що містить дволанцюгову ДНК, який здатний до іп мімо і іп міго трансдукції широкого ряду типів клітин людини і нелюдського походження. Ці клітини включають епітеліальні клітини дихальних шляхів, гепатоцити, м'язові клітини, кардіоміоцити, синовіоцити, первинні епітеліальні клітини молочних залоз і постмітотично остаточно диференційовані клітини, такі як нейрони.

Аденовірусні вектори також здатні до трансдукції клітин, що не діляться. Це дуже важливо для таких захворювань, як муковісцидоз, у випадку якого уражені клітини у епітелії легені мають низьку швидкість кругообігу. Насправді, кілька випробувань ведуться з використовуванням аденовірус-опосередкованого перенесення білка транспортера муковісцидозу (СЕТЕ) у легені дорослих пацієнтів, хворих муковісцидозом.

Аденовіруси були використані як вектори для генної терапії і для експресії гетерологічних генів. Великий (36 т.п.о.) геном може вмістити аж до 8 т.п.о. вставки чужорідної ДНК їі здатний ефективно реплікуватися у лінії клітин, що доповнюють, з продукуванням дуже високих титрів аж до 1072. Таким чином, аденовірус є однієї з кращих систем для дослідження експресії генів у первинних клітинах, що не розмножуються.

Для експресії вірусних або чужорідних генів з геному аденовірусу не потрібна клітина, що розможується. Аденовірусні вектори входять у клітини за допомогою опосередкованого бо рецептором ендоцитозу. Виявившись всередині клітини, аденовірусний вектор рідко інтегрується у хромосому хазяїна. Замість цього, він функціонує епісомально (незалежно від геному хазяїна) у вигляді лінійного геному в ядрі хазяїна. Отже, застосування рекомбінантного аденовірусу усуває проблеми, пов'язані з випадковою інтеграцією у геном хазяїна.

Поксвірусні вектори

Поксвірусні вектори можуть бути використані відповідно до наданого винаходу, тому що великі фрагменти ДНК легко клонувати у їх геном, і були описані рекомбінантні атенуйовані варіанти вірусу вісповакцини (Меуєег еї а!І. 1991; тій апа Моз5, 1983).

Приклади поксвірусних векторів включають, але без обмеження ними, лепоріпоксивірус:

Орогп еї аї, 1986, (вірус фіброма Шоупа); капріпоксвірус: Сегепоп еї аї., 1989, (вірус віспи овець- 1 з Кенії); ортопоксвірус: УМеїг еї аї., 1983, (вірус коров'ячої віспи); Езрозіо еї аї., 1984, (вірус віспи мавп їі натуральної віспи); Нгибу еї а!., 1983, (вірус коров'ячої віспи); Кіїраїгіск еї аї., 1985, (вірус пухлини мавп Яба); авіпоксвірус: Віпп5 еї аї., (1988) (вірус пташиної віспи); Воуїе еї аї., 1987, (вірус віспи курей); Зсппіїлієїп еї аї, 1988, (вірус віспи курей, вірус віспи перепелів); ентомопоксвірус (Гуїмуп еї аї., 1992).

Поксвірусні вектори широко використовуються як вектори для експресії генів, що цікавлять, у еукаріотичних клітинах. Легкість їх клонування і розмноження у множині клітин-хазяїв призвела, зокрема, до широкого використовування поксвірусних векторів для експресії стороннього білка і як засоби доставки антигенів вакцини.

Вектори на основі вірусу коров'ячої віспи

Вектор наданого винаходу може являти собою вектор на основі вірусу коров'ячої віспи, такий як ММА або МУМАС. Найбільш переважним є штам модифікованого вірусу коров'ячої віспи

Анкара (ММА) або штам, що походить від нього. Альтернативні варіанти векторів на основі вірусу коров'ячої віспи включають вектори на основі авіпоксвірусів, такі як вірус пташиної віспи або віспи канарок, відомий як АГЇМАС, і похідні від нього штами, які можуть інфікувати і експресувати рекомбінантні білки у клітинах людини, але не здатні реплікуватися.

Клітини

Наданим винаходом також забезпечуються сконструйовані за допомогою генної інженерії клітини, які включають і стабільно експресують САК наданого винаходу.

Антигенспецифічні таргетуючі домени можуть бути здатні до специфічного зв'язування,

Зо МНеС-необмеженим чином, з антигеном, який звичайно не зв'язується з Т-клітинним рецептором таким чином. В одному варіанті здійснення антигенспецифічні таргетуючі райони включають специфічні відносно мішені антитіла або їх функціональні еквіваленти або їх фрагменти або похідні. Антигенспецифічне антитіло може являти собою Рар-фрагмент антитіла або одноланцюговий варіабельний фрагмент (5сЕм) антитіла.

Сконструйовані за допомогою генної інженерії клітини, які можуть включати і експресувати

САК наданого винаходу, включають, але без обмеження ними, Т-клітини, ненавчені Т-клітини, стовбурові Т-клітини пам'яті, центральні Т-клітини пам'яті, ефекторні Т-клітини пам'яті, клітини- природні кілери, гомопоетичні стовбурові клітини і/або клітини, здатні давати початок терапевтично відповідному потомству. В одному варіанті здійснення сконструйовані за допомогою генної інженерії клітини є аутологічними клітинами. Як приклад, окремі Т-клітини наданого винаходу можуть бути СО4-4/С08-, С04-/С08.-, С04-/С208- або СО4ч4/СОв'к. Т-клітини можуть являти собою змішану популяцію СО4-/С08- і С04-/С08-- клітин або популяцію одного клону.

Генетично модифіковані клітини можуть бути одержані шляхом стабільної трансфекції клітин з використовуванням ДНК, що кодує САК наданого винаходу.

Різні методи дають стабільні трансфектанти, які експресують САК наданого винаходу. В одному варіанті здійснення спосіб стабільної трансфекції і перенацілювання клітин здійснюють шляхом електропорації з використовуванням голої ДНК. При використовуванні голої ДНК, час, необхідний для створення перенацілених клітин, може бути значно зменшений. Додаткові методи генної інженерії клітин з використовуванням голої ДНК, що кодує САК наданого винаходу, включають, але без обмеження, хімічні методи трансформації (наприклад, з використовуванням фосфату кальцію, дендримерів, ліпосом і/або катіонних полімерів), нехімічні методи трансформації (наприклад, електропорацію, оптичну трансформацію, електроперенесення генів і/або гідродинамічну доставку) і/або методи на основі частинок (наприклад, імпалефекція, використовуючи генну гармату, і/або магнетофекцію). Трансфековані клітини, що демонструють присутність одного інтегрованого не перебудованого вектора і експресію САКЕ, можуть бути розмножені ех мімо. В одному варіанті здійснення клітини, вибрані для ех мімо розмноження, є СОв8-- і демонструють здатність специфічно розпізнавати і лізувати антигенспецифічні клітини-мішені. бо Вірусні методи трансдукції також можуть бути використані для створення перенацілених клітин, які експресують САК наданого винаходу.

Стимуляція Т-клітин за допомогою антигену при відповідних умовах призводить до проліферації (розмноженню) клітин і/або продукуванню 1-2. Клітини, що включають САК наданого винаходу, будуть збільшуватися у кількості у відповідь на зв'язування одного або більше антигенів з антигенспецифічними таргетуючими районами САК. Наданим винаходом також забезпечується спосіб одержання і збільшення кількості клітин, що експресують САК.

Спосіб може включати трансфекцію або трансдукцію клітин вектором, що експресуює САК, після стимуляції клітин: 1) поліклональними стимулами, такими як безклітинні каркаси, переважно сфери з оптимальним розміром, що містять принаймні поліпептид, що активує, переважно антитіло, специфічне для СОЗ, і поліпептид, що активує, переважно антитіло, специфічне для СО28; 2) пухлинними клітинами, що експресують антиген-мішень; 3) природними штучними антигенпрезентуючими клітинами, і культивування їх разом з цитокінами, що включають ЇЇ -2, 1-7, 1-15, 11-21 окремо або у комбінації.

Терапевтичні методи і фармацевтичні композиції

Тут забезпечуються способи лікування захворювання, пов'язаного з антигеном, що є мішенню САК наданого винаходу, у суб'єкта, що потребує цього. Спосіб включає введення ефективної кількості САК, полінуклеотиду або вектора, що кодує САК, або клітини, що експресує вказаний САК, для здійснення лікування захворювання, пов'язаного з цим антигеном, у суб'єкта.

Також забезпечується фармацевтична композиція, що включає САК наданого винаходу.

САК наданого винаходу у композиції може бути будь-яким одним або більше з полінуклеотиду, що кодує САКЕ, вектора, що кодує САК, білка, що включає САК, або генетично модифікованих клітин, що включають САК.

Фармацевтична композиція являє собою композицію, яка включає або складається з терапевтично ефективнуцсої) кількість(ості) фармацевтично активного агента. Вона переважно включає фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач (у тому числі їх комбінації). Прийнятні носії або розріджувачі для терапевтичного застосування добре відомі у фармацевтичній галузі і описані, наприклад, у Кетіпдіоп'є РПпагтасецшііса! 5сієпсез5, Маск

Рибіїєпіпд Со. (А. К. Сеппаго ейй. 1985). Вибір фармацевтичного носія, наповнювача або

Зо розріджувача може бути здійснений з урахуванням шляху введення, що передбачається, і стандартної фармацевтичної практики. Фармацевтичні композиції можуть включати як - або на додаток до - носій(ія), наповнювач або розріджувач будь-яке придатне в'яжуча речовинаци), мастильний матеріал(и), суспендуючий агент(и) обволікаючий засіб(и) або солюбілізатор(и).

Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають, наприклад, воду, сольові розчини, спирт, силікон, віски, вазелін, рослинні олії, поліетиленгліколі, пропіленгліколь, ліпосоми, цукри, желатин, лактозу, амілозу, стеарат магнію, тальк, поверхнево-активні речовини, кремнієву кислоту, в'язкий парафін, парфумерне масло, моногліцериди і дигліцериди жирних кислот, складні ефіри жирних кислот, розчинені у петролейному ефірі, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон і тому подібне.

Приклади

Приклад 1 - Методи

Створення конструкцій СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі І Ма ЕВ

Послідовності спайсерів на основі ЇМОЕК походили з екстраклітинної частини рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (МОБ), за винятком сигнального пептиду (РОВ1І38, ТМК16 НИОМАМ). Довга конструкція дикого типу (МУМІ) містить як чотири багаті цистеїном домени ТМЕБЕ, так і багату серином/гтреоніном ніжку. Коротка конструкція дикого типу (ММУУ5) містить тільки чотири багаті цистетном домени ТМЕК. Мутована довга конструкція (ММ) містить чотири багаті цистеїном домени ТМЕК, багату серином/треоніном ніжку і включає специфічну модифікацію у четвертому домені щоб уникнути зв'язування з МОБ (мап еї аї, У Віо!

Спет, 1991, дУип 25:266(18):12099-104). Мутована коротка конструкція (ММ5) містить тільки чотири багаті цистеїном домени ТМЕК, включаючи специфічну модифікацію у четвертому домені. Спейсери були синтезовані СЕМЕАКТ, фланковані специфічними сайтами рестрикції (Ватні і РЯМІ), щоб зробити можливим клонування у оригінальну СО44муб-специфічну конструкцію САК другого покоління (фіг. 9, ЗЕО ІЮ МО:15), що належить авторам наданого винаходу, замість спейсера СН2СНЗ ІдС1. Всі конструкції були оптимізовані відносно частоти використовування кодонів для експресії у організмі людини. Всі конструкти були експресовані у основах 5ЕО-КМ (ретровірусному векторі на основі МОМІМ, що широко використовується, який спирається на сплайсинг для експресії генів (Кімієге еї аі, РМАБ, 1995, ди! 18:92(15):6733-7)).

Спейсер МОРЕ дикого типу довгий (МУМ): Послідовність білка (ЗЕО ІЮ МО:1) (510)

МКЕАСЕТОБУТНЕСЕССКАСНІСЕУАОРСООСАМОТУСЕРВСЬСЕУТЕВОУУВАТЕВСЕРСТЕС

ЧУСЬОБМЧЗАРСУКАВОАУСВСАЖСХ ОПЕР ТСВСКАСВУСКАСВССУКСОПВКОМЕУСЕКСВІНХТ

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО МО 2):

АВС ВОАС ТО ТАС ен АТ ТО АЕН БО АВ ев Вон і МВА ТЕ о ВАТА АК ТЕО НКТ ОС УКОСІВ

Со ТОН ал сн ЕК А ТАС о і Ох

СтТОСАСАСОСА ТОВ УВО о Во А і іх Ех НАТО НІХ

АСТАССАсСвАССАСАСААСС ОВ ВАРТО ЧАС ТУКА р и и із кі КОД КЕ АЛАНА АТАК АВ ВН САНУ пасСтаАрзсссАастосасл сою ат ВВ А осла АоАЛО АС АСТ ОАЕ ТОНАХ АВСАСАІ ді нс ВН В С похил ВК Аді нн АСОМ А ее ВА АТО АСААТО

Спейсер І МОРЕ дикого типу короткий (МУ): Послідовність білка (ЗЕО ІО МО:3): кЕдДСЕТОвЕ Но СКАСМІвоУвдво о Амос ВУТЕВПУУЗАТЕРСКРСТЕС утома ОСУВААШСНОВА СУ ОКЕАНУ Астон Х

ХОПЕАМНУЮРЕСЛЕСТУСВОСЖЕКЦЕЬКАСТЕНАБАВСЬЕ.

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО МО 4):

ЕЕ ТЕ НК НЕ ВЕ и КЕ НК НВ Ж А КЕ ее В й ВИ ЕТ АК

СЕТАМ АОС ОСАСНОАОВО К Оов

СТОК АТО АТ Кіт АК кН НЕ

АСТАССАССАСТА АСАД ССС А ТОК САСсНя г ААТ Д АННЕ їхні ок і НАВС Ех ія В ДОВ ВНТ сви АСАД АСЕ і К АКТАТВВ полин АС АТАКА и НІВ,

Спейсер І МОГ мутований довгий (ММІ): Послідовність білка (ЗЕО ІЮ МО:5): кЕдАСЕТОСБЕТНОСВБОСКВвСМОсваечАдЕОАМНОСТУСЕРОБОНТЕВИМУВАТЕРСОКРЕТЕС чУусьемеарСсУКАПВАЧУСНОСАЖОЯ МОПЕТЕЗНСКАСНІСКАЄСВЗО УКВ ОПКОЦЮМТУСЕЕСРЕВяУ

ЕВЕЗАКААПАКСЕЕІРОНюЮРТТКОТЕРЕССССТАБОТОКЕКАРРЕСІАВТУАУУ ДЮ УК

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО МО:6):

АадодоОшОсстТОССоСАСТС те тт вос вто ст ВТО оно А АСВ Но ШОН Р АТ А АСК ТОН НАТО КОСА

ОСТ ЕСА ово о вс тов ТТ КО

СТОЛА ОА ТОСОЛ ОО То а ОХ АТО ГА

АСТАССАССАСАСАСА ВССУ ВС Ст А т Ти ча СО АС г КОС АСТ РУТА ОА АТАСКЧН НТ А АТ СОС АСТТТАССТТАСАУ пиві сс и вс соаА СВ шпат вуса АСААТ.

Спейсер ГМО мутований короткий (ММ5):

Послідовність білка (БЕО 1О МО:7):

ЕБЕАСРРІБІТНЕВСВССКАСМІСВСУАСРОСАМОТУСЕВСЬОВУТЕВОИУУВАТЕРСКРСТЕС

Усіма рОСУВБАНИАУСВОТЯ я Ве ОовАСВ МКАС У иКОМиСвА СХ

Нуклеотидна послідовність (ЗЕО ІО МО:8):

АВААСсССТ КА СС ЕІ вСА Свв асасісс това САС

Тіло Аванс ВМ В Вінн АТО г Гн ШВУ ТК Тих

ОСОСТОСАССТЕСАСССАССТО ТУР ОВССАСОСБАССССТОСААСО СТІВА СТО ТО ЧЧСИ

СтТОСАСАССАТОА НК СУТО Ківі КН іх Тіз ГАТТ АС

АСЕАССАСВСАС ОЛОВО АСОМ ОК я Кок Я ог Я осі он с с (ЛК РСАСТТСТОСАССАСВАССАСААСАСОССТО ТВО сдосТтОоСОСссасосАССТА САС

НК се В ВС ЕВ с В ЕЕ Ковані

Умовні позначення:

З підкресленням: багатий цистеїном домен с номером 1 ТМЕК. Жирний шрифт: багатий цистеїном домен с номером 2 ТМЕК.

Жирний шрифт з підкресленням: багатий цистеїном домен с номером З ТМЕК.

Курсив: багатий цистеїном домен с номером 4 ТМЕМК. Курсив з підкресленням: багата серином/греоніном ніжка.

Трансдукція і умови культивування

Т-клітини активували з використовуванням СОЗ/СО 28-сферклітинного розміру (СіпЕХМімоО,

Іпмійгодеп) плюс 1/-7//-15 (5 нг/мл, Рергоїест) і НМ-трансдукували шляхом двох циклів центрифугованої інокуляції на день 2 і З після стимуляції. У день 6, сфери вилучали, і Т-клітини культивували у середовищі ВРМІ 1640 (Сірсо-ВАЇ), 10 95 ЕВ5 (Віомупінакеї!) у присутності 1І--7 і

І/-15. Поверхнева експресія СО44у6б-специфічних конструкцій САВ зі спейсером СН2СНЗ (СНУ

Її СНМ) була виявлена за допомогою мАт, специфічних для спейсера СН2СНЗ Ідат (дЧаскзоп

І арогайогіев), у той час як поверхневу експресію СО44уб-специфічних конструкцій СА зі спейсерами на основі ІМС (МУ, ММУ5, ММІ ї НМС) аналізували з використовуванням

Зо І МаЕВ-специфічних мАт від ВО Віозсієпсе (клон: С40-14579) або від Мійепуї (клон: МЕ20О.4).

Між днем 9 і днем 15 з моменту активації, експресуючі СО44ум6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ

Ід091 Т-клітини були ЕБАС5- відсортовані, використовуючи поліклональні, специфічні для

СН2СНЗ ІДдО1 мАт, у той час як експресуючі СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМО Т-

клітини забарвлювали РЕ- кон'югованим, І МОЕК-специфічним мАт С40-14579 і сортували за допомогою колонок, використовуючи анти-РЕ парамагнітні сфери (Міпйепуї). Після сортування збільшення кількості Т-клітин наводили як кратне збільшення: число Т-клітин на день х/число Т- клітин після сортування.

Іп міго аналізи для аналізу специфічного розпізнавання

В аналізах співкультивування, САК-відсортовані Т-клітини культивували з клітинами- мішенями при різних співвідношеннях Е:Т. Через 4 дні клітини, що вижили, підраховували і аналізували за допомогою ЕАС5. Т-клітини, трансдуковані нерелевантним САК (СО19), завжди використовувалися як контроль. Індекс елімінації розраховували у такий спосіб: 1-(кількість залишкових клітин- мішеней у присутності СО44умб.САК287 и Т-клітин)//число залишкових клітин- мішеней у присутності СТК.САК287- Т-клітин). В аналізах розведення СЕБЕ, у САК- відсортовані Т-клітини вводили СЕБЕ, і їх стимулювали з використовуванням опромінених (10000 рад) пухлинних клітин у співвідношенні Е:Т-1:5 або біологічно активних концентрацій

МОР. Через 6 днів, проліферацію Т-клітин вимірювали за допомогою ЕАС5, аналізуючи відсоток клітин, які розбавили барвник СЕБЕ.

Моделі протипухлинної ефективності з використовуванням ксенотрансплантату

Експериментальні протоколи були схвалені Комітетом з догляду за тваринами і їх використовуванням (ІАСИОС). Для моделі мінімальної залишкової хвороби, мишам МО (даскхоп) внутрішньовенно вводили шляхом інфузії 1,5х105 лейкозних клітин Тпрі/миша. Через три дні мишей піддавали лікуванню шляхом внутрішньовенного введення 5х10924 відсортованих, експресуючих СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі ГМО Т-клітин, експресуючих СО44мб-

САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітин або Т- клітин, що несуть нерелевантний САК (СО19).

Приживлення Т-клітин контролювали щотижня за допомогою кровопускання і аналізу ГАС5.

Через 7 тижнів мишей умертвляли, і їхню печінку аналізували за допомогою гістопатології і

ЕАС5 на наявність клітин ТНР-1. Для моделі стійкого захворювання, мишам МО вводили внутрішньовенно 2х106 клітин мієломи ММ'І1.5/миша. Через п'ять тижнів після цього мишей піддавали лікуванню шляхом внутрішньовенного введення 5х10924 відсортованих, експресуючих

СОр44у6-САНК.287 зі спейсерами на основі МОРЕ Т-клітин, експресуючих СО44у6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітин або Т-клітин, що несуть нерелевантний САК (СО19). Приживлення

Зо Т-клітин і прогресування мієломи контролювали щотижня за допомогою кровопускання і аналізу

ЕАС5 (клітини мієломи будуть відрізняти від Т-клітин за відмінним СО45/СО03 людини фенотипу). Коли циркулюючі клітини ММ1.5 перевищували 30 клітин/мкл, і/або миші проявляли явні ознаки пов'язаного з пухлиною страждання (параліч або »10 95 втрати ваги), мишей піддавали евтаназії.

Протокова цитометрія

Для аналізу ГАС5 були використані кон'юговані з РІТС, РЕ, РегсР, РЕ-Су7, АРС, АРС-Су?7 і

Расіїіс Вісе антитіла, спрямовані проти людського СЮО44уб6, СО4 (е-Віозсіепсє), СО123, СО19, ср14, 203, 08, СО45КА, СО621, СХОК4, СО127, 2033, СО38, С045, | МОРЕ, мишиного СО45,

ТААр (ВО Віозсіеєпсе5) і СН2СНЗ ІдС1 (даскзоп Іарогаїогіе5). Клітини (2105) інкубували з антитілами протягом 15 хвилин при 4"С і промивали РВ5 з 1 96 ЕВ5. Зразки пропускали через протоковий цитометр ЕАС5 Сапіо ІІ (ВО Віозсіепсев), і дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення РіІом/ До (Тгеє 5їаг Іпс). Відносна інтенсивність флуоресценції (ЕЕ) була розрахована у такий спосіб; середня інтенсивність флуоресценції зразка/середню інтенсивність флуоресценції відповідного ізотипу як контроль.

Приклад 2 - Створення конструкцій СО44м6-САК.287 зі спейсерами на основі ГМО.

Недавно автори наданого винаходу сконструювали СО44мб- специфічний САК на основі ланцюга СОЗС у комбінації з ендокостимулювальним доменом СО28 (Сабзибссі є аї, Віоса 2013,

Мом 147122(20):3461-72). У екстраклітинний спейсерний район цього САК, спейсер СН2СНЗ

І9С1 був вставлений для кращого таргетингу антигену СО44уУ6б і для забезпечення можливості відбирання і іп мімо відстеження трансдукованих Т-клітин. Однак серйозним недоліком САКЕ зі спейсером СН2СНЗ є їхня взаємодія з Есу- рецепторами (ЕсукК) (Нотрвасі еї аїЇ, Сепе ТНег 2000,

Уцп;/7(12):1067-75), що потенційно веде до неспецифічного таргетингу клітин, що експресують ці рецептори, (наприклад, моноцитів/макрофагів) і/або іп мімо усуненню трансдукованих Т- клітин (фіг. 1). Щоб обійти цю проблему, автори наданого винаходу замінили початковий спейсер

СН2СНЗ різними екстраклітинними доменами з рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (МОМ). Зрізаний варіант ІМОЕЖК, в якому відсутні внутрішньоклітинні компоненти, що передають сигнали, вже використовувався у клініці для генного маркування Т- клітин (Вопіпі єї а!Ї, Маї Мей, 2003, Арг9(4):367-9; Сісеті єї аї, І апсеї Опсої, 2009, Мау;10(5):489- 500). Екстраклітинна частина І МОГ складається з 4 багатих цистеїном районів ТМЕК і багатої бо серином/треоніном ніжки (фіг. 18). Насамперед, автори наданого винаходу створили дві конструкції СО44у6-САК.287: одну зі спейсером у вигляді всієї екстраклітинної частини І МОЕК (МОРЕ дикого типу довгим або МУМІ), а іншу тільки з 4 багатими цистеїном районами ТМЕВ (МОРЕ дикого типу короткий або ММУ5). Для виключення можливості антиген-незалежної активації конструкції зі спейсером на основі ГМОЕК за допомогою природного ліганду МОБ, автори наданого винаходу створили дві додаткові конструкції СО44мб-САК.287, що несуть делецію четвертого багатого цистетном домену ТМЕК, який, як відомо, анулює передачу сигналу від МОБ (мап еї аї, ) Віої Снет, 1991, дип 25; 266(18):12099-104), створюючи мутовану по МОРЕ довгу ізоформу або ММІ і мутовану по ЇМОРК коротку ізоформу або ММ5, відповідно. Як контроль, автори наданого винаходу створили також конструкцію СО44м6-

САК.287, що включає мутований варіант початкового спейсера СН2СНЗ (СНМ), який не здатний розпізнавати ЕсукІ (Нотрбасі еї аї, Сепе ТНег 2000, дип/7(12):1067-75). Примітно, що як ЕсуйІЇ, так ії ЕсуКПШ можуть використовувати залишки крім цього спільного набору, що дозволяє припустити, що ця мутація не повністю анулює зв'язування (Зпіеїдз5 еї аї, у Віої Снет, 2001, Маг 2:276(9):6591-604. Аптоиг єї а!, Мої! Іттипої, 2003, Оеєс; 40(9):585-93).

Приклад З - Конструкції СО44умб6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕК можуть бути використані для відбирання і відстеження трансдукованих Т-клітин

Різні конструкції СО44у6-САН.287 зі спейсерами на основі І МОЕАВ були клоновані у ретровірусні вектори (М) для трансдукції первинних Т-клітин. Для трансдукції, Т-клітини активували з використовуванням СОЗ/СО 28-сфер плюс І1І-7/І-15, відповідно до протоколу, який краще зберігає їх функціональний фенотип (Капеко 6ї аї, Віоса, 2009, дап 29:113(5):1006- 15. Вопадаплга вї аї, Віоса 2011, дип 16;117(24):6469-78. Сієвтгі єї аї, Віоса, 2013, дап 24:121(4):573- 84). Після трансдукції, всі конструкції могли бути ідентифіковані на поверхні Т-клітин, використовуючи спрямоване проти І МСЕВ мАт С40-1457 (фіг. 2А), що вказувало на те, що вони правильно процесувалися, закріплювалися на клітинній мембрані і, найголовніше, розпізнавались спрямованими проти МОЕВ мАт. Як наслідок, експресуючі СО44у6-САВ.287 з різними спейсерами на основі І МСЕ Т-клітини могли бути відсортовані з використовуванням імуномагнітних сфер (фіг. 28). При ближчому розгляді, автори наданого винаходу виявили, що тільки ізоформа зі спейсером ММУУЇ зв'язувалася з іншим спрямованим проти ЇМОЕА мАт,

МЕ20.4, що дозволяє припустити, що конформаційні зміни, обумовлені спейсерами на основі

Зо ІМОБА різних довжин, можуть контролювати доступність епітопу для МЕ20.4. Важливо відзначити, що кінетика збільшення кількості експресуючих конструкції з різними спейсерами на основі І МОВ клітин була схожа з такою експресуючих СО44у6-САВ.287 зі срейсером СН2СНЗ

Т-клітин (фі. 28), що виключає потенційне проліферативну перевагу, викликану екстраклітинними послідовностями І! МСЕВ, встановленими у САВ. Наприкінці культивування популяція, що одержується у результаті, була збагачена відносно рано диференційованих Т- клітин (фіг. 23), що вказує на відсутність порушення шляху функціонального диференціювання активованих за допомогою сфер Т-клітин у присутності І -7/ЛІ -15.

Приклад 4 - Експресуючі СО44у6-САН.287 зі спейсерами на основі І МОЕА Т-клітини зберігають СО44уб-специфічне розпізнавання, втративши при цьому неспецифічне розпізнавання, опосередковане взаємодією з ЕсуВ.

Для перевірки збереження СО44уб-специфічного розпізнавання після заміни початкового спейсера СН2СНЗ спейсерами на основі | МОЕВ, експресуючі СО44у6-САВ.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕА Т-клітини були досліджені у експериментах співкультивування з СО44У6- експресуючими пухлинними клітинами. Подібно експресуючим СО44у6-САВ.287 зі спейсером

СН2СНЗ Т-клітинам, експресуючі СО44у6-САВ.287 зі спейсерами на основі МОВА Т-клітини ефективно усували СО44мб6-- (лінії клітин ММІ15 ї ТНР-1), але не СО44м6- (лінії клітин ВМ173) пухлинні клітини (фіг. ЗА). Крім того, СО44уб-специфічне розпізнавання було пов'язане із сильним збільшенням кількості Т-клітин (фіг. ЗВ), що означає повне збереження терапевтичного потенціалу експресуючих СО44у6-САВ.287 зі спейсерами на основі МОВА Т-клітин. Отже, у результаті виходить, що САК зі спейсерами на основі ГМО відповідно до наданого винаходу є ефективними проти пухлинних моделей, що експресують специфічний антиген, на який вони націлені.

Щоб продемонструвати відсутність неспецифічного розпізнавання, опосередкованого взаємодією з ЕсКу, експресуючі СО44мб-САК.287 зі спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітини співкультивували з СО44мба/Есуюеж лейкозними клітинами ТПрі або з СО44у6-/Есукв5ж лейкозними клітинами НІ-60. У цій системі, у той час як експресуючі СО44умб-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини усували як СО44мб-- клітини Тр, так і СО44мб6- клітини НІ-60, експресуючі СО44ум6-САК.287 САК зі спейсерами на основі ЇМОЕК Т- клітини специфічно усували СО44умба- клітини ТНР-1, але не СО44м6б- клітини НІ-60 (фіг. 4А). Відповідно, бо експресуючі СО44у6-САК.2872 САК зі спейсерами на основі І МОЕК Т-клітини проліферували у відповідь на СО44мб-- клітини ТНР-1, але не на СО44мб- клітини НІ-60 (фіг. 48). В обох системах, поведінка експресуючих конструкцій зі спейсерами на основі ЇМОЕК клітин перекривалася з такою експресуючих СО44м6-САК.287 САК з мутованим спейсером СН2СНЗ Т- клітин, демонструючи скасування Есук-опосередкованих ефектів.

Отже, через відсутність Ес-домену, до складу якого входять шарнірна ділянка-СН2-СНЗ константної ділянки імуноглобуліну Їдс, як спейсер, САК, що містять, спейсер що походить від

ГМО, відповідно до наданого винаходу, не зв'язуються з Ес-гамма- рецепторами для дос, що, таким чином, дозволяє уникнути активації небажаної і потенційно токсичної нецільової імунної реакції. Відповідно, САК зі спейсерами на основі ЇМО є більш безпечними, ніж ті, які містять шарнірну ділянку-СН2-СНЗ Ід.

І, нарешті, щоб виключити антиген-незалежну стимуляцію за допомогою розчинного МОБ, експресуючі СО44уб6-САК28.7 зі спейсерами на основі І МОЕК Т-клітини культивували іп міїго з

МОР. Навіть при надфізіологічних концентраціях МОБ, які, як відомо, підштовхує диференціацію лінії ГМОЕК-експресуючих нервових клітин РС12 (фіг. БА), експресуючі СО44м6б-САК.287 САК зі спейсерами на основі ЇМОЕК Т-клітини не були стимульовані до проліферації (фіг. 58), що вказує на відсутність передачі сигналу за допомогою розчинного МОБ.

Приклад 5 - Експресуючі СО44мб-САК.287 зі спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітини краще зберігаються іп мімо і опосередковують чудові протипухлинні ефекти Після демонстрації ефективного і специфічного розпізнавання іп міго, експресуючі СО44мб6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕК Т-клітини випробовували на протипухлинну активність іп мімо, спочатку у моделі мінімальної залишкової хвороби, а потім у моделі стійкого захворювання (М/ЕБ). У першій моделі, мишей М5О піддавали інфузії лейкозних клітин ТНР-1 і через три дні піддавали лікуванню експресуючими СО44мб6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ або різними спейсерами на основі ГМОЕК Т-клітинами. Експресуючі СО44мб6-САК.287 з різними спейсерами на основі

ІМОРК Т-клітини краще розмножувалися (фіг. бА) і зберігалися (фіг. 6В), ніж експресуючі

Сра44у6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т- клітини. Відповідно, експресуючі СО44у6-САК.287 зі спейсерами на основі ЇМО Т-клітини, очевидно, опосередковує більш сильні протипухлинні ефекти, на що вказувала краща нормалізація ваги печінки з інфільтратом клітин Трр1 у порівнянні з мишами, яким здійснена інфузія експресуючих СО44мб6-САК.287 зі спейсером

Зо СН2СНЗ Т-клітин (фіг. 68). У другій моделі стійкого захворювання, мишей М5О піддавали інфузії СО44уб-експресуючих мієломних клітин ММІ1.5, а через 5 тижнів, коли пухлина вже колонізувала кістковий мозок, піддавали лікуванню експресуючими СО44м6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ або різними спейсерами на основі ЇМОРЕК Т-клітинами. Експресуючі

СОр44у6-САК.287 Т-клітини, що несуть ізоформу ММІ, не були включені. У цій більш точній моделі, у той час як експресуючі СО44ум6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини ледь приживлялися і не опосередковували який- небудь значний протипухлинний ефект, експресуючі

СОр44у6-САК.287 з різними спейсерами на основі Г/МОЕК Т-клітини розмножувалися (Фіг. 7А), зберігалися і призводили до разючої протипухлинної активності (фіг. 7 В).

Здатність експресуючих СО44ум6-САК.287 зі спейсерами на основі ІМОРК Т-клітин опосередковувати чудову протипухлинну активність була надалі підтверджена з використовуванням моделі стійкої мієломи з використовуванням СО44мб- клітин ММ1.5, що експресують люциферазу, що секретується. Наявність цієї люциферази дозволяє контролювати день у день кількість циркулюючих пухлинних клітин ММ1.5 у мишей, підданих лікуванню експресуючими СО44у6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ (мб СНУ) або зі спейсером ММ5 І МОЕК (уб ММ5) Т-клітинами. У цій складній моделі, у той час як експресуючі СО44умб6-САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини продемонстрували однакову протипухлинну активність з експресуючими неспоріднений САК Т-клітинами (СТЕК), експресуючі СО44у6-САК.287 зі спейсером ММ5 Т-клітини здатні тримати під контролем кількість циркулюючих пухлинних клітин аж до 21 днів (фіг. 7ВІЗ А) і значно збільшувати загальну виживаність (фіг. 7ВІ5 В).

Приклад 6 - Методи

Створення конструкцій СО19-САК.287 і СЕА-САК.287 зі спейсерами на основі І МОЕК

Стратегію, аналогічну до тієї, що описана у прикладі 1, використовували для створення СО 19-специфічних і СЕА- специфічних конструкцій САК (фіг. 22). Були створені наступні конструкції:

СО19-САК.287: що містить СО 19-специфічний таргетуючий домен, ланцюг СОЗС у комбінації з ендокостимулювальним доменом СО28 і спейсером СН2СНЗ ІдСІ1 дикого типу (СснН2гСНЗ)

МУ: СО0О19-САК.287, що містить довгий спейсер на основі І МОРЕ дикого типу (що включає 4-ТМЕВ-суз домени і ніжку) бо ММ: С019-САК.287, що містить мутований короткий спейсер на основі І МО (у тому числі

4-ТМЕВ-суз домени з делецією у четвертому домені)

СЕА-САК.287: що містить СЕА-специфічний, таргетуючий домен, ланцюг СОЗС у комбінації з ендокостимулювальним доменом СО28 і спейсером СН2СНЗ ІдС1 дикого типу (СН2СНЗ)

ММ: СЕА-САК.287, що містить довгий спейсер на основі І МОГ дикого типу (що включає 4-ТМЕВ-суз домени і ніжку)

ММ: СЕА-САК.287, що містить мутований короткий спейсер на основі ЇМО (що включає 4-ТМЕВ-суз домени з делецією у четвертому домені)

Трансдукція і умови культивування

Т-клітини активували з використовуванням СОЗ/СО 28-сфер клітинного розміру (СііпЕХММО,

Іпмігодеп) плюс 1-7//-15 (5 нг/мл, Рергоїесп) і КМ-трансдукували шляхом двох циклів центрифугованої інокуляції у день 2 і З після стимуляції. У день 6, сфери вилучали, і Т-клітини культивували у середовищі КРМІ 1640 (Срірсо-ВАГ), 10 95 ЕВЗ (ВіоуупінакКег) у присутності 1-7 ії 1-15. Поверхнева експресія

СО19- і СЕА-специфічних конструкцій САК зі спейсером СН2СНЗ (СНМУ) була виявлена за допомогою мАт, специфічних для спейсера СН2СНЗ ІдС1 (Часкзбоп І арогайогіев), у той час як поверхневу експресію конструкцій САК зі спейсерами на основі ГМОБЕЖК (МУМІ і МУУБ) аналізували з використовуванням ГМОЕК- специфічних мАт від ВО Віозсіепсе (клон: С40- 14579). Між днем 9 і днем 15 з моменту активації, експресуючі САК.287 зі спейсером СН2СНЗ Т- клітини були РАСзЗ-відсортовані, використовуючи поліклональні, специфічні для СН2СНЗ Ідс1 мАт, у той час як експресуючі САК.287 зі спейсерами на основі І МОР Т-клітини забарвлювали

РЕ-кон'югованим, ГМОЕК-специфічним мАт С40-14579 і сортували за допомогою колонок, використовуючи анти-РЕ парамагнітні сфери (Мінепуї).

Іп міго аналізи для аналізу специфічного розпізнавання

В аналізах співкультивування, САК-відсортовані Т-клітини культивували з клітинами- мішенями у співвідношенні Е:Т-1:10. Через 4 дні клітини, що вижили, підраховували і аналізували за допомогою ЕГАСЗ5. Індекс елімінації розраховували у такий спосіб: 1-(«кількість залишкових клітин-мішеней у присутності СО44м6-40552.САК287 Т-клітин,

СО19.САК2872- Т-клітин і СЕА.САК287ж Т- клітин)//число клітин-мішеней, що залишилися, у присутності СО19.САК287 Т-клітин). Супернатант від співкультур збирали через 24 години

Зо інкубації і аналізували на продукування цитокінів (ІЕМУу, 1-2 ії ТМЕРа) за допомогою аналізу СВА (ВО Віоієдепа).

Моделі протипухлинної ефективності з використовуванням ксенотрансплантату

Для моделі мінімальної залишкової хвороби, мишам М5С (даскбзоп) внутрішньовенно вводили шляхом інфузії 1,5:105 лейкозних клітин АГ -СМ/миша. Через три дні мишей піддавали лікуванню шляхом внутрішньовенного введення 5х106 відсортованих, експресуючих СО19-

САК.287 або СЮО44у6-45452.САК.28 зі спейсерами на основі ГМО (МУМ, ММ5). Приживлення

Т-клітин контролювали щотижня за допомогою кровопускання і аналізу ЕАС5. Через 7 тижнів, мишей умертвляли, і їхній кістковий мозок (ВМ) аналізували за допомогою ГАС5 на наявність клітин АГ-СМ з використовуванням спрямованих проти пНСО45 і НСО19 мАт.

Приклад 7 - Конструкції САК.287 зі спейсерами на основі ЇМОЕК можуть бути використані для відбирання і відстеження трансдукованих Т-клітин

Конструкції САК.287 з різними спейсерами на основі ЇМОЕК були клоновані у ретровірусні вектори (КМ) для трансдукції первинних Т-клітин. Для трансдукції, Т-клітини активували з використовуванням СОЗ/СО 28-сфер плюс 1/-7/ЛІ-15, відповідно до протоколу, який краще зберігає їх функціональний фенотип (Капеко еї аї, Віоса, 2009, дап 29:113(5):1006-15. Вопдапга еї аі, Віоса 2011, дип 16;117(24):6469-78. Сієїі єї аї, Віоса, 2013, дап 24;121(4):573-84). Після трансдукції, Т-клітини можна було відсортувати за допомогою імуномагнітних сфер (фіг. 23), що вказує на те, що, як це показано для САД, мішенню яких є антиген СО44муб, спейсери, що походять від І МОВ, правильно процесувалися і закріплювалися на клітинній мембрані також у

БО контексті двох інших САВ, специфічних для антигенів СО19 і СЕА.

Приклад 8 - Експресуючі СО19-САВ.287, СЕА-САВ.2827 і СО44У6- 40252.САВ.2872 зі спейсерами на основі /МСЕВ Т-клітини зберігають антигенспецифічне розпізнавання, втративши при цьому неспецифічне розпізнавання, опосередковане взаємодією з ЕсуВ.

Для перевірки збереження СО19- і СЕА-специфічного розпізнавання після заміни початкового спейсера СН2СНЗ спейсерами на основі І МСЕРВ, експресуючі СО19-САВ.2857 і СЕА-

САН.287 зі спейсерами на основі ІМОСРЕА Т-клітини були досліджені у експериментах співкультивування з антигенекспресуючими пухлинними клітинами. Подібно експресуючим конструкцію зі спейсером СН2СНЗ Т-клітинам, експресуючі СО19-САВ.287, СЕА- САНВ.2857 зі 60 спейсерами на основі | МОЕВА Т-клітини ефективно усували СО19-4, СЕА- і СО44у6-- пухлинні клітини, відповідно, зберігаючи негативні по антигену пухлинні клітини (фіг. 24А). Зокрема, експресуючі СО19-САНВН.287 САВ зі спейсером на основі Ї МОВ Т-клітини специфічно усували

СО19-- клітини АГ -СМ і ВУ-173, але не СО19- клітини НІ -60 і ВХРОЗ (фіг. 24А). Точно так само, експресуючі СЕА-САВ.2857 зі спейсерами на основі І МСЕВ Т- клітини специфічно усували СЕА-- клітини ВХРСОЗ, але не СЕА- клітини НІ -60, АГ І -СМ ї ВУ-173 (фіг. 24А), а експресуючі СО44У6- 40252.САВ.287 Т-клітини специфічно усували СО44у6-- клітини ВХРОЗ клітини, але не СО44У6- клітини АГІ/-СМ, ВМ173З і НІ-60 (фіг. 24А). Результати, що порівнюються, були одержані при оцінюванні антигенспецифічного вивільнення цитокінів (ІЕМУ, 1-2 ії ТМЕс) (фіг. 248).

САВ, що містять | МСОЕВ як спейсер відповідно до наданого винаходу, як виходить у результаті, зберігають специфічність і протипухлинний ефект з різними антигенспецифічними таргетуючими доменами.

Щоб продемонструвати відсутність неспецифічного розпізнавання, опосередкованого взаємодією з ЕсВу, експресуючі СО19-САН.2872, СЕА-САН.287 С044у6-4252.САН.287 зі спейсерами на основі І МОВ Т-клітини співкультивували з Есуй5-С019-СЕА- клітинами НІ -60.

У цій системі тільки експресуючі СО19-САВ.287 і СЕА-САВ.287 зі спейсером СН2СНЗ Т-клітини здатні усувати клітини НІ-60-мішені, тим самим підтверджуючи, що використовування спейсера на основі | МСЕВ дозволяє уникнути активації небажаної вродженої імунної відповіді.

Приклад 12 - Експресуючі СО19-САН.2872 зі спейсерами на основі ЇМОЕВ Т-клітини опосередковують протипухлинні ефекти іп мімо

Після демонстрації ефективного і специфічного розпізнавання іп мйго, експресуючі СО19-

САВ.2857 зі спейсерами на основі І МСЕВ Т-клітини випробовували на протипухлинну активність іп мімо, у моделі мінімальної залишкової хвороби. Мишей М5С піддавали інфузії лейкозних клітин АГ -СМ і через три дні піддавали лікуванню експресуючими СО19-САВ.287 з різними спейсерами на основі І МОВ (МУ. ії ММ5) Т-клітинами. У цьому випадку, експресуючі СО44му6- 40252.САВ.2872 зі спейсерами на основі І МОВА (МУУЇ ії ММ5) Т-клітини були використані як негативний контроль, оскільки лейкозні клітини АГ -СМ не експресують антиген СО44У6 (фіг. 25). Експресуючі СО19-САВН.287 з обома спейсерами на основі МОВ Т-клітини, очевидно, опосередковує протипухлинні ефекти, на що вказувала більш низька концентрація клітин АЇ ЇЇ -

СМ, що інфільтрують кістковий мозок, у порівнянні з мишами, яким здійснена інфузія

Зо експресуючих СО44у6-САВ.287 Т-клітин (фіг. 25).

Усі публікації, згадані у наведеному вище описі, включені сюди за допомогою посилання.

Різні модифікації і варіації описаних САК, полінуклеотидів, векторів, клітин і композицій наданого винаходу будуть очевидні кваліфікованим фахівцям у даній галузі техніки, не виходячи за рамки обсягу і суті наданого винаходу. Хоча наданий винахід був описаний у зв'язку з конкретними переважними варіантами здійснення, слід розуміти, що заявлений винахід не має бути надмірно обмежений такими конкретними варіантами здійснення. Насправді, різні модифікації описаних способів здійснення наданого винаходу, які очевидні фахівцям у галузі біохімії і біотехнології або у суміжних галузях, як передбачається, знаходяться в границях обсягу наведеної нижче формули винаходу.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

   1. Химерний рецептор антигену (САК), що включає екстраклітинний спейсер, який включає щонайменше частину екстраклітинного домену рецептора фактора росту нервів з низькою спорідненістю (І МОЕК) людини, де екстраклітинний спейсер включає перші три ТМЕК-Сув домени ГМО.

   2. САК за п. 1, причому вказана щонайменше частина /МОЕК придатна для полегшення імуноселекції і ідентифікації клітин, трансдукованих вказаним САК.

   3. САК за п. 1 або 2, причому у спейсері відсутній внутрішньоклітинний домен І МОСК.

   4. САК за будь-яким із попередніх пунктів, причому спейсер включає всі чотири ТМЕК-Суз домени ГМО.

   5. САК за будь-яким з попередніх пунктів, причому спейсер включає четвертий ТМЕК-Су5 домен (ТМЕН-Суз 4), але при цьому із вказаного домену видалена наступна амінокислотна послідовність: МНМОРСІ РСТМСЕОТЕКОЇІ КЕСТЕМУ, і вона замінена наступною амінокислотною послідовністю: АКА.

   6. САК за будь-яким з попередніх пунктів, причому спейсер включає багату на серин/тгтреонін ніжку ГМО.

   7. САК за будь-яким з пп. 1-5, причому у спейсері відсутня багата на серин/гтреонін ніжка

   ГМО.

   8. САК за будь-яким з пп. 1-3, причому вказаний спейсер включає весь екстраклітинний домен

   ГМО.

   9. САК за будь-яким з пп. 1-3, причому вказаний спейсер включає екстраклітинний домен І МОВ, за винятком багатої на серин/греонін ніжки.

   10. САК за будь-яким з пп. 1-3, причому спейсер включає послідовність, вибрану з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 7, або послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична їй.

   11. САК за будь-яким з пп. 1-3, причому спейсер складається з послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕБЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІЮО МО: 7, або послідовності, яка щонайменше на 90 95 ідентична їй.

   12. Химерний рецептор антигену (САК), що включає () антигенспецифічний таргетуючий домен; (ії) екстраклітинний спейсерний домен, визначений у будь-якому з пп. 1-11; (її) трансмембранний домен; (м) необов'язково щонайменше один костимулювальний домен; і (м) внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали.

   13. САК за п. 12, причому антигенспецифічний таргетуючий домен включає антитіло або його фрагмент.

   14. САК за п. 13, причому антигенспецифічний таргетуючий домен являє собою одноланцюговий варіабельний фрагмент.

   15. САК за будь-яким з пп. 12-14, причому мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену є пухлинний антиген.

   16. САК за п. 15, причому пухлинний антиген вибирають з групи, яка складається з СО44, СО19, Сбог2го, 0022, бОр23, С0123, С5-1, КОН, мезотеліну, с-Меї, РОМА, Неге, й0-2, СЕА, МАСЕ АЗ ТОВ та їхніх комбінацій.

   17. САК за п. 15, причому пухлинним антигеном є ізоформа 6 СО44 (СО44м6).

   18. САК за будь-яким з пп. 12-17, причому трансмембранний домен включає будь-який один або більше з трансмембранного домену дзета-ланцюга Т-клітинного рецепторного комплексу, сор28, СОва і їхніх комбінацій. Зо 19. САК за будь-яким з пп. 12-18, причому костимулювальний домен включає костимулювальний домен з будь-якого одного або більше з СО28, СО137 (4-188), СО134 (0Хх40), баріО, С027, 202, СО5, ІСАМ-1, І ЕА-1, Гек, ТМЕВ-Ї, ТМЕВ-Ї, Раз, СОЗО, СО40 та їхніх комбінацій.

   20. САК за будь-яким з пп. 12-19, причому внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, включає внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, з одного або більше з дзета-ланцюга СОЗ людини, ЕсуКІ, Ес5КІ, цитоплазматичного хвоста Ес-рецептора, що несуть імунорецепторний тирозиновий активуючий мотив (ІТАМ) цитоплазматичних рецепторів і їхніх комбінацій.

   21. САК за будь-яким з пп. 12-20, причому мішенню антигенспецифічного таргетуючого домену є СО44умб, трансмембранний домен включає трансмембранний домен СО28, внутрішньоклітинний домен, що передає сигнали, включає внутрішньоклітинний домен дзета- ланцюга СОЗ людини, що передає сигнали, а костимулювальний домен включає ендокостимулювальний домен СО28.

   22. Полінуклеотид, що кодує САК за будь-яким з пп. 1-21.

   23. Вектор, що включає полінуклеотид за п. 22.

   24. Вектор за п. 23, причому вектор являє собою вірусний вектор.

   25. Клітина, що включає САК за будь-яким з пп. 1-21, полінуклеотид за п. 22 або вектор за п. 23 або 24.

   26. Клітина за п. 25, причому клітина являє собою Т-клітину.

   27. Фармацевтична композиція, що включає клітину за п. 25 або 26.

   28. Застосування САК за будь-яким з пп. 12-21, полінуклеотиду за п. 22, вектора за п. 23 або 24 або клітини за п. 25 або 26 при лікуванні раку.

   29. Застосування САК за п. 21, полінуклеотиду, що кодує вказаний САК, вектора, що включає вказаний полінуклеотид, або клітини-хазяїна, що включає вказаний САКЕ, полінуклеотид або вектор, при лікуванні пухлин, які експресують СО44.

   І) САЛЬ Т-нлітиви В Сай Т-кдітивя пт «ек Й й. р / С) Н ке Билучення х диня Її КВ КУ х Р " | й. КУ сан тканин а я ша ; Я я У Беж в пий М ще і: НД | г ж Кк ше ле щи сесплецифічний ї оо ММК о ши ИН таргетинг сь. ПО ! СОКУ "сно ЕсСук-виспресуючі нятини Есун-енспресуючі клітини

   ФІГ. 1 чегесосгосевсосевесвесодеекедескчеесеосесетескюєстютю СЛ Я песоюосоюеесоесестосотеслоеуотесогевгесесегосгсенн . СМУУ сим МАЯ. МВ ММ. ММ щоЕ ЗК в г Зк це Кк: ї і т Ті ЕК - -7 ЩО КІ і у Ж гдх . Зв іксЕн ши ші ши шу г. Б. о її о че . о ши ни ши ши ши КЕ сни шо я яв ві Ша я В с мя не ще ІС вх МЕ в г я В вів ск лкаск Фо в Кз во БЕ В в Як в С | т о Я. ши ШИ ЩЕ . і Кі -- я. щі зу овдсороеко в у св ори ЕХКОвО роко ; Бум оо оком роожсо Зуороує вра багата ї З В я ї З херивомутреоніном ї З З 5 З ніжна З КІ

   ІХ. їВБ пососоровоюю юю ооо ооо ооо Сл Уув- СА НУ КУ й З Каву у

   КУМ. МУТ5 ММ. ММ ши сш шу ни в. а ши ше Од ЩО ши Ак Кі м м и щ ши нен и и и миши Я ота: БК 1457У МАТ вв і Ї зва: 18 1 3 Я ядві 5 У явні яв А й ра і СЕ ДИ ен нн нн НИ АН НН ШИ ни не кни ин ши ие ши и и ШИ І, п І п о о ск пи й НЕ М ОО М І 4311. і й і Кі ро ро у киш ше ще х ши іч 7 о - ме то1 с ой Н г ї ТК ння не ЛЕ М нь, МОогК БО МОБ ВО М5ЕА НО каЕМ ВО А ше нн пиши ши 1 МЕЗВА ше шк ЕЕ ЕН ше Ши : і о МЕРА МАТ пива ше ни : у ! ше ши | В | ; :

   В. орфннно ГОД НЕК хни ВЕ Я М А-5О88Е я ша. ши дн МК МЕЬЯ МОБе Его кока МЕООА МОР АВ

   ФІг. 2 ооооооюородоююводвовоттттютттюютох К . ЯЗ ; . Вс нзнініснднівіівівівівівівівін в вон: вн в пін нінінсннінаній нт». 2 СОра4Ув-САН.ОВІ щ вче « Йон НВ МА Му ММ. мм же ! на М ї ім: ЕВ Я ЖЕ Е ян ВУЖ 5 а зай хау АК А пи ші ни и хе я ме ие ПИ ко А в МЕМ НЕ Е вх ос КИ Н Н : опох ННЯ мк Й ї і т м ли ни ше Еш ше: і во не і п х Н ї ра ї х ї і: Ба : ху : їх й у Н є 4 МЕС княтттттнон МК дода хлялинякині СИНИ чн о НН. Ж ЗЕ тріжнжннняту ВІК МК. МЕ БЕК ще 5 48 45 Часідні пісяя сортування

   Ек. а

   СНУ. Сни МА. МуУча ММ. МО кв І мая зх ли і заша ро000вя я | зе 1 000000ОБВА Її: й І ди Кк Мо НЕ НЕ Н Ні 1. і ОїО00лдмует МО ледтромох. КТЕОледертеюн и ше КУд ее Не М давня КН НЕК і Ми Є о понеее ною их но ШНШ Я Може еяе хе: ше НЕ НИ кол: НН нн ВЕН ФХХ: хо пк КАКАККАКАКААКАНННННКНК А КкАнАн как ююсссюсююссккесесессосс ХМК В МД, поооююююєсоососовесеседа о ліднннннннн ккккккккюсккююююсесевссоє НУ СМ М МА ММ КМ ле ННЯ з 9-4 Х і їй ко 5 Бе з г ке КІ пише ше ши і Ше В Щ по о ше 7" Ме х МІ Ж Ж що З ОЇ Ен ме од. ох т т й Е Н 7 КЖ С Є я МК х Ба Ж Зв ка ШЕ ШЕ Ж Ні - Ж ЗЕ вв БОДІ 5 х і ря ! їх йо СЕ ек ТВ Ж жи й у, Жов З вд он у Я сина шо -2 НК РАЗ з. се ше ШОН -к. ВМТ - ік х КЗ НК х 1. Ж п ж НИ Ба, 5 ве оо Х 5 й. В Ву я Кох ЕЕ ря БМ ві 5 ІТ і Я ЕЕ ї Н З Е; - Шев Бен чик ни уд я пот я ВО тю я ут як ДО о в поков ее З оси Оу я ях КЕ йо х їх -- о М Ох ото як а мое ме шоож мох Єпіввіднеме Співвідноше Єпіввідноше Єпіввідновюе Співвідновше Співвідненяе ння чня ЕТ ння ння ЕТ чвя ЕТ нина БТ Зк, З пппнннетееттсо нт» СУДОВА Я, пня З с і АД Кл ІВАН СНУ СИМ МУМ. МУУВ ММ ММ Тільки | Бор И ШЕ ої ШЕ НЕ ЗБК сих ОВО Бк ЧО же то од т ме що тТклияинн о ОМ: Ге т: МЕЖ шу ро пу БОгя кі і Ше : я ее я п: Кі ЗУМІВ Тсров и ЩІ: 100105 ДА їде Кох ЩО з З в ОН КН Е ши шани чини ша чи Дня КЕ пан с зви ДТ ня ду Я ЗЕ Ко : снвосюмніяяе Б. 00 о Ж А які г ові дяквї ЯМІ ! М. ЦО Че І Во. КВТ ОА. Зх жи Я Жов щої ЯК ПО: се ОО НИ КО ; шнш шен Не ле шк ни ин СТУК СЕБЕ. ОВК СЕВЕ СЕВЕ СЕЕЕ жжх. ЗВ р дгкоосетогооюссєесовоєговсссєссосесогосговесогоосесовесогеоссоовсссст СОВИ улнсленосннтнннккнккнкннннксснеоогоогосвовеоовсовеовссововнно НУ ши МУ МУХЖКх ВБОНИ ММЗ щ- | в Е. зе пе ж Зо вет ко а ЧИН ВЕК ШЕ В о кож шо У З фо ї ен 5 Н х а жк хї ж Не й хх І! шо. - Ж овді х босу. «ЩО я 1 М их вд «що ЩА . м он а Чо БО во НВ Ж м о Баг дос ЕОМ т Оп імен хі Фо ок щі: ов 5 ве щ м що шо Ко Я ня ео ух ее ВЕ З З ї о Н - т 1 Б 5 їх и 15 4 я їх Жов Ж де кни За ЩО вон ОВЕН, У Ф Н днину ж Не ї ї-я У я і Же і ки Ка Конан кан нин М м не овбт ос и і ис зм ами с В ен и с НЕ и НН НН Ха По С Пн У Бо пов я ях Ме ж й мох мох Свіввідноше Співвідноше Співвіднеон Сліввідноюше бСиівнідненн Єдіввіднаша вна мвя Б нина БТ ння т яма КТ ма ЕТ кА АД КА ААНААААААА ДАЛА ДАК кююкюкюєчнюо ВВ МН ямеюєстетееттеттететтттннНКчНнНАчАННАНКАНАНЯ РИМ НМ МАК, КЗ МА. Ми слюоввивок ЦК й і Бах Я ж й - г їх і Ще їх Б Й Я ТАКО шу ВИН НН . вл От КАВОЇ ЖИ: ЗМІ ФВНУНІЧе ух ОБЖ 105 ОХ ЕКО ча оон КОХ КЗ етеру метра Хюнжняя ІдЕ яІШТТеКІ Мет и ре пкнннктвве кажи вну ий

   ФІГ. 4 че зику ат і : г т Ї че Зк ї кв ок ї, НІ ; НЖЙ НІ 15 КН ідї ка та згід т Її НАХ НЕМА ЗИ НІЙ ХМ НИМИ НМЛ ПО ПЕ о о о НН ПИЛОК ПО ПК ОМК К ОО ПЕК КК ПЕ МЕ ОХ Оу ПО п ОО я пок Ме и М ВОК ОВО ОО Ме КВ МН КК ВХ ОК ВК КК МО 0 ЕС ос Гри ОМ Я ПОМ ВО ко о т ОО ОН НН М З ОККО . их де ЕМ я ОМ ВАК ОКХ МЕН М ОЗ ОО клІТННИ Ге 1 ЗО БЕКОН ВАК ВОК КО в ОО я й й " ну и НН ОК КК КК М ПЕ и МН Я ПО В М ЕМО ПІК Ки МО Я КОКО ОООБОУ ОО Ох ОО ІЕЕ МО ОККО С З ОО ОВ В ОО ОО пише В В В о ВЕБ КК МКК МКК ЖЕК КО КК КВ Моя КА В Ех В ЕН В ОН ОМ К ВЕК ОКХ о НН АХ КЕКВ МКК ОО і МА я ПО МОМ ДО ОО НН В М ДНК МКК МЕККА БЕК В пон МО уж. ЗА пеня ФОАФВ-САН ОВ согессях М - І . оепкокичкккжкюнткк КАК тот ТАТ ТОР КАТОТ КА АКААН дід ев Мля з я Зх СНУ пнЖ КУЙ. МА ЧУ ММ «ВК НЕ 1 пої ча що пх не ик і гоже чі ОСТ : шт ній «ОЇ ТВ т Ой ЩА як їі І г ли і пн ВН здатну ний Життя шити заяв см У дж 1 НЕ: ЗІ НЕ ще 5 я М я мі ВВ НЯ в ; НУ їх : ЩЕ НУ роя ЗЕ Я КО в СБ сндетюнин ЕК КВ ше 1 дес в З З Кк КІ В Ме р ай ПЕТ и реглан ти ВК «МЕ тими ЩА ня. х МІХ нн, КИЕВ ні ЕХ : НЕ МУ п Щ БО : я ДЕ сої шин нн ВН птн КІ ГК ДЕ: Най З 5 Ж ВЗ МІ пк КК в о: рення ВД финянннннннкнин Кі САМоонтютнннннн дн С дня «ЖК КІ ІН ВО ВЖИ 5 І 55 МІ Іщук МІ Ж: Я НЕ Ві ше ше нн НЯ йо жя ЯМ З ВМ В ій Я ; ня Мнложтннння пк МИ пкт ння фу Хнтетюююютт и Життя ОКО міни Я. Му: ПВ КІ ск ШО хе РОН їде МК Я Щі МО ЯМКИ У лннноннк Ех М дпннолнояннк М юн сн ЖЕ ниви «ЩЕ. г ТЕЩЕ сакра пемненйся БК нення я ЖЖ пе ОБ СЕВЕ «ЕВ ДУТЕУЕ СЕ о СЕ Ж т-7-- т ра в-Зщ КЗ КУ су се рез О0Б Худ Зет. Ве Же Ж. г2Я ї ГУ? жа ит ЛВ Му. се Х і їй : Вот Н я і і ої і 1 шо їж МА в у пу сова М во З в: Ж В : пи 5 з Мрія, М ц т 28 СЕ в ен: т ва с Зав дО Ух Мт Мои що - ЯЗ М 8и:- ВХ я їх Я 5 Фо БО У ЗІ -ВЕ в МОЯ КУ Я Кк ЗХ М Е Е ще «ох 5 еВ 5.8 9: що х 5 З до ОВ ПА « 0 «Я яр зх А У ща З ще Оу лип ж «8.8 ре й В в В т то ЩЕ я К ще -- ще о Ко чх КУ З що 2 ЗО ЗА с С» зц-ВВ 5. Не В За Я за В 3 В В МК сї яко по На - я ко В Е ще ЩО лов слувщою Ж т -е о ще т а соколи ВИ коти В ЗБ НА ЬМ вра З Я К Ко Ж З серееть ж пен оми ее ЯМ ж ом ше ня Ж У г СЕ ща х кова не я «ван Ка ох ж що бша и - я га шк й КЕ код Ж Зх ОІВ КІ лоти я кох Ж ТОЖ - пово до зи щоб щ КЗ 7 в Ж х й х ше во во Бе УВО Я І Ж Се мох МО щу ШО щу кВ х У Х ЖД п Ж інопотеююетогесонивоеоеньннвйноннноложнох СЛІВ НЕ Ж Ах не д З ІК 1 ОМУМ МУМ КА ММ. МУ уд по ре ВВ 15 рр З 160 пелети ЯК зняття і Н шен кі 385 З я Кшт у НИ ї Щі плит пежеж Ух ожини « КЗ в НН НІШ Не Іван й т ї 1 Не ти Н ща Ок Б НН чі 5 Но бен ОЇ Миті НЕДО ННЯ МАПИ З 5 с т НИ ЕВ ц : | Су МА НИ гкддинНКи хі Н нн КО и КДЖ, Гея Н з еКНОй Ко фею, ІБК ЗЕ ЕК і М 5 ЗО Я КОЖ ВО ПК й БО й х в. 2 З МК ди Н Ко ПЕК, ! Н УК, Н Во ТК ПЕК Н Ка жк і еВ КОВНеМ НЕ ПИЛИ ро 5. СТИХ нн ММ РАМ нету В ОМА отут ВЕК Ж - - п У рт є є рожа» КІ - пече ния і ха к ія щ х : ЕК ВКА вк ще г ої ок ВВ, є Не | : З ям ж : ТВ. З хх Коти пи НН Н з Море в х Ки Ії І АЙ 1 дану ТОЖ і - : ж ве щі Ех ОР а ШЕ Н ! : В, У ще НИ Кіл ВЖК ОО Н М х п НУ БЕ ОтЕ Н що я і г У жим меш В кеш не и Не КА А НЕБА: І шОЖ о що шо БАК Корж | ОТ: 1 Рой у і оз шо ОО Я Кі х ТОРКОлО | ТТ і ГНКЯННЕУ х Н Но пОоО-оОО в ПИ х КОТ АННИ Рог же пу Ж Ком 3 РОБ Х і КОЖ, х Рі і Н ож ш Ж ХК х оси їм 7 лих ї і с ме су її з А С НН А ЗНА - Ж Ж 5 бут Є Е п Ех аж. Ж

   В Є фиюнк Жкае фрння ХЕ - 5 Гв ЖЖ: до ях Ст щі фо 1 -4ї ї «кн СНУУ а, їх З чл х ї -а- ММ.

   Ват» ек Я й МАЕ ЖЕ їв х МмЕ, ВО я г ше -- ММ.

   Я вл «5 М . я НІ Я ОО іх -- ММ5 "ш що -В. - зва Ні К СІ й 5 з За ва з зе і о як і г ха Кв ПК КМ, са І МОВА ж що с еще В М чн З й ди ї п я я Б В ол 44335908 265 30 ї Е Е З ві ща і і о й шк іасідні ах й ; ФЕРБ, ФЖ-еб 1 | и ' «я: СТВ 1; . дрхрв 5 х Ж да зе мини а -к СВІ Годо « т ною х ре : Н ! В і ї їх . г Н а а і З яв ВАД, фрі - СА Ж ак їі їй рр 7 ке: Мен Е ВУ і і ВАВ ЯН 4 ; і ; шк - м Е ово а Я я НН -- ММ і й | 8 - х 4 ех ! ж і: га фени тя З Сх Є ж ня г Б З -в ; ї Бе 5 Фк У ї фондю лек (З оо ФО й в а ж 5 ї8 91 54 857 30 33 ж -к хх , Й Оурожожо ж УЧасідні за вифузією Т-клітині же, 7 д -е СЕТ в т- МОНУ -о- ММ я хз ЛК ут -е СЕТ З Я Ж : Го чекової | з захо рвав а ! | з зв СНуу Шк Кі "Ше | оо лж км 12 таке й 8. : щ-ї | зо Її фон З зи чЕ - х і їх Ах З і Я гу ія зх г 7 жо о ІЙ ! З їх ГЕ і Е здхнів ле ГА Б хо : фея й Кк : ке |; г . ково й ин и ИН ВИН Бої о зніс лини: зв ПИ пня Міома моло зола іе зм зони аа Фіат о? м й по 7 за Зі 28 35 43 39 де 83 70 77 84 Час ідні) Час (дні за інфузівю Т-клітит

   ФЕБ. ТІВ о МСАСАТСВАМ ООРАЕТЬЬІ ІСУБІССАКЕ АСРТСОТУТНЯ СЕССКАСМОЬС ЕСУЛОРССАМ та во 80 100 110.7 120 ОТМСЕРСІЮ5З УТЕБРУУБАТ ЕРСКРСТЕСУ, СТО9МАРСУ ЕАРОАУСВСА УСУТОРЕТТС Во А 150 150 170. 180 ЯСЕАСВУСЕА СОСІХЕБСОЮ КОМТУСЕЕСР ОСТУВОБАМН УОРСІРСТУС ЕОТЕВОТВЕС 1905. 200 21050 280002300. 240. ТВМАПАЕСЕЕ ІРОВМІТАБТ РРЕСЗОБТАР ЗТОЕРВАРРЕ ОБІІТАВТУАС учттуМСяВО З ав 860, 270 г 280. 290. 300 РУУТВСТТОМ БІРУУСЗІРА АУУУСІЛАЧІ ВЕКВИМЗСКО МКОСАМЯВРУ МОТРРРЕСЕК

   310.7 320 330 зо 35000006 ІНБОІЗСІБЗУЮ ЗО51НОООРН ТОТАБСОАЬК СОбСЬУЗБІР РАКВЕЕУЕКЬ БМСБАСОТИВ 370 З80 00000390 400 410 420 НЬАСЕГСУОР ЕБІРЗЕТНЕА; СРУВАБЬАЗИ АТООБАТІОА ПІАЛЬВКІОВ АСІУЕВЬСВЕ: 5ТАТВРУ ШИ ше ше ши шо шк

   ФІГ. 8 (5Е01ІЮ МО: 14)

   Фетр, 5 СОЯДНЬСАНОВ БО МО: 15 ! Нуклевтиди атваасосОоСстасСсОвиат ати ОАССпОСО АсАТ ТОАСАСАОАССССО МС АЮССТОТСТСТОвОСССТО пкелодоасОоосеста ас АОС АВАНС ТАИ КИ М В В В и В В КК еВ ВМ ВВ КИ Ки о Ки М А В Ки шим ВМ В В о Р ВИ ОВ етос АСТАТиАО АСИСТ ОА АСОМ АВОАСТЕСООСОТИ В чесестасоОостОс,сОосАСеСМНтТ ТВО О ОС ОАСОСАССАВОСТ ОА АТС СОонНН ЦЧС ОК КСО НТ испетовтосстола ета не есе аАНОчмИСааТ дАашвестаннеНавю ни АС АВС ООН ОА смОтала ОА ка а А ОСА ВВОН І АС ІАО ТОТОССАССАТСАОССАССОВСОСОАОСТАСАССТАСТАССТОВАСАОСАТСААОЯ осо ОиТтАССАТИВОСОНООАСААЛЛОСОАААС НАСОС АСАТ ЗАСТОСО А ОСА ОЗ СТ АСТАКСТИ СОВИ тозастастосоовсвсесАсестостовссотТТесасосона оо состава тссеаааттттсостостоастостосттоотосвотостов мимо осоостостосасаотоастАсСатоаасАатостосососсоссє сосссссиьессосааосаттассоссстатоссєсАсслсасовсттсосав «ета тТсосстссвиове у цаластт сонюмммоосО гАСа о И КО в о В КК ВИ А НААН нки в и ЕК ОВ шана Тест мА ат ООН С АСВ ГОЛО ТО САТАНИ ОО ОС ОЗ М ан и КК и а В В Овна о а В В В Білон (ЗО Ю МОГ МЕдВАсСвоКОоООчьемгкзкаУмосвееТьоьасвАТоВСпаАвАВІМУ ТУ ньвекносаевІвІеТОнокОсУуеанивОовОоВОагое тео созивБенореевоасетКУуІкВссосвосвавОозозасосспеОовУуацнцУ крРОСЄСВБСЬКЬОСАдаСсЕтТваЗоУоМанУнОоввоКсьЕвУ ТІНИ сВЕТІБВОМАКМОСусОММНЕоВАВОоТАУ СВО охновВотоУТУВНСІВА пені ек ня НЕ хо и ИН ки КЕ А Аіук ов вижене Ов СКМ в МИ ЕЙ ер ен в нон в я ЕН ВО НН Я У СІ АГЕНАОМООВЕУМ КТ ТеРУБОВОСЧЕВвОК о гУДКО НОСОВУ МНЕАСНИНУ ТОК ОВО ПОККОСКЕНУБУУУВСУСАСУВЬУТУАКІТКНТВО КВЕОВОЬНеВУМиМТрЕОрРОВТВКНУОВУВРРЕОКАЗУВОКУКРОВКАПА РА УЮ ОСОБОВУ Ан еЕКУПЛУОКИЕОСВОВЕМСОКРЕВКМРОВССУМЕТОКО КИ акауслІснкосевввсксносвуУЄсьЬТАТКОогураАснМОодеьоеЕ Особливосте СЕУ снасні срев дізеталанцюх

   ФІГ. 10 СПЯДУВ-САВ.ЗВЕ зі спейсером ІІСЕЕ дикого типу довгим (МИ)

   Послідовність білка МЕАРАСС КА еО ТОБ У ТОБРАТЬВЕБРОБНАТ СВБ В вими осквоодев там АЗОУувАНЕВОВОоВОТОЕТЬТІВО крРЕПЕДУтТУСІ.

   СМ ЗНИСТЕОВОсТкУуУЄКнНОсОоОовОоОовОоЗаовах засОоЗкУдВ УЗ УКРОСІ В ЯСААВБОКТЕО У ОМА УВОХ вскКОсс кута ПОКОЕТІЗ КОМА УСОММН КА ЕПВТАУтТУсСАКоОССЦО АЧС УТУВВОЮЛРКЕДССВТ ОО УТНОСВЕССК ДОМ ЗЕВУАОРССАМОТУСЕНСТ ОБУ УУЗАТЕРСКЕСТЕСУВІ, ОБМБАРСУЕАВОАУСВСАУСУХОРЕТТОВСЕАСЕУСЕАСВСЬМЕВС ООКОМІХСЕЕСРОВТХЗОЕАМНУВВОСРСТУСЕОТЕНОНЕСТЕМА РАЕСЕКЕСВИТЕЗТЕСЕО ОВТ ЛЕВ ГОЕРЕАРЕЕОр А5ТУАОУУ ЛУМСІЗОРУУТКОГТОМЕКЕМЛЛ УУУСОУ АСУ В УТУАЕПОМУУВ ака змУитевеРОоКТЕКнНуОвуУАРРКОБААУКОНУКЕВА ЗАПАРА УВО ЗОМС УМЕСМ ОАЕ УС ОКА КОВЕМОСЗ КРОК ЕВ ЕСН КГ ОКО МАКА ЖЕД ИКОСЕВККСКОСНОСИ УСНО ТА зкОогтрАнМОдЕиеЕ

   Умовні позначки

   Сор4дув-специфічний одноланцюгтовий Фодгмент

   ЕМО (послідовність, запозичена з бази даних ОМІРВОТ (РОВІЗ8, ТМчКІ16. НИМАМ,

   положення 283501

   СОЗВА (послідовність, запозичена з бази даних ШМІРВОТ (30747, СПО НОМАМ,

   положення 15352203 дзета-ланцюєсСЮЗ (послідовність, запозичена з бази даних ШМІРВОТ (220983,

   СО НОМАМ, полеження 31343

   ФІК. 15 СІВ4УБ-САНОВХ зі спейсером МЗОЕВ дикого типу коротким (ПУМБ

   Послідовність білка МЕАРАОСЦЕ ЦМВ ЕМСТОЗРАТ ОЦ ЗРОЕКАТЬЗСБАВЕВ УТ СОКРОСАРВ У СТОМАБОУВАНЕВБСВОВБО ТОРТІВ, ЕРЕВЕДУТТС Ома РОоСсО ТКУ КАСОовОомЗосоВОСкОоВ зососУусУєЗасаУукКРОВаОД НК ОСААЗОЕТЕВО ОМ МУКОй вокОеБеМУЗпаВосЗВ гу века панОоМАКИВ У ОМА КПА УСсАНОСС ОА КОТ УТУВВОПЛЕКЕАСВТОЕ КРОК ДСМЕСЕСУДОРССАМОТУСЕРСЬОВУТЕЕрУУВАТЕРСКЕСТЕСУ ВІ, ОБМЗАРСУКАВОДУСКСЯУВ КУСОК ТОКСЕАСКУСКАОВСЬККОС ООКОМТУСЕЕСВОСТУВОЕАМНУВРСЬССТУСЕОТЕВОБВЕСТВИА ОАЕСЕЕРКЕ УМ УУУ ВОМ АСУ МТМАЕПЕ УВК НООУ МемМТеКВРОВТЕКНУОРУАРРЕСЕААТУКЗКУКРЗАНЗАрАРАУЦОЮ ООМОС УМА СКК УВУСОКЕКОКОКЕМСОКРОКЕКАРОВСІ МЕ ГОКОКМАБА УСЕ СМКОКЕНКОсКанНОС УВО АТО УОАСНМО дев

   Умовні позначки

   СрЯд4уйспецифічний одноланцюговий фрагменту

   МОЯ (послідовність, запозичена з бази даних ПОМІРНО (РОВІЗВ, ТІ НОМАМ,

   положення 23-19

   СОВОВК (послідовність; запозичена з бази даних ОМІРВОТ (210747, СІВ НИМАМ,

   положення ТУ дзета-ланцям СОЗ послідовність, запозичена з бази даних ПЧІРВОТ ІРОПОБІ,

   СО МОМАМ, положення 315343 еже. їз СОВЯЛДУЄ САН. ЯВа зі спейсором ІМОГА мутованим довгим (ММ Послідовність білка МЕАРАСЦЦ КЕ ЦЛАЛ ОТТО УСТОБРАТІ Я ЯРОЕНАТ ЗСЗАБВ ІМ У АЛ ООКРОСАРКИ ТИ ТОМ АБОУВАНЕЗОВОБОТОК ТТ. БРЕОБАУТТУСЬСМОЗМВЕ Тр ОватТкУЄККНОССОВООСССВВОСООЗ ПОСНІЗЕМОМЕВОВОЇ КРОН ЯСААЗОЕТЕ Оу ОМ УВОА РОКОСЕШУЄТЗВЗСОБУТУ У ЮИКОККЕТІЗКОМАКМЗ УС ОМ д ЕОТАУТУСАНОС ОУЧОВОТ УТУЗОСОРКЕАСЕТСЬУТНОСЕСОК

   АСМ.СЕСУАОРССАМОТУСЕРСІОБУТЕВОХУУВАТЕРСКРСТЕСУВІ, ОІМБАРСУЄА ВОД УСВСАУСУУСОЕТ ТОКСЕАСКУСЕАСВСЬУКУС ОКОМ ТУСЕЕССОС ГУЗОКЛАКААОДЕ СЕКСУ ТА ТОРС ОЮ ТАРУТОЕРЕАРРЕООНАЗТУАВУУТТУМОВЗОРУУТВОТТОМРКЕМ УУУУВОМ АСУ ВМС УТУАРИЕМУКОКИЗНЦ НЕОУМиМТРЕВЕСР ТЕКНХОРХАРРВОБДАУВВКУКЕБАЕБАПАРАУВОСОМОСУМЕСМО ЕКЕБЕУЛВУДАККВСКОРЕМОЗКРОНЕКМРОКСИ МЕ ОКОКМАБА ХВ ЕОМ КОСсКеВОоКанНОСс ов ЗТАТКОТУЮАНМОАКеВА Умовні позвачки Сіл» б-специфічний однеоланцютовий Фрагмент ІМОРЕ (послідовність, запозичена з бази даних ННРВОТ РОВІ, ТМВІ6 НОМАМ, положення МЕН. Жирним шрифтом; амінонислоти, які, у мутованому варіанті, були замінені відносно до початкових залишків делетованіяк МЕУОРСИВСТУСЕОТЕКСНКЕСТАМ СЕМ (послідовність, занозичена з бази даних СОМІРНОТ (РІО, Сг НМА, положення 1535920 дзета-ланукн СОЗ (послідовність, запозичена з бази даних ІМІРВОТ (РОБ, СОЗХ НОМАМ, положення 31-143)

   Фетр. ї3 СОа4УБ САН ОВУ зі спейсвром СЕ мутованню ковотким (МО) Послідовність Білка меди АВР ТОРА ВРСЕНАТ СВД УМА ООКРОСАРЕ УСТЯ АББУРАВЕВОСВОВОТОКТЬТВВ веду ог витоку вОовоазЗОосОооВ ОСОБУ УВО УКРОСЯІ ВІ ЗСААЗОКТЕЗУ ОМ УВОА воКкОосЕ ЛУПУ ги ОБІКОВЕТОКОМАКМа УС ОМ КА ЕОТАУТУСАКОСС ОА СО ПУТУЗВСОВАИКЕАСР ТО УТНЗОЕССК АСМОСЕВУАОРССАМ с ТУСЕРСТОВ У ТЕЗОУКОАТЕРСКРСТЕСусі, ОЗМ5АРСУЕАВОДУСКСАУВУУОСЕТТОКСЕДСВУСЕА ОСТ УКВС ОДКОМТУСЕЕСРОСТУВОЕАДАНААОАЕСЕЕРКЕЖМ УУУСОУ АСУ

   З.УТУАЕНЕЩУВЗКЕВВЦІНІСУМИМТРЕВРОРТЕКНУОРХАРЕВ ОРЕ У ЕД уККБАЗААРАУВОСОМОСУМЕ М ОККЕВУСИЛ ОКА СЕОРЕМОСКРОКЕКИРОЕСІЇ УМЕКОКОКМАБА УЗ МИКСЕКВВО ка7аносноваетАТКОГкАСНМОЕРЕК Умовні позначки СраЯув-специфічний одноланцдютовий фрагмент Кен (послідовність, запозичена з бази даних ШМІВНОТ (РОВІ ЯВ, ТМНІВ НОМАВ, положення 29-190). Жирним прифтом: амінекислети, які, у мутованому варіанні, були замінені відноєно до початкових залишків (делетовані я МНИМОРСО СТУС ВЕСТ СПЯВЯ (послідовність, запозичена з бази даних НМРВОТ 10747, со28а нуМАМ, положення 158-290) дзета-лавцює СЛ (послідовність, запозичена я бази даних ОМІЕВОТ (РОЮЗЕЗ, СО НиИМАМ, положення 3-13 хг. за СОУ Б-САВ.ВІ зі спедсвром УСЕ Я дикого типу довгим МАЛИ

   Поспідоєність білка МЕРА РО СУА РОТТОВБУСТОБРАТ ВМ.ЗРОЕКНА ПТ ОСА ВА ОКО ОДН ГИ ТОН АБУ АКеОЗВОВУ ТОК ТО ЕРЕВКДУТТС СОМИ РЕТКОССТКУЮКИВЗОСОВБОСОсОВОоВОСОЗ поБОозкУуВУуєВОосО УКРОСУ КІ ОСААЗОКТЕ БУ СМ АУВОА вакКОСЕМ УТОГ СчКОВЕТаКОМАККО УЧ ОМА ЕВТАУТУСАКОС ОТ СВОпП УТУВВСОРКЕАСТОСУТНСЕССК ДЕМЕВЕВУАОГСВАМОИТУСЕРССОВУ ТЕО УУЗА ПЕРСКРСТКСУЄЬ ОБМБАРСУКАрОВУСКСАУВУХООЕТТЕНСЕАСВУСЕАОЗСЬУКВС ОКОМ ТУСЕЕСРОВТУВКОБАВНУВОССВСТУСЕО ТЕО АКЕСТКИХ ОАССЕЕ РОКИ Ка ГТЕРЕСОВО ТАРОТОЕРЕАДЕРЕВОАСТУА С УУ ПУМОВБОРУУТВОТТОМРКЕММІ УМО ОУСАСУВИ МТМАВНЕМУВ КК НІВ УМЕИМТРеЕВРОТЕКНУСВТАВРЕОБААТИВКУКЕВЕ 5АПАРАУВОВОМО МЕ М ОККЕБУДУ ОКЕКОКОРЕМОССКРЕНК МРОБСС УМ ОКОКМАКА Уч СМКОСЕНеКОКОСНОСО УНН ОТАК ОТУВАГНМОАЛ РР

   Умовні позначки

   СралЗубспецифічний одноланцюговий Ффрагменії

   ІМОРА (послідовність, запозичена з бази даних НМІРНОТ РОВІЗВ, чів.

   НОМАМ,

   положення 29-50

   СОВА (послідовність, запозичена з бахи даних НМРЕОТ РІО, СТАВ НИМАМ,

   полощшення 153-550 даета-ланцюєСОЗ (послідовність, запозичена з бази даних НМІРВОТ (620963,

   СОЗХ, НЮОМАМ, положення 31-143, без Й у положенні ВО)

   зі. 15 СОЯ4УБ САН.

   Я зі спейсевом МОБ дикого типу харотким (МУ

   Послідовність білка МЕРА ЦО ОТТО ЕС ТОЗРАТ В ЗРОСЕКАТ ЗСЗАВВЗ ІМУРИМ ДОКРОСАРНИ ГИ.

   ТОМІ АВОУРАВЕЗОВОЗОТОЕТІТІЗВІ, ЕРЕОБАУТУСІОМІЗЗМРІ.ТЕООСОТКУККАсОСОзООвОоВООобОЗ ЗОСОБЕУОСУЕЗОССІ УКРООВІ НІ ЗСААЗСЕТЕВВУЮМОМУВОА ОКО УВП ОБІКОВЕПВВОМАКИВС У ОМ НА ЕОТАУТтТТСсАнОос осо УуУТУВВОЮиКЕДСОеТО УТ ОЕСОК ЕМ СЕСУЛОРССАМО ГУСЕРССОБУТЕВОУУВАТЕРСКРСТЕСУЄЬ ОЗМЗАРСУБАПВОДУСВСАУВУУОСЕТТОВСЕАСВУСЕАДОЗОГУКВС ООКОМТУСЕЕСРОСТУЗОБАМНУЮВСЬССТУСЕОТЕВОСВЕСТВ МА РАЕСЕЕЕКЕМУ УУУСОУ АСУ УТУАЕ ПЕ шУВаКЕВК І НЮХ МиМТеВВРОВТВКНУОРУАРРВОЕААХВЗКУКЕВВВАПАРАУЮОЄ САС УМ АМС ККУ У ОККЕКСКОРЕМОСКРЕКНКА РОСТ УМЕЇ, ОКОКАИАБА ЗЕ ОМКоеКНКОКСНО а ТАТКОТУВАСНМОХ РЕ

   Умовні позначки

   КОВЯ4уб-специфічний одноланішюогоний фрагменту

   МОР (послідовність, запозичена з бази даних НМІРВОТ РОВІЗВ, ТМВІ6 НИиМАМ,

   положення 23390

   СОВА (послідовність, запозичена з бази даних ОМІВВОТ (810747, СО28. НОМАМ,

   положення БОЇ дзета-ланцюг СОЮЗ (послідевність, запозичена з бази даних ШМІРВОТ Р,

   СОЗХ НИМАМ, положення 311-343, без й у положенні 80

   ФІ. 36 СОЛЯУБ-САН Ве Зі спейсером НЕМОВ мутованим довгим (ЯМ) Послідовність білка МЕАРАОЦ ЦО МЛ РОТТОСУЮТОЗРВАТІ ЗІ ЗРОЕМНАТ СА МУР АА СОКРОСАРЕШУ МТ ЗМСАЗОУВАНЕВМОВОВОТОКТЬТІВМ.

   ЕВЕСЕДУТТС ОСІВ МВЕ ТР ОСсОтТКУВІКНОВООВОСОсОоБОвОовОВ сасаЗВЕУС ЕВ УКРОСВІКЕЗСААБОКТЕ ВУС АМУВОА вВОКОС Ему уУгУ У ОВІКОВЕПЗВОМАКМЗ УК ОМ КА ЕВТАУТУСАКОВСЦОУЧОВОТУТУВЗООРКЕАСРІСТЬУТНОСЕСЬК демовЕсУВОревАМОТУСЕРССОвУ ТЕЗУ А РСР ТЕСУВЬ ОБМИЗАРСУКАПЛОА УСС УСУУООЕТТСВСКАСКУСЕАВОСЬУЄВС ВОКОМТУСЕЕСРОСТУВОБЛАНААРАЕСЕВВСВИТТИБТРРЕСВОВ ТАРЕТОЄРЕДРЕЕОЛЬАБТУДОУУТ ТУМБА ТТОМеЕКАМ м УУУусОоу АСУ УТуУЛ ЕЕ мука КА ни НЗОУМЕМТеКА о ТАКО УАРЕВОгДАУ Наук ЗВБАПАРА УВО ЧЕМ ЕСЕ УВУЦІОКАКСКОВЕМСОКРЕККИРОБО УСЕ ОКОКМАКАУВЕ юка кикКОсКкОСвоо УВО ТАТКОТУОАНМОАСвЕ Умовні позначки Сралудчепецифічний одноланцютєвий Фрагмент МЧОРК (послідовність, запозичена з'бази даних ОМІРАОТІРОВІЗЯ, ТМВі6 НОМАМ, положення 292501. Живним праеафтуом: амінокислоти, які, улоутевансму варінні, були замінені відносно до початкових залишків (делехтовані як МНУВРСОСТУСЄСЕТЕНСВЕСТЕМИ СООВЯ (послідовність, запозичена з бази даних ЦМІРКО ТРІО, Ср НІНМАМ, положення 1533-2201 дзетасванцюг СОЗ (послідовність, запозичена з бази даних ШНВНОТ (820953, СОЗХ НОМАМ, положення З1-143, без Оу положенні ВОЇ

   ФІ. ї7 ЄМЛУВ-САН. ВХ зі епейсером ІМЯ мутованим коротким ПММ) Послідовність бідна МЕДОМ РОТТ ОЕМ ТОВРАТ Я БРОКНАТ ВОСВАЗВВ МГ ООКРОБАРНИ ГТМ АЗОВУРАНЕВОЗВБЕОТОР ПЛОВ ЕРЕПЕДУТУСІ СМУЗЗМЕ ТЕСсОСТКУЄКНКООСОоСОВОВСсСОЗвОовОоВ ЗОсОЗЕМОСУЄЗБОСІ УКРОСВЕ КІ ЗСААБОЕТРаЗУЮМОУМУКОА РОоОКОСЕМУуєпПОВОООегГ У ОВКОВЕТІКОМАКИВ СОМ КА БОТАУУУСАНОСі ПУШОК ОТ УТУВВОВеККАСРТСг УТНЯСЕССК АСМІ.СЕСУДОРССАМОТУСЕРСІОЗУТЕВОУУЗАТЕРСКРСТЕСУВІ, О5МБАРСУЕАОПАУСВСАУСУХОПЕТТОВСЕАСНУСЕАСВСЬМУЕВС ОДКОАМТУСЕЕСВОСТУВОгААВААОАЕСЕЕРКЕМАЛ УУУСОМЛ АСУ

   ЗМ.УТУАЕНЕЖУВЗКАЗНІ НЕОУМУМТРЕВРОРТЕКНУОРУАРРА ПАЛАТ УКЕЗНЗАВАРА УВО МОЇ УМА СКАЕВУЮЛ ЮККМ ОКОРЕМСОКРЕККМРОБСІ КМЕСОКОКМАБА УСЕ МКОЕКККОК нас УуН У ТАТКО УОАСНМОДЕРеК Умовні позначки. Сннує-специфічний одноланциновий Фрагмену ЇМОРЯ (послідовність, запозичена з бази даних ОМІРВОТ РОВІЗЯ, ТМА36 НОМАМ, положення 29-390). Жирним шрифтом: амінокислоти, які, у мутованому варіанті, Були замінені відносно до початкових залишків делетованіяк: МИУОРССРСТУЄКОТЕКСИ ВЕСТ У СОВА (послідовність, запозичена з бази даних ОМІРВОТ ІРІО747, СПОВ. НОМАВ, положення 153-Ж0 дзетахланцюг СО (посліДОВНІСТь, ЗОПОЗИченНІЗ З бази даних ПВІВНОТ гРОПОВ8, СОЗУ НИМАК, положення 311-143, без Й у положенні 80) м

   Фет. їв СПОдУЗО52САВІВХ зі спейсером МЩСЕВ дикого твпу довтим (МАЛІ

   Послідовність білий МЕАРАО КОЛ СИ ВО ТОЕМСТОВРВАТ З БАЗЕКАТ ОСА ВІМУРИ У ОКРОСАВЕНІУЄТОМ АВОУРАВКЕ ОВО ОКО ЕРЕОКАУ УС ОМ МРиттеОосОатТкКувкисосоЗпОооОБеЕУСЄ УЄЗОСО КРОВІ ВСААЗОКТЕ затомея ува еоКкОаЦ Кума ГУ оМкКОветавоМАКМСт ОММ БЕНАКОТАУтСАНОО ОТ УОКОТ ТУКА АСЕТОУТНОСЕССКАЄМЕ ОЕВУВОРО САМО ТУСЕВСС ОВУ ТК ВОУКВАТЕРСКРС ТЕ СУС ОВ МЕЛЕ СУЄМО ПАУСНСАУЗУУЮОВТТОВСЕАСВУСЕ ЛЕВ УЄВСОКОМТУСЕЕСРОЄТУВОЄ АМНУВЕССВСТУСЕОТЕКО МЕСТВУМАОАЕСЕВ РОБИ ТВО ТЕВЕСВОСТАРЗТ ФЕРЕАРРЕОРЦАЗТУАСУУТТУМОВВОРУУТИСТТОМЕКЕ ММ УМО СУС АСВ СЕУТУАкЕшУВАКАВАК І НЗОУМИМТеВеРОРТВКНУОРУАРРЕОЕААУВЕКИ КЕБНВАДАРА УСНА МЕ ОВК УЛ ОККО КОРЕМОСКРЕНКАО ЕСГУАКЕ ОКОКМАКАУЗЕКЗМИМКСЕНКВОКООС ТОСЬСТАТКО ТОВ НМ, ер

   Умовні позначки срадуавспецифчний одноланшеговий фрагмент ІЗКО М Ме)

   ІЇМОЕВ послідовність, запозичена з бази даних ШМНРАОТ ІРОВІЗЯ, ТМАЗ НОМАЙ,

   положення 2552501

   СПОВЕ (послідовність, запозичена з бази даних ІНРЯСН (210747, СО, НИМАМ,

   положення 15350 дазета"-ланцює СОЮЗ (послідовність, завозичена з бази даних ОМІРАОТ 1РОПОБЗ,

   СОЗХ МНОМАМ, положення 31-14, без С у положенні ВО)

   ФІГ. 18 СПЯЧУБЯСБеСАНЯВ: зі спейсером ІМОБВ дикого типу коротким (МУКУ Песлідевність ВіІЛКа МЕдеАСЕО ЛЕ УМ РОТТЗЕМСТОЗРАТВЕБРОКАТЬЗСВАВЕЗМУ В УСО ОКРОСАРНИ МТУ АБСУРАНЕЗОВОВОТОКТ ТОВ ЕРЕВКАУУ УСС МРІТЕОСОТКУЮКНОВПОВООСОВЕУСЬУКВООСЬУКРОСВЬКЬБСААВОГТЕ зом УкадРОКОСЕЧЗА ПОВООВУ РИ ОВІКОНЕПОКОНАКИВ У ОМА

   З.НАКОТАУУСАНОСЬ УМОВ О УТ УЗВОСРКЕАС ТО ТВО КАСМІ, ЗЕВБУВДОРСОЗАМОТУСЕРСЇ ВОУТЕБОУУВАТЕРСКАСТЕ СУС ОЗМБАРСУЄАВ ПАСКА УВО СКАСВМУСЕАСВБОВУКОСОВКОМТУСЕССОТУВОе АМННУВРСЬВСТУСЕОТЕНОВЕСТАМІАОАЕСЕ СР КЕ ММ УУУВОМ АСУВЬ МТ УДЕНЕЧУУВЗКАВНІ нІОУМИМТРАВРОРТАКНУОРУАРРАОКАДАУВаКУКАЕВ ЗАПАРА УСС ЧЕ ОАЕ КА КАК пОРЕМОСКРЕНКАВОВСУ АЕБОКОКМАБКАУВЕНЗ МКС НА АОСНОСІ УСС ТАТКО УПА НМСМЕ ВВА умовні позначки Срмаув-специфічний одноланцютовий фрагмент (БО АНІ ЇМОЕК (послідовність, запозичена з бази даних ШМІРВОТІРОЯЗЗВ, ТМВІ6 НОМАК, положення 295-190) СПІВАК (послідевність, запозичена з'єази давих ОМІРВОТ РОТА, СО28. НИМАМ, положення 153-250) дзетахпанцют СОЗ (послідовність, запозичена х бази даних ШМІРВОТ ІР20963, СОЗХ НОМАМ, положення 313-143, без 0 у положенні ВО!

   ФІй. 50 Саду ЗО52-САВІВУ зі спейсером ОБ Я мутованим дова ММ Послідевність білка МЕАВАС РА РОТТО ВУД ТОЗРАТЬ ОБ ЗРОЄНАТ СВАТИ АН О ОКРОВАРВЦ УСТ ЗМ АБОУРАНРВОЗОЗОТОКТЬТВЗЕРЕОКА УТ ОМВО НеСТРОсОТКкУуВКОасОоОовОЗЕУОЬ УК ЗООЗОУКРООВ ЛІ ЗСААБОКТЕ ЗОМ УуУУВОАвакаеЕУуУ сову ОщКОВеПОВОМАКМЗСТ ОМ

   З.КАКОТАУТУСАВОСИ ТАКО УТУЗВОМСРКЕАСЕТО ТНК вБЕСУЛОГРОАМОТУЄКЬС ОВУ ВОК УК АОС ТКС УВС ОЗ ОСУвАЮ ПАУСЕСАУСУУСОВТТОВСЕАСВУСЕАО В Ук СООКОМгТУСЕКСРОС ТВОЄ ВАНАДОДЕСКЕКОВИМТ ВІТРЕ ОВТ АЄЗТОКРЕАВРЕОр АВ ПАСУЄТУ МОЗБОВУУТИВТТОМРКЕМУМ УУУООУСАСУВО С УТУАЕПЕЖУВаКиВАННІО УМИМТеЕВАРОРТВАНУОЕХАВРВОКААУНаКУКЕЗНАЗАВАРА КОСОСОМОСУМЧЕ АОС ОКАВОКОВЕМООКиНЕКАРОКТ КК ОКОКМАКАУЗЕНЗА какккАСКОоНОСС УОЗ ТаТкКОоТУВАЕНМИСЬСВЕ Умовні позначки сра4овб-специ вічний одноланцютовий Фрагмент (БО ЦО МО) ІВ ЕЯ (послідовність, запозичена з бази даних ЮМІРНОТ РОВІЗЯ, ТЕ НИМАМ, положення 295-250). жирним інврифтом: амінокислотн, які, у мутованому варіанті, були замінені відносно до початкових залишнів (делетованняк: МНС РСТУСЕСТЕВОКВЕСТА МИ СООБВ послідовність, запозичена з бази даник ПШМІРВОТ (В ЦЯУ, СЯ НОМАВ, положення 153-220 дзета-ланцюєг СОЮЗ (послідовність, запозичена з бази даних ЮМІРНОТ (Р20953, СОЗХ, НОМАМ, положення З31-143, без Су положенні-яОї їх. 3 СОЯ Е САН: зі спейсером ІМОРК мутованим коротким Послідовність білка МЕАВАСС КЕ ЛАУСВОТ Таку, ТОЗВАТЬВІЗРОЄНАТ ВСАА СО ОКРООАВНН ГА ТМ АЗОУВАНЕЗОЗОВБО ТОК ТТ ЕРЕОРАУУТООМВ мета ОоТкУєКкНИаОо асо У Є УКОСУ КРООВНЕЗСААБОКТЕ ЗауУпвМОУУпОАвакКсС Ему оаВу ТУ ОЧКОВЕТІЗНОМАКМЗ ТОМ ЗКНАКОВТАУТУСАКОСТЮУУЧСНОТ УТУВВООВРКСАСР ТУ ТНОСЕССААЄМ, ВЕСУЛОКИЦАЛО ТУ ДСОТ БО УК АТЕ КЕКС ТКС УСЬОМУ ЄАЮ ОАУСИСЛ УСЕ ПОЛО АСНУСЕ АЦСК ОСОКОМТОКЕСРЕНа ТУЮ ння и У В НИ М ВЕН В на В тео ТВкнУОВУуАиРНОК ААУ ВОЛКОВА ОАРА УОСЮЮВМОСУМЕНА ДЕККЛУСОКНВОНОРЕМССКРНИКАМРОКО УМЕСОКОКМАКА УЗ АКОЕВІ, Ка НОСі УС ТАТКО УЛАСНАИЮАЬНЕВ Умовні позначки сралув-аве СбаЯуб-специфічний одноланцюговий враплент (ЗЕД ЛО МО МОРЯ (послідовність, запозичена з бази даних МІРВСН (РОВІЗЯ, ТМАІ6 НИМАМ, положення 259-190. Живним шрифтом амінекислотн.які, у мутованому варівнті, були замінені відносно до початкових заліків (делетовані як МАУВРСРСТУЄЕВТЕ КО КЕСТА МУ) СОН (послідовністю, запозичена з бази даних ШМІРВОТ (РІО, Соя НИМАН, положення 155-350 дзетаєланцюєсСюЗ (послідовність, запозичена з бази даних ОМІРКОТ ІР2ПОБЗ, СИЗИ НЕМА, положення 831-143, без бу положенні ДО)

   СОТОСАН ОВ: СИМ УЄ МАЙ. МУ Бах ІЗ зх 1 Б. Я х я Те У

   І. т Ка ГЕ по МО БК Бек ек І ши ше й как ша. се З ння нн я В, мовно | т І ! с реме жи ЗИ с. кі ВО А Мк ще їх й я Сн Мй. ММа що ! - з ді щ Е : сх КУ | ї о щих . ш і. ІП ІТ З г

   М . що ЖЕ щ її м 5 що і і ЕВ - і к В т У о нь у ща р ЖК. ОХ ; Багата серином/треоніном 0 ні Се ніжна жи ие пери виех СО он ш- ДОВ п меш шк: : ОХ Ко : і я о ко З п доки . У о : : ОК Зк ї. Я КЕ: ЗО : ек ; В. о й З У ЕХ ше вай : я КК ЗО ха я ки Зах у с п ск у МОЯ ККУ Я й . ОО ех Ох ХК З х Я ВУ . ї І 5 ЕС ООН й Ж Хе ВО МО і : о о о ж Кк ВМО ЗО Я о о. ЕЕ о. о В Е ОК що рес ї о хокааня лоааяняй УК МБО ре ВЕ Я Х КЕ о ! : знов ВО . Ж КК о : Я УМ. о Ко ЯК: п ха що ОКО Н ; Х ЗО ЗО ЗО ЗО і ЗБ, Я ОО еще ОБО ОККО й. се ше й ЕЕ. 5 З Ж ж ореорі Ох ХК ПУ ях Мо З п с о 0 Я ВО емо ОО Мо ОО о я ЗО ЕК о. з о ЗІ о. о З: КОСУ ПО АОКУ ху ЖК В ОО - о - ВЕ КОКО ОО 0 ш о їз 7 Ох ОО у КО З ОХ. ОК УК ій х МОХ 5 ВО ВО ОО М 5 БО З У ОЗОН ОК ее нені ; Я МОМ БУХ о ОО : Ж я ОКХ Я КЕЙ Ох ХХ ; Кн я ж . ! ет то й Же : : ЕК : ! я і й зе ж декноах у СЕА -і т 19 -і - У пені пон о Є КЕ МК 2 ІЗ УВС ув» Е пня ВМ ! В путч кннксноня ха Щ : 7 х ді -- КЗ 3 : ШІ пам ЕОВ ВАЄ що зб і ЗЕ й т З Б Н Н схкучу іще того ОО Б і оМцеея я : І : і т що ХХ й ХУ ЯКУ С ще о ш квя Ве Бе Є що З ІЗ А мм я М ОО і Ку БУ С е ка а ко Н я с . КО щХ ЕІ ве З ЩО і. Ка жо ве . ха пе 0. З : І Ву З х Я КО ЗУ Ах Н Уже і СУ М хх й хо а о М щ ав . і ся Оля у 0. ща ще я і. : ШЕ 3 3 р ев ік і |. Я я. в З ; З Б ТПУ В Ме шй ск В ме і. Ж пе ша вив ЕЕ. їз ОЗ ие Ж пив 18 2 яні ЕБжЕ «заееЦня і З З ДЕ Я 3 З пед - й ре їх 1 С їй хі Ах ся ож гу гра трокКох 5 Ж хх ве СА Ох ЩА Я хх ве ОК Я і ооо хе. зх - 53 - рез 25 щу й : ох - тк ОО . : що хх по і ха щи Й фе зе нн Я Н ! СЕК Н щ ! Е тк «ЕД ї Е за, ; 1веораєвькс : сн Ме 7 Н Н ее 7 Н ! ВХРОЗ Є Е Е ! ; Ї Н А же і Ї чу ДКС А, г, се че . ! і еВ м. і. 0 ! Оу І 5 і Н с У Б п М МК і : З Е 0. 0 Е шо . з ва г З Е х о п Ж її. в ! І З | і ЕКЗ і. ! ще: о З З КЕ т ще ! ше шщщ : ов в ї МО ХХ Я ро хо ЩО КЕ пеки З о «е КЕ. м ше ЩЕ як ЕКІЯ ех Я ) ТЕН БУ І хе і з ве. ще С3У Ме ке ож хі щу ж ж : й М МОЯ ок КК оо т - -- пт Ше ше 15, КЕ ХЕ ще Б ЗУ Соки ЦЕОЛУ о: о - Ба М жо БОШ й : ж Не п Я КК сах КЕ Ж ОО - до ї чі вс Н ШЕ ва МО а а ож -В

   : 5. щХ ще ще Я їй ід еВ І и ОО щі ш ве сш ї ТВ ЯКО що ХХХ денним Шо Бо що ж ж Ж де клжтячнх, і Од ЩО т АК сх З сштнітквнтнню, : ня УОжЖ с во і І ях лчсктнтки ! маш «ек ЗЕрене поля Ї р дічнпеко інте : в деккетчнялалянх і пути сх Кук ІК. яв в пи ї дід не ї Е жех дише щас І ; Н БУ сю сх Кк. дин ТК з. і ох, Я соєю ТЕКИ МАО ! Н КО лак Е; Че МВ ЯМ ! Н -К ож ще и Я я Н Кия до Ж» ЯКО З В Н уж их. си В Без, ж Ж.

   З Бе Я -е Е З їх ем НУК хх ї СЕК КОСА з хх «Ех яку но Хе Кх віз ке Й БК чай З с Ех ЩЕ му мі З п СКШН а В З я Б 5 Ж: пз ЖЕ дих НК З ве ХХ хе ККУ КІЗ: Ха ЗЕ М СЕ еВ А ВКМ срср пок З Кр укуєчух В ово КМ СК тен дош М Мод КАМ, шо ІМ сей КВ дб до У М КМ хі ж ШО Б а КУ ЛВ Ж М Ж ОМ ЖОВ тм ОК в я хижих ПІВ БЕХЕВЕ ПЕВНЕ ЗЕББЕЖИВЕ : р СЯ "х а Кн зи з, мг. ї ї ВеМЕВеЦ тахекя я Ве де Я ВКА Ве Я : : : ла івояе вуж ! : : Н яд вк че і ; ї НО: ле 4 У і ДЗК с Ж о і ! щої Ку ще М ка ; ї М КК: - У -- 1 : «Ж ШТАМ І хуй МЕ 1 і ще ЗЕ ЗУ ОО Ку ! Т свре ува, х окж ет соя ; ЗН Яд Я ! КО БИ Я ОО НРЕКСКА о во є «деку КУ і : ми 7 7 Хкнля КО Кк УКХ ооо да Н : ДЕ МКУ КЕ т- ЖЖ її щм І : Б В КУ п св Е Шу «ек ї і Е їх МАВ ЩЗ " ді ХМ маже і Ї Входи ока ра о крови ом; Же курку ! і ЗАЧ Я МЕ В Ж ВЕ У тих СУКИ ен КЕ ї ї ЕВ ВАКВ ЯК ее ХЕ ОВЕМЕ : : КЕжкем ве Ж ВЕК тан ке Ж і і Зк цпЕрсх яке і і 5 -ко на Е Н яко ме ситу, Е : КК о У щ З і : ЕЕ - Зх А ЗНО Н ї кан свт нАі мМ й БУ о і зу аик хр кутю ви ен Я СУМ ХВ, хх о й Н РОСС ОО ою КО Є шеджо хх є і Н У ук Ж вх ан і : дак КК я з й пе КУН хх ТОК дов і ї Н ех х яко МВ З се м т ї Н шк м ти то ще ЩЕ і і по Е ке ак КО хо ще Н : АВМ» що КУ Ко ; "ЕК ! і і ОО еусеЯв 0ВАВАНВ утен у БМ ус и МІЖ КО В Ж МЕ КК Ж М ВЕ КО Щи Ж М ї ПОЛЬКА ОО МОУ ЦО о КОКО шо Ж КОТУ ї : рекет Ковка ер я раки цю і і і і ; днк мччнттлттнА КК ААУ КАК АХА АКА ААКА КА АК АК АКА АКА ААКК КК КК АК АКА Ан АААХААК КАК КАХ ААККАК АКАД УКАААИ ЮК кккнкнккнкКЯ

   ЗХ КЗ ММ ММ У сх й щх З ве 55 же ху н- ек я їх у зу Зх Ух й й і 5 Зк Бо в к сно . й - хо я Я їх хх ОХ ОХ З ія ЩЕ еВ ой я й З вк ния х НК я ДК й 5 У ЩЕ КА З ВЕ у з 5 КЕ с З н ЗОН ї. кеш 5 ЗВ Х Са з б : ; ен щХ я І ще я Я ще 5 ах ІНН Й х. ДО я щ 5 Аня сх І КК 53 я МК . ! « наш ше з дан З. 5 дк хо хи МЕ УК їх ; ще АК 5 З ха и МОХ о в кання зе ду 3 хе хх ще -- се х В.

   ФК. В

   Фтхг. 86 СВа4Уб ОА САНЯХ зі спейсером МОРЯ динаго типу довгим (МБ АЛЛА

   ДНК, мільнра п. завинив н Октава ка еесни ВО НН ВІВ ВН ПЕС Ми повно ов Ки Ви ВК мив йв нави исвсвна н св акев ев вони Ес ес овес агвазізаназізе нава ав си звакнистйвсвіавомн сно сяви ивсвасттова се мив всзавосВес моє аесакивісваці нас арісса мів ана вина носи вина ов ав асросвоояВ ВНіЕксавосі а вве снсс а вснвов нина аа кавані кава сви ан сви е зно аатниеоеВ аква вва ВВ с Восссен вве ссавкаасвв а вав к ВВ и а ЕВАНС анЕвшевзнсвКеековВеаувиса ев ан квас ав вка Вена Вих Он КИ КІВ Я и в ко к ізе кА Вени мо ВК дакзисссовеве вен пре НО ЕК КСВ ВІВ Вів оси ПЕС ВІСН зВЕНСККЕВ НИК ВК ое ва ЕН Не аКСиКВВСНВВНВКОВ ООВВО ВВЕ ос ВкдасссеВи сви ві а ок есаремаВи ЕЧССК Н В ККВК ВКСККВ НЕЕЧЕе Ж ВА ВВ ЕН а КА КН КО и НВ а ЕК КК КУ КТ КВК ка ОО о З В в ЕК ВВ КК ТКА КА КО А ЕК М ЕК В КАВА ОК КИ и НЕК Я З АК ЗК НК М Я У вів нки кава овес висів ем аванс аа В рони вісе вив ие сазссвиконізевнисваковачнв о кн ас тикавнаессваосн засів а досади неви ссісВісВосо ване ав поетеси К ев Спи КЕКВ КК ЗОВ Сів ЕК НАНОВО СЕ пе В ВО КК ва КСО сН В КОМИ Віссанестіаси ие етанвсрессо мес аНи шНКН Віки Ен ва НК вот сваеаи мата чевес свв он аслииснасвармсввевсва винна кис ви сво наве ВВЕ екв КЕ ПЗ В С КБ ке ПЕВ Сет КК насенвснспвн сів носнсссссассво аванси сне ес иа весен КВК ие ТЕвасемКопу За Ве рване ссср св аозссасовосВ нерівне песен ікони свннананосясс навів ревесвисвавсановівевееев вс авкНесвК УЗ ЕК ЕК ЕК ПЕВ І ХК Є КК УК ВУ А ВВ КК ЕК ВК вия звезал ав Каве сві в ВВЕ Квас вав КВН НКиОЕ ЕК НЯ НО ие ВЕ ЕН ЗМК АН ВК НЕ жи Жа ККЗ КЕ А НЕ век М КАК АЧС ТКУ НК КВК МКК а КВ КВ ОКУ сеанси свісваккнссвансвн ав ксеав несаВинасас вісті ран ав сови вКае КВ ЕК ОК М у ВЕК КК хе Я УА КИ КК ЕК Ж я Я Ж В ЕВ ВУ ЕК В КН ЗК У КК КА У МК Ежена Не ЕаСПрерІВВССН Кер Вс ВН ВК ВК ОК ВН ВИК АКИсВВВеВНвО А ЕККВ ее ее Си В ЕК В ПОЗИ ВЕ ПЕК ПЕВ ОК ВК Н КУ ВКУ КО ЯМо АКЗаа пЕсовОрісванвасв анонс коваснив вка скаК Вино Нв тнівівевчнявснсскавсиисвест свое свсвка нс ники ссв Ки месник авнсяс ССОСЗ ВК ВС нив кванти оввозква нано авт рессвве вока свв ЕНН ККВСя ВТ тис свикикассассваєватссвавннке о ек еп ее Вс На ТЕСТВВІЗасарідв оо мВ с в вка ин аа аа ва сосок ти во хе КК КТ В КВ В ОК КВ ЕК С КЕ ЕВ Ок ЗК у ВК ЕК ІК А ЕК В ОТ ОБО ЗК М А Не На Ж прескакнациво аксона вав акав ана вн киева кана иви ово я сосен енЕКесВановнс вс Ост весен ов ові сви васВ основ Во ери ОВ шомесаарсю ки авто ки ндакзсвкин си кісса вестися всі висів ав вейвсвироса ве ані вана ВОЗ ана свои ер аа сосвс ан і рисове аа ає коси сво окваазвіЗси в как око М свасаао вовна Весна В нев со вов ее вефБікнізавсннисво кра сарана да с авсв іван еиссаазсав ВН Ким еиесс неаневсснаваиси внесок кокосове ве мав акивосв з Все восссВ ак саНЕ зерна асани вес сис еко австкавізаави зво ск ковсся іс свапрас те сесесвЕ КОКС со тав пис КСВ КВ СС СС пршКаДиВ екз аме сови еконо и гав Перм есва зай Зантат ан ие в воскавЕ цемававнасн Есе Ева завомиев сив аеро васв очна сазватакоа сьо ванни Нв ес ВН КК НВ ЕК Пе КВК ВВ Казан сов ово и аа кала анна на вана сінокоси а и ад ев азни ас ев КН візка нвийез нами віник КК воски В ТАК КК Ка Кі НВК ке нн нен и КС о В В З КЕ враз ана ен аранк се кр Вее в к п екв ан К аск сен мін вв нн а о В ока ВС НО ОК КК иВКВООВ ЖЕКи ЖК: СТУК ВКА ВК ВЕ В КСО В КТК ДЕ КА КА НК Я АЕНОВЯ ВЕН СВОВ ВИ ВО она кова Вовк сВсствсга вве ставом Кв сне ссвенасавааи и свои ла кіски Ким ас ові сви сова вовка аве во певна на винна и вон ен ВВС сно ве о оон ка Во са ав саван нанасиві засо ев встсавкании ванни нав ав осві сво песпимносвк нн нен овсссвиваасв нанні наван нал в се Кене а в моВа взисвезнісвасавови вана івана в Кк во вана есе иа зав Всі ие ка с о вав в І КН ЕК ВУ КН в КС Ж ЕЕ КЯ ЕК АВК ОН ЗК АЖ в ен ПЕК ВУ А ЕВ Хе М ее ЕВ ВВ КЕ У ККУ УК КК Аж КМ С ПАЗА С сс авсеВносалезасвмесесава випр ів мас те ев схасаанав вра вве скнв и ОК КК КВ ЕЕ КОН А НЯ ЕК КО ОК не ЗЕнтв И Я Я сеадимано ис сови орати ав свои а рн вата ва ВВ ваназера рев вісвансва тай віза ва ти заз и аа п івзазккв Еванс оя звацісяивассванатставовм они ов сов мив кана вар аве ван ев СК гани коп ромксяазававссвов асан оов ка Енн хнкі казки НН ссрааов нене ваксвсаднівсвав чн ос тва ра зесевізк несе в ооо п мосв ооо а зніса КЕ о НИ ОК ке НИ Ки ЕК КН В Ки Кв КО свідозсвсавесознесм вану асивссвевосвавс вва ан савкапвповесрвоакованаВе КЗ НЕ Ж З ве все С м ЕС КО яв ав са он РОК еВ КК НК ПО В В НК ККУ СТВ Як ЗК еВ Не НЕСЕ КОС КЕНЕ Нео НТК вк вас ока оси ССО аа вссром сосок ансснаас ва сЕзЕКесВисваКК ас: вискаенависвовина вс сссв есе свавссоссн осо снився нан сзве нов ВеКа садептсссроєт два іден окон мив свои вав во вс нано вони називні навсониснюва іс всвеназавк Во о яхт. 37 Сралув-4655-САВІВх зі спейсером МОРЯ дикого типу коротким ГУБ КІ ДН. мільярд в.о. замкнене мав совавсалз іван кн ес аеосізни осика из нани ен канави масива ВОВК в В Осо В Ва агавагвававіякВе вант сива вим авз и дви засви ке моста нива анонси НИ зі ние вхо ові вам лан ана увів ав аа Вимк озави ес васкесиквавсесвіввиванн навиками овес ак ника зврийвавинмоввоссзавсвнива тивів нев оссекеаливсолаваасвнвнаасавс аванси сЗдиа вл ееннив т в осссвв св ивис В вЕНо нн кавет осв совно квас вва ВС зеевиосссавни асан еВ сеанс СМ Кк ВИс каса звкзвохвсаассстса овес ки вас Есе а В осві яна Кові есная У е вн КВ НК ВКА У КК ХК КА АК ВА Я В КО М КК Км някассногвассслсвн вино кова ВН нс и вав ва ВН ати ек КВ ДН КВУ КІ КАК КК МОВ ЕК ВЕА К НА К КК Н КИ Ка Ж КА смів ска ав Как ВВЕ повара и кн Кк ивакеввакнвва ЕК Ну и З НК Зав мин и о Кк А З Конні ЗО зва иониаскезаааанк росія мс мана са вовааи ки варсвеаосе сайта навів ви Кава вовна сов ованасвасае нав ВАК МОНО сосвкв и век рВ он ви В вва снв сс вквн и асв іван еН ВеЕСОСссі вва ве а ут Вк КОВКИ а ЕК СТее Ки ОК Е В в ое внесена в вс оон Кави свсссссв оо зав зомрасаврввастазсввссосвс соки рстов оп аса дис карі кп сасва Нор к асо евро загавстван вас све ніс аосваениова ее совосваса свв анивкск иа сонваВа касета сасад стирає всостов авіа ниві ке нн все ВоК а О ис Оги осо вове не НК НОСЕНКО онов у МКК нев КО пен нос Не ВВ кВи ВЕ Внкси ван ОКХ иво Коник вв сарі сковесава вес Кс ВЗ ВОК У КВ КК МК ОВУ в А В КАВУ КТК Весавкс вив ве ос КН сі во Еся ВВЕ рссогінес п снвовианикассавенин а сяавсрех НЕО ЖУК ХА КК КВК о В ие ин и ЖАКА Я ОО НВ о С ПО Кн КК ЕН ВЕ З НЕ Кк Зо а ОК НН ен В ВОК КЕ КК КЕ В ЕК ЕК КК М ВЖК КК Ек І МЕ ЗК Я ВЕ КМ ВЕ ТИ МВ ОК ЕЕ и кажи КИ СЕНОВСН СВО ВАВ Ес ив наве с В ВсК око КК Вовка вва А ЕК ОО КН В ЗКУ КК вик КК КЕН НК я ЕСЕ ВЕ Кв Зв и в Я СК Ж в Ір о ЗК а ор як я КЕ ген сзет сов кВелокснавсВ св каві Вес ово став Ве каско со вна НО КН КО КО КЕКВ Я ОУН ке осК М с Я ке ня КЕТЕАН я КЕ оККЕ НА ВВ в Кора о ВВ НЕ В КК А КТ СМБОСВОсСсЕНиеКево иа вис иенссссиссе сви свв оспісвен осо ад авсвесокиВеоовва Гео НЕ КВН УТ ЗЕ КОЗА ВЕ ЕЕ В НВ: КЕ ВН ИН КК ТеСТНВоВ рес НКВаавес вав ивани со аку ване вас ана аствсакав ана и осо ани скоро зн НК КЕКВ а ОС и Пк ке ее ен Сея Ме КК КЕ КО КВОТ ОК ТАК Тонке В В КЕ Я ек гвресезавенакавиевкосві вна ананаса и ав ЕВо раси Кс зисавсизаа ав уосви миски ававнне вас ие сан нив ов а Тквма аа Вікрессваасаин твіти нео иствикессавн ви ев наві и виносвазсави ВВА зарсарвтесікосссниствкевссво ва осно всрвик нос ансав сив Ни са св ние ссезвевоівЗа осв Назара в св ово М Мокре еВ ває зсвавосввеихнинес авт осва пе тввковорседЕ маси сеанс овиВ и ас сва ве ЕС ПрИККВА НОМ еВ Ва на стревісавров ВВ ов са сво вся ва ов нава ев Вази вени осВі ва ка ве і СВ ав вн вав соки а а ана ЗивЕе ЧОН а ИН КЕН КИ ПІ ЕК ЕК ки нН вавня я зезсрижсани вес аси нале авни ласі азЕ киев парт сссво ванна вівовсіа я а канони ка на В о кіна В рені вва ВІКНІ ТЕ НТ ВВ ВАВ ВЕ ВВ КЕ КИ КА СВ КЕ ВВС В ЕВ ВВ покупок Ки кінза ванни а віника васн соска свв М рана сававі сна Тека наноси Во ов внвазавоссть ек иакссва ази вес всаре ан о опера БА А ві в вн і КА в ав ЕМ МК внісвсвс всі вот сс сарізсаН с нев реснеВіви и анемони сиве еовеси сво Все Е Кене естистсссн мое асан яса вав СКии викрив свои Вас сНиЕНг певовиос ооо мВ ке і н і дке дата та нВ саке оісвне вс снеки вав екв сеанси миритнинсезАтасансвая В м смена танессдатваннспсавіва тн вааназнваанзк кара нов ЕВ ес віСВ сом В В веве са Вес ес а ссс вана сво ин ваза кс ЗВ евЕ ідсесвев не есВі свати е тва вок ва есКаЕ и М св с осевнев сви а весно В снеки НИ вів вас вив аванс ве ас кар о ВН Вовка вавазасва насос асавевае кана Кон винВс во овасевс стса сиве зно ева КК аистаВосце вс оно вка нн ОК Кі квр ас вив КВН ер осВа сива свае кексвівсассвсв ни века евовис НН ки вснсвласта ма сівЕсваВстВси Вени зие м сссвиоваеВв ам ав ЕЕ ЗК ЗУ КК КК ВОК Ки я В С КВН пі ЗНЗ ЕК ЕЕ У НИВУ св СН МУ Ті КУ зисинисввсаи нев вссви ки вавиес се вів а ст аса са синк о свв еси Нива ваВ з насНае дк косвак вес авнев коки сан сс ав пае а а ов ва аа сви нан За Зав таввіжавав с и мкаснн с смезссава т еспав ваимснм сс рансрісзва є свізиа нав неза и с какао мМи Оголена всваани вас совст сао ее носик вісвакваассаВо ви цеЕ дашвінасес повнова каса смак нос ви чне сс сви ва вівневе кі асВ Є МеВ ІДЕ Вс ВЕ виз ш сс весен и ве нВсісв вна сеВЕИасоКеВ ни исесаденх Ве СЕУ У ЗК ОК КК ее ЖЕ В А ЗНО ВАН КА Я КЕ: НЕТ Не КН она Б ВИ КВ КК в А НИ ев ТЕН ОвссВК кас вав ва нт В ка осн икик сна нс вна аивсвсспосаснскносНЕ Орос и кос на нн ОК В я пе ВІК ВО я ЕЕ ОК по в ок Кент яки ме Ки МеКООЕК в БУ я М Н в еЗс ОЖ Ав я НО ВАК Ат а В ЕК ВК З ККУ Я НК ВА

   ФІГ. й СБаДеБ ОБ САНОВХ зі спейсером (МОРЯ мутованим довгим (Б ММ

   ДНК, мільнод по; ване вав аатаси соска візаві вки вив ваВаВИ ЗК завів сс азам Нм саа Овна ие Ес ВаиК ЕХ віваасвазноі вас ввнаскав ни и сво ансемсснс сви кава вано риси во зилнісвинасави оса рові евкам ов есова мо Ква сі еВ а В аа вн да ооо Ка низкесазвн екс аа вав ев оеван вас івана ваза ва сви свое ві сви васвіеовас зими книссзааснина о ин ав ес доссе вв врата воа ва вин акіовізвиеви с мососви і озквпосва ванна рію есе сосни вис иВОМсВвВх заеозессова риса ке м а аасіавое сновок ноне на етос навеена а зве авоссасовнрвсв и мохи арсенал Ви Ов терасісво Тов Вове осн ак на вас СВ ДЕН сива снв НИК АК АН НА я о ЕЕ КН Кі КЕ сив же іван стерво врата она сасссви ово вЕ ниви Св ее КА ВН р КК АВ НА ВЕК ЕЕ В ВК ВН КВ З УНК КВК ссзванвин ов на п испісни наро оавио ово КО вовни Не ЕГО ЕВ КО КА АК В КВК В ТА НЯ ТАК В Я КК КЕ Ма свиковок винну вини он кис авансові сн ин кока висо ае ВиКаск мис ее ВВЕ М КК Ве ВЕН Нав ВК вки ик Ікеа ОЗ я а НМ КК вок Кен КВ Ки КК кни З ВЕК ККУ о ек Косі КА ее ее сво СК ТА КМ е Я Коси ПЕ и ЕЕ Ус Я ВС НЕ Ко ок пек В Ж Кв Кс Ж НО КЕ Кок е Кс а ве ов и я Су Я Ве В КТК КУ Во ЕК ОКО оо Кая КОСОВО ТЯ НК РН ЗК ЗОВ НЕ ЖЕ ЕВ С ВКА ЗК ЗК В и Ж БЕК ТЕ КЕ М ОК РН вен івсвсовіостнсівастесо ково ан ев смсвся с виносок пров осо ни вх КК А А КА О ВВУ ВАИ К ВЕКЯ Ки КОВО вв М В ЕМ В я пеки ее ВЕК Ж ЕЕ ЗК СЕК ТЯ КО КО КК ЕМ З в В КК вежа вавс вано осивова Косово вв ан вив вевиСКеваса Кавове Зисндестрива скани вес Вогни осо спро сооснас Кв ов Вона во нов їн В ОЧКА ЕК НОВ С До З БНО У Км КЕКВ МК В СК ВК АС КЕНЕ авовисневсспсакозввеевас во иви ва савв есе вк висо вка сарана терну акасксни хна свист вниз свисиссиввавсн ін нево иа ви Вев они КЗ ЯК КН НК КК ВК ВЕ КА А Зв ог асассеав свв віВсВва еко косі ена Кв евнессп осо рови нессаа вон Кок васвдсдовасссановнов ня киева стае асан вн стіна киев ор о ніна АСК КЕ ЕК А А ЕТ КЕ ОО КН В КС КК ие івІкавваннвсвавс ас вана ско вв тва кавова сно ни коса ска а БЕСТСК КЕо СКТК Е МК КО З ОК ПА ов м ву от ик ее КК жК и Іде всгі т са В ВО КВК В В ово нок ов сс сван в а кеНі ее ет ее ру ст НЕ В ЕЕ ОК ПЕ КСОВ К У З КО ЗЕ ПОН ж сзомевасВікас в еро мне ссоосв не Ве ССС есери а вка все спдсВенаве вин сис ково нина пе все нося вс васдпрс са Веде ква заВинані св Вик сва ЕЖНаСЕТНЕС ВККС щоки в о паоккрВ ак овакавсс ско ванно ис ин нсавиана ав вия весесавав тва сови ввесанквв ВК кв ка КВ сови вка осавинасн сна сКНе ВеСпсВса ев ве се ВЕ ОН ор ан Ва Ен яна неси касок сс арок вити Касіснасва насоса анс тик ВМ сов варив и Ви оса н В кввантох зачекати ваавснесви нос віквавнаж сна ивнавізеанава св квави нави оВо ВІНОК В А КАК и ВВА НУ В о ВН ЗК асвана струк е вас с воссоввовиноссвавчасив в с ссво вв Ввести Ва Зх ЗІНвек вве сеспвви Во Нм есе ка вла весавісви нев ово Новое сток ЕК А и и Я еВ В НЕ КН КВ еВ У УНК КК В ев м а ОК Км ЕІ у В КК Я КК ЕВ А ЗОВ ОК З С КН ЗА ВВ Я вне пбавва мічна неси вав нас вес кава азни ев и В кока а Ва закнізкнств ами сс мс кан чес пе ни а В пк вва пт зазанесасвсі ан совка ва ав варене ве сан еостВМсВв о осо Тазре паса авсви Нек сн ака невинна Нр и ЕЕ Васі ваз Не Кен акУ ЗиН ЕНОБК С НА Н, К КВ Я ОЗ З КП Сов в ЗВ кВ НО в КУ КО ВК вені ниві ев кава м Ніно іван евсве сво ВК сани ові ВВкаєзе зкспиаснаксилеезансвс ев кіно са вівасткки азастесв ма нон писано сно КЕ У Кв я ізо Мн ав ТАКУ МК ЕК КО КУ З Не НН ви ЖЗУ се де ве сво кс всас соєве ки ссксВі а ав ссосюВвсвоссдюся свое явексвоідасесесп кеВ сно есонасва вс вас сени нс сова в КИ сасевісіквсра ВЕК ана КЕКВ СЕ ак вЕВІ КН сна вати ав вс ов иВНЕ зкорокквасрє в певен на сін но ен канава аос т еВін а НЕ авіа еваззневай Вага ак ова се в В КН есН В ве У В стсвоссзка аск евро ззавізназнації КТС ее Я ін КТ ВН НК В А СТЕ В В ВЕУ Я енативавцн ек и ема ан емммкаснеснвисвваза сив о сао ес ані вано Івернвосери всяка ас сви м вас вана а а тесв соска азся тн овесвасиння «ва сзНскеНсвиз низ совавкиза сі сне мі ковсва см кве е ВВ Вена сосен аа ква ВОВК кежхнУннн вас вк свідо не вве нка е новив Ви а ВО ва ПВ НВ вКа сага ан ву КЕКВ рвав Ки нн чо Зам Ку У МНК о ев В Кок КЕ КЕ о Овес ок Те КЕ КК заагакасвиа неви ав сто кам аввсанеиннві св нова сві ОН В на вагпізззавнви иа аа сек немов осо мав ав св ск кос НВК ва савани МСЕ ем ос веева вимо нев асаавав вас ва ЕВ вен с аиа ри Сезам свв еЕссвесакнроковеаесваата ТЕКСТ ВетвК Зеник Во СХ каста есісве ве ВВ ас есвее в сю ев Касове м еко кана вва юне В ен в ста ММ УК НА нн ен І НЕК еназавевссаевс това внесе о ен ЕК Кис вив вва зсвковев осо асвавонс вен козкиника ЕН КК ОК о нн а А А нія у Ж и ЕК в кепа ВОВК СН ВВС Вс КВ ап Ні ов око Ва НВ ЗНОВ А ЕК СК те КЕ ЕК Кол Не ЕК АВ Ка КК и кеЕНнехссвас мав свисвсввоввв м сссюенаверсики с кавевса вера аа іван всі сис нВкЕ ме о С ВВ СС КО то с в ка во ех. 25 СПЯЯуУБ-Я059-САНІВУ зі єпейсером ММОРА мутованим коротким (ув ММ ЛНК, мінзяро пос. завис авневк осі зара сссваа сиза магазинов ен вос ви оВенспов нави аносиВЕ низасе назва вас нак ВН В свв новив аівівсаав са сс т ассваВияї Відавізананолвро ази а ис са ав оес песто касові ване в вад нвосВЕ ие вістку сакивісви сосни сват ова на ванни вам атаса вав аа се ВВаВ ВиТЕВснавеавснвактан ковим есе иван иа ни ока ск навмисна зускзасвінассивскн вині ван Ессен кино са Вксу кіна скоса оствакев санок овес нрев ками вааомНи Не зро ос ани плани ве кава зссавіся внесе ВО см свонс атлет м ве ззаекоссвова оті вени вес ос ра Каси В кванти совіти іні екс кКанив сн ваква насос вісвЕс ЕВ ВЕН СЕН КОКО вив екасссвс оси я ен ис аксвс НВ нап ав Вик а ВС ВЕ ізвизеаав осн неви ов онко са нст КВ КОВО В ее ие ен ЗК КК КІТв Ж и о ву мА КК КЕ ВАЗ С ЕС ЕКОН а ние ЕЕ КБУ с ОК на я НК КЕ КК КК В В Ко вс КО ЗВ ЕК В Кв еЕм Я ІНФфЦЕІН ОН КЕКС тв вас аретазк квт аніс вва Клин иа сазссніснекнка ніс акевнакасв рес ис возів иссв м ав во нев осксвве свв ав кервсссвісносив вени Не КН вові ен весно інв КК песоссссек увести ак вано Кс сс ссвссссві ме ессс вав есе Всна о ДаТОССЕсИ кеВ танкові вносив а вок роко вів ав ака івасавесосттвсван сам всвнемн в сави визнав вве савівссває паса ака он касові кис екінни пи вок са свв із анавовваиссіснсівванне васспасисові івано ово ве євавні сов овсзнос кос Ко Кі СКК тенесеве о ав вс ев наве сосок во вет е осв нов осне свв нот каовсВкане ореноосе и Ван Вс к на В КО Нес рисок саВовВовисвік ав ак ово освиса ва нисенє ЗНЕСЕННЯ ТЯ Вр ВЕН В В ОВЕС ВАВ СОМИ КЕКВ Во, кв свваКнса свинка аванси ен КН в в в о в Кк ЗМ ана З зання зведеЕсО своими ин ісскасВЕнОсвннсів Нр вести сивоса знов Косино пермізессниаснневі сови, сві ковескнвсаеноси лено Зо озна ис ВО КНрескОвия ЕЕ КК В КЕ ВА НЯ ЗЕ ВК КК В КК НОЯ ЗВ ЕК ОН В ВК В КД КН с с вав иа Ме МК ВЕ КСЗІ ОВС ЕК: КК С ЕВ МК КК ин У ЕКС З КМ КВ В ОК КЕ ВОК З и с З КЕ КК я ВА Ве НЕ КІ р С В ее А ГУ у они в и Я ВЕ НОВ ОО ЗК ЗК Ки в я КВ ЗК Те в ее Я СКК Я венстовевсзв ас вавс касі екс ово ооо ниосснвсс рас квот естосасс во вснвемквсВное ее КЕ В КЕ ЕК ЕН Я КЕ КУ ВК КК и Я ЕЕ ЕЕ ЕВ В НН Не З в КН ВЕ Я ЕМВ НЕ З СО ВЕК ВЕК ЕН У ЕК У Ви а м КЕ а Р кассзаквесяека а овес реве В сне та вся ксвас сенат СО В ВВ ааКо вка кІконссакном аа М дені свасне ов сов ср ваост тан сна вс авіа інаанн ак скев ав