JPH10313868A - 膜局在型ｚａｐ−７０を用いた免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 膜局在型キメラタンパク質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含む組換えベクター及び形質転換細胞、
免疫賦活化方法並びに免疫賦活剤の提供。 【解決手段】 配列番号３若しくは４で表されるアミノ
酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、免
疫賦活活性をもたらすタンパク質をコードするＤＮＡ、
該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターによ
って形質転換された形質転換細胞、前記ＤＮＡを免疫担
当細胞に導入することを特徴とする免疫担当細胞の賦活
化方法、並びに前記形質転換細胞を含む免疫賦活剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制活性を有
する膜局在型キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターを含む形質転
換細胞、免疫担当細胞の賦活方法、及び該形質転換細胞
を含む免疫賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】担癌状態の動物においては、免疫機能の
低下が起こることが知られている。ここで特に注目され
ることは、免疫応答の調節に重要な役割を果たすことが
知られているＴ細胞において、癌細胞の抗原を認識する
レセプターの発現が抑制される点である。従って、たと
え正常な動物の免疫系が癌細胞に対抗し得る能力を持っ
ていても、担癌状態ではその能力を発揮することができ
ない。免疫系が抑制されると癌細胞に対する免疫応答が
減弱することから、特に手術の難しい部位の腫瘍、又は
転移を起こした小さな状態の腫瘍を取り除く上で大きな
障害となる。

【０００３】一方、癌の治療に使用される化学療法剤
は、激しい副作用をもたらすのみならず、免疫系の応答
を極端に抑えてしまうため、最終的には日和見感染によ
り患者に死を招くことも少なくない。以上の点から、担
癌状態において免疫系を活性状態に保つことは極めて重
要な課題である。

【０００４】ところで、ZAP-70と呼ばれるタンパク質
は、細胞質に存在してＴ細胞に特異的に発現するプロテ
インチロシンキナーゼである。ZAP-70は通常は細胞質に
存在しているが、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）から
の刺激が細胞に加わると、ZAP-70はレセプターのリン酸
化によって細胞膜に移動する。この移動に伴ってZAP-70
の活性化が起こり、ZAP-70はチロシンリン酸化を受けた
抗原レセプターに共通して見られるモチーフ構造、すな
わち免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（Immuno
receptor Tyrosine-based Activation Motif; ITAM) と
結合する。そして、リン酸化機能によりさらに別の分子
へと情報が伝達され、細胞の活性化が引き起こされる。

【０００５】ZAP-70を欠損する患者由来Ｔ細胞ではＴＣ
Ｒ刺激に対する応答性が全く失われていることから、ZA
P-70はＴＣＲのシグナル伝達に必須のものであることが
明らかとなっている（Elder,M.E.et al.,Science,264,1
596-1599(1994); Chan,A.C.et al.,Science,264,1599-1
601(1994) ）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、膜局在型キ
メラタンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組
換えベクター及び形質転換細胞、免疫担当細胞の免疫賦
活化方法、並びに免疫賦活剤を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、ＴＣＲの刺激を行わず
にZAP-70を細胞膜に局在化することにより、細胞を活性
化させることに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号３若しくは
４で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において
１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れた配列を含み、免疫賦活活性をもたらすタンパク質を
コードするＤＮＡである。タンパク質としては膜局在型
プロテインチロシンキナーゼ（例えばZAP-70）が挙げら
れる。そして、前記ＤＮＡとしては、例えば配列番号１
又は２で表されるものが挙げられる。

【０００９】さらに、本発明は、前記ＤＮＡを含む組換
えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベク
ターによって形質転換された形質転換細胞である。該細
胞としては、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細
胞又は好中球が挙げられる。

【００１０】さらに、本発明は、前記ＤＮＡを免疫担当
細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞又は
好中球）に導入することを特徴とする免疫担当細胞の賦
活化方法である。さらに、本発明は、前記形質転換細胞
を含む免疫賦活剤である。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、プロテインチ
ロシンキナーゼであるZAP-70に膜結合タンパク質が連結
された膜局在型のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ
である。本発明のＤＮＡは、ZAP-70をコードするＤＮＡ
（ZAP-70ＤＮＡともいう）と、膜結合タンパク質をコー
ドするＤＮＡとを連結させることにより、また、ZAP-70
のSH2ドメインを欠失させた SH2欠失型ZAP-70をコード
するＤＮＡと、膜結合タンパク質をコードするＤＮＡと
を連結することにより得ることができる。さらに、ZAP-
70又はSH2 欠失型ZAP-70のアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変
異型のものと膜結合タンパク質とのキメラタンパク質を
コードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。本発明
のＤＮＡは、以下の工程により得ることができる。

【００１２】(1) ZAP-70をコードするＤＮＡ及び膜結合
タンパク質をコードするＤＮＡのクローニング ZAP-70をコードするｃＤＮＡの塩基配列は既に公知であ
るが（Chan, et al.,1992.Cell,71,649-662 ）、市販の
Ｔ細胞由来のｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社、Cl
onetech 社等) から公知の方法（“Molecular Cloning
”,J.Sambrooket al.,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,1989)により新たにクローニングすることができ
る。例えば、ZAP-70の塩基配列の一部（オリゴヌクレオ
チド）を化学合成し、これに結合するクローンをｃＤＮ
Ａライブラリーの中から同定する。

【００１３】一方、本発明における膜結合タンパク質
は、膜貫通タンパク質（ＴＭ）及び細胞外ドメイン（Ｃ
Ｄ２と呼ばれる）からなるタンパク質複合体である。該
ＣＤ２及びＴＭをコードするｃＤＮＡも公知であり（Mo
ingeon,P.et al.,1989.Immunol.Rev.111,111-144）、Ｃ
Ｄ２及びＴＭをコードするｃＤＮＡを新たにクローニン
グする場合も、ZAP-70をコードするｃＤＮＡをクローニ
ングする方法と同様の方法により行うことができる。

【００１４】(2) ZAP-70ＤＮＡ又は欠失型ZAP-70ＤＮＡ
と膜結合タンパク質をコードするＤＮＡとの連結 (i) ZAP-70ＤＮＡと膜結合タンパク質をコードするＤＮ
Ａとの連結 ZAP-70ＤＮＡと膜結合タンパク質をコードするＤＮＡと
の連結は、これらのＤＮＡを適当な制限酵素で消化した
後リガーゼを用いて連結することにより、又はZAP-70Ｄ
ＮＡと、膜結合タンパク質をコードするＤＮＡとを適当
なオリゴヌクレオチドで結合させることにより行われ
る。

【００１５】あるいは、上記(1) により得られた各ＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲ（PolymeraseChain Reaction)を
行ってそれぞれのＤＮＡを増幅し、両ＤＮＡを連結して
もよい。この場合、プライマーは以下の通り合成する。

【００１６】(i-a) 膜結合タンパク質をコードするＤＮ
Ａを増幅する場合は、５’側プライマーについては、膜
結合タンパク質（例えばＣＤ２）内部であって５’末端
側の適当な領域（例えば５’末端から３’側方向に30塩
基程度の領域）の中から15〜30塩基のオリゴヌクレオチ
ドを適当に選択し、合成する（図１(a) ；プライマー１
という）。３’側プライマーについては、ＣＤ２の膜貫
通部（ＴＭ）の細胞内部側の領域（図１においてＴＭの
ＳＨ２側の領域）と、ZAP-70のＮ末側にある領域とがと
もに含まれるものを合成する（図１(a) ；プライマー２
という）。

【００１７】(i-b) ZAP-70 ＤＮＡを増幅する場合は、
５’側プライマーについては、上記プライマー２と相補
的なものを用い（図１(b) ；プライマー３という）、
３’側プライマーについては、ZAP-70ＤＮＡの内部であ
って３’末端側の適当な領域（例えば３’末端から５’
側方向に30塩基程度の領域）の中から15〜30塩基のオリ
ゴヌクレオチドを適当に選択し、合成する（図１(b) ；
プライマー４という）。

【００１８】ＰＣＲの反応条件は適宜定めることがで
き、上記のプライマーを用いて各ＤＮＡ断片を増幅（一
次ＰＣＲ）する。ＰＣＲ反応は公知の方法（J.Sambroo
k, et al., “Molecular Cloning", ColdSpring Harbor
Laboratory Press, 1989) により、あるいは市販のキ
ット（Perkin-Elmer社製等) を用いて行うことができ
る。

【００１９】次に、各増幅断片を連結するための二次Ｐ
ＣＲを行う（図１(c),(d))。二次ＰＣＲの鋳型として、
上記一次ＰＣＲの反応産物をそれぞれ混合したものを用
いる（図１(c))。また、二次ＰＣＲに用いるプライマー
は、５’側プライマーとしてプライマー１を、３’側プ
ライマーとしてプライマー４を用いる。二次ＰＣＲの反
応についても、一次ＰＣＲの場合と同様である。

【００２０】(ii) 欠失型ZAP-70ＤＮＡと膜結合タンパ
ク質をコードするＤＮＡとの連結 本発明において、欠失型キメラZAP-70とは、天然型ZAP-
70のＳＨ２部位を切断した断片（欠失型ZAP-70）と膜結
合タンパク質とを連結したキメラタンパク質をいう。従
って、欠失型キメラZAP-70をコードするＤＮＡは、天然
型ZAP-70ＤＮＡを適当な制限酵素（例えばSacII 、EcoR
I 等) で処理してＳＨ２をコードする領域を欠失させた
のち、得られるＤＮＡ断片に、膜結合タンパク質である
Src1-14(ニワトリSrc の第１〜14番目のアミノ酸；Take
ya,T. and H.Hanafusa.1983,Cell32,881-890)をコード
するＤＮＡをリガーゼを用いて連結させることにより得
ることができる。

【００２１】(3) 本発明のキメラＤＮＡの変異型の作製 本発明では、ZAP-70ＤＮＡおよび欠失型ZAP-70ＤＮＡに
変異を導入することもできる。変異の導入は、公知の方
法、例えばＰＣＲを用いた方法により行うことができ
る。まず、ZAP-70ＤＮＡ全体のうち、変異を導入する部
位を含む断片を適当な制限酵素を用いて切り出す。次
に、変異させた塩基及びその変異部位の前後10塩基程度
の塩基を含むプライマーを、センス鎖（センスプライマ
ー）およびアンチセンス鎖（アンチセンスプライマー）
としてそれぞれ合成する。そして、変異部位から数百塩
基５’側に５’側プライマー（プライマー５という）
を、及び変異部位から数百塩基３’側に３’側のプライ
マー（プライマー６という）を合成する（図２(a) ）。
さらに、プライマー５とアンチセンスプライマー、及び
プライマー６とセンスプライマーとの組合せにより２つ
のＰＣＲ反応を行う（図２(b))。最後に、その精製物を
もとにプライマー５及びプライマー６を用いて２次ＰＣ
Ｒを行う（図２(c))。この産物を精製後、適当な制限酵
素で処理したのち、同じ場所を制限酵素処理した残りの
ZAP-70ＤＮＡに結合させ、変異が導入されたZAP-70ＤＮ
Ａの全体が完成する。

【００２２】図３に本発明のキメラＤＮＡの模式図を示
す。図３において、「ZAP-70」は天然型ZAP-70コードす
るＤＮＡ、「CD2/ZAP-70」はZAP-70にCD2 及びTMを連結
したキメラタンパク質コードするＤＮＡ、「CD2/ZAP-70
(A369)」、「CD2/ZAP-70(F492)」及び「CD2/ZAP-70(F49
3)」はZAP-70の第369 番目のアミノ酸をアラニンに、第
492 番目のアミノ酸をフェニルアラニンに、第492 番目
のアミノ酸をフェニルアラニンにそれぞれ変異させたと
きのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに「Sr
c/ZAP-70」は欠失型ZAP-70にSrc1-14 を連結したキメラ
タンパク質（欠失型キメラZAP-70）をコードするＤＮＡ
である。

【００２３】上記連結されたＤＮＡ断片を保持するため
のプラスミドＤＮＡには公知のプラスミドベクター（例
えばStratagene社のpBluescript 等) を用いることがで
きる。プラスミドＤＮＡは、上記ＤＮＡを消化した制限
酵素と同一の制限酵素で消化しておく。

【００２４】上記それぞれのＤＮＡとプラスミドＤＮＡ
とを、公知のライゲーションキット（ベーリンガーマン
ハイム社）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。
次に、得られる組換えベクターを大腸菌JM109 、HB101
、XL1-Blue等に導入した後アンピシリン耐性コロニー
を選抜し、公知方法に基づいてプラスミドＤＮＡを調製
する（J.Sambrook, et al., “Molecular Cloning", Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 。

【００２５】目的とするＤＮＡの塩基配列は、上記プラ
スミドＤＮＡを制限酵素で消化した後、公知方法（例え
ばジデオキシ法）により決定する（J.Sambrook, et a
l., “Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Labor
atory Press, 1989) 。本発明では、例えば市販の自動
塩基配列決定装置を用いてもよい。

【００２６】このようにして決定されるZAP-70と膜結合
タンパク質とのキメラタンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列として、CD2/ZAP-70をコードするＤＮＡについ
ては例えば配列番号１で表されるものが挙げられ、Src/
ZAP-70をコードするＤＮＡについては例えば配列番号２
で表されるものが挙げられる。

【００２７】ただし、配列番号３又は４で表されるアミ
ノ酸配列を有するCD2/ZAP-70又はSrc/ZAP-70キメラタン
パク質がキナーゼ活性、特にプロテインチロシンキナー
ゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列に欠失、置換、
挿入等の変異が生じてもよい。従って、例えばZAP-70の
アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Met)が
欠失しているものや、第492 番目のチロシンがフェニル
アラニンに置換しているものを含むキメラタンパク質な
ども、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含ま
れる。また、本発明のCD2/ZAP-70又はSrc/ZAP-70キメラ
タンパク質に含まれるアミノ酸をコードする塩基配列の
ほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチ
ドをコードする縮重異性体も本発明のＤＮＡに含まれ
る。

【００２８】(4) 組換えベクター及び形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを、形質
転換の目的となる細胞、すなわち免疫担当細胞（例えば
Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞若しくは好中球又
はこれらの前駆細胞など）にに導入することにより得ら
れる。発現ベクターとして、例えばアデノウイルスやレ
トロウイルス由来のベクターが用いられる。従って、遺
伝子導入法は、それぞれのウイルスの増殖欠損性の株に
よる感染法が用いられる。

【００２９】(5) 免疫担当細胞の賦活化 本発明では、免疫担当細胞に本発明のＤＮＡを導入する
ことにより、免疫担当細胞を賦活化（活性化）すること
ができる。免疫担当細胞は、生体内で主として免疫反応
を司る細胞であれば特に限定されない。例えばＴ細胞、
Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞、好中球又はこれらの前駆
細胞などが免疫担当細胞として挙げられる。これらの免
疫担当細胞は、血液、脾臓、胸腺、骨髄、リンパ節等か
ら調製することができる。さらに、これらの細胞の他に
樹立した細胞株を用いることもできる。

【００３０】Ｔ細胞は、一般に周知の方法（セルソータ
ー法、マグネットソーター法、ナイロンウールカラム法
等）により調製される。例えば、Ｔ細胞に特異的に発現
する表面抗原であるＣＤ３分子に対する蛍光抗体により
細胞を染色した後、これらをBecton-Dickinson社のFACS
-VANTAGEなどで分離する。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥満細胞
及び好中球についても、上記方法と同様にして、これら
の細胞に特異的に発現する表面抗原の染色及びセルソー
ターの利用により調製することができる。

【００３１】次に、このようにして調製された免疫担当
細胞に本発明のＤＮＡを導入する。本発明のＤＮＡを導
入するには、増殖性を喪失させたアデノウイルスやレト
ロウイルス株による感染法等を用いることにより行うこ
とができる。

【００３２】以上のようにして調製された免疫担当細胞
は、本発明のＤＮＡ（CD2/ZAP-70、Src/ZAP-70又はこれ
らの変異体をコードするＤＮＡ）が発現することによっ
てZAP-70が膜に局在化したものであり、免疫賦活活性を
有する。なお、該免疫賦活細胞の活性は、活性化Ｔ細胞
の核因子（NF-AT; nuclear factor of activated T cel
l)の活性化やIL-2レセプターの発現などを指標として測
定する。

【００３３】(6) 免疫賦活剤 本発明の免疫賦活細胞を免疫賦活剤として使用する場合
は、使用する対象を特に限定しない。例えば、個々の免
疫機能が低下した疾病を予防又は治療することを特異目
的として用いることができ、その疾患の種類に特に限定
されないが、主として癌化学療法後の免疫抑制状態、感
染症等の治療又は予防に有効である。

【００３４】本発明の免疫賦活剤を投与する方法として
は非経口投与が挙げられ、非経口投与には、注射、例え
ば静脈注射、点滴静注、組織内注射等が含まれる。ま
た、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回
数により異なり、広範囲に変えることができる。この場
合、本発明の免疫賦活剤の有効量と適切な希釈剤及び薬
理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有
効量（有効細胞数）は、１×10⁵〜１×10⁷細胞／kg体重
／日であり、１日１回から数回に分けて１日以上投与さ
れる。

【００３５】本発明の免疫賦活剤を非経口投与する場合
には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を
含有し、要時調製する。また、本発明の免疫賦活剤を投
与する際に、種々のサイトカイン（例えばインターフェ
ロン等）を単独又は適宜組合せて添加してもよい。

【００３６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例１〕キメラタンパク質をコードするＤＮＡのク
ローニング (1) CD2/ZAP-70キメラＤＮＡ ZAP-70をコードするｃＤＮＡ（ZAP-70ｃＤＮＡ）及びCD
2 をコードするｃＤＮＡ（ＣＤ２ｃＤＮＡ）は既に公知
であり、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡを作製するためにこれ
らのｃＤＮＡを使用した（ZAP-70：C.M.Iwashima et a
l.,1992.Cell,71,649-662; CD2 : Moingeon,P.et al.,1
989.Immunol.Rev.111,111-144) 。

【００３７】まず、ＣＤ２ｃＤＮＡの膜貫通部の直前に
ある制限酵素NdeIの部分とZAP-70の5'端にあるSacII の
部分を合成オリゴヌクレオチドで結合させることにより
行った。この際使用したオリゴヌクレオチドを以下に示
す。

【００３８】センス側：5'-TATGTGGAGGAGGCAGCCTCTTGAT
GGTCTTTGTGGCACTGCTCGTTTTCTATATCACCAAAAGGAAACCAGACC
CCGC-3' （配列番号５) アンチセンス側：5'-GGGGTCTGGTTTCCTTTTGGTGATATAGAAA
ACGAGCAGTGCCACAAAGACCATCAAGAGGCTGCCTCCTCCACA-3'
（配列番号６） その結果、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡについては配列番号
１で表される塩基配列が得られ、そのアミノ酸配列は配
列番号３で表されるものであった。ここで、配列番号１
で表される塩基配列のうち、膜結合タンパク質をコード
するＤＮＡの配列は第１〜654 番目であった。また、ZA
P-70ｃＤＮＡの配列は655 番目から３’端までであっ
た。

【００３９】一方、Src/ZAP-70キメラＤＮＡについて
は、ZAP-70ＤＮＡの５’側非翻訳領域（-1から-30 番目
の位置) 、ニワトリSrc の第１〜第14番目のアミノ酸残
基及びスペーサーアミノ酸（グリシン）をコードするオ
リゴヌクレオチドの各配列が含まれたＤＮＡ（配列；5'
-ACGTCCCCAGGTTTCGGGAGGCCCAGGGGCGATGGGGAGTAGCAAGAGC
AGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGCGGG-3'(配列番号７））を、ヒ
トZAP-70の263 番目の位置からＣ末端までコードするＤ
ＮＡ断片の先端に連結した。その結果、配列番号２で表
される塩基配列が得られた。また、そのアミノ酸配列は
配列番号４で表されるものであった。

【００４０】さらに、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡのうち、
ZAP-70ＤＮＡの一部に変異を導入したものを数種類作製
した。これは、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡのZAP-70部分
を、制限酵素及びリガーゼを用いて変異型のZAP-70ＤＮ
Ａと取り替えることによっておこなった。使用した変異
型のうち、A369(ZAP-70 のアミノ酸配列の369 番目のリ
シン(AGG) をアラニン(GCG) に変異させたもの) は既知
のものである(Iwashima,M.et al.,1994.Science,263,11
36) 。

【００４１】A369を作製したときと同じようにして、F4
92（ZAP-70のアミノ酸配列のうち、第492 番目のチロシ
ン（TAC)をフェニルアラニン(TTC) に変異させたもの)
、F493（ZAP-70のアミノ酸配列のうち、第493 番目の
チロシン（TAC)をフェニルアラニン(TTC) に変異させた
もの) 、K37K190(ZAP-70のアミノ酸配列のうち、37番目
及び190 番目のアルギニンをリシンに変異させたもの)
を２段階ＰＣＲにより導入した。一次ＰＣＲのために使
用したプライマーは、F492については以下の通りであ
る。

【００４２】(a) ZAP-70ＤＮＡの塩基配列1591-1615 に
相当するＤＮＡ(5'-ACCTGGCGGCCCGCAACGTCCTGCT-3'（配
列番号８) (b) F492変異を含むアンチセンス鎖(5'-TGAGCGGGCAGTGT
AGAAGCTGTCG-3'（配列番号９） (c)F492 変異を含むセンス鎖(5'-CGACAGCTTCTACACTGCCC
GCTCA-3'（配列番号１０） (d) ZAP-70ＤＮＡの1820-1796 に相当するＤＮＡ(5'-CT
GGCCGTAGGACAAGGCCTCCCAC-3'（配列番号１１）

【００４３】ＰＣＲは、(a) と(b) 、(c) と(d) との組
合せのプライマーを用い、ZAP-70ｃＤＮＡを鋳型とし
た。そして、Ampli taq ポリメラーゼ（ロッシュ社製）
及び付属のバッファーを含む反応液中、94℃１分、55℃
２分及び72℃２分のサイクルを１サイクルとしてこれを
35サイクル行った。

【００４４】期待される大きさのフラグメントをアガロ
ース電気泳動及びQiaex(Qiagen社)で精製した後、二次
ＰＣＲでは、２つのフラグメントを混ぜたものを鋳型と
し、(a) と(d) をプライマーとして一次ＰＣＲと同様に
ＰＣＲを行い、最終産物を得た。これをクローニングベ
クターpBluescriptKS(+)(Stratagene 社) にクローニン
グし、予定された変異が導入されていることを確認し
た。そして、このフラグメントを制限酵素BstEIIで消化
した後、同様の処理をしたZAP-70ＤＮＡに導入した。

【００４５】F493についても上記と同様の方法で作製し
た。但し、使用したプライマーは(b) の代わりに(b')
（5'-TGAGCGGGCAGTGAAGTAGCTGTCG-3'(配列番号１２))、
(c) の代わりに(c')（5'-CGACAGCTACTTCACTGCCCGCTCA-
3'(配列番号１３))を用いた。また、K37K190 について
は、既存のK37 変異及びK190変異（いずれもIwashima,
M.et al.,1994.Science,263,1136)のＤＮＡを制限酵素
処理し、K37 変異部位を、K190変異部位を有するＤＮＡ
に組み込むことで作製した。

【００４６】〔実施例２〕免疫担当細胞の活性化 (1) 細胞の培養 Jurkat及びJ.RT3.T3.5細胞、並びにSV40 large T抗原(T
Ag) でトランスフェクトされたJurkat細胞(Jurkat TAg
細胞) を、10％ウシ胎児血清、100 μg/mlのペニシリン
及び100 μg/mlのストレプトマイシンを含むRPMI-1640
培地でそれぞれ培養した。Jurkat及びJ.RT3.T3.5細胞は
Arthur Weiss教授(University of California, San Fra
ncisco) より供与された。J.TAg 細胞はG.Crabtree教授
(Stanford University) より供与された。

【００４７】(2) 発現プラスミド及びレポータープラス
ミドの構築 実施例１により得られたCD2/ZAP-70キメラＤＮＡ、その
変異体、及びSrc のＮ末端部分にZAP-70のキナーゼドメ
インを結合したＤＮＡを、それぞれ制限酵素処理及びリ
ガーゼ処理により発現ベクターpME18Sに導入した。ま
た、細胞の活性化は、Ｔ細胞の代表的リンフォカインで
あるIL-2プロモーター／エンハンサー領域の転写活性を
指標として測定した。このため、遺伝子発現のマーカー
として、IL-2プロモーターを制御するNF-AT の結合領域
をもつ部分をルシフェラーゼ遺伝子につないだ公知のレ
ポータープラスミド（Northrop,J.P.et al.1993.J.Bio
l.Chem.,268,2917-2923) を用いた。

【００４８】ここで、ZAP-70のアミノ酸配列の369 番目
のリシン(AAG) をアラニン(GCG) に変異させたものを変
異体CD2/ZAP-70(A369) (変異体A369) とし、ZAP-70の49
2 番目のチロシン(TAC) をフェニルアラニン(TTC) に変
異させたものを変異体F492とし、ZAP-70の493 番目のチ
ロシン(TAC) をフェニルアラニン(TTC) に変異させたも
のを変異体F493とし、ZAP-70の37番目及び190 番目のア
ルギニンをともにリシンに変異させたものを変異体K37K
190 とした。Src/ZAP-70キメラＤＮＡについては、ZAP-
70ＤＮＡの5'側非翻訳領域(-1 から-30 番目の位置) 、
ニワトリSrc の第１〜14番目のアミノ酸残基及びスペー
サーアミノ酸（グリシン) をコードするＤＮＡをそれぞ
れ含むオリゴヌクレオチド（配列: 5'-ACGTCCCCAGGTTTC
GGGAGGCCCAGGGGCGATGGGGAGTAGCAAGAGCAGCCTAAGGACCCCAG
CCAGCGCGGG -3'（配列番号７））を、ヒトZAP-70の263
番目の位置からＣ末端までコードするＤＮＡ断片の先端
（最も５’側）に連結した。すべてのCD2/ZAP-70キメラ
ＤＮＡ及びSrc/ZAP-70キメラＤＮＡをプラスミドpME18S
にクローニングし、次いでpMIKHyg にトランスフェクト
した。

【００４９】(3) 細胞へのトランスフェクション、刺激
及びルシフェラーゼアッセイ ルシフェラーゼアッセイのために、Jurkat、J.RT3.T3.5
及びJ.TAg 細胞（５×10⁶個）について、各種発現構築
物（CD2/ZAP-70キメラＤＮＡ及びその変異体並びにSrc/
ZAP-70キメラＤＮＡ) を用いてエレクトロポレーション
を行った(800μF 及び350〜400V) 。

【００５０】24〜36時間後に細胞を分取し、最終用量５
mlのRPMI培地（1.0 μM/mlのイオノマイシン及び10ng/m
l のPMA(phorbol myristate acetate)を含む又は含まな
い)で培養した。培養８〜12時間後に細胞を回収し、Pic
aGeneキット（和光化学）及びルミノメーター（Lumat-L
B9501; Berthold) を使用してルシフェラーゼ活性を測
定した。PMA 及びイオノマイシンで処理したときの活性
を最大刺激とし、これに対する相対活性（％）を各サン
プルについて計算した。この値（％）を用いて、ベクタ
ーをトランスフェクトしなかったときの細胞と比較して
平均何倍誘導されたかを測定した。その結果、本発明の
ＤＮＡ(CD2/ZAP-70 キメラＤＮＡ) のみが細胞の活性化
を引き起こした（図４，左パネルの「CD2/ZAP-70」）。

【００５１】この時の活性化の度合いは抗Ｔ細胞抗原レ
セプター抗体（anti-TCR) による処理（マウス腹水を1:
1000希釈で使用）による刺激（図４、右パネル）と同程
度のものであった。また、変異を導入したものではF492
が活性化を増強したのに対し、F493及びA369は活性化を
抑制した（図５）。これは、F493及びA369変異体がZAP-
70のキナーゼ活性を消失させることによると考えられる
（Wange,R.L.et al.,1995.J.Biol.Chem.,270,18730-187
33) 。

【００５２】(4) 免疫沈降及びウエスタンブロット ウエスタンブロットは、ECL キット(Amersham)を用い
て、説明書に従って実施した。CD2/ZAP-70キメラＤＮＡ
の発現を検出するため、ビオチン化した抗CD2 モノクロ
ーナル抗体(Pharmingen)、及びストレプトアビジンアガ
ロース(Sigma) を用いて細胞溶解物の免疫沈降を行っ
た。その結果、図６に示すように、ウエスタンブロッテ
ィングにより本発明の形質転換体によりキメラタンパク
質が生成されていることがわかった。

【００５３】(5) キメラタンパク質が免疫担当細胞の細
胞膜に局在した免疫賦活細胞の調製及び活性の測定 ＴＣＲのβ鎖の発現を欠くJurkat細胞であるJ.RT3.T3.5
をCD2/ZAP-70キメラＤＮＡ及びNF-AT-luc でトランスフ
ェクトした。なお、対照として本発明のＤＮＡを含まな
いもの(Mock)を用いた。活性の測定は、ピッカジーンキ
ット（和光純薬）を用いることにより行った。

【００５４】その結果、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡがトラ
ンスフェクトされた細胞が活性化された（図７Ａ）。同
様にして、Jurkat細胞をNF-AT-luc 及び各発現ベクター
（ZAP-70ＤＮＡ、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡ又はK37K190
変異型キメラＤＮＡ) でトランスフェクトした。その結
果、CD2/ZAP-70キメラＤＮＡ及びK37K190 変異型ＤＮＡ
でトランスフェクトした細胞が活性化された（図７
Ｂ）。

【００５５】さらに、上記と同様にしてSrc/ZAP-70キメ
ラＤＮＡでトランスフェクトした細胞についても前記と
同様にして活性化の測定を行った。その結果、Src/ZAP-
70キメラＤＮＡも細胞を活性化した（図７Ｃ）。以上の
結果から、Ｔ細胞抗原レセプターの存在とは関係なく、
膜に局在化させたZAP-70がＴ細胞の活性化を行うことが
明らかとなった。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、キナーゼ活性を有する膜
局在型キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含む組換えベクター及び形質転換細胞、並びに免疫賦
活剤が提供される。本発明のＤＮＡは、癌や感染症など
の免疫抑制を有する疾患の予防、治療等に有用である。

【００５７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..2568 配列： ATG AGC TTT CCA TGT AAA TTT GTA GCC AGC TTC CTT CTG ATT TTC AAT 48 Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 GTT TCT TCC AAA GGT GCA GTC TCC AAA GAG ATT ACG AAT GCC TTG GAA 96 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 ACC TGG GGT GCC TTG GGT CAG GAC ATC AAC TTG GAC ATT CCT AGT TTT 144 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 CAA ATG AGT GAT GAT ATT GAC GAT ATA AAA TGG GAA AAA ACT TCA GAC 192 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 AAG AAA AAG ATT GCA CAA TTC AGA AAA GAG AAA GAG ACT TTC AAG GAA 240 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 AAA GAT ACA TAT AAG CTA TTT AAA AAT GGA ACT CTG AAA ATT AAG CAT 288 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 CTG AAG ACC GAT GAT CAG GAT ATC TAT AAG GTA TCA ATA TAT GAT ACA 336 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 100 105 110 AAA GGA AAA AAT GTG TTG GAA AAA ATA TTT GAT TTG AAG ATT CAA GAG 384 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 AGG GTC TCA AAA CCA AAG ATC TCC TGG ACT TGT ATC AAC ACA ACC CTG 432 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 ACC TGT GAG GTA ATG AAT GGA ACT GAC CCC GAA TTA AAC CTG TAT CAA 480 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 GAT GGG AAA CAT CTA AAA CTT TCT CAG AGG GTC ATC ACA CAC AAG TGG 528 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 170 175 ACC ACC AGC CTG AGT GCA AAA TTC AAG TGC ACA GCA GGG AAC AAA GTC 576 Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val 180 185 190 AGC AAG GAA TCC AGT GTC GAG CCT GTC AGC TGT CCA GAG AAA GGT CTG 624 Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu 195 200 205 GAC ATC TAT CTC ATC ATT GGC ATA TGT GGA GGA GGC AGC CTC TTG ATG 672 Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met 210 215 220 GTC TTT GTG GCA CTG CTC GTT TTC TAT ATC ACC AAA AGG AAA CCA GAC 720 Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Pro Asp 225 230 235 240 CCC GCG GCG CAC CTG CCC TTC TTC TAC GGC AGC ATC TCG CGT GCC GAG 768 Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg Ala Glu 245 250 255 GCC GAG GAG CAC CTG AAG CTG GCG GGC ATG GCG GAC GGG CTC TTC CTG 816 Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu 260 265 270 CTG CGC CAG TGC CTG CGC TCG CTG GGC GGC TAT GTG CTG TCG CTC GTG 864 Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser Leu Val 275 280 285 CAC GAT GTG CGC TTC CAC CAC TTT CCC ATC GAG CGC CAG CTC AAC GGC 912 His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu Asn Gly 290 295 300 ACC TAC GCC ATT GCC GGC GGC AAA GCG CAC TGT GGA CCG GCA GAG CTC 960 Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala Glu Leu 305 310 315 320 TGC GAG TTC TAC TCG CGC GAC CCC GAC GGG CTG CCC TGC AAC CTG CGC 1008 Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn Leu Arg 325 330 335 AAG CCG TGC AAC CGG CCG TCG GGC CTC GAG CCG CAG CCG GGG GTC TTC 1056 Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro Gly Val Phe 340 345 350 GAC TGC CTG CGA GAC GCC ATG GTG CGT GAC TAC GTG CGC CAG ACG TGG 1104 Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg Gln Thr Trp 355 360 365 AAG CTG GAG GGC GAG GCC CTG GAG CAG GCC ATC ATC AGC CAG GCC CCG 1152 Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser Gln Ala Pro 370 375 380 CAG GTG GAG AAG CTC ATT GCT ACG ACG GCC CAC GAG CGG ATG CCC TGG 1200 Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg Met Pro Trp 385 390 395 400 TAC CAC AGC AGC CTG ACG CGT GAG GAG GCC GAG CGC AAA CTT TAC TCT 1248 Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys Leu Tyr Ser 405 410 415 GGG GCG CAG ACC GAC GGC AAG TTC CTG CTG AGG CCG CGG AAG GAG CAG 1296 Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg Lys Glu Gln 420 425 430 GGC ACA TAC GCC CTG TCC CTC ATC TAT GGG AAG ACG GTG TAC CAC TAC 1344 Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val Tyr His Tyr 435 440 445 CTC ATC AGC CAA GAC AAG GCG GGC AAG TAC TGC ATT CCC GAG GGC ACC 1392 Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro Glu Gly Thr 450 455 460 AAG TTT GAC ACG CTC TGG CAG CTG GTG GAG TAT CTG AAG CTG AAG GCG 1440 Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Ala 465 470 475 480 GAC GGG CTC ATC TAC TGC CTG AAG GAG GCC TGC CCC AAC AGC AGT GCC 1488 Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn Ser Ser Ala 485 490 495 AGC AAC GCC TCA GGG GCT GCT GCT CCC ACA CTC CCA GCC CAC CCA TCC 1536 Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser 500 505 510 ACG TTG ACT CAT CCT CAG AGA CGA ATC GAC ACC CTC AAC TCA GAT GGA 1584 Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser Asp Gly 515 520 525 TAC ACC CCT GAG CCA GCA CGC ATA ACG TCC CCA GAC AAA CCG CGG CCG 1632 Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro 530 535 540 ATG CCC ATG GAC ACG AGC GTG TAT GAG AGC CCC TAC AGC GAC CCA GAG 1680 Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu 545 550 555 560 GAG CTC AAG GAC AAG AAG CTC TTC CTG AAG CGC GAT AAC CTC CTC ATA 1728 Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile 565 570 575 GCT GAC ATT GAA CTT GGC TGC GGC AAC TTT GGC TCA GTG CGC CAG GGC 1776 Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly 580 585 590 GTG TAC CGC ATG CGC AAG AAG CAG ATC GAC GTG GCC ATC AAG GTG CTG 1824 Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu 595 600 605 AAG CAG GGC ACG GAG AAG GCA GAC ACG GAA GAG ATG ATG CGC GAG GCG 1872 Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala 610 615 620 CAG ATC ATG CAC CAG CTG GAC AAC CCC TAC ATC GTG CGG CTC ATT GGC 1920 Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly 625 630 635 640 GTC TGC CAG GCC GAG GCC CTC ATG CTG GTC ATG GAG ATG GCT GGG GGC 1968 Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly 645 650 655 GGG CCG CTG CAC AAG TTC CTG GTC GGC AAG AGG GAG GAG ATC CCT GTG 2016 Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val 660 665 670 AGC AAT GTG GCC GAG CTG CTG CAC CAG GTG TCC ATG GGG ATG AAG TAC 2064 Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr 675 680 685 CTG GAG GAG AAG AAC TTT GTG CAC CGT GAC CTG GCG GCC CGC AAC GTC 2112 Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 690 695 700 CTG CTG GTT AAC CGG CAC TAC GCC AAG ATC AGC GAC TTT GGC CTC TCC 2160 Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser 705 710 715 720 AAA GCA CTG GGT GCC GAC GAC AGC TAC TAC ACT GCC CGC TCA GCA GGG 2208 Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly 725 730 735 AAG TGG CCG CTC AAG TGG TAC GCA CCC GAA TGC ATC AAC TTC CGC AAG 2256 Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys 740 745 750 TTC TCC AGC CGC AGC GAT GTC TGG AGC TAT GGG GTC ACC ATG TGG GAG 2304 Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu 755 760 765 GCC TTG TCC TAC GGC CAG AAG CCC TAC AAG AAG ATG AAA GGG CCG GAG 2352 Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu 770 775 780 GTC ATG GCC TTC ATC GAG CAG GGC AAG CGG ATG GAG TGC CCA CCA GAG 2400 Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu 785 790 795 800 TGT CCA CCC GAA CTG TAC GCA CTC ATG AGT GAC TGC TGG ATC TAC AAG 2448 Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys 805 810 815 TGG GAG GAT CGC CCC GAC TTC CTG ACC GTG GAG CAG CGC ATG CGA GCC 2496 Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala 820 825 830 TGT TAC TAC AGC CTG GCC AGC AAG GTG GAA GGG CCC CCA GGC AGC ACA 2544 Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr 835 840 845 CAG AAG GCT GAG GCT GCC TGT GCC TGAGCTCCCG CTGCCCAGGG GAGCCCTCCA 2598 Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala 850 855 CGCCGGCTCT TCCCCACCCT CAGCCCCACC CCAGGTCCTG CAGTCTGGCT GAGCCCTGCT 2658 TGGTTGTCTC CACACACAGC TGGGCTGTGG TAGGGGGTGT CTCAGGCCAC ACCGGCCTTG 2718 CATTGCCTGC CTGGCCCCCT GTCCTCTCTG GCTGGGGAGC AGGGAGGTCC GGGAGGGTGC 2778 GGCTGTGCAG CCTGTCCTGG GCTGGTGGCT CCCGGAGGGC CCTGAGCTGA GGGCATTGCT 2838 TACACGGATG CCTTCCCCTG GGCCCTGACA TTGGAGCCTG GGCATCCTCA GGTGGTCAGG 2898 CGTAGATCAC CAGAATAAAC CCAGCTTCCC TCTTGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAACC 2956

【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：１１１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1116 配列： ATG GGG AGT AGC AAG AGC AAG CCT AAG GAC CCC AGC CAG CGC GGG TCA 48 Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg Gly Ser 1 5 10 15 GGG GCT GCT GCT CCC ACA CTC CCA GCC CAC CCA TCC ACG TTG ACT CAT 96 Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser Thr Leu Thr His 20 25 30 CCT CAG AGA CGA ATC GAC ACC CTC AAC TCA GAT GGA TAC ACC CCT GAG 144 Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu 35 40 45 CCA GCA CGC ATA ACG TCC CCA GAC AAA CCG CGG CCG ATG CCC ATG GAC 192 Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro Met Pro Met Asp 50 55 60 ACG AGC GTG TAT GAG AGC CCC TAC AGC GAC CCA GAG GAG CTC AAG GAC 240 Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 AAG AAG CTC TTC CTG AAG CGC GAT AAC CTC CTC ATA GCT GAC ATT GAA 288 Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu 85 90 95 CTT GGC TGC GGC AAC TTT GGC TCA GTG CGC CAG GGC GTG TAC CGC ATG 336 Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met 100 105 110 CGC AAG AAG CAG ATC GAC GTG GCC ATC AAG GTG CTG AAG CAG GGC ACG 384 Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr 115 120 125 GAG AAG GCA GAC ACG GAA GAG ATG ATG CGC GAG GCG CAG ATC ATG CAC 432 Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala Gln Ile Met His 130 135 140 CAG CTG GAC AAC CCC TAC ATC GTG CGG CTC ATT GGC GTC TGC CAG GCC 480 Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala 145 150 155 160 GAG GCC CTC ATG CTG GTC ATG GAG ATG GCT GGG GGC GGG CCG CTG CAC 528 Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly Gly Pro Leu His 165 170 175 AAG TTC CTG GTC GGC AAG AGG GAG GAG ATC CCT GTG AGC AAT GTG GCC 576 Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val Ser Asn Val Ala 180 185 190 GAG CTG CTG CAC CAG GTG TCC ATG GGG ATG AAG TAC CTG GAG GAG AAG 624 Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys 195 200 205 AAC TTT GTG CAC CGT GAC CTG GCG GCC CGC AAC GTC CTG CTG GTT AAC 672 Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Val Asn 210 215 220 CGG CAC TAC GCC AAG ATC AGC GAC TTT GGC CTC TCC AAA GCA CTG GGT 720 Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly 225 230 235 240 GCC GAC GAC AGC TAC TAC ACT GCC CGC TCA GCA GGG AAG TGG CCG CTC 768 Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu 245 250 255 AAG TGG TAC GCA CCC GAA TGC ATC AAC TTC CGC AAG TTC TCC AGC CGC 816 Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg 260 265 270 AGC GAT GTC TGG AGC TAT GGG GTC ACC ATG TGG GAG GCC TTG TCC TAC 864 Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr 275 280 285 GGC CAG AAG CCC TAC AAG AAG ATG AAA GGG CCG GAG GTC ATG GCC TTC 912 Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu Val Met Ala Phe 290 295 300 ATC GAG CAG GGC AAG CGG ATG GAG TGC CCA CCA GAG TGT CCA CCC GAA 960 Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu 305 310 315 320 CTG TAC GCA CTC ATG AGT GAC TGC TGG ATC TAC AAG TGG GAG GAT CGC 1008 Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg 325 330 335 CCC GAC TTC CTG ACC GTG GAG CAG CGC ATG CGA GCC TGT TAC TAC AGC 1056 Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser 340 345 350 CTG GCC AGC AAG GTG GAA GGG CCC CCA GGC AGC ACA CAG AAG GCT GAG 1104 Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu 355 360 365 GCT GCC TGT GCC TGA 1119 Ala Ala Cys Ala 370

【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：８５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu 20 25 30 Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe 35 40 45 Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His 85 90 95 Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr 100 105 110 Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu 115 120 125 Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu 130 135 140 Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln 145 150 155 160 Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp 165 170 175 Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val 180 185 190 Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu 195 200 205 Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met 210 215 220 Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Pro Asp 225 230 235 240 Pro Ala Ala His Leu Pro Phe Phe Tyr Gly Ser Ile Ser Arg Ala Glu 245 250 255 Ala Glu Glu His Leu Lys Leu Ala Gly Met Ala Asp Gly Leu Phe Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Cys Leu Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val Leu Ser Leu Val 275 280 285 His Asp Val Arg Phe His His Phe Pro Ile Glu Arg Gln Leu Asn Gly 290 295 300 Thr Tyr Ala Ile Ala Gly Gly Lys Ala His Cys Gly Pro Ala Glu Leu 305 310 315 320 Cys Glu Phe Tyr Ser Arg Asp Pro Asp Gly Leu Pro Cys Asn Leu Arg 325 330 335 Lys Pro Cys Asn Arg Pro Ser Gly Leu Glu Pro Gln Pro Gly Val Phe 340 345 350 Asp Cys Leu Arg Asp Ala Met Val Arg Asp Tyr Val Arg Gln Thr Trp 355 360 365 Lys Leu Glu Gly Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ile Ile Ser Gln Ala Pro 370 375 380 Gln Val Glu Lys Leu Ile Ala Thr Thr Ala His Glu Arg Met Pro Trp 385 390 395 400 Tyr His Ser Ser Leu Thr Arg Glu Glu Ala Glu Arg Lys Leu Tyr Ser 405 410 415 Gly Ala Gln Thr Asp Gly Lys Phe Leu Leu Arg Pro Arg Lys Glu Gln 420 425 430 Gly Thr Tyr Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Val Tyr His Tyr 435 440 445 Leu Ile Ser Gln Asp Lys Ala Gly Lys Tyr Cys Ile Pro Glu Gly Thr 450 455 460 Lys Phe Asp Thr Leu Trp Gln Leu Val Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Ala 465 470 475 480 Asp Gly Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Glu Ala Cys Pro Asn Ser Ser Ala 485 490 495 Ser Asn Ala Ser Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser 500 505 510 Thr Leu Thr His Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser Asp Gly 515 520 525 Tyr Thr Pro Glu Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro 530 535 540 Met Pro Met Asp Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu 545 550 555 560 Glu Leu Lys Asp Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile 565 570 575 Ala Asp Ile Glu Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly 580 585 590 Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu 595 600 605 Lys Gln Gly Thr Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala 610 615 620 Gln Ile Met His Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly 625 630 635 640 Val Cys Gln Ala Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly 645 650 655 Gly Pro Leu His Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val 660 665 670 Ser Asn Val Ala Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr 675 680 685 Leu Glu Glu Lys Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 690 695 700 Leu Leu Val Asn Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser 705 710 715 720 Lys Ala Leu Gly Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly 725 730 735 Lys Trp Pro Leu Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys 740 745 750 Phe Ser Ser Arg Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu 755 760 765 Ala Leu Ser Tyr Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu 770 775 780 Val Met Ala Phe Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu 785 790 795 800 Cys Pro Pro Glu Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys 805 810 815 Trp Glu Asp Arg Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala 820 825 830 Cys Tyr Tyr Ser Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr 835 840 845 Gln Lys Ala Glu Ala Ala Cys Ala 850 855

【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：３７２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gln Arg Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Pro Thr Leu Pro Ala His Pro Ser Thr Leu Thr His 20 25 30 Pro Gln Arg Arg Ile Asp Thr Leu Asn Ser Asp Gly Tyr Thr Pro Glu 35 40 45 Pro Ala Arg Ile Thr Ser Pro Asp Lys Pro Arg Pro Met Pro Met Asp 50 55 60 Thr Ser Val Tyr Glu Ser Pro Tyr Ser Asp Pro Glu Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Lys Lys Leu Phe Leu Lys Arg Asp Asn Leu Leu Ile Ala Asp Ile Glu 85 90 95 Leu Gly Cys Gly Asn Phe Gly Ser Val Arg Gln Gly Val Tyr Arg Met 100 105 110 Arg Lys Lys Gln Ile Asp Val Ala Ile Lys Val Leu Lys Gln Gly Thr 115 120 125 Glu Lys Ala Asp Thr Glu Glu Met Met Arg Glu Ala Gln Ile Met His 130 135 140 Gln Leu Asp Asn Pro Tyr Ile Val Arg Leu Ile Gly Val Cys Gln Ala 145 150 155 160 Glu Ala Leu Met Leu Val Met Glu Met Ala Gly Gly Gly Pro Leu His 165 170 175 Lys Phe Leu Val Gly Lys Arg Glu Glu Ile Pro Val Ser Asn Val Ala 180 185 190 Glu Leu Leu His Gln Val Ser Met Gly Met Lys Tyr Leu Glu Glu Lys 195 200 205 Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Val Asn 210 215 220 Arg His Tyr Ala Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ala Leu Gly 225 230 235 240 Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Thr Ala Arg Ser Ala Gly Lys Trp Pro Leu 245 250 255 Lys Trp Tyr Ala Pro Glu Cys Ile Asn Phe Arg Lys Phe Ser Ser Arg 260 265 270 Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Met Trp Glu Ala Leu Ser Tyr 275 280 285 Gly Gln Lys Pro Tyr Lys Lys Met Lys Gly Pro Glu Val Met Ala Phe 290 295 300 Ile Glu Gln Gly Lys Arg Met Glu Cys Pro Pro Glu Cys Pro Pro Glu 305 310 315 320 Leu Tyr Ala Leu Met Ser Asp Cys Trp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Arg 325 330 335 Pro Asp Phe Leu Thr Val Glu Gln Arg Met Arg Ala Cys Tyr Tyr Ser 340 345 350 Leu Ala Ser Lys Val Glu Gly Pro Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ala Glu 355 360 365 Ala Ala Cys Ala 370

【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TATGTGGAGG AGGCAGCCTC TTGATGGTCT TTGTGGCACT GCTCGTTTTC TATATCACCA 60 AAAGGAAACC AGACCCCGC 79

【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGGGTCTGGT TTCCTTTTGG TGATATAGAA AACGAGCAGT GCCACAAAGA CCATCAAGAG 60 GCTGCCTCCT CCACA 75

【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACGTCCCCAG GTTTCGGGAG GCCCAGGGGC GATGGGGAGT AGCAAGAGCA GCCTAAGGAC 60 CCCAGCCAGC GCGGG 75

【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACCTGGCGGC CCGCAACGTC CTGCT 24

【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGAGCGGGCA GTGTAGAAGC TGTCG 25

【００６６】配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGACAGCTTC TACACTGCCC GCTCA 25

【００６７】配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGCCGTAG GACAAGGCCT CCCAC 25

【００６８】配列番号：１２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGAGCGGGCA GTGAAGTAGC TGTCG ２５

【００６９】配列番号：１３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGACAGCTAC TTCACTGCCC GCTCA 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡを構築するための模式図であ
る。

【図２】本発明のＤＮＡを構築するための模式図であ
る。

【図３】本発明のＤＮＡを示す模式図である。

【図４】本発明のＤＮＡが導入された細胞のルシフェラ
ーゼ活性を示す図である。

【図５】本発明のＤＮＡが導入された細胞のルシフェラ
ーゼ活性を示す図である。

【図６】ウエスタンブロットの結果を示す電気泳動写真
である。

【図７】本発明のＤＮＡが導入された細胞のルシフェラ
ーゼ活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号３若しくは４で表されるアミノ
   酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、免
   疫賦活活性をもたらすタンパク質をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 タンパク質が膜局在型プロテインチロシ
   ンキナーゼである請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 プロテインチロシンキナーゼがＺＡＰ−
   ７０である請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 ＤＮＡが配列番号１又は２で表されるも
   のである請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含む組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターによって
   形質転換された形質転換細胞。
7. 【請求項７】 細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、肥
   満細胞又は好中球である請求項６記載の形質転換細胞。
8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを免疫担当細胞に導入することを特徴とする免疫担
   当細胞の賦活化方法。
9. 【請求項９】 免疫担当細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ
   細胞、肥満細胞又は好中球である請求項８記載の賦活化
   方法。
10. 【請求項１０】 請求項６又は７記載の形質転換細胞を
    含む免疫賦活剤。