JPWO2018074457A1 - 未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法 - Google Patents

Abstract

脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する未分化幹細胞除去剤。未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、前記未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法。（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、前記未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程

Description

本発明は、未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法に関する。また、前記未分化幹細胞除去剤を含む培地、移植用細胞の製造方法、及び医薬組成物に関する。
本願は、２０１６年１０月１７日に、日本に出願された特願２０１６−２０３８３９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性を有する幹細胞についての研究が進められている。これらの細胞は多能性を有することから、分化・誘導して所望の系譜に分化した細胞を作製し、移植医療において使用することが可能になりつつある。

胚性幹細胞や人工多能性幹細胞の分化・誘導は、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、全ての幹細胞に対して目的とする系譜の分化を惹起することは難しく、分化・誘導操作後も一部に未分化幹細胞が残存することがある。このような未分化幹細胞は、増殖活性を有し、かつ多種類の細胞に分化できることから、生体内に移植された場合、奇形腫を形成する恐れがある（例えば、非特許文献１を参照）。このような理由から、幹細胞を分化・誘導して作製した細胞集団を、そのまま生体に移植して治療に用いることは困難である。

したがって、幹細胞から分化・誘導した細胞の生体への移植を安全に実行し、理想的な治療効果を得るために、未分化幹細胞を除去することが必要である。また、未分化幹細胞が残存したまま移植されてしまった場合には、生体内における未分化幹細胞の増殖を抑制する必要がある。

これまでに、未分化幹細胞を培養条件中で選択的に除去できるとされる方法が報告されている（例えば、非特許文献２〜４を参照）。本発明者らの研究グループでも、非心筋細胞や未分化幹細胞から、心筋細胞を選抜する方法を開発してきた（特許文献１〜６、非特許文献５を参照）。

国際公開第２００６／０２２３７７号 国際公開第２００７／０８８８７４号 国際公開第２００９／０１７２５４号 国際公開第２０１０／１１４１３６号 国際公開第２０１１／０５２８０１号 国際公開第２０１６／０１０１６５号

Miura et al., (2009) Nature Biotech., 8, 743-745. Ben-David,et al., (2013) Cell Stem Cell, 12, 167-179. Wang,et al., (2009) Science, 325, 435-439. Shiraki,et al., (2014) Cell Metabolism, 19, 780-794. Tohyama,et al., (2016) Cell Metabolism, 23, 663-674.

しかしながら、未分化幹細胞の残存率を低減させる目的において、未分化幹細胞の除去技術については未だ検討の余地があった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、未分化幹細胞の高効率な除去を可能とする未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、未分化幹細胞を、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、又はコレステロール合成阻害剤の存在下で培養することにより、未分化幹細胞の細胞死を誘導可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
［２］前記脂肪酸合成阻害剤が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、及びマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであり、
前記脂肪酸利用阻害剤が、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として脂肪酸利用を阻害するものである、
前記［１］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［３］前記脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の適用対象中の濃度が、０．１〜５００μＭである前記［１］又は［２］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［４］前記コレステロール合成阻害剤が、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものである、前記［１］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［５］前記コレステロール合成阻害剤の適用対象中の濃度が、０．０１〜５０μＭである、前記［１］又は［４］に記載の未分化幹細胞除去剤。
［６］グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む、前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤。
［７］オルリスタット、Ｃ７５、ＬＹ２９４００２、ＳＢ２０４９９０、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる１又は２以上を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
［８］前記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤を含む培地。
［９］未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、前記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
［１０］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記［９］に記載の未分化幹細胞除去方法。
［１１］前記分化細胞が心筋細胞である、前記［９］又は［１０］に記載の未分化幹細胞除去方法。
［１２］ 以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、前記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。

［１３］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記分化細胞が心筋細胞である、前記［１２］又は［１３］に記載の製造方法。
［１５］未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、前記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
［１６］前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、前記［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、前記［１５］又は［１６］に記載の医薬組成物。

本発明の未分化幹細胞除去剤によれば、未分化幹細胞の高効率な除去が可能である。
本発明の未分化幹細胞除去方法によれば、未分化幹細胞の高効率な除去が可能である。

細胞内での脂肪酸の合成経路の概略を説明する図である。 実験例１で、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とｉＰＳ細胞との、ＦＡＳＮの発現の比較の結果を示す画像である。 実験例２で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例３で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例４で培養した純化精製心筋細胞の画像である。 実験例５で培養した線維芽細胞の画像である。 実験例６で培養した、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とヒトｉＰＳ細胞とを含む細胞混合物の画像である。 実験例６で、脂肪酸合成阻害剤を含む培地と含まない培地とで培養された細胞混合物における、Ｏｃｔ４陽性のコロニー数を比較した結果を示すグラフである。 細胞内でのコレステロールの合成経路の概略を説明する図である。 実験例７で、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とヒトｉＰＳ細胞との、ＦＡＳＮの発現の比較の結果を示す画像である。 実験例７で、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とヒトｉＰＳ細胞との、ＦＡＳＮの発現の比較の結果を示すウエスタンブロッティングの写真である。 実験例８で培養した未分化幹細胞株の画像である。 実験例９で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地（ＰＡ−ＢＳＡ）と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地（ＢＳＡ）と、で培養されたヒトｉＰＳ細胞のウェルの画像である。 実験例９で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地（ＰＡ−ＢＳＡ）と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地（ＢＳＡ）と、で培養されたヒトｉＰＳにおける、生存細胞数を比較した結果を示すグラフである。 実験例１０で、ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株と、陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｎ／Ｃ ｓｉＲＮＡ）を導入した未分化幹細胞株との、ＦＡＳＮの発現を比較した結果を示すウェスタンブロッティングの写真である。 実験例１０で、ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株（ＦＡＳＮ ＮＤ）と、陰性対照ｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株（Ｎ／Ｃ）との、細胞増殖を比較した結果を示すグラフである。 実験例１１で、脂肪酸合成阻害剤及び脂肪酸を含む培地（ＰＡ−ＢＳＡ）と、脂肪酸合成阻害剤を含み、脂肪酸を含まない培地（ＢＳＡ）と、で培養された、ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株（ＦＡＳＮ ＫＤ）と、陰性対照ｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株（Ｎ／Ｃ）との、細胞増殖を比較した結果を示すグラフである。

≪定義等≫
本明細書において、「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する多能性幹細胞を包含する概念として用いられ、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、及びこれらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞、並びに各種体性幹細胞を含み得る。「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する細胞であれば特に限定されず、上記例示したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同等の性質を有する未知の細胞も包含する。

細胞が未分化幹細胞であることは、未分化幹細胞に特異的な性質の有無や、未分化幹細胞に特異的な各種マーカーの発現等から判断することができる。例えば、未分化幹細胞に特異的な性質としては、自己複製能を有し、未分化幹細胞とは異なる性質を有する別種の細胞へと分化可能である性質が挙げられる。また、テラトーマ形成能やキメラマウス形成能等も未分化幹細胞に特異的な性質として挙げられる。

未分化幹細胞に特異的な各種マーカー（以下、「未分化幹細胞マーカー」という。）とは、未分化幹細胞に特異的に発現する因子であり、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５等を例示することができる。これら未分化幹細胞マーカーの少なくとも１つの発現が観察された場合には、当該細胞を未分化幹細胞と判断することができる。未分化幹細胞マーカーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態として、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞を未分化幹細胞と判断してもよい。なお、細胞における未分化幹細胞マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲやマイクロアレイ等の公知の方法を用いて確認することができる。

未分化幹細胞は、哺乳類の未分化幹細胞であってもよく、げっ歯類の未分化幹細胞であってもよく、霊長類の未分化幹細胞であってもよく、ヒトの未分化幹細胞であってもよい。一例として、ヒト由来の未分化幹細胞を挙げることができ、より具体的な例としては、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞等を挙げることができる。

本明細書において、「分化細胞」とは、上記「未分化幹細胞」の性質を有しない細胞のことを指す。分化細胞は、未分化幹細胞から誘導・分化された細胞であり得るが、分化多能性を有しない。分化細胞としては、例えば、ＥＳ細胞から分化した細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞であってよい。分化細胞の例としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等が挙げられる。

≪未分化幹細胞除去剤≫
１実施形態において、本発明は、未分化幹細胞除去剤を提供する。
本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有する。
以下、実施の形態に基づき、本発明を説明する。

後述する実施例に示されるように、本発明者らは、脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸分解阻害剤（脂肪酸利用阻害剤）を未分化幹細胞に接触させると、細胞死を誘導可能であることを見出した。この理由として、本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞（未分化幹細胞）において、当該脂肪酸合成経路が亢進されていることを見出した。おそらく、当該脂肪酸合成経路及びその代謝経路は未分化幹細胞の生存に非常に重要であるものと考えられる。そのため、係る脂肪酸合成又は脂肪酸分解の阻害により、未分化幹細胞に細胞死が誘導されるものと考えられる。
さらに、本発明者らは、コレステロール合成阻害剤を未分化幹細胞に接触させると、細胞死を誘導可能であることを見出した。コレステロールは細胞膜の構成成分であり、当該コレステロール合成経路は未分化幹細胞の生存に非常に重要であるものと考えられる。そのため、係るコレステロール合成の阻害により、未分化幹細胞に細胞死が誘導されるものと考えられる。
また、未分化幹細胞が残存する細胞集団が生体内に移植された場合であっても、当該生体に対して脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤又はコレステロール合成阻害剤を投与することにより、生体内の未分化幹細胞を選択的に除去することができる。

本明細書において「脂肪酸利用阻害剤」は、脂肪酸を利用した物質の合成に係る代謝経路の反応を阻害する機能、及び/又は脂肪酸の分解に係る代謝経路の反応を阻害する機能を有するものである。本明細書において「脂肪酸利用阻害剤」は、脂肪酸の分解に係る代謝経路の反応を阻害する「脂肪酸分解阻害剤」を包含する。
脂肪酸の分解に係る代謝経路としては、β酸化に係る代謝経路が好ましい。脂肪酸利用阻害剤は「β酸化に係る脂肪酸代謝阻害剤」であることが好ましい。β酸化に係る脂肪酸代謝としては、β酸化、β酸化に利用される脂肪酸代謝産物の合成、β酸化に利用される脂肪酸代謝産物のミトコンドリアへの取り込み等が挙げられる。

また、脂肪酸を利用した物質の合成に係る代謝経路としては、トリグリセリド及び／又はリン脂質の合成に係る代謝経路が好ましい。脂肪酸利用阻害剤は「トリグリセリド及び／又はリン脂質の合成に係る脂肪酸代謝阻害剤」であることが好ましい。

これら阻害剤の種類は特に限定されるものではなく、脂肪酸合成阻害、脂肪酸利用阻害、又はコレステロール合成阻害の機能を有する物質であればよく、有機物であっても無機物であってもよい。有機物としては有機化合物が好ましく、低分子化合物、核酸、ぺプチド、タンパク質等も例示できる。

図１は、天然の細胞の細胞質における脂肪酸合成経路及び脂肪酸分解（脂肪酸利用）経路の概略を説明する図である。クエン酸（ｃｉｔｒａｔｅ）から、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＴＰ ｃｉｔｒａｔｅ ｌｙａｓｅ：ＡＣＬＹ）によりアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）が合成され、アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）から、脂肪酸合成酵素（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＦＡＳＮ）により脂肪酸（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ：ＦＡ）が合成される。
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＡＣＣ）は、アセチル−ＣｏＡからのマロニル−ＣｏＡの生成を触媒する。マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ｍａｌｏｎｙｌ‐ＣｏＡ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＭＣＤ）は、マロニル−ＣｏＡからのアセチル−ＣｏＡの生成を触媒する。
合成された脂肪酸は、アシルＣｏＡ合成酵素（ａｃｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＡＣＳ）の働きにより、脂肪酸アシル−ＣｏＡ（ＦＡ−ＣｏＡ）となり、その後いくつかの反応を経て、結果としてカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１：ＣＰＴ１）によってミトコンドリア内へ輸送され、β酸化に利用される。

本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、図１に示す脂肪酸合成経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸合成を阻害するものであってよい。本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、及びマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。好ましくは、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよく、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、及び脂肪酸合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。

本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、図１に示すβ酸化に係る脂肪酸分解経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。

脂肪酸は、β酸化に利用される他、トリグリセリド及びリン脂質の合成等にも利用される。脂肪酸アシル−ＣｏＡは、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＰＡＴ）によるリゾホスファチジン酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ：ＬＰＡ）の合成に利用される。また、脂肪酸アシル−ＣｏＡは、アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ａｃｙｌ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＧＰＡＴ）によるホスファチジン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ：ＰＡ）の合成に利用される。また、脂肪酸アシル−ＣｏＡは、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＰＡＰ）によるジアシルグリセロール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ：ＤＡＧ，ＤＧ）の合成に利用される。また、脂肪酸アシル−ＣｏＡは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＤＧＡＴ）によるトリグリセリドの合成に利用される。更には、脂肪酸アシル−ＣｏＡは、モノアシルグリセロールリパーゼ（ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｐａｓｅ：ＭＡＧＬ）によって脂肪酸とグリセロールにも分解される。本実施形態の脂肪酸利用阻害剤は、脂肪酸を利用するこれらの経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、脂肪酸利用を阻害するものであってよい。

図９は、コレステロール合成経路の概略を説明する図である。アセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）から、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＡＣＡＴ２）によりアセトアセチル−ＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）が合成される。アセトアセチル−ＣｏＡから、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素１（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔａｓｅ １：ＨＭＧ−ＣｏＡ Ｓｙｎｔａｓｅ １）によりヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ：ＨＭＧ−ＣｏＡ）が合成される。ＨＭＧ−ＣｏＡから、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によりメバロン酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）が合成される。その後いくつかの反応を経て、結果としてコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）が合成される。

本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、図９に示すコレステロール合成経路のいずれかの反応を完全又は部分的に阻害して、コレステロール合成を阻害するものであってよい。本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。好ましくは、本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。

脂肪酸合成阻害剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。脂肪酸利用阻害剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。コレステロール合成阻害剤は、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤を１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸利用阻害剤を１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、コレステロール合成阻害剤を１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。

本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、脂肪酸合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。脂肪酸合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）、Ｃ７５、フラボノイズ、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）等が挙げられ、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）、Ｃ７５が好ましい。
オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）及びＣ７５は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）又はＣ７５と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。

オルリスタットは、下記式（１）で表される化合物（Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ−（１Ｓ）−１−［［（２Ｓ,３Ｓ）−３−ｈｅｘｙｌ−４−ｏｘｏ−２−ｏｘｅｔａｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｄｏｄｅｃｙｌ ｅｓｔｅｒ）として知られる。

Ｃ７５は、下記式（２）で表される化合物（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２Ｒ−ｏｃｔｙｌ−５−ｏｘｏ−３Ｓ−ｆｕｒａｎｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）として知られる。

本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤は、ＡＴＰクエン酸リアーゼを標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。ＡＴＰクエン酸リアーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、ＬＹ２９４００２及びＳＢ２０４９９０が好ましく挙げられる。ＬＹ２９４００２及びＳＢ２０４９９０は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ＬＹ２９４００２又はＳＢ２０４９９０と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。

本実施形態の脂肪酸分解阻害剤は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として、脂肪酸分解を阻害するものであってよい。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として、脂肪酸分解を阻害する脂肪酸分解阻害剤としては、エトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）、ペルヘキシリン（Ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ）、ラノラジン（Ｒａｎｏｌａｚｉｎｅ）等が挙げられ、エトモキシル、ペルヘキシリンが好ましい。エトモキシル及びペルヘキシリンは、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、エトモキシル又はペルヘキシリンと同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。

本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、ソラフェンＡ（Ｓｏｒａｐｈｅｎ Ａ）、ＴＯＦＡ、Ａ７６９６６２、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ＡＩＣＡＲ等が挙げられ、ＴＯＦＡ、Ａ７６９６６２が好ましい。ＴＯＦＡ及びＡ７６９６６２は、市販のものを使用できる。また、本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、ＴＯＦＡ又はＡ７６９６６２と同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。

本実施形態の脂肪酸合成阻害剤は、アシルＣｏＡ合成酵素を標的として脂肪酸合成を阻害するものであってよい。アシルＣｏＡシンテターゼを標的として脂肪酸合成を阻害する脂肪酸合成阻害剤として、トリアクシンＣ（Ｔｒｉａｓｃｉｎ Ｃ）、ＴＺＤｓ等が挙げられる。

また、上記のＡＴＰクエン酸リアーゼやアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸合成酵素、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ合成酵素などの発現を制御する転写因子として、ＳＲＥＢＰが知られている。実施形態の脂肪酸合成阻害剤及び／又は脂肪酸利用阻害剤としては、ＳＲＥＢＰの機能を阻害するものであってもよく、ファトスタチン（Ｆａｔｏｓｔａｔｉｎ）やＦＧＨ１１００１９等が挙げられる。

本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するものであってよい。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを標的としてコレステロール合成を阻害するコレステロール合成阻害剤として、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン（Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓｔａｔｉｎ）、ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）、セリバスタチン（Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、ロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、メバスタチン（Ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）等が挙げられ、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンが好ましく、シンバスタチンがより好ましい。プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンは、市販のものを使用できる。また、本実施形態のコレステロール合成阻害剤は、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチンと同等の機能を有するものであれば、これらの化合物の塩又は誘導体であってもよい。

実施形態の未分化幹細胞除去剤は、オルリスタット、Ｃ７５、ＬＹ２９４００２、ＳＢ２０４９９０、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる１又は２以上を含有してもよい。

本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸合成阻害剤の濃度が、０．１〜５００μＭであってよい。なお、本明細書中において、単位としての「Ｍ」は、ｍｏｌ／Ｌを意味する。また、本明細書中において、「適用対象中」とは、培地中、又は血中を意味する。
また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸利用阻害剤の濃度が０．１〜５００μＭであってよい。
また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸合成阻害剤の濃度が０．１〜５００μｇ／ｍＬであってよい。
また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有する脂肪酸利用阻害剤の濃度が０．１〜５００μｇ／ｍＬであってよい。
また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有するコレステロール合成阻害剤の濃度が０．０１〜５０μＭであってよい。
また、本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、適用対象中の含有するコレステロール合成阻害剤の濃度が０．０１〜５０μｇ／ｍＬであってよい。
本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がオルリスタットである場合、適用対象中のオルリスタットの濃度は、０．１〜５００μＭが好ましく、１〜５０μＭがより好ましく、３〜１５μＭがさらに好ましい。
本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がＣ７５である場合、適用対象中のＣ７５の濃度は、０．１〜５００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１００μｇ／ｍＬがより好ましく、５〜５０μｇ／ｍＬがさらに好ましい。
本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がＳＢ２０４９９０である場合、適用対象中のＳＢ２０４９９０の濃度は、０．１〜５００μＭが好ましく、１〜２００μＭがより好ましく、２０〜１００μＭがさらに好ましい。
本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤がＬＹ２９４００２である場合、適用対象中のＬＹ２９４００２の濃度は、０．１〜５００μＭが好ましく、１〜２００μＭがより好ましく、２０〜１００μＭがさらに好ましい。
本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤（脂肪酸利用阻害剤）がエトモキシルである場合、適用対象中のエトモキシルの濃度は、０．１〜５００μＭが好ましく、１〜２００μＭがより好ましく、２０〜１００μＭがさらに好ましい。
本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤（脂肪酸利用阻害剤）がペルヘキシリンである場合、適用対象中のペルヘキシリンの濃度は、０．１〜５００μＭが好ましく、１〜１００μＭがより好ましく、５〜５０μＭがさらに好ましい。
本実施形態に係るコレステロール合成阻害剤がシンバスタチンである場合、適用対象中のシンバスタチンの濃度は、０．０１〜５０μＭが好ましく、０．１〜３０μＭがより好ましく、０．１〜１０μＭがさらに好ましい。

本実施形態に係る脂肪酸合成阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、脂肪酸合成阻害剤が未分化幹細胞の細胞質に取り込まれ、図１に示す脂肪酸合成経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。
本実施形態に係る脂肪酸分解阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、脂肪酸分解阻害剤が未分化幹細胞の細胞質及び／又はミトコンドリアに取り込まれ、図１に示す脂肪酸分解経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。
本実施形態に係るコレステロール合成阻害剤と未分化幹細胞とが接触すると、コレステロール合成阻害剤が未分化幹細胞の細胞質に取り込まれ、図９に示すコレステロール合成経路のいずれかの反応が完全又は部分的に阻害されることとなる。

本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有するものであればよい。本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種のみからなるものであってもよく、未分化幹細胞除去能を有する限りにおいて、その他の任意成分を含有していてもよい。
他の成分は、特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、トランスフェクション促進剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられる。
本実施形態の未分化幹細胞除去剤の剤型は、特に限定されず、液状物、粉末状物、顆粒状物、ゲル状物、固形物等の種々の形態であり得る。また、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、コレステロール合成阻害剤、又はこれらの組合せをミセル内に封入したエマルション形態や、リポソーム内に封入したリポソーム形態であってもよい。

患者への投与は、例えば、非経口的または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。非経口的な投与方法としては、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経皮的投与等が挙げられる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
例えば、未分化幹細胞から誘導された分化細胞組織の移植を受けた患者は、本実施形態の未分化幹細胞除去剤の投与により、分化細胞組織中に残存する未分化幹細胞を生体内で除去することができる。これにより、移植組織の癌化等の未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を予防又は治療できる。

本実施形態の未分化幹細胞除去剤は、後述する培地、未分化幹細胞除去方法、移植用細胞の製造方法、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物、及び未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法等に使用することができる。

本実施形態の未分化幹細胞除去剤が、除去の対象とする未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。

≪培地≫
１実施形態において、本発明は、培地を提供する。本実施形態の培地は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を含む。本実施形態の培地は、細胞の培養に使用できる。本明細書において、「培養」とは、生体（個体）外において細胞を飼育又は生育させることを意味し、いわゆるｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を扱うことを含む。「培地」とは、前記培養環境を細胞に提供する液体又は固体の物質のことを指す。

本実施形態の培地は、例えば、任意の培地成分と、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種（以下、「脂肪酸合成阻害剤等」ということがある。）と、を含む組成物であり得る。本実施形態の培地は、媒体と脂肪酸合成阻害剤等とを含む組成物である。媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。媒体は、脂肪酸合成阻害剤等を溶解させるものであってもよく、分散させるものであってもよい。培地成分は、細胞の生育に有効な成分を含有していてもよく、そのような成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類、糖類、成長因子等の各種成分が挙げられる。その他、抗生物質、緩衝液、キレート剤、フェノールレッド指示薬等の成分を含有していてもよい。

本実施形態の培地から脂肪酸合成阻害剤等を除いた残りの成分は、従来培地として用いられている一般的な細胞培養液［例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（例えば、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳ］）、ＲＰＭＩ培養液（例えば、ＲＰＭＩ １６４０など）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲ１など］と同様の組成としてもよい。前記成分は、未分化幹細胞維持培地として用いられている一般的な細胞培養液［例えばＳｔｅｍＦｉｔ培地、ｍＴｅＳＲ（登録商標） Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）培地、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）培地など］と同様の組成としてもよい。

本実施形態の培地中の脂肪酸合成阻害剤等の濃度は、前述した未分化幹細胞除去剤中の適用対象中の脂肪酸合成阻害剤等の濃度と同じであってよい。本実施形態の培地が脂肪酸合成阻害剤等を上記濃度で含むことにより、効果的に未分化幹細胞を除去可能である。また、未分化幹細胞と分化細胞とが混在する場合、分化細胞の生育を良好な状態とさせつつ、未分化幹細胞を除去可能である。

本実施形態の培地は、脂肪酸を含まないことが好ましい。また脂肪酸が生合成されないよう、使用される脂肪酸合成阻害剤の標的の下流に位置する脂肪酸合成の前駆体（図１参照）を含まないことが好ましい。また脂肪酸が利用されないよう、使用される脂肪酸利用阻害剤の標的の下流に位置する物質を含まないことが好ましい。また、本実施形態の培地は、コレステロールを含まないことが好ましい。またコレステロールが生合成されないよう、使用されるコレステロール合成阻害剤の標的の下流に位置するコレステロール合成の前駆体を含まないことが好ましい。

本実施形態の培地は、グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでもよい。これらの化合物を含まない培地で未分化幹細胞を培養することでも、未分化幹細胞の細胞死を誘導可能であるとされる。
しかし、本実施形態の培地は、脂肪酸合成阻害剤等を含んでいるので、これら、グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含んでいても、未分化幹細胞除去能が良好に発揮される。また、グルコース、グルタミン、及びメチオニンを含んでいてもよいため、これらの成分を含まない場合と比べて、細胞の生育が良好となることが期待される。

また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞除去剤の製造のための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。

<<キット>>
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を備えるキットを提供する。

本実施形態のキットは、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤のほか、未分化幹細胞から分化細胞を誘導するための試薬類、培地類、細胞培養器具、使用説明書等をさらに備えるものであってもよい。分化細胞を誘導するための試薬類は、誘導しようとする分化細胞に応じて、適宜選択することができる。心筋細胞を誘導するための試薬類としては、例えば、デメチラーゼ、５−アザシチジン、ＤＭＳＯなどの染色体ＤＮＡ脱メチル化剤；ＰＤＧＦ、繊維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）、エンドセリン１（ＥＴ１）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）および骨形成因子４（ＢＭＰ−４）、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子；レチノイン酸などのビタミン；Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＴＥＦ−１、ＴＥＦ−３、ＴＥＦ−５およびＭｅｓＰ１などの転写因子；心筋細胞由来の細胞外基質；ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテなどのＢＭＰアンタゴニスト等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、培地類としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ Ｂｓｓ］等）、ＲＰＭＩ培養液（ＲＰＭＩ １６４０等）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲＩ、ＳｔｅｍＦｉｔ培地、ｍＴｅＳＲ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＳｕｒｅ培地等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、細胞培養器具等としては、細胞培養プレート等を挙げることができるが、これに限定されない。

本実施形態のキットは、後述の未分化幹細胞除去方法に好適に用いることができ、当該未分化幹細胞除去方法を説明する指示書等をさらに備えることができる。上記実施形態の未分化幹細胞除去剤と共に、未分化幹細胞除去方法に使用する試薬類、指示書等をキット化することにより、より簡便かつ短時間に未分化幹細胞除去方法を実施することができる。

≪未分化幹細胞除去方法≫
１実施形態において、本発明は、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法を提供する。

本実施形態の未分化幹細胞除去方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤である。
本明細書において、「細胞混合物」とは、２種以上の細胞を含む細胞集団である。「細胞混合物」は、２種以上の細胞のほか、培地の成分等を含み得る。「未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物」は、１個以上の未分化幹細胞と１個以上の分化細胞とを含み、任意に培地の成分等を含み得る。未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。

未分化幹細胞に、分化・誘導処理を行うと、未分化幹細胞から分化細胞が誘導される。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しく、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物が形成される。本実施形態の方法では、このような未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物から、未分化幹細胞のみを選択的に除去することができる。なお、本実施形態の方法において、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物は、未分化幹細胞と分化細胞とを混合したものであってもよい。

本実施形態の方法において、未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。

本実施形態の方法において、分化細胞は、特に限定されないが、混在する未分化幹細胞と同種の未分化幹細胞から分化・誘導されたものであることが好ましい。未分化幹細胞から分化細胞への分化・誘導方法は、これまでに幾つか報告されており、これら公知の方法を用いて分化細胞を誘導することができる。

前記細胞混合物中の未分化幹細胞を、選択的に除去できる効率は、高いほど好ましい。上記実施形態の未分化幹細胞除去剤の存在下で、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養し、細胞混合物を得た場合、未分化幹細胞数／（未分化幹細胞数＋分化細胞数）×１００で表される未分化幹細胞残存率は、０．１％未満であることが好ましく、０．０１％未満であることがより好ましく、０．００１％未満であることがさらに好ましい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。
前記細胞混合物中に残存する未分化幹細胞は、前記未分化幹細胞に特異的な各種マーカーを発現する細胞を、未分化幹細胞と判断することで検出してよい。ただし、上記に挙げた未分化幹細胞残存率は、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞を未分化幹細胞と判断して、前記細胞混合物中に残存する未分化幹細胞を検出したものとする。ここでは、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤を含有しない培地で培養した未分化幹細胞を陽性対照として、前記陽性対照の未分化幹細胞におけるＯｃｔ３／４の発現量と同等程度の発現量を示す細胞を、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞として検出すればよい。

分化細胞としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、免疫細胞（例、リンパ球等）、血管細胞、眼細胞（例、網膜色素上皮細胞等）、血液細胞（例、巨核球、赤血球等）、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等であってよい。中でも、心筋細胞又は線維芽細胞が好ましく、心筋細胞がより好ましい。

多能性を有する幹細胞から心筋細胞を誘導する場合、心筋細胞への分化が進行するにつれて、未分化中胚葉、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）を経て心筋細胞に分化すると考えられている。ここで、未分化中胚葉とは、未分化中胚葉に特異的なＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質の発現が認められる段階をいう。一方、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）とは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ等の未分化中胚葉に特異的なタンパク質の発現が認められ、かつ同一細胞においてＮｋｘ２．５やアクチニン等の心筋細胞特異的タンパク質の発現が認められない細胞であって、培養液に対して新たに物質が加えられることを必要とせず、専ら心筋細胞へ分化する能力を有する細胞を意味する。心筋細胞とは、自律拍動を行っている細胞のことを意味する。心筋細胞は、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、アクチニン等のマーカーを発現する。本明細書においては、「心筋細胞」という用語は、心筋細胞及び心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）を包含する概念として用いられる。

未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導は、例えば、国際公開第０１／０４８１５１号、国際公開第２００５／０３３２９８号、国際公開第２００８／１５００３０等に記載の方法を用いて行うことができる。例えば、未分化幹細胞を培養する培地に、心筋細胞への分化を惹起する物質を添加することにより、心筋細胞への分化・誘導を行ってもよい。
そのような物質としては、例えば、デメチラーゼ、５−アザシチジン、ＤＭＳＯなどの染色体ＤＮＡ脱メチル化剤；ＰＤＧＦ、繊維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）、エンドセリン１（ＥＴ１）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）および骨形成因子４（ＢＭＰ−４）、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンなどの接着分子；レチノイン酸などのビタミン；Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＴＥＦ−１、ＴＥＦ−３、ＴＥＦ−５およびＭｅｓＰ１などの転写因子；心筋細胞由来の細胞外基質；ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテなどのＢＭＰアンタゴニスト等を挙げることができる。

線維芽細胞とは、線維産生能を有する細胞のことを意味する。細胞が線維芽細胞であることは、線維産生能等の線維芽細胞に特異的な性質や、各種マーカーの発現から判断してもよい。線維芽細胞マーカーとしては、ビメンチン、ＥＲ−ＴＲ７等のマーカーが知られており、マーカーが陽性である細胞を線維芽細胞であると判断できる。

本実施形態の方法は、未分化幹細胞除去剤の存在下で、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養する工程を含む。当該工程は、上記のような細胞培養用培地に未分化幹細胞除去剤を添加し、細胞混合物を培養することにより、実施することができる。あるいは、未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を培養している培地中に、未分化幹細胞除去剤を添加してもよい。

未分化幹細胞除去剤の培地への添加量は、特に限定されないが、培地に添加したときの最終濃度として、例えば、０．１〜５００μＭ、１〜５０μＭ、３〜１５μＭ等を例示することができる。

未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養は、細胞培養に一般的に用いられる温度で行えばよい。例えば、培養温度として、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３８℃、より好ましくは３０〜３７℃を例示することができる。

未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の培養時間は、特に限定されないが、好ましくは２４時間以上、より好ましくは４８時間以上である。必要に応じて、細胞は継代培養されてもよい。継代の前後で、培地の組成は、未分化幹細胞除去剤を含む限りにおいて、同一であってもよく異なっていてもよい。

未分化幹細胞除去剤の存在下での細胞混合物の細胞密度は、特に限定されないが、１×１０〜１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好ましく、１×１０^３〜１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがより好ましく、１×１０^４〜１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬがさらに好ましい。

本実施形態の方法により、未分化幹細胞を除去した細胞混合物は、未分化幹細胞の割合が低減され、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の未分化幹細胞除去方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された細胞混合物を得ることができる。したがって、本実施形態の方法で得られた細胞混合物は、生体へと移植される移植用細胞として好適に使用することができる。

また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞を除去するための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。

≪移植用細胞の製造方法≫
１実施形態において、本発明は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法、を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。

本実施形態の移植用細胞の製造方法に使用する未分化幹細胞除去剤は、上記実施形態の未分化幹細胞除去剤である。

本実施形態の方法における工程（ｉ）は、未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程である。工程（ｉ）における未分化幹細胞は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞であることがより好ましい。

工程（ｉ）において、未分化幹細胞から誘導する分化細胞の種類は、特に限定されず、所望の分化細胞に誘導すればよい。未分化幹細胞から分化細胞への誘導方法は、目的とする分化細胞に応じて、公知の方法を適宜選択して用いることができる。未分化幹細胞から誘導する分化細胞の例としては、例えば、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、免疫細胞（例、リンパ球等）、血管細胞、眼細胞（例、網膜色素上皮細胞等）、血液細胞（例、巨核球、赤血球等）、その他各組織細胞、及びそれらの前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な分化細胞の例としては、心筋細胞が挙げられる。未分化幹細胞から心筋細胞への誘導は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。

一般的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、工程（ｉ）で得られる細胞混合物は、通常、未分化幹細胞が残存し、未分化幹細胞と分化細胞との細胞混合物となっている。また、前記細胞混合物は、任意に培地の成分等を含み得る。前記細胞混合物の形態は、特に限定されず、集合状態、分散状態、培養容器に接着した状態、細胞外マトリクス等の接着因子へ接着した状態、シート状、塊状、コロニー、胚様体、細胞塊、組織、器官等であり得る。

本実施形態の製造方法における工程（ｉｉ）は、前記工程（ｉ）により得られた細胞集団を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程である。本工程（ｉｉ）における培養は、上記≪未分化幹細胞除去方法≫で例示したような方法により行うことができる。

本実施形態の製造方法は、上記工程（ｉ）及び（ｉｉ）に加えて、他の工程を追加してもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。これらの工程を追加する場合、これらの工程は、上記工程（ｉ）及び（ｉｉ）の間、又は上記工程（ｉｉ）の後に行われる。

分化細胞の精製工程や回収工程は、分化細胞の種類に応じて、適宜適切な方法を選択することができる。例えば、分化細胞が心筋細胞である場合には、国際公開第２００６／０２２３７７号、国際公開第２００７／０８８８７４号、国際公開２０１６／０１０１６５号に記載の方法等を、精製工程に適用してもよい。また、回収工程としては、遠心分離法等を適用してもよい。

本実施形態の製造方法において得られる移植用細胞において、分化細胞／（未分化幹細胞＋分化細胞）×１００で表される分化細胞率は、例えば、５０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。

本実施形態の製造方法により製造された移植用細胞は、未分化幹細胞が選択的に除去されているため、未分化幹細胞の割合が低減されており、専ら分化細胞により構成される。そのため、本実施形態の製造方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を得ることができる。そのため、前記移植用細胞を生体に移植した場合でも、奇形腫形成等のリスクが低減される。

また、他の態様において、本発明は、移植用細胞を製造するための、脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。

さらに、他の態様において、本発明は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法によって製造された移植用細胞、を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。

≪医薬組成物≫
１実施形態において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物、を提供する。

本実施形態の医薬組成物が含む未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。
未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、特に限定されないが、当該分化細胞の移植を必要とするヒト、又はヒト以外の動物であり得る。例えば、当該分化細胞が正常に機能していない患者、当該分化細胞を含む組織に欠損、障害等を有する患者であってよい。ヒト以外の動物は、特に限定されないが、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、サルなどの霊長類；マウス、ラットなどのげっ歯類；イヌ、ネコなどのペット動物；牛、ウマ、ヒツジ、ブタなどの家畜類等が挙げられる。未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、未分化幹細胞が由来する生物と同種の生物であることが好ましく、未分化幹細胞が由来する個体と同一の個体であることがより好ましい。未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、後述の≪治療方法等≫に記載の「移植が必要な対象」であってもよい。

治療的有効量である限り、本実施形態の医薬組成物における、脂肪酸合成阻害剤等の含有量は特に制限されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもの等を挙げることができる。

本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞除去剤に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもの等を挙げることができる。

また、本実施形態の医薬組成物は、他の成分として、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したもののほかに、アジュバント等の免疫賦活剤を含んでいてもよい。アジュバントの例としては、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、Ｏ／Ｗエマルジョン等が含まれるが、これらに限定されない。また、本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞除去剤に加えて、薬理活性を有する他の薬剤を含んでいてもよい。他の薬剤の例としては、例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、解熱剤、未分化幹細胞に対して免疫誘導できる化合物等が挙げられる。

本実施形態の医薬組成物の剤型は、特に限定されず、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤、エマルション製剤、リポソーム製剤等の種々の剤型とすることができる。

本実施形態の医薬組成物は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するために使用される。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、全ての未分化幹細胞を分化細胞に誘導することは難しいため、移植用細胞として調製された分化細胞中に、未分化幹細胞が残存してしまう場合がある。未分化幹細胞が残存したまま移植された場合、生体内で未分化幹細胞が増殖し、奇形腫等の疾患を生じる恐れがある。本実施形態の医薬組成物は、そのような疾患を治療又は予防するために、当該分化細胞を移植された対象に投与される。なお、未分化幹細胞の増殖に起因する疾患は、特に限定されないが、奇形腫や癌等を挙げることができる。

本実施形態の医薬組成物の投与対象において、移植される分化細胞は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞であれば、特に限定されない。分化細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞から誘導されたものであり、より好ましくはｉＰＳ細胞から誘導されたものである。一例として、分化細胞は、ｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞である。また、分化細胞は、上記≪移植用細胞の製造方法≫で記載した方法により製造された移植用細胞であってもよい。

本実施形態の医薬組成物の投与経路は、有効成分の種類、製剤の形態、移植された分化細胞の種類、分化細胞が移植された場所等に応じて、適宜選択することができる。例えば、≪未分化幹細胞除去剤≫で述べたものと同様の投与方法であってもよい。

本実施形態の医薬組成物の投与量及び投与間隔は、移植した分化細胞の種類、移植量、及び移植場所等；移植を受けた対象の年齢、性別、体重等；医薬組成物の投与方法等により、適宜選択することができる。投与量は、例えば、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．５ｍｇ〜５ｍｇ等を例示することができる。また、投与間隔は、１日に１〜数度、数日〜数ヶ月に１度等であってよい。例えば、１日に一度、又は１週間に一度等の投与を例示することができる。

本実施形態の医薬組成物によれば、生体内に移植された細胞に未分化幹細胞が残存していた場合であっても、生体内で未分化幹細胞を選択的に除去することができる。そのため、生体内で未分化幹細胞が増殖することに起因する疾患を治療又は予防することができる。

他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。

また、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種の使用、を提供する。

さらに、他の態様において、本発明は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象における、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の治療又は予防に使用するための、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種、を提供する。

≪治療方法等≫
１実施態様において、本発明は、未分化幹細胞除去剤を、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に投与することを含む、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法、を提供する。

本実施形態の方法において、対象に投与される未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化幹細胞除去剤≫で記載したものと同様である。本実施形態の方法は、肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に投与することを含む、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防する方法であるともいえる。
また、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植される対象は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様である。 上記未分化幹細胞除去剤は、上記≪医薬組成物≫に記載の医薬組成物の形態で対象に投与されてもよい。また、未分化幹細胞除去剤は、上記脂肪酸合成阻害剤等以外の他の成分と組み合わせて、対象に投与されてもよい。他の成分は、特に限定されないが、上記≪未分化幹細胞除去剤≫及び≪医薬組成物≫で記載したもの等を挙げることができる。

上記未分化幹細胞除去剤は、未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象に、脂肪酸合成阻害剤等についての治療的有効量が投与される。脂肪酸合成阻害剤等の治療的有効量は、移植した分化細胞の種類、移植量、及び移植場所等；移植を受けた対象の年齢、性別、体重等；未分化幹細胞除去剤の投与方法等により異なるが、脂肪酸合成阻害剤等の有効成分量として、例えば、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．５ｍｇ〜５ｍｇ等を例示することができる。

投与対象、及び対象疾患は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様のものを対象とすることができる。また、投与方法は、上記≪医薬組成物≫で記載したものと同様に行うことができる。

また、１実施態様において、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の移植方法を提供する：
（ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；
（ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、未分化幹細胞除去剤の存在下で培養し、移植用細胞を得る工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程。

本実施形態の移植方法における工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、上記≪移植用細胞の製造方法≫で記載した工程（ｉ）及び（ｉｉ）と同様に行うことができる。また、本実施形態の移植方法の工程（ｉｉ）で使用する未分化幹細胞除去剤は、上記≪未分化細胞除去剤≫で記載したものと同様である。

本実施形態の移植方法における工程（ｉｉｉ）は、前記工程（ｉｉ）で得られた移植用細胞を、移植が必要な対象に移植する工程である。「移植が必要な対象」とは、当該対象の生体内において、前記工程（ｉｉ）で得られた移植用細胞と同種の細胞に欠陥、損傷等が生じており、前記移植用細胞を移植することにより、当該細胞の欠陥、損傷等に起因する症状の改善が見込める対象である。移植は、一般的な細胞移植の手法により行うことができる。

本実施形態の移植方法は、上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）に加えて、他の工程を追加してもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。これらの工程を追加する場合、これらの工程は、上記工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）の間に行われる。このような精製工程や回収工程は、前記≪移植用細胞の製造方法≫に記載したように行うことができる。

本実施形態の移植方法によれば、未分化幹細胞を実質的に含まないか、未分化幹細胞の割合が低減された移植用細胞を生体内に移植することができるため、奇形腫形成等のリスクが低減される。

また、本実施形態の移植方法は、工程（ｉｉｉ）の後に、さらに以下の工程（ｉｖ）を行ってもよい。
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で移植用細胞を移植した対象に、未分化幹細胞除去剤を投与する工程

上記工程（ｉｖ）は、上記実施形態の治療又は予防する方法と同様に行うことができる。工程（ｉｖ）を行うことにより、たとえ移植用細胞に未分化幹細胞が残存したまま移植された場合であっても、奇形腫等の当該未分化幹細胞の増殖に起因する疾患の発症を予防することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ_２条件に設定されたインキュベーター内で行った。

（未分化幹細胞の培養）
ヒト胚性幹細胞は、WiCell Research Instituteから入手したＨ９株を使用し、ヒト人工多能性幹細胞は、国立大学法人・京都大学ｉＰＳ細胞研究所山中伸弥教授から入手した。
ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞は、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ ３５４２７７）を用いて未分化維持培養を行った。培養液は、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ｃａｔ １１８７５−１１９）を用いた。未分化維持培養液に関しては、ｍＴｅＳＲ１の他に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）など、フィーダーフリー用の培地として一般的に使用されているものであれば使用可能である。またマトリックスとして、マトリゲルの他に、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）やｉＭａｔｒｉｘ−５１１（Ｔａｋａｒａ ｎｏ．８９２００１）などがあり、その他のフィーダーフリー用のマトリックスとして一般的に使用されているものであれば使用可能である。
植え継ぎに際しては、ＣＴＫ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｅｐｒｏ ＣＥＬＬ）、３７℃５分にてヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞のコロニーを分離した。細胞の分散処理に関しては、ＣＴＫ ｓｏｌｕｔｉｏｎ以外に、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｎｏ．１１１０５０１）やＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ／Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も使用可能である。

（未分化幹細胞からの心筋細胞の誘導）
未分化幹細胞から心筋細胞への分化・誘導にあたり、今回の実験で用いた心筋細胞の分化誘導法は以下の通りである。
・心筋細胞への分化・誘導にあたり、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞が５０〜９０％コンフルエントになったところで、ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢ２７（インスリンなし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ又はＷａｋｏ）６μＭを添加したものに培地を交換した（Ｄａｙ ０）。
・Ｄａｙ １〜Ｄａｙ ２は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・次いで、Ｄａｙ ３〜Ｄａｙ ５は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地に、さらにＩＷＰ２ ５μＭ又はＩＷＲ−１（Ｓｉｇｍａ Ｉ０１６１）５μＭを添加した培地で培養を行った。
・さらに、Ｄａｙ ６〜Ｄａｙ ７は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（−）培地で培養を行った。
・そして、Ｄａｙ ８以降は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７インスリン（＋）培地で培養を行った（Ｌｉａｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１３，８，１６２−１７５）。Ｄａｙ ８〜Ｄａｙ １１の段階で、拍動する心筋細胞を確認することができた。

（未分化幹細胞からの線維芽細胞の誘導）
未分化幹細胞から線維芽細胞への分化・誘導にあたり、今回の実験で用いた線維芽細胞誘導法は、以下の通りである。
・ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞が５０〜９０％コンフルエントになったところで、ＭＥＭα培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％ＦＢＳを添加した培養液（ｂＦＧＦ不含）に交換し、培養を行った。、２〜４日おきに培養液を交換して培養することにより、約１０日でビメンチン陽性の線維芽細胞を得ることが出来た(Ｔｏｈｙａｍａ Ｓ， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１６参照)。

［実験例１］ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とｉＰＳ細胞とでのＦＡＳＮの発現の比較
上記に示す手順によりヒトｉＰＳ細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトｉＰＳ細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。ＯＣＴ４は未分化状態を表すマーカーとして使用した。ＦＡＳＮは、図１に示すとおり、脂肪酸合成に関与する酵素タンパク質である。上記細胞混合物の免疫染色により、ＯＣＴ４及びＦＡＳＮを発現する細胞を検出した。結果を図２に示す。また、ＤＡＰＩ染色の結果も併せて示す。

図２に示される結果から、ＯＣＴ４及びＦＡＳＮの発現細胞が重なることが判明した。このことから、ＯＣＴ４を発現しないヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞では、ＦＡＳＮの発現が低い一方で、ＯＣＴ４を発現する未分化のヒトｉＰＳ細胞では、ＦＡＳＮの発現が非常に高いことが明らかとなった。

［実験例２］脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、各種未分化幹細胞株の培養
ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、図３に示す各終濃度（２μＭ、４μＭ、６μＭ、８μＭ、１０μＭ）となるようＯｒｌｉｓｔａｔ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｏ４１３９）を添加し、本発明の１実施形態に係る培地を得た。Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まない培地（０μＭ）、及び上記の各終濃度でＯｒｌｉｓｔａｔを含む各培地にて、以下の３種の細胞株を７２時間培養した。
・２５３Ｇ４：ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）株
・Ｆｆｌ１４：ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）株
・Ｈ９：ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）株
７２時間の培養の後、細胞が有するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を、ＳｔｅｍＴＡＧ（登録商標）アルカリホスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ ８６−Ｒ）で発色させてＡＰ染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図３に示す。

図３に示される結果から、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含む培地での培養により、Ｏｒｌｉｓｔａｔ濃度依存的に、各未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。

［実験例３］各種脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、図４に示す各終濃度となるよう以下の６種の脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤をそれぞれ添加し、本発明の１実施形態に係る培地を得た。
・Ｃ７５ ：ＦＡＳＮ阻害
・ＬＹ ２９４００２：ＡＣＬＹ阻害
・ＳＢ ２０４９９０：ＡＣＬＹ阻害
・Ｅｔｏｍｏｘｉｅｒ：ＣＰＴ１阻害
・Ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ：ＣＰＴ１阻害
上記の脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含む各培地にて、２５３Ｇ４細胞を７２時間培養した。
７２時間の培養の後、ＡＬＰ染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図４に示す。

図４に示される結果から、上記のいずれの脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤を含む培地での培養によっても、脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の濃度依存的に、未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。

［実験例４］脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、純化精製心筋細胞の培養
上記に示す手順によりヒトｉＰＳ細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトｉＰＳ細胞とを含む細胞混合物を用意した。文献（Tohyama,et al., (2016) Cell Metabolism, 23, 663-674.）に記載の方法に沿って、グルコース（−）グルタミン（−）乳酸添加培地で５日間ほど上記細胞混合物を培養して心筋細胞以外の細胞を死滅させ、純化精製心筋細胞を得た。次いで、終濃度１０μＭでＯｒｌｉｓｔａｔを含むＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（＋））で、１６日間培養した。コントロールとして、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まないＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（−））でも同様に培養を行った。Ｄａｙ９及びＤａｙ１６の心筋細胞の様子を図５に示す。

図５に示される結果から、Ｄａｙ９〜Ｄａｙ１６にかけて心筋細胞の成熟化（肥大化）が確認され、本実施形態に係る培地を用いて、純化精製心筋細胞を良好に培養可能であることが示された。

［実験例５］脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、線維芽細胞の培養
上記に示す手順によりヒトｉＰＳ細胞から誘導した線維芽細胞と、ヒトｉＰＳ細胞とを含む細胞混合物を用意した。前記細胞混合物を、終濃度１０μＭでＯｒｌｉｓｔａｔを含むＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（＋））で、９日間培養した。コントロールとして、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まないＭＥＭα＋１０％ＦＢＳ培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（−））でも同様に、前記細胞混合物の培養を行った。Ｄａｙ９の心筋細胞及びそのＶｉｍｅｎｔｉｎ染色の結果を図６に示す。

図６に示される結果から、本発明の１実施形態に係る培地を用いて、ヒトｉＰＳ細胞由来線維芽細胞を良好に培養可能であることが示された。

［実験例６］脂肪酸合成阻害剤を含有する培地での、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とｉＰＳ細胞とを含む細胞混合物の培養
上記に示す手順によりヒトｉＰＳ細胞から誘導した後に純化精製した心筋細胞と、ヒトｉＰＳ細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。上記細胞混合物の、ＯＣＴ４に対する免疫染色を実施した。上記細胞混合物を、終濃度１０μＭでＯｒｌｉｓｔａｔを含むＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（＋））で、７２時間培養した。コントロールとして、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（−））でも同様に培養を行った。７２時間の培養の後、免疫染色によりＯＣＴ４の発現細胞を検出した。２反復試験分の結果を図７に示す。また、ＤＡＰＩ染色の結果も併せて示す。同結果からＯｃｔ４を発現する細胞のコロニー数を定量した３反復試験分の結果を図８に示す。

図７〜８に示される結果から、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まない培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（−））で培養を行った場合、ＯＣＴ４を発現する未分化幹細胞が残存していること確認された。一方、Ｏｒｌｉｓｔａｔを含む培地（Ｏｒｌｉｓｔａｔ（＋））で培養を行った場合、ＯＣＴ４を発現する未分化幹細胞の残存は検出されなかった。
このことから、本発明の１実施形態に係る未分化幹細胞除去剤で、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞と、ヒトｉＰＳ細胞と、が混在した状態にある細胞混合物を培養することにより、当該細胞混合物において、未分化状態の細胞特異的に細胞死を誘導することができることが示された。また、当該細胞混合物から、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を含む分化状態の細胞のみを、選択的に選抜することができることが示された。
実験例６にて、このようにして得られた細胞混合物からは、未分化幹細胞の性質を有する細胞が除かれており、未分化幹細胞の除去率も非常に高いものであった。当該細胞混合物は、生体への移植等の用途への適用が見込まれ、際立った顕著な有用性が示された。
［実験例７］ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とｉＰＳ細胞とでのＦＡＳＮの発現の比較
上記に示す手順によりヒトｉＰＳ細胞から誘導した心筋細胞と、ヒトｉＰＳ細胞とが混在した状態にある細胞混合物を用意した。トロポニンＩ（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ：ＴｎＩ）は心筋細胞のマーカーとして使用した。ＦＡＳＮは、図１に示すとおり、脂肪酸合成に関与する酵素タンパク質である。上記細胞混合物の免疫染色により、ＴｎＩ及びＦＡＳＮを発現する細胞を検出した。結果を図１０に示す。また、ＤＡＰＩ染色の結果も併せて示す。

図１０に示される結果から、ＴｎＩ及びＦＡＳＮの発現細胞は重ならないことが判明した。このことから、ＴｎＩを発現するヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞では、ＦＡＳＮの発現が低い一方で、ＴｎＩを発現しない未分化のヒトｉＰＳ細胞では、ＦＡＳＮの発現が非常に高いことが明らかとなった。

また、抗ＦＡＳＮ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４）及びヒトｉＰＳ細胞から誘導した心筋細胞における、ＦＡＳＮの発現を確認した。陰性対照として、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）を用いた。結果を図１１に示す。
図１１に示される結果から、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞ではＦＳＡＮの発現は検出されず、ヒトｉＰＳ細胞ではＦＡＳＮが高発現することが示された。

［実験例８］コレステロール合成阻害剤を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、図１２に示す各終濃度（０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ）となるようＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎ（Ｓ６１９６：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加し、本発明の１実施形態に係る培地を得た。
Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎを含まない培地（０μＭ）及び上記各終濃度でＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎを含む培地にて、２５３Ｇ４細胞を７２時間培養した。
７２時間の培養の後、ＡＬＰ染色を行い、赤色に染色された細胞を生細胞として確認した。各ウェルの様子を図１２に示す。

図１２に示される結果から、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎを含む培地での培養によっても、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎの濃度依存的に、未分化幹細胞の細胞死が誘導されることが確認された。

［実験例９］脂肪酸合成阻害剤及びパルミチン酸を含有する培地での、未分化幹細胞株の培養
ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、図１３に示す各終濃度（２μＭ、６μＭ、８μＭ）となるようＯｒｌｉｓｔａｔ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｏ４１３９）を添加し、本発明の１実施形態に係る培地を得た。Ｏｒｌｉｓｔａｔを含まない培地（０μＭ）、及び上記の終濃度でＯｒｌｉｓｔａｔを含む各培地に、さらに、パルミチン酸（終濃度５０μＭ）、カルニチン（終濃度０．５ｍＭ）、及びＢＳＡ（終濃度８．３μＭ）を添加した各培地、並びにカルニチン（終濃度０．５ｍＭ）とＢＳＡ（終濃度８．３μＭ）とのみを添加した各培地を用意した。前記の各培地にて、ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ４）を７２時間培養した。
７２時間の培養の後、生細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｓｓａｙ（Ｌ３２２４：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で検出した。各ウェルの様子を図１３に示す。また、同結果から、生細胞数を定量した結果を図１４に示す。

図１３〜１４に示される結果から、Ｏｒｌｉｓｔａｔに加えてカルニチンとＢＳＡとのみを添加した培地（ＢＳＡ）での培養では、Ｏｒｌｉｓｔａｔ濃度依存的に、ヒトｉＰＳの細胞死が誘導されることが確認された。一方、Ｏｒｌｉｓｔａｔに加えて、パルミチン酸、カルニチン、及びＢＳＡを添加した培地（ＰＡ−ＢＳＡ）での培養では、ヒトｉＰＳ細胞の細胞死が抑制されることが確認された。脂肪酸であるパルミチン酸の添加により、ヒトｉＰＳ細胞の細胞死が抑制されたことから、ＯｒｌｉｓｔａｔによるヒトｉＰＳ細胞の細胞死の誘導は、脂肪酸合成の阻害により生じていることが確認された。

［実験例１０］ＦＡＳＮをノックダウンした未分化幹細胞株の培養
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ４）に、ＦＡＳＮに対するｓｉＲＮＡ（ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡ）を導入して、ＦＡＳＮノックダウン未分化幹細胞株（ＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株）を作製した。また、陰性対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｎ／Ｃ）のｓｉＲＮＡを導入した未分化幹細胞株を、陰性対照株（Ｎ／Ｃ未分化幹細胞株）として作製した。ＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株、及びＮ／Ｃ未分化幹細胞株におけるＦＡＳＮ発現を、抗ＦＡＳＮ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した結果を図１５に示す。図１５の結果から、ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡ導入により、ＦＡＳＮの発現がノックダウンできていることを確認した。使用した各ｓｉＲＮＡは、以下の通りである。
ＦＡＳＮ ｓｉＲＮＡ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ｓｉＲＮＡ ＩＤ：ｓ５０３０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
Ｎ／Ｃ ｓｉＲＮＡ：Ｓｉｌｅｎｃｅｒ^ＴＭ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｏ． １ ｓｉＲＮＡ（ＡＭ４６１１：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）
上記ＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株、及びＮ／Ｃ未分化幹細胞株を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で７２時間培養し、細胞増殖を確認した。結果を図１６に示す。

図１６に示される結果から、ＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株では、Ｎ／Ｃ未分化幹細胞株と比較して、細胞増殖が抑制されることが確認された。このことから、ＦＳＡＮは、未分化幹細胞の生存及び増殖に、必須な因子であることが示された。

［実験例１１］パルミチン酸を含有する培地での、ＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株の酸培養
ＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ社製）又はｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に、パルミチン酸（終濃度５０μＭ）、カルニチン（終濃度０．５ｍＭ）、及びＢＳＡ（終濃度８．３μＭ）を添加した培地（ＰＡ−ＢＳＡ培地）、並びにカルニチン（終濃度０．５ｍＭ）とＢＳＡ（終濃度８．３μＭ）とのみを添加した培地（ＢＳＡ培地）の各培地を用意した。前記の各培地にて、上記実験例１１で作製したＦＡＳＮ ＫＤ未分化細胞株及びＮ／Ｃ未分化細胞株を７２時間培養し、細胞増殖を確認した。結果を図１７に示す。

図１７に示される結果から、ＰＡ−ＢＳＡ培地で培養したＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株（ＦＡＳＮ ＫＤ ｗ／ＰＡ−ＢＳＡ）、ＢＳＡ―ＰＡ培地で培養したＮ／Ｃ未分化幹細胞株（Ｎ／Ｃ ｗ／ＰＡ−ＢＳＡ）、及びＢＳＡ培地で培養したＮ／Ｃ未分化幹細胞株（Ｎ／Ｃ ｗ／ＢＳＡ）は、同程度の細胞増殖を示した。一方、ＢＳＡ培地で培養したＦＡＳＮ ＫＤ未分化幹細胞株は、上記３株と比較して、細胞増殖が抑制された。このことから、ＦＡＳＮにより合成されるパルミチン酸は、未分化幹細胞の生存及び増殖に、必須な成分であることが示された。

本発明によれば、未分化幹細胞の高効率な除去を可能とする未分化幹細胞除去剤、及び未分化幹細胞除去方法等を提供することができ、再生医療分野等に広く利用可能である。

Claims (17)

1. 脂肪酸合成阻害剤、脂肪酸利用阻害剤、及びコレステロール合成阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
2. 前記脂肪酸合成阻害剤が、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、脂肪酸合成酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、及びマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的として脂肪酸合成を阻害するものであり、
   前記脂肪酸利用阻害剤が、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１を標的として脂肪酸利用を阻害するものである、
   請求項１に記載の未分化幹細胞除去剤。
3. 前記脂肪酸合成阻害剤又は脂肪酸利用阻害剤の適用対象中の濃度が、０．１〜５００μＭである、請求項１又は２に記載の未分化幹細胞除去剤。
4. 前記コレステロール合成阻害剤が、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼからなる群から選ばれる少なくとも一種の因子を標的としてコレステロール合成を阻害するものである、請求項１に記載の未分化幹細胞除去剤。
5. 前記コレステロール合成阻害剤の適用対象中の濃度が、０．０１〜５０μＭである、請求項１又は４に記載の未分化幹細胞除去剤。
6. グルコース、グルタミン、及びメチオニンからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤。
7. オルリスタット、Ｃ７５、ＬＹ２９４００２、ＳＢ２０４９９０、エトモキシル、ペルヘキシリン、及びシンバスタチン、並びにこれらの塩からなる群から選ばれる１又は２以上を含有することを特徴とする、未分化幹細胞除去剤。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤を含む培地。
9. 未分化幹細胞及び分化細胞を含む細胞混合物を、請求項１〜７のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養することを含む、未分化幹細胞除去方法。
10. 前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項９に記載の未分化幹細胞除去方法。
11. 前記分化細胞が心筋細胞である、請求項１０又は１１に記載の未分化幹細胞除去方法。
12. 以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、移植用細胞の製造方法：
    （ｉ）未分化幹細胞から所望の分化細胞を誘導する工程；及び
    （ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた細胞混合物を、請求項１〜７のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤の存在下で培養する工程。
13. 前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１２に記載の製造方法。
14. 前記分化細胞が心筋細胞である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
15. 未分化幹細胞から誘導された分化細胞を移植された対象において、前記未分化幹細胞の増殖に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の未分化幹細胞除去剤を含む、医薬組成物。
16. 前記未分化幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記未分化幹細胞から誘導された分化細胞が心筋細胞である、請求項１５又は１６に記載の医薬組成物。