CN110050060A

CN110050060A - 未分化干细胞去除剂以及去除未分化干细胞的方法

Info

Publication number: CN110050060A
Application number: CN201780063213.0A
Authority: CN
Inventors: 远山周吾; 福田恵一; 藤田淳; 田野崎翔
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-07-23
Also published as: SG11201903254PA; KR102218042B1; RU2735247C1; JPWO2018074457A1; IL265980A; WO2018074457A1; JP6811489B2; AU2017346898A1; EP3527657A1; KR20190052096A; US20190300857A1; CA3040637A1; EP3527657A4; AU2017346898B2; CA3040637C

Abstract

本申请提供一种未分化干细胞去除剂，其含有选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种；一种去除未分化干细胞的方法，其包括在未分化干细胞去除剂的存在下培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物；以及一种用于移植的细胞的制备方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：从未分化干细胞诱导所需的分化细胞的步骤(i)，以及在未分化干细胞去除剂的存在下对在步骤(i)中所获得的细胞混合物进行培养的步骤(ii)。

Description

未分化干细胞去除剂以及去除未分化干细胞的方法

技术领域

本发明涉及未分化干细胞去除剂以及去除未分化干细胞的方法。本发明进一步涉及一种含有未分化干细胞去除剂的培养基，一种用于移植的细胞的制备方法，以及一种药物组合物。

要求于2016年10月17日提交的日本专利申请号2016-203839的优先权，其内容通过引用结合于本申请中。

背景技术

近年来，对多能干细胞如胚胎干细胞(ES细胞)和诱导性多能干细胞(iPS细胞)的研究取得了进展。因为这些细胞是多能的，所以可以通过分化和诱导产生分化成所需谱系的细胞，并且可以在医学移植中使用所产生的细胞。

胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的分化和诱导通常在体外进行。

然而，在体外，难以引起所有干细胞分化成目标谱系。因此，未分化干细胞可在分化和诱导操作后部分地保留。由于这种未分化干细胞具有增殖活性并且可以分化成各种细胞，所以在将这些未分化干细胞移植到活体中的情况下，可以形成畸形肿瘤(参见，例如，非专利文献1)。出于这个原因，难以将通过分化和诱导干细胞产生的细胞群直接移植到活体中以被用于治疗。

因此，需要去除未分化干细胞，以便安全地将从干细胞分化和诱导的细胞移植到活体中，从而获得理想的治疗效果。另外，在有未分化干细胞残留而进行移植的情况中，有必要抑制未分化干细胞在生物体内的增殖。

迄今已报道了在培养条件下可选择性去除未分化干细胞的方法(参见，例如，非专利文献2至4)。本发明的发明人的研究小组还开发了一种从非心肌细胞和未分化干细胞中选择心肌细胞的方法(参见专利文献1至6和非专利文献5)。

引用列表

专利文献

【专利文献1】PCT国际公开号WO2006/022377

【专利文献2】PCT国际公开号WO2007/088874

【专利文献3】PCT国际公开号WO2009/017254

【专利文献4】PCT国际公开号WO2010/114136

【专利文献5】PCT国际公开号WO2011/052801

【专利文献6】PCT国际公开号WO2016/010165

非专利文献

【非专利文献1】Miura et al.,(2009)Nature Biotech.,8,743-745.

【非专利文献2】Ben-David,et al.,(2013)Cell Stem Cell,12,167-179.

【非专利文献3】Wang,et al.,(2009)Science,325,435-439.

【非专利文献4】Shiraki,et al.,(2014)Cell Metabolism,19,780-794.

【非专利文献5】Tohyama,et al.,(2016)Cell Metabolism,23,663-674.

发明内容

然而，为了降低未分化干细胞的残留比例，仍然存在进一步研究去除未分化干细胞的技术的空间。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种能够高效去除未分化干细胞的未分化干细胞去除剂以及一种去除未分化干细胞的方法。

问题的解决方案

作为实现上述目的的深入研究的结果，本发明的发明人发现，通过在脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂或者胆固醇合成抑制剂的存在下培养未分化干细胞，可以诱导未分化干细胞的细胞死亡。因此，本发明的发明人完成了本发明。

即，本发明包括以下方面。

[1]一种未分化干细胞去除剂，其含有选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂所组成的组中的至少一种。

[2]根据[1]所述的未分化干细胞去除剂，

其中，所述脂肪酸合成抑制剂通过靶向选自由ATP柠檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶以及丙二酰辅酶A脱羧酶所组成的组中的至少一种因子来抑制脂肪酸合成，并且

所述脂肪酸利用抑制剂通过靶向肉毒碱棕榈酰转移酶1来抑制脂肪酸的利用。

[3]根据[1]或[2]所述的未分化干细胞去除剂，其中，施用对象中的所述脂肪酸合成抑制剂或所述脂肪酸利用抑制剂的浓度为0.1至500μM。

[4]根据[1]所述的未分化干细胞去除剂，其中，胆固醇合成抑制剂通过靶向选自乙酰辅酶A乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶所组成的组中的至少一种因子来抑制胆固醇合成。

[5]根据[1]或[4]所述的未分化干细胞去除剂，其中，施用对象中的所述胆固醇合成抑制剂的浓度为0.01至50μM。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的未分化干细胞去除剂，还含有选自由葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸所组成的组中的至少一种化合物。

[7]一种未分化干细胞去除剂，其含有选自由奥利司他、C75、LY294002、SB204990、乙莫克舍、哌克昔林和辛伐他汀以及其盐类所组成的组中的一种或两种或更多种。

[8]一种培养基，其含有[1]～[7]中任一项所述的未分化干细胞去除剂。

[9]一种去除未分化干细胞的方法，包括在[1]～[7]中任一项所述的未分化干细胞去除剂的存在下，培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物。

[10]根据[9]所述的去除未分化干细胞的方法，其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

[11]根据[9]或[10]所述的去除未分化干细胞的方法，其中，所述分化细胞是心肌细胞。

[12]一种用于移植的细胞的制备方法，包括以下步骤(i)和(ii)：

步骤(i)：从未分化干细胞中诱导所需的分化细胞；以及

步骤(ii)：在[1]至[7]中任一项所述的未分化干细胞去除剂的存在下培养步骤(i)中获得的细胞混合物。

[13]根据[12]所述的制备方法，其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

[14]根据[12]或[13]所述的制备方法，其中，所述分化细胞是心肌细胞。

[15]一种药物组合物，用于治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞增殖引起的疾病，该药物组合物包括根据[1]至[7]中的任一项所述的未分化干细胞去除剂。

[16]根据[15]所述的药物组合物，其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

[17]根据[15]或[16]所述的药物组合物，其中，由所述未分化干细胞诱导的所述分化细胞是心肌细胞。

发明的有益效果

根据本发明的未分化干细胞去除剂，可以高效地去除未分化干细胞。

根据本发明的去除未分化干细胞的方法，可以高效地去除未分化干细胞。

附图简要说明

图1为说明细胞中脂肪酸合成途径的概略图。

图2显示了在实验示例1中在来自人iPS细胞的心肌细胞和iPS细胞之间的FASN表达的比较结果的图像。

图3显示了在实验示例2中培养的未分化干细胞系的图像。

图4显示了在实验示例3中培养的未分化干细胞系的图像。

图5显示了在实验示例4中培养的纯化和精制的心肌细胞的图像。

图6显示了在实验示例5中培养的成纤维细胞的图像。

图7显示了在实验示例6中培养的含有来自人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞的细胞混合物的图像。

图8显示了实验示例6中在含有脂肪酸合成抑制剂的培养基和不含有脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养的细胞混合物中Oct4阳性集落数的比较结果的图。

图9为说明细胞中胆固醇合成途径的概略图。

图10显示了实验示例7中在来自人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞之间的FASN表达的比较结果的图像。

图11为Western印迹的照片，其显示了在实验示例7中来源于人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞之间的FASN表达的比较结果。

图12显示了在实验示例8中培养的未分化干细胞系的图像。

图13显示了实验示例9中在含有脂肪酸合成抑制剂和脂肪酸的培养基(PA-BSA)中以及在含有脂肪酸合成抑制剂但不含脂肪酸的培养基(BSA)中培养的人iPS细胞的孔的图像。

图14显示了实验示例9中在含有脂肪酸合成抑制剂和脂肪酸的培养基(PA-BSA)中以及在含有脂肪酸合成抑制剂但不含脂肪酸的培养基(BSA)中培养的人iPS细胞的活细胞数的比较结果图。

图15是Western印迹的照片，其显示了实验示例10中在导入了FASN siRNA的未分化干细胞系和在导入了阴性对照siRNA(N/C siRNA)的未分化干细胞系之间的FASN表达的比较结果。

图16是显示了实验示例10中在导入了FASN siRNA的未分化干细胞系(FASN ND)与在导入了阴性对照siRNA的未分化干细胞系(N/C)之间的细胞增殖的比较结果的图。

图17是显示了实验示例11中分别在含有脂肪酸合成抑制剂和脂肪酸的培养基(PA-BSA)以及含有脂肪酸合成抑制剂且不含脂肪酸的培养基(BSA)中培养的导入了FASN siRNA的未分化干细胞系(FASN KD)与导入了阴性对照siRNA的未分化干细胞系(N/C)之间的细胞增殖的比较结果的图。

具体实施方式

<<定义等>>

在本说明书中，术语“未分化干细胞”用作包含具有分化多能性的多能干细胞的概念，并且可以包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)、诱导性多能干细胞(inducedplu-ripotent stem cells，iPS细胞)、由这些干细胞所诱导的具有分化多能性的细胞以及各种成体干细胞。术语“未分化干细胞”不受特别限制，只要它是具有分化多能性的细胞，并且还包括具有与上述举例说明的ES细胞和iPS细胞相当的性质的未知细胞。

基于对未分化干细胞特异性的性质的存在与否，以及对未分化干细胞特异性的各种标记物的表达，可以确定细胞是否为未分化干细胞。例如，对未分化干细胞特异性的性质的示例包括具有自我复制能力并且可以分化成具有与未分化干细胞不同性质的不同种类细胞的性质。另外，其示例还包括畸胎瘤形成能力、嵌合小鼠形成能力等作为对未分化干细胞特异性的性质。

对未分化干细胞特异的各种标记物(下文称为“未分化干细胞标记物”)是在未分化干细胞中特异性表达的因子，其示例包括Oct3/4、Nanog、Sox2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、Lin28、Fbx15等。在观察到这些未分化干细胞标记物中的至少一种的表达的情况下，可以确定该细胞是未分化干细胞。可以单独使用一种未分化干细胞标记物，或者可以组合使用其两种或更多种。在一个实施方案中，可以将表达Oct3/4的细胞确定为未分化干细胞。可以使用已知方法如RT-PCR和微阵列来检查细胞中未分化干细胞标记物的表达。

未分化干细胞可以是哺乳动物未分化干细胞、啮齿动物未分化干细胞、灵长类动物未分化干细胞或者人未分化干细胞。其示例包括人源性未分化干细胞，其更具体的示例包括人iPS细胞、人ES细胞等。

在本说明书中，术语“分化细胞”是指不具有“未分化干细胞”特性的细胞。分化细胞可以是从未分化干细胞诱导和分化的细胞，但不具有分化多能性。分化细胞可以是例如从ES细胞分化的细胞或从iPS细胞分化的细胞。分化细胞的示例包括心肌细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、神经细胞、免疫细胞如淋巴细胞、血管细胞、诸如视网膜色素上皮细胞的眼部细胞、诸如巨核细胞和红细胞的血细胞如、其他组织细胞以及上述细胞的前体细胞。

<<未分化干细胞去除剂>>

在一个实施方案中，本发明提供未分化干细胞去除剂。

本实施方式的未分化干细胞去除剂含有选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇抑制剂所组成的组中的至少一种。

在下文中，将基于实施例解释本发明。

如后述的实施例所示，本发明的发明人发现，在使脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸降解抑制剂(脂肪酸利用抑制剂)与未分化干细胞接触时，可以诱导细胞死亡。本发明的发明人发现其原因是因为人iPS细胞(未分化干细胞)中的脂肪酸合成途径增强。据推测，脂肪酸合成途径及其代谢途径被认为对未分化干细胞的存活非常重要。由于这个原因，人们认为通过抑制相关的脂肪酸合成或脂肪酸降解，在未分化干细胞中诱导细胞死亡。

此外，本发明的发明人已经发现，通过使胆固醇合成抑制剂与未分化干细胞接触可以诱导细胞死亡。胆固醇是细胞膜的组成部分，胆固醇合成途径被认为对未分化干细胞的存活非常重要。由于这个原因，人们认为通过抑制相关的胆固醇合成，在未分化干细胞中诱导细胞死亡。

另外，即使在将未分化干细胞残留的细胞群移植到生物体内的情况下，也可以通过给予脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂或胆固醇合成抑制剂选择性地去除生物体内的未分化干细胞。

在本说明书中，“脂肪酸利用抑制剂”是具有抑制利用脂肪酸的物质的合成的代谢途径的反应的功能的抑制剂，和/或抑制参与脂肪酸的降解的代谢途径的反应的功能。在本说明书中，“脂肪酸利用抑制剂”包括“脂肪酸降解抑制剂”，其抑制参与脂肪酸降解的代谢途径的反应。

作为参与脂肪酸降解的代谢途径，优选为涉及β-氧化的代谢途径。脂肪酸利用抑制剂优选为“参与β-氧化的脂肪酸代谢抑制剂”。与β-氧化相关的脂肪酸代谢的示例包括β-氧化、用于β-氧化的脂肪酸代谢物的合成、用于β-氧化的脂肪酸代谢物掺入线粒体等。

另外，作为参与利用脂肪酸的物质的合成的代谢途径，优选为参与甘油三酯和/或磷脂合成的代谢途径。脂肪酸利用抑制剂优选为“参与甘油三酯和/或磷脂合成的脂肪酸代谢抑制剂”。

这些抑制剂的种类没有特别限定，可以使用任何物质，只要其具有抑制脂肪酸合成、抑制脂肪酸利用或抑制胆固醇合成的功能，并且可以是有机物质或无机物质。有机物质优选为有机化合物，并且其示例包括低分子量化合物、核酸、肽、蛋白质等。

图1是说明天然细胞的细胞质中脂肪酸合成途径和脂肪酸降解(脂肪酸利用)途径的概略图。乙酰辅酶A(acetyl-CoA)由柠檬酸盐(citrate)通过ATP柠檬酸裂解酶(ATPcitrate lyase:ACLY)合成，脂肪酸(fatty acid，FA)由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A(malony-CoA)通过脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FASN)合成。

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)催化从乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A。丙二酰辅酶A脱羧酶(Malonyl-CoA decarboxylase,MCD)催化从丙二酰辅酶A生成乙酰辅酶A。

合成的脂肪酸通过酰基辅酶A合成酶(acyl-CoA synthetase，ACS)的作用变成脂肪酸酰基辅酶A(fatty acid acyl-CoA，FA-CoA)，经历几次反应之后，所得产物通过肉毒碱棕榈酰转移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT1)转运到线粒体中，然后用于β-氧化。

本实施方案的脂肪酸合成抑制剂可通过完全或部分抑制如图1所示的脂肪酸合成途径的任何反应来抑制脂肪酸合成。本实施方式的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向选自由ATP柠檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶以及丙二酰辅酶A脱羧酶组成的组中的至少一种因子来抑制脂肪酸合成。优选地，本实施方案的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向选自由ATP柠檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶组成的组中的至少一种因子来抑制脂肪酸合成，并且可以通过靶向选自由ATP柠檬酸裂解酶和脂肪酸合成酶组成的组的至少一个因子来抑制脂肪酸合成。

本实施方案的脂肪酸降解抑制剂可以通过完全或部分抑制如图1所示的参与β-氧化的脂肪酸降解途径的任何反应来抑制脂肪酸降解。本实施方式的脂肪酸降解抑制剂可以通过靶向肉毒碱棕榈酰转移酶1来抑制脂肪酸降解。

除了用于β-氧化之外，脂肪酸还用于合成甘油三酯和磷脂。脂肪酸酰基辅酶A用于通过甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)合成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)。此外，脂肪酸酰基辅酶A用于通过酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(acyl-glycerol-3-phosphate acyltransferase，AGPAT)合成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)。此外，脂肪酸酰基辅酶A用于通过磷脂酸磷酸酶(phosphatidatephosphatase，PAP)合成二酰基甘油(diacylglycerol，DAG、DG)。此外，脂肪酸酰基辅酶A用于通过二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)合成甘油三酯。此外，脂肪酸酰基辅酶A也通过单酰基甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)降解为脂肪酸和甘油。本实施方案的脂肪酸利用抑制剂可通过完全或部分抑制这些脂肪酸利用途径的任何反应来抑制脂肪酸的利用。

图9是说明胆固醇合成途径的概略图。乙酰乙酰基辅酶A由乙酰辅酶A通过乙酰辅酶A乙酰转移酶(acetyl-CoA acetyltransferase，ACAT2)合成。羟甲基戊二酰辅酶A(Hydroxymethylglutaryl-CoA，HMG-CoA)由乙酰乙酰基辅酶A通过羟甲基戊二酰辅酶A合酶1(acetoacetyl-CoA by hydroxymethylglutaryl-CoA Syntase 1，HMG-CoA合成酶1)合成。甲羟戊酸由HMG-CoA通过羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoAreductase，HMG-CoA还原酶)合成。然后，经过几次反应，合成胆固醇。

本实施方案的胆固醇合成抑制剂可通过完全或部分抑制如图9所示的胆固醇合成途径中的任何反应来抑制胆固醇合成。本实施方案的胆固醇合成抑制剂可以通过靶向选自由乙酰辅酶A乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶以及HMG-CoA还原酶所组成的组中的至少一个因子来抑制胆固醇合成。优选地，本实施方案的胆固醇合成抑制剂可以通过靶向HMG-CoA还原酶来抑制胆固醇合成。

脂肪酸合成抑制剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种或多种。脂肪酸利用抑制剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种或多种。胆固醇合成抑制剂可以单独使用一种，也可以组合使用两种或多种。

未分化干细胞去除剂可以含有一种脂肪酸合成抑制剂、或两种或多种脂肪酸合成抑制剂的组合。未分化干细胞去除剂可以含有一种脂肪酸利用抑制剂，或两种或多种脂肪酸利用抑制剂的组合。未分化干细胞去除剂可以含有一种或两种或多种胆固醇合成抑制剂的组合。未分化干细胞去除剂可以含有选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂所组成的组中的一种或两种或多种的组合。

本实施方式的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向脂肪酸合成酶来抑制脂肪酸合成。通过靶向脂肪酸合成酶来抑制脂肪酸合成的脂肪酸合成抑制剂的示例包括奥利司他、C75、黄酮、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，GCG)等，优选奥利司他和C75。

作为奥利司他和C75，可以使用市售产品。另外，只要本实施方式的脂肪酸合成抑制剂具有与奥利司他或C75相同的功能，则脂肪酸合成抑制剂可以是这些化合物的盐或衍生物。

奥利司他被称为由式(1)表示的化合物，(N-甲酰基-L-亮氨酸-(1S)-1-[[(2S,3S)-3-己基-4-氧代-2-氧杂环丁烷基]甲基]十二烷基酯(N-formyl-L-leucine-(1S)-1-[[(2S,3S)-3-hexyl-4-oxo-2-oxetanyl]methyl]dodecyl ester))。

已知C75为式(2)所示的化合物(四氢-4-亚甲基-2R-辛基-5-氧代-3S-呋喃羧酸(tetrahydro-4-methylene-2R-octyl-5-oxo-3S-furancarboxylic acid))。

根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向ATP柠檬酸裂解酶来抑制脂肪酸合成。通过靶向ATP柠檬酸裂解酶抑制脂肪酸合成的脂肪酸合成抑制剂的优选示例包括LY294002和SB204990。作为LY294002和SB204990，可以使用市售产品。另外，只要本实施方式的脂肪酸合成抑制剂具有与LY294002或SB204990相同的功能，脂肪酸合成抑制剂可以是这些化合物的盐或衍生物。

本实施方式的脂肪酸降解抑制剂可以通过靶向肉毒碱棕榈酰转移酶1来抑制脂肪酸降解。通过靶向肉毒碱棕榈酰转移酶1来抑制脂肪酸降解的脂肪酸降解抑制剂的示例包括乙莫克舍(Etomoxir)、哌克昔林(Perhexiline)、雷诺嗪(Ranolazine)等，且乙莫克舍和哌克昔林为优选的。可以使用市售产品作为乙莫克舍和哌克昔林。另外，只要本实施方式的脂肪酸合成抑制剂具有与乙莫克舍或哌克昔林相同的功能，则脂肪酸合成抑制剂可以是这些化合物的盐或衍生物。

本实施方式的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向乙酰辅酶A羧化酶来抑制脂肪酸的合成。

通过靶向乙酰辅酶A羧化酶抑制脂肪酸合成的脂肪酸合成抑制剂的示例包括索拉芬A(Soraphen A)、TOFA、A769662、二甲双胍、AICAR等，优选TOFA和A769662。可以使用市售产品作为TOFA和A769662。另外，只要本实施方式的脂肪酸合成抑制剂具有与TOFA或A769662相同的功能，脂肪酸合成抑制剂可以是这些化合物的盐或衍生物。

本实施方式的脂肪酸合成抑制剂可以通过靶向酰基辅酶A合酶来抑制脂肪酸合成。通过靶向酰基辅酶A合成酶抑制脂肪酸合成的脂肪酸合成抑制剂的示例包括TriascinC、TZD等。

另外，已知SREBP是控制ATP柠檬酸裂解酶、乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、酰基辅酶A合酶等的表达的转录因子。本实施方式的脂肪酸合成抑制剂和/或脂肪酸利用抑制剂可以抑制SREBP的功能，其示例包括Fatostatin、FGH110019等。

本实施方式的胆固醇合成抑制剂可以通过靶向HMG-CoA还原酶来抑制胆固醇合成。通过靶向HMG-CoA还原酶抑制胆固醇合成的胆固醇合成抑制剂的示例包括普伐他汀(Pravastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、阿托伐他汀(Atorvastatin)、匹他伐他汀(Pitavastatin)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、洛伐他汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)等。优选为普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹他伐他汀和瑞舒伐他汀，更优选为辛伐他汀。可以使用市售产品作为普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹他伐他汀和瑞舒伐他汀。此外，只要本实施方案的胆固醇合成抑制剂具有与普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、匹他伐他汀或者瑞舒伐他汀相同的功能，胆固醇合成抑制剂可以是这些化合物的盐或衍生物。

本实施方式的未分化干细胞去除剂可以含有选自由奥利司他、C75、LY294002、SB204990、乙莫克舍、哌克昔林、辛伐他汀及其盐类所组成的组中的一种、两种或多种。

在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的脂肪酸合成抑制剂的浓度可以为0.1～500μM。在本说明书中，术语“M”作为单位表示mol/L。另外，在本说明书中，术语“在施用对象中”是指在培养基中或在血液中。

此外，在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的脂肪酸利用抑制剂的浓度可以为0.1至500μM。

此外，在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的脂肪酸合成抑制剂的浓度可以为0.1至500μg/mL。

此外，在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的脂肪酸利用抑制剂的浓度可以为0.1至500μg/mL。

此外，在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的胆固醇合成抑制剂的浓度可以为0.01至50μM。

此外，在本实施方式的未分化干细胞去除剂中，施用对象中含有的胆固醇合成抑制剂的浓度可以为0.01至50μg/mL。

在根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂是奥利司他的情况下，施用对象中奥利司他的浓度优选为0.1至500μM，更优选为1至50μM，甚至更优选为3至15μM。

在根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂是C75的情况下，施用对象中C75的浓度优选为0.1至500μg/mL，更优选为1至100μg/mL，甚至更优选为5至50g/mL。

在根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂为SB204990的情况下，施用对象中SB204990的浓度优选为0.1至500μM，更优选为1至200μM，甚至更优选为20至100μM。

在根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂为LY294002的情况下，施用对象中LY294002的浓度优选为0.1至500μM，更优选为1至200μM，甚至更优选为20至100μM。

在根据本实施方案的脂肪酸降解抑制剂(脂肪酸利用抑制剂)是乙莫克舍的情况下，施用对象中的乙莫克舍的浓度优选为0.1至500μM，更优选为1至200μM，甚至更优选为20至100μM。

在根据本实施方案的脂肪酸降解抑制剂(脂肪酸利用抑制剂)是哌克昔林的情况下，施用对象中的哌克昔林的浓度优选为0.1至500μM，更优选1至100μM，甚至更优选为5至50μM。

在根据本实施方案的胆固醇合成抑制剂是辛伐他汀的情况下，施用对象中辛伐他汀的浓度优选为0.01至50μM，更优选0.1至30μM，甚至更优选0.1至10μM。

在根据本实施方案的脂肪酸合成抑制剂与未分化干细胞接触的情况下，将脂肪酸合成抑制剂掺入未分化干细胞的细胞质中，从而完全或部分抑制如图1所示的酸合成途径的任何反应。

在根据本实施方案的脂肪酸降解抑制剂与未分化干细胞接触的情况下，将脂肪酸降解抑制剂掺入未分化干细胞的细胞质和/或线粒体中，从而完全或部分抑制如图1所示的脂肪酸降解途径中的任何反应。

在根据本实施方案的胆固醇合成抑制剂与未分化干细胞接触的情况下，将胆固醇合成抑制剂掺入未分化干细胞的细胞质中，从而完全或部分抑制如图9所示的胆固醇合成途径中的任何反应。

只要本实施方式的未分化干细胞去除剂含有选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种，可以使用任何未分化干细胞去除剂。本实施方式的未分化干细胞去除剂可以是任何未分化干细胞去除剂，只要未分化干细胞去除剂由选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种组成即可，并且可以包含其他任选组分，只要包括去除未分化干细胞的能力即可。

其他组分没有特别限制，其示例包括药学上可接受的载体、转染促进剂、缓冲剂、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、pH调节剂、螯合剂等。

本实施方式的未分化干细胞去除剂的形态没有特别限定，可以是各种形态，例如液体物质、粉末物质、粒状物质、凝胶状物质和固体物。此外，所述药剂也可以是乳液形式，其中，脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂、胆固醇合成抑制剂或其组合包封在胶束中；或者为脂质体形式，其中脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂、胆固醇合成抑制剂或其组合包封在脂质体中。

例如，可以通过本领域技术人员已知的方法对患者肠胃外或口服给药。除了动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等之外，肠胃外给药方法包括鼻内给药、经支气管给药、肌肉内给药、透皮给药等。剂量根据患者的体重和年龄、给药方法等而变化，但是本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量。

例如，在经历了从未分化干细胞诱导的分化细胞组织的移植的患者中，可以通过施用本实施例的未分化干细胞去除剂来体内去除残留在分化细胞组织中的未分化干细胞。因此，可以预防或治疗由未分化干细胞的增殖引起的疾病，例如移植组织的癌变。

本实施方式的未分化干细胞去除剂可用于培养基、去除未分化干细胞的方法、用于移植的细胞的制备方法、用于治疗或预防由未分化干细胞增殖引起的疾病的药物组合物、治疗或预防由未分化干细胞增殖引起的疾病的方法等，这些将在后面进行描述。

通过本实施方式的未分化干细胞去除剂去除的未分化干细胞没有特别限定，优选为iPS细胞或ES细胞，更优选为iPS细胞。

<<培养基>>

在一个实施方案中，本发明提供培养基。本实施方式的培养基包含上述实施方式的未分化干细胞去除剂。本实施方案的培养基可用于培养细胞。在本说明书中，术语“培养”是指在活体(个体)外培育或培养细胞，并且包括所谓的体外处理细胞。术语“培养基”是指为细胞提供培养环境的液体或固体物质。

本实施方式的培养基可以是一种组合物，其含有例如任选的培养基成分以及选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂(以下称为“脂肪酸合成抑制剂等”)组成的组中的至少一种。本实施方式的培养基是含有培养基和脂肪酸合成抑制剂等的组合物。培养基的示例包括水、缓冲溶液等。培养基可以溶解或分散脂肪酸合成抑制剂等。培养基组分可含有对细胞生长有效的组分，这些组分的示例包括各种组分，如氨基酸、维生素、无机盐、糖类和生长因子。此外，可以包含诸如抗生素、缓冲溶液、螯合剂和酚红指示剂的组分。

通过从本实施方案的培养基中去除脂肪酸合成抑制剂等而获得的其余组分可以具有与用作相关技术的培养基的一般细胞培养溶液相同的组成【例如，达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)培养液、MEM培养液(例如，α-MEM，MEM【汉克平衡液溶液(Hank'sBSS)】)、RPMI培养液(例如RPMI 1640等)、F12培养液、StemPro34、mTeSR1等】。上述组分可以具有与用作未分化干细胞保养培养基的一般细胞培养溶液相同的组成【例如，StemFit培养基、mTeSR(注册商标)Essential 8(注册商标)培养基、StemSure(注册商标))培养基等】。

本实施方式的培养基中的脂肪酸合成抑制剂等的浓度可以与上述未分化干细胞去除剂的施用对象中的脂肪酸合成抑制剂等的浓度相同。对于含有上述浓度的脂肪酸合成抑制剂等的本实施方式的培养基，可以有效地去除未分化干细胞。另外，在未分化干细胞和分化细胞共存的情况下，可以去除未分化干细胞，同时保持分化细胞的生长处于有利状态。

本实施方式的培养基优选不含脂肪酸。另外，培养基优选不含有位于所用脂肪酸合成抑制剂的目标的下游的脂肪酸合成前体(参见图1)，因此脂肪酸不会被生物合成。此外，培养基优选不含有位于所用脂肪酸利用抑制剂的目标的下游的物质，因此不使用脂肪酸。另外，本实施方式的培养基优选不含有胆固醇。另外，培养基优选不含有位于所用胆固醇合成抑制剂的目标的下游的胆固醇合成前体，因此胆固醇不会被生物合成。

本实施方式的培养基可以含有选自由葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸所组成的组中的至少一种化合物。通过在不含这些化合物的培养基中培养未分化干细胞，意识到可以诱导未分化干细胞的细胞死亡。

然而，由于本实施方式的培养基含有脂肪酸合成抑制剂等，即使培养基含有选自由葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸所组成的组中的至少一种化合物，去除未分化干细胞能力也可以被有利地展现。另外，由于培养基可含有葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸，因此期望细胞的生长比不含这些成分的情况更有利。

另外，在另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种在未分化干细胞去除剂的制备中的用途。

《试剂盒》

在一个实施方案中，本发明提供了包含上述实施方案的未分化干细胞去除剂的试剂盒。

除了上述实施方案的未分化干细胞去除剂之外，本实施方案的试剂盒还包括用于从未分化干细胞诱导分化细胞的试剂、培养基、细胞培养仪器、使用说明书等。用于诱导分化细胞的试剂可以根据待诱导的分化细胞进行适当选择。用于诱导心肌细胞的试剂的示例包括，但不限于：染色体DNA去甲基化试剂，例如去甲基化酶、5-氮杂胞苷和DMSO；细胞因子如PDGF、成纤维细胞生长因子8(FGF-8)、内皮素1(ET1)、中期因子(midkine)和成骨因子4(BMP-4)以及G-CSF；粘附分子，如明胶、层粘连蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白；维生素，如维甲酸；转录因子如Nkx2.5/Csx、GATA4、MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D、dHAND、eHAND、TEF-1、TEF-3、TEF-5和MesP1；来自心肌细胞的细胞外基质；BMP拮抗剂如noggin、chordin、fetuin、follistatin、sclerostin、Dan、Cerberus、gremlin和dante等等。此外，培养基的示例包括但不限于达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)培养液、MEM培养溶液(α-MEM、MEM[汉克平衡液溶液]等)、RPMI培养液(RPMI 1640等)、F12培养液、StemPro 34、MTeSRI、StemFit培养基、mTeSR Essential 8培养基、StemSure培养基等。此外，细胞培养器等的示例包括细胞培养板等，但不限于此。

本实施方式的试剂盒可以适当地用于去除未分化干细胞的方法，这将在后面描述，并且可以进一步包括解释用于去除未分化干细胞的方法的说明书等。通过用于去除未分化干细胞的方法的试剂、说明书等，以及与上述实施方案的未分化干细胞去除剂，可以在短时间内轻易地开展去除未分化干细胞的方法。

<<去除未分化干细胞的方法>>

在一个实施方案中，本发明提供了去除未分化干细胞的方法，其包括在未分化干细胞去除剂的存在下培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物。

本实施方式的去除未分化干细胞的方法中使用的未分化干细胞去除剂是上述实施方式的未分化干细胞去除剂。

在本说明书中，术语“细胞混合物”是指包含两种或更多种细胞的细胞群。除了两种或更多种细胞之外，“细胞混合物”可以包括培养基等的组分。“含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物”包括一种或多种未分化干细胞和一种或多种分化细胞，并且可任选地包括培养基等的组分。含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物的形式没有特别限制，可以是聚集状态、分散状态、附着于培养容器的状态、附着于粘附因子的状态，如细胞外基质、片状态、块状态、集落形式、胚状体形式、细胞团块形式、组织形式、器官形式等。

当未分化干细胞经历分化和诱导过程时，从未分化干细胞诱导分化细胞。然而，在体外，难以将所有未分化干细胞诱导为分化细胞，并且通常留有未分化干细胞，从而形成未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物。在本实施方案的方法中，只能从未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物中选择性地去除未分化干细胞。在本实施方案的方法中，含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物可以是通过混合未分化干细胞和分化细胞而获得的混合物。

在本实施方式的方法中，未分化干细胞没有特别限定，优选为iPS细胞或ES细胞，更优选为iPS细胞。

在本实施方案的方法中，分化细胞不受特别限制，并且优选是从与共存的未分化干细胞相同种类的未分化干细胞分化和诱导的细胞。迄今已报道了几种将未分化干细胞分化和诱导成分化细胞的方法，并且可以使用这些已知方法诱导分化细胞。

由于可选择性地去除细胞混合物中未分化干细胞的效率变得更高，其变得更为优选。通过在上述实施方案的未分化干细胞去除剂的存在下培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物获得细胞混合物的情况下，由未分化干细胞数/(未分化干细胞的数量+分化细胞的数量)×100表示的未分化干细胞的残留率优选小于0.1％，更优选小于0.01％，甚至更优选小于0.001％。上述细胞数中不包括死细胞。

可以通过确定表达对未分化干细胞特异的各种标记物的细胞是未分化干细胞来检测保留在细胞混合物中的未分化干细胞。只要上述未分化干细胞的残留率是通过确定表达Oct3/4的细胞是未分化干细胞，并通过检测残留在细胞混合物中的未分化干细胞而可以获得的比例。这里，通过使用在不含有上述实施例的未分化去除剂的培养基中培养的未分化干细胞作为阳性对照，足以将表达水平显示为与在阳性对照的未分化干细胞中的Oct3/4表达水平相等的细胞检测为表达Oct3/4的细胞。

分化细胞的示例可包括心肌细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、免疫细胞(例如、淋巴细胞等)、血管细胞、眼细胞(例如、视网膜色素上皮细胞等)、血细胞(用于例如、巨核细胞、红细胞等)、其他组织细胞以及其祖细胞等。其中，优选为心肌细胞或成纤维细胞，更优选为心肌细胞。

在从多能干细胞诱导心肌细胞的情况下，认为随着分化成心肌细胞的进展，细胞通过未分化的中胚层、心脏中胚层(或预先确定的心肌细胞)分化成心肌细胞。这里，未分化的中胚层是指特异于未分化中胚层的Brachyury蛋白的表达被识别的阶段。同时，心脏中胚层(或预先确定的心肌细胞)是指其中观察到对未分化的中胚层特异性蛋白质，如Brachyury，的表达的细胞，但是在相同的细胞中并未观察到对心肌细胞特异的蛋白质，如Nkx2.5和辅肌动蛋白，的表达，并且能够在不需要向培养液中添加新物质的情况下专门分化成心肌细胞。心肌细胞是指进行自主脉动的细胞。心肌细胞表达标记物，例如Nkx2.5、GATA4和辅肌动蛋白。在本说明书中，术语“心肌细胞”用作包含心肌细胞和心脏中胚层(或预先确定的心肌细胞)的概念。

从未分化干细胞向心肌细胞的分化和诱导可以通过使用例如PCT国际公开号WO01/048151、PCT国际公开号WO2005/033298、PCT国际公开号WO2008/150030等中描述的方法进行。例如，可以通过将导致分化成心肌细胞的物质添加到用于培养未分化干细胞的培养基中来进行向心肌细胞的分化和诱导。

这些物质的示例包括：染色体DNA去甲基化剂，例如去甲基化酶、5-氮杂胞苷和DMSO；细胞因子如PDGF，成纤维细胞生长因子8(FGF-8)，内皮素1(ET1)，中期因子(midkine)和成骨因子4(BMP-4)和G-CSF；粘附分子，如明胶、层粘连蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白；维生素，如维甲酸；转录因子如Nkx2.5/Csx、GATA4、MEF-2A、MEF-2B、MEF-2C、MEF-2D、dHAND、eHAND、TEF-1、TEF-3、TEF-5和MesP1；来自心肌细胞的细胞外基质；BMP拮抗剂如noggin、chordin、fetuin、follistatin、sclerostin、Dan、Cerberus、gremlin和dante等。

成纤维细胞是指具有产纤维能力的细胞。可以基于对成纤维细胞的特异性，例如纤维生成能力和各种标记物的表达来确定细胞是否是成纤维细胞。作为成纤维细胞标记物，已知诸如波形蛋白和ER-TR7的标记物，并且可以将对标记物呈阳性的细胞确定为成纤维细胞。

本实施方案的方法包括在未分化干细胞去除剂的存在下培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物的步骤。该步骤可以通过将未分化干细胞去除剂添加到如上所述的细胞培养用培养基中并培养细胞混合物来进行。或者，可以将未分化干细胞去除剂添加到培养基中，其中，含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物在培养基中进行培养。

添加到培养基中的未分化干细胞去除剂的量没有特别限制，但是，例如，0.1至500μM、1至50μM、3至15μM等，作为将试剂加入培养基中时的最终浓度。

在未分化干细胞去除剂的存在下培养细胞混合物可以在通常用于细胞培养的温度下进行。例如，培养温度可以是20℃至40℃，优选25℃至38℃，更优选30℃至37℃。

在未分化干细胞去除剂的存在下，细胞混合物的培养时间没有特别限制，优选24小时或更长，更优选48小时或更长。如果需要，可以将细胞传代培养。在传代培养之前和之后，培养基的组合物可以彼此相同或不同，只要其含有未分化干细胞去除剂即可。

在未分化干细胞去除剂的存在下细胞混合物的细胞密度没有特别限制，并且优选为1×10至1×10⁷个细胞/mL，更优选1×10³至1×10⁶个细胞/mL，甚至更优选1×10⁴至1×10⁶个细胞/mL。

根据本实施方案的方法，已经去除未分化干细胞的细胞混合物具有降低的未分化干细胞比例，并且仅由分化细胞组成。因此，根据本实施方式的去除未分化干细胞的方法，可以得到基本上不含有未分化干细胞的细胞混合物，或者可以减少未分化干细胞的比例。因此，通过本实施方式的方法获得的细胞混合物可以适当地作为用于移植到生物体内的细胞。

另外，在另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种用于去除未分化干细胞的用途。

《用于移植的细胞的制备方法》

在一个实施方案中，本发明提供了用于用于移植的细胞的制备方法，包括以下步骤(i)和(ii)：

步骤(i)：从未分化干细胞中诱导所需的分化细胞；和

步骤(ii)：在未分化干细胞去除剂的存在下培养步骤(i)中获得的细胞混合物。

本实施方式的用于移植的细胞的制备方法中所使用的未分化干细胞去除剂是上述实施方式的未分化干细胞去除剂。

本实施方案的方法中的步骤(i)是指从未分化干细胞诱导所需的分化细胞的步骤。步骤(i)中的未分化干细胞没有特别限制，优选为iPS细胞或ES细胞，更优选为iPS细胞。

在步骤(i)中，由未分化干细胞诱导的分化细胞的类型没有特别限制，只要分化细胞被诱导成所需的分化细胞即可。作为将未分化干细胞诱导为分化细胞的方法，可以根据目标分化细胞适当选择和使用已知的方法。由未分化干细胞诱导的分化细胞的示例包括，但不限于：心肌细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、免疫细胞(例如、淋巴细胞等)、血管细胞、眼细胞(例如、视网膜色素上皮细胞等)、血细胞(例如，巨核细胞、红细胞等)、其他组织细胞以及其祖细胞等。合适的分化细胞的示例包括心肌细胞。从未分化干细胞向心肌细胞的诱导可以通过上述《用于去除未分化干细胞的方法》中举例说明的方法进行。

通常，在体外，由于难以将所有未分化干细胞诱导为分化细胞，未分化干细胞通常保留在步骤(i)中获得的细胞混合物中，从而形成未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物。另外，细胞混合物可任选地含有培养基等的组分。细胞混合物的形式没有特别限制，可以是聚集状态、分散状态、附着于培养容器的状态、附着于粘附因子的状态，如细胞外基质、片状态、块状态、集落形式、胚状体形式、细胞团块形式、组织形式、器官形式等。

本实施方式的制备方法中的步骤(ii)是指在未分化干细胞去除剂的存在下对步骤(i)中获得的细胞群进行培养的步骤。该步骤(ii)中的培养可以通过上述《去除未分化干细胞的方法》中举例说明的方法进行。

在本实施方案的制备方法中，除了上述步骤(i)和(ii)之外，还可以增加其他步骤。其他步骤的示例包括纯化分化细胞的步骤，收集分化细胞的步骤等。在增加这些步骤的情况下，这些步骤在步骤(i)和(ii)之间或步骤(ii)之后进行。

在纯化步骤和收集分化细胞的步骤中，可以根据分化细胞的类型选择合适的方法。例如，在分化细胞是心肌细胞的情况下，可以应用PCT国际公开号WO2006/022377、PCT国际公布号WO2007/088874、PCT国际公布号WO2016/010165等中描述的方法可以应用到纯化步骤。另外，可以应用离心分离方法等作为收集步骤。

在通过本实施方式的制备方法获得的用于移植的细胞中，由分化细胞/(未分化干细胞+分化细胞)×100表示的分化细胞比例可以是，例如，50％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，或95％或更多。死细胞不包括在上述细胞数中。

在通过本实施方案的制备方法制备的用于移植的细胞中，由于已经选择性地去除未分化干细胞，因此未分化干细胞的比例减少。因此，用于移植的细胞仅由分化细胞组成。因此，根据本实施方式的制备方法，可以获得用于移植的细胞，其中，基本上不含未分化干细胞，或者未分化干细胞的比例减少。因此，即使在将用于移植的细胞移植到生物体内的情况下，也会降低畸胎瘤形成等的风险。

另外，在另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种用于制备移植细胞的用途。

此外，在另一方面，本发明提供了用于移植的细胞，其通过用于移植的细胞的制备方法产生，该方法包括以下步骤(i)和(ii)：

步骤(i)：从未分化干细胞中诱导所需的分化细胞；和

步骤(ii)：在未分化干细胞去除剂存在培养步骤(i)中所获得的细胞混合物。

《药物组合物》

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞增殖引起的疾病的药物组合物，其中，该药物组合物包括未分化干细胞去除剂。

本实施方式的药物组合物中含有的未分化干细胞去除剂与上述《未分化干细胞去除剂》中所记载的相同。

被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者没有特别限制，但可以是需要移植分化细胞的人类或非人类动物。例如，受试者可以是患有分化细胞功能不正常的患者，或者是在含有分化细胞的组织中具有缺陷、紊乱等的患者。非人类动物包括但不限于哺乳动物。哺乳动物的示例包括灵长类动物如猴子；啮齿动物如小鼠和大鼠；宠物，如狗和猫；家畜，如牛、马、羊和猪等。被移植了从未分化干细胞中诱导的分化细胞的受试者优选与衍生未分化干细胞的生物体的种类相同，更优选与衍生未分化干细胞的个体相同。待移植从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者可以是后面将要描述的“治疗方法等”中描述的“需要移植的受试者”。

本实施方式的药物组合物中的脂肪酸合成抑制剂等的含量只要是治疗有效量即可，没有特别限定，可举例说明上述《未分化干细胞去除剂》中所记载的内容等。

除了未分化干细胞去除剂之外，本实施方案的药物组合物可以含有其他组分。其他组分没有特别限制，可以举例说明上述《未分化干细胞去除剂》中描述的组分等。

需要说明的是，本实施方式的药物组合物除了上述《未分化干细胞去除剂》中所记载的其他成分以外，还可以含有佐剂等免疫刺激剂。佐剂的示例包括但不限于磷酸铝、氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素，不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)ISCOMATRIX、GM-CSF、CpG、O/W乳液等。除了未分化干细胞去除剂之外，本实施方案的药物组合物可以含有具有药理活性的其他药物。其他药物的示例包括抗炎剂、镇痛剂、解热剂，以及能够针对未分化干细胞进行免疫诱导的化合物等。

本实施方案的药物组合物的剂型没有特别限制，可以是各种剂型，如液体剂、粉剂、颗粒剂、片剂、粉剂、悬浮剂、乳剂、乳剂制剂和脂质体制剂。

本实施方案的药物组合物用于治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞增殖引起的疾病。通常，由于难以在体外将所有未分化干细胞诱导为分化细胞，因此在某些情况下，未分化干细胞可保留在作为用于移植的细胞所制备的分化细胞中。在未分化干细胞保持被移植的情况下，未分化干细胞在活体中增殖并且可能引起诸如畸胎瘤的疾病。为了治疗或预防这种疾病，移植了分化细胞的受试者被给予了本实施方案的药物组合物。由未分化干细胞的增殖引起的疾病没有特别限制，并且其示例包括畸胎瘤、癌症等。

待移植到本实施方案的药物组合物的给药对象中的分化细胞不受特别限制，只要它是由未分化干细胞诱导的分化细胞即可。分化细胞优选从iPS细胞或ES细胞诱导，更优选从iPS细胞诱导。例如，分化细胞是由iPS细胞诱导的心肌细胞。另外，分化细胞可以是通过上述《用于移植的细胞的制备方法》中描述的方法所制备的用于移植的细胞。

本实施方式的药物组合物的给药途径可以根据活性成分的种类、制剂的形态、移植的分化细胞的种类、移植分化细胞的位置等适当选择。例如，给药途径可以是与上述《未分化干细胞去除剂》中所描述的给药途径相同的给药方法。

本实施方式的药物组合物的剂量和给药间隔可以根据移植的分化细胞的种类、移植量、移植部位等；接受移植的受试者的年龄、性别、体重等；药物组合物的给药方法等等进行适当选择。剂量可以是例如0.001mg至1000mg、0.01mg至100mg、0.1mg至30mg、0.1mg至10mg、0.5mg至5mg等。另外，给药间隔可以是每天一次至数次，一次是几天至几个月等。例如，可以举例说明给药间隔为每天一次、每周一次等。

根据本实施方案的药物组合物，即使在未分化干细胞保留在被移植到活体内的细胞中的情况下，也可以在体内选择性地去除未分化干细胞。因此，可以治疗或预防由活体中的未分化干细胞的增殖引起的疾病。

另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种在制备所述药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞增殖引起的疾病。

另外，在另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种的用途，以治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞的增殖引起的疾病。

此外，在另一方面，本发明提供选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种，以用于治疗或预防在被移植了从未分化干细胞中诱导的分化细胞的受试者中由未受分化的干细胞的增殖引起的疾病。

《治疗方法等》

在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防由未分化干细胞增殖引起的疾病的方法，该方法包括向受试者给予未分化干细胞去除剂，其中，该受试者被移植了从未分化干细胞中诱导的分化细胞。

在本实施方式的方法中待给予受试者的未分化干细胞去除剂与上述《未分化干细胞去除剂》中所记载的相同。本实施方案的方法是治疗或预防由未分化干细胞增殖引起的疾病的方法，该方法包括向被移植了从未分化干细胞中诱导的分化细胞的受试者给予选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂组成的组中的至少一种。

另外，被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者与上述《药物组合物》中所描述的相同。未分化干细胞去除剂可以以上述《药物组合物》中所描述的药物组合物的形式给予受试者。另外，未分化干细胞去除剂可以与除脂肪酸合成抑制剂等之外的成分组合，以便给予受试者。其他成分没有特别限定，可以列举例说明上述《未分化干细胞去除剂》和《药物组合物》中所记载的成分。

将治疗有效量的未分化干细胞去除剂的脂肪酸合成抑制剂等给予受试者，其中，该受试者被移植了从未分化干细胞诱导的分化细胞。脂肪酸合成抑制剂等的治疗有效量根据移植的分化细胞的种类、移植量、移植部位等；接受移植的受试者的年龄、性别、体重等；未分化干细胞去除剂的给药方法等等而有所不同。脂肪酸合成抑制剂等的有效成分量可以是例如0.001mg至1000mg、0.01mg至100mg、0.1mg至30mg、0.1mg至10mg、0.5mg至5mg等。

给药对象和目标疾病可以与上述《药物组合物》中描述的那些相同。另外，给药方法可以与上述《药物组合物》中所描述的相同。

另外，在一个实施方案中，本发明提供了用于移植的细胞的移植方法，该方法包括以下步骤(i)至(iii)：

步骤(i)：从未分化干细胞中诱导所需的分化细胞；

步骤(ii)：在未分化干细胞去除剂的存在下培养步骤(i)中获得的细胞混合物，以获得用于移植的细胞；和

步骤(iii)：将步骤(iii)中获得的用于移植的细胞移植到需要移植的受试者中。

本实施方式的移植方法中的步骤(i)和(ii)可以与上述《用于移植的细胞的制备方法》中所记载的步骤(i)和(ii)同样的方式进行。另外，本实施方式的移植方法的步骤(ii)中使用的未分化干细胞去除剂与上述《未分化细胞去除剂》中所记载的相同。

本实施方式的移植方法中的步骤(iii)是将步骤(ii)中获得的用于移植的细胞移植到需要移植的受试者的步骤。“需要移植的受试者”是在对象的活体内的与步骤(ii)中获得的用于移植的细胞的类型相同的细胞中已经发生了缺陷、损伤等的受试者，并且通过移植用于移植的细胞，由细胞的缺陷、损伤等引起的症状预期会得到改善。移植可以通过细胞移植的一般方法进行。

在本实施方式的移植方法中，除了上述步骤(i)至(iii)之外，还可以增加其他步骤。其他步骤的示例包括纯化分化细胞的步骤、收集分化细胞的步骤等。在增加了这些步骤的情况下，这些步骤在步骤(ii)和(iii)之间进行。这种纯化步骤和收集步骤可以像《用于移植的细胞的制备方法》中所描述的那样进行。

根据本实施方式的移植方法，可以将基本上不含有未分化干细胞的或者其中未分化干细胞的比例降低的用于移植的细胞移植到活体内。因此，降低了畸胎瘤形成等的风险。

另外，在本实施方式的移植方法中，在步骤(iii)之后可以进一步进行以下步骤(iv)。

步骤(iv)：向受试者给予未分化干细胞去除剂，其中，所述受试者在步骤(iii)中被移植了用于移植的细胞。

上述步骤(iv)可以与上述实施方案的处理或预防方法相同的方式进行。通过进行步骤(iv)，即使在未分化干细胞保持被移植到用于移植的细胞中的情况下，也可以防止由未分化干细胞的增殖，如畸胎瘤，引起的疾病的发作。

在下文中，将基于实施例描述本发明，但是本发明不限于以下实施例。

示例

将细胞在37℃和5％CO₂的条件下在培养箱中培养。

(未分化干细胞的培养)

从WiCell研究院(WiCell Research Institute)获得的H9菌株用作人胚胎干细胞，并且人类诱导性多能干细胞获自京都大学iPS细胞研究所院的国立大学公司山中伸弥教授。

使用Matrigel(BD Bioscience cat 354277)对人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞进行未分化的维持培养。作为培养液，使用mTeSR1(STEMCELL Technologies Inc.cat11875-119)。除了mTeSR1之外，可以使用任何用于未分化维持的培养溶液，只要它通常用作无饲养层培养基，例如Essential 8(Life Technologies)、TeSR2(STEMCELL TechnologiesInc.)等。另外，基质包括Vitronectin(Life Technologies)、iMatrix-511(Takarano.892001)等，除Matrigel外，可以使用任何基质，只要它通常用作其它无饲养层基质即可。

在传代培养后，通过CTK溶液(Repro CELL)在37℃下分离人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的集落5分钟。关于细胞分散处理，除了CTK溶液(CTK solution)之外，还可以使用StemPro Accutase(Life Technologies no.1110501)和TrypLE Express/Select(LifeTech-nologies)。

(从未分化干细胞到心肌细胞的诱导)

关于从未分化干细胞向心肌细胞的分化和诱导，在该实验中使用的用于分化和诱导心肌细胞的方法如下。

关于心肌细胞的分化和诱导，当人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞达到50％至90％汇合时，将培养基换成在RPMI培养基(Invitrogen)(第0天)添加有6μM的B27(无胰岛素，将Invitrogen)和CHIR99021(Selleckchemor Wako)的培养基。

在第1天至第2天，在不含胰岛素的RPMI/B27培养基中进行培养。

接下来，在第3天至第5天，在培养基中培养，其中，除了不含胰岛素的RPMI/B27培养基外，还添加了5μM的IWP2或5μM的IWR-1(Sigma I0161)。

此外，在第6天至第7天，在不含胰岛素的RPMI/B27培养基中进行培养。

此外，从第8天开始，在含有胰岛素的RPMI/B27培养基中进行培养(Lian,X.,et al.,Nat Protocol,2013,8,162-175)。在第8天至第11天的阶段，可以确认脉动的心肌细胞。

(从未分化干细胞诱导成纤维细胞)

关于从未分化干细胞向成纤维细胞的分化和诱导，本实验中使用的用于诱导成纤维细胞的方法如下。

当人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞达到50％至90％汇合时，将培养基更换为不含bFGF的培养液以进行培养，其中，10％FBS加入MEMα培养基(Invitrogen)中。每2至4天更换培养液。因此，可在约10天内获得波形蛋白阳性成纤维细胞(参见Tohyama S,CellMetabolism 2016)。

【实验示例1】来自人iPS细胞的心肌细胞和iPS细胞之间FASN表达的比较

根据上述方法制备处于从人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞共存的状态的细胞混合物。OCT4用作代表未分化状态的标记。如图1所示，FASN是参与脂肪酸合成的酶蛋白。通过细胞混合物的免疫染色检测表达OCT4和FASN的细胞。结果如图2所示。另外，DAPI染色的结果也一起被示出。

基于图2中所示的结果，发现了表达OCT4和FASN的细胞重叠。基于上述观察，阐明了在来自不表达OCT4的人iPS细胞的心肌细胞中FASN的表达低，而在表达OCT4的未分化人iPS细胞中FASN的表达非常高。

【实验示例2】在含有脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养各种未分化干细胞系

将奥利司他(由Sigma制造，O4139)加入到StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technologies制造)中，使得每种最终浓度变为如图3所示的浓度(2μM、4μM、6μM、8μM和10μM)。因此，获得了根据本发明一个实施方案的培养基。将以下三种细胞系在每种上述终浓度的不含奥利司他(0μM)的培养基和含有奥利司他的培养基中各培养72小时。

253G4：人诱导性多能干细胞(人iPS细胞)系

Ffl14：人诱导性多能干细胞(人iPS细胞)系

H9：人胚胎干细胞(人ES细胞)系

关于细胞具有的碱性磷酸酶(ALP)的活性，培养72小时后，通过用StemTAG(注册商标)碱性磷酸酶染色试剂盒(Sigma 86-R)显色进行AP染色，细胞染成红色的被确认为活细胞。每个孔的状态如图3所示。

基于图3中所示的结果，证实了通过在含有奥利司他的培养基中培养，以奥利司他浓度依赖性方式诱导每种未分化干细胞的细胞死亡。

【实验示例3】在含有各种脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸利用抑制剂的培养基中培养未分化干细胞系

将如下所示的六种脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸利用抑制剂中的每一种添加到StemFit培养基(由AJINOMOTO CO.,LTD.制造)或mTeSR1培养基(由Stem Cell Technologies,Inc.制造)中，使得每个最终浓度变为如图4所示的浓度。因此，获得了根据本发明一个实施方案的培养基。

C75：FASN抑制

LY294002：ACLY抑制

SB 204990：ACLY抑制

乙莫克舍：CPT1抑制

哌克昔林：CPT1抑制

将253G4细胞在含有上述脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸利用抑制剂的各培养基中培养72小时。

培养72小时后，进行ALP染色，确认染成红色的细胞为活细胞。每个孔的状态如图4所示。

基于图4中所示的结果，证实了当在含有上述脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸利用抑制剂的任一种的培养基中培养时，以脂肪酸合成抑制剂或脂肪酸利用抑制剂浓度依赖性方式诱导未分化干细胞的细胞死亡。

【实验示例4】在含有脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养纯化和精制的心肌细胞

根据上述方法制备含有由人iPS细胞诱导的心肌细胞和人iPS细胞的细胞混合物。按照文献(Tohyama,et al.,(2016)Cell Metabolism,23,663-674.)中描述的方法，将上述细胞混合物在不含葡萄糖、不含谷氨酰胺的乳酸添加培养基中培养约5天，以杀死心肌细胞以外的细胞。因此获得纯化和精制的心肌细胞。随后，在含有终浓度为10μM的奥利司他的MEMα+10％FBS培养基(奥利司他(+))进行培养16天。作为对照，在不含奥利司他的MEMα+10％FBS培养基(奥利司他(-))中以相同方式进行培养。第9天和第16天的心肌细胞状态显示在图5中。

基于图5中所示的结果，从第9天至第16天确认心肌细胞的成熟(扩大)，并且显示使用根据本实施方案的培养基可以有利地培养纯化和精制的心肌细胞。

【实验示例5】在含有脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养成纤维细胞

根据上述方法制备含有由人iPS细胞诱导的成纤维细胞和人iPS细胞的细胞混合物。随后，将细胞混合物在含有终浓度为10μM的奥利司他的MEMα+10％FBS培养基(奥利司他(+))中培养9天。作为对照，将细胞混合物以相同方式在不含奥利司他的MEMα+10％FBS培养基(奥利司他(-))中培养。第9天的心肌细胞和其波形蛋白染色结果如图6所示。

基于图6中所示的结果，示出了使用根据本发明一个实施方案的培养基可以有利地培养来自人iPS细胞的成纤维细胞。

【实验示例6】在含有脂肪酸合成抑制剂的培养基中培养含有来自人iPS细胞的心肌细胞和iPS细胞的细胞混合物

根据上述方法制备其中从人iPS细胞诱导的纯化和精制的心肌细胞和人iPS细胞共存的状态的细胞混合物。在细胞混合物中，进行针对OCT4的免疫染色。将细胞混合物在含有终浓度为10μM的奥利司他(奥利司他(+))的StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technologies制造)中培养72小时。作为对照，在不含奥利司他(奥利司他(-))的StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technol-ogies制造)中以相同方式进行培养。培养72小时后，通过免疫染色检测表达OCT4的细胞。两次重复测试的结果显示在图2中。此外，DAPI染色的结果也一起显示。基于结果对表达Oct4的细胞集落数进行定量的三次重复试验的结果示于图8中。

基于图7至8所示的结果，证实了在不含奥利司他(奥利司他(-))的培养基中进行培养的情况下，表达OCT4的未分化干细胞仍然存在。另一方面，在含有奥利司他(奥利司他(+))的培养基中进行培养的情况下，未检测到表达OCT4的残留的未分化干细胞。

基于这些发现，通过在根据本发明的一个实施方案的来自人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞共存于未分化干细胞去除剂中的状态下培养细胞混合物，可以诱导细胞混合物中未分化状态的细胞的细胞特异性死亡。另外，显示仅可以从细胞混合物中选择性地选择分化状态的细胞，其中，所述分化状态的细胞包括源自人iPS细胞的心肌细胞。

在实验示例6中，如此获得的细胞混合物中排除具有未分化干细胞特性的细胞。因此，未分化干细胞的去除率也非常高。该细胞混合物期望被用于诸如移植到活体内的应用中，并显示出突出和显著的有用性。

【实验示例7】来自人iPS细胞的心肌细胞和iPS细胞之间FASN表达的比较

根据上述方法制备处于从人iPS细胞的心肌细胞和人iPS细胞共存的状态的细胞混合物。肌钙蛋白I(TnI)用作心肌细胞标记物。如图1所示，FASN是参与脂肪酸合成的酶蛋白。通过细胞混合物的免疫染色检测表达TnI和FASN的细胞。结果如图10所示，DAPI染色的结果也一起显示。

基于图10中所示的结果，发现表达TnI和FASN的细胞不重叠。基于上述观察，阐明了在来自表达TnI的人iPS细胞的心肌细胞中FASN的表达低，而在不表达TnI的未分化的人iPS细胞中FASN的表达非常高。

此外，通过使用抗FASN抗体的Western印迹证实了从人iPS细胞(253G4)诱导的心肌细胞和人iPS细胞中FASN的表达。使用人皮肤成纤维细胞(HDF)作为阴性对照。结果如图11所示。

基于图11所示的结果，显示在源自人iPS细胞的心肌细胞中未检测到FSAN的表达，而在人iPS细胞中FASN被高度表达。

【实验示例8】在含有胆固醇合成抑制剂的培养基中培养未分化干细胞系

将辛伐他汀(S6196：由Sigma Aldrich制造)加入到StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1培养基(由Stem Cell Technologies制造)中，使得每种最终浓度变为如图12所示的浓度(0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM和2μM)。因此，获得了根据本发明一个实施方案的培养基。

将253G4细胞在每种上述终浓度的不含辛伐他汀(0μM)的培养基和含有辛伐他汀的培养基中培养72小时。

培养72小时后，进行ALP染色，确认染成红色的细胞为活细胞。每个孔的状态如图12所示。

基于图12中所示的结果，通过在含有辛伐他汀的培养基中培养，证实了每种未分化干细胞的细胞死亡也被以辛伐他汀浓度依赖性方式诱导。

【实验例9】在含有脂肪酸合成抑制剂和棕榈酸的培养基中培养未分化干细胞系

将奥利司他(由Sigma制造，O4139)加入到StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technologies制造)中，使得每种最终浓度变为如图13所示的浓度(2μM、6μM以及8μM)。因此，获得了根据本发明一个实施方案的培养基。通过向不含奥利司他的培养基(0μM)和含有上述终浓度的奥利司他的培养基中的每一个加入棕榈酸(终浓度50μM)、肉毒碱(终浓度0.5mM)和BSA(终浓度8.3μM)，制备得到培养基。通过向向不含奥利司他的培养基(0μM)和含有上述终浓度的奥利司他的培养基中的每一个中仅加入肉毒碱(终浓度0.5mM)和BSA(终浓度8.3μM)，制备得到培养基。将人iPS细胞系(253G4)在上述各培养基中培养72小时。

培养72小时后，用LIVE/DEAD Assay(L3224，由Thermo Fisher Scientific制造)检测活细胞。每个孔的状态如图2所示。另外，基于相同结果对活细胞数进行量化的结果显示在图14中。

基于图13至14所示的结果，证实了通过在除奥利司他之外仅加入了肉碱和BSA的培养基(BSA)中培养，人iPS细胞的细胞死亡以奥利司他浓度依赖性方式被诱导。另一方面，证实了通过在除奥利司他之外加入了棕榈酸、肉毒碱和BSA的培养基(PA-BSA)中培养，人iPS细胞的细胞死亡被抑制。基于通过添加作为脂肪酸的棕榈酸抑制人iPS细胞的细胞死亡的发现，证实了奥利司他诱导人iPS细胞的细胞死亡是由脂肪酸合成的抑制引起的。

【实验示例10】具有敲除FASN的未分化干细胞系的培养

通过将针对FASN的siRNA(FASN siRNA)导入人iPS细胞系(253G4)来产生FASN被敲除的未分化干细胞系(FASN KD未分化干细胞系)。另外，制备导入了阴性对照(negativecontrol，N/C)的siRNA的未分化干细胞系作为阴性对照系(N/C未分化干细胞系)。通过使用抗FASN抗体的Western印迹证实FASN KD未分化干细胞系和N/C未分化干细胞系中FASN表达的结果显示于图3中。基于图15中的结果，证实通过导入FASN siRNA可以敲除FASN的表达。使用的每种siRNA如下。

FASN siRNA：Applied Biosystems(注册商标)siRNA ID：s5030(Thermo FisherScientif-ic制造)

N/C siRNA：Silencer^TM阴性对照No.1siRNA(AM 4611：Thermo Fisher Scientific制造)

将上述FASN KD未分化干细胞系和N/C未分化干细胞系在StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technologies制造)中培养72小时以确认细胞增殖。结果如图16所示。

基于图16中所示的结果，证实了与N/C未分化干细胞系相比，FASN KD未分化干细胞系中细胞增殖受到抑制。基于这一发现，证明FSAN是未分化干细胞存活和增殖的必需因素。

【实验例11】在含有棕榈酸的培养基中FASN KD未分化干细胞系的酸性培养

通过将棕榈酸(终浓度50μM)、肉碱(终浓度0.5mM)和BSA(终浓度8.3μM)加入到StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technologies制造)中获得的培养基(PA-BSA培养基)以及通过仅将肉毒碱(终浓度0.5mM)和BSA(终浓度8.3μM)加入到StemFit培养基(由AJINOMOTO制造)或mTeSR1(由Stem Cell Technolo-gies制造)中获得的培养基(BSA培养基)被制备。将在实验示例11中制备的FASN KD未分化细胞系和N/C未分化细胞系在每种上述培养基中培养72小时以确认细胞增殖。结果如图17所示。

基于图17中所示的结果，在PA-BSA培养基(FASN KD w/PA-BSA)中培养的FASN KD未分化干细胞系，在BSA-PA培养基(N/C w/PA-BSA)中培养的N/C未分化干细胞系以及在BSA培养基(N/C w/BSA)中培养的N/C未分化干细胞系显示出相同水平的细胞增殖。另一方面，与上述三种细胞系相比，在BSA培养基中培养的FASN KD未分化干细胞系中细胞增殖受到抑制。基于这些发现，显示由FASN合成的棕榈酸是未分化干细胞的存活和增殖的必需组分。

工业适用性

根据本发明，可以提供能够高效去除未分化干细胞的未分化干细胞去除剂、去除未分化干细胞的方法等，并且它们可以广泛用于再生医学技术领域等。

Claims

1.一种未分化干细胞去除剂，包括：

选自由脂肪酸合成抑制剂、脂肪酸利用抑制剂和胆固醇合成抑制剂所组成的组中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的未分化干细胞去除剂，

3.根据权利要求1或2所述的未分化干细胞去除剂，

其中，施用对象中的所述脂肪酸合成抑制剂或所述脂肪酸利用抑制剂的浓度为0.1至500μM。

4.根据权利要求1所述的未分化干细胞去除剂，

其中，所述胆固醇合成抑制剂通过靶向选自由乙酰辅酶A乙酰转移酶、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶以及羟甲基戊二酰辅酶A还原酶所组成的组中的至少一个因子来抑制胆固醇合成。

5.根据权利要求1或4的未分化干细胞去除剂，

其中，施用对象中的所述胆固醇合成抑制剂的浓度为0.01至50μM。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的未分化干细胞去除剂，还包括：

选自由葡萄糖、谷氨酰胺和甲硫氨酸所组成的组中的至少一种化合物。

7.一种未分化干细胞去除剂，包括：

选自由奥利司他、C75、LY294002、SB204990、乙莫克舍、哌克昔林和辛伐他汀以及其盐类所组成的组中的一种或两种或更多种。

8.一种培养基，包括：

根据权利要求1至7中任一项所述的未分化干细胞去除剂。

9.一种去除未分化干细胞的方法，包括：

在如权利要求1至7中任一项所述的未分化干细胞去除剂的存在下，培养含有未分化干细胞和分化细胞的细胞混合物。

10.根据权利要求9所述的去除未分化干细胞的方法，

其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

11.根据权利要求10或11所述的去除未分化干细胞的方法，

其中，所述分化细胞是心肌细胞。

12.一种用于移植的细胞的制备方法，包括以下步骤(i)和(ii)：

(i)：从未分化干细胞中诱导所需的分化细胞；以及

(ii)：在根据权利要求1至7中任一项所述的未分化干细胞去除剂的存在下，培养步骤(i)中获得的细胞混合物。

13.根据权利要求12所述的制备方法，

其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

14.根据权利要求12或13所述的制备方法，

其中，所述分化细胞是心肌细胞。

15.一种药物组合物，用于治疗或预防在被移植有从未分化干细胞诱导的分化细胞的受试者中由未分化干细胞增殖引起的疾病，所述药物组合物包括：

根据权利要求1至7中任一项所述的未分化干细胞去除剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，

其中，所述未分化干细胞是诱导性多能干细胞。

17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，

其中，由所述未分化干细胞诱导的所述分化细胞是心肌细胞。