CN104968350A - 疾病的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在有需要的动物中抑制血管通透性过高的方法。该方法包括向所述动物给药血管-通透性过高-抑制量的达那唑化合物。该方法包括根据动物的体脂含量向所述动物给药有效量的达那唑化合物。本发明还提供调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法。

Description

疾病的治疗方法

相关申请的交叉参考

本发明要求2012年12月19日提交的临时申请61/739,524的优先权，并且在此将其全部公开内容引入作为参考。

发明领域

本发明涉及抑制血管通透性过高(vascular hyperpermeability)以及由其导致的水肿和其它不良作用的方法。本发明还涉及调节内皮细胞的细胞骨架的方法。本发明的方法包括根据动物的体脂含量向该动物给药达那唑(达那唑)化合物。

背景技术

血管内皮位于所有血管内部。其作为血液与组织和器官的界面。内皮形成半渗透屏障，其保持血液隔室的完整性，但是允许水、离子、小分子、大分子和细胞以经调节的方式通过。该过程的失调将导致血管渗漏到皮下组织中。渗漏到组织中的液体会引起水肿，其在多种疾病中可以引起严重且危及生命的后果。因此，非常需要用于减少水肿，尤其是在水肿的最早期阶段减少水肿，以及生理学上恢复内皮屏障的方法。

内皮是控制分子从血液到组织实质交换的重要看门人。其在很大程度上控制具体的血管床到血源性分子(blood-borne molecule)的渗透。内皮细胞屏障的通透性和选择性主要取决于不同血管床内的微脉管系统内的内皮的结构和类型。不同器官的微血管床内的内皮细胞显示出结构上的分化，其可以被分成三个主要的形态学类型：窦状型(sinusoidal)、开窗型(fenestrated)和连续型。

窦状内皮(也称为“不连续内皮”)具有大的细胞间和细胞内间隙(gap)并且无基底膜，其使得分子从毛细血管腔到组织及从组织到毛细血管腔的分子运输受到最小限度地限制。在肝脏、脾脏和骨髓中发现了窦状内皮。

开窗内皮(fenestrated endothelium)的特征在于存在大量60～80nm直径的被称为窗的圆形的跨细胞的开口。在需要小分子快速交换的组织和器官中发现开窗内皮，包括肾脏(肾小球、肾小管周围毛细血管和上行直小血管(ascending vasa recta))、胰腺、肾上腺、内分泌腺和肠。这些窗被细小的膈覆盖，除了在发育成熟的、健康的肾小球中的那些。参考Ichimura等人，J.Am.Soc.Nephrol.，19:1463-1471(2008)。

连续性内皮不含有窗或大的间隙。相反地，连续性内皮的特征在于未被中断的内皮细胞单层。体内的大部分内皮为连续性内皮，且连续性内皮被发现位于或包围脑(血脑屏障)、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏的一些区域(乳突微脉管系统、下行直小血管)、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜(血视网膜屏障)、骨骼肌、睾丸和身体的其它组织和器官。

连续性内皮中的内皮运输随细胞旁途径和跨细胞的途径出现被认为是一种常识。细胞旁途径是在内皮细胞之间，通过内皮细胞间连接(IEJ)的途径。在未受干扰的连续性内皮中，通过扩散和对流来实现水、离子和小分子的细胞旁途径运输。大量水(最多40％)也通过被称为水通道的水-运输膜通道跨细胞地跨越内皮细胞屏障。大量刺激可以破坏IEJ组织，从而打开内皮屏障中的间隙。这些细胞间间隙的形成允许液体、离子、大分子(例如蛋白质)和其它血浆成分以不受限制的方式通过内皮细胞之间。这种细胞旁途径-引起的通透性过高产生水肿和其它不良作用，其能够最终导致组织和器官的损害。

跨细胞途径负责大分子跨过内皮细胞的主动转运，所述大分子例如白蛋白和其它血浆蛋白质，该过程被称作“转胞吞作用”。大分子的运输出现在被称作为细胞膜穴样凹陷的小泡中。几乎所有的连续性内皮具有丰富的细胞膜穴样凹陷，除了位于脑和睾丸中的连续性内皮具有很少的细胞膜穴样凹陷。转胞吞作用是多步过程，其涉及连续的来自质膜的细胞膜穴样凹陷芽殖和裂变和跨细胞的易位，以及随后的与相对质膜(opposite plasmalemma)的对接和融合，在此细胞膜穴样凹陷通过胞吐作用向间质中释放它们的成分。在正常的生理学条件下，转胞吞作用是选择性的并且受到了严密的调控。

对于跨细胞途径的本质重要性的认识正在逐步深入。血浆蛋白质的转胞吞作用，尤其是白蛋白(其代表65％的血浆蛋白质)的转胞吞作用受到格外的关注因为其具有调节经血管的血液渗透压梯度的能力。可以认识到，随着增加的白蛋白和其它血浆蛋白质的转胞吞作用高于基础水平，会增加它们的组织蛋白质浓度，随后会导致水跨过内皮屏障移动，从而产生水肿。

通过转胞吞作用也会运输低密度脂蛋白(LDL)跨过内皮细胞。在高脂血症中，已经通过检测LDL转胞吞作用的显著增加来作为动脉粥样硬化形成的初期事件。LDL在内皮下空间聚集，并陷入在扩张的基底膜(basal lamina)和细胞外基质中。在高脂血症中内皮下脂蛋白聚集，随后的一连串事件会导致粥样斑块的形成。已有报道称晚期的粥样硬化病变有时会伴随IEJ的打开以及LDL和白蛋白大量不受控制的通过。

血管并发症是糖尿病的标志。在大血管水平，动脉粥样硬化过程的加速往往表现为疾病。关于微血管病，视网膜、肾小球以及神经的微脉管系统的变化导致最多种的临床并发症，但是，随着研究数量的持续增加，显示糖尿病也会影响其它器官的微脉管系统，例如肠系膜、皮肤、骨骼肌、心脏、脑、以及肺部，导致另外的临床并发症。在所有这些血管床中，血管通透性的改变可能代表了糖尿病内皮功能障碍的特点。

在连续性内皮中，在糖尿病的早期，对于血浆大分子的毛细管的通透性过高被解释为跨内皮的囊泡运输的强化(即，由增强转胞吞作用引起)而不是IEJ的脱稳定化。此外，已有报道称糖尿病患者的内皮细胞包括脑的那些内皮细胞，含有与正常相比数量增加的细胞膜穴样凹陷，以及糖化的蛋白质、尤其是糖化的白蛋白，其会被内皮细胞吸收，并且以比它们天然形式明显更快的速度进行胞转作用。此外，增强的大分子转胞吞作用是会持续到超过糖尿病早期阶段的过程，并且如果不对该疾病进行治疗，可能是导致糖尿病患者组织和器官水肿的原因。该水肿随后导致组织和器官的损害。在高血压中也已经报道了大分子跨细胞运输的类似的增加。

细胞旁途径-引起的通透性过高也是糖尿病和糖尿病血管并发症的原因。细胞旁途径的IEJ包括粘着连接(AJ)和紧密连接(TJ)。糖尿病改变在AJ和TJ两者中的特定蛋白质的含量、磷酸化和定位，从而促进增加的内皮屏障通透性。

为了支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Frank等人，Cell TissueRes.,335:41-47(2009)；Simionescu等人，Cell Tissue Res.,335:27-40(2009)；van den Berg等人,J.Cyst.Fibros.,7(6):515-519(2008)；Viazzi等人，Hypertens.Res.,31:873-879(2008)；Antonetti等人，第14章,第340-342页,in DiabeticRetinopathy(由Elia J.Duh编辑，Humana Press,2008)；Felinski等人，CurrentEye Research,30:949-957(2005)；Pascariu等人，Journal of Histochemistry&Cytochemistry,52(1):65-76(2004)；Bouchard等人，Diabetologia,45:1017-1025(2002)；Arshi等人，Laboratory Investigation,80(8):1171-1184(2000)；Vinores等人，Documenta Ophthalmologica,97:217-228(1999)；Oomen等人，EuropeanJournal of Clinical Investigation,29:1035-1040(1999)；Vinores等人，Pathol.Res.Pract.,194:497-505(1998)；Antonetti等人，Diabetes,47:1953-1959(1998)；Popov等人，Acta Diabetol.,34:285-293(1997)；Yamaji等人，CirculationResearch,72:947-957(1993)；Vinores等人，Histochemical Journal,25:648-663(1993)；Beals等人，Microvascular Research,45:11-19(1993)；Caldwell等人，Investigative Ophthalmol.Visual Sci.,33(5):16101619(1992)。

通过转胞吞作用和细胞旁途径，也会发生开窗内皮中的内皮运输。此外，借由窗发生内皮运输。开窗内皮对于水和小亲水溶解物具有显著高的通透性，这是因为窗的存在。

窗可能会或可能不会被膈所覆盖。具有带膈的窗(diaphragmed fenestrae)的内皮的位置包括内分泌组织(例如胰岛和肾上腺皮质)、胃肠粘膜以及肾脏的肾小管周围毛细血管。具有带膈的窗的开窗内皮的血浆蛋白质的通透性不会超过连续性内皮的血浆蛋白质的通透性。

具有不带膈的窗的内皮的位置包括肾的肾小球。血管小球的开窗内皮被延伸到窗内的多糖包被覆盖(形成所谓的“筛型塞子(seive plug)”)以及被更为松散关联的糖蛋白的内皮细胞表面层覆盖。功能的选择通透性研究的数学分析已经确定血管小球的内皮细胞多糖包被(包括存在于窗中的)，以及与其关联的表面层占据循环中血浆白蛋白的最多95％的固位(retention)。

已经发现血管小球内皮中的窗的损失与一些疾病中的蛋白尿相关，这些疾病包括糖尿病性肾病、移植肾肾小球病、先兆子痫、糖尿病、肾功能衰竭、环孢霉素A肾病、血清性肾炎以及Thy-1肾炎。已经发现肌动蛋白重排，以及尤其是张力丝(stress fiber)的解聚对于窗的形成和保持是重要的。

为了支持上述关于开窗内皮的讨论以及获得额外的信息，参考Satchell等人，Am.J.Physiol.Renal Physiol.,296:F947-F956(2009)；Haraldsson等人，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,18:331-335(2009)；Ichimura等人，J.Am.Soc.Nephrol.,19:1463-1471(2008)；Ballermann，Nephron Physiol.,106:19-25(2007)；Toyoda等人，Diabetes,56:2155-2160(2007)；Stan,“EndothelialStructures Involved In Vascular Permeability,”，679-688页，EndothelialBiomedicine(编辑，Aird,Cambridge University出版，Cambridge,2007)；Simionescu和Antohe,“Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium:Changes in Various Pathologies,”42-69页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada和Higgs,Springer-Verlag,Berlin,2006)。

通过转胞吞作用，发生窦状内皮中的内皮运输，且通过细胞间间隙(内皮之间的狭缝)和细胞内间隙(窗)。用肌动蛋白丝-断裂药物治疗窦状内皮可以引起间隙数量的显著和快速的增加，表明为对肌动蛋白细胞骨架内的内皮的孔隙率的调节。已经报道了其它改变细胞骨架的药物会改变窗的直径。因此，窗-关联的细胞骨架可能会控制在窦状内皮中内皮过滤的重要功能。在肝脏中，窗的减少(defenestration)(窗的损失)导致内皮通透性的降低，其与一些疾病和病症的发病相关，这些疾病和病症包括老化、动脉粥样硬化生成、动脉粥样硬化、肝硬化、纤维化、肝衰竭、原发性肝癌和转移性肝癌。为了支持上述讨论以及获得更多的信息，参考Yokomori，Med.Mol.Morphol.,41:1-4(2008)；Stan,“Endothelial Structures Involved In VascularPermeability,”679-688页，Endothelial Biomedicine(编辑，Aird,CambridgeUniversity出版，Cambridge,2007)；DeLeve,“The Hepatic SinusoidalEndothelial Cell,”1226-1238页，Endothelial Biomedicine(编辑，Aird,CambridgeUniversity出版，Cambridge,2007)；Pries和Kuebler，“NormalEndothelium,”1-40页，The Vascular Endothelium I(编辑，Moncada和Higgs，Springer-Verlag,Berlin,2006)；Simionescu和Antohe,“Functional Ultrastructureof the Vascular Endothelium:Changes in Various Pathologies,”42-69页，TheVascular Endothelium I(编辑，Moncada和Higgs,Springer-Verlag,Berlin,2006)；Braet和Wisse，Comparative Hepatology,1:1-17(2002)；Kanai等人，Anat.Rec.,244:175-181(1996)；Kempka等人，Exp.Cell Res.,176:38-48(1988)；Kishimoto等人，Am.J.Anat.,178:241-249(1987)。

糖尿病性视网膜病是最常见的糖尿病性眼疾病，并且是美国成年人失明的诱导原因(National Eye Institute factsheet,2009年，www.nei.nih.gov/health/diabetic/retinopathy.asp)。在2000年，世界卫生组织公布，在美国糖尿病的患病率据报道为17,702,000例。该报告还指出，截止到2030年，该患病率预计将上升至30,312,000例(Wild,2004)。糖尿病性视网膜病是在视网膜脉管系统中进行性和蓄积性的变化，其包括微动脉瘤、视网膜内出血和渗出物、血管迂曲、视网膜内微血管异常(IRMA)和视网膜前新血管化形成(Boyd,等人Canadian Diabetes Association Clinical PracticeGuidelines Expert Committee 2008,S134-139)。视网膜前新血管化形成可导致玻璃体出血、视网膜脱离、纤维化和永久性视力丧失。糖尿病性视网膜病还包括糖尿病性黄斑水肿(DME)，其为液体外渗，涉及并威胁中央视力。糖尿病中大多数视力丧失是由于DME(Moss,等人,Ophthalmology 1998；105:998-1003)。血管通透性增加和水肿在这一过程的早期发生。在视网膜组织永久性被破坏之前，有效地治疗血管通透性和水肿可逆转或减缓糖尿病的这些并发症(Gardner,et al.Current Diabetes Reports 2008；8:263-269；Sander,et al.Invest Ophthalmol Vis.Sci.2007；48:3983-3987；和Antonetti,等人Diabetes2006；55:2401-2411)。

对于有临床意义的糖尿病性黄斑水肿(CSME)的主要治疗包括视网膜激光光凝术和玻璃体内雷珠单抗。对渗漏区域的视网膜激光光凝术可减少50％的中度视力丧失(30％至15％)并减缓疾病进程。但是，激光治疗受限于：在一些情况下的疗效缺乏、程序性不适、需要重复治疗和有烧蚀视网膜损害的风险，包括中心凹烧伤和伤疤，其可随时间增加(American Academy ofOphthalmology Preferred PracticeDiabetic Retinopathy,2008；Maeshima,et al.Retina.2004；24:507-511)。在2012年7月30日，玻璃体内雷珠单抗被批准用于治疗DME。这个注射到眼睛的抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法被证明是有效的，但出于以下原因无法给药至一些患者：有免疫反应、青光眼、局部眼刺激的风险或眼内炎的发展，其可能造成完全视力丧失。此外，重复数月的过程的高治疗花费对于很多患者而言很难负担。

除了常规措施，例如控制血糖、高血压和血脂，目前尚无有效地口服药物来治疗糖尿病性视网膜病，尤其是DME。对新型药物疗法存在显著未满足的临床需求，所述新型药物疗法可有效地治疗糖尿病性视网膜病和DME(Ryan,等人Am.J.Health Syst Pharm.2007；64(17Suppl,12):S15-21)。

发明内容

本发明的一个实施方案涉及在有此需要的动物中抑制血管通透性过高的方法，包括确定该动物体脂含量并根据该动物的体脂含量给药该动物血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。本发明的另一实施方案涉及在有此需要的动物中抑制血管通透性过高的方法，包括给药该动物血管通透性过高抑制量的达那唑化合物，其中所述量对应于该动物的体脂含量。

在一个方面，确定步骤包括计算该动物的体质指数(BMI)。

在另一方面，所述达那唑化合物可口服给药。在另一方面，所述达那唑化合物可以约0.5mg/BMI单位/天至约1.0mg/BMI单位/天的量给药。在另一方面，达那唑化合物可每天给药两次。在另一方面，当该动物的BMI小于26时，达那唑化合物的量为约2mg/天至约15mg/天。还在另一方面，该动物的BMI小于26时，达那唑化合物的量为约5mg/天。在另一方面，当该动物的BMI为26至35时，则达那唑化合物的量为约2mg/天至约15mg/天。在一个方面，当该动物的BMI为26至35时，达那唑化合物的量为约10mg/天。仍在另一方面，当该动物的BMI大于35时，达那唑化合物的量为约5mg/天至约45mg/天。又在另一方面，当该动物的BMI大于35时，达那唑化合物的量为约15mg/天。

在其他方面，所述动物由于存在由血管通透性过高介导的疾病或病症，因此需要达那唑化合物。达那唑化合物的给药可在诊断出该疾病或病症后立即开始。在各个方面，该疾病或病症可为糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、老年性黄斑退化症、脑部水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状动脉微血管病变、脑微血管病变、Eals病、损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文加斯综合征、缺血、黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿、肾病综合征、神经病、水肿导致的器官衰竭、先兆子痫、肺水肿、肺动脉高压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉闭塞、视网膜炎、视网膜病变、无症状性脑梗死、系统性炎症反应综合征、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血管渗漏综合征、玻璃体出血或Von Hipple Lindau病。在优选的方面，该疾病或病症可为黄斑水肿、神经病、视网膜病变或糖尿病的血管并发症。

血管并发症可以是水肿、内皮下间隙的低密度脂蛋白的蓄积、加速的动脉粥样硬化、脑血管壁加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病心肌病、糖尿病母亲的胎儿的肺发育滞后、一个或多个肺部生理参数的变化、感染易感性增加、肠系膜中的血管增生、糖尿病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病以及皮肤发红、变色、干燥和溃疡。在优选的方面，所述血管并发症可以是水肿、糖尿病心肌病、糖尿病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病或糖尿病性肾病。

在各个方面，由于该动物具有一个或多个由血管通透性过高介导的疾病或病症的早期迹象或倾向于发展成由血管通透性过高介导的疾病或病症，则该动物需要达那唑化合物。在一个方面，所述疾病或病症是糖尿病、高血压或动脉粥样硬化。

在一个方面，所述血管通透性过高可以是见于脑、隔膜、十二指肠肌肉组织、脂肪、心脏、肾脏、大血管、肺、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸或其周围的连续内皮的血管通透性过高。在一个方面，所述连续内皮可见于脑、心脏、肺、神经或视网膜，或在其周围。

仍在另一方面，所述血管通透性过高是见于肾、胰腺、肾上腺、内分泌腺体或肠或其周围的开窗内皮的血管渗透性过高。在一个方面，所述开窗内皮见于肾脏中。

本发明的达那唑化合物可为达那唑。

本发明的达那唑化合物可为延时释放制剂。在一个方面，所述延时释放制剂包含选自以下的成分：脂质体和多糖。

本发明的动物可以是人。

本发明的另一实施方案涉及调节动物内皮细胞的细胞骨架的方法，其包括确定该动物的体重；并根据该动物的体重向其给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。在一个方面，确定的步骤包括计算该动物的体质指数(BMI)。在另一方面，该细胞骨架的调节包括抑制肌动蛋白张力丝(stress fiber)的形成。仍在另一方面，所述细胞骨架的调节包括导致、增加或延长皮质肌动蛋白环的形成。又在另一方面，细胞骨架的调节包括RhoA的抑制。

附图说明

图1显示了跨内皮细胞单层的HRP通透性降低的变化百分比。达那唑的剂量响应对处理了24小时的细胞的HRP通透性有影响。数据表示为平均值+SEM，其是通过3个单独的试验，一式三份进行计算的。*＝P值<.05，与载体相比。

图2显示了达那唑的TEER响应：0.1μm的达那唑与载体相比的暂时响应。TEER测量了跨生长于transwell植入物上的内皮细胞单层。越高的电阻说明了越高的屏障完整性。

图3A-3H显示了纤丝状肌动蛋白皮质重排和达那唑。视网膜内皮细胞用连接鬼笔毒环肽的罗丹明染色。处理后，将细胞固定3小时(凝血酶暴露仅15分钟)。治疗组：载体对照(图3A)，0.1μm达那唑(图3B)，1μm达那唑(图3C)，10μm达那唑(图3D)，100ng/ml TNF-α(图3E)，TNF-α+0.1μm达那唑(图3F)，0.1U/mL凝血酶(图3G)和凝血酶+μm达那唑(图3H)。

图4显示了通过基线BMI，视网膜厚度与基线的最小二乘方平均变化。由于治疗和基线BMI之间的显著相互作用，最小二乘方平均值和P值估计为25％、50％和75％BMI四分位数。最终的ANCOVA模型包含治疗效果、从基线开始的天数、基线视网膜厚度和BMI。所述P值将各活性组与安慰剂组进行比较：所述Dunnett-Hsu方法用于多重比较调整。

图5显示了在用达那唑培养HUVEC细胞后所测的OD水平，其为预防内皮细胞初始增殖能力的量度。

图6A-6E显示了在用达那唑培养后所拍摄的HUVEC细胞的照片，其为预防内皮细胞管形成能力的量度。图6A显示的是对照；图6B显示的是1μM达那唑；图6C显示的是10μM达那唑，图6D显示的是50μM达那唑；和图6E显示的是50μM LY294002。

图7显示了在用达那唑处理HUVEC细胞后所测量的荧光，其为预防内皮细胞侵袭能力的量度。

发明详述

本发明通常涉及在有此需要的动物中抑制血管通透性过高的改进方法。该方法包括确定该动物的体脂含量并根据该动物的体脂含量向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。已经确定的是，使用达那唑化合物来治疗血管通透性过高对给药达那唑化合物的动物的体脂含量敏感。本发明提供了一种改进的方法，其通过个体基础上的校准剂量来给药达那唑化合物以抑制血管通透性过高。更具体地，具有较高体脂含量的个体比具有较低体脂含量的个体需要更高剂量的达那唑化合物来有效地治疗用于抑制血管通透性过高。不受理论的限制，认为是由于达那唑化合物可溶于脂肪。因此，具有高体脂含量的个体减少一些达那唑化合物，因为所述达那唑化合物在其体内被脂肪吸收。

本文所用术语“体脂含量”是指动物的脂肪含量且可通过多种方式确定，包括但不限于计算该动物的体质指数(BMI)、体脂百分比、瘦体重和体表面积。或者，合格的个体可对个体进行定性评估以将个体归类到体脂含量类别。在优选的实施方案中，体脂含量是由动物的BMI测定的。

本文所用的BMI是由动物的体重和身高计算的值。根据疾病的控制和预防中心(www.cdc.gov/healthyweight/assessing/bmi/adult_bmi/index.html)，BMI提供了一个针对大多数人的可靠的体脂指标并用于筛选可导致健康问题的体重类别。BMI并不直接测量体脂，但认为与直接测量体脂相关，例如通过水下称重或双能X-线吸收仪(DEXA；低水平x-线来确定体脂、骨和肌肉的量)(Validity of body mass index compared with other body-compositionscreening indexes for the assessment of body fatness in children and adolescents.American Journal of Clinical Nutrition 2002；7597–985；Garrow JS and Webster J.Quetelet's index(W/H2)as a measure of fatness.International Journal of Obesity1985；9:147–153)。成人和儿童BMI的计算方式相同。BMI的计算可基于以下公式：

公式：体重(kg)/[高度(m)]²

根据公制，BMI的公式是体重(公斤)除以高度(米)的平方。由于身高常用厘米进行测量，因此将以厘米计的身高除以100，得到以米计的身高。

公式：体重(lb)/[身高(in)]²x 703

计算BMI：以磅计的体重(lb)除以以英寸计的身高(in)的平方，并乘以转换因子703。

对于20岁及以上的成人，BMI是使用标准体重状态类别解释的，所述标准体重状态类别适用于所有年龄，无论男女。而对于儿童和青少年，BMI的解释由年龄和性别特异性的。

与成人BMI范围有关的标准体重状况类别如表1所示。

表1

BMI	体重状况
		18.5以下	体重过轻
18.5-24.9	正常
		25.0-29.9	超重
30.0及以上	肥胖

BMI数和身体肥胖之间的联系相当强；但是其因性别、种族和年龄而异。这些变化包括以下实例(Prentice AM and Jebb SA.Beyond Body MassIndex.Obesity Reviews.2001August；2(3):141–7；Gallagher D,等人，Howuseful is BMI for comparison of body fatness across age,sex and ethnic groups？American Journal of Epidemiology 1996；143:228–239)：有同一BMI，女人往往比男人具有更多的体脂；有同一BMI，平均情况下，老人往往比年轻的成人具有更多的体脂；高强度训练的运动员可具有高BMI，这是由于增加的肌肉而并非增加的体脂。

体脂含量和BMI是正相关的，即BMI平均值增加，那么体脂含量增加。

本文所用体脂百分比或体脂比率是动物脂肪的总重除以该动物的总体重。体脂包括必需体脂和储存体脂。必需体脂在维持生命和生殖功能上是必要的。女人的必需体脂百分比比男人要高，是由于需要分娩和其他激素功能。男人的必需体脂的百分比是2–5％，而女人是10–13％。(ACE(2009)What arethe guidelines for percentage of body fat loss？American Council on Exercise(ACE).Ask the Expert Blog.December 2,2009)。储存体脂包括在脂肪组织中蓄积的脂肪，其中一部分用于保护胸部和腹部的内脏器官。最不推荐总的体脂百分比超过上述必需脂肪百分比值。许多方法可用于确定体脂百分比，例如用测径器进行测量或通过使用生化电阻分析(测量穿过动物体的电流速度)、水下称重、双X-线吸收测定法进行测量。体脂百分比是健康水平的测定，因为它是唯一直接计算动物的相对身体组成而不考虑身高或体重的身体测量。

典型的体脂百分比是：

男性体脂百分比：年龄20-39：8％-19％；年龄40-59：11％-21％；年龄60-79：13％-24％。

女性体脂百分比：年龄20-39：21％-32％；年龄40-59：23％-33％和年龄60-79：24％-35％。

体脂含量和体脂百分比是正相关的，也就是说体脂百分比越高意味着体脂含量越高。

本文所用的瘦体重(LBM)是身体组合的成分，其通过总体重减去体脂重量计算：总体重为瘦肉加脂肪。方程是：

瘦体重等于体重减去体脂：LBM＝BW–BF。

瘦体重加体脂等于体重：LBM+BF＝BW。

为瘦肉的总体重的百分比通常不举例–其通常为60–90％。或者，计算作为补充的体脂百分比，且通常为10–40％。

体脂含量和瘦体重是负相关的，即，瘦体重越少说明体脂含量越多。

本文所用的体表面积(BSA)是测量或计算人体的表面积。已发表了各种计算，不用直接测量便可得到BSA。在以下式中，BSA的单位是m²，W是体重，单位是kg，且H是高度，单位是cm。使用最广泛的是Du Bois公式(Du Bois D,Du Bois EF(Jun 1916)。"A formula to estimate the approximatesurface area if height and weight be known".Archives of Internal Medicine 17(6):863–71；Verbraecken,J；等人(Apr 2006)."Body surface area in normal-weight, overweight,and obese adults.A comparison study".Metabolism—Clinical andExperimental 55(4):515–24)：

BSA＝0.007184x W^0.425x H^0.725

体脂含量和BSA是正相关的，也就是说，BSA越高意味着体脂含量越高。

根据该动物的体脂含量给药达那唑化合物的步骤可包括根据以下现象给药一定量的达那唑化合物使得接受一定量达那唑化合物的个体有效地抑制血管通透性过高：高体脂含量个体比低体脂含量个体需要更高剂量的达那唑化合物以抑制血管通透性过高。一旦通过任意上述措施得到该个体的体脂含量，那么可确定达那唑化合物的适当量。例如且不限于，在用BMI测定体脂含量的实例中，基于该动物的BMI得到的达那唑化合物的量可为约0.5mg/BMI单位/天至约1.0mg/BMI单位/天，或更具体地为约0.5mg/BMI单位/天、约0.6mg/BMI单位/天、约0.7mg/BMI单位/天、约0.8mg/BMI单位/天、约0.9mg/BMI单位/天或约1.0mg/BMI单位/天。在本发明的另一方面，当该动物的BMI小于26时，则基于该动物的BMI得到的达那唑化合物的每日剂量可为约2mg/天至约15mg/天。在优选的方面，当该动物的BMI小于26时，该达那唑化合物的每日剂量为约5mg/天。仍在另一方面，当该动物的BMI约26至35时，则基于该动物的BMI得到的达那唑化合物的每日剂量可为约2mg/天至约15mg/天。在优选的方面，当该动物的BMI为约26至35时，该达那唑化合物的每日剂量为约10mg/天。还在另一方面，当该动物的BMI大于35时，则基于该动物的BMI得到的达那唑化合物的每日剂量可为约5mg/天至45mg/天。在优选的方面，当该动物的BMI大于35时，则基于该动物的BMI得到的达那唑化合物的每日剂量为约15mg/天。

本文所用的“血管通透性过高”是指血管内皮的通透性比基础水平高。本文所用的“血管通透性过高”包括细胞旁引起的通透性过高和跨细胞作用引起的通透性过高。

本文所用的“细胞旁引起的通透性过高”是指由于细胞旁转运引起的血管通透性过高，其比基础水平高。“细胞旁引起的通透性过高”的其他特征如下所述。

本文所用的“细胞旁转运”是指离子、分子和液体穿过胞间连接(interendothelial junction)(IEJ)的运动，所述胞间连接位于内皮的内皮细胞之间。

本文所用的“跨细胞作用引起的通透性过高”是指由跨细胞作用导致的血管通透性过高，其比基础水平高。

本文所用的“跨细胞作用”是指大分子的主动运输并伴有液相血浆组分穿过内皮的内皮细胞。“跨细胞作用”的其他特征如下所述。

本文所用的“基础水平”是指在正常组织或器官中所见的水平。

本文所用的“抑制”及类似术语是指减少、延缓或预防。

如果动物目前患有由血管通透性过高介导的疾病或病症、呈现出该疾病或病症的早期迹象，或具有发展成该疾病或病症的倾向，那么该动物“需要”本发明的治疗。

本发明所用的“介导”及类似术语是指由血管通透性过高导致、导致、参与或恶化。

本文所用的“一个”或“一种”是指一或多个。

本发明在上文中特别描述了抑制血管通透性过高的改进方法，其根据该动物的体脂含量向个体给药一定量的达那唑化合物。此方法是对下述通过给药达那唑化合物来抑制血管通透性过高的常规方法的改进。该方法包括向有此需要的动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。根据本发明，抑制血管通透性过高包括抑制细胞旁引起的通透性过高和跨细胞作用引起的通透性过高。最近的证据表明，跨细胞作用引起的通透性过高是许多疾病或病症中最终导致组织和器官损伤的过程的第一步。因此，本发明提供了对这些疾病或病症早期干涉的方式，其可减少、减缓或甚至有可能预防在其中可见的组织或器官损伤。

本发明还提供抑制存在于含有连续性内皮或被连续性内皮包围的任何组织或器官中的血管通透性过高的改进方法。如上所述，连续性内皮存在于或包围脑(血脑屏障)、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏的一些区域(乳突微脉管系统、下行直小血管)、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜(血视网膜屏障)、骨骼肌、皮肤、睾丸、脐静脉和身体的其它组织和器官。优选地，连续性内皮发现在脑、心脏、肺部、神经或视网膜中或在脑、心脏、肺部、神经或视网膜周围。

本发明还提供抑制存在于含有开窗内皮或被开窗内皮包围的任何组织和器官中的血管通透性过高的改进方法。如上所述，开窗内皮存在于或包围肾(肾小球、肾小管周围毛细血管和上行直小血管)、胰腺、肾上腺、内分泌腺和肠。优选地，开窗内皮发现存在于肾中，尤其是在肾的肾小球中。

此外，通过血管通透性过高引起的任何疾病或病症可以通过本发明的方法来治疗。这样的疾病和病症包括糖尿病、高血压和动脉粥样硬化。

特别地，糖尿病的血管并发症，包括含有连续性内皮或开窗内皮的脑、心脏、肾脏、肺部、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤以及其它组织和器官的血管并发症可以通过本发明来治疗。这些血管并发症包括水肿、LDL在内皮下空间的聚集、加速的动脉粥样硬化、以及下述并发症：脑(血管壁的加速老化)、心脏(心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病性心肌病)、肾脏(糖尿病性肾病)、肺部(在患糖尿病的母亲中胎儿肺部发育的滞后、一些肺部生理学参数的变化和感染敏感性的增加)、肠系膜(血管增生)、神经(糖尿病性神经病变)、视网膜(黄斑水肿和糖尿病性视网膜病)和皮肤(发红、变色、干燥和溃疡)。

糖尿病性视网膜病是导致失明的主要原因，其影响估计二千一百万患有糖尿病的美国人中的约25％。尽管其发病率和发展可以通过加强血糖和血压控制来降低，但几乎所有患有1型糖尿病的患者和超过60％患有2型糖尿病的患者最终会发展成糖尿病性视网膜病。糖尿病性视网膜病存在两个阶段。第一，非增生性视网膜病变，是该疾病的较早阶段且其特征在于增加的血管通透性、微动脉瘤、水肿以及最终的血管闭塞。新血管化不是非增生性阶段的成分。在这个阶段大部分的视觉丧失是由于黄斑(视网膜的中心区域)中的液体积累。这种液体积累被称为黄斑水肿并且可以导致暂时或永久的视力降低。糖尿病性视网膜病的第二阶段被称为增生性视网膜病变，且其特征在于异常新血管的形成。不幸地是，这种异常新血管化可以是非常严重的损伤，这是因为其可以引起眼部的出血、视网膜瘢痕组织、糖尿病患者的视网膜剥离或青光眼，这些中的任何均可以导致视力降低或失明。黄斑水肿也会出现在增殖阶段。

糖尿病性神经病变是糖尿病常见的严重的并发症。存在四种主要类型的糖尿病性神经病变：周围神经病变、自主神经病变、神经根神经丛病变(radiculoplexus神经病)以及单一神经病变。周围神经病变(最常见的糖尿病性神经病变类型)的表现和症状包括：麻木，或感觉疼痛、或温度变化(尤其是脚部和脚趾)的能力降低、麻刺感或发烫感觉、锐痛、走路时的疼痛、对于非常轻的接触极其敏感、肌无力、走路困难、以及严重的脚部问题(例如溃烂、感染、变形以及骨和关节疼痛)。自主神经病变影响自主神经系统，自主神经系统控制心脏、膀胱、肺部、胃、肠、性器官以及眼部，这些区域中的任何部分均可能出现问题。神经根神经丛病变(也称为糖尿病肌萎缩、股神经病或近端神经病变(proximal神经病))通常影响臀部、肩部或腹部的神经，通常影响身体的一侧。单一神经病变是指仅损害一个神经，通常是胳膊、腿或面部的神经。糖尿病性神经病变的常规并发症包括四肢(例如，脚趾、脚或腿)的丧失、沙尔科关节(charcot joint)、尿路感染、尿失禁、无知觉性低血糖(甚至可能是致死的)、低血压、消化问题(例如，便秘、腹泻、恶心以及呕吐)、性功能障碍(例如，勃起功能障碍)、以及出汗增加或减少。可以看出，症状可以从轻微到疼痛、到失去能力以及甚至是致死的。

糖尿病性肾病是在美国引起末期肾脏疾病的最普遍的原因。其是糖尿病的血管并发症，影响肾脏的肾小球毛细血管并且降低肾脏的过滤能力。首先显示患有肾病的是超过滤的出现，以及随后的微量白蛋白尿。严重的蛋白尿和持续衰退的肾功能出现在末期肾脏疾病之前。通常，在肾病的任何表现出现之前，通常会忽视视网膜病变。对于由糖尿病引起的末期肾脏疾病患者通常建议进行肾移植。接受移植的患者5年存活率为约60％，相比地，进行透析的患者5年存活率仅为2％。

高血压通常发展很多年，并且其最终会影响几乎每个人。未受控制的高血压会增加严重健康问题的风险，所述严重健康问题包括：心力衰竭、充血性心力衰竭、中风、周围动脉疾病、肾衰竭、动脉瘤、眼部损伤、以及在记忆或认知方面出现问题。

动脉粥样硬化也是逐渐发展的。动脉粥样硬化能够影响冠状动脉、颈动脉、周围动脉或微脉管系统，动脉粥样硬化的并发症包括：冠心病(其可以引起心绞痛或心力衰竭)、冠状微血管疾病、颈动脉疾病(其可以引起短暂性脑缺血发作或中风)、周围动脉疾病(其可以引起对于热和冷的敏感度的丧失或甚至是组织死亡)、以及动脉瘤。

根据本发明可以治疗的其它疾病和病症包括：急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、老化相关性黄斑变性、脑水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状微血管疾病、脑微血管疾病、伊尔斯氏病(Eals病),由损伤(例如，创伤或烧伤)引起的水肿、与高血压相关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文-加斯综合征(Irvine Gass Syndrome)、缺血、黄斑水肿(例如，由血管闭塞、眼内手术后(例如，白内障手术)、葡萄膜炎或视网膜色素变性引起，以及由糖尿病引起的其它疾病)、肾炎(例如，肾小球肾炎、血清病性肾炎以及Thy-1肾炎)、肾病、肾病水肿、肾病综合征、神经病、组织水肿引起的器官衰竭(例如，在败血病中或由创伤引起)、先兆子痫、肺水肿、肺高血压、肾功能衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉阻塞(例如，分支或中央静脉阻塞)、视网膜炎、视网膜病变(例如，动脉硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、放射性视网膜病变、镰状红细胞性视网膜病变以及早熟性视网膜病变，以及其它糖尿病性视网膜病)、无症状性脑梗死、全身炎症反应综合征(SIRS)、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血管渗漏综合征、玻璃体出血以及Von Hipple Lindau病。此外，已知一些药物(包括那些用于治疗多发性硬化的药物)会引起血管通透性过高，并且达那唑可以用来减少在使用这些药物时的上述不期望的副作用。遗传性和获得性血管性水肿可以明确地与那些可以通过本发明治疗的疾病和病症区分。

在本文中使用的“治疗”表示减少(全部或部分地)症状、减少疾病或病症的持续时间或严重程度。还考虑了治愈疾病或预防疾病或病症，但是其与治疗疾病或病症不同。

近期的证据显示转胞吞作用-引起的通透性过高是在多种疾病和病症中最终导致组织和器官损害的过程的第一步。因此，本发明提供在这些疾病和病症中的早期介入手段，其能够减少、延迟或甚至潜在地预防在这些疾病和病症中组织和器官的损伤。例如，基于对于能够通过本发明治疗的疾病或病症(上述的那些疾病和病症)中的一种的诊断，可以对动物立即进行治疗。或者，优选对于下述动物的治疗，所述动物在存在症状之前具有这样的疾病或症状的早期表现或具有发展为这样的疾病或症状的表现或倾向。糖尿病、高血压以及动脉粥样硬化的早期表现以及危险度因子是众所周知的，并且对于显示这些早期表现或危险度因子的动物的治疗可以在疾病或病症的症状存在之前开始(即预防地)。

例如，根据诊断，对于被确诊为患有糖尿病的患者的治疗可以立即开始。具体地，糖尿病患者应当优选在出现血管并发症的任何症状之前，用达那唑化合物来治疗，尽管这经常是不可能的，因此大多数糖尿病患者在其确诊时已显示这些症状(参见下文)。或者，糖尿病患者应当在非增生性糖尿病性视网膜病较为轻微(即，微动脉瘤和视网膜内出血的轻微水平)时接受治疗。参见糖尿病性视网膜病，第9页(编辑Elia Duh,M.D.,Human Press,2008)。这样的早期治疗可以提供预防黄斑水肿和从视网膜病变发展为增生性糖尿病性视网膜病的最佳机会。此外，糖尿病性视网膜病的存在被认为是其它糖尿病的微血管并发症存在或将会发展的表现(参见同上,474-477页)，并且早期的治疗还可以预防或减少这些其它的并发症。当然，糖尿病血管并发症的更重度的疾病和病症也可以利用有益结果来治疗。

但是，如上文所述，在糖尿病被确诊时，血管并发症通常已经存在。相应地，优选对于具有发展为糖尿病的早期表现或倾向的病人进行预防性治疗。这些早期表现和危险度因子包括空腹血糖高但是还未足够高地确定为糖尿病(“糖尿病前期”)、高胰岛素血症、高血压、血脂障碍(高胆固醇、高甘油三酯、高低密度脂蛋白、和/或低水平高密度脂蛋白)、肥胖(体重指数高于25)、不活泼、超过45岁、睡眠不足、家族糖尿病史、少数种族、妊娠糖尿病史、以及多囊卵巢综合征史。

相似地，根据诊断，对于被确诊为患有高血压的患者的治疗可以立即开始。高血压通常不会引起任何症状，但是对于具有发展为高血压倾向的患者可以开始预防性治疗。高血压的危险度因子包括年龄、种族(在黑人中高血压更为常见)、家族史(高血压在家族中延续)、超重或肥胖、缺乏活力、吸烟、饮食中盐分过多、饮食中钾过少、饮食中维生素D过少、饮酒过多、压力水平高、某些慢性条件(例如，高胆固醇、糖尿病、肾脏疾病以及睡眠性呼吸暂停)以及使用某些药物(例如，口服避孕药、苯丙胺、减肥药丸、以及一些冷和过敏药物(allergy medications))。

对于被确诊为动脉粥样硬化的患者可以在诊断后立即开始治疗。但是，优选对于具有发展为动脉粥样硬化的早期表现或倾向的患者进行预防性治疗。动脉粥样硬化的早期表现和危险度因子包括年龄、动脉瘤或早期心脏疾病的家族史、高血压、高胆固醇、高甘油三酯、胰岛素耐受性、糖尿病、肥胖、吸烟、缺乏体力活动、不健康饮食、以及高C-反应蛋白水平。

用来抑制血管通透性过高的本发明的方法包括向有此需要的动物给药有效量的达那唑化合物以抑制血管通透性过高。在此使用的“达那唑化合物”是指达那唑、达那唑的前药以及达那唑和其前药的药学上可接受的盐。

达那唑(17α-孕甾-2,4-二烯-20-炔并[2,3-d]-异噁唑-17β-醇)是已知的合成类固醇激素。其结构为：

制备达那唑的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利号3,135,743和英国专利号905,844。此外，达那唑可以从多个来源商购，包括Barr Pharmaceuticals,Inc.,Lannett Co.,Inc.、Sanofi-Aventis Canada、Sigma-Aldrich以及Parchem Trading Ltd。

“前药”表示当向动物给药这类前药时，在体内释放活性母体药物(在本案中为达那唑)的任何化合物。达那唑的前药包括如下：达那唑中的羟基与任何基团键合并且可以在体内被切断从而产生游离羟基的物质。达那唑前药的实例包括达那唑的酯(例如，乙酸酯、甲酸酯、以及苯甲酸酯衍生物)。

达那唑和其前药的药学上可接受的盐包括传统的非毒性盐，例如衍生自无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)的盐、衍生自有机酸(例如，乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)的盐、或衍生自碱(例如药学上可接受的金属阳离子或衍生自N,N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、或乙二胺的有机阳离子的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐)的盐。这些盐可以通过常规方式制备，例如用酸来中和化合物的游离碱形式。具体地，异噁唑例如达那唑是弱碱性物质并且在加入强酸的条件下会形成酸加成盐，以及在加入强酸的酯(例如，强无机酸或有机磺酸的酯，优选低级烷基、低级烯基或低级芳烷基酯，例如甲基碘、乙基碘、乙基溴、丙基溴、丁基溴、烯丙基溴、硫酸甲酯、苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸甲酯、苄基氯等)的条件下会形成季铵盐。参见美国专利号3,135,743。

如上所述，达那唑化合物可以用来抑制血管通透性过高以及治疗由血管通透性过高引起的疾病或病症。为了实现上述，向需要此治疗的动物给药达那唑化合物。优选地，所述动物为哺乳动物，例如兔子、山羊、狗、猫、马或人。最优选所述动物为人。

本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)的有效的用药形式、给药方式以及用药量可以利用在此给出的指导根据经验来确定。本领域技术人员理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、疾病或病症的严重程度、一种或多种给药途径、治疗的持续时间、对动物给药的任何其它药物的鉴别、动物的年龄、尺寸以及物种、以及在医学和兽医学领域已知的类似因素，用药量会发生变化。通常来说，本发明化合物的合适的每天剂量是对产生治疗效果有效的最低剂量的化合物量。但是，每天剂量将在合理的医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确定。如果需要，有效的每天剂量可以分成两次、三次、四次、五次、六次或更多次亚剂量(sub-dose)来给药，在每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得可接受的反应。

之前已经有报道称达那唑化合物可以抑制血管生成。参见PCT申请WO2007/009087。令人吃惊以及相当意外的是，已经发现在实现本发明中可使用的达那唑化合物的最佳剂量比之前报道的用于抑制血管生成的达那唑化合物的最佳剂量低约100-1000倍，并且显著低于目前对患者给药以治疗其它疾病和病症的那些量(通常地，对于成年人为200-800mg/天)。使用这些较低剂量的达那唑化合物会避免任何显著的副作用，可能会避免所有的副作用，这对于根据本发明的疾病以及病症的早期或预防性治疗是非常有利的。

具体来说，抑制血管通透性过高的达那唑化合物的有效剂量可以为0.1ng/kg/天～35mg/kg/天，优选为40ng/kg/天～5.0mg/kg/天，最优选为100ng/kg/天～1.5mg/kg/天。有效的剂量也可以是如下剂量：可以在相关液体(例如血液)中产生0.0001μM～5μM，优选0.1μM～1.0μM，更优选0.1μM～0.5μM，最优选约0.1μM的浓度。有效剂量也可以是如下剂量：可以在待治疗的组织或器官中产生约0.17％(重量/重量)或更少，优选0.00034％～0.17％，最优选0.0034％～0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时，优选以0.0001μM～5μM，优选以0.1μM～1.0μM，更优选以0.1μM～0.5μM，最优选以约0.1μM的浓度给药达那唑化合物，或优选以约0.17％(重量/重量)或更少，优选以0.00034％～0.17％，最优选以0.0034％～0.017％的浓度给药达那唑化合物。当口服给药成年人时，优选剂量为约1ng/天～约100mg/天，更优选剂量为约1mg/天～约100mg/天，最优选剂量为约10mg/天～约90mg/天，优选以每天两次相同的剂量给药。此外，由于期待达那唑会在细胞和组织中积累，因此在一段时间(例如，2-4周)之后可以将初始(负荷)剂量(例如，每天100mg)降低至更低的维持剂量(例如，每天1mg)，这可能会导致不确定的副作用而不是显著的副作用，也可能将会没有任何副作用。如文中所用的，达那唑化合物的“血管-通透性过高-抑制剂量”定义为是指上述在本段落中描述的那些量。

本发明还提供调节动物中内皮细胞的细胞骨架的改进方法。该方法包括向所述动物给药有效量的达那唑化合物。本发明的该实施方式是基于如下发现：达那唑抑制F-肌动蛋白张力丝的形成、引起皮质肌动蛋白环(cortical actinring)的形成、通过1-磷酸鞘氨醇(S1P)促进以及延长皮质肌动蛋白环的形成、抑制RhoA、增加VE-钙粘蛋白的磷酸化、可能会激活屏障-稳定化GTPase以及可能会稳定微管。细胞骨架的调节可以降低血管通透性过高以及提高血管通透性过低(即，通透性低于基础水平)，由此使内皮重新为内环境稳定。相应地，由血管通透性过高引起的那些疾病和病症可以被治疗(参见上文)并且由血管通透性过低引起的那些疾病和病症也可以被治疗。后一类型的疾病和病症包括肝脏老化、动脉粥样硬化生成、动脉粥样硬化、肝硬化、肝脏纤维化、肝功能衰竭、以及原发性肝癌和转移性肝癌。

本发明还提供了调节动物内皮细胞的细胞骨架的方法，其通过测定动物的体脂含量并根据该动物的体脂含量向其给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。在一个方面，确定步骤包括计算该动物的体脂含量。正如所讨论的，该动物的体重含量可通过多种方式测定，包括但不限于，动物的机体质量指数(BMI)、体脂百分比、瘦体重和体表面积。在优选的实施方案中，体脂含量是由动物的BMI测定的。

调节内皮细胞的细胞骨架的方法包括向动物给药有效量的达那唑化合物。“达那唑化合物”和“动物”具有与上述相同的含义。

用于调节细胞骨架的本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)的有效的剂型、给药方式以及给药量可以利用在此给出的指导根据经验来确定。本领域技术人员应当理解的是针对待治疗的具体的疾病或病症、疾病或病症的严重程度、一种或多种给药途径、治疗的持续时间、对动物给药任何其它药物的鉴别、动物的年龄、尺寸以及物种、以及在医学和兽医学领域已知的类似因素，给药量会发生变化。通常来说，本发明化合物的合适的每天剂量是对产生治疗效果有效的最低剂量的化合物量。但是，每天剂量将在合理的医学判断的范围内由参加的医师或兽医来确定。如果需要，有效的每天剂量可以分成两次、三次、四次、五次、六次或更多次亚剂量(sub-dose)来给药，在每天合适的时间间隔单独给药。该化合物的给药应当持续直到取得可接受的反应。

具体来说，用于调节内皮细胞的细胞骨架的达那唑化合物的有效剂量可以为0.1ng/kg/天～35mg/kg/天，优选为40ng/kg/天～5.0mg/kg/天，最优选为100ng/kg/天～1.5mg/kg/天。有效的剂量也可以是如下剂量：可以在相关液体(例如血液)中产生0.0001μM～5μM，优选0.1μM～1.0μM，更优选0.1μM～0.5μM，最优选约0.1μM的浓度。有效剂量也可以是如下剂量：可以在待治疗的组织或器官中产生约0.17％(重量/重量)或更少，优选0.00034％～0.17％，最优选0.0034％～0.017％的浓度。当局部地或部分地给药时，优选以0.0001μM～5μM，优选以0.1μM～1.0μM，更优选以0.1μM～0.5μM，最优选以约0.1μM的浓度给药达那唑化合物，或以约0.17％(重量/重量)或更少，优选以0.00034％～0.17％，最优选以0.0034％～0.017％的浓度给药达那唑化合物。当口服给药成年人时，优选剂量为约1ng/天～约100mg/天，更优选剂量为约1mg/天～约100mg/天，最优选剂量为约10mg/天～约90mg/天，优选以每天两次相同的剂量给药。此外，由于预期达那唑在细胞和组织中积累，因此在一段时间(例如，2-4周)之后可以将初始(负荷)剂量(例如，每天100mg)降低至更低的维持剂量(例如，每天1mg)，这可能会导致不确定的副作用而不是显著的副作用，也可能将会没有任何副作用。

本发明化合物(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐)可以通过任何合适的给药途径给药治疗的动物患者，所述给药途径包括口服、经鼻、肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮下或肌内)、经皮、眼内和局部(包括口腔和舌下)途径。根据本发明对于可治疗的任何疾病或病症通常优选口服给药。用来治疗眼部的疾病和病症的优选的给药方式为口服、眼内和局部给药。最优选的为口服。相当意外以及令人惊奇的是，眼部的疾病可以通过口服达那唑化合物来治疗，这是因为之前还没有报道称通过口服给予药物可成功地治疗这类疾病和病症。

治疗脑的疾病和病症的优选的给药方式是口服和肠胃外给药。优选口服给药。

尽管可以单独给药本发明的化合物，但优选作为药物制剂(组合物)给药。本发明的药物组合物包括一种或多种本发明化合物作为活性成分，其与一种或多种药学上可接受的载体混合，以及任选与一种或多种其它化合物、药物或其它物质混合。每种载体在与制剂的其它成分的相容性方面必须是“可以接受的”并且对于动物是无害的。在本领域中药学上可接受的载体是已知的。与所选择的给药途径无关，可以通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物配制成药学上可接受的剂型。参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences。

适合口服给药的本发明的制剂可以是如下形式：胶囊、扁囊剂、药丸、片剂、粉末、颗粒或作为含水或不含水液体中的溶液或悬浮液、或水包油或油包水液体乳剂，或酏剂或糖浆、或锭剂(使用惰性基底，例如明胶和甘油，或蔗糖以及阿拉伯树胶)等，每种均含有特定量的一种或多种的本发明化合物作为活性成分。一种或多种的本发明化合物还可以以推注、药糖剂以及糊状形式给药。

在用于口服给药的本发明固体制剂形式(胶囊、片剂、药丸、糖衣丸、粉末、颗粒等)中，活性成分(即达那唑、达那唑的前药或者它们中的任何一种的药学上可接受的盐，或上述物质的组合物)与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体为例如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或下述中的任何：(1)填料或膨胀剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和/或硅酸；(2)粘合剂例如，羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、特定的硅酸盐、以及碳酸钠；(5)溶液阻燃剂(solutionretarding agent)，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、以及它们的混合物；以及(10)着色剂。在为胶囊、片剂和药丸的情况下，药物组合物还可以含有缓冲剂。相似类型的固体组合物可以以如下形式利用：作为利用赋形剂例如乳糖和高分子量聚乙二醇等的、在软和硬-填充的明胶胶囊中的填料。

片剂可以通过任选与一种或多种辅助成分压缩或模塑来制备。压缩片剂可以通过使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羧甲淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可以通过在适当的机械中模塑使用惰性液体稀释剂润湿的成粉末状的化合物的混合物来制备。

片剂，以及本发明药物组合物的其它固体剂型，例如糖衣丸、胶囊、药丸和颗粒剂可以任选利用涂层或壳(例如肠溶性涂层和在药剂学领域中已知的其它涂层)来获得或制备。也可以使用如下物质来制备从而可以提供其中的活性成分的缓慢或受控释放，所述物质例如，变化比例的羟丙基甲基纤维素从而提供所期望的释放曲线，其它聚合物基体，脂质体和/或微球。可以利用例如通过细菌滤器(bacteria-retaining filter)来过滤以对其进行灭菌。这些组合物还可以任选含有遮光剂，并且可以为如下的组合物，该组合物可以在胃肠道的特定部位仅释放或优选释放活性成分，任选地以延迟的方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括多聚物质和蜡。活性成分也可以为微囊化形式。

用于本发明化合物的口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有通常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其是棉花子油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及山梨醇酐的脂肪酸酯、以及它们的混合物。

除了惰性稀释剂，口服组合物还可以包括例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜化剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。

除了活性成分之外，悬浮液还可以含有助悬剂例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、琼脂以及黄蓍树胶，以及它们的混合物。

在本发明的一个实施方案中，所述达那唑化合物是定时释放制剂。如本文所用术语“定时释放”是指当将所述达那唑化合物和/或药物组合物用例如多糖、生物相容性聚合物、其他聚合基质、胶囊、微胶囊、微粒、推注制剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂球(lipospheres)、干粉或透皮递送系统进行配制，则获得受控或持续的释放。本发明的其他控释组合物包括液体，其在给药至动物时原位形成固体或凝胶。此外，术语“定时释放制剂”包括用于实现药物的受控释放的一类生物可降解聚合物，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、缩醛树脂、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacylates)和水凝胶的交联或二亲嵌段共聚物。在优选的实施方案中，所述定时释放制剂包括成分，例如脂质体、多糖及其组合。

本发明还提供适合用于眼部治疗的药物产品。这样的药物产品包括药物组合物、装置和植入物(其可以是组合物或装置)。

用于向眼球中眼内注射的一种或多种的本发明化合物的药物制剂(组合物)包括：溶液、乳剂、悬浮液、颗粒、胶囊、微球、脂质体、基体等。参见，例如，美国专利号6,060,463，美国专利申请公开号2005/0101582和PCT申请WO 2004/043480，在此将它们完整的公开内容引入作为参考。例如，用于眼内注射的药物制剂可以包括一种或多种本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗的含水或不含水溶液、悬浮液或乳剂，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、助悬剂、增稠剂或增粘剂(例如透明质酸聚合物)。合适的含水和不含水载体的实例包括：水、盐水(优选为0.9％)、含葡聚糖的水溶液(优选5％)、缓冲液、二甲基亚砜、醇类和多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)。这些组合物还可以包含辅助剂，例如润湿剂和乳化剂，以及分散剂。此外，可注射药物型的延长吸收可以通过包含在延迟吸收的试剂中来实现，所述试剂例如聚合物和明胶。可注射的缓释型(injectable depot form)可以通过将药物结合到微胶囊或微球中来制备，所述微胶囊或微球由生物可降解聚合物例如聚乳酸-聚羟基乙酸制备。其它生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯和聚酸酐(poly(anhydrides))。缓释注射制剂(depot injectable formulation)也可以通过使药物包埋到与眼部组织相容的脂质体(由常用组分形成，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱)或微乳剂中来制备。根据药物与聚合物或液体(liquid)的比例，具体的聚合物或液体成分的性质，所使用的脂质体的类型，以及微胶囊或微球是否被包覆或未被包覆，可以控制药物从微胶囊、微球和脂质体中释放的速率。

本发明化合物也可以通过外科手术作为眼部植入物的形式给药。例如，可以将具有聚乙烯醇或聚乙酸乙烯酯扩散壁以及含有一种或多种的本发明化合物的储存容器(reservoir container)移植到巩膜中或移植到巩膜上。另外的例子，可以将一种或多种的本发明化合物结合到由聚合物制备的聚合物基体中，所述聚合物例如聚己酸内酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚酸酐或脂质(例如癸二酸)，并可将其移植到巩膜上或眼内。上述方法通常通过下述过程来完成：针对接受局部或部分麻醉的动物并且利用在角膜后的小切口。然后，通过切口插入该基体并且与巩膜缝合。

本发明的化合物还可以局部给药到眼部，本发明优选的实施方式为适用于眼部的局部的药物组合物。适用于眼部的局部的药物组合物包括溶液、悬浮液、分散液、滴剂、凝胶、水凝胶以及软膏剂。参见，例如美国专利号5,407,926和PCT申请WO 2004/058289、WO 01/30337和WO 01/68053，在此将它们完整的公开内容引入作为参考。

适用于眼部的局部的制剂包括在含水或不含水基底中的一种或多种本发明的化合物。局部的制剂还可以包括吸收促进剂、渗透促进剂、增稠剂、粘度提高剂、用于调节和/或保持pH的试剂、用于调节渗透压的试剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液、盐(优选氯化钠)、助悬剂、分散剂、增溶剂、稳定剂和/或张度剂。适用于眼部的局部的制剂优选包括吸收或渗透促进剂以促进一种或多种的本发明化合物吸收或渗透到眼部中，和/或包括可以提高一种或多种的本发明化合物在眼部的停留时间的增稠剂或粘度提高剂。参见PCT申请WO 2004/058289、WO 01/30337和WO 01/68053。吸收/渗透促进剂的例子包括单独的二甲基砜或与二甲基亚砜结合的二甲基砜、羧酸和表面活性剂。增稠剂和粘度提高剂的例子包括葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、纤维素类聚合物(例如羟丙基甲基纤维素)、含羧基的聚合物(例如丙烯酸的聚合物或共聚物)、聚乙烯醇和透明质酸或其盐。

适合用于眼部治疗的液体剂型(例如，溶液、悬浮液、分散液以及滴剂)可以通过例如如下方法来制备：将一种或多种的本发明化合物溶解、分散、悬浮等在载体中，所述载体例如水、盐水、含水葡聚糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液、分散液或悬浮液。如果需要，该药物制剂还可以含有微量无毒性的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠(triethanolamine sodium acetate)、三乙醇胺油酸酯等。

适合用于眼部治疗的含水的溶液和悬浮液除了一种或多种的本发明化合物之外，可以包括防腐剂、表面活性剂、缓冲液、盐(优选氯化钠)、张度剂以及水。如果使用悬浮液，颗粒大小应当小于10μm以最小化对眼部的刺激。如果使用溶液或悬浮液，递送到眼部的量应当不超过50μl以防止过量的溶液或悬浮液从眼部漏出。

适合用于眼部治疗的胶体悬浮液通常由微粒(即，微球、纳米球、微胶囊或纳米胶囊，其中微球和纳米球通常为其中陷入有、吸附有或以其它方式含有制剂的聚合物基体的整体式颗粒，而针对微胶囊和纳米胶囊，制剂通常装入到胶囊中)形成。这些微粒的尺寸上限为约5μ～约10μ。

适合用于眼部治疗的眼部的软膏剂包括在合适的基底中的一种或多种的本发明化合物，所述基底例如矿物油、液态羊毛脂、白凡士林、上述物质的两种或全部三种的混合物，或聚乙烯-矿物油凝胶(polyethylene-mineral oilgel)。可以任选包括防腐剂。

适合用于眼部治疗的眼部的凝胶包括悬浮在亲水基底中的一种或多种的本发明化合物，所述亲水基底例如Carpobol-940，或乙醇、水和丙二醇的混合物(例如，以40:40:20的比例)。使用了胶凝剂，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或甘草酸铵(ammoniated glycyrrhizinate)。可以任选包括防腐剂和/或张度剂。

适合用于眼部治疗的水凝胶通过与可膨胀的、形成凝胶的聚合物混合来形成，所述聚合物例如上述列出的作为增稠剂或粘度提高剂的那些，除了在本领域中被称作“水凝胶”的通常与被称作“增稠的”溶液或悬浮液的制剂相比具有更高粘度的那些制剂之外。与上述预先制成的水凝胶不同，也可以制备制剂，使得在将其给药到眼部后原位地形成水凝胶。这样的凝胶在室温下为液体但是在更高的温度下为凝胶状(因此将其称为“热可逆的”水凝胶)，所述更高的温度例如当放置使其与体液接触时。提供上述性质的可生物相容的聚合物包括丙烯酸聚合物和共聚物、N-异丙基丙烯酰胺衍生物和环氧乙烷和环氧丙烷的ABA嵌段共聚物(通常被称作“泊洛沙姆(poloxamer)”，并且以商品名可以从BASF-Wayndotte商购)。

优选的分散液为脂质体的，在这种情况下，制剂被包封在脂质体(由交替的含水隔室(compartment)和脂质双分子层构成的微囊泡)中。

可以利用含水或不含水的基底制备眼部滴剂，所述基底还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地递送液体成分(借助于特殊形状的闭合物)的塑料瓶来递送滴剂。

还可以借助插入到眼部的浸渍有药物的固体载体来局部地施加本发明的化合物。通常通过聚合物的溶出或生物侵蚀，渗透或它们的组合来影响药物的释放。可以使用一些基体型传输(matrix-type delivery)系统。这样的系统包括用所期望的本发明的化合物浸渍或浸泡的亲水的软性隐形眼镜，以及在放入到眼部后不需要将其拿出的其它生物可降解或可溶的装置。这些可溶的眼部植入物可以由眼部能够忍受的并且与待给药的本发明化合物相容的任何可降解物质构成。这样的物质包括但不限于：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、丙烯酸乙酯以及乙烯基吡咯烷酮的聚合物和共聚物，以及交联的多肽或多糖(例如甲壳质)。

用于其它类型局部给药(即，不是针对眼部)或用于经皮肤给药本发明化合物的剂型包括粉末剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片(patch)、滴剂以及吸入剂。可以在无菌条件下，将活性成分与药学上可接受的载体，与任何缓冲剂，或者根据需要与推进剂(propellant)混合。软膏剂、糊剂、乳膏和凝胶除了含有活性成分之外，可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或它们的混合物。粉末剂和喷雾剂除了含有活性成分之外，可以含有赋形剂例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可任选含有常用的推进剂例如氯氟烃以及可挥发的未取代的烃(例如丁烷和丙烷)。经皮贴片具有附加的优点，即提供本发明化合物到身体的可控递送。这样的剂型可以通过将一种或多种的本发明化合物溶解、分散或以其它方式混合到合适的介质中来制备，所述介质例如弹性体基体材料。吸收促进剂也可以用于增加化合物跨皮肤的流动。这样的流动的速率可以通过提供速度可控膜或将化合物分散到聚合物基体或凝胶中来控制。浸渍有药物的固体载体(例如，敷料(dressing))也可以用于局部给药。

药物制剂包括适于通过吸入或鼻吸入法或用于鼻部给药的那些药物制剂。对于通过吸入法给药到上(鼻部)或下呼吸道，通常由吸入器、喷雾器或加压包装(pressurized pack)或递送喷雾剂的其它方便装置来递送本发明的化合物。加压包装可以包括合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供用来递送计量量的阀来确定。

或者，对于通过吸入法或鼻吸入法给药，组合物可以采取干燥粉末的形式，例如一种或多种本发明化合物以及合适的粉末基底的粉末混合物，所述粉末基底例如乳糖或淀粉。粉末组合物可以以在例如胶囊或药筒，或者在例如明胶或泡罩包装(blister pack)中的单位剂量形式呈现，在气雾吸入器、吹入器或定量喷雾器的帮助下可以从上述单元中给药粉末。

对于鼻内给药，可以借助于鼻滴剂或液体喷雾剂，例如借助于塑料瓶喷雾器或定量喷雾器给药本发明化合物。液体喷雾剂通常由加压包装递送。喷雾器的典型例子为Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

可以利用含水或不含水的基底制备鼻滴剂，所述含水或不含水的基底还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。可以借助于简单的眼部带盖的点滴瓶或借助于适合用于滴加地递送液体成分(借助于特殊形状的闭合物)的塑料瓶来递送滴剂。

适合用于肠胃外给药的本发明药物组合物包括一种或多种本发明的化合物和一种或多种药学上可接受的无菌等渗含水或不含水溶液、分散液、悬浮液或乳剂、或可以在即将使用前重新形成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、使制剂与待受试者血液等渗的溶质，或助悬剂或增稠剂。此外，可以使用药物包覆的支架(stent)。

可以用于本发明药物组合物的合适的含水和不含水的载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及它们的适当的混合物、植物油(例如橄榄油)、以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。通过使用包覆材料(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂可以保持适当的流动性。

这些组合物还可以含有辅助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在组合物中还期望包含等渗试剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂来实现，所述试剂例如单硬脂酸铝和明胶。

在一些情况中，为了延长药物的效果，期望可以使药物从皮下或肌内注射中的吸收变慢。这可以通过使用晶体或具有较差水溶性的无定形材料的液体悬浮液来实现。药物吸收的速率取决于其溶解的速率，反之，其溶解的速率可能取决于晶体的大小和晶型。或者，肠胃外给药药物的延迟吸收可以通过在油媒介物中溶解或悬浮该药物来实现。

可注射的缓释形式可以通过在可生物降解的聚合物(例如聚乳酸-聚羟基乙酸)中形成所述药物的微胶囊型基体来制备。根据药物和聚合物的比例，使用的具体的聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的实例包括聚原酸酯和聚酸酐。缓释注射制剂也可以通过使药物包封到与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。可以对注射材料进行灭菌，例如利用细菌滤器来过滤。

可以将制剂放置在单位剂量或多剂量经密封的容器例如安瓿和药水瓶中，以及可以在冻干的条件下保存并且仅需要在即将使用前，添加灭菌的液体载体，例如用于注射的水。临时的注射溶液以及悬浮液可以由上述无菌粉末、颗粒剂和片剂类型来制备。

可以单独提供达那唑化合物以治疗涉及血管通透性过高或细胞骨架的功能障碍的疾病或病症。或者，达那唑化合物可以与一种或多种其它适合用于治疗上述疾病或病症的治疗或药物结合提供。例如，可以在其它治疗或药物之前，结合其它治疗或药物(包括同时)，或者在其它治疗或药物之后给药该达那唑化合物。在使用另外药物的情况下，该药物和达那唑化合物可以以单独的药物组合物的形式给药或作为相同的药物组合物的部分给药。合适的药物例如描述在美国申请号12/820,325中，将其全部内容在此引用作为参考。

如一些实施例所表明的，发明人已经确定，当达那唑以口服方式给药至患有糖尿病性黄斑水肿(DME)的患者时，其会导致中心凹视网膜厚度(centralsubfield retinal thickness)的降低，其通过光学相干断层扫描(OCT)测量。此外，将人内皮细胞用达那唑进行处理的体外临床前研究已经证明了通过血管通透性的相应下降能增强内皮屏障作用。不同于靶向VEGF的药物的眼内注射，达那唑是口服给药的且具有行之有效的安全性。

还使用了人的视网膜、脐带、脑和肾微血管组织来研究达那唑对血管通透性的影响。这些发现表明，达那唑对血管通透性存在双相剂量响应(图1)。在transwell系统中对辣根过氧化物酶(HRP)到单层人内皮细胞的转移进行追踪，显示在100-至500-纳摩尔浓度，达那唑减少了跨细胞通道。然而，增加该浓度逆转了达那唑的有益效果且导致细胞旁通透性增加。达那唑的有益效果还出现的非常迅速。在暴露于达那唑提高屏障的浓度的几分钟内，内皮细胞表现出f-丝状肌动蛋白皮质环的形成且提升了内皮屏障功能，其通过鬼笔毒环肽染色和跨表皮电阻(TEER)模型证明(图2和3)。此外，在这些浓度下的达那唑抵消了由于促炎分子(例如TNF-a或凝血酶)的刺激形成的张力纤维(图3)。

通过考虑下述非限制性实施例，本发明另外的主题、优点和新特征对于本领域技术人员来说是显然的。

实施例

实施例1:

本实施例证明，向患有糖尿病性黄斑水肿(DME)的患者口服给药达那唑是安全的，没有表现出严重的不良事件。达那唑可以BMI剂量调整的方式降低DME并趋于改善视敏度。如图1和2所示，达那唑可对内皮细胞具有双相作用。在低剂量时，达那唑降低血管渗漏，而在高浓度下观察到血管通透性的增加。这个双相作用是由在下述不同BMI的体内达那唑的有效性支持的。

为了评估达那唑对DME的安全性和有效性，在加拿大St.Michael医院进行了12周的随机安慰剂对照的双盲研究。研究包括患有DME且中央子域(central subfield)视网膜厚度为300μm或更厚的患者。共34例患者组成该安全性设定群体。有效性评估人群(n＝23)由安全性设定中的患者组成，他们在4周的治疗中完成了80％或更高的研究药物。从基线到12周的治疗，中央子域视网膜厚度的变化是主要终点，而次要终点是指，从基线到12周的治疗，在视网膜体积和糖尿病性视网膜病早期治疗研究(ETDRS)中最佳矫正视力(BCVA)的变化。研究的3个达那唑剂量为10mg(5mg，每日两次)、30mg(15mg，每日两次)和90mg(45mg，每日两次)。所有的治疗均为口服给药，每日两次。

第一个显著的发现是，达那唑对视网膜厚度的影响依赖于基线体质指数(BMI；P＝.01)。在低BMI值时，低达那唑剂量有效地降低视网膜厚度，而在高BMI值时，高剂量更为有效(图4)。如以前所确定的，视网膜厚度降低大于11％被认为是临床显著的。在12周中，相比于安慰剂组的29％(7名患者中的2名)，几乎所有接受了15-mg剂量的受试者(86％,7名患者中的6名)的视网膜厚度均显著减低。相比于安慰剂(P＝.05)，15-mg组的视网膜体积也有所降低。

对于ICD-9-CM视力减退上的BCVA变化，使用该治疗使得36％的受试者改善了至少一个方面。安慰剂组的受试者改善比例最小(14％)，而用达那唑治疗的所有受试者中的47％改善了至少一个方面。

在基线或第12周，在任意组中均未检测到眼高血压，并报道无所研究药物相关的严重不良反应。发生了三种治疗相关的不良反应(外周性水肿、银屑病和恶化抑郁症)，它们全部被认为可能与活性化合物有关。

相比于安慰剂组7名患者中的2名，接受30mg达那唑的几乎全部患者在12周的治疗后均看到了OCT的临床相关变化(6/7)。在治疗组的访问4(第12周)时，根据ETDRS线(5个字母)，存在至少一个BCVA的清晰度的改善趋势。这种趋势可能会在视网膜体积的变化上更容易观察到，因为视敏度与体积变化的相关程度远比与视网膜厚度变化要高。还观察到，达那唑的疗效是BMI依赖性的，即，30mg达那唑剂量对视网膜厚度的影响随着基线BMI增加变得更加显著(即，降低越多的视网膜厚度)，而10mg剂量对视网膜厚度的影响随着基线BMI增加变得更不显著。这与它的亲脂性有关。还观察到，治疗对视网膜厚度变化的影响依赖于基线视网膜厚度。对于所有随机患者的基线视网膜厚度的中位数为400μm。用达那唑治疗基线视网膜厚度>400μm的患者比治疗基线视网膜厚度≤400μm的患者表现出更高的治疗效果。这种相互作用在BCVA中未观察到。

实施例2:

这个例子证明了向患DME的患者口服给药两种不同剂量的达那唑的有效性和安全性。

进行随机、安慰剂对照、平行、双盲研究来证明两种剂量(0.5mg/BMI/天和1.0mg/BMI/天)的达那唑对患有DME的成人患者的有效性和安全性。450名随机患者代表该样品大小。有效性可通过与安慰剂(乳糖和硬脂酸镁)比较所提高的视敏度(VA)来确定。此外，这两种口服BMI相关剂量的达那唑的有效性和耐受性通过与安慰剂(乳糖和硬脂酸镁)相比腹侧黄斑厚度变化(CMT)和VA响应状态进行监测。

一旦患者符合研究入选标准并获得了书面的知情同意书，则计算患者的BMI和腰/臀比。这两种剂量的口服达那唑(或安慰剂)在患有DME的成人患者中给予12周的时间，然后进行4周的清除以确定疗效减退。清除过程后，提供患者12周的开放标签扩展研究以评估达那唑最佳剂量效果的持续时间。在最初的12周的主要研究中，一旦有30％的受试者完成了4周的治疗，那么可确定达那唑的最佳剂量。收集血浆达那唑水平并始终进行监控。

剂量、给药方式和给药：达那唑以口服剂量给药，1mg/BMI或0.5mg/BMI，分成2个每日剂量。达那唑和相应的安慰剂每日给药两次，持续12周，如早晨给药一次，一次两粒胶囊以及晚上给药一次，一次两粒胶囊，空腹服用，即，饭前1小时或饭后2小时。在主体12周的研究过程中，达那唑的总的每日剂量为0.5mg/BMI/天和1mg/BMI/天。在开放标签扩展研究中，可将间断分析所确定的达那唑的最佳剂量(如下所讨论)每日给药两次，持续12周。

口服给药安慰剂(乳糖和硬脂酸镁)并分成两个日剂量。

常规糖尿病治疗药物可与达那唑一同给药。该药物可包括患者常用的糖尿病、抗高血压和抗脂质药。

向该患者给药达那唑或安慰剂治疗，持续12周，然后进行4周的清除期，在这之后，即第16周，评估患者的视力恢复并登记到12周的开放标签扩增研究。

每日剂量(4粒胶囊)与安慰剂的每日剂量相同，0.5mg/BMI组或1.0mg/BMI组，如下表2-4所示(“Cap”是指胶囊)

表2 1mg达那唑/BMI

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	总共
						<25	10	0	7.5	7.5	25
25-29.99	7.5	7.5	7.5	7.5	30
						30-34.99	7.5	10	7.5	10	35
35+	10	10	10	10	40

表3 0.5mg达那唑/BMI

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	总共
						<25	7.5	0	5	0	12.5
25-29.99	7.5	0	7.5	0	15
						30-34.99	10	0	7.5	0	17.5
35+	10	0	10	0	20

表4安慰剂组

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	总共
						<25	0	0	0	0	0
25-29.99	0	0	0	0	0
						30-34.99	0	0	0	0	0
35+	0	0	0	0	0

疗效确定：从基线到12周，将糖尿病性视网膜病早期治疗研究(ETDRS)进行的字母读数的最佳矫正视力(BCVA)的变化与安慰剂相比较。次要测量包括从基线到12周，通过光学相干断层扫描(OCT)测定的中央黄斑厚度(CMT)的变化；在第12周，视敏度(VA)由10的基线或更多字母的BCVA的变化；以及不良反应的频率和严重性，包括临床显著异常的实验室结果。

统计学方法：主要分析是在以下两个比较组中，从基线到第12周的BCVA字母变化的多重比较：(1)达那唑0.5mg/BMI与安慰剂相比；(2)达那唑1.0mg/BMI与安慰剂相比。将协方差分析(ANCOVA)与作为协变量的基线字母读取以及与治疗的主要效果的混合效果分析作为主要分析进行。使用混合效果，如由一些受试者获得的双眼的数据。多重性将通过各活性组与安慰剂的Dunnett比较来确定。

次要分析检测的是治疗组和安慰剂组在基线到第12周CMT变化的差异。用协变量调整基线CMT的混合效果模型用于评估CMT变化；Dunnett比较将用来矫正多重误差。

在第12周，使用逻辑连接函数的广义估计方程(GEE)模型，其包括基线BCVA字母作为协变量，用于评估响应状态(定义为10或更多字母的增益)。

实施例3：达那唑对于血管生成的影响(对比)

A.HUVEC细胞增殖

步骤：

从Cambrex(Walkersville，MD)获得了初始的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和EGM-2生长培养基。在组织培养瓶中，将细胞在补充有2％胎牛血清(FCS)的培养基中，于37℃和5％CO₂下传代。当由供给人指出60-80％融合时，利用胰蛋白酶进行次代培养。

将2次传代的HUVEC的冷藏保存的安瓿解冻并以5000细胞/cm²的浓度放置在96孔组织培养板中。在乙醇中配制50mM达那唑的储存液，并且将培养基中的FCS提高至5％以保持达那唑在溶液中。利用含有达那唑终浓度在0.1～100μM范围的培养基处理细胞，重复三次。进行培养24、48和72小时，并用Promega(Madison，WI)的Celltiter 96AQ_ueous One Solution CellProliferation Assay(Celltiter 96AQ_ueous单细胞细胞增殖分析)测定细胞增殖。简单来说，从每个孔中吸出培养基并且利用200μl Cambrex的Hepes缓冲盐溶液(HBSS)清洗细胞并升温至37℃。向每个孔中加入100μl经稀释的celltiter溶液(15μl原液+85μl含EGM-2的0.1％FCS)，并且再继续温育4小时。利用酶标仪使用530nm过滤片并减去空白值后测定光密度，并且以OD±标准偏差的形式显示数据。在每个孔中的乙醇的终浓度小于0.2％并且对于细胞增殖或生存力没有影响。

作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用学生t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P<0.05被认为是统计学上显著的。

结果，观察和讨论：

在一段时间，在达那唑存在时培养的初始的HUVEC减少了由Promegacelltiter增殖试验获得的OD，并且具有剂量依赖趋势(图1)。Celltiter试验基于由于脱氢酶引起的试验溶液形成的甲月替染料的减少，其直接与细胞数量关联。

在24小时时，只有在非常高的剂量下，达那唑处理似乎是有效的。在10μM或更高浓度的达那唑时观察到试验中OD显著的降低(p值<0.05)。在无达那唑的孔中检测到的OD为0.414±0.06，以及利用10μM达那唑处理使OD降低至0.288+0.037，而利用100μM达那唑处理使得OD降低至0.162+0.017，分别相当于30％和65％的抑制率。

在48小时时，甚至在1μM的水平时也可以观察到显著地抑制。48小时后在培养物中得到的无达那唑的读数增加至0.629±0.095，以及利用1μM时降低至0.378±0.037，利用10μM时降低至0.241±0.012，以及利用100μM时降低至0.19±0.033(或抑制率分别为40％、61％和70％)。

在72小时后，所有的达那唑处理检测显示在HUVEC增殖上显著的减少。在无达那唑的孔中得到的OD为1.113±0.054，以及在0.1μM处理后降低至0.798±0.037，在1μM处理后降低至0.484±0.022，在10μM降至0.229+0.016，以及100μM降至0.156±0.018(抑制率分别为28％、57％、80％和86％)。

在所有时间点，全部100μM达那唑剂量得到的检测结果是一致的，显示在该浓度可以完全阻止细胞增殖。

总体上，达那唑显示对内皮细胞增殖的较强的抑制。

B.HUVEC管的形成(Tube Formation)

步骤：

为了研究由HUVEC形成的毛细管样结构，从BD Biosciences(San Jose,CA)购买的血管生成系统：内皮细胞管形成试验(Endothelial Cell TubeFormation Assay)，并且根据制造商的说明书使用。简单来说，在5％FCS的存在下，在96孔组织培养板中的再水合基质胶塞(rehydrated materigel plug)上接种100000HUVEC，以引发管形成。添加达那唑使得终浓度为1μM、10μM或50μM，并添加50μM LY294002(阳性对照)。在18小时后，利用Kodak DCS Pro SLR/N数码相机(Rochester,NY)对孔拍照，并安装到倒置显微镜上。包括经乙醇处理的孔以确定该媒介(vehicle)对于细胞分化的任何影响。

结果，观察和讨论：

为了说明达那唑能否阻止由HUVEC形成管样结构，使用了含有基质胶塞的96孔板。在生成血管的物质的存在下，并且提供了细胞外基质骨架(extracellular matrix scaffold)下培养内皮细胞，内皮细胞会分化成结构松散的类毛细血管。在达那唑存在下生长的HUVEC与对照相比，显示为具有较细和较少确定的关联的更为不组织化的结构(参见图2，其中A＝对照，B＝1μM达那唑，C＝10μM达那唑，D＝50μM达那唑，以及E＝50μM LY294002)。利用50μM达那唑处理导致位于基质胶塞上的分离的HUVEC群落，其具有非常少的、细的联系或血管内腔空间。达那唑的影响与阳性对照化合物LY294002非常相似。为了确定所使用的媒介没有影响，利用相当于所用的最高剂量的达那唑的浓度的乙醇处理孔，并且观察到对于管形成没有影响(数据未示出)。这些数据显示在50μM，达那唑是管形成的有效抑制剂。在1μM或10μM，达那唑对于管形成没有影响。

C.HUVEC侵入(invasion)

步骤：

从BD Biosciences(San Jose，CA)购买BioCoat基质胶侵入室(MatrigelInvasion Chamber)。在37℃利用500μl HBSS对植入物进行再水合2小时，随后在潮湿的培养箱中使用。利用含有0.1％FCS的温EGM-2清洗经胰蛋白酶作用的HUVEC两次，并且将其添加到侵入植入物(invasion insert)的上部室内，使得在总体积250μl中有100000个细胞。将达那唑和对照化合物添加到上部储存室内使得终浓度为10μM和100μM。将补充有5％FCS的750μl EGM-2添加到底部的室内以引发侵入，并将板温育24小时。利用润湿的棉刷从上部的室中移出非侵入性细胞(non-invasive cell)，然后用HBSS清洗植入物两次。然后将植入物浸没在HBSS中制备的10μM钙黄绿素AM中，并温育4小时。利用在485nm激发和在595nm发射的酶标仪测定荧光。LY294002以及结构上相似但非活性的化合物LY303511分别作为该实验的阳性和阴性对照。

结果：

图7示出了结果。作为典型实验中呈现的所有数据均重复三次。每个亚组之间的差异利用学生t-检测在Microsoft Excel软件中进行分析。P<0.05被认为是统计学上显著的。

使用多孔的、基质胶包覆的植入物确定达那唑是否可以影响内皮细胞的侵入或迁移(图7)。在用于本研究的系统中，在将FCS加入到与内皮细胞相反的室内之后，通过荧光染色检测到细胞的显著增加(从5674FU±77增加至7143±516)。10μM和100μM浓度的达那唑没有影响，但LY294002显示几乎完全弱化了细胞侵入(5814±153)。这些数据显示FCS中存在的因素引发了由HUVEC生成蛋白酶，该蛋白酶降解了细胞外基质，然后沿趋化梯度迁移。达那唑对于本模型中的HUVEC的侵入和迁移没有明显地抑制效果。

D.HUVEC迁移

步骤：

在划痕迁移试验(scratch migration assay)中进行分析以确定达那唑对于HUVEC的迁移的影响。将传代8次的HUVEC，批号8750(由Lonza获得)，放置到6孔板(ICS BioExpress)的内皮生长培养基-2(EGM-2)完全培养基(由Lonza获得)中。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48-72小时以获得融合的单层。然后用1000μl移液器吸头“刮下”该单层并且用温EGM-2培养基清洗其两次。抽吸最终清洗培养基并且用新鲜的EGM-2培养基或含有一定范围浓度的达那唑(Sigma,#D8399)的新鲜的EGM-2培养基来替代。拍摄已受损的单层的照片并且将该板放置在37℃培养箱，在5％CO₂中继续温育24小时。对孔再次拍照。利用Adobe Photoshop软件测量每张照片中的间隙，间隙的测量值通过在间隙中的像素数量来示出。

结果：

下表5中列出了三次单独实验的结果。根据表5可以看出，在该分析中发现50μM、75μM和100μM的达那唑显著地抑制HUVEC迁移。用于该试验的EGM-2培养基与在上述C部分描述的基质胶模型(Matrigel model)中所用的FCS相比，含有生长因子的混合物(cocktail)。在生长因子方面的不同可能会导致使用这两个模型得到的结果不同。

表5

一种或多种的化合物	达那唑浓度	平均像素	平均抑制％	STD	SEM
						稀释剂对照(乙醇)		1264.00
达那唑	10μM	1004.00	21.14	14.87	8.59
						达那唑	25μM	1184.00	5.50	8.80	5.08
达那唑	50μM	895.33	27.64	17.63	10.18
						达那唑	75μM	317.33	74.62	6.80	3.93
达那唑	100μM	178.67	85.90	0.92	0.53

实施例4：达那唑对于HUVEC单层的血管通透性的影响

步骤：

进行试验以确定达那唑对于HUVEC单层的通透性的影响。使用内皮生长培养基-2(EGM-2)(由Lonza获得)，将传代5～10次的HUVEC，批号7016(由Lonza获得)接种到位于24孔板的孔中的1微米孔径植入物(Greiner BioOne24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610或ISC BioExpress，#T-3300-15)上。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48-72小时以获得融合并且形成紧密单层。然后除去上述培养基，并用新鲜的培养基或含有一定浓度范围的达那唑(Sigma,#D8399)的新鲜的培养基代替。将肿瘤坏死因子α(TNFα；Pierce Biotechnology,#RTNFAI)和白细胞介素-1β(IL-1β；Sigma,#I-9401)添加到适当的孔中，使得每一种物质的终浓度为10ng/ml。TNFα和IL-1β引发通透性；它们可以引起通透性高达10倍的增加。最后，以最终的稀释率为1:250，将轭合至辣根过氧化物酶(HRP)(Pierce Biotechnology，#N100，1.25mg/ml)的链霉抗生物素蛋白添加到每个孔中。HRP是具有约44000分子量的大分子。在每个孔的上部室中最终体积为300μl，以及在每个孔的下部室中最终体积为700μl。将该板在37℃培养箱，在5％CO₂中继续温育24小时。在上述温育后，移出植入物并丢弃。通过对植入物上的细胞的视觉观察显示所有的单层仍是完整的。

为了评估HRP流过液，将15μl位于下部的室中的得到的溶液转移到96孔ELISA板中(每个反应进行三次)。接下来，将100μl四甲基联苯胺(TMB)溶液(Pierce)添加到每个孔中，然后在室温下显色5分钟。通过加入100μl的0.18N酸性溶液终止显色。使用设定为450nm-530nm(450nm minus 530nm)的酶标仪测定每个孔的OD。与对照比较计算通透性的抑制比例，并且将三组单独实验的平均值列在表6中。

根据表6可以看出，25.0μM或更高浓度的达那唑实际上增加了血管通透性。10.0μM的浓度对于血管通透性的影响非常小或没有影响。0.1μM～5.0μM浓度、最佳为0.1μM～0.5μM的达那唑降低了血管通透性。该剂量响应曲线非常有意思，因为其在0.001μM(或可能更低)～0.005μM的浓度时存在抑制的第二峰值。因此达那唑针对血管通透性显示出非常有意思并且出乎意料的剂量响应曲线。

如实施例3所示，需要达那唑的浓度为50μM～100μM使得在用达那唑温育18～24小时后获得对HUVEC增殖、迁移和管形成的抑制。如实施例4所示，在24小时后，抑制血管生成的这些最佳浓度可能显著地增加血管通透性(参见表2)。相反地，用于抑制血管通透性的最佳浓度(0.1μM～0.5μM)在24小时会显著影响血管生成。

表6

化合物(s)	达那唑浓度	平均抑制％	STD	SEM
					达那唑	0.001μM	19.35	5.39	3.11
达那唑	0.005μM	16.37	8.04	4.64
					达那唑	0.01μM	-2.74	14.56	8.40
达那唑	0.05μM	7.67	8.83	5.10
					达那唑	0.1μM	35.59	23.08	11.54
达那唑	0.5μM	30.95	12.01	6.01
					达那唑	1.0μM	21.20	31.13	13.92
达那唑	5.0μM	14.63	15.30	7.65
					达那唑	10.0μM	14.29	36.85	13.03
达那唑	25.0μM	-1.06	22.60	11.30
					达那唑	50.0μM	-377.36	384.50	171.95
TNFα+IL-1β+达那唑	0.1μM	31.30	25.26	12.63
					TNFα+IL-1β+达那唑	1.0μM	29.22	16.17	7.23
TNFα+IL-1β+达那唑	10.0μM	8.47	20.45	9.14
					TNFα+IL-1β+达那唑	25.0μM	-39.93	15.53	7.76
TNFα+IL-1β+达那唑	50.0μM	-117.16	29.20	14.60

实施例5：达那唑对于血管通透性的影响

将传代9次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell BiologyResearch Institute，Kirkland,WA)传代至EGM-2培养基(Lonza，Walkersville，MD)中直到获得80％的融合。然后使用胰蛋白酶-EDTA使细胞从传代瓶中释放，并且对在得到的悬浮液中的细胞进行计数以确定生存力和细胞数量。在本实验中细胞悬浮液的存活力高于90％。

然后将细胞在300μl EGM-2完全培养基中(由Lonza获得)接种到位于24孔板的孔中的植入物(1微米孔径)(Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)上。然后将700μl EGM-2置于下部的室中，在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时以获得融合的单层。针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX 100电极(两者均来自于World Precision Instruments)进行跨内皮电阻(TER)检测以确认半通透屏障的建立。为了进行测量，每个探针放置在每个孔中，其中一个电极位于上部的室中一个电极位于下部的室中。

然后，按照下述步骤重复地处理细胞两次。缓慢的从植入物中倾倒出EGM-2培养基，并替换为IMDM培养基，所述IMDM培养基除了VEGF和氢化可的松之外含有0.5％胎牛血清和EGM-2添加物(均来自Lonza)。在一些孔中，IMDM培养基含有以10倍系列稀释的一系列达那唑(Sigma,#D8399)。在向每个孔的上部室中加入30μl含有4％荧光标记的人血清白蛋白的溶液之前，在5％CO₂下，将该板在37℃培养箱中温育4小时。在37℃培养箱中在5％CO₂存在下，再温育该板18小时。

在上述温育之后，移出植入物并丢弃，并将200μl培养基从下部的室转移到96孔黑色荧光-板(Falcon)中，重复三份。然后在340nm的激发波长和470nm的发射波长检测每个孔的荧光。然后计算每个植入物的平均荧光单位(Mean fluorescence unit)(FU)，对两次重复读数取平均。结果列在表3中。

表7

达那唑浓度	平均FU	STD
			无	767.13	8.38
0.01μM	688.50	14.94
			0.1μM	743.90	8.95
1.0μM	783.39	14.59
			10.0μM	768.99	18.85

可以看出，达那唑的最低浓度(0.01μM)提供最大的抑制(约10％)。在下部室中没有细胞的对照孔显示超过4000FU，这说明视网膜内皮单层是选择性通透的。

实施例6：达那唑对于三种不同内皮细胞单层的TER的影响

进行试验以确定达那唑对人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied CellBiology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(transendothelialelectrical resistance,TER)的影响。为了进行，将150000个传代14次的人视网膜内皮细胞在300μl EGM-2完全培养基(由Lonza获得)中接种到位于24孔板的孔中的植入物(1微米孔径)(Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)上，。然后，在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养24小时。在温育之后，缓慢的从植入物中倾倒出培养基，并替换为新鲜的EGM-2或含有终浓度为1μM达那唑的新鲜的EGM-2。将该板重新放回到培养箱中并再培养144小时。试验也以同样的方式利用传代8次的人脑内皮细胞和传代8次的人脐静脉内皮细胞进行。

使用与STX 100电极连接的EVOM²伏欧表(两者均来自于WorldPrecision Instruments)对每个植入物进行初始TER检测。在24、48、72和144小时也进行检测。结果列出在下表8、9和10中。所有的数据均以植入物的TER测量值/cm²减去空白植入物的TER的形式示出。

表8

人视网膜内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	32.3	96.0	144.4	148.0	219.7
1.0μM	21.7	132.3	182.3	217.7	234.8

表9

人脑内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	41.4	115.7	176.3	154.0	151.5
1.0μM	32.3	139.9	188.4	149.5	125.8

表10

人脐静脉内皮细胞

达那唑浓度	0小时	24小时	48小时	72小时	144小时
						无	82.3	217.2	276.3	226.8	227.3
1.0μM	70.2	246.0	364.1	270.7	286.4

可以看出，在视网膜和脐静脉内皮细胞单层中，达那唑提高了TER测量值(离子通透性降低)。除了在较早的时间点之外，达那唑对于脑内皮细胞单层的TER没有太多影响。TER是跨细胞单层的电阻的测量值。其是屏障完整性的指标与离子通透性相关联。

实施例7：达那唑对于Akt磷酸化的影响

进行试验以确定达那唑对于人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，AppliedCell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的Akt磷酸化的影响。细胞在25cm²瓶中的含2％胎牛血清(Lonza)的EGM-2培养基(Lonza，Walkersville，MD)中生长至接近融合。然后使用胰蛋白酶/EDTA使细胞从传代瓶中释放。对得到的悬浮液中的细胞进行计数，并且在EGM-2培养基中以1×10⁴细胞/孔的浓度接种到96孔板上。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃温育24小时。然后，添加200μl EGM-2培养基(对照)或不同浓度的达那唑，然后再温育该板2小时。在上述温育之后，立即用4％甲醛固定细胞、冷冻、按照制造商的说明书，使用Akt Cellular Activation of Signaling ELISA试剂盒(AKT S473的CASE^TM试剂盒；SABiosciences，Frederick，MD)确定Akt磷酸化的程度。在平行试验中使用利用比色法检测的传统的ELISA方式，AKTS473的CASE^TM试剂盒定量活化的(磷酸化的)Akt蛋白相对于总Akt蛋白的量。Akt磷酸化位点为丝氨酸473，并且可以被用于两个平行试验之一的抗体中的一种识别，从而提供对于活化的Akt蛋白的检测。在另一个平行试验中使用的另一个抗体识别Akt以提供对于总Akt蛋白的检测。使用辣根过氧化物酶标记的二次抗体对两种一次抗体进行检测。加入制造商提供的展开溶液(Developing Solution)10分钟，然后加入制造商提供的终止溶液(StopSolution)，产生可以用比色分析法检测的结果。

下表11中列出结果。可以看出，所有浓度的达那唑均引起Akt磷酸化(活化)的增加。

表11

相信这些结果提供了对于实施例4中得到的血管通透性剂量响应曲线的可能的解释。如实施例4所示的，低剂量的达那唑降低通透性，而高剂量则增加通透性。相信在S473的一定水平的Akt磷酸化会降低通透性(本实验中的0.5-5.0μM浓度)，而在S473的Akt的高度磷酸化会引起通透性的增加(本实验中的10-50μM浓度)。

实施例8：达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响

进行试验以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞

(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。为了进行，用5μg/cm²纤维连接蛋白(Sigma)包覆Greiner组织培养基孔植入物(Greiner tissue culture well insert)(Greiner BioOne24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代12次的人视网膜内皮细胞在300μl EGM-2培养基(Lonza)中以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中。下部室的体积为700μl EGM-2培养基(Lonza)。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX2探针(两者均来自于World Precision Instruments)进行TER检测以确认内皮屏障的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。

然后，缓慢地倾倒出培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺(雄激素受体拮抗剂)、氟维司群(雌激素受体拮抗剂)和PI3激酶抑制剂LY 294002(对照)。所有添加剂的储备溶液，除了达那唑之外，均配制成10mM在DMSO中的溶液。达那唑储备溶液为10mM的乙醇溶液。在相同的溶剂中制备所有添加剂的工作200μM稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的200nM稀释液，以及乙醇和DMSO的等量稀释液(对照)，将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基(对照)组合添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该板放回到培养箱中，针对每个植入物在30分钟、60分钟、120分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过从植入物的读数中减去背景测量值并再除以植入物的表面积(0.33cm²)从而计算TER。结果列在下表12中。

表12

从表12中可以看出，与对照(无治疗)相比，达那唑和氟维司群提高了TER测量值(降低了通透性)，而羟基氟他胺降低了读数(提高了通透性)。达那唑阻止了由羟基氟他胺引起的降低。上述结果可以是在这些细胞中达那唑占据雄激素受体的证据。在相同的时间点，达那唑和氟维司群显示出累加的效果。

实施例9：达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响

细胞旁途径的IEJ包括AJ和TJ。肌动蛋白细胞骨架与每个连接(junction)结合并且通过肌动蛋白重构控制连接的完整性。肌动蛋白丝重组到张力丝中在连接上施加机械力，将它们撕开，导致形态上的细胞收缩和变化。肌动蛋白的聚合过程是非常动态的，从而使得肌动蛋白结构快速重组并且由静止表型(quiescent phenotype)转换，静止表型的特征在于具有厚的皮质的肌动蛋白环和不具有张力丝，而活化的细胞表型具有细或非皮质的肌动蛋白(nocortical actin)以及具有大量张力丝。看起来肌动蛋白细胞骨架还可能通过调节细胞膜穴样凹陷的移动涉及到转胞吞作用中。

将人视网膜内皮细胞(ACBRI 181,Applied Cell Biology Research Institute,Kirkland,WA)接种到Falcon Optilux试验板(BD Biosciences)上，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔1000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时。然后，去除培养基并替换为补充有0.1％胎牛血清的200μl IMDM培养基(均来自Lonza)，并且在这些生长因子和血清饥饿条件下培养该细胞1小时以抑制肌动蛋白聚合。然后添加达那唑(0.1μM或10μM终浓度)或PI3激酶抑制剂LY294002(10μM终浓度)(阳性对照)。在加入这些化合物后，立刻加入TNFα(50ng/ml终浓度)。在5％CO₂中、于37℃培养箱中温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)的1:40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。之后，向每个孔中加入100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于剂量，细胞显示出不同的染色图案。在较低的达那唑剂量(0.1μM)时，观察到遍及细胞质的散开的染色，其可能表示稳定过程或休止的表型(restingphenotype)。在较高的达那唑剂量(10.0μM)时，检测到具有多个焦点的张力丝。这些发现与上述较低的达那唑剂量抑制通透性而较高的达那唑剂量提高通透性的结果(参见上述实施例)相关。TNFα刺激细胞使得在浓烈染色的焦点张力丝较强的生长。达那唑和LY294002减少了细胞的数量，该细胞显示利用TNFα形成张力丝。

实施例10：达那唑对肌动蛋白张力丝形成的影响

将人视网膜内皮细胞(ACBRI 181,Applied Cell Biology Research Institute,Kirkland,WA)接种到由1μg/cm²纤维连接蛋白包覆的Falcon Optilux试验板(BD Biosciences)上，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔3000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时。然后，去除培养基并替换为补充有2.0％胎牛血清的200μlUltraculture培养基(均来自Lonza)，并且在这些生长因子和血清饥饿条件下培养该细胞过夜以抑制肌动蛋白聚合。然后除去培养基，并替换为补充有2.0％胎牛血清并含有达那唑(0.1μM、1μM或10μM)或PI3激酶抑制剂LY294002(10μM)(阳性对照)的新鲜的Ultraculture培养基。将这些化合物在5％CO₂中、于37℃培养箱中温育30分钟后，添加血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度25ng/ml)。在5％CO₂中、于37℃培养箱中再温育30分钟后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)的1:40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。为了计算细胞核的染色，向每个孔中加入3μM DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚，重复两次(Invitrogen))溶液100μl。在5分钟之后，用100μl PBS清洗细胞两次。然后向每个孔中添加100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)和DAPI过滤片(ex350/em460)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝形成的能力。当用达那唑处理后，取决于应用的剂量，细胞显示出不同的张力丝形成方式。在较低的达那唑剂量(0.1μM)时，观察到遍及细胞质的散开的F-肌动蛋白染色。在1.0μM达那唑，持续散开的染色，但是可以观察到张力丝和包围大多数细胞周边的焦点。在最高的达那唑剂量(10.0μM)时，不存在任何散开的染色，可以观察到张力丝的形成和焦点。使用较低剂量的达那唑所观察到的染色显示为核周围的染色方式，表明类似于利用紫杉醇(紫杉醇化合物，已知用来稳定和聚合微管)观察到的微管的稳定化。利用VEGF，形成较强的张力丝。达那唑以依赖于剂量的方式改变VEGF模式：(i)最低的0.1μM达那唑剂量使得张力丝不太清晰并且出现一些分散的染色；(ii)1.0μM剂量显示厚度较薄的张力丝，但在接触表面上可以观察到焦点；以及(iii)最高10.0μM达那唑剂量显示具有焦点的较强的张力丝形成。LY294002阻止了利用VEGF观察到的较强的张力丝形成并且显示出散开的染色。

实施例11：达那唑对血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白)磷酸化的影响

在具有5％CO₂的37℃培养箱中，在使用EGM-2培养基(Lonza)的纤维连接蛋白包覆的(1μg/cm²)10cm²组织培养基板上使传代12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181,Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)生长至融合。但达到完全融合时，用补充有0.5％胎牛血清和L-谷氨酰胺(均来自Lonza)的Ultraculture培养基替换上述培养基，在这些生长因子和血清饥饿条件下培养上述细胞24小时。然后，除去培养基，并替换为补充有0.5％胎牛血清和L-谷氨酰胺并含有达那唑(0.1μM、1μM或10μM)或乙醇(媒介对照)的新鲜的Ultraculture培养基。在5％CO₂中、于37℃培养箱中温育15分钟后，添加血管内皮生长因子(VEGF)(终浓度为50ng/ml)，并在5％CO₂中、于37℃培养箱中再温育该板15分钟。

立刻处理该板以按照如下裂解细胞。将PBS和裂解缓冲液(PBS含有1％Triton X-100，其中补充有磷酸酶抑制剂溶液1和2(Sigma)，蛋白酶抑制剂(Sigma)和原钒酸钠，终浓度2mM)冷却至4℃。用5ml冰冷PBS清洗细胞两次，然后用500μl冰冷裂解缓冲液累裂解细胞。将得到的蛋白质提取物转移到1.7ml微量离心管中，通过在4℃、10000rpm条件下离心10分钟除去细胞残渣。然后，将450μl澄清的溶液转移到含有包覆有10μl C19抗-VE钙粘蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)(按照制造商的说明书进行包覆)的Protein Dynabeads(Invitrogen)的管中。然后将提取物和珠在轨道摇床上在4℃温育过夜以从提取物中捕获VE钙粘蛋白。然后用冰冷的裂解缓冲液冲洗珠四次。为了从珠上释放蛋白质，于75℃在含有20％还原染料(Invitrogen)的SDS上样染料中加热珠10分钟。

在4-20％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中，在120V分离释放的蛋白质1小时。为了确定凝胶中总蛋白质的磷酸化，按照制造商的说明书，依次进行Pro-Q diamond(Invitrogen)和SYPRO ruby(Invitrogen)蛋白质染色。对凝胶进行拍照并使用Kodak影像工作站进行密度测定。结果如下表13所示。

表13

VE-钙粘蛋白

可以看出，达那唑引起VE-钙粘蛋白磷酸化的增加。VEGF引起VE-钙粘蛋白磷酸化更高程度的增加(高度磷酸化)，这一点被达那唑逆转。VE-钙粘蛋白是AJ的成分，取决于其残基(residue)，VE-钙粘蛋白的磷酸化能够具有很多效果。通常来说，VE-钙粘蛋白的酪氨酸磷酸化导致AJ分解并且增加通透性。而丝氨酸665磷酸化与降低的屏障功能相关，引起VE-钙粘蛋白快速的但可逆的内化。似乎存在反馈回路，其中内化的(internalized)VE-钙粘蛋白驱动细胞质p120(与AJ复合的支架蛋白)的增加。这样的向上调节引起活性RhoA的降低，其与屏障-稳定化GTPase(例如Rac1、Rap-1和Cdc42)的增加相关。相信在本实验中观察到的在低剂量达那唑处理后的VE-钙粘蛋白磷酸化的增加导致屏障稳定化GTPase的活化。此外，达那唑可以阻止由VEGF导致的磷酸化的去稳定化。

实施例12：达那唑和类固醇受体拮抗剂对于视网膜内皮细胞单层的TER的影响

进行试验以确定达那唑和类固醇受体拮抗剂对于人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。为了进行，用5μg/cm²纤维连接蛋白包覆Greiner组织培养基孔植入物(Greiner BioOne 24-孔Thincert细胞培养植入物，#662610)。然后，将传代13次的人视网膜内皮细胞在300μl EGM-2培养基(Lonza)中，以每植入物120000个细胞的比例接种到孔上部的室中。下部室的体积为700μl EGM-2培养基(Lonza)。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时以形成紧密的单层。在温育的末期，针对所有的植入物，使用附着在EVOM²伏欧表上的STX 2探针(两者均来自于World PrecisionInstruments)进行TER检测以确认内皮屏障的完整性。与无细胞的植入物相比，所有的植入物均显示出提高的电阻。

然后，缓慢地倾倒出培养基，并替换为具有以及不具有一些添加剂的新鲜的EGM-2。添加剂为达那唑、羟基氟他胺(雄激素受体拮抗剂)、氟维司群(雌激素受体拮抗剂)、睾酮、雌二醇和PI3激酶抑制剂LY 294002(对照)。所有添加剂的储备溶液，除了达那唑之外，均配制成10mM在DMSO中的溶液。达那唑储备溶液为10mM的乙醇溶液。利用相同的溶剂制备所有添加剂的工作200μM稀释液。然后，在EGM-2培养基中配制每种添加剂的200nM稀释液，以及乙醇和DMSO的等量稀释液(对照)，将达那唑和其它添加剂中的每一种或培养基(对照)组合添加到孔中，且下表中示出了终浓度。然后将该板放置在培养箱中，针对每个植入物在5分钟、30分钟、60分钟和24小时采用上述的方法进行TER检测。通过从植入物的读数中减去背景测量值(空白植入物)并再除以植入物的表面积(0.33cm²)从而计算TER。结果列在下表14中。

从表14中可以看出，与对照(无治疗)相比，达那唑提高了TER测量值，羟基氟他胺降低了读数，睾酮稍稍降低了读数，以及氟维司群基本没有影响。达那唑阻止了由羟基氟他胺引起的降低，而稍微降低睾酮中的结果。如实施例8中的结果，这些结果可以是在这些细胞中达那唑占据雄激素受体的证据。

表14

实施例13：达那唑对于肌动蛋白张力丝形成的影响

将传代6次的人肾小球微血管内皮细胞(ACBRI 128，Cell SystemsCorporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)以及传代12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Cell SystemsCorporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)接种到由5μg/cm²纤维连接蛋白包覆的16-室载玻片中，以在总体积200μl EGM-2培养基(Lonza)中每个孔2000个细胞的浓度接种。在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养48小时。然后，添加用Hanks平衡盐溶液(HBSS；Lonza)稀释的测试化合物(达那唑，TNFα和S1P)，并得到以下终浓度：达那唑(1μM)(Sigma)，TNFα(1ng/ml)(Sigma)，以及S1P(1μM)(Sigma)。将该载玻片与测试化合物在具有5％CO₂的37℃培养箱中一起温育15分钟、30分钟、或24小时。在上述温育后，吸出培养基，在室温下，用在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中的3.6％甲醛固定该细胞10分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次。用在PBS中的0.1％Triton X-100透化处理细胞5分钟。然后，所有的孔均用100μl PBS清洗两次，并且将PBS中的罗丹明标记鬼笔环肽(Invitrogen)的1:40稀释液50μl加入到细胞中，对F-肌动蛋白进行染色，并将该细胞在室温下放置20分钟。所有的孔均用100μl PBS清洗两次。之后，向每个孔中加入100μl PBS并且使用具有罗丹明过滤片(ex530/em590)的倒置显微镜对细胞进行观察和拍照。

结果显示达那唑影响张力丝在人肾小球微血管内皮细胞中形成的能力。当用达那唑单独处理时，在15分钟细胞展示出核周围染色，在3小时，许多细胞中出现遍及具有褶皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处理的对照类似的染色。单独利用TNFα，在所有时间观察到张力丝，显示张力丝的细胞数量和纤维的厚度随时间增加。在所有时刻，达那唑降低张力丝的形成并且降低纤维的厚度，在3小时，开始观察到皮质肌动蛋白环和有褶皱的边缘。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环(corticalring)，其在15分钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相似的形态。达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和24小时。

利用达那唑单独处理视网膜内皮细胞，在15分钟，细胞显示出核周围染色，在3小时，许多细胞中出现遍及具有褶皱边缘的细胞散开的染色，并且在24小时，其具有与未处理的对照类似的染色。单独利用TNFα，在所有时间观察到张力丝，显示张力丝的细胞数量和纤维的厚度从15分钟增加至3小时，并在24小时温育后开始降低。在所有时刻，达那唑降低张力丝的形成和/或降低纤维的厚度。在15分钟和24小时，观察到散开的染色，在3小时可以看到皮质肌动蛋白环。单独用S1P处理细胞，显示出肌动蛋白皮质环，其在15分钟开始形成并且在3小时时最强。在24小时，细胞重新返回到与未处理的对照相似的形态。在3小时，达那唑似乎增强了皮质环。此外，观察到了散开的染色，尤其是在15分钟和24小时。

S1P(1-磷酸鞘氨醇)在血管内皮的形成和保持上起着非常重要的作用。S1P是构成的信号输入(constitutive signaling input)，其通过对于肌动蛋白细胞骨架的作用促进血管内皮的组构和屏障功能。尤其是，S1P涉及皮质肌动蛋白纤维的形成以及粘附连接的组构。S1P的缺失会导致血管渗漏和水肿，以及S1P可以逆转内皮功能障碍和修复屏障功能。

在本实验中，达那唑显示在视网膜和肾小球内皮细胞两者中增强S1P保护效果的能力。达那唑还可以逆转在这两种内皮细胞类型中由TNFα引起的张力丝的形成。在单独用达那唑处理的细胞中观察到散开的核周围染色。

实施例14：达那唑对ECIS的影响

进行试验以确定达那唑对人肾小球微血管内皮细胞(ACBRI 128，CellSystems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)或人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Cell Systems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。使用具有8孔多电极板(8W10E)的细胞电阻抗测试传感器(ECIS)系统(ECISZθ，由Applied Biophysics获得)测定电阻。如下利用在HBSS中的5μg/cm²纤维连接蛋白包覆板的每个孔，向每个孔中加入100μl的纤维连接蛋白，并且在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每个孔中加入400μl EGM-2培养基(Lonza)。将该板与ECISZθ系统连接并且使其电稳定。吸出每个孔的EGM-2培养基并替换为200μl含100000个细胞的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为400μl新鲜的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中温育6小时。制备测试化合物在HBSS中的浓溶液，并且放置在培养箱中使其平衡。然后按照下述最终浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑(1μM)(Sigma)和S1P(1μM)(Sigma)。监测ECIS(阻抗)90小时。

在视网膜内皮细胞中，在进行处理之后的约1.5-2.0小时，与未处理的细胞相比，单独的1.0μM达那唑显示ECIS增加，并且持续5小时。在进行处理之后的第一个15分钟内，与未处理细胞相比，单独的S1P显示ECIS增加，并且持续约3小时。与S1P单独和未处理的细胞相比，达那唑和S1P组合增加了ECIS，该增加的ECIS持续约90小时。因此，达那唑显示具有提高S1P早期效果的能力，以及当S1P存在时在整个实验中保持更高阻抗的能力。

肾小球内皮细胞显示出不同的模式。单独的达那唑对于ECIS没有作用直到处理之后约30小时。与未处理的细胞相比，从约30小时～约90小时，单独的达那唑增加ECIS，并且在约60-90小时出现最大增加。单独的S1P也对于ECIS没有作用直到处理之后约30小时。与未处理的细胞相比，从约30小时～约60小时，单独的S1P增加ECIS。达那唑和S1P的组合对于ECIS没有作用直到处理之后约30小时。与未处理的细胞、S1P单独和达那唑单独相比，上述组合增加了ECIS。具体来说，与未处理的细胞相比，该组合从约30～约70小时增加ECIS，与S1P单独相比，该组合从约30～约75小时增加ECIS，与达那唑单独相比，该组合从约30～约50小时增加ECIS。

实施例15：达那唑对ECIS的影响

进行试验以确定达那唑对人肾小球微血管内皮细胞(ACBRI 128，CellSystems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute的独家经销商)，Kirkland，WA)的跨内皮电阻(TER)的影响。使用具有8孔多电极板(8W10E)的细胞电阻抗测试传感器(ECIS)系统(ECISZθ，由Applied Biophysics获得)测定电阻。如下利用在HBSS中的5μg/cm²纤维连接蛋白包覆板的每个孔，向每个孔中加入50μl的纤维连接蛋白，并且在存在5％CO₂的条件下，将该板在37℃培养箱中培养30分钟。除去纤维连接蛋白溶液，向每个孔中加入200μl EGM-2培养基(Lonza)。将该板与ECISZθ系统连接并且使其电稳定。吸出每个孔的EGM-2培养基并替换为200μl含40000个传代6次的细胞的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl新鲜的EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中再温育24小时。吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中温育过夜。最终，吸出每个孔的EGM-2培养基并且替换为200μl没有地塞米松的新鲜EGM-2培养基。将该板再次与ECISZθ系统连接，并且在5％CO₂中，于37℃培养箱中温育2小时。制备测试化合物在HBSS中的浓溶液，并且放置在培养箱中使其平衡。然后按照下述最终浓度将测试化合物加入到合适的孔中：达那唑(1μM)(Sigma)和地塞米松(1μM)(Sigma)。监测ECIS(阻抗)90小时。

在约3小时，与未处理的细胞相比，单独的达那唑增加了ECIS并持续约90小时。该增加在约12～约15小时最大。与地塞米松相比，达那唑显示相似的形式，但是ECIS(TER)的增加没有地塞米松显著。

实施例16：达那唑对于RhoA的影响

内皮细胞细胞骨架的重构对于内皮的许多功能是重要的。小GTP-结合蛋白的Rho家族被认为是F-肌动蛋白细胞骨架动力学(cytoskeletal dynamics)的关键调节剂。Rho家族包括三个亚型：RhoA、RhoB和RhoC。RhoA活性的活化导致在内皮细胞中张力丝明显形成。利用凝血酶刺激内皮细胞增加Rho GTP以及肌球蛋白磷酸化，其与增加的细胞收缩性一致。RhoA的抑制阻断该响应，以及屏障功能的丧失，其显示Rho在血管通透性的关键作用。

使用从Cytoskeleton，Denver,Colorado购买的可商购的Rho活化试验(GLISA)，按照制造商的说明书进行该实验。简单来说，在纤维连接蛋白-包覆的(1μg/cm²)6-孔组织培养基板上，使用EGM-2培养基(Lonza)，在具有5％CO₂的37℃培养箱中，培养了传代8次或12次的人视网膜内皮细胞(ACBRI 181，Applied Cell Biology Research Institute，Kirkland，WA)24小时(每个孔30000个细胞，具有3ml的总体积)。然后，吸出培养基并替换为补充有0.1％胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素和ITSS(胰岛素，转铁蛋白硒钠(transferrin sodium selenium))(所有均来自Lonza)的Ultraculture培养基，以得到血清饥饿细胞并且减少RhoA的背景值。在具有5％CO₂的37℃培养箱中培养该细胞24小时。在加入到细胞中之前，将在HBSS中稀释的测试化合物放置在培养箱中使其平衡。然后，将150μl每种测试化合物加入到合适的培养孔中，然后在培养箱中再温育该板15分钟。然后，将凝血酶加入到适当的孔中。1分钟之后，用1.5ml磷酸盐缓冲盐溶液清洗细胞1次，并且然后用100μl补充有蛋白酶抑制剂的GLISA裂解缓冲液裂解细胞。刮下提取物，并转移到微量离心管中，并转移到冰上以保存RhoA的活性形式。通过在4℃、10000rpm条件下离心2分钟除去细胞残渣得到澄清的所有提取物。然后将上清液转移的新的管子中，并且放回到冰上。取出每个提取物的等量样品用于GLISA试验和蛋白质测定。所有的蛋白质浓度均在10％以内，以及以所获得的浓度(相当于每孔15μg总蛋白质)使用该提取物。GLISA试验通过使用试剂盒中提供的试剂来进行。

下表15列出了传代12次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导的活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了Rho A的凝血酶-诱导活化。

下表16列出了传代8次的视网膜内皮细胞的结果。如所预料的，由凝血酶诱导的活性RhoA水平非常高。所有的测试化合物均抑制了Rho A的凝血酶-诱导活化。

表15

*由Sigma获得

表16

实施例17：血管通透性过高的动物模型

每天新西兰白兔口服接受0.215mg/kg达那唑两次，共7天。然后向所述兔子玻璃体内注射血管内皮生长因子A(VEGF-A)一次，以在视网膜中产生血管渗漏。然后，24小时之后，注射荧光素钠，使用Fluorotron(Ocumetrics)测量眼部的荧光(5次测量取平均)。一只对照(安慰剂)兔子在视网膜中具有250荧光单位，说明其中血管渗漏。单独达那唑处理的兔子具有16荧光单位，显示达那唑使得血管渗漏降低了94％。

本发明的前述说明书是为了说明和描述的目的。此外，该说明书不旨在限制本发明为所公开的形式。因此，符合上述教导以及相关领域的技术或知识的变更和修改是在本发明的范围内的。上文所描述的实施方案还旨在解释已知用于实施本发明的最佳模式并使得本领域其他技术人员利用本发明在这样或其他的实施方案中，或根据本发明具体应用或用途的需要做各种修改。应将所附权利要求解释为包括现有技术允许的替代实施方案的范围。

Claims (46)

1.抑制有此需要的动物的血管通透性过高的方法，其包括：

a.确定该动物的体脂含量；和

b.根据该动物的体脂含量向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述确定步骤包括计算该动物的体质指数(BMI)。

3.权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是口服给药的。

4.权利要求2的方法，其中所述达那唑化合物以约0.5mg/BMI单位/天至约1.0mg/BMI单位/天的量给药。

5.权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物每日给药两次。

6.权利要求2的方法，其中当该动物的BMI小于26时，则所述达那唑化合物的量为约2mg/天至约15mg/天。

7.权利要求6的方法，其中当该动物的BMI小于26时，则所述达那唑化合物的量为约5mg/天。

8.权利要求2的方法，其中当该动物的BMI为26至35时，则所述达那唑化合物的量为约2mg/天至约15mg/天。

9.权利要求8的方法，其中当该动物的BMI为约26至35时，则所述达那唑化合物的量为约10mg/天。

10.权利要求2的方法，其中当该动物的BMI大于35时，则所述达那唑化合物的量为约5mg/天至约45mg/天。

11.权利要求10的方法，其中当该动物的BMI大于35时，则所述达那唑化合物的量为约15mg/天。

12.权利要求1的方法，其中由于该动物存在由血管通透性过高介导的疾病或病症，因此其需要所述达那唑化合物。

13.权利要求12的方法，其中达那唑化合物的给药可在诊断出该疾病或病症后立即开始。

14.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病。

15.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为动脉粥样硬化。

16.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为高血压。

17.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、老年性黄斑退化症、脑部水肿、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状动脉微血管病变、脑微血管病变、Eals病、损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文加斯综合征、缺血、黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿、肾病综合征、神经病、水肿导致的器官衰竭、先兆子痫、肺水肿、肺动脉高压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉闭塞、视网膜炎、视网膜病变、无症状性脑梗死、系统性炎症反应综合征、移植肾肾小球病、葡萄膜炎、血管渗漏综合征、玻璃体出血或VonHipple Lindau病。

18.权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为黄斑水肿。

19.权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为神经病。

20.权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为视网膜病变。

21.权利要求12的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病的血管并发症。

22.权利要求21的方法，其中所述血管并发症为水肿、内皮下间隙的低密度脂蛋白的蓄积、加速的动脉粥样硬化、脑血管壁加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病心肌病、糖尿病母亲的胎儿的肺发育滞后、一个或多个肺部生理参数的变化、感染易感性增加、肠系膜中的血管增生、糖尿病性神经病、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病以及皮肤发红、变色、干燥和溃疡。

23.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为水肿。

24.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病心肌病。

25.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性神经病。

26.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性黄斑水肿。

27.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性视网膜病。

28.权利要求27的方法，其中所述糖尿病性视网膜病为非增殖性糖尿病性视网膜病。

29.权利要求22的方法，其中所述血管并发症为糖尿病性肾病。

30.权利要求1的方法，其中由于该动物具有一个或多个由血管通透性过高介导的疾病或病症的早期迹象或倾向于发展成由血管通透性过高介导的疾病或病症，则该动物需要达那唑化合物。

31.权利要求30的方法，其中所述疾病或病症为糖尿病、高血压或动脉粥样硬化。

32.权利要求1的方法，其中所述血管通透性过高是发现位于或包围脑、膈、十二指肠、脂肪、心脏、肾脏、大血管、肺部、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸的连续性内皮的血管通透性过高。

33.权利要求32的方法，其中所述连续性内皮被发现位于或包围脑、心脏、肺部、神经或视网膜。

34.权利要求1的方法，其中所述血管通透性过高是发现位于或包围肾脏、胰腺、肾上腺、内分泌腺或肠的开窗内皮的血管通透性过高。

35.权利要求34的方法，其中所述开窗内皮发现存在于肾中。

36.权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是达那唑。

37.权利要求1的方法，其中所述达那唑化合物是延时释放制剂。

38.权利要求37的方法，其中所述延时释放制剂包含选自脂质体和多糖的成分。

39.权利要求1的方法，其中所述动物是人。

40.抑制有此需要的动物血管通透性过高的方法，其包括向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物，其中所述量对应于该动物的体脂含量。

41.调节动物内皮细胞的细胞骨架的方法，其包括

a.确定该动物的体重；和

b.根据该动物的体重，向该动物给药血管通透性过高抑制量的达那唑化合物。

42.权利要求41的方法，其中所述确定步骤包括计算该动物的体质指数(BMI)。

43.权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括抑制肌动蛋白张力丝的形成。

44.权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括引起、增加或延长皮质肌动蛋白环的形成。

45.权利要求41的方法，其中所述细胞骨架的调整包括抑制RhoA。

46.权利要求41的方法，其中所述动物为人。