CN109563150A - 由血管高通透性介导的疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抑制有此需要的动物中的血管高通透性的方法。方法包括对动物施用有效量的药物组合物和一种或多种p38 MAPK抑制剂，所述药物组合物通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白来制备。

Description

由血管高通透性介导的疾病的治疗

对相关申请的交叉引用

本申请要求2016年7月26日提交的美国临时专利申请No.62/366,969的35U.S.C.§119(e)下的优先权权益。美国临时专利申请No.62/366,969的全部公开内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及用于抑制血管高通透性以及水肿和由此引起的其它不利效应的方法和试剂盒。方法包括对动物施用人血清白蛋白的低分子量级份(称为“LMWFHSA”)和p38MAPK抑制剂。

发明背景

血管内皮作为所有血管内部的衬里。它作用为血液与组织和器官之间的界面。内皮形成半透性屏障，其维持血液区室的完整性，但是允许水、离子、小分子、大分子和细胞以受调节的方式通过。此过程的失调导致血管渗漏到下面的组织中。引起水肿的流体对组织的渗漏可以在多种疾病中具有严重且危及生命的后果。因此，非常希望具有用于减少水肿，优选在其最早的阶段，并且将内皮屏障恢复为生理性的方法。

内部血液-视网膜屏障的破坏是几种眼部疾病(包括糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜静脉阻塞)的发病机制的一个促成因素(Klaassen I,etal.Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown indiabetic macular edema and other pathological conditions.Progress in retinaland eye research 2013；34:19-48)。所得的液体和蛋白质的积累使斑变厚，损害视力。若不加以抑制，黄斑水肿可导致永久性视力丧失，并且是导致糖尿病失明的主要原因。在2012年，估计有2910万美国人患有糖尿病，另有8600万人表现出前驱糖尿病的体征(NationalDiabetes Statistics Report:Estimates of Diabetes and Its Burden in the UnitedStates.于:Services UDoHaH(编).Atlanta,GA:Centers for Disease Control andPrevention；2014)。与人口老龄化一起考虑，此种状况对工业世界造成严重的健康风险。

在病理条件下内皮屏障完整性的丧失主要是由肌动蛋白细胞骨架施加的收缩力的结果。促炎性介质触发第二信使系统，其激活肌球蛋白轻链激酶和Rho相关的含有卷曲螺旋的蛋白激酶两者，它们促进肌球蛋白II电动机对f-肌动蛋白应力纤维束的磷酸化依赖性结合(Dudek SM,Garcia JG.Cytoskeletal regulation of pulmonary vascularpermeability.Journal of applied physiology2001；91:1487-1500)。串联或独立地，肌动蛋白细胞骨架重塑也可以通过p38MAPK调节。在正常生理条件下，27kDa热休克蛋白将肌动蛋白单体隔绝于胞质溶胶，但是其被p38MAPK的磷酸化减轻此种约束，释放肌动蛋白以参与应力纤维形成(Mehta D,Malik AB.Signaling mechanisms regulating endothelialpermeability.Physiological reviews 2006；86:279-367)。因为内皮细胞收缩机器锚定于细胞连接和粘着斑两者，所以所得的肌动球蛋白张力物理地拉开单层中的开放间隙。

大量证据提示了微管网络也有助于控制细胞旁通透性。例如，内皮细胞与紫杉醇(一种微管稳定化合物)的温育显著降低TNFα诱导的通透性(Petrache I,et al.The roleof the microtubules in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cellpermeability.American journal of respiratory cell and molecular biology 2003；28:574-581)。相反，用诺考达唑(nocodazole)和长春碱(vinblastine)使微管脱稳定化经由肌球蛋白轻链磷酸化和Rho-GTP酶活化增加通透性(Verin AD,Birukova A,Wang P,etal.Microtubule disassembly increases endothelial cell barrier dysfunction:role of MLC phosphorylation.American journal of physiology Lung cellular andmolecular physiology 2001；281:L565-574)。令人感兴趣的是，可以通过用p38抑制剂SB203580处理减弱用2-甲氧基雌二醇对微管的破坏(Bogatcheva NV,Adyshev D,Mambetsariev B,Moldobaeva N,Verin AD.Involvement of microtubules,p38,and Rhokinases pathway in 2-methoxyestradiol-induced lung vascular barrierdysfunction.American journal of physiology Lung cellular and molecularphysiology 2007；292:L487-499)。总的来说，这些发现指示细胞骨架的所有组分之间存在密切关系以调节通透性。

通过称为转胞吞的过程直接穿过内皮的转运也有助于屏障功能。此种作用模式对免疫特权区室如眼及对于大分子通过是特别感兴趣的。穿梭开始于在顶端质膜上形成胞膜窖或“穴样”内陷，在内吞囊泡中捕获腔溶质和受体结合配体(Yuan SY,RigorRR.Regulation of Endothelial Barrier Function.San Rafael(CA)；2010)。然后，这些囊泡可以再循环回到顶膜或通过细胞内部以通过基底外侧的胞吐作用释放它们的内容物。微管的破坏降低内皮细胞上的胞膜窖的表面水平，证明了细胞骨架对此途径的依赖性(Mehta D,Malik AB.Signaling mechanisms regulating endothelialpermeability.Physiological reviews2006；86:279-367)。通过此种途径的溶质通过不容低估，因为驻留胞膜窖内的流体体积占内皮细胞内部体积的15-20％(Yuan SY,RigorRR.Regulation of Endothelial Barrier Function.San Rafael(CA)；2010)。

发明概述

本发明的一个实施方案涉及抑制有此需要的动物中血管高通透性的方法，该方法包括对动物施用有效量的药物组合物和一种或多种p38MAPK抑制剂，该组合物包括通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白制备。

在一方面，一种或多种p38MAPK抑制剂选自下组：SB 203580、SB203580盐酸盐、SB202190、SB 239063、SB 706504、AL 8697、AMG 548、CMPD-1、DBM 1285二盐酸盐、EO 1428、JX401、ML 3403、RWJ 67657、SCIO 469盐酸盐、SKF 86002二盐酸盐、SX 011、TA 01、TA 02、TAK715、VX 702、VX 745、p38MAPK抑制剂TOCRISET^TM及其组合。

在一方面，动物具有由血管高通透性介导的疾病或状况。

在一方面，在诊断所述疾病或状况后立即开始施用所述药物组合物和所述一种或多种p38MAPK抑制剂。

在一方面，疾病或状况是眼部疾病。

在另一方面，疾病或状况是糖尿病的血管并发症。

在另一方面，疾病或状况是糖尿病的血管并发症。例如，血管并发症是水肿、内皮下间隙中低密度脂蛋白积累(accumulation of low density lipoproteins insubendothelial space)、加速性动脉粥样硬化(accelerated atherosclerosis)、脑血管壁加速老化(accelerated aging of vessel walls in the brain)、心肌水肿(myocardialedema)、心肌纤维化、舒张期功能障碍(diastolic dysfunction)、糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy)、糖尿病母亲胎儿肺发育迟缓(retardation of lungdevelopment in the fetuses of diabetic mothers)、一个或多个肺生理参数的改变、对感染的易感性增加、肠系膜中血管增生(vascular hyperplasy in the mesentery)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema)、糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)，或皮肤发红、变色、干燥和溃疡。在一方面，血管并发症是水肿。另一方面，血管并发症是糖尿病性心肌病。在另一方面，血管并发症是糖尿病性神经病变。在另一方面，血管并发症是糖尿病性黄斑水肿。在另一方面，血管并发症是糖尿病视网膜病变。在一方面，糖尿病视网膜病变是非增殖性糖尿病视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy)。在另一方面，血管并发症是糖尿病性肾病。

在另一方面，疾病或状况是急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratory distress syndrome)、年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration)、动脉粥样硬化、脉络膜水肿(choroidaledema)、脉络膜炎(choroiditis)、冠状微血管疾病(coronary microvascular disease)、脑微血管疾病(cerebralmicrovascular disease)、糖尿病、Eals病、由损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏(glomerular vascular leakage)、失血性休克(hemorrhagic shock)、高血压、欧文-加斯综合征(Irvine Gass Syndrome)、缺血，黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿(nephrotic edema)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、神经病(neuropathy)、由水肿所致的器官衰竭、先兆子痫、肺水肿、肺动脉高血压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血(retinal hemorrhage)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion)、视网膜炎、视网膜病变(retinopathy)、无症状脑梗死(silent cerebral infarction)、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome)、移植物肾小球病(transplantglomerulopathy)，葡萄膜炎(uveitis)，血管渗漏综合征(vascular leakage syndrome)，玻璃体出血(vitreous hemorrhage)或Von Hipple Lindau病。在一方面，疾病或状况是黄斑水肿。在另一方面，疾病或状况是神经病。在另一方面，疾病或状况是视网膜病变。

另一方面，由于由血管高通透性介导的疾病或状况的一种或多种早期体征或形成的素因，动物需要药物组合物和一种或多种p38MAPK抑制剂。在一方面，疾病或状况是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化或眼部疾病。

在另一方面，血管高通透性是在脑、膈(diaphragm)、十二指肠肌肉组织(duodenalmusculature)、脂肪、心脏、肾、大血管、肺、肠系膜(mesentery)、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸中或周围找到的连续内皮的血管高通透性。在一方面，连续内皮在脑、心脏、肺、神经或视网膜中或周围找到。

在另一方面，血管高通透性是在肾、胰腺、肾上腺、内分泌腺或肠中或周围找到的有孔内皮(fenestrated endothelium)的血管高通透性。在一方面，有孔内皮在肾脏中找到。

在另一方面，除去白蛋白的步骤包括通过选自超滤、蔗糖梯度离心、层析、盐沉淀和超声处理的分离方法处理人血清白蛋白组合物。在另一方面，除去步骤包括使所述人血清白蛋白组合物通过具有保留所述白蛋白的分子量截留的超滤膜，并且其中所得滤液包含LMWFHSA。

本发明的另一个实施方案是通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白制备的药物组合物和一种或多种p38MAPK抑制剂，用于治疗由血管高通透性介导的疾病或状况和/或用于抑制血管高通透性。在一方面，疾病或状况是眼部疾病。

在一方面，一种或多种p38MAPK抑制剂选自SB 203580、SB 203580盐酸盐、SB202190、SB 239063、SB 706504、AL 8697、AMG 548、CMPD-1、DBM 1285二盐酸盐、EO 1428、JX401、ML 3403、RWJ 67657、SCIO 469盐酸盐、SKF 86002二盐酸盐、SX 011、TA 01、TA 02、TAK715、VX 702、VX 745、p38MAPK抑制剂TOCRISET^TM及其组合。

附图简述

图1A和1B。通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白制备的组合物(即LMWFHSA)降低人视网膜内皮细胞(HREC)中的大分子通透性和晚期屏障破坏。(图1A)HREC在转孔(transwell)插入物上生长至汇合，然后用盐水、LMWF5A或10μM福司柯林处理。通过HRP测量24小时内的大分子通透性，并且计算相对于盐水对照的相对通透性。数据呈现为平均值±SD(单因素ANOVA，然后是Bonferroni事后，*＝p<0.025，n＝3)(图1B)。HREC在电极阵列上生长至汇合，然后用盐水或LMWF5A处理监测跨内皮电阻(trans-endothelial resistance)48小时。

图2A-2C。LMWF5A诱导HREC中α-微管蛋白的乙酰化。(图2A)用盐水或LMWF5A处理3小时的HREC中乙酰化α-微管蛋白的免疫荧光染色。(图2B)对代表性免疫荧光实验进行量化。将HREC处理0.5、3、6或24小时，并且针对乙酰化α-微管蛋白染色。数据呈现为相对于通过DAPI计数器染色测定的细胞数目标准化的均值FU±SD(单因素ANOVA，然后是Bonferroni事后，相对于盐水*＝p<0.01，相对于3小时LWWF5A，**＝p<0.02，n＝6)。(图2C)对用LMWF5A处理0.5、3、6或24小时的HREC的溶胞物上的乙酰化α-微管蛋白进行代表性蛋白质印迹。然后进行光密度测定法并相对于肌动蛋白加载标准化。

图3：LMWF5A诱导HREC中乙酰化α-微管蛋白定位的变化。用盐水或LMWF5A处理3小时、6小时或24小时的HREC中乙酰化α-微管蛋白的代表性免疫荧光染色。盐水处理的对照中的乙酰化α-微管蛋白主要位于核周围的微管组织中心。LMWF5A处理的HREC表现出升高的细胞质和核周染色。

图4A和4B。对PI3-激酶的抑制减少，而对p38MAPK的抑制加强LMWF5A诱导的乙酰化α-微管蛋白的乙酰化。(图4A)在存在PI3-激酶(10μM LY294002)或p38MAPK(10μMSB203580)的特异性抑制剂的情况下暴露于LMWF5A达3小时的HREC的代表性免疫荧光。数据呈现为相对于通过DAPI计数器染色测定的细胞数目标准化的均值FU±SD(单因素ANOVA，然后是Bonferroni事后，相对于盐水+DMSO，*＝p<0.01，相对于LWWF5A+DMSO，**＝p<0.025，n＝6)。(图4B)对在存在特异性抑制剂的情况下用LMWF5A处理3小时的HREC的溶胞物上的乙酰化α-微管蛋白进行的代表性蛋白质印迹。然后进行光密度测定并相对于肌动蛋白加载标准化。

发明详述

本发明提供了抑制血管高通透性的方法。该方法包括对有此需要的个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含人血清白蛋白的低分子量级份(LMWFHSA)和一种或多种p38有丝分裂原(mitogen)活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂。

本发明还提供了包含LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂的药物组合物，用于治疗由血管高通透性介导的疾病或状况和/或抑制血管高通透性。

根据本发明的血管高通透性的抑制包括抑制细胞旁引起的高通透性(paracellular-caused hyperpermeability)和转胞吞引起的高通透性。最近的证据指示，转胞吞引起的高通透性是最终导致许多疾病和状况中组织和器官损伤的过程的第一步。因此，本发明提供了这些疾病和状况的早期干预手段，其可以减少、延迟或甚至潜在地预防在其中看到的组织和器官损伤。

本发明还提供了调节动物中内皮细胞的细胞骨架的方法。该方法包括对动物施用有效量的活性成分，其中活性成分包含LMWFHSA或其药学上可接受的盐，和一种或多种p38MAPK抑制剂。

本发明还提供了试剂盒。该试剂盒包含LMWFHSA或其药学上可接受的盐和一种或多种p38MAPK抑制剂。

下面更详细地描述LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂对内皮通透性的出乎意料的影响。如本文中公开的含LMWFHSA的组合物(也称为LMWF5A)可以是源自人血清白蛋白的小于5kDa级分的生物制剂。在临床试验中，LMWFHSA单次关节内注射相对于盐水对照导致注射后4周观察到的疼痛的显著的42.3％减少，其持续至试验完成(Bar-Or D,et al.Arandomized clinical trial to evaluate two doses of an intra-articularinjection of LMWFHSA in adults with pain due to osteoarthritis of theknee.PloS one 2014；9:e87910)。体外实验还已经证明了，此种LMWFHSA通过抑制从经刺激的外周血单个核细胞(PBMC)和T细胞系两者的细胞因子释放而拥有抗炎特性(Bar-Or D,Thomas GW,Bar-Or R,et al.Commercial human albumin preparations for clinicaluse are immunosuppressive in vitro.Critical care medicine 2006；34:1707-1712；Shimonkevitz R,et al.A diketopiperazine-containing fraction of human serumalbumin modulates T-lymphocyte cytokine production through rap1.The Journalof trauma 2008；64:35-41；Thomas GW,et al.Anti-Inflammatory Activity in the LowMolecular Weight Fraction of Commercial Human Serum Albumin(LMWF5A).JImmunoassay Immunochem 2016；37:55-67)。最近的研究显示了，LMWFHSA也加强来自经LPS刺激的PBMC的抗炎前列腺素15d-PGJ₂的释放(Thomas GW,et al.Anti-InflammatoryActivity in the Low Molecular Weight Fraction of Commercial Human SerumAlbumin(LMWF5A).J Immunoassay Immunochem 2016；37:55-67；Thomas GW,Rael LT,Hausburg M,et al.The low molecular weight fraction of human serum albuminupregulates production of15d-PGJ in Peripheral Blood MononuclearCells.Biochem Biophys Res Commun2016)。此外，骨髓来源的间充质干细胞的LMWFHSA处理降低Rho GTP酶活性和应激纤维形成(Bar-Or D,et al.Low Molecular WeightFraction of Commercial Human Serum Albumin Induces Morphologic andTranscriptional Changes of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.StemCells Transl Med 2015；4:945-955)。

如下面更详细讨论的，通过细胞成像和免疫印迹两者研究体外通透性以及监测的细胞骨架变化两者，出乎意料地发现LMWFHSA降低了通透性并且介导微管网络的变化。这些观察结果扩展了围绕LMWFHSA的生物活性的知识，特别提示此种生物制剂改变微管动力学和转胞吞。

“血管高通透性”在本文中用于意指与基础水平相比增加的血管内皮的通透性。如本文所用，“血管高通透性包括细胞旁引起的高通透性和转胞吞引起的高通透性。

“细胞旁引起的高通透性”在本文中用于意指与基础水平相比增加的由细胞旁转运引起的血管高通透性。下文描述了“细胞旁引起的高通透性”的其他特征。

“细胞旁转运”在本文中用于意指离子、分子和流体通过内皮的内皮细胞之间的内皮间连接(IEJ)的运动。

“转胞吞引起的高通透性”在本文中用于意指与基础水平相比增加的由转胞吞引起的血管高通透性。

“转胞吞”在本文中用于意指大分子和伴随的流体相血浆成分穿过内皮的内皮细胞的主动转运。下文描述了“转胞吞”的其他特征。

“基础水平”在本文中用于指在正常组织或器官中发现的水平。

“抑制”和类似术语在本文中用于意指减少、延迟或预防。

若动物目前具有由血管高通透性介导的疾病或状况，表现出此类疾病或状况的早期体征，或具有形成此类疾病或状况的素因，则动物“需要”根据本发明的治疗。

“介导”和类似术语在本文用于指由血管高通透性引起，引起，累及血管高通透性或由血管高通透性加剧。

内皮是控制从血液到组织实质的分子交换的关键守门者。它主要控制特定血管床对血液传播分子的通透性。内皮细胞屏障的通透性和选择性强烈依赖于作为不同血管床中微血管系统的衬里的内皮的结构和类型。作为不同器官的微血管床的衬里的内皮细胞表现出结构分化，其可以分组为三种主要形态类别：窦状、有孔的(fenestrated)和连续的。

窦状内皮(也称为“不连续内皮”)具有大的细胞间和细胞内间隙并且没有基底膜，允许分子从毛细管腔到组织中的最小限度受限转运，反之亦然。在肝、脾和骨髓中发现窦状内皮。

有孔内皮以大量具有直径60至80nm的称为窗孔的圆形跨细胞开口的存在为特征。在需要快速交换小分子的组织和器官，包括肾(肾小球、管周毛细血管和上行直小血管)、胰腺、肾上腺、内分泌腺和肠中发现有孔内皮。除了成熟健康的肾小球中的窗孔以外，窗孔覆盖有薄的膈。参见Ichimura et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,19:1463-1471(2008)。

连续内皮不含窗孔或大间隙。相反，连续内皮以不间断的内皮细胞单层为特征。体内的大多数内皮是连续内皮，并且在脑(血脑屏障)、膈、十二指肠肌肉组织、脂肪、心脏、肾脏的某些区域(乳头状微血管系统，下行直小血管)、大血管、肺、肠系膜、神经、视网膜(血液视网膜屏障)、骨骼肌、睾丸和身体的其他组织和器官中或周围发现连续内皮。

连续内皮中的内皮转运在一般意义上可以被认为通过细胞旁和跨细胞途径发生。细胞旁途径是内皮细胞之间经由内皮间连接(IEJ)的途径。在未受扰乱的连续内皮中，水、离子和小分子通过扩散和对流在细胞旁转运。大量的水(高达40％)也经由称为水通道蛋白的水转运膜通道跨细胞穿过内皮细胞屏障。多种刺激物可以破坏IEJ的构造，从而打开内皮屏障中的间隙。这些细胞间间隙的形成允许以不受限制的方式使内皮细胞之间的流体、离子、大分子(例如蛋白质)和其他血浆成分通过。此种细胞旁引起的高通透性产生水肿和其他不良反应，其最终可以导致对组织和器官的损伤。

跨细胞途径负责大分子(例如白蛋白和其他血浆蛋白)跨越内皮细胞的主动转运，称为“转胞吞”的过程。在称为胞膜窖的囊泡中发生大分子的转运。除了位于几乎没有胞膜窖的睾丸和脑中的连续内皮外，几乎所有连续内皮都有丰富的胞膜窖。转胞吞是一个多步骤的过程，其涉及从质膜的连续胞膜窖出芽和裂殖以及跨细胞的易位，然后与相对的质膜对接和融合，在所述相对的质膜中胞膜窖通过胞吐将其内含物释放入间质中。转胞吞是选择性的并且在正常生理条件下受到严格调节。

越来越认识到跨细胞途径的根本重要性。血浆蛋白的转胞吞，特别是占血浆蛋白的65％的白蛋白，由于其调节经血管胶体渗透压(oncotic pressure)梯度的能力而是特别感兴趣的。然后，如可以理解，高于基础水平的增加的白蛋白和其他血浆蛋白的转胞吞将增加它们的组织蛋白浓度，这继而引起水移动过内皮屏障，从而产生水肿。

低密度脂蛋白(LDL)也通过转胞吞转运过内皮细胞。在高脂血症中，LDL转胞吞的显著增加已经作为动脉粥样硬化生成的初始事件检测。LDL在内皮下的空间中积累，在扩张的基底层和细胞外基质中俘获。高脂血症中的内皮下脂蛋白积累之后是一系列事件，导致动脉粥样化斑形成。报告了晚期动脉粥样化损伤偶尔伴有IEJ的开放和LDL和白蛋白的大量不受控制的传播。

血管并发症是糖尿病的标志。在大血管水平，该疾病似乎表现为动脉粥样化过程的加速。就微血管病而言，视网膜、肾小球和神经的微血管系统的改变引起最多的临床并发症，但是不断增加数目的研究显示糖尿病也影响其他器官，例如肠系膜、皮肤、骨骼肌、心脏、脑和肺的微血管系统，引起额外的临床并发症。在所有这些血管床中，血管通透性的变化似乎代表了糖尿病内皮功能障碍的标志。

在连续内皮中，糖尿病早期阶段中对血浆大分子的毛细管高通透性通过跨内皮囊泡运输的增强(即通过增加的转胞吞)，而非通过IEJ的脱稳定化来解释。此外，报告了糖尿病患者的内皮细胞(包括脑的内皮细胞)与正常者相比含有增加数目的胞膜窖，并且糖化蛋白(特别是糖化白蛋白)受到内皮细胞摄取，并比其天然形式以实质上更大的速率被转胞吞。此外，增加的大分子转胞吞是一个持续超出糖尿病早期阶段的过程，并且若不进行治疗则似乎是整个疾病期间糖尿病性组织和器官中水肿的原因。此种水肿继而导致组织和器官损伤。已经在高血压中报告了大分子的跨细胞转运的类似增加。

细胞旁引起的高通透性也是糖尿病和糖尿病血管并发症的一个因素。细胞旁途径的IEJ包括粘附连接(AJ)和紧密连接(TJ)。糖尿病改变了AJ和TJ两者中某些蛋白质的含量、磷酸化和定位，从而有助于增加的内皮屏障通透性。

为了支持前述讨论和进一步的信息，参见Frank et al.,Cell Tissue Res.,335:41-47(2009),Simionescu et al.,Cell Tissue Res.,335:27-40(2009)；van den Berget al.,J.Cyst.Fibros.,7(6):515-519(2008)；Viazzi et al.,Hypertens.Res.,31:873-879(2008)；Antonetti et al.,第14章,第340-342页,于Diabetic Retinopathy(由EliaJ.Duh编,Humana Press,2008),Felinski et al.,Current Eye Research,30:949-957(2005),Pascariu et al.,Journal of Histochemistry&Cytochemistry,52(1):65-76(2004)；Bouchard et al.,Diabetologia,45:1017-1025(2002)；Arshi et al.,Laboratory Investigation,80(8):1171-1184(2000)；Vinores et al.,DocumentaOphthalmologica,97:217-228(1999)；Oomen et al.,European Journal of ClinicalInvestigation,29:1035-1040(1999)；Vinores et al.,Pathol.Res.Pract.,194:497-505(1998)；Antonetti et al.,Diabetes,47:1953-1959(1998),Popov et al.,ActaDiabetol.,34:285-293(1997)；Yamaji et al.,Circulation Research,72:947-957(1993)；Vinores et al.,Histochemical Journal,25:648-663(1993)；Beals et al.,Microvascular Research,45:11-19(1993)；Caldwell et al.,InvestigativeOphthalmol.Visual Sci.,33(5):16101619(1992)。

有孔内皮中的内皮转运也通过转胞吞和细胞旁途径发生。此外，通过窗孔发生内皮转运。由于存在窗孔，有孔内皮显示对水和小亲水性溶质的显著高通透性。

窗孔可以被隔覆盖或可以不被隔覆盖。具有分隔窗孔的内皮的位置包括内分泌组织(例如，胰岛和肾上腺皮质)、胃肠粘膜和肾管周毛细管。具有分隔窗孔的有孔内皮对血浆蛋白的通透性不超过连续内皮的。

具有非分隔窗孔的内皮的位置包括肾的肾小球。肾小球有孔内皮被延伸到窗孔中(形成所谓的“筛塞(seive plug)”)的糖萼和更松散相关的内皮细胞表面糖蛋白层覆盖。功能性选择通透性(permselectivity)研究的数学分析得出结论，肾小球内皮细胞糖萼(包括存在于窗孔中的糖萼)及其相关的表面层说明循环内高达95％的血浆蛋白的保留。

已经发现肾小球内皮中的窗孔损失与几种疾病中的蛋白尿有关，所述疾病包括糖尿病性肾病、移植物肾小球病、先兆子痫、糖尿病、肾衰竭、环孢菌素肾病、血清病肾炎和Thy-1肾炎。已经发现肌动蛋白重排，特别是应力纤维(stress fiber)的解聚对于窗孔的形成和维持是重要的。

为了支持有孔内皮的前述讨论以及对于其他信息，参见Satchell et al.,Am.J.Physiol.Renal Physiol.,296:F947-F956(2009)；Haraldsson et al.,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,18:331-335(2009)；Ichimura et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,19:1463-1471(2008)；Ballermann,Nephron Physiol.,106:19-25(2007)；Toyoda et al.,Diabetes,56:2155-2160(2007)；Stan,"Endothelial StructuresInvolved In Vascular Permeability,"第679-688页,Endothelial Biomedicine(Aird编,Cambridge University Press,Cambridge,2007)；Simionescu and Antohe,"Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium:Changes in VariousPathologies,"第42-69页,The Vascular Endothelium I(Moncada and Higgs编,Springer-Verlag,Berlin,2006)。

窦状内皮中的内皮转运通过转胞吞和经由细胞间间隙(内皮间裂缝)和细胞内间隙(窗孔)发生。用肌动蛋白丝破坏药物处理窦状内皮可以诱导间隙数目的实质性且快速的增加，指示调节以肌动蛋白细胞骨架作为内皮衬里的孔隙率。已经报告了其他细胞骨架改变药物改变窗孔的直径。因此，窗孔相关的细胞骨架可能控制窦状内皮中的内皮过滤的重要功能。在肝脏中，引起内皮通透性降低的脱窗孔化(defenestration)(窗孔损失)已经与几种疾病和状况的发病机制联系起来，包括衰老、动脉粥样硬化生成(atherogenesis)、动脉粥样硬化、硬化、纤维化、肝功能衰竭和原发性和转移性肝癌。为了支持上述内容以及对于其他信息，参见Yokomori,Med.Mol.Morphol.,41:1-4(2008)；Stan,"EndothelialStructures Involved In Vascular Permeability,"第679-688页,EndothelialBiomedicine(Aird编,Cambridge University Press,Cambridge,2007)；DeLeve,"TheHepatic Sinusoidal Endothelial Cell,"第1226-1238页,Endothelial Biomedicine(Aird编,Cambridge University Press,Cambridge,2007)；Pries and Kuebler,"NormalEndothelium,"第1-40页,The Vascular Endothelium I(Moncada and Higgs编,Springer-Verlag,Berlin,2006)；Simionescu and Antohe,"Functional Ultrastructureof the Vascular Endothelium:Changes in Various Pathologies,"第42-69页,TheVascular Endothelium I(Moncada and Higgs编,Springer-Verlag,Berlin,2006)；Braetand Wisse,Comparative Hepatology,1:1-17(2002)；Kanai et al.,Anat.Rec.,244:175-181(1996)；Kempka et al.,Exp.Cell Res.,176:38-48(1988)；Kishimoto et al.,Am.J.Anat.,178:241-249(1987)。

本发明提供了抑制含有连续内皮或由连续内皮围绕的任何组织或器官中存在的血管高通透性的方法。如上所述，连续内皮存在于在脑(血脑屏障)、膈、十二指肠肌肉组织、脂肪、心脏、肾脏的某些区域(乳头状微血管系统，下行直小血管)、大血管、肺、肠系膜、神经、视网膜(血液视网膜屏障)、骨骼肌、睾丸、脐静脉和身体的其他组织和器官中或周围。优选地，连续内皮在脑、心脏、肺、神经或视网膜中或周围找到的内皮。

本发明还提供了抑制含有有孔内皮或被有孔内皮围绕的任何组织或器官中存在的血管高通透性的方法。如上所述，有孔内皮存在于肾(肾小球、管周毛细血管和上行直小血管)、胰腺、肾上腺、内分泌腺和肠中或周围。优选地，有孔内皮是在肾中找到的有孔内皮，特别是在肾的肾小球中找到的有孔内皮。

以下实施例中呈现的数据提供下述的证据，即与LMWFHSA相比，LMWFHSA和p38MAPK抑制剂的组合通过微管介导的机制降低内皮通透性达出乎意料的量，因此本发明提供了抑制有此需要的动物中的血管高通透性的方法，包括对动物施用有效量的包含LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂的药物组合物。在另一方面，本发明提供了包含LMWFHSA与一种或多种p38MAPK抑制剂的药物组合物，用于治疗血管病症和/或抑制血管高通透性。在一方面，p38MAPK抑制剂选自下组：SB 203580、SB 203580盐酸盐、SB 202190、SB 239063、SB706504、AL 8697、AMG 548、CMPD-1、DBM 1285二盐酸盐、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ67657、SCIO 469盐酸盐、SKF 86002二盐酸盐、SX 011、TA 01、TA 02、TAK 715、VX 702、VX745、p38MAPK抑制剂TOCRISET^TM及其组合。

此外，可以通过抑制血管高通透性的本发明的方法治疗由血管高通透性介导的任何疾病或状况。此类疾病和状况包括糖尿病、高血压、动脉粥样硬化和眼部疾病。

特别地，本发明可以治疗糖尿病的血管并发症，包括脑、心脏、肾、肺、肠系膜、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤和其它含有连续或有孔内皮的组织和器官的血管并发症。这些血管并发症包括水肿、内皮下空间中的LDL积累、加速性动脉粥样硬化，以及下列各项：脑(血管壁加速老化)、心脏(心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍、糖尿病性心肌病)、肾(糖尿病性肾病)、肺(糖尿病母亲胎儿肺发育迟缓，几个肺生理参数的改变和对感染的易感性增加)、肠系膜(血管增生)、神经(糖尿病性神经病变)、视网膜(黄斑水肿和糖尿病视网膜病变)和皮肤(发红、变色、干燥和溃疡)。通过本发明的方法可以抑制1型(自身免疫)和2型(非胰岛素依赖性)糖尿病中的血管高通透性。2型是最常见的糖尿病类型，影响90-95％的糖尿病患者，并且其治疗，尤其是那些具有2型糖尿病的早期体征或形成2型糖尿病的素因的患者的治疗(见下文)应当特别是有益的。

糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因，其影响估计的2100万患有糖尿病的美国人中的约25％。尽管可以通过强化血糖和血压控制降低其发病率和进展，但几乎所有患有1型糖尿病的患者和超过60％的患有2型糖尿病的患者最终形成糖尿病视网膜病变。糖尿病视网膜病变有两个阶段。第一种非增殖性视网膜病变是疾病的较早期阶段，并且以增加的血管通透性、微动脉瘤、水肿和最终血管闭合为特征。新血管形成不是非增殖期的组成。在此阶段期间的大部分视力丧失是由于黄斑(视网膜的中心区域)中积累的液体所致。此种液体积累称为黄斑水肿，并且可以引起暂时或永久性视力下降。糖尿病视网膜病变的第二阶段称为增生性视网膜病变，并且以异常的新血管形成为特征。不幸的是，此种异常的新血管形成可以是非常具有破坏性的，因为它可以导致眼出血、视网膜瘢痕组织、糖尿病性视网膜脱离或青光眼，其中任何一种都可以导致视力下降或失明。黄斑水肿也可以在增殖期发生。

糖尿病性神经病变是糖尿病的常见严重并发症。糖尿病性神经病变有四种主要类型：周围神经病变、自主神经病变、神经根神经丛神经病变(radiculoplexus neuropathy)和单神经病变。周围神经病变(最常见的糖尿病性神经病变类型)的体征和症状包括麻木或感觉疼痛或温度变化的能力降低(特别是脚和趾中)、麻刺感或灼热感、剧烈疼痛、行走时疼痛、对最轻微的触摸的极度敏感性、肌无力、行走困难和严重的脚部问题(如溃疡、感染、畸形和骨骼和关节疼痛)。自主神经病变影响控制心脏、膀胱、肺、胃、肠、性器官和眼的自主神经系统，并且可以发生这些区域的任一个中的问题。神经根神经丛神经病变(也称为糖尿病性肌萎缩、股神经病或近端神经病变(proximal neuropathy))通常影响臀部、肩部或腹部中的神经，通常在身体的一侧。单神经病变意味着仅对一种神经的损伤，通常在臂、腿或面部中。糖尿病性神经病变的常见并发症包括肢体(例如趾、脚或腿)丧失、夏科关节(charcotjoints)、尿路感染、尿失禁、低血糖无意识(甚至可能致命)、低血压、消化问题(如便秘、腹泻、恶心和呕吐)、性功能障碍(例如，勃起功能障碍)、以及出汗增加或减少。如可以看出，症状的范围可以为轻微到疼痛，致残，甚至致命。

糖尿病性肾病是美国终末期肾病的最常见原因。它是糖尿病的血管并发症，其影响肾脏的肾小球毛细管并降低肾脏的过滤能力。肾病首先以超过滤，然后是微量白蛋白尿的出现指示。重度蛋白尿和肾功能的进行性下降先于终末期肾病。通常，在出现任何肾病体征之前，通常已经诊断出视网膜病变。通常对因糖尿病而患有终末期肾病的患者推荐肾移植物。与依赖透析的患者的仅2％相比，接受移植物的患者在5年时的存活率为约60％。

高血压通常在多年内形成，并且它最终几乎影响每个人。不受控制的高血压增加严重健康问题的风险，包括心脏病发作、充血性心力衰竭、中风、外周动脉疾病、肾衰竭、动脉瘤、眼损伤以及记忆或理解问题。

动脉粥样硬化也逐渐形成。动脉粥样硬化可以影响冠状动脉、颈动脉、外周动脉或微血管系统，并且动脉粥样硬化的并发症包括冠状动脉疾病(其可以引起咽峡炎或心脏病发作)、冠状动脉微血管疾病、颈动脉疾病(其可以引起短暂性缺血性发作或中风)、外周动脉疾病(其可以引起对热和冷的敏感性丧失或甚至组织死亡)和动脉瘤。

可以根据本发明治疗的其他疾病和状况包括急性肺损伤、年龄相关的黄斑变性、脉络膜水肿、脉络膜炎、冠状动脉微血管系统疾病、脑微血管系统疾病、Eals病、由损伤(例如，创伤或烧伤)引起的水肿、与高血压相关的水肿、肾小球血管渗漏、失血性休克、欧文-加斯综合征(Irvine Gass Syndrome)、由缺血引起的水肿、黄斑水肿(除由糖尿病引起外，如由血管闭塞、眼内手术(如白内障手术)后、葡萄膜炎或色素性视网膜炎引起)、肾炎(例如，肾小球肾炎、血清病肾炎和Thy-1肾炎)、肾病、肾病性水肿、肾病综合征、神经病变、由于组织水肿所致的器官衰竭(例如，在败血症中或由于创伤)、先兆子痫、肺水肿、肺动脉高血压、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血、视网膜静脉阻塞(如支气管或中央静脉阻塞)、视网膜炎、视网膜病变(除了糖尿病视网膜病变以外，如动脉粥样硬化性视网膜病变、高血压性视网膜病变、辐射性视网膜病变、镰状红细胞性视网膜病变和早产儿视网膜病变)、无症状脑梗死、全身炎症反应综合征(SIRS)、移植物肾小球病、葡萄膜炎、血管渗漏综合征、玻璃体出血和Von Hipple Lindau病。此外，已知某些药物(包括用于治疗多发性硬化症的药物)引起血管高通透性，并且哌嗪二酮(哌嗪二酮的前药或它们中任一种的药学上可接受的盐)可以用于减少在使用这些药物时此种不想要的副作用。

“治疗”或“处理”在本文中用于指减少(完全或部分)疾病或状况的症状、持续时间或严重性。

最近的证据指示转胞吞引起的高通透性是最终导致许多疾病和状况中组织和器官损伤的过程的第一步。因此，本发明提供了这些疾病和状况的早期干预手段，其可以减少、延迟或甚至潜在预防在它们中看到的组织和器官损伤。例如，可以在诊断出根据本发明可治疗的疾病或状况之一(上文描述的那些疾病和状况)后立即治疗动物。

或者，优选的是在症状存在之前治疗具有此类疾病或状况的早期体征或形成此类疾病或状况的素因的动物。糖尿病、高血压和动脉粥样硬化的早期体征和风险因素是公知的，并且可以在疾病或状况的症状存在之前(即，预防性)开始治疗表现出这些早期体征或风险因素的动物。

例如，可以在诊断后立即开始治疗诊断出糖尿病的患者。特别地，糖尿病患者优选应当在存在的血管并发症的任何症状之前用LMWFHSA和p38MAPK抑制剂的组合治疗，尽管这通常是不可能的，因为大多数糖尿病患者在他们得到诊断时显示此类症状(见下文)。或者，应当在非增殖性糖尿病视网膜病变轻微(即，轻微水平的微动脉瘤和视网膜内出血)时治疗糖尿病患者。参见Diabetic Retinopathy,第9页(Ed.Elia Duh,M.D.,Human Press,2008)。此类早期治疗将提供预防黄斑水肿和视网膜病变进展为增殖性糖尿病视网膜病变的最佳机会。此外，认为糖尿病视网膜病变的存在是糖尿病的其他微血管并发症存在或将形成的体征(见同上，第474-477页)，并且早期治疗也可以预防或减少这些额外的并发症。当然，作为糖尿病血管并发症的更晚期疾病和状况也可以以有益的结果治疗。

然而，如上所述，在诊断出糖尿病时通常已经存在血管并发症。因此，优选预防性治疗患有糖尿病的早期体征或具有形成糖尿病的素因的患者。2型糖尿病的早期体征和风险因素包括较高的但高得不足以被分类为糖尿病(“前驱糖尿病”)的空腹血糖、超高胰岛素血症、高血压、血脂异常(高胆固醇、高甘油三酯、高低密度脂蛋白、和/或低水平的高密度脂蛋白)、肥胖(体重指数高于25)、不活动、超过45岁龄、睡眠不足、糖尿病家族史、少数民族、妊娠糖尿病史、多囊卵巢综合征病史和代谢综合征的诊断。因此，具有2型糖尿病早期体征或形成2型糖尿病的素因的患者可以容易地预防性治疗。

类似地，可以在诊断后立即开始治疗诊断出高血压的患者。高血压通常不引起任何症状，但是可以在具有形成高血压的素因的患者中开始预防性治疗。高血压的风险因素包括年龄、种族(高血压是在黑人中更常见)、家族史(家庭中的高血压例)、超重或肥胖、缺乏活动、吸烟、饮食中含盐过多、饮食中钾含量过低、饮食中维生素D过少、饮酒过量、压力过高、某些慢性状况(如高胆固醇、糖尿病、肾病和睡眠呼吸暂停)和使用某些药物(如口服避孕药、苯丙胺类、减肥药、以及一些感冒和变态反应药物)。

可以在诊断后立即开始治疗诊断出动脉粥样硬化的患者。然而，优选预防性治疗具有动脉粥样硬化早期体征或形成动脉粥样硬化的素因的患者。动脉粥样硬化的早期体征和风险因素包括年龄、动脉瘤家族史或早期心脏病、高血压、高胆固醇、高甘油三酯、胰岛素抗性、糖尿病、肥胖、吸烟、缺乏体力活动、不健康的饮食和高水平的C-反应蛋白。

用于抑制血管高通透性的本发明方法包括对有此需要的动物施用有效量的活性成分以抑制血管高通透性，其中活性成分包含LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂。

本发明的LMWFHSA组合物和/或产物可以通过除去溶液中的一些或全部白蛋白的公知方法从溶液制备，包括从包含白蛋白(例如人血清白蛋白)的商品化药物组合物制备，所述公知的方法如超滤、层析(大小排阻层析、Centricon过滤、亲和层析(例如，使用附着有一种或多种针对期望的哌嗪二酮的抗体或一种或多种针对截短蛋白质或肽的抗体的珠的柱)、阴离子交换或阳离子交换)、蔗糖梯度离心、层析、盐沉淀或超声处理。可以使用所得的含LMWFHSA的组合物和/或产物，并将其掺入如上所述的药物组合物中。

使用超滤分离方法，人血清白蛋白组合物可以通过具有保留白蛋白而允许较低分子量的组分通入所得滤液或级分中的分子量截留的超滤膜。此滤液可以包含具有小于约50kDA，小于约40kDa，小于30kDa，小于约20kDa，小于约10kDa，小于约5kDa，小于约3kDa的分子量的组分。优选地，滤液包含具有小于约5Da的分子量的组分(也称为“<5000MW”或LMWF5A)。此种<5000MW或LMWF5A级分或滤液含有天冬氨酰-丙氨酰哌嗪二酮(“DA-DKP”)，其在二肽天冬氨酸-丙氨酸从白蛋白切割后形成，然后环化成哌嗪二酮。

本发明的LMWFHSA的生理学上可接受的盐也可用于本发明的实践中。生理上可接受的盐包括常规的无毒盐，例如源自无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)、有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯甲酸、水杨酸、草酸、抗坏血酸等)或碱(如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或源自N,N-二苄乙烯二胺、D-葡糖胺或乙二胺的有机阳离子)的盐。盐以常规方式制备，例如通过用酸中和化合物的游离碱形式。

如上所述，LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂可以用于抑制血管高通透性和治疗由血管高通透性介导的疾病或状况。为此，对需要治疗的动物施用LMWFHSAP和p38MAPK抑制剂。优选地，动物是哺乳动物，例如兔、山羊、狗、猫、马或人。最优选地，动物是人。

如本发明中使用的LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂用作活性成分。“活性成分”在本文中用于意指具有治疗、药学或药理学活性的化合物，特别是本文所述的治疗、药学或药理学活性。LMWFHSA在本发明中不用作载体或药物组合物的载体系统的一部分，如美国专利No.5,976,569,6,099,856,7,276,534和PCT公开文本WO 96/10396,WO 2006/023943,WO 2007/098500,WO 2007/121411和WO 2010/102148中所述。

本发明组合物的有效剂量形式、施用方式和剂量的量可以使用本文中提供的指导凭经验确定。本领域技术人员应当理解，剂量的量将随待治疗的具体疾病或状况、疾病或状况的严重程度、施用途径、治疗持续时间、对动物施用的任何其他药物的身份、动物的年龄、大小和物种、以及医学和兽医领域中已知的相似因素而变化。通常，本发明组合物的合适剂量是组合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。然而，剂量将由主治内科医生或兽医在合理的医学判断范围内确定。若期望的话，有效剂量可以作为2、3、4、5、6或更多个亚剂量施用，贯穿一天或其他时间段以适当的间隔分开施用。应当继续施用组合物直至达到可接受的响应。

本发明的LMWFHSA组合物可以与一种或多种p38MAPK抑制剂同时、序贯或间歇施用。

在本发明的一方面，一种或多种p38MAPK抑制剂与LMWFHSA组合物序贯施用。在另一个实施方案中，在施用LMWFHSA组合物之前施用一种或多种p38MAPK抑制剂。在另一个实施方案中，在施用LMWFHSA组合物后施用一种或多种另外的p38MAPK抑制剂。在一个实施方案中，一种或多种另外的p38MAPK抑制剂与LMWFHSA组合物以交替剂量施用，或者在以下方案中施用，在所述方案中LMWFHSA组合物以规定的间隔在一个或多个连续剂量的一种或多种p38MAPK抑制剂间施用或与一个或多个连续剂量的一种或多种p38MAPK抑制剂一起施用，反之亦然。在一个实施方案中，LMWFHSA组合物在开始施用一种或多种p38MAPK抑制剂之前的一段时间内以一个或多个剂量施用。换言之，LMWFHSA组合物作为单一疗法施用一段时间，然后与新剂量的LMWFHSA同时或以与LMWFHSA交替的方式添加p38MAPK抑制剂施用。或者，可以在开始施用LMWFHSA组合物之前施用一种或多种p38MAPK抑制剂一段时间。

在本发明的一方面，当一种或多种p38MAPK抑制剂的治疗过程开始时，另外剂量的LMWFHSA组合物在相同的时间段内施用，或施用所述时间的至少一部分，并且一旦p38MAPK抑制剂的过程已经结束，可以继续施用。然而，LMWFHSA在整个时段内的给药日程表可以与一种或多种p38MAPK抑制剂的给药日程表不同。例如，LMWFHSA组合物可以在同一天或者在一种或多种p38MAPK抑制剂的最后给予(新近)剂量后至少1-4天(或最后一剂后任何合适的天数)施用，并且可以每天、每周、每两周、每月、每两个月或每3-6个月、或者如由内科医生确定的更长的间隔施用。

在本发明的方面，LMWFHSA组合物和一种或多种p38MAPK抑制剂可以一起(同时)施用。如本文所用，同时使用不一定意味着所有化合物的所有剂量在同一天同时施用。相反，同时使用意味着每个组分(例如，LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂)在大约相同的时段(几小时内)开始并且在相同的一般时间段内施用，注意每个组分可以具有不同的给药日程表。另外，在同时施用期之前或之后，LMWFHSA或p38MAPK抑制剂组合物中的任一种可以在没有另一种的情况下施用。

本发明还提供了调节动物中的内皮细胞的细胞骨架的方法。细胞骨架的调节可以降低血管高通透性并增加血管低通透性(hypopermeability)(即，低于基础水平的通透性)，从而使内皮恢复到稳态。因此，可以治疗由血管高通透性介导的那些疾病和状况(参见上文)，并且还可以治疗由血管低通透性介导的那些疾病和状况。后一类疾病和状况包括老化的肝脏、动脉粥样化形成、动脉粥样硬化、肝硬化、肝纤维化、肝衰竭和原发性和转移性肝癌。

调节内皮细胞的细胞骨架的方法包括对动物施用有效量的LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂。哌嗪二酮类与上文对于抑制血管高通透性的那些相同，并且“动物”具有与上述相同的含义。

用于调节细胞骨架的本发明组合物的有效剂量形式、施用方式和剂量的量可以使用本文提供的指导凭经验确定。本领域技术人员应当理解，剂量的量将随待治疗的具体疾病或状况、疾病或状况的严重程度、施用途径、治疗持续时间、对动物施用的任何其他药物的身份、动物的年龄、大小和物种、以及医学和兽医领域中已知的相似因素而变化。通常，本发明组合物的合适每日剂量是组合物的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。然而，剂量将由主治内科医生或兽医在合理的医学判断范围内确定。若期望的话，有效每日剂量可以作为2、3、4、5、6或更多个亚剂量施用，贯穿一天以适当的间隔分开施用。应当继续施用组合物直至达到可接受的响应。

本发明组合物的LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂组分可以通过任何合适的施用途径对动物患者施用以进行治疗，所述施用途径包括口服、经鼻、胃肠外(例如，静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内)、透皮、眼内和局部(包括含服和舌下)，并且LMWFHSA的施用途径可以与一种或多种p38MAPK抑制剂的施用途径相同或不同。例如，LMWFHSA的施用途径可以通过滴眼剂局部施用，而一种或多种p38MAPK抑制剂可以通过口服施用途径同时或序贯施用。用于治疗眼疾病和状况的LMWFHSA的优选给药途径是口服、眼内和局部施用。最优选的是局部施用。用于治疗脑疾病和状况的LMWFHSA的优选施用途径是口服和胃肠外施用。最优选的是口服。

虽然本发明的化合物可以单独施用，但优选将化合物作为药物配制剂(组合物)施用。本发明的药物组合物包含一种或多种本发明化合物作为活性成分，与一种或多种药学上可接受的载体混合，并任选地与一种或多种其他化合物、药物或其他物质混合。在与配制剂的其他成分相容并且对动物无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。药学上可接受的载体是本领域公知的。无论选择的施用途径如何，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明化合物配制成药学上可接受的剂量形式。参见例如Remington’s PharmaceuticalSciences。

适合于口服施用的本发明的配制剂可以为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末剂、颗粒的形式或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基底，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)等(各自含有预定量的一种或多种本发明化合物作为有效成分)。本发明的一种或多种化合物还可以以大丸剂(bolus)、药糖剂或糊剂施用。

在用于口服施用的本发明的固体剂量形式(胶囊、片剂、丸剂、锭剂、粉末剂、颗粒等)中，活性成分(即式I的哌嗪二酮、式I的哌嗪二酮的前药、它们中任一种的药学上可接受的盐、或前述物质的组合)与一种或多种药学上可接受的载体如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种混合：(1)填充剂或膨胀剂(extender)，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂(solution retarding agent)，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂硫酸钠及其混合物；(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。使用诸如乳糖或乳糖类等赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等，类似类型的固体组合物可以用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。

片剂可以通过任选地用一种或多种辅助成分压缩或模制来制备。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。

本发明的药物组合物的片剂和其它固体剂量形式，例如锭剂、胶囊、丸剂和颗粒可以任选地用涂层材料和壳体，例如肠溶衣和药物配制领域中公知的其它涂层材料刻痕或制备。它们也可以配制成使其中的活性成分缓慢或受控释放，例如使用提供期望释放概况的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以通过例如过滤通过细菌截留滤器来灭菌。这些组合物还可以任选地含有遮光剂，并且可以是下述组成的，使得它们仅仅或者优先在胃肠道的某部分中，任选以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可以为微胶囊形式。

用于口服施用本发明化合物的液体剂量形式包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂量形式可以含有本领域常用的惰性稀释剂，诸如例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇(tetrahydrofuryl alcohol)、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯及其混合物。

除惰性稀释剂外，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性成分外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)，膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶以及其混合物。

本发明还提供适用于治疗眼的药物产品。此类药物产品包括药物组合物、装置和植入物(其可以是组合物或装置)。

用于将一种或多种本发明化合物眼内注射到眼球中的药物配制剂(组合物)包括溶液、乳剂、悬浮液、颗粒、胶囊、微球、脂质体、基质等。参见例如美国专利No.6,060,463、美国专利申请公开No.2005/0101582和PCT申请WO 2004/043480，其全部公开内容通过引用并入本文。例如，用于眼内注射的药物配制剂可以包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等张水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂的组合，所述溶液、悬浮液或乳剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂或粘度增强剂(如透明质酸聚合物)。合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水(优选0.9％)、水中的右旋糖(优选5％)、缓冲剂、二甲基亚砜、醇和多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)。这些组合物还可以含有佐剂，如润湿剂和乳化剂和分散剂。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂如聚合物和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。可以通过将药物掺入由可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)制成的微胶囊或微球中来制备可注射的储库(depot)形式。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)、聚(乙醇)酸、聚(乳)酸、聚己内酯和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在脂质体(由通常成分，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱构成)或与眼组织相容的微乳剂中制备储库可注射配制剂。根据药物与聚合物或脂质的比率、特定聚合物或脂质组分的性质、采用的脂质体的类型、以及微胶囊或微球是包被还是未包被，可以控制从微胶囊、微球和脂质体中的药物释放速率。

本发明的化合物也可以作为眼植入物手术施用。例如，可以将具有聚乙烯醇或聚乙酸乙烯酯的可扩散壁并且含有一种或多种本发明化合物的储库容器植入巩膜中或巩膜上。作为另一个实例，本发明的一种或多种化合物可以掺入由聚合物，如聚己内酯、聚(乙醇)酸、聚(乳)酸、聚(酸酐)，或脂质，如癸二酸制成的聚合基质中，并且可以在巩膜上或眼中植入。这通常用接受表面或局部麻醉剂的动物，并使用在角膜后面做出的小切口来实现。然后，将基质插入切口并缝合到巩膜。

本发明化合物也可以局部施用到眼，并且本发明的优选实施方案是适合于对眼应用的局部药物组合物。适合于对眼应用的局部药物组合物包括溶液、悬浮液、分散液、滴剂、凝胶、水凝胶和软膏。参见例如美国专利No.5,407,926和PCT申请WO 2004/058289,WO 01/30337和WO 01/68053，所有这些的完整公开内容通过引用并入本文。

适合于对眼的应用的局部配制剂包含在水性或非水性基质中的一种或多种本发明化合物。局部配制剂还可以包含吸收增强剂、渗透增强剂、增稠剂、粘度增强剂、用于调节和/或维持pH的试剂、调节渗透压的试剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲剂、盐(优选氯化钠)、悬浮剂、分散剂、增溶剂、稳定剂和/或张力剂。适合于对眼的应用的局部配制剂优选包含吸收或渗透增强剂以促进一种或多种本发明化合物吸收或渗透到眼中和/或增稠剂或粘度增强剂，其能够增加一种或多种本发明化合物在眼中的停留时间。参见PCT申请WO 2004/058289,WO 01/30337和WO 01/68053。示例性的吸收/渗透增强剂包括单独或与二甲基亚砜、羧酸和表面活性剂组合的甲磺酰基甲烷。示例性增稠剂和粘度增强剂包括葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、纤维素聚合物(如羟丙基甲基纤维素)、含羧基的聚合物(如丙烯酸的聚合物或共聚物)、聚乙烯醇和透明质酸或其盐。

适合于治疗眼的液体剂量形式(例如，溶液、悬浮液、分散液和滴剂)可以通过例如将本发明的一种或多种化合物在媒介物诸如例如水、盐水、水性右旋糖、甘油、乙醇等中溶解、分散、悬浮等以形成溶液、分散液或悬浮液来制备。若期望的话，药物配制剂还可以含有少量无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。

除一种或多种本发明化合物外，适合于治疗眼的水溶液和悬浮液可以包含防腐剂、表面活性剂、缓冲剂、盐(优选氯化钠)、张力剂和水。若使用悬浮液，则颗粒大小应当小于10μm以使眼刺激最小化。若使用溶液或悬浮液，则递送至眼的量不应超过50μl，以避免从眼的过度溢出。

适合于治疗眼的胶体悬浮液通常由微粒(即微球、纳米球、微胶囊或纳米胶囊)形成，其中微球和纳米球通常是聚合物基质的整体颗粒，其中配制剂被捕获，吸附或以其他方式包含，而在微胶囊和纳米胶囊的情况下，配制剂实际上是包囊的)。这些微粒的大小的上限为约5μ至约10μ。

适合于治疗眼的眼科软膏包括在合适的基底，例如矿物油、液体羊毛脂、白凡士林、前述两种或所有三种的组合，或聚乙烯-矿物油凝胶中的一种或多种本发明的化合物。可以任选地包含防腐剂。

适合于治疗眼的眼用凝胶包括悬浮在亲水性基质，例如Carpobol-940或乙醇、水和丙二醇的组合(例如，比率为40:40:20)中的一种或多种本发明的化合物。使用胶凝剂，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或氨化甘草酸盐。可以任选地包含防腐剂和/或张力剂。

适合于治疗眼的水凝胶通过掺入可溶胀的凝胶形成聚合物，例如上文作为增稠剂或粘度增强剂列出的那些凝胶形成聚合物形成，只是本领域称为“水凝胶”的配制剂通常比称为“增稠”溶液或悬浮液的配制剂具有更高的粘度。与此类预先形成的水凝胶相反，也可以制备配制剂，以便在施用于眼后原位形成水凝胶。此类凝胶在室温是液体，但在较高温度是凝胶(因此称为“热可逆”水凝胶)，例如当与体液接触时。赋予此性质的生物相容性聚合物包括丙烯酸聚合物和共聚物，N-异丙基丙烯酰胺衍生物和环氧乙烷和环氧丙烷的ABA嵌段共聚物(通常称为“泊洛沙姆”，并且以商品名可购自BASF-Wayndotte)。

优选的分散体是脂质体，在此情况下，配制剂被包封在脂质体(由交替的水性区室和脂质双层构成的微观囊泡)内。

滴眼剂可以用还包含一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性或非水性基质配制。滴液可以通过简单的滴眼管-加盖瓶或通过塑料瓶递送，所述塑料瓶适合于通过特殊形状的闭合件逐滴递送液体内容物。

本发明化合物还可以通过插入眼中的药物浸渍的固体载体局部施用。药物释放通常通过聚合物的溶解或生物侵蚀、渗透或其组合来实现。可以使用几种基质型递送系统。此类系统包括浸渍或浸泡有期望的本发明化合物的亲水性软性隐形眼镜，以及放置在眼中后不需要除去的可生物降解或可溶性装置。这些可溶性眼用插入物可以由可以被眼容许并且与待施用的本发明化合物相容的任何可降解物质构成。此类物质包括但不限于聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、丙烯酸乙酯和乙烯基吡咯烷酮的聚合物和共聚物，以及交联多肽或多糖，例如几丁质。

用于本发明化合物的其他类型的局部施用(即，不针对眼)或用于透皮施用的剂量形式包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片、滴剂和吸入剂。活性成分可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，并与任何可能需要的缓冲剂或推进剂混合。除活性成分外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶可以含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮类、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。除活性成分外，粉剂和喷雾剂可以含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外含有常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷。透皮贴片具有提供本发明化合物向身体的受控递送的附加优点。此类剂量形式可以通过将一种或多种本发明化合物溶解、分散或以其它方式掺入适当的介质如弹性体基质材料中来制备。吸收增强剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制此类通量的速率。经药物浸渍的固体载体(例如敷料)也可以用于局部施用。

药物配制剂包含适合于通过吸入或吹入的施用或鼻施用的那些药物配制剂。为了通过吸入施用到上(鼻)或下呼吸道，本发明的化合物方便地从吹入器、喷雾器或加压包装或其他方便的递送气溶胶喷雾的手段递送。加压包装可以包含合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀递送计量的量来确定。

或者，对于通过吸入或吹入的施用，组合物可以采取干粉末形式，例如，一种或多种本发明化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂量形式在例如胶囊或药筒中，或者例如可以借助于吸入器、吹入器或计量剂量吸入器施用粉末的明胶或泡罩包装中呈现。

对于鼻内施用，本发明化合物可以通过滴鼻剂或液体喷雾施用，例如通过塑料瓶雾化器或计量剂量吸入器施用。液体喷雾剂方便地从加压包装中递送。典型的雾化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。

可以用还含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性或非水性基质配制鼻滴剂。滴液可以通过简单的滴眼管-加瓶盖或通过塑料瓶递送，所述塑料瓶适合于通过特殊形状的闭合件逐滴递送液体内容物。

适合于胃肠外施用的本发明药物组合物包含一种或多种本发明化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等张水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂，或可以刚好在使用前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，所述无菌可注射溶液或分散液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、与意图接受者的血液等张的溶质或悬浮剂或增稠剂。此外，可以使用经药物包被的支架。

可以在本发明的药物组合物中采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，可以通过使用涂层材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可以含有佐剂，如润湿剂、乳化剂和分散剂。还可以期望在组合物中包含等张剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。

在某些情况下，为了延长药物的效果，期望减缓从皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，其继而可以取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性媒介物中来实现胃肠外施用药物的延迟吸收。

通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊状基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库可注射配制剂。可注射材料可以例如过滤通过细菌截留滤器来灭菌。

配制剂可以在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈现，并且可以在冻干条件下贮存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以从上文描述的类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

如本文呈现的实施例中所公开，提供了下述证据，即本发明的LMWFHSA组合物(对于某些实施方案，在本文中也称为“LMWF5A”)在体外降低内皮通透性。通透性测定法证明了用LMWFHSA处理HREC减少了大分子溶质的通过，并且针对细胞旁途径提供保护，所述细胞旁途径伴随延伸培养中的培养基耗竭。这些变化与α-微管蛋白乙酰化的增加是同时的，这暗示微管动力学参与LMWFHSA的所述活性。

微管的主要功能之一是提供细胞内运输所必需的支架形成(scaffolding)。动力蛋白和驱动蛋白分子马达当它们探索胞质以递送货物时沿着这些动力学聚合物追踪(Etienne-Manneville S.From signalling pathways to microtubule dynamics:thekey players.Curr Opin Cell Biol 2010；22:104-111)。已经充分证明，微管蛋白的乙酰化控制驱动蛋白的亲和力和转运的方向性两者(Wloga D,Gaertig J.Post-translationalmodifications of microtubules.Journal of cell science 2010；123:3447-3455；ReedNA,et al.Microtubule acetylation promotes kinesin-1binding and transport.CurrBiol 2006；16:2166-2172)。因此，LMWFHSA诱导的微管乙酰化似乎减少了HREC中的转胞吞和基底外侧运输。为了支持这点，观察到在用LMWFHSA攻击后HREC单层间的阻力略微降低。虽然违反直觉，但已经证明通过阻断发动蛋白抑制内皮细胞中的转胞吞伴随着细胞旁通透性的增加(Armstrong SM,et al.Co-regulation of transcellular and paracellularleak across microvascular endothelium by dynamin and Rac.Am J Pathol 2012；180:1308-1323)。结合驱动蛋白或动力蛋白的siRNA敲低减少白蛋白的跨内皮转运的事实(Mehta D,Malik AB.Signalling mechanisms regulating endothelialpermeability.Physiological reviews2006；86:279-367)，似乎可能的是改变的运输有助于观察到的LMWFHSA诱导的大分子通透性降低。

微管网络和肌动蛋白细胞骨架之间存在密切关系，其也可能联系LMWFHSA诱导的α-微管蛋白乙酰化与细胞旁通透性。在微管的脱稳定化后观察到的细胞旁通透性可以归因于共定位的GTP酶交换因子。GEF-H1在微管降解后释放，并且已经显示参与血管通透性的Rho依赖性增加(Bogatcheva NV,Verin AD.The role of cytoskeleton in theregulation of vascular endothelial barrier function.Microvasc Res 2008；76:202-207)。相反，稳定化隔离GEF-H1以及吸收促进伸长的另一种交换因子EPAC(BogatchevaNV,Verin AD.Therole of cytoskeleton in the regulation of vascular endothelialbarrier function.Microvasc Res 2008；76:202-207)。因此，用LMWFHSAP处理后看到的微管乙酰化的延长升高可以转换GTP酶活性并且可以解释在TEER测定法中观察到的晚期效应。

从机制上讲，LMWFHSA诱导的微管蛋白乙酰化可以受PI3-激酶和p38MAPK反转控制。在下面的实施例中，PI3-激酶的药理学抑制减少，而p38抑制协同增强处理后的乙酰化。在成纤维细胞的前沿处微管的PI3-激酶稳定化对于迁移是必需的(Onishi K,et al.ThePI3K-Akt pathway promotes microtubule stabilization in migratingfibroblasts.Genes Cells2007；12:535-546)。p38抑制对抗TNFα诱导的肺动脉内皮细胞中的微管破坏(Petrache I,et al.The role of the microtubules in tumor necrosisfactor-alpha-induced endothelial cell permeability.American Journal ofRespiratory Cell and Molecular Biology 2003；28:574-581)。令人感兴趣的是，PI3-激酶抑制增加了肿瘤细胞对用长春新碱的微管解聚的敏感性(Fujiwara Y,et al.Blockadeof the phosphatidylinositol-3-kinase-Akt signalling pathway enhances theinduction of apoptosis by microtubule-destabilizing agents in tumor cells inwhich the pathway is constitutively activated.Mol Cancer Ther2007；6:1133-1142)。这似乎也适用于阻断PI3-激酶的其他细胞功能促进VEGF诱导的内皮细胞活化和凋亡(Gratton JP,et al.Akt down-regulation of p38signalling provides a novelmechanism of vascular endothelial growth factor-mediated cytoprotection inendothelial cells.J Biol Chem2001；276:30359-30365)。此外，PI3-激酶通过抑制p38MAPK信号传导在小鼠模型中针对呼吸机诱导的血管通透性提供保护(Peng XQ,etal.Protective role of PI3-kinase/Akt/eNOS signalling in mechanical stressthrough inhibition of p38mitogen-activated protein kinase in mouse lung.ActaPharmacol Sin2010；31:175-183)。因此，HREC的LMECFHSA治疗可以导致赖氨酸-40特异性脱乙酰酶的直接抑制和/或经由PI3-激酶介导的级联对p38MAPK的下调。

本发明的LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂可以与一种或多种适合于治疗疾病或状况的其他治疗或药物联合给予。例如，LMWFHSA和一种或多种p38MAPK抑制剂可以在其他治疗或药物之前，与其他治疗或药物一起(包括同时)或之后施用。在另一种药物的情况下，药物和LMWFHSA以及一种或多种p38MAPK抑制剂可以在分开的药物组合物中或作为相同药物组合物的一部分施用。

本发明还提供试剂盒。试剂盒包括容纳本发明的LMWFHSA以及一种或多种p38MAPK抑制剂的容器。试剂盒可以进一步包含一个或多个另外的容器，每个容器容纳一种或多种适用于本发明方法的其他药物。合适的容器包括小瓶、瓶(包括带有滴管的瓶或挤压瓶)、泡罩包装、吸入器、广口瓶、喷雾器、小包(例如，由箔、塑料、纸、塞璐玢或另一种材料制成)、注射器和管。试剂盒还包含施用LMWFHSA和p38MAPK抑制剂以及任选地适用于本发明方法的一种或多种其他药物的用法说明。例如，用法说明可以印刷在容纳容器的包装上，可以印刷在附在试剂盒或容器的标签上，或者可以印刷在试剂盒中包含或与试剂盒一起包含的不同纸页上。容纳容器的包装可以是例如盒，或者容器可以包裹在例如塑料收缩包装中。试剂盒还可以含有本领域已知并且从商业和用户的角度来看可以期望的其他材料。例如，试剂盒可以含有帮助患者管理他/她的糖尿病或高血压的用法说明。

如本文所用，“一个”或“一种”表示一个/种或多个/种。

如本文所用，“包含”和“包括”在其范围内包括所有较窄的术语，例如“基本上由......组成”和“由......组成”作为本文中以“包含”或“包括”表征的本发明的备选实施方案。就“基本上由......组成”的使用而言，该短语将权利要求的范围限于规定的步骤和材料以及不实质上影响本文公开的本发明的基本和新颖特征的那些步骤和材料。本发明的基本和新颖特征可以是在动物中抑制血管高通透性，调节内皮细胞的细胞骨架或两者。

通过考虑以下非限制性实施例，本发明的其他目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

实施例

以下实施例证明用LMWF5A(“LMWFHSA”)处理的人视网膜内皮细胞(HREC)在培养后期表现出减少的辣根过氧化物酶(HRP)传递以及增加的跨内皮电阻(TEER)。这伴随着乙酰化α-微管蛋白的量和分布的快速增加。钙消耗和对PI3-激酶的抑制减少了LMWFHSA诱导的乙酰化，而p38MAPK抑制加强了此种效应。

通过追踪在24小时内辣根过氧化物酶(HRP)穿过多孔插入物上培养的人视网膜内皮细胞(HREC)的传递来评估大分子通透性。为了进一步探索通透性，在电极阵列室中监测跨内皮电阻(TEER)达48小时。另外，通过免疫荧光染色和免疫印迹测定α-微管蛋白的乙酰化。

试剂

除非另有说明，否则所有试剂均购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。SB203580获自ThermoFisher Scientific(Waltham,MA)。商业5％HSA的<5kDa滤液由AmpioPharmaceuticals(Englewood,CO)使用切向流过滤(TFF)和5kDa MWCO Hydrosart滤膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH,Germany)分离，并且也称为LMWFHSA a或LMWF5A。

原发性视网膜内皮细胞

购自Cell Systems(Kirkland,WA)的原代人视网膜内皮细胞(HREC)在如推荐补充的EGM-2生长培养基(Lonza,Walkersville,MD)中培养，并在第6至9代使用。

内皮通透性测定法

HREC在用10μg/cm²纤连蛋白包被的0.1μm孔转孔插入物(Thincerts；Greiner,Monroe NC)中培养至汇合。然后添加含有盐水、生理盐水中的福司柯林(10μM终浓度)或与EGM-2培养基相等混合的LMWFHSA的培养基。为了测量大分子通透性，将链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP；ThermoFisher Scientific)以42ng/ml的终浓度添加到上室中。24小时后，通过从底部室吸取10μl并与100μL四甲基联苯胺底物溶液(ThermoFisherScientific)混合来评估比色分析。5分钟后，用100μL 0.18M H₂SO₄终止反应，并在450nm处测量吸光度(Spectra Max M₂ ^e微板阅读器；Molecular Devices,Sunnyvale,CA)。通过在EGM-2培养基中与ECIS Ztheta system(Applied Biophysics,Troy NY)连接的经纤连蛋白包被的8W10E+电极阵列上培养HREC至汇合来测量电阻变化。然后，用盐水或与EGM-2相等混合的LMWF5A替换溶液，并在4000Hz监测阻抗48小时，数据呈现为标准化电阻。

免疫荧光染色

在用EGM-2中的2％明胶包被的玻璃底24孔组织培养板(Cellvis,Mountain View,CA)上培养HREC。然后，用500μL盐水、盐水中制备的要测试的化合物的2倍工作稀释液、或LMWFHSA的组合与500μl EGM-2一起交换培养基，并温育指定的时间。处理后，用10％中性缓冲福尔马林固定细胞10分钟，并且用PBS中的0.1％Triton X-100透化5分钟。使用PBS制备的4％山羊血清(ThermoFisher Scientific)封闭细胞1小时，然后于4℃将细胞暴露于封闭溶液中的抗乙酰化α-微管蛋白克隆6-11B-1抗体(1:1000；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)过夜。然后，添加缀合有Alexa fluor 488的抗小鼠IgG(1:1000；Invitrogen,Carlsbad,CA)达1小时，然后进行DAPI反染色(PBS中300nM；ThermoFisherScientific)达5分钟。在倒置显微镜(Zyla sCMOS相机；Andor,South Windsor,CT和eclipse Ti；Nikon,Melville,NY)上拍摄随机选择的帧，并使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ij)测量荧光强度(Schneider CA,et al.NIH Image to ImageJ:25yearsof image analysis.Nature methods2012；9:671-675)。对于标准化，确定每个帧的DAPI染色核的数目，并将数据作为中值FU/DAPI对象呈现。

免疫印迹分析

在经2％明胶包被的6孔培养皿上将HREC培养至汇合，然后如对免疫荧光染色所描述的那样处理，相应地进行体积缩放。处理后，在100μl裂解缓冲液(Qproteome MammalianProtein kit；Qiagen,Valencia,CA)中根据制造商的用法说明裂解细胞，并通过以12,000xg的冷却的4℃离心10分钟澄清。通过在煮沸还原缓冲液(Bolt Reducing Buffer)和煮沸LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific)中煮沸后的SDS-PAGE分离溶胞物。使用小鼠抗乙酰化α-微管蛋白克隆6-11B-1和山羊抗肌动蛋白抗体混合物(1:1000；Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)，然后缀合有Alexa fluor 594的鸡抗小鼠IgG和缀合有Alexa fluor 488的鸡抗山羊IgG抗体混合物(1:1000；Invitrogen,Carlsbad,CA)进行蛋白质印迹分析。免疫印迹在具有适当滤器组的成像站(Carestream Health,Rochester,NY)上显现。

数据分析

使用事后Bonferroni校正进行单因素ANOVA检验，并以设置为0.05的显著性使用Excel(Microsoft；Redmond,WA)构建95％置信区间。

实施例1：LMWFHSA对视网膜内皮细胞通透性的影响

为了评估LMWFHSA对血管通透性的影响，采用两种体外测定法。首先，在多孔转孔插入物上建立的汇合的HREC单层间测定HRP的通过。如图1A所看到，与盐水处理的对照相比，LMWFHSA(“LMWF5A”)显著降低此模型中的HRP通透性达48％(p<0.025；n＝3)。通过用10μM福司柯林处理实现类似的降低。

已经确立LMWFHSA降低了大分子通透性，然后在处理后监测跨内皮电阻达48小时。在此测定法中，在暴露于LMWFHSA后观察到电阻的立即增加，持续30分钟，随后与盐水相比减少2-5％达约15小时(图1B)。然而，24小时后，经LMWFHSA处理的细胞表现出电阻增加，其持续到实验完成。总之，这些数据提示LMWFHSA处理最初减少转胞吞作用，然后提供保护而免于与培养基耗竭对应的屏障功能的分解。

实施例2：LMWFHSA诱导HRECα-微管蛋白乙酰化的时间和表型变化

先前的研究证明了LMWFHSA处理骨髓来源的间充质干细胞导致与围绕细胞外周形成丝足(filopodia)样突起同时发生的细胞质应力纤维的减少(Bar-Or D,et al.LowMolecular Weight Fraction of Commercial Human Serum Albumin InducesMorphologic and Transcriptional Changes of Bone Marrow-Derived MesenchymalStem Cells.Stem Cells Transl Med2015；4:945-955)。然而，在HREC中，在处理后未观察到f-肌动蛋白的可评估的变化(数据未显示)。相反，免疫荧光(IF)染色揭示，暴露于LMWFHSA后3小时，HREC表现出α-微管蛋白乙酰化(微管稳定化的感知标记物)的显著增加(图2A)。图2B描绘了代表性的IF实验，其中跟踪LMWFHSA诱导的微管蛋白乙酰化的时间变化。在所有测试时间点时观察到相对于盐水对照的显著增加(p<0.01；n＝6)：30分钟时1.5倍，3小时时1.8倍，6小时时1.7倍，和24小时时1.3倍。通过蛋白质印迹分析证实这些发现(图2C)。此外，此技术提供了检测10分钟后出现的乙酰化增加的灵敏度。

IF还显示了LMWFHSA改变HREC中乙酰化微管蛋白的分布(图3)。当在更高放大率下观察时，盐水对照中的乙酰化α-微管蛋白主要位于细胞核周围的微管组织中心。相反，经LMWFHSA处理的HREC表现出升高的细胞质和核周染色。

实施例3：LY294002(PI3-激酶抑制剂)减少LMWFHSA诱导的α-微管蛋白乙酰化，而SB203580(p38MAPK抑制剂)增强LMWFHSA诱导的α-微管蛋白乙酰化

本实施例评估了抑制PI3-激酶和抑制p38MAPK对LMWF5A诱导的HREC的α-微管蛋白乙酰化的影响。在特异性抑制剂存在下用LMWFHSA处理HREC，并在3小时后进行IF。如图4A所看到，用10μM LY294002抑制PI3-激酶降低了LMWFHSA诱导的乙酰化(相对于LMWF5A+DMSO，p＝0.025；n＝6)。当对一式三份进行的四个分开实验计算抑制百分比时，发现LY294002使LMWFHSA诱导的乙酰化降低24％(95％CI 29-19)。相反，相对于盐水-DMSO对照(p<0.01；n＝6)和LMWF5A-DMSO(p<0.025；n＝6)处理的细胞两者，用SB203580抑制p38MAPK分别使α-微管蛋白乙酰化显著增加57％(95％CI 63-51)和222％(95％CI 236-208)。当通过蛋白质印迹分析时出现类似的模式(图4B)。

本文引用的所有文献均通过引用并入本文。

虽然已经详细描述了本发明的各种实施方案，但是显而易见的是，本领域技术人员将想到那些实施方案的修改和改编。然而，应当明确理解，此类修改和改编都在本发明的范围内，如所附示例性权利要求书中所述。

Claims (29)

1.抑制有此需要的动物中的血管高通透性的方法，其包括对所述动物施用有效量的：

(i)通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白制备的药物组合物；和

(ii)一种或多种p38MAPK抑制剂。

2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种p38MAPK抑制剂选自下组：SB 203580、SB203580盐酸盐、SB 202190、SB 239063、SB 706504、AL 8697、AMG 548、CMPD-1、DBM 1285二盐酸盐、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ 67657、SCIO 469盐酸盐、SKF 86002二盐酸盐、SX011、TA 01、TA 02、TAK 715、VX 702、VX 745、p38MAPK抑制剂TOCRISET^TM及其组合。

3.权利要求1的方法，其中所述动物具有由血管高通透性介导的疾病或状况。

4.权利要求3的方法，其中在诊断所述疾病或状况后立即开始施用所述药物组合物和所述一种或多种p38MAPK抑制剂。

5.权利要求3的方法，其中所述疾病或状况是眼部疾病。

6.权利要求3的方法，其中所述疾病或状况是糖尿病的血管并发症。

7.权利要求6的方法，其中所述血管并发症是水肿、内皮下间隙中低密度脂蛋白积累、加速性动脉粥样硬化、脑血管壁加速老化、心肌水肿、心肌纤维化、舒张期功能障碍(diastolic dysfunction)、糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy)、糖尿病母亲胎儿肺发育迟缓(retardation of lung development in the fetuses of diabeticmother)、一个或多个肺生理参数的改变、对感染的易感性增加、肠系膜中血管增生(vascular hyperplasy in the mesentery)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema)、糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)，或皮肤发红、变色、干燥和溃疡。

8.权利要求7的方法，其中所述血管并发症是水肿。

9.权利要求7的方法，其中所述血管并发症是糖尿病性心肌病。

10.权利要求7的方法，其中所述血管并发症是糖尿病性神经病变。

11.权利要求7的方法，其中所述血管并发症是糖尿病性黄斑水肿。

12.权利要求7的方法，其中所述血管并发症是糖尿病视网膜病变。

13.权利要求12的方法，其中所述糖尿病视网膜病变是非增殖性糖尿病视网膜病变(nonproliferative diabetic retinopathy)。

14.权利要求3的方法，其中所述血管并发症是糖尿病性肾病。

15.权利要求3的方法，其中所述疾病或状况是急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)、年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration)、动脉粥样硬化、脉络膜水肿(choroidal edema)、脉络膜炎(choroiditis)、冠状微血管疾病(coronary microvascular disease)、脑微血管疾病(cerebralmicrovascular disease)、糖尿病、Eals病、由损伤引起的水肿、与高血压有关的水肿、肾小球血管渗漏(glomerular vascular leakage)、失血性休克(hemorrhagic shock)、高血压、欧文-加斯综合征(Irvine Gass Syndrome)、缺血，黄斑水肿、肾炎、肾病、肾病性水肿(nephrotic edema)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、神经病(neuropathy)、由水肿所致的器官衰竭、先兆子痫、肺水肿、肺动脉高血压(pulmonary hypertension)、肾衰竭、视网膜水肿、视网膜出血(retinal hemorrhage)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion)、视网膜炎、视网膜病变(retinopathy)、无症状脑梗死(silent cerebral infarction)、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome)、移植物肾小球病(transplant glomerulopathy)、葡萄膜炎(uveitis)、血管渗漏综合征(vascular leakagesyndrome)，玻璃体出血(vitreous hemorrhage)或Von Hipple Lindau病。

16.权利要求15的方法，其中所述疾病或状况是黄斑水肿。

17.权利要求15的方法，其中所述疾病或状况是神经病。

18.权利要求15的方法，其中所述疾病或状况是视网膜病变。

19.权利要求1的方法，其中由于由血管高通透性介导的疾病或状况的一种或多种早期体征或形成的素因，所述动物需要所述药物组合物和所述一种或多种p38MAPK抑制剂。

20.权利要求19的方法，其中所述疾病或状况是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化或眼部疾病。

21.权利要求1的方法，其中所述血管高通透性是在脑、膈(diaphragm)、十二指肠肌肉组织(duodenal musculature)、脂肪、心脏、肾、大血管、肺、肠系膜(mesentery)、神经、视网膜、骨骼肌、皮肤或睾丸中或周围找到的连续内皮的血管高通透性。

22.权利要求21的方法，其中所述连续内皮在脑、心脏、肺、神经或视网膜中或周围找到。

23.权利要求1的方法，其中所述血管高通透性是在肾、胰腺、肾上腺、内分泌腺或肠中或周围找到的有孔内皮(fenestrated endothelium)的血管高通透性。

24.权利要求23的方法，其中所述有孔内皮在肾脏中找到。

25.权利要求1的方法，其中除去所述白蛋白的步骤包括通过选自超滤、蔗糖梯度离心、层析、盐沉淀和超声处理的分离方法处理所述人血清白蛋白组合物。

26.权利要求25的方法，其中除去步骤包括使所述人血清白蛋白组合物通过具有保留所述白蛋白的分子量截留的超滤膜，并且其中所得滤液包含DA-DKP。

27.药物组合物，其包含通过从人血清白蛋白组合物中除去白蛋白来制备的组合物和一种或多种p38MAPK抑制剂，用于治疗由血管高通透性介导的疾病或状况和/或用于抑制血管高通透性。

28.权利要求27的组合物，其中所述一种或多种p38MAPK抑制剂选自SB 203580、SB203580盐酸盐、SB 202190、SB 239063、SB 706504、AL 8697、AMG 548、CMPD-1、DBM 1285二盐酸盐、EO 1428、JX 401、ML 3403、RWJ 67657、SCIO 469盐酸盐、SKF 86002二盐酸盐、SX011、TA 01、TA 02、TAK 715、VX 702、VX 745、p38MAPK抑制剂TOCRISET^TM及其组合。

29.权利要求27的组合物，其中所述疾病或状况是眼部疾病。