CN1938025A - 影响血管生成的化合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

通过向一组细胞、组织或有机体施用一种化合物可以影响血管生成。这种影响可以是抑制或刺激血管生成。所述化合物可以用于治疗与血管生成不足或不受调控相关的疾病状态。

Description

影响血管生成的化合物及其使用方法
技术领域
本发明涉及可用于促进或抑制血管生成的化合物和涉及含有影响血管生成化合物的药物组合物，其可用于多种与血管生成相关的疾病。本发明进一步涉及这种影响血管生成化合物的使用方法。
背景技术
血管生成是形成新血管的基本过程。这个过程涉及血管内皮细胞迁移到组织中，然后这些内皮细胞聚集成血管。血管生成可以经血管生成剂诱导或是自然条件的结果。血管生成或其缺乏在多种病理状态中发挥重要的作用。这些状态中一些的特征在于新血管生成，例如，癌症、糖尿病视网膜病、青光眼和年龄相关的黄斑变性。其它，例如，中风、不孕、心脏病、溃疡和硬皮病，是血管生成不充分的疾病。
血管生成有许多阶段(见，例如，Zhu and Witte，Invest New Drugs 17：195-212，1999)。血管生成的早期阶段包括内皮细胞蛋白酶产生、细胞迁移、和增殖。早期阶段也显示出需要一些生长因子。血管生成的更晚阶段包括血管和壁细胞的集聚、基底膜的产生和血管床特化的诱导。血管形成的最后阶段包括重建，其中形成中的脉管系统变成稳定的、成熟的血管床。因此，过程是高度动态的，经常需要协调的空间和时间的基因表达波。
复杂的血管生成过程容易通过干扰一个或多个关键步骤而被破坏，并且许多疾病状态可以因该破坏而产生或被其恶化。失控的血管生成可以引起或恶化疾病，例如，眼部新血管生成被认为是失明的最常见原因并且是大约20种眼病的病理基础。在某些先前存在的病况如关节炎中，新形成的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃体，引起出血和失明。
除了与失控血管生成关联的病理外，不充分的血管生成也导致不期望的结果。死的或被破坏的组织可以导致很多疾病，被破坏组织的血管再生直至健康、正常的血管生成过程对预防进一步并发症是关键的。
因此，在医学领域中已经认识到，影响血管生成的化合物具有治疗很多疾病状态和作为研究工具的潜力。研究人员已经在鉴定和利用天然的影响血管生成的分子方面取得一些进展。在鉴定能用于影响血管生成的化合物上也取得一些进展。但是经常发现那些有希望影响血管生成的化合物具有不能接受的毒性特征，其制造非常困难或昂贵，或者两者都有。不管当前的知识水平和可用的治疗方法，在本领域内仍然需要能用于影响血管生成或者预防或治疗血管生成相关病况的进一步的药物或化合物。
派克昔林最初被用于处理心绞痛。尽管有一些积极效果，对肝和神经的不良作用也与施用派克昔林有关。最初被分类为冠状血管扩张剂被修改为钙通道拮抗剂，但是最近的数据显示它可能是通过抑制肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)起作用的心脏代谢剂。Killalea S.M.和Krum H.在Am.J.Cardiocasc.Drugs，2001；1(3)：193-204中描述了用派克昔林处理严重心肌缺血的评价。
红霉素由一种红色链霉菌(Streptomyces erythraeus)菌株产生，其属于大环内酯类抗生素。它是碱性的，容易与酸形成盐，然而具有微生物活性的是其碱。它主要通过局部或口服给药治疗细菌感染。因为这种药用于人的实质性历史，期望它可作为阐明任何进一步应用的候选物。一些最近的研究已经表明红霉素可能具有新用途，例如，见Yatsunami J，et al.，Inhibitory effects of roxithromycin on tumor angiogenesis，growth and metastasis of mouse B16 mlanoma cells，Clin Exp Metastasis.1999 Mar；17(2)：119-24；Yatsunami J，et al.，Inhibition of tumor angiogenesis by roxithromycin，a 14-membered ring macrolide antibiotic，Cancer Lett.1998 Sep 25；131(2)：137-43；Yatsunami J，et al.，Clarithromycin is a potent inhibitor of tumor-inducedangiogenesis，Res Exp Med(Berl)，1997；197(4)：189-97。
多巴胺调节剂是已知的并且很多已经有效地用于患者。例如，甲磺酸溴隐亭(溴隐亭)是一种麦角碱衍生物，其具有强效的多巴胺受体拮抗活性。它可以用在多种其它应用中，比如不孕，但是它潜在的所有应用范围仍然没有被阐明。相似的，在相关文献中描述了依替必利和稠环乙脲调控多巴胺的能力。多巴胺和多巴胺受体-2选择性激动剂比如溴隐亭已经在下文中显示可阻止血管生成：Basu S et al.，Theneurotransmitter dopamine inhibits angiogenesis induced by vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor，Nat Med.2001 May；7(5)：569-74。依替必利没有显示出对血管生成的影响。
在本领域内也已知存在抗霉菌剂。例如，由于它们的抗真菌活性，咪康唑、硫康唑和益康唑已知是因为它们的抗真菌活性已经被用于多种治疗中的物质。咪康唑也许是最为人所知的，但是硫康唑也是一种抗霉菌剂，其是一种具有广谱抗真菌活性的咪唑衍生物。它的抗其它微生物的能力正在研究中。象其它抗真菌剂一样，益康唑典型的被局部施用。当这样做时，只有非常低剂量的活性物质被吸收。这在阐明其它用途和应用益康唑于那些有前景的其它用途时是一种障碍。
进一步说，抗雄激素已经被提供，其实例包括氟利坦和达那唑。氟利坦已经被成功用来抑制雄激素，然而，存在与其应用相关的肝伤害的严重和确实的风险。肝衰竭和死亡已经被报导，典型的是在应用氟利坦的起先几个月内。尽管这样，确定氟利坦其它一些潜在的有益的用途是有根据的。合成激素达那唑，源自妊娠素，由于它在口服施用后快速和广泛的代谢，其是一种理想的药物。不像主要用于男性患者的氟利坦，达那唑提供了在男性和女性对象中的临床数据的优点。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供影响血管生成的化合物。本发明进一步的目的是提供影响血管生成化合物的使用方法。本发明的另一个目的是阐明已知化合物的新用途。
根据第一个实施方案，其提供抑制一组细胞、组织或有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的派克昔林或红霉素与至少一种抗VEGF治疗的组合或其药物能接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。有机体可以是哺乳动物，并且哺乳动物可具有选自以下的病况：癌、肉瘤、视网膜病变、黄斑变性、角膜溃疡、硬皮病、Berger’s病、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎性肠病、牛皮癣、肉状瘤病和类风湿性关节炎。化合物可以被局部施用。
根据进一步的实施方案，提供抑制一组细胞、组织或有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的药物组合物，其包含派克昔林或红霉素与至少一种抗VEGF治疗的组合、或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。有机体可以是哺乳动物，并且哺乳动物可具有选自下组的病况：癌、肉瘤、视网膜病变、黄斑变性、角膜溃疡、硬皮病、Berger’s病、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎性肠病、牛皮癣、肉状瘤病和类风湿性关节炎。化合物可以被局部施用。药物组合物被配制为油膏(salve)、凝胶、软膏(ointment)、贴剂(patch)、注射剂、口服溶液或悬液并且药物组合物可以在控释基质中。药物组合物可以进一步包含药物可接受的载体、稀释剂、介质(vehicle)或赋形剂。在药物组合物含有派克昔林的地方，所述方法可以进一步包括向该组细胞、组织或有机体施用至少一种抗VEGF治疗。抗VEGF治疗可以是AVASTIN和MACUGEN。
根据进一步实施方案，提供一种刺激一组细胞、组织和有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的化合物，其选自溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。有机体可以是哺乳动物。哺乳动物可以具有选自以下的病况：中风、缺血性心脏病、伤口愈合、缺血、心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定性心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化和脑梗塞。化合物可以被局部施用。
根据进一步实施方案，提供一种刺激一组细胞、组织和有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的药物组合物，其包含选自以下的化合物：溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。有机体可以是哺乳动物。哺乳动物可以具有选自以下的病况：中风、缺血性心脏病、伤口愈合、缺血、心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定性心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化和脑梗塞。
根据进一步实施方案，提供一种增加向组织的血流的方法，其包括向组织施用可有效促进血管生成量的药物组合物，其包含选自以下的化合物：溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑。
为了方便，在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语被集中在此。
术语“患者”表示在本文中公开的新治疗方法的对象。
术语“组织”表示一组活细胞。在合适的地方，这个术语应该被理解为包括单个细胞和成组细胞。这个术语也可以被理解为包括器官。这个术语不但涉及原位的活物质，而且也涉及已经在体外培养或提取自有机体的活物质。
术语“动物”或“有机体”涉及哺乳动物，优选人。
术语“血管生成”意思是活细胞、组织或有机体形成新血管的过程。
术语“影响血管生成”意思是指在被处理的组织或有机体中影响血管生成的化合物或方法。例如，这种影响可以是抑制或促进血管生成。
词组“血管生成相关病况”表示任何一种医学状况或疾病状态，其被认为受血管生成或血管生成的增加/减少或其缺乏的影响，包括可以与未来血管生成相关的病况。这些病况的实例包括癌、肉瘤、视网膜病变、黄斑变性、角膜溃疡、中风、缺血性心脏病、不孕、溃疡、硬皮病、伤口愈合、缺血、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定性心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、Berger’s病、动脉栓塞、动脉血栓、脑血管闭塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、红变增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎性肠病、牛皮癣、肉状瘤病和类风湿性关节炎。
术语“刺激剂”表示启动、促进或增加所治疗组织或患者中天然或典型的(即未受影响的)血管生成的速度、持续期或程度的分子或化合物。
术语“抑制剂”表示停止、预防、降低、阻碍或延迟所治疗组织或患者中天然或典型的(即未受影响的)血管生成的分子或化合物。
正如在本文中使用的术语“药物”、“药用化合物”或“药”表示用于活细胞、组织、人或其它动物的任何药用物质。包括在这个定义内的有化合物类似物，天然存在和合成的化合物。
词组“药物可接受的”表示分子实体和组合物，当其施用于患者时，其是生理可耐受的并且不产生典型变态反应或类似的不期望反应。
在本文中使用的词组“治疗有效量”表示一种量，当作为理想给药方案的部分被施用时，其在某种程度上足以影响血管生成并导致一些临床显著的变化。当与血管生成抑制剂结合使用时，这个术语表示一种量，其将在所治疗的组织或患者中预防、或优选减少至少约30％、更优选至少约50％、最优选至少约90％的血管生成。当与血管生成刺激剂或促进剂结合使用时，这个术语表示一种量，其将在所治疗的组织或患者中启动、或优选增加至少约30％、更优选至少约50％、最优选至少约90％的血管生成。本文所述的指定化合物的对应“治疗有效量”的量将依赖一些因素变化，比如特定化合物、疾病状况和其严重性、需要治疗的哺乳动物身份，但是本领域的技术人员仍然很容易确定它。
“治疗”意思是指至少缓解哺乳动物如人的疾病状况，其是通过影响血管生成而被减轻，并包括：(a)哺乳动物的预防性治疗，特别是当发现哺乳动物容易具有疾病状况但仍未确诊时；(b)抑制疾病状况；和/或(c)全部或部分减轻疾病状况。
“药物可接受的前药”表示一种化合物，其在生理条件下或通过溶剂分解可以被转化成一种具有在本文中公开的化学式的化合物。
“药物可接受的活性代谢物”表示一种由本文公开的化学式的一种化合物通过生物代谢，比如在患者体内，产生的药物活性产物。
“药物可接受的溶剂合物”表示一种溶剂合物，其保持本文公开化学式的一种生物活性化合物的生物有效性和特性。药物可接受的溶剂合物的实例包括，但不限于，与水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸或乙醇胺组合的一种或多种本文公开的化合物。
“药物可接受的盐”表示一种盐，其保持本文所公开化合物的游离酸和碱的生物有效性和特性并且不是生物学或其它方面不期望的。药物可接受盐的实例包括，但不限于，硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐(methoxyenzoates)、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、萘基-1-磺酸盐、萘基-2-磺酸盐和扁桃酸盐。
如果本发明的化合物是一种碱，期望的盐可以通过本领域任一适合的已知方法制备，包括用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；所述有机酸比如醋酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖醛酸(pyranosidyl acids)比如葡糖醛酸和半乳糖醛酸、α-羟基酸比如柠檬酸和酒石酸、氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸、芳香酸比如苯甲酸和肉桂酸、磺酸比如对甲苯磺酸或乙磺酸等等。
如果本发明的化合物是一种酸，期望的盐可以通过本领域任一适合的已知方法制备，包括用无机或有机碱处理游离酸，比如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属或碱土金属氢氧化物等等。合适盐的示例性实例包括有机盐，其衍生自氨基酸比如甘氨酸和精氨酸、氨、伯胺、仲胺、叔胺、环胺比如哌啶、吗啉和哌嗪，和无机盐，其衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂。
在化合物、盐或溶剂合物是固体的情况中，本领域的技术人员应理解本发明的化合物、盐和溶剂合物可以以不同的晶形存在，所有这些都在本发明的范围内。
本发明的化合物可以作为单独的立体异构体、外消旋物和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物存在。所有这些单独立体异构体、外消旋物和其混合物都在本发明的范围内。优选本发明的化合物以光学纯形式使用。
正如本领域技术人员通常所理解的，光学纯化合物是一种对映体纯的化合物。正如在本文中所用的，术语“光学纯”意味着一种化合物，其包括至少充足量的单个对映异构体，得到具有期望药理活性的化合物。优选“光学纯”表示一种化合物，其包含至少90％的单个异构体，优选至少95％，更优选97.5％和最优选99％。
本发明也涉及影响血管生成的方法和治疗或预防血管生成相关病况的方法，这些方法或治疗包括使用本文公开化合物或其药物可接受的前药、盐、活性代谢物或溶剂合物。
本发明化合物作为血管生成作用剂的活性可通过本领域技术人员可用的任一方法测定，包括体内和体外检测。
本文公开化合物、或其药物可接受的前药、盐、活性代谢物和溶剂合物可以按照本领域技术人员所接受的任何可接受施用模式进行施用。适合的施用模式实例包括，但不限于，经口、鼻、胃肠道外、局部和透皮。
本文公开化合物可以作为药物组合物以技术人员认可的任何合适药物形式施用。合适的药物形式包括，但不限于，固体、半固体、液体或冻干制剂，比如片剂、粉剂、胶囊、悬液和气溶胶。药物组合物也可以包括合适的赋形剂、稀释剂，介质和载体，以及其它药物活性剂，这取决于应用目的。
可接受的制备药物组合物的合适药物形式的方法对本领域技术人员是已知的。例如，药物制剂可以按照药剂师的常规技术制备，其涉及步骤比如当制备片剂时必需的混合、造粒和压片，或者适当地混合、填充和溶解成分，用来得到期望的产物，用于，例如，口服、胃肠道外、局部、鼻内、支气管内和/或眼内施用。
固体或液体药物可接受的载体、稀释剂、介质或赋形剂可以应用于药物组合物中。固体载体的实例包括淀粉、乳糖、硫酸二氢钙、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例可包括醇、油、盐水和水。载体或稀释剂可以包括合适的长时间释放材料，比如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，其可以单独或与蜡一起。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆、酏剂、乳剂、软明胶胶囊、无菌注射液(例如溶液)或非水或水性液体悬液的形式。
药物组合物的剂量含有至少治疗有效量的活性化合物(既，本文描述的化合物或其药物可接受的前药、盐、活性代谢物或溶剂合物)和优选由一或多个药物剂量单位组成。所选药剂可以通过任一已知施用药剂的方法施用于需要影响血管生成治疗的哺乳动物例如人患者，所述施用方法包括局部，例如作为软膏或乳剂；口服；胃肠道外注射；或通过鼻内、支气管内、耳内或眼内持续输注。
附图说明
图1显示初步血管生成筛选测试的示例性的结果；
图2显示派克昔林马来酸酯的化学结构；
图3显示红霉素的化学结构；
图4A，4B和4C图示表示派克昔林的细胞增殖数据；
图5A，5B和5C图示表示红霉素的细胞增殖数据；
图6A，6B和6C显示派克昔林的细胞活力检测结果；
图7A，7B和7C显示红霉素的细胞活力检测结果；
图8A，8B和8C图示表示用派克昔林处理的B16F10细胞的细胞活力数据；
图9A，9B和9C图示表示用红霉素处理的B16F10细胞的细胞活力数据；
图10显示两种VEGFR-1抑制剂的IC50值；
图11A和11B分别显示派克昔林单独的和与VEGFR-1抑制剂结合的IC50值；
图12A和12B分别显示红霉素单独的和与VEGFR-1抑制剂联合的IC50值；
图13显示稠环乙脲(S)(-)的化学结构；
图14显示咪康唑的化学结构；
图15显示硫康唑的化学结构；
图16显示氟利坦的化学结构；
图17显示达那唑的化学结构；
图18显示稠环乙脲的细胞增殖数据；
图19显示咪康唑的细胞增殖数据；
图20显示氟利坦的细胞增殖数据；
图21显示达那唑的细胞增殖数据；
图22显示用选择化合物处理后，定量测定HUVEC的出芽；
图23显示联合使用VEGF和选择化合物处理后，定量测定HUVEC的出芽；
图24显示用选择化合物和VEGFR-1抑制剂处理后，定量测定HUVEC的出芽。
具体实施方式
以下实施例只用来举例说明本发明，但没有限制本发明的目的。如果来源没有具体说明，那么材料就是已知的并且可以从商业获得。
应该理解，由于其制造和使用，本发明的化合物可以具有与下列出不同的化学和结构性质。例如，在应用期间，化合物可经过一系列代谢变化，其产生的中间体的特征可以不在下文中所列举的某些参数范围内。然而，如果这些中间体和代谢终产物在施用前、施用中或施用后一个时间具有下文中具体指定的必要值，那么它们就仍然在本发明的范围内。
正如上面所指明的，本发明的化合物可以被用来影响血管生成。这种用途可以被限定于细胞或组织培养应用，以及向患者施用。为了确保向技术人员充分公开本发明，与鉴定要求保护的化合物相关的细节通过引用于此处的方式提供。当说明书中提供具体步骤或材料的目的时，这种目的是基于对目前作用机制的理解。这种描述是为了充分公开的目的；然而，本发明并不局限于本文所描述的理论。
初步血管生成筛选
HUVEC球状体评估
选择用来评估血管生成筛选的测试物质。测试物质被合成或适当获得并保存在-20℃的DMSO中。使用前，测试物质被融化并且将5mM测试物质稀释于内皮细胞基本培养基中的10倍浓缩工作溶液(100μM)中。基本培养基部分添加用于刺激HUVEC出芽的25ng VEGF/100μl。
筛选过程是Korff和Augustin(J Cell Sci 112：3249-58，1999)描述的修改版。概括的说，通过吸取400个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)到非附着96孔培养板的每个孔中制备球状体。使用前，HUVEC按照提供商的使用说明(PromoCell，Heidelberg，Germany)进行培养。让细胞过夜聚集成球状体(Korff and Augustin：JCell Biol 143：1341-52，1998)。聚集后，收获48个HUVEC球状体。每个所收集的球状体被接种到900μl甲基纤维素-胶原溶液中并且被吸取到24孔培养板的单个孔中让胶原凝胶聚合。
接种后30分钟，加入测试物质。应用工作稀释物(10倍浓度)，将100μl吸取到每孔中聚合胶原凝胶的顶部。随后培养板在37℃培育24小时。在培育期结束时，向培养板的每个孔加入1ml多聚甲醛(10％)进行固定。
HUVEC球状体通过显微镜检测内皮细胞(EC)出芽强度。通过与VEGF对照细胞出芽程度比较，EC出芽程度被划分成4组。这些组是：强烈抑制出芽(表明测试化合物是强烈的血管生成抑制剂)，抑制出芽只产生基芽(表明测试化合物是血管生成抑制剂)，超出VEGF对照出芽很多的出芽(表明测试化合物是血管生成刺激剂)或与VEGF对照出芽不可区分的出芽(在此测试化合物没有显示出效果)。实例性结果见图1。
NHDF球状体评估
对被划分为抑制剂或刺激剂的测试化合物，进行第二次筛选。在第二次筛选中，测试物质被融化并且将5mM测试物质稀释于内皮细胞基本培养基中的10倍浓缩工作溶液(100μM)中。基本培养基中没有添加物。
代替HUVEC，通过吸取400个人皮肤成纤维细胞(NHDF)到非附着96孔培养板的每个孔中制备球状体。使用前，NHDF按照提供商的使用说明(PromoCell，Heidelberg，Germany)进行培养。让细胞过夜聚集成球状体(Korff and Augustin：JCell Biol 143：1341-52，1998)。聚集后，收获48个NHDF球状体。每个所收集的球状体被接种到900μl甲基纤维素-胶原溶液中并且被吸取到24孔培养板的单个孔中让胶原凝胶聚合。
接种后30分钟，加入测试物质。应用工作稀释物(10倍浓度)，将100μl吸取到每孔中聚合胶原凝胶的顶部。随后培养板在37℃培育24小时。在培育期结束时，向培养板的每个孔中加入1ml多聚甲醛(10％)进行固定。
NHDF球状体通过显微镜检测成纤维细胞发散强度(scattering intensity)。成纤维细胞发散强度的程度被划分成4个组：强烈抑制发散(表明测试化合物是非特异性抑制剂)，抑制或仅轻微抑制发散(表明测试化合物是EC特异性抑制剂)，发散未受影响(表明测试化合物是EC特异性刺激剂)或发散增加(表明测试化合物是非特异性刺激剂)。实例性结果见图1。
血管生成抑制剂
如果测试化合物降低HUVEC出芽至只产生基芽或根本没有出芽，并且如果NHDF发散没有被影响或被轻微影响，化合物被认为是血管生成抑制剂。
派克昔林马来酸酯
派克昔林马来酸酯是一种这样的抑制剂。它的化学结构显示在图2中。它的CASNo.是6724-53-4，化学式结构是C23H39NO4，分子量是393.6。派克昔林马来酸酯表现出出芽抑制，但是没有成纤维细胞侵入作用，使得它是特异性血管生成抑制剂。
红霉素
红霉素是一种这样的抑制剂。它的化学结构显示在图3中。它的CAS No.是114-07-8，化学式结构是C37H67NO13，分子量是733.9。红霉素表现出出芽抑制，但是没有成纤维细胞侵入作用，使得它是特异性血管生成抑制剂。根据红霉素历史上的用途，并且即使根据最近的对这种化合物替代性应用的研究，这个发现是令人吃惊的。
通过鉴定上述化合物作为血管生成抑制剂，本发明人获得了可以抑制或预防血管生成的新的可用化合物。可以期望它预防、降低或停止具有特定疾病状态如癌的患者中的血管生成。作为替代，可以期望在其它健康动物或细胞/组织培养模型中阻止血管生成以进一步研究血管生成机制。
确定抑制的体外测试
细胞增殖测定
为了进一步确定上述使人吃惊的结果，在细胞增殖测定中检测化合物。用结晶紫测量细胞增殖；这种碱性染料使细胞核着色并且提供灵敏、快速的评价。未染色或脱染的细胞层的光吸收可以忽略不计，使得可以在孔中进行细胞数量测量。
6种细胞类型(HUVEC，HDMEC、SMC、成纤维细胞，A375和RENCA)被平板接种并以log2滴定法用化合物处理72小时。确定每种细胞类型的最佳细胞数量并在595nm测量光密度(OD)。每个数据点都测量4次。72小时后停止测定，随后进行分析。
从处理后获得的所有OD值中减去加入化合物前平板接种细胞的OD值。然后计算相对于对照增殖的百分率。因此负值代表比平板接种时更少的细胞计数。在下面的表1中给出IC50值。结果以相对于对照增殖的百分率表示。使用GraphPad Prism软件计算IC50(GraphPad Software，Inc.)。派克昔林的结果图示在图4A-4C中，红霉素的结果显示在图5A-5C中。
表1：在增殖检测中获得的IC50的总结
化合物                                        每种细胞类型IC50值
  HUVEC   HDMEC   SMC   成纤维细胞   A375 RENCA
派克昔林 1.0×10-5 1.1×10-5   1.4×10-5 1.2×10-5  2.5×10-5 7.6×10-6
    红霉素   ＞1×10-4   ～1×10-4   ＞1×10-4   ＞1×10-4   ＞1×10-4   5.6×10-5
细胞活力测定
通过基于细胞还原刃天青(resazurin)为荧光产物试卤灵(resorufin)进行细胞活力测定。活细胞可以代谢并还原染料，然而死细胞迅速丧失了这种能力，使得荧光增加与活细胞数成正比。按照log2滴定法加入测试化合物，并且在处理后24小时对活细胞进行分析。在激发波长560nm和发射波长590nm测定荧光。计算相对于未处理对照增殖的活细胞百分率。表2显示在细胞活力测定中获得的IC50值。派克昔林的结果显示在图6A-6C中，红霉素的结果显示在图7A-7C中。
表2：在细胞活力检测中获得的所选IC50结果的总结
化合物                            每种细胞类型的IC50值
HUVEC  HDMEC   SMC 成纤维细胞   A375  RENCA
  派克昔林 8.4×10-6  8.0×10-6   3.2×10-5 5.2×10-6   1.0×10-5  5.0×10-6
通过前述的两个测定，确定在增殖测定和活力测定中，当用派克昔林处理时，RENCA细胞比其它细胞类型更敏感。因此，随后对B16F10细胞进行检测。与RENCA模型相似，B16F10肿瘤模型是一种同位肿瘤模型。用派克昔林和红霉素处理B16F10细胞24和48小时后，IC50被测定为1.0×10-5 M；结果显示在图8和9中。
评价联合VEGF抑制剂的协同作用
3D血管生成测定适合测定具有很小变化的IC50。因此，将这种测定应用于单独的或与VEGFR-2抑制剂联合的测试化合物，来分析IC50变化。被检测的抑制剂是SU5614和PTK787/ZK222584。被应用的VEGFR-2抑制剂的浓度接近IC50。
SU5614的IC50＝4.2×10-6M并且此外已经描述于Sun L，et al.，Synthesis andbiological evaluation of 3-substituted indolin-2-ones：a novel class of tyrosine kinaseinhibitors that exhibit selectivity toward particular receptor tyrosine kinase.J MedChem.1998 Jul 2；41(14)：2588-603，并可以获得，例如从Calbiochem。PTK787/ZK222584(在图中有时被缩写为AG1)的IC50＝1.0×10-7M并且另外已经描述于Bold，G.et al.，New anilinophthalazines as potent and orally well absorbedinhibitors of the VEGF receptor tyrosine kinase useful as antagonists or tumor-drivenangiogenesis，J.Med.Chem.2000，43，2310-2323。
VEGFR-2抑制剂的IC50值在基于球状体的3D测定中被确定，见图10。当与AG1联合检测时派克昔林或红霉素被加到凝胶顶部，当与SU5614联合检测时派克昔林或红霉素被直接加入凝胶中，浓度分别显示在图11A和B以及图12A和B中。数据总结于表3中。
表3：在协同3D血管生成检测中获得的IC50的总结
化合物     无VEGFR-2抑制剂 有VEGFR-2抑制剂
  派克昔林     5.4×10-6     3.3×10-6
  红霉素     -     8.6×10-5
可以进一步进行测试证明要求保护的化合物的有用作用。例如，Spherogenex血管生成测定可以用来阐明测试化合物的特定对映异构体的作用。尽管已知有时VEGF可以驱动血管生成，所述测定也可以用来确定bFGF驱动的血管生成，由此可以确定化合物对非VEGF驱动的血管生成的影响。比较用血管生成调节化合物处理和未处理对照之间Spherogenex血管生成测定的mRNA表达谱可以用来确定测试化合物影响哪个信号传导路径。
进一步分析的一个实例是Hepato-Cellular Carcinoma Model(HCC)体内研究。这个研究可以评价派克昔林和红霉素在皮下和高度血管化的肿瘤模型如Alexander细胞中的抗血管生成作用。以上已经显示派克昔林在体外对HUVEC 3D出芽(IC50＝1.5×10-6)的影响比对成纤维细胞发散(IC50＝1.9×10-5)更强。派克昔林可影响细胞活力(内皮细胞，成纤维细胞，Alexander细胞)，IC50约10μM，这可以干扰潜在的抗细胞生成作用。红霉素只有与VEGFR-2抑制剂联合时，才观察到对HUVEC出芽的影响。在这个进一步的研究中，红霉素单独的抗血管生成作用可以被排除。
  Alexander细胞(PLC/PRF/5)可以从，例如，American Type Culture Collection(Manassas，Virginia，USA)获得。单层Alexander细胞可以生长于85％Dulbecco’sModified Eagle’s Medium(DMEM)，15％ Fetal Bovine Serum(FBS)，4mML-glutamine，100单位青霉素G/ml和100μg硫酸链霉素/ml。细胞可以在90％空气和10％二氧化碳的加湿环境中在37℃培养。优选可以每4天更换培养基。
可以应用6-8周大的雌性NMRI-nu/nu小鼠。Alexander细胞可以植入小鼠的左腹部，例如，使用29G针注射器以0.2ml等分将4×107细胞注射到左腹皮下区域。接种后，出现的皮下肿瘤可以通过卡尺测量和乘以所有三维距离来测定。
肿瘤大小接近约100mm3之后，可以开始治疗(研究第一天)，持续约21天。可以使用如下表4详述的4个试验组。
表4：体外分析中可选择的给药方案
    组     处理     给药路径
    1     对照     -     -
    2     派克昔林     40mg/kg(1/2MTD) 口服
    3     红霉素     10mg/kg     腹腔注射
    4     PTK787/ZK222584     50mg/kg     口服
正如所显示的，第一组作为对照组，其中动物在注射Alexander-细胞后，不接受进一步处理。第二组可以通过强饲法每天口服40mg/kg剂量来评价派克昔林对肿瘤的影响。第三组可以标准剂量水平如腹腔注射10mg/kg每天一次接受红霉素，优选联合给予低剂量的PTK787/ZK222584。第四组可以每天两次口服施用50mg/kg剂量的PTK787/ZK222584，任选一个第四组的亚组或者分开的第五组接受低剂量的PTK787/ZK222584。
处理大约21天后，小鼠被处死并且收集肿瘤，和任选的适当储存在-80℃。对于肿瘤脉管系统的组织学检查，可以制作组织的冷冻切片(5-10μm厚)。为了观察血管，可以对CD31(PECAM-1)进行免疫组织化学的的染色，使用确定的放大倍数(×200)进行显微血管计数。在低放大倍数检查所有组织切片，如果希望可以进行照像。肿瘤组织的增殖指数可以通过冷冻切片的BrdU标记进行测定。如果是那种情况，应该在处死前12小时向动物施用BrdU(500mg/kg)。为检查凋亡指数，可以对冷冻切片进行TUNEL染色。
基于已经获得的显著结果，希望这个研究揭示与对照的第一组相比，2-4组中肿瘤大小的减小。如果第四组接受变化量(低和高剂量)的PTK787/ZK222584，预计那些接受高剂量的比接受低剂量的具有更小的肿瘤。预计用派克昔林处理的第二组动物和接受红霉素联合低剂量PTK787/ZK222584的第三组动物具有用高剂量PTK787/ZK222584处理动物程度的肿瘤大小减小。因为派克昔林和红霉素/VEGFR-2抑制剂已经显示出具有令人吃惊的血管生成抑制活性，与对照动物比较，接受这些化合物的动物将具有明显更小的肿瘤。第2和3组动物中可以观察到肿瘤凋亡增加和微血管密度降低。
血管生成刺激剂
如果测试化合物刺激HUVEC出芽明显超出VEGF对照，并且NHDF发散未受影响或只有轻微增加，化合物被视为血管生成刺激剂。
多巴胺调节剂
溴隐亭是一种血管生成刺激剂，其分子式为C32H40BrN5O5·CH4SO3和分子量为750.70。依替必利与稠环乙脲(S)(-)一样也已知作为一种多巴胺受体阻滞剂。稠环乙脲的化学结构被显示在图13中。它的CAS No.是18016-80-3，化学式结构为C20H26N4O，分子量式338.5。稠环乙脲(S)(-)显示出增加的出芽刺激作用，但是没有成纤维细胞侵入作用，这使得它是特异性血管生成刺激剂。在研究表明某些多巴胺调节剂对血管生成没有作用或事实上起到阻止血管生成作用的地方，这与前述和上面记载的是令人吃惊的对比。
抗霉菌剂
咪康唑是一种刺激剂。它的化学结构显示在图14中。它的CAS No.是22916-47-8，化学式结构为C18H14C14N2O，分子量为416.1。咪康唑显示出增加的出芽刺激作用，但是没有成纤维细胞侵入作用，这使得它是特异性血管生成刺激剂。硫康唑的化学结构显示在图15中，其是(±)-1-[2，4-二氯-b-[(p-氯苯甲基)-硫基]-苯乙基]咪唑单硝酸盐。益康唑是1-[2-{(4-氯-苯基)甲氧基}-2-(2，4-二氯苯基)乙基]-1H-咪唑单硝酸盐，两个都是已知的抗真菌剂并且令人吃惊的已经显示出也是血管生成刺激剂。
抗雄性激素
氟利坦是一种这样的刺激剂。它的化学结构显示在图16中。它的CAS No.是13311-84-7，化学式结构为C11H11F3N2O3，分子量为276.2。氟利坦显示出增加的出芽刺激作用，但是没有成纤维细胞侵入作用，这使得它是特异性血管生成刺激剂。达那唑也是一种抗雄性激素，其也令人吃惊的显示出是一种血管生成刺激剂。它的化学结构显示在图17中。它的CAS No.是17230-88-5，化学式结构为C22H27NO2，分子量为337.5。达那唑显示出增加的出芽刺激作用，但是没有成纤维细胞侵入作用，这使得它是特异性血管生成刺激剂。
通过鉴定上述化合物作为血管生成刺激剂，本发明人使得找到可以刺激或起始血管生成的新化合物的可能性变成可能。可以期望它刺激具有某些疾病状态如缺血的患者的血管生成。作为替代，可以期望它在动物或细胞/组织培养物模型中刺激血管生成用于进一步研究血管生成的机制。例如，通过施用本发明的化合物，可以在表达肿瘤的动物模型中刺激血管生成，其将提供针对肿瘤生长的额外研究机会和用于研究肿瘤治疗提供可能改善的动物模型。
确认刺激的体外检测
细胞增殖测定
为了进一步确认上述令人吃惊的结果，在细胞增殖测定中检测化合物。按上述进行测定。从处理72小时后的OD值中减去第零天的OD值。因此负值代表观察到比起始平板接种时更少的细胞和进一步表明化合物对HUVEC的细胞毒性作用。化合物抑制增殖，结果显示在图18-21中。
HUVEC球状体结果
正如上面有关血管生成抑制剂的描述，新发现作为血管生成刺激剂的化合物也在3D血管生成测定中进行评价。它们全部都被发现独立地刺激EC出芽或进一步增加VEGF诱导的出芽。
用化合物处理单层HUVEC6小时，然后与未处理的HUVEC比较时，确定诱导的转录变化。根据它们在不加VEGF、联合VEGF以及与VEGFR-2抑制剂PTK787/ZK222584(1μM)一起的条件下诱导出芽的能力检测化合物。1μM浓度的VEGFR-2抑制剂完全阻止了VEGF诱导的出芽。
图22显示了化合物单独对HUVEC出芽的作用，处理24小时后基芽被减去并且所得出芽与EVGF诱导的出芽进行比较。溴隐亭和依替必利刺激的出芽都超过了VEGF诱导的出芽。
联合VEGF(25ng/ml)给予化合物也被评价，数据显示在图23中。化合物甚至可以进一步增强VEGF驱动的血管生成。从联合PTK787/ZK222584施用化合物的评价中获得的结果显示在图24中，其中百分比表示与未处理对照的比较。结果显示出芽不是VEGF依赖性的，因为它不能被VEGFR抑制剂抑制。
进一步阐明刺激的体内检测
除了上述的体外检测方法，也可以进行体内检测，以进一步定性和定量测试化合物的作用。可以联合或不用血管生成刺激剂(例如，生成因子比如VEGF或bFGF)，在Passaniti，A.，et al Lab Invest.1992 Oct；67(4)：519-28中所述的matrigel血管生成测定中评价测试化合物。作为替代或另外，可以使用以下所述的改进matrigel血管生成方法：Guedez，L，et al.，American Journal of Pathology，2003，vol.162，no.5，1431-39。
也可以通过在心肌梗塞和组织缺血的疾病模型中分析测试化合物处理对血管生成过程的作用来收集信息。这些模型对技术人员是已知的，并且包括，例如，以下所述的那些：WO03/000009(PCT/US02/19568)和Witzenbichler B.，Am J Pathol.1998 Aug；153(2)：381-94。
可以按照WO05/008250所述进行进一步的体外评价来评价经化合物处理的小鼠中视网膜血管化和血管密度。
给药和使用指导
可以使用本文描述的化合物影响血管生成。化合物的量、施用途径和其它相关因素可以很好的基于对化合物的原有适应症建议的方案。技术人员可以获得这些信息；例如，见Goodman&Gilman，The Pharamacological Basis of Therapeutics。给药和递送可以基于患者需要和随本领域中它们发展而改进的给药技术的可用性进行修改。
优选的治疗方法可以进一步包括治疗后检测受影响组织或有机体中血管生成的步骤。检测血管生成的方法在本领域是已知的，例如见美国专利No.6,689,807。
可以想到，本发明的化合物可以被有机体内如人体内的酶代谢而产生可以影响血管生成的代谢物。这些代谢物是在本发明的范围内。也可以想到，可以施用化合物的前体，其经过加工过程如酶代谢作用而产生本发明的化合物。
在某些环境下，技术人员可以选择联合其它活性化合物使用一种或多种上面所讨论的化合物。作为替代，两种或多种本文公开的化合物可以联合施用并不同程度的影响血管生成。可以以同时或顺序的方式施用化合物。确定特定的化合物组合是否以优选方式相互作用的一种方法是制备线性等效剂量分析应图(isobologram)(Tallarida RJ.，et al.，Statistical analysis of drug-drug and site-site interaction withisobolograms，Life Sciences.45(11)：947-61，1989)。这种图示帮助阐明是否另外的化合物仅有加和作用，或者它们有协同作用。在这种评价中，至少评价9个试验组；3个组限定第一化合物的剂量效应，3个组限定第二化合物的剂量效应，和3个组限定那两种化合物的固定比例组合的剂量效。
对单剂量组，选定的剂量效应值，ED50值，假定具有加和作用作图为线。这条线是基于被检测化合物的比例；第一测试化合物对第二测试化合物的1∶2比例被显示。当对施用组合化合物的组测量的数据被添加到假想的加和线上时，观察到的剂量效应位于加和线的左侧(即下方)代表一起使用的化合物具有协同作用，而观察到的剂量效应位于加和线的右侧(即上方)代表组合化合物具有拮抗作用。
当本文中公开的化合物与阻断VEGF活性或信号传递的治疗组合使用时特别有效。这种抗VEGF治疗包括抑制性抗VEGF受体抗体、可溶性受体构造物、反义策略、抗VEGF的RNA aptamers和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。
可以优选与上述化合物组合使用的具体化合物的实例是AVASTIN(bevacizumab)，其是一种抗VEGF的重组人抗体，和MACUGEN(pegaptanibsodium)，其是一种选择性结合并中和VEGF的aptamer。抗VEGF领域的研究正在继续，当与本文公开的一种或多种化合物联合使用时，预计未来的化合物将显示出相似的积极作用。
有效的剂量将随着具体治疗病况、治疗对象的年龄和身体状况、病况严重性、治疗持续期、并行治疗的性质(如果有)、具体施用途径和健康护理从业者知识和经验范围内的因素而变化。例如，关于闭塞或阻塞性血管病，有效量是产生足够的血管生成从而提供缺血区血流增加的量。
前述公开仅仅是为了举例说明本发明而列出，并无限制的目的。因为本领域技术人员可以结合本发明精神和实质对公开的实施方案进行修改，应该认为本发明包括所附权利要求及其等同物范围内的所有事项。

Claims (21)

1.抑制一组细胞、组织或有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的派克昔林或红霉素与至少一种抗VEGF治疗的组合，或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。
2.根据权利要求1的方法，其中有机体是哺乳动物。
3.根据权利要求2的方法，其中哺乳动物具有选自以下的病况：癌、肉瘤、视网膜病变、黄斑变性、角膜溃疡、硬皮病、Berger’s病、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎性肠病、牛皮癣、肉状瘤病和类风湿性关节炎。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中化合物被局部施用。
5.抑制一组细胞、组织或有机体中血管生成的方法，其包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的药物组合物，其包括派克昔林或红霉素与至少一种抗VEGF治疗的组合、或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。
6.根据权利要求5的方法，其中有机体是哺乳动物。
7.根据权利要求6的方法，其中哺乳动物具有选自以下的病况：癌、肉瘤、视网膜病变、黄斑变性、角膜溃疡、硬皮病、Berger’s病、增生性玻璃体视网膜病变、慢性炎症、炎性肠病、牛皮癣、肉状瘤病和类风湿性关节炎。
8.根据权利要求5-7任一项的方法，其中化合物被局部施用。
9.根据权利要求5-8任一项的方法，其中药物组合物被配制为油膏、凝胶、软膏、贴剂、注射剂、口服溶液或悬液。
10.根据权利要求5-9任一项的方法，其中药物组合物在控释基质中。
11.根据权利要求5-10任一项的方法，其中药物组合物进一步包含药物可接受载体、稀释剂、介质或赋形剂。
12.根据权利要求5-11任一项的方法，其中进一步包括向该组细胞、组织或有机体施用至少一种抗VEGF治疗，其中药物组合物包含派克昔林。
13.根据权利要求1、5或12任一项的方法，其中所述至少一种抗VEGF治疗选自AVASTIN和MACUGEN。
14.刺激一组细胞、组织和有机体中血管生成的方法，包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的化合物，其选自：溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。
15.根据权利要求14的方法，其中有机体是哺乳动物。
16.根据权利要求14的方法，其中哺乳动物具有选自以下的病况：中风、缺血性心脏病、伤口愈合、缺血、心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定性心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化和脑梗塞。
17.根据权利要求14-16任一项的方法，其中化合物被局部施用。
18.刺激一组细胞、组织和有机体中血管生成的方法，包括向该组细胞、组织或有机体施用治疗有效量的药物组合物，其包含选自以下的化合物：溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑或其药物可接受的前药、盐、溶剂合物、水合物、活性代谢物或其组合。
19.根据权利要求18的方法，其中有机体是哺乳动物。
20.根据权利要求18的方法，其中哺乳动物具有选自以下的病况：中风、缺血性心脏病、伤口愈合、缺血、心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定性心绞痛、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化和脑梗塞。
21.增加流向组织血流的方法，包括向组织施用可有效促进血管生成量的药物组合物，其包含选自以下的化合物：溴隐亭、依替必利、稠环乙脲(S)(-)、咪康唑、硫康唑、益康唑、氟利坦和达那唑。
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