KR20150105355A - 질병을 치료하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이를 필요로 하는 동물에서 혈관 투과성 항진(vascular hyperpermeability) 억제 방법을 제공한다. 상기 방법은 동물에 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 투여하는 것으로 구성된다. 상기 방법은 동물의 체지방 함량(body fat content)을 계산한 동물에 다나졸 화합물의 유효량을 투여하는 것으로 구성된다. 본 발명은 또한 동물에서 내피세포(endothelial cell)의 세포골격(cytoskeleton)을 조절하는 방법을 제공한다.

Description

질병을 치료하기 위한 방법{METHOD FOR TREATMENT OF DISEASES}

관련된 출원의 상호참조

본 출원은 2012년 12월 19일 출원된 가출원 출원번호 61/739,524의 우선권을 주장하여, 본 명세서에 전체적으로 참조로 통합된다.

기술분야

본 발명은 혈관 투과성 항진(vascular hyperpermeability) 및 부종(edema) 및 이의 결과인 다른 부작용(adverse effect) 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 내피세포(endothelial cell)의 세포골격(cytoskeleton) 조절의 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 동물의 체지방 함량(body fat content)을 계산한 동물에 다나졸(danazol) 화합물을 투여하는 것으로 구성된다.

혈관내피(vascular endothelium)는 모든 혈관의 안쪽에 형성되어 있다. 이는 혈액 및 조직 및 장기(organ) 사이의 공유영역(interface)로서 역할을 한다. 내피는 혈액 체액 구획(blood fluid compartment)의 온전성(integrity)을 유지하기 위해 반투과성의 벽(semi-permeable barrier)을 형성하나, 조절 방식에 있어서 물, 이온(ion), 저분자, 거대분자(macromolecule) 및 세포의 통과를 허용한다. 이런 과정의 조절장애는 기초조직(underlying tissue) 안으로 혈관 누출을 야기한다. 부종의 요인인 조직 안으로의 체액 누출은 다양한 질병의 결과로 위험하고 생명을 위협할 수 있다. 따라서, 바람직하게는 이의 초기단계에서 부종을 감소시키고, 생리적인 내피장벽(endothelial barrier)을 복원하기 위한 방법이 매우 바람직하다.

내피는 혈액에서 실제적 조직으로의 분자 교환을 조절하는 주요 게이트키퍼(gatekeeper)이다. 이는 특정 혈관상(vascular bed)에 대한 혈액매개 분자(blood-borne molecule)의 투과성(permeability)을 조절한다. 내피세포 장벽의 투과성 및 선택성(selectivity)은 다른 혈관상에 있어서 미소혈관계(microvasculature) 내피 내벽(lining)의 구조 및 종류에 매우 의존적이다. 구조적 차이가 존재하는 다른 장기의 미소혈관상 내피세포 내벽은 세 일차적 형태상의 카테고리로 나눌 수 있다: 유동(sinusoidal), 창문(fenestrated) 및 연속적인(continuous).

유동 내피(또한 "비연속적인 내피(discontinuous endothelium)"로 언급됨)는 큰 세포 사이(intercellular) 및 세포 사이 갭(gap)을 갖고, 모세혈관 루멘(capillary lumen)에서 조직 및 역으로 분자의 전달을 최소한으로 제한하기 위해 허용된 기저막(basement membrane)을 갖지 않는다. 유동 내피는 간, 비장 및 골수에서 발견된다.

창문 내피(fenestrated endothelia)는 직경 60 내지 80 ㎚의 천공(fenestrae)이라 불리는 열린 원형의 세포횡단(circular transcellular)의 다수의 존재에 의해 특징된다. 창문 내피는 신장[사구체(glomeruli), 세관주위 모세혈관(peritubular capillaries) 및 상승한 바사렉타(ascending vasa recta)], 췌장, 부신(adrenal gland), 내분비샘(endocrine gland) 및 창자(intestine)를 포함하는 소분자의 빠른 교환이 요구되는 조직 및 장기에서 발견된다. 상기 천공은 성숙한, 건강한 사구체를 제외하고 얇은 가로막에 의해 덮여있다. Ichimura 외, J. Am . Soc. Nephrol ., 19:1463-1471(2008)을 참조하라.

연속적인 내피(continuous endothelia)는 천공 또는 큰 갭을 포함하지 않는다. 대신, 연속적인 내피는 중단되지 않는 내피세포 단층(monolayer)으로 특징된다. 체내의 대부분의 내피는 연속적인 내피이고, 연속적인 내피는 뇌[뇌혈관 장벽(blood brain barrier)], 가로막(diaphragm), 십이지장 근육(duodenal musculature), 지방, 심장, 신장의 어떤 부분[유두의 미소혈관계(papillary microvasculature), 감소한 바사렉타(descending vasa recta)], 큰 혈관, 폐, 장간막, 신경, 망막[망막혈관 장벽(blood retina barrier)], 골격근(skeletal muscle), 고환 및 신체의 다른 조직 및 장기에서, 또는 그 주위에서 발견된다.

연속적인 내피에서 내피의 전달은 부세포적(paracellular) 및 세포횡단 경로에 의해 발생하는 일반적인 감각을 통과할 수 있다. 상기 부세포적 경로는 내피세포 사이의 연결지점(interendothelial junction, IEJ)을 통한 내피세포 사이의 경로이다. 흐트러지지 않은 연속적인 내피에 있어서, 물, 이온 및 소분자는 확산(diffusion) 및 대류(convection)에 의해 부세포적으로 전달된다. 물의 유의적인 양(최대 40%)은 아쿠아포린(aquaporin)으로 불리는 물-전달막 채널(water-transporting membrane channel)을 세포횡단적으로 내피세포벽을 횡단한다. 다양한 자극제가 IEJ의 조직을 방해할 수 있고, 그렇게 함으로써 내피장벽의 갭이 열린다. 이들 세포 사이 갭의 형태는 제한되지 않은 방식에서 내피세포 사이의 체액, 이온, 거대분자(예를 들면, 단백질) 및 다른 플라스마 구성성분(constituent)을 허용한다. 이런 부세포적-원인의 과투과성(hyperpermeability)은 조직 및 장기 손상의 궁극적인 결과일 수 있는 부종 및 다른 부작용을 생성한다.

세포횡단 경로는 알부민 및 다른 플라스마 단백질과 같은 거대분자의 활발한 전달, '통과세포외배출(transcytosis)'로 언급되는 기전인 내피세포의 횡단에 책임이 있다. 거대분자의 전달은 포낭(caveolae)이라 불리는 소포(vesicle)를 발생시킨다. 모든 연속적인 내피의 대부분은 적은 포낭을 갖는 뇌 및 고환에 위치한 연속적인 내피를 제외하고 풍부한 포낭을 갖는다. 통과세포외배출은 성공적인 포낭 출아(budding) 및 플라즈말렘마(plasmalemma)로부터의 핵분열(fission) 및 세포를 가로지르는 위치이동에 이은 반대편 플라즈말렘마와의 결합(docking) 및 융합(fusion)을 포함하는 다단계(multi-step) 기전으로, 포낭은 간극(interstitium) 안으로 엑소사이토시스(exocytosis)에 의해 그들의 내용물(content)을 배출한다. 통과세포외배출은 선택적이고, 일반 생리적 상태하에서 엄격하게 조절된다.

세포횡단 경로의 근본적인 중요성은 성장구현(growing realization)이다. 플라스마 단백질, 특히 플라스마 단백질의 65%를 나타내는 알부민(albumin)의 통과세포외배출은 관통과(transvacular) 콜로이드 삽투압(oncotic pressure) 구배를 조절하기 위한 이의 능력 때문에 특히 흥미롭다. 이해할 수 있는 바와 같이, 그리고나서 알부민 및 다른 플라즈마 단백질의 기저수준보다 위로 증가된 통과세포외배출은 그들의 조직 단백질 농도를 증가시킬 것이고, 차례로 물이 내피장벽을 횡단하여 이동할 수 있도록 할 것이며, 그렇게 함으로써 부종을 생성한다.

저밀도 리포 단백질(low density lipoprotein, LDL) 또한 통과세포외배출에 의해 내피세포를 횡단하여 전달된다. 과지질혈증(hyperlipidemia)에 있어서, LDL 통과세포외배출의 유의적인 증가는 아테롬 발생(atherogenesis) 이벤트의 시작으로써 탐지된다. LDL은 내피하의 공간(subendothelial space)에 축적되고, 확장된 기저판(basal lamina) 및 세포외 기질(extracellular matrix) 내에서 모아진다. 과지질혈증에 있어서, 내피하의 리포단백질 축적에 이어 아테롬성 플라크 형성(atheromatous plaque formation) 결과 일련의 이벤트가 이어진다. 발전된 죽상판 경화증(atherosclerotic) 병변(lesion)은 IEJ, 및 LDL 및 알부민의 거대한 통제되지 않은 통로의 열림을 가끔 동반한다고 보고되었다.

혈관 합병증은 당뇨의 특징이다. 큰 혈관(large vessel)의 수준에 있어서, 질병은 죽상판 경화증(atherosclerotic) 기전의 촉진으로 발현되기 위해 나타난다. 미소혈관증(microangiopathy)에 대하여, 망막, 신장 사구체(renal glomerulus) 및 신경의 미소혈관계에서의 변화는 가장 많은 임상 합병증의 원인이나, 지속적으로 증가하는 다양한 연구는 당뇨가 또한 추가적인 임상 합병증의 요인인 장간막, 피부, 골격근, 심장, 뇌 및 폐와 같은 다른 장기의 미소혈관계에 영향을 주는 것을 나타낸다. 이들 혈관상 모두에 있어서, 혈관 투과성의 변화는 당뇨성 내피 기능장애(diabetic endothelial dysfunction)의 특징을 대표하는 것으로 나타난다.

연속적인 내피에 있어서, 당뇨의 초기 단계에 있어서, 플라스마 거대분자에 대한 모세혈관 과투과성(hyperpermeability)은 IEJ의 불안성이 아닌 내피세포사이 소포성 전달의 강화(예를 들어, 증가된 통과세포외배출에 의해)에 의해 설명된다. 추가적으로, 뇌의 이들을 포함하는 당뇨의 내피세포는 정상과 비교하여 증가된 수의 포낭을 포함하고, 당화 단백질, 바람직하게는 당화 알부민이 내피세포에 의해 흡수되며, 그들의 원래 형태보다 더욱 큰 비율로 통과세포외로 배출된다. 추가적으로, 거대분자의 증가된 통과세포외배출은 당뇨가 초기를 넘어 지속되고, 만약 치료되지 않고 남아있을 때 질병을 통한 당뇨성 조직 및 장기에서 부종의 원인이 될 수 있도록 나타나는 기전이다. 상기 부종은 차례차례 조직 및 장기 손상을 유도한다. 유사하게 거대분자의 세포횡단 전달의 증가가 고혈압에서 보고되었다.

부세포적-원인 과투과성(paracellular-caused hyperpermeability)은 또한 당뇨 및 당뇨의 혈관 합병증에서의 인자(factor)이다. 부세포적 경로의 IEJ는 접착 연결지점(adherens junction, AJ) 및 단단한 연결지점(tight junction, TJ)을 포함한다. 당뇨는 AJ 및 TJ 모두에서 특정 단백질의 함량, 인산화(phosphorylation) 및 위치를 변화시키고, 그렇게 함으로써 내피 장벽 투과성을 증진시키는데 기여한다.

상기 서술한 토의 및 추가적인 정보를 뒷받침하기 위해, Frank 등, Cell Tissue Res ., 335:41-47(2009), Simionescu 등, Cell Tissue Res ., 335:27-40(2009); van den Berg 등, J. Cyst . Fibros ., 7(6):515-519(2008); Viazzi 등, Hypertens. Res ., 31:873-879(2008); Antonetti 등, Chapter 14, 페이지 340-342, Diabetic Retinopathy(Elia J. Duh 편집본, Humana Press, 2008), Felinski 등, Current Eye Research, 30:949-957(2005), Pascariu 등, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 52(1):65-76(2004); Bouchard 등, Diabetologia, 45:1017-1025(2002); Arshi 등, Laboratory investigation, 80(8):1171-1184(2000); Vinores 등, Documenta Ophthalmologica, 97:217-228(1999); Oomen 등, European Journal of Clinical investigation, 29:1035-1040(1999); Vinores 등, Pathol . Res . Pract ., 194:497-505(1998); Antonetti 등, Diabetes, 47:1953-1959(1998); Popov 등, Acta Diabetol ., 34:285-293(1997); Yamaji 등, Circulation Research, 72:947-957(1993); Vinores 등, Histochemical Journal, 25:648-663(1993); Beals 등, Microvascular Research, 45:11-19(1993); Caldwell 등, Investigative Ophthalmol . Visual Sci ., 33(5):16101619(1992)를 참조하라.

창문 내피에서 내피이동은 또한 통과세포외배출 및 부세포적 경로에 의해 발생한다. 추가적으로, 내피이동은 천공에 의해 발생한다. 창문 내피는 천공의 존재때문에 물 및 작은 친수성 용질에 대해 현저하게 높은 투과성을 나타낸다.

천공은 가로막에 의해 덮여있거나, 덮여있지 않을 것이다. 가로막화된 천공(diaphragmed fenestrae)과 함께 있는 내피의 위치는 내분비 조직(endocrine tissue)[예를 들어, 췌장도(pancreatic islets) 및 부신피질(adrenal cortex)], 위장점막(gastrointestinal mucosa) 및 신장 세뇨관 주위 모세혈관(renal peritubular capillaries)을 포함한다. 가로막화된 천공을 갖는 창문 내피의 플라스마 단백질에 대한 투과성은 연속적인 내피의 그것을 초과하지 않는다.

비가로막화된 천공(nondiaphragmed fenestrae)과 함께 있는 내피의 위치는 신장의 사구체를 포함한다. 사구체의 창문 내피는 천공['시이브 플러그(seive plugs)'를 형성] 안으로 확장되는 글라이코칼릭스(glycocalys)로 덮여있고, 당단백질(glycoprotein)의 내피세포 표면 막에 더욱 느슨하게 결합한다. 기능적 선택투과성(permselectivity) 연구의 수학적 연구는 천공의 존재를 포함하는 사구체 내피 세포 글라이코칼릭스이고, 이는 순환기 내에서 플라스마 단백질을 최대 95%까지 유지하기 위해 표면 막 계정(surface layer account)과 결합된다.

사구체 내피에서 천공의 손실은 당뇨성 신증, 이식 사구체 신증(transplant glomerulopathy), 자간전증(pre-eclampsia), 당뇨, 신부전(renal failure), 사이클로스포린 신증(cyclosporine nephropathy), 혈청병 신염(serum sickness nephritis) 및 Thy-1 신염(Thy-1 nephritis)을 포함하는 심각한 질병에 있어서 단백뇨(proteinuria)와 결합되어 발견되었다. 액틴 재배열 및, 특히 스트레스 섬유(stress fiber)의 탈중합(depolymerization)은 천공의 형성 및 유지를 위해 중요한 것으로 발견되었다.

상기 서술한 토의 및 추가적인 정보를 뒷받침하기 위해, Satchell 등, Am . J. Physiol . Renal Physiol ., 296:F947-F956(2009); Haraldsson 등, Curr . Opin . Nephrol. Hypertens ., 18:331-335(2009); Ichimura 등, J. Am . Soc . Nephrol ., 19:1463-1471(2008); Ballermann, Nephron Physiol ., 106:19-25(2007); Toyoda 등, Diabets, 56:2155-2160(2007); Stan, "Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability", 페이지 679-688, Endothelial Biomedicine(ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Simionescu 및 Antohe, "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies", 페이지 42-69, The Vascular Endothelium I(eds. Moncada 및 Higgs, Springer-Verlag, Berlin, 2006).

유동 내피에서 내피이동은 통과세포외배출에 의해 및 세포사이 갭[내피사이 구멍(interendothelial slits)] 및 세포내(intracellular) 갭(천공)을 통해 발생한다. 액틴 필라멘트-분열된(filament-disrupting) 약물은 액틴 세포골격에 의해 내피 내벽의 다공성 조절을 나타내는 다수의 갭에 있어서 상당하고 빠른 증가로 도입될 수 있다. 약물에 변화한 다른 세포골격은 천공의 직경을 변화시키는 것으로 보고되었다. 그러므로, 세포골격 결합된 천공은 아마도 유동 내피에서 내피 여과의 기능을 중요하게 조절한다. 간에서, 내피의 투과성 감소의 원인인 축출(defenestration)(천공의 손실)은 노화, 아테롬 발생(atherogenesis), 아테롬성 동맥경화증, 간경변(cirrhosis), 섬유증(fibrosis), 간부전(liver failure), 및 1차 및 전이성 간암을 포함하는 몇몇의 질병 및 상태의 발병과 연관되어 있다. 상기 서술한 토의 및 추가적인 정보를 뒷받침하기 위해, Yokomori, Med. Mol. Morphol., 41:1-4(2008); Stan, "Endothelial Structure Involved In Vascular Permeability", 페이지 679-688, Endothelial Biomedicine(ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); DeLeve, "The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell", 페이지 1226-1238, Endothelial Biomedicine(ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Pries 및 Kuebler, "Normal Endothelium", 페이지 1-40, The Vascular Endothelium I(eds, Moncada 및 Higgs, Springer-Verlag, Berlin, 2006); Simionescu 및 Antohe, "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies", 페이지 42-69, The Vascular Endothelium I(eds, Moncada 및 Higgs, Springer-Verlag, Berlin, 2006); Braet 및 Wisse, Comparative Hepatology, 1:1-17(2002); Kanai 등, Anat. Rec., 244:175-181(1996); Kempka 등, Exp. Cell Res., 176:38-48(1998); Kishimoto 등, Am. J. Anat., 178:241-249(1987).

당뇨성 망막증은 가장 흔한 당뇨성 눈질병이고, 미국 성인에서 맹목(blindness)의 원인을 유발한다(National Eye Institute factsheet, 2009 at www.nei.nih.gov/health/diabetic/retinopathy.asp). 2000년에 세계보건기구는 미국에서 당뇨가 17,702,000명이라고 보고하여 출판하였다. 상기 보고는 또한 2030년까지 30,312,000명으로 증가할 것이라고 예상된다고 언급하였다(Wild, 2004). 당뇨성 망막증은 미세동맥류(microaneurysms), 망막 내(intra-retinal) 출혈(hemorrhage) 및 삼출물(exudate), 혈관 비틀림(vascular tortuosity), 망막 내 미세혈관 이상(intra-retinal microvascular anomalies, IRMA) 및 망막앞 신혈관형성(pre-retinal neovascularization)을 포함하는 망막의 혈관계(vasculature)에서 진행되고 누적된다(Boyd 등, Canadian Diabetes Association Clinical Practice Guidelines Expert Committe 2008, S134-139). 망막앞 신혈관형성은 유리체 출혈(vitreous hemorrhage), 망막 박리(retinal detachment), 섬유증 및 영구적인 시력 상실을 유도할 수 있다. 당뇨성 망막증은 또한, 중심시(central vision)를 포함 또는 위협하는 체액의 유출인 당뇨성 황반부종(Diabetic Macular Edema, DME)을 포함한다. 당뇨에서 대부분의 시력 상실은 DME 때문이다(Moss 등, Ophthalmology, 1998; 105:998-1003). 증가된 혈관 투과성 및 부종은 이 기전의 초기 단계를 발생시킨다. 혈관 투과성 및 부종의 효율적인 치료는 망막 조직이 영구적인 손상을 입기 전에 이들 당뇨 합병증을 역전시키거나 늦추는 것이다(Gardner 등, Current Diabetes Reports 2008; 8:263-269; Sander 등, Invest Ophthalmol Vis. Sci. 2007; 48:3983-3987; 및 Antonetti 등, Diabetes 2006;55:2401-2411).

임상적으로 유의적인 당뇨성 황반부종(CSME)의 일차적인 치료는 망막의 레이저 광응고술(laser photocoagulation) 및 유리체 내의(intravitreal) 라니비주맙(ranibizumab)을 포함한다. 누출 부위에 대한 망막의 레이저 광응고술은 50%(30%부터 15%까지)까지 시력 저하를 완화시키고, 질병의 진행을 늦출 수 있다. 그러나, 레이저 치료는 어떤 경우에 있어서 효과의 부족, 절차상의 통증, 반복된 치료의 필요성, 및 시간 초과로 증가될 수 있는 중심와 화상(foveal burn) 및 상처를 포함하는 절제 망막 손상(ablative retinal damage)에 의해 제한적이다(American Academy of Ophthalmology Preferred Practice Pattern®, Diabetic Retinopathy, 2008; Maeshima 등, Retina, 2004; 24:507-511). 유리체 내의 라니바주맙(LUCENTIS®)은 2012년 07월 30일에 DME의 치료에 승인되었다. 눈에 주입하는 상기 항-혈관 내피 성장인자(anti-vascular endothelial growth, VEGF) 치료는 효율적이나, 몇몇의 이유로 어떤 환자들에는 투여될 수 없다: 완전한 시력 상실을 유도할 것인 면역 반응, 녹내장, 국부 눈 자극 또는 안내염의 발달의 위험. 추가적으로, 매달 반복되는 시술을 위한 높은 치료 비용이 많은 환자의 형편을 어렵게 만든다.

혈당 조절, 고혈압 및 혈중 지질과 같이 일반적인 다른 측정보다 당뇨성 망막증, 특히 DME를 위한 효율적인 경구 약물이 없다. 유의적으로 충족되지 않은 임상적 필요가 당뇨성 망막증 및 DME를 효과적으로 치료할 수 있는 신규한 약물 치료방법의 존재를 필요로 한다(Ryan 등, Am. J. Health Syst Pharm. 2007; 64(17Suppl, 12)S:15-21).

발명의 요약

본 발명의 한 실시예는 동물의 체지방 함량(body fat content)을 결정하고, 동물의 체지방 함량에 상응하는 다나졸(danazol) 화합물의 혈관 투과성 항진 억제(vascular hyperpermeability inhibiting) 양을 투여하는 것으로 구성되는 이를 필요로하는 동물에서 혈관 투과성 항진을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시예는 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제 양을 동물에 투여하는 것으로 구성되는 이를 필요로하는 동물에서 혈관 투과성 항진 억제 방법에 관한 것이고, 여기서 양은 동물의 체지방 함량에 상응한다.

한 측면에서, 결정의 단계는 동물의 체질량 지수(body mass index, BMI) 계산을 포함한다.

다른 측면에서, 다나졸 화합물은 경구로 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 다나졸 화합물은 약 0.5 ㎎/BMI 유닛/일 내지 약 1.0 ㎎/BMI 유닛/일 사이의 양으로 투여될 수 있다. 또 다른 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26보다 낮을 때, 약 2 ㎎/일 내지 약 15 ㎎/일 사이이다. 다른 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26보다 낮을 때, 약 5 ㎎/일이다. 다른 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26 내지 35사이일 때, 약 2 ㎎/일 내지 약 15 ㎎/일 사이이다. 한 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26 내지 35사이일 때, 약 10 ㎎/일이다. 또 다른 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 약 5 ㎎/일 내지 약 45 ㎎/일 사이이다. 또 다른 측면에서, 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 약 15 ㎎/일이다.

다른 측면에서, 동물은 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 존재때문에 다나졸 화합물을 필요로한다. 다나졸 화합물의 투여는 질병 또는 상태의 진단후에 바로 시작될 수 있다. 다양한 측면에서, 질병 또는 상태는 당뇨(diabete), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압, 급성 폐손상(acute lung injury), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 나이-관련 황반변성(age-related macular degeneration), 뇌부종(cerebral edema), 맥락막 부종(choroidal edema), 맥락막염(choroida), 관상동맥 미세혈관 질환(coronary microvascular disease), 뇌 미세혈관 질환(cerebral microvascular disease), 일스 질병(Eals disease), 부상으로 인한 부종(edema caused by injury), 고혈압과 관련된 부종(edema associated with hypertension), 사구체 혈관 누출(glomerular vascular leakage), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 어바인 개스 증후군(Irvine Gass Syndrome), 허혈(ischemia), 황반부종(macular edema), 신장염(nephritis), 신장병증(nephropathies), 신부종(nephrotic edema), 신증후군(nephrotic syndrome), 신경병증(neuropathy), 부종으로 인한 장기부전(organ failure due to edema), 자간전증(pre-eclampsia), 폐부종(pulmonary edema), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 신부전(renal failure), 망막부종(retinal edema), 망막출혈(retinal hemorrhage), 망막정맥폐쇄(retinal vein occlusion), 망막염(retinitis), 망막증(retinopathy), 무음 뇌경색(silent cerebral infarction), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 이식사구체 신병증(transplant glomerulopathy), 포도막염(uveitis), 혈관 누출 증후군(vascular leakage syndrome), 유리체 출혈(vitreous hemorrhage) 또는 폰 히플 린다 질환(Von Hipple Lindau disease)일 수 있다. 바람직한 측면에서, 질병 또는 상태는 황반부종, 신경병증, 망막증 또는 당뇨의 혈관 합병증일 수 있다.

혈관 합병증은 부종(edema), 피하 공간에서 저밀도 지질단백질의 축적(accumulation of low density lipoproteins in subendothelial space), 가속된 아테롬성 동맥경화증(accelerated atherosclerosis), 뇌의 가속된 혈관벽의 노화(accelerated aging of vessel walls in the brain), 심근부종(myocardial edema), 심근 섬유증(myocardial fibrosis), 이완기 기능장애(diastolic dysfunction), 당뇨성 심근병증(diabetic cardiomyopathy), 당뇨병 산모 태아의 폐발달 지연(retardation of lung development in the fetuses of diabetic mothers), 하나 또는 그 이상의 폐 생리학적 파라미터 변경(alterations of one or more pulmonary physiological parameters), 감염에 대한 감수성 증가(increased susceptibility to infections), 장간막에서 혈관 과다형성증(vascular hyperplasy in the mesentery), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 황반부종(diabetic macular edema), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 및 피부의 발적(redness), 변색(discoloration), 건조(dryness) 및 궤양(ulcerations)일 수 있다. 바람직한 측면에서, 혈관 합병증은 부종, 당뇨병성 심근병증, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 황반부종, 당뇨성 망막증, 비증식성 당뇨성 망막증(nonproliferative diabetic retinopathy), 또는 당뇨성 신증일 수 있다.

다양한 측면에서, 동물은 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 발병의 하나 또는 그 이상의 초기 신호, 또는 경향(predisposition)때문에 다나졸 화합물을 필요로 한다. 한 측면에서, 질병 또는 상태는 당뇨, 고혈압 또는 아테롬성 동맥경화증이다.

한 측면에서, 혈관 투과성 항진은 뇌(brain), 가로막(diaphragm), 십이지장 근육(duodenal musculature), 지방(fat), 심장, 신장, 큰혈관(large blood vessel), 폐, 장간막(mesentery), 신경, 망막, 골격근(skeletal muscle), 피부 또는 고환(testis)에서, 또는 주변에서 발견된 연속적인 내피(continuous endothelium)의 혈관 투과성 항진일 수 있다. 한 측면에서, 연속적인 내피는 뇌, 심장, 폐, 신경 또는 망막에서, 또는 그 주변에서 발견된다.

또 다른 측면에서, 혈관 투과성 항진은 신장, 췌장(pancreas), 부신(adrenal), 내분비선(endocrine gland) 또는 소장(intestine)에서, 또는 그 주변에서 발견된 창문 내피의 혈관 투과성 항진이다. 한 측면에서, 창문 내피는 신장에서 발견된다.

본 발명의 다나졸 화합물은 다나졸일 수 있다.

본 발명의 다나졸 화합물은 시간-방출 제형(time-release formulation)일 수 있다. 한 측면에서, 시간-방출 제형은 리포좀 및 다당류로 구성된 군으로부터 선택된 요소를 포함한다.

본 발명의 동물은 인간일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 동물의 체질량 결정; 및 동물의 체질량에 상응하는 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물에서 내피세포의 세포골격 조절 방법과 관련된다. 한 측면에서, 결정의 단계는 동물의 체질량 지수(BMI) 계산을 포함한다. 또 다른 측면에서, 세포골격의 조절은 액틴 스트레스 섬유 형성(actin stress fiber formation)의 억제를 포함한다. 또 다른 측면에서, 세포골격의 조절은 RhoA의 억제를 포함하는 피질의 액틴 고리(cortical actin rings)의 형성의 요인(causing), 증가(increasing) 또는 지속(prolonging)을 포함한다.

도 1은 내피세포 단층(monolayer)을 통과하는 HRP 투과성에서 감소된 변화의 백분율을 나타낸다. 세포의 HRP 투과성에 영향을 주는 다나졸의 투여량 반응(dose response)은 24시간 동안 처리된다. 데이터는 따로따로 세번 수행하여 계산된 평균+SEM으로 나타내고, 각각은 3개로 수행되었다. *=P값<.05 대 전달매체(vehicle).
도 2는 다나졸의 TEER 반을을 나타낸다: 0.1 ㎛ 대 전달매체의 일시적 영향. TEER은 트렌스웰(transwell) 삽입에서 성장한 내피세포의 단층을 통해 측정된다. 더 높은 저항성은 높은 장벽 온전성과 같다.
도 3A 내지 3H는 F-액틴 피질의(cortical) 재배열 및 다나졸을 나타낸다. 망막의 내피세포는 로다민(rhodamine)이 연결된 팔로이딘(phalloidin)으로 염색되었다. 세포는 처리 후 3시간 동안 고정되었다[오직 15분동안 트롬빈(thrombin) 노출됨)]. 치료군: 전달매체 대조군(도 3A), 0.1 ㎛ 다나졸(도 3B), 1 ㎛ 다나졸(도 3C), 10 ㎛ 다나졸(도 3D), 100 ng/㎖ TNF-α(도 3E), TNF-α+0.1 ㎛ 다나졸(도 3F), 0.1 U/㎖ 트롬빈(도 3G), 및 트롬빈+㎛ 다나졸(도 3H).
도 4는 베이스라인(baseline) BMI에 의한 베이스라인으로부터 망막의 두께에서 최소 제곱 평균(square mean)의 변화를 나타낸다. 치료 및 베이스라인 BMI 사이의 유의적인 상호작용때문에, 최소 제곱 평균 및 P 값은 25%, 50%, 및 75% BMI 분위수(quartiles)로 추정된다. 최종 ANCOVA 모델은 치료 효과, 베이스라인으로부터의 날, 베이스라인 망막의 두께 및 BMI를 포함한다. 플라시보 그룹 및 각 활성 그룹과 비교한 P 값: 둔네트-슈(Dunnett-Hsu method) 방법이 다중 비교 조절(adjustment)을 위해 적용되었다.
도 5는 내피세포의 초기 분열을 예방하는 이의 능력 측정으로서 다나졸 처리된 HUVEC 세포의 배양 후 측정된 OD 수준을 나타낸다.
도 6A-6E는 내피세포의 튜브 형성을 예방하는 이의 능력 측정으로서 다나졸과 배양된 후 촬영된 HUVEC 세포의 사진을 나타낸다. 도 6A는 대조군을 나타낸다; 도 6B는 1 μM 다나졸을 나타낸다; 도 6C는 10 μM 다나졸을 나타낸다; 도 6D는 50 μM 다나졸을 나타낸다; 및 도 6E는 50 μM LY294002을 나타낸다.
도 7은 내피세포 침습(invasion)을 예방하기 위한 이의 능력 측정으로서 다나졸 처리된 HUVEC 세포의 치료 후 측정된 형광발광(fluorescence)을 나타낸다.

본 발명은 이를 필요로하는 동물에서 혈관 투과성 항진(vascular-hyperpermeability) 억제의 개선된 방법과 일반적으로 관련된다. 상기 방법은 동물의 체지방 함량(body fat content) 결정 및 체지방 함량에 상응하는 다나졸(danazol) 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 혈관 투과성의 치료를 위한 다나졸 화합물의 용도는 다나졸 화합물이 투여될 동물의 체지방 함량에 민감함을 결정한다. 본 발명은 개체별 기준에서 보정된 양에 의해 혈관 투과성 항진을 억제하기 위한 다나졸 화합물 투여의 개선된 방법을 제공하기 위한 것이다. 더욱 바람직하게, 높은 체지방 함량을 갖는 개체는 혈관 투과성 항진을 억제하기 위해 효과적으로 처리되기 위해 낮은 체지방 함량을 갖는 개체보다 다나졸 화합물의 많은 양을 필요로한다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이는 지방에서 용해되는 다나졸 화합물때문이라고 여겨진다. 그러므로, 높은 체지방 함량을 갖는 개체는 그들의 체내 지방에 의해 흡수되어 다나졸 화합물의 일부를 잃는다.

본 명세서에 사용된 용어 "체지방 함량(body fat content)"은 동물의 지방 함량을 나타내고, 동물의 체질량 지수, 체지방률(percent body fat) 및 지방제외 체질량(lean body mass) 및 신체 표면영역(body surface area) 계산을 포함하나 이에 한정하지 않는 다양한 방법을 통해서 결정될 수 있다. 그렇지 않으면, 자격이 있는 개체는 체지방 함량 카테고리안으로 개체를 카테고리화하기 위해 개체의 질적 평가(qualitative assessment)를 만들 수 있다. 바람직한 실시예에서, 체지방 함량은 동물의 BMI에 의해 측정된다.

본 명세서에서 사용된 BMI는 동물의 체중 및 키로부터 계산된 값이다. 질병통제예방센터에 따르면(www.cdc.gov/healthyweight/assessing/bmi/adult_bmi/index.html), BMI는 대부분의 사람들을 위한 체비만(body fatness)의 신뢰할 수 있는 지표(indicator)를 제공하고, 건강 문제를 유발할 체중 카테고리를 위한 선별을 위해 사용된다. BMI는 체지방을 직접적으로 측정하지 않으나, 수중체중법(underwater weighing) 또는 이중에너지 방사선 흡수계측법(dual energy x-ray absorptiometry)[DEXA; 체지방, 뼈 및 근율의 양을 결정하기 위한 저수준(low-level) 엑스레이(x-ray)]에 의한 것과 같은 체지방의 직접적 측정과 연관되어 있다고 여겨진다(Mei Z 등, Validity of body mass index compared with other body-composition screening indexes for the assessment of body fatness in children and adolescents. American Journal of Clinical Nutrition 2002; 7597-985; Garrow JS 및 Webster J. Quetelet's index(W/H2) as a measure of fatness. International Journal of Obesity 1985;9:147-153). BMI는 어른 및 아이 모두에서 같은 방법으로 측정된다. BMI의 계산은 하기 식에 기초할 수 있다:

식: 무게(㎏)/[키(m)]²

미터법으로, BMI를 위한 식은 킬로그램(kilogram)의 몸무게를 제곱미터(meter squared)의 키로 나눈 값이다. 키가 일반적으로 센티미터(centimeter)로 측정된 이후, 미터의 키를 얻기 위해 센티미터의 키에 100을 곱하여 나눈다:

식: 무게(lb)/[키(in)]²×703

BMI는 제곱 인치[inches(in) squared]의 키로 파운드(pound, lbs)의 체중을 나누고, 703의 전환율을 곱해서 계산된다.

20세 및 그 이상의 어른을 위해, BMI는 남성 및 여성 모두를 위한 모든 연령을 위해 같은 표준 체중 상태 카테고리를 사용하여 해석된다. 아이 및 청소년을 위해, 다른 한편으로는 BMI의 해석은 나이 및 성별 모두에 특이적이다.

어른을 위한 BMI 범위의 표준 체중 상태 카테고리는 표 1에 나타난다.

BMI	체중 상태
18 이하	저체중
18.5-24.9	정상
25.0-29.9	과체중
30.0 및 그 이상	비만

BMI 숫자 및 체비만(body fatness) 사이의 상관관계는 상당히 강하다; 그러나 성별, 인종 및 나이에 의한 상관관계는 다르다. 이런 다양성은 하기 예를 포함한다(Prentice AM 및 Jebb SA. Beyond Body Mass Index, Obesity Reviews, 2001 August; 2(3):141-7; Gallagher D 등, How useful is BMI for comparison of body fatness across age, sex and ethnic groups?, American Journal of Epidemiology 1996;143:228-239): 같은 BMI일 때, 여성은 남성보다 더 많은 체지방을 갖는 경향이 있다; 같은 BMI일 때, 노인은 평균적으로 젊은 사람보다 더 많은 체지방을 갖는 경향이 있다; 많이 단련된 운동선수(athletes)는 증가된 체비만보다 증가된 강건(muscularity)때문에 높은 BMI를 가질 것이다.

체지방 함량 및 BMI는 긍정적으로 연관되어 있고, 이는 BMI 평균이 증가하면, 체지방 함량이 증가한다.

본 명세서에서 사용된 체지방률(percent body fat) 또는 체지방률(body fat percentage)은 동물 지방의 전체 질량을 동물의 전체 체질량으로 나눈 것이다. 체지방은 필수적인 체지방(essential body fat) 및 보관된 체지방(storage body fat)을 포함한다. 필수적인 체지방은 삶의 유지 및 생식기능에 필요하다. 여성을 위한 필수적인 체지방률은 출산 및 다른 호르몬 기능의 요구때문에 남성보다 높다. 필수적인 체지방률은 남성에서 2-5%, 및 여성에서 10-13%이다[ACE(2009) What are the guidelines for percentage of body fat loss? American Council on Exercise(ACE), Ask the Expert Blog. December 2, 2009). 보관된 체지방은 가슴 및 복부의 내부 장기를 보관하기 위한 일환인 지방조직(adipose tissue)에서의 지방 축척으로 구성된다. 최소 요구되는 전체 체지방률은 상기 보고된 필수적인 체지방률 값을 초과한다. 칼리퍼(caliper)로 또는 생체전기저항분석법(bioelectrical impedance analysis)(그들이 동물의 신체를 통과하는 전류의 속도를 측정)의 사용을 통한 측정, 수중체중법(underwater weighing), 이중 X-선 흡수 스캔(dual X-ray absorptiometry scan)과 같은 많은 방법이 체지방률 결정에 유용하다. 체격측정(body measurement)이 유일하게 키 또는 체중과 관련하지 않고 동물의 상대적인 체성분(body composition)을 직접적으로 계산된 이후, 체지방률은 체비만 수준의 측정이다.

전형적인 체지방률은:

남성 체지방률: 나이 20-39: 8% 내지 19%; 나이 40-59: 11% 내지 21%; 나이 60-79: 13% 내지 24%.

여성 체지방률: 나이 20-39: 21% 내지 32%; 나이 40-59: 23% 내지 33% 및 나이 60-79: 24% 내지 35%.

체지방 함량 및 체지방률은 긍정적으로 연관되고, 이는 체지방률이 증가하면 체지방 함량이 증가함을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 지방제외 체지방(lean body mass, LBM)은 전체 체중으로부터 체지방 중량을 빼서 계산된 체성분의 요소이다: 전체 체중은 제외된 지방을 더한 것이다. 공식에서:

지방제외 체지방은 체중 빼기 체지방과 동일하다: LBM=BW-BF.

지방제외 체지방 더하기 체지방은 체중과 동일하다: LBM+BF=BW.

제외된 전체 체질량률은 일반적으로 인용되지 않는다-이는 일반적으로 60 내지 90%이다. 대신에, 보완된 체지방률이 계산되고, 일반적으로 10 내지 40%이다.

체지방 함량 및 지방제외 체지방은 부정적으로 연관되고, 이는 지방제외 체지방이 감소하면 체지방 함량이 증가함을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 신체 표면영역(body surface area, BSA)은 특정되거나, 인간신체의 표면적을 계산한 것이다. 하기 식에서, BSA는 m²이고, W는 ㎏인 무게, 및 H는 ㎝인 키이다. 가장 넓은 용도는 Du Bios 식[Du Bois D, Du Bois EF(1916년 6월), "A formula to estimate the approximate surface area if height and weight be known", Archives of internal Medicine 17(6):863-71; Verbraecken J 등, (2006년 04월), "Body surface area in normal-weight, overweight, and obese adult. A comparison study", Metabolism - Clinical and Experimental 55(4):515-24):

BSA=0.007184×W^0.425×H^0.725

체지방 함량 및 BSA는 긍정적으로 연관되고, 이는 BSA가 증가하면 체지방 함량도 증가함을 의미한다.

동물의 체지방 함량에 상응하는 다나졸 화합물의 투여 단계는 혈관 투과성 항진을 억제하기 위해 효과적인 다나졸 화합물을 받는 낮은 체지방 함량을 갖는 개체보다 혈관 투과성 항진을 억제하기 위해 다나졸 화합물의 많은 양을 필요로하는 높은 체지방 함량을 갖는 개체의 현상을 간주하여 다나졸 화합물의 양을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한번 개체의 체지방 함량이 상기 서술된 어떤 측정으로 알려졌다면, 다나졸 화합물의 적절한 양이 투여될 수 있다. 예를 들고, 방법으로 제한하지 않으며, 체지방 함량이 BMI에 의해 측정된 경우, 동물의 BMI에 기초한 다나졸 화합물의 양은 약 0.5 ㎎/BMI 유닛/일 및 약 1.0 ㎎/BMI 유닛/일 사이일 수 있고, 또는 더욱 바람직하게, 약 0.5 ㎎/BMI 유닛/일, 약 0.6 ㎎/BMI 유닛/일, 약 0.7 ㎎/BMI 유닛/일, 약 0.8 ㎎/BMI 유닛/일, 약 0.9 ㎎/BMI 유닛/일 또는 약 1.0 ㎎/BMI 유닛/일의 양이다. 본 발명의 다른 측면에서, 동물의 BMI에 기초한 다나졸 화합물의 일일 양은 동물의 BMI가 26보다 낮을 때 약 2 ㎎/일 및 15 ㎎/일 사이일 수 있다. 바람직한 측면에서, 동물의 BMI가 26보다 낮을 때 다나졸 화합물의 일일 양은 약 5 ㎎/일이다. 또 다른 측면에서, 동물의 BMI가 26 및 35 사이일 때, 동물의 BMI에 기초한 다나졸 화합물의 일일 양은 약 2 ㎎/일 내지 약 15 ㎎/일 사이일 수 있다. 바람직한 측면에서, 동물의 BMI가 26 및 35 사이일 때, 다나졸 화합물의 일일 양은 약 10 ㎎/일이다. 또 다른 측면에서, 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 동물의 BMI에 기초한 다나졸 화합물의 일일 양은 약 5 ㎎/일 및 45 ㎎/일 사이일 수 있다. 바람직한 측면에서, 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 동물의 BMI에 기초한 다나졸 화합물의 일일 양은 약 15 ㎎/일이다.

본 명세서에서 사용된 "혈관 투과성 항진(vascular hyperpermeability)"은 기저수준과 비교하여 증가된 혈관내피의 투과성을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "혈관 투과성 항진"은 부세포적-원인 과투과성(paracellular-caused hyperpermeability) 및 통과세포외배출-원인 과투과성(transcytosis-caused hyperpermeability)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "부세포적-원인 과투과성"은 기저수준과 비교하여 증가된 부세포적 이동이 원인인 혈관 투과성 항진을 의미한다. "부세포적-원인 과투과성"의 다른 특징은 하기에 서술된다.

본 명세서에 사용된 "부세포적 이동(paracellular transport)"은 내피의 내피세포 사이의 내피세포 사이의 연결지점(interendothelial junction, IEJ)을 통한 이온, 분자 및 체액의 이동을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "통과세포외배출-원인 과투과성"은 기저수준과 비교하여 증가된 통과세포외배출이 원인인 혈관 투과성 항진을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "통과세포외배출"은 내피의 내피세포를 통과하는 거대분자 및 동반되는 체액-상(fluid-phase) 플라즈마 구성성분의 활발한 이동을 의미한다. "통과세포외배출"의 다른 특징은 하기에 서술된다.

본 명세서에서 사용된 "기저수준(basal level)"은 일반 조직 또는 장기에서 발견되는 수준을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "억제(inhibiting)", "억제하다(inhibit)" 및 유사한 용어는 줄이고, 늦추거나 또는 막는 것을 의미한다.

만약 동물이 혈관 투과성 항진에 의해 매개된 질병 또는 상태를 현재 갖는다면 본 발명에 따른 치료의 필요가 있는 동물은 질병 또는 상태와 같은 초기 신호를 갖거나, 질병 또는 상태와 같은 발전의 경향을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 "매개된(mediated)" 및 유사한 용어는 혈관 투과성 항진에 의한 요인, 관련 또는 악화된 것이 원인임을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 또는 그 이상을 의미한다.

본 발명은 동물의 체지방 함량에 상응하는 양으로 개체에 다나졸 화합물 투여에 의한 혈관 투과성 항진의 개선된 방법으로 상기 구체적으로 서술되었다. 본 발명의 방법은 다나졸 화합물의 투여에 의해 혈관 투과성 항진 억제를 위한 하기 서술된 일반적인 방법을 개선한 것이다. 방법은 이를 필요로하는 동물에 다나졸 화합물의 혈관 투과성 억제 양을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 혈관 투과성 항진의 억제는 부세포적-원인 과투과성 및 통과세포외배출-원인 과투과성의 억제를 포함한다. 최근의 증거는 통과세포외배출-원인 과투과성이 많은 질병 및 상태에서 조직 및 장기의 손상을 궁극적으로 유도하는 기전의 첫번째 단계임을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 그들에서 보이는 조직 및 장기 손상을 감소, 지연 또는 심지어 잠재적으로 막을 수 있는 이들 질병 및 상태에서 초기 중재(intervention)의 평균을 제공한다.

본 발명은 또한 연속적인 내피를 포함하거나 둘러싸인 어떤 조직 또는 장기에서 존재하는 혈관 투과성 항진 억제의 개선된 방법을 제공한다. 상기 언급된 바와 같이, 연속적인 내피는 뇌[뇌혈관 장벽(blood brain barrier)], 가로막(diaphragm), 십이지장 근육(duodenal musculature), 지방, 심장, 신장의 어떤 부분[유두의 미소혈관계(papillary microvasculature), 감소한 바사렉타(descending vasa recta)], 큰 혈관, 폐, 장간막, 신경, 망막[망막혈관 장벽(blood retina barrier)], 골격근(skeletal muscle), 고환, 탯줄 정맥(umbilical vein) 및 신체의 다른 조직 및 장기에서, 또는 그 주위에 존재한다. 바람직하게, 연속적인 내피는 뇌, 심장, 폐, 신경 또는 망막에서, 또는 그 주위에서 발견된다.

본 발명은 또한 창문 내피에 포함되거나, 둘러싸인 어떤 조직 또는 장기에 존재하는 혈관 투과성 항진 억제의 개선된 방법을 제공한다. 상기 언급된 바와 같이, 창문 내피는 신장[사구체(glomeruli), 세관주위 모세혈관(peritubular capillaries) 및 상승한 바사렉타(ascending vasa recta)], 췌장, 부신(adrenal gland), 내분비샘(endocrine gland) 및 창자(intestine)에, 또는 그 주위에 존재한다. 바람직하게, 창문 내피는 신장에서 발견되고, 특히, 신장의 사구체에서 발견된다.

추가적으로, 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 어떤 질병 또는 상태는 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 이런 질병 및 상태는 당뇨, 고혈압 및 아테롬성 동맥경화증을 포함한다.

특히, 뇌, 심장, 신장, 폐, 장간막, 신경, 망막, 골격근, 피부, 및 지속적인 또는 창문 내피를 포함하는 다른 조직 및 장기를 포함하는 당뇨의 혈관 합병증은 본 발명에 의해 치료될 수 있다. 이들 혈관 합병증은 부종, 내피하의 공간에의 LDL 축적, 가속된 아테롬성 동맥경화증, 및 하기를 포함한다: 뇌[맥관벽의 축척된 노화(accelerated aging of vessel wall)], 심장[심근의(myocardial) 부종, 심근의 섬유증, 이완기 기능장애(diastolic dysfunction), 당뇨성 심근병증(diabetic cardiomyopathy)], 신장(당뇨성 신증), 폐(당뇨병 산모 태아의 폐발달 지연, 하나 또는 그 이상의 폐 생리학적 파라미터 변경, 감염에 대한 감수성 증가), 장간막(혈관 과다형성증), 신경(당뇨성 신경병증), 망막(황반부종 및 당뇨성 망막증) 및 피부(발적, 변색, 건조 및 궤양).

당뇨성 망막증은 당뇨를 갖는 약 2100만 미국인의 약 25%에 영향을 준 맹목의 원인을 유발한다. 하지만 이의 발생정도 및 진행은 결국 당뇨성 망막증이 발생한 제 1형 당뇨병의 거의 모든 환자 및 제 2형 당뇨병 환자의 60% 이상에서 집중적인 혈당 및 혈압조절을 통해서 줄일 수 있다. 당뇨성 망막증에는 두 단계가 있다. 첫번째, 비증식성 망막증은 질병의 초기단계 이고, 혈관 투과성, 미세동맥류, 부종에 의해 특징되며, 결국 혈관이 폐쇄된다. 신혈관형성은 비증식성 단계의 요소가 아니다. 이 단계에서의 대부분 시각 손실은 황반, 망막의 중심 영역에서 체액의 축척때문이다. 이런 체액의 축척은 황반부종으로 불리고, 일시적 또는 영구적인 시야 감소의 원인일 수 있다. 당뇨성 망막증의 두 번째 단계는 증식성 망막증으로 불리고, 이는 새로운 혈관 형성에 의해 특징된다. 유감스럽게도, 이런 비정상적 신혈관형성은 감소된 시야 또는 맹목의 원인이 될 수 있는 어떤 눈, 망막의 상처조직, 당뇨성 망막의 박리 또는 녹내장에서 출혈의 원인일 수 있기 때문에 매우 손상이 될 수 있다. 황반부종은 또한 증식성 단계에서 생성될 수 있다.

당뇨성 황반부종은 당뇨의 일반적이고 심각한 합병증이다. 당뇨성 신경병증은 주요한 네 개의 종류가 있다: 말초신경병증(peripheral neuropathy), 자율신경병증(autonomic neuropathy), 라디쿨로플렉서스 신경병증(radiculoplexus neuropathy) 및 단발신경병증(mononeuropathy). 당뇨성 신경병증의 가장 일반적인 형태인 말초신경병증의 신호 및 증상은 통증 또는 온도의 변화를 느끼는 능력을 잃거나 감소(특히 발 및 발가락에서), 감각의 따끔거림 또는 화끈거림, 날카로운 통증, 걸을 때 통증, 가장 가벼운 접촉에 대한 극도의 민감성, 근육의 약함, 걷기 어려움, 및 심각한 발 문제(궤양, 감염, 기형 및 뼈 및 관절의 통증과 같은)를 포함한다. 자율신경병증은 심장, 방광, 폐, 위, 장, 생식기 및 눈을 조절하는 자율신경계(autonomic nervous system)에 영향을 주고, 이들 영역의 어떤 곳에서 문제가 발생할 수 있다. 라디쿨로플렉서스 신경병증[근위축증(amyotrophy), 대퇴부(femoral) 신경병증 또는 근위의(proximal) 신경병증으로 또한 불림]은 일반적으로 둔부(hip), 어깨 또는 복부, 일반적으로 신체의 한 부분에 영향을 준다. 단발신경병증은 오직 하나의 신경, 전형적으로 팔, 다리 또는 얼굴에 입은 손상을 의미한다. 당뇨성 신경병증의 일반적인 합병증은 팔다리의 손실(예를 들면, 발가락, 발 또는 다리), 샤르코 관절(charcot joint), 요로감염, 요실금, 저혈당 비인식(hypoglycemia unawareness)(심지어 치명적일 수 있음), 저혈압, 소화장애(예를 들면, 변비, 설사, 메스꺼움 및 구토), 성기능 장애(예를 들면, 발기부전), 및 증가 또는 감소된 땀흘림을 포함한다. 보일 수 있는 바와 같이, 증상은 마일드에서 고통스러운 범위, 불능화(disabling) 및 심지어 치명적일 수 있다.

당뇨성 신증은 미국에서 신장 질병의 최종 단계의 일반적인 원인이다. 당뇨의 혈관 합병증은 신장의 사구체 모세혈관(glomerular capillaries)에 영향을 주고, 신장의 여과능력을 감소시킨다. 신증은 초여과(hyperfiltration) 및 이어지는 미세단백뇨(microalbuminuria)의 모습을 나타내는 첫번째 표시이다. 무거운 단백뇨(proteinuria) 및 점진적인 신장 기능의 감소는 마지막 단계 신장 질병의 선행이다. 전형적으로, 신증이 나타남의 어떠한 신호 전에, 망막증이 일반적으로 진단된다. 신장 이식은 당뇨때문인 마지막 단계 신장 질병을 갖는 환자에게 일반적으로 추천된다. 이식을 받은 환자의 5년간 생존율은 투석을 받은 환자가 오직 2%인 것과 비교하여 약 60%이다.

고혈압은 일반적으로 수년동안 발달하고, 이는 결국 거의 모두에게 영향을 준다. 조절되지 않은 고혈압은 심근 경색(heart attack), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 뇌졸중(stroke), 말초동맥 질병(peripheral artery disease), 신장질환(kidney failure), 동맥류(aneurysms), 눈손상(eye damage), 및 기억력 또는 이해력의 문제를 포함하는 심각한 건강 문제의 위험을 증가시킨다.

아테롬성 동맥경화증은 또는 서서히 발달한다. 아테롬성 동맥경화증은 관상동맥(coronary arteries), 경동맥(carotid artery), 말초동맥(peripheral arteries) 또는 미소혈관계에 영향을 줄 수 있고, 아테롬성 동맥경화증의 합병증은 관상동맥 질병(coronary artery disease)(협심증이나 심근경색을 일으킬 수 있음), 관상동맥 미세혈관 질병(coronary microvascular disease), 경동맥 질병(carotid artery disease)(일과성 허혈 발작 또는 뇌졸중을 일으킬 수 있음), 말초동맥 질병(peripheral artery disease)(더위 및 추위 또는 심지어 조직 죽음에 대한 민감도가 떨어지는 원인일 수 있음) 및 동맥류(aneurysms)를 포함한다.

본 발명에 따라 치료될 수 있는 추가적인 질병 및 상태는 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 나이-관련 황반변성, 뇌부종, 맥락막 부종, 맥락막염, 관상동맥 미세혈관 질환, 뇌 미세혈관 질환, 일스 질병, 부상으로 인한 부종(예를 들면, 트라우마 또는 화상), 고혈압과 관련된 부종, 사구체 혈관 누출, 출혈성 쇼크, 어바인 개스 증후군, 허혈, 황반부종[예를 들면, 혈관폐색(vascular occlusions), 안구수술 후(post-intraocular surgery)(예를 들어, 백내장 수술), 포도막염(uveitis) 또는 색소망막염(retinitis pigmentosa)에 의해 원인이되는, 게다가 당뇨에 의해 원인이되는], 신장염[예를 들면, 사구체신염(glomerulonephritis), 혈청병 신염(serum sickness nephritis) 및 Thy-1 신염(Thy-1 nephritis)], 신장병증, 신부종, 신증후군, 신경병증, 부종으로 인한 장기부전(예를 들어, 폐혈증 또는 트라우마에 의한), 자간전증, 폐부종, 폐고혈압, 신부전, 망막부종, 망막출혈, 망막정맥폐쇄(예를 들면, 말초 또는 중앙 정맥 폐쇄), 망막염, 망막증[예를 들어, 동맥경화 망막증(artherosclerotic retinopathy), 고혈압 망막증(hypertensive retinopathy), 방사선 망막증(radiation retinopathy), 겸상세포 망막증(sickle cell retinopathy) 및 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 추가적으로 당뇨성 망막증], 무음 뇌경색, 전신성 염증반응 증후군(SIRS), 이식사구체 신병증, 포도막염, 혈관 누출 증후군, 유리체 출혈 또는 폰 히플 린다 질환을 포함한다. 추가적으로, 다중의 경화증을 치료하기 위해 사용되는 특정 약물은 혈관 투과성 항진의 원인임이 알려져 있고, 다나졸이 이들 약물이 사용될 때 이런 원하지 않는 부작용을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 유전적인(hereditary) 및 혈관부종의 요구는 본 발명에 따라 치료될 수 있는 이들 질병 및 상태로부터 분명히 제외된다.

본 명세서에서 사용된 "치료하다(treat)", "치료(treating)" 또는 "처치(treatment)"는 질병 또는 상태의 증상, 기간 또는 심각성을 줄이기 위한(완전히 또는 부분적으로) 것을 의미한다. 질병의 제거(curing), 또는 질병 또는 상태의 예방 또한 고려되나, 질병 또는 상태의 치료와는 다르다.

최근의 증거는 통과세포외배출 원인 과투과성이 많은 질병 및 상태에서 조직 및 장기 손상을 최종적으로 유발하는 기전의 첫 번째 단계임을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 이들에서 보여지는 조직 및 장기 손상을 감소, 연기 또는 심지어 잠재적으로 막을 수 있는 이들 질병 및 상태에서 초기 중재의 의미를 제공한다. 예를 들어, 동물은 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질병 또는 상태의 하나로 진단되고 바로 치료받을 수 있다(이들 질병 및 상태는 상기 서술되었다).

그렇지 않으면, 증상이 존재하기 이전에 질병 또는 상태와 같은 발달을 위한 초기 신호, 또는 경향을 갖는 동물의 처치가 바람직하다. 당뇨를 위한 초기 신호, 및 위험 인자는 고혈압 및 아테롬성 동맥경화증이 잘 알려져 있고, 이들의 초기 신호 또는 위험 인자를 갖는 동물의 처치는 질병 또는 상태의 증상이 존재하기 전에 시작될 수 있다[즉, 예방을 위해(prophylactically)].

예를 들어, 당뇨를 진단받은 고객의 처치는 진단을 기반으로 바로 시작될 수 있다. 특히, 당뇨는 비록 일반적으로 불가능 하더라도, 그들이 진단을 받았을 때 대부분의 당뇨가 나타내는 증상을 보이면 존재하는 혈관 합병증의 어떤 증상 이전에 다나졸 화합물로 바람직하게 치료되어야 한다(하기 참조). 그렇지 않으면, 당뇨는 비증식성 당뇨성 망막증이 가벼울동안 치료되어야 한다(즉, 미세동맥류 및 망막내 출혈의 가벼운 수준). Diabetic Retinopathy, 페이지 9(Ed. Elia Duh, M.D., Human Press, 2008)을 참조하라. 초기 처치는 황반부종 및 증식성 당뇨성 망막증으로 망막증의 진행을 예방할 수 있는 최고의 기회를 제공할 것이다. 또한, 당뇨성 망막증의 존재는 존재하거나 발달할 수 있는 당뇨의 다른 미세혈관 합병증의 신호를 고려하고(Id., 페이지 474-477을 참조하라), 초기 처치는 이들 추가적인 합병증을 막거나 줄일 것이다. 물론, 당뇨의 혈관 합병증으로 더욱 발달된 질병 및 상태 또한 유익한 결과로 치료될 수 있다.

그러나, 상기 기재한 바와 같이 혈관 합병증은 당뇨가 진단된 시점에서 종종 이미 존재한다. 따라서, 당뇨의 초기 신호 또는 발달의 경향을 갖는 환자를 예방적으로 치료하는 것이 바람직하다. 이들 초기 신호 및 위험 인자는 높지만 당뇨로 분류될 정도["전당뇨(prediabetes)"]로 충분히 높지 않은 공복 혈당, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고혈압, 이상지질혈증(dyslipidemia)[높은 콜레스테롤, 높은 중성지방(triglycerides), 높은 저밀도 지질단백질, 및/또는 낮은 수준의 고밀도 지질단백질(high-density lipoprotein)], 비만(체질량 지수 25이상), 무기력( inactivity), 45세 이상의 나이, 수면부족(inadequate sleep), 당뇨 가족력, 소수인종(minority race), 임신성 당뇨(gestational diabetes) 가족력 및 다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome) 가족력을 포함한다.

유사하게, 고혈압을 진단받은 환자의 처치는 진단을 근거로 바로 시작될 수 있다. 고혈압은 일반적으로 어떠한 증상도 유발하지 않으나, 예방을 위한 처치가 고혈압의 발달을 위한 경향을 나타내는 환자에서 시작될 수 있다. 고혈압의 위험 인자는 나이, 인종(고혈압은 흑인에서 더욱 일반적이다), 가족력(고혈압은 가족에서 이어진다), 과체중 또는 비만, 운동부족, 흡연, 식이에서 너무 많은 소금, 식이에서 너무 적은 칼륨, 식이에서 너무 적은 비타민 D, 너무 많은 음주, 높은 스트레스, 특정 만성 상태(예를 들면, 고콜레스테롤, 당뇨, 신장 질병 및 수면성 무호흡) 및 특정 약물의 사용[예를 들면, 경구 피임약(oral contraceptives), 암페타민(amphetamines), 다이어트 약, 일부 감기 및 알레르기 약물]을 포함한다.

아테롬성 동맥경화증을 진단받은 환자의 처치는 진단을 근거로 바로 시작될 수 있다. 그러나, 아테롬성 동맥경화증의 초기 신호, 또는 발달을 위한 경향을 갖는 환자의 예방을 위한 치료가 바람직하다. 아테롬성 동맥경화증을 위한 초기 신호 및 위험 인자는 나이, 동맥류(aneurysm) 또는 조기 심장질병(early heart disease)의 가족력, 고혈압, 고콜레스테롤, 고중성지방, 인슐린 저항성, 당뇨, 비만, 흡연, 운동부족, 건강하지 않은 식이요법, 및 C-반응성 단백질(C-reactive protein)의 높은 수준을 포함한다.

혈관 투과성 항진 억제를 위한 본 발명의 방법은 혈관 투과성 항진을 억제하기 위해 이를 필요로하는 동물에 다나졸 화합물의 유효한 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, "다나졸 화합물(danazol compound)"은 다나졸, 다나졸의 프로드러그(prodrug) 및 다나졸 및 이의 프로드러그의 약학적으로 허용가능한 염을 의미한다.

다나졸[17α-프레그나-2,4-디엔-20-이노[2,3-d]-이소옥사졸-17β-올(17α-pregna-2,4-dien-20-yno[2,3-d]-isoxazol-17β-ol]은 합성 스테로이드 호르몬으로 잘 알려져 있다. 이의 구조는 다음과 같다:

다나졸의 제조 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 미국 등록특허 3,135,743 및 영국 등록특허 905,844를 참조하라. 또한, 다나졸 화합물은 Barr Pharmaceuticals, Inc., Lannett Co., Inc., Sanofi-Aventis Canada, Sigma-Aldrich, 및 Parchem Trading Ltd.를 포함하는 많은 소스로부터 상업적으로 유용하다.

"프로드러그(prodrug)"는 이와 같은 프로드러그가 동물에 투여되었을 때, 생체 내에서(in vivo) 활성 모약물(parent drug)(이 경우에는 다나졸)이 방출되는 어떤 화합물을 의미한다. 다나졸의 프로드러그는 다나졸 화합물에서 수산기(hydroxyl group)가 자유 수산기를 생성하기 위해 생체 내에서 잘릴 수 있는 어떤 그룹에 결합되어 있다. 다나졸 프로드러그의 예는 다나졸의 에스테르(esters)[예를 들어, 아세테이트(acetate), 포름산염(formate), 및 벤조산염(benzoate) 유도체]를 포함한다.

다나졸 및 이의 프로드러그의 약학적으로 허용가능한 염은 무기산[염산(hydrochloric), 브롬화 수소산(hydrobromic), 황산(sulfuric), 인산(phosphoric), 질산(nitric) 등과 같은], 유기산[아세트산(acetic), 프로피온산(propionic), 숙신산(succinic), 글리콜산(glycolic), 스테아린산(stearic), 젖산(lactic), 말산(malic), 타르타르산(tartaric), 시트르산(citric), 글루탐산(glutamic), 아스파라긴산(aspartic), 벤조산(benzoic), 살리실산(salicylic), 옥살산(oxalic), 아스코르브산(ascorbic acid) 등과 같은] 또는 염기[수산화(hydroxide), N,N-디벤질에틸렌디아민(N,N-dibenzylethylenediamine)에서 유도된 약학적으로 허용가능한 금속 양이온 또는 유기 양이온(organic cation)의 탄산염(carbonate) 또는 중탄산염(bicarbonate), D-글루코사민(D-glucosamine), 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine)과 같은]를 포함한다. 상기 염은 전통적인 방식, 예를 들어, 산과 함께 있는 화합물의 자유염기(free base) 중화에 의해서 제조된다. 특히, 다나졸과 같은 이소옥사졸(isoxazoles)은 기본 물질이 약하고, 강한 산의 추가에 의해 산-추가 염 및 강한 산의 에스테르의 추가에 의해 사차 암모늄염(quaternary ammonium salts)을 형성할 것이다[예를 들어, 강한 무기 또는 유기 술폰산의 에스테르, 바람직하게는, 요오드화 메틸(methyl iodide), 요오드화 에틸(ethyl iodide), 에틸 브로마이드(ethyl bromide), 프로필 브로마이드(propyl bromide), 부틸 브로마이드(butyl bromide), 알릴 브로마이드(allyl bromide), 메틸 설페이트(methyl sulfate), 메틸 벤젠술포네이트(methyl benezenesulfonate), 메틸-p-톨루엔-술포네이트(methyl-p-toluene-sulfonate), 벤질 클로라이드(benzyl chloride) 등과 같은 저급알킬(lower-alkyl), 저급 알케닐(lower alkenyl), 저급 아랄킬에스테르(lower aralkyl ester)]. 미국 등록특허 3,135,743을 참조하라.

상기 서술된 바와 같이, 다나졸 화합물은 혈관 투과성 항진의 억제 및 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 질병 또는 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 그렇게 하기 위해서, 다나졸 화합물을 처치를 필요로하는 동물에 투여한다. 바람직하게는, 상기 동물은 토끼, 염소, 개, 고양이, 말 또는 인간과 같은 포유동물(mammal)이다. 더욱 바람직하게는 상기 동물은 인간이다.

본 발명의 화합물(즉, 다나졸, 다나졸의 프로드러그 또는 이들 중 하나의 약학적으로 허용가능한 염)을 위한 효율적인 투여 형태, 투여 방법 및 투여량은 본 명세서에서 제공된 안내에 따라 경험적으로 결정될 것이다. 투여량은 의학 및 수의학 기술분야에 잘 알려진 치료될 특정 질병 또는 상태, 질병 또는 상태의 심각성, 투여 경로, 처치 기간, 동물에 투여될 어떤 다른 약물의 정체, 나이, 동물의 크기 및 종(species) 등에 따라 매우 달라질 것임이 통상의 기술분야에서 기술자에게 잘 이해된다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 적절한 일일량은 치료학적 영향을 생산할 수 있는 효율적인 최소량인 화합물의 양일 것이다. 그러나, 일일량은 올바른 의학적 판단 범위내에서 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다. 원하는 경우, 효율적인 일일량은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상의 서브도즈(sub-dose)로서 투여될 수 있고, 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 나누어서 투여될 수 있다. 화합물의 투여는 허용가능한 반응이 달성될 때까지 계속 지속되어야 한다.

다나졸 화합물은 신혈관형성을 억제한다고 이전에 보고되어 있다. PCT 출원번호 WO 2007/009087을 참조하라. 놀랍고, 꽤 예상밖으로, 다나졸 화합물의 신혈관형성 억제를 위해 이전에 보고된 양과 비교하여 본 발명의 실습에서 약 100-1000배 낮은 최적 투여량 및 다른 질병 및 상태의 처치를 위해 환자에 현재 투여되는 이들(일반적으로 성인을 위해 200-800 ㎎/일)보다 상당히 적게 사용할 수 있음이 발견되었다. 다나졸 화합물의 이런 낮은 투여량의 사용은 본 발명에 따라 질병 또는 상태의 초기 또는 예방적 처치를 위해 특별히 이로울 수 있는 어떤 유의적인 부작용, 아마도 모든 부작용을 피할 것이다.

특히, 혈관 투과성 항진의 억제를 위한 다나졸 화합물의 유효한 투여량은 0.1 ng/㎏/일 내지 35 ㎎/㎏/일, 바람직하게는 40 ng/㎏/일 내지 5.0 ㎎/㎏/일, 가장 바람직하게는 100 ng/㎏/일 내지 1.5 ㎎/㎏/일것이다. 유효한 투여량은 또한 관련된 체액(예를 들어, 혈액)의 농도의 결과로, 0.0001 μM 내지 5 μM , 바람직하게는 0.1 μM 내지 1.0 μM, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 내지 0.5 μM, 가장 바람직하게는 약 0.1 μM일 수 있다. 유효한 투여량은 또한 0.17%(무게/무게) 또는 그 이하, 바람직하게는 0.00034% 내지 0.17%, 가장 바람직하게는 0.0034% 내지 0.017%의 처리될 조직 또는 장기에서 농도의 결과일 수 있다. 국소(topically) 또는 국부적으로(locally) 투여될 때, 다나졸 화합물은 0.0001 μM 내지 5 μM, 바람직하게 0.1 μM 내지 1.0 μM, 더욱 바람직하게 0.1 μM 내지 0.5 μM, 가잘 바람직하게 약 0.1 μM의 농도 또는 약 0.17%(무게/무게) 또는 그 이하, 바람직하게 0.00034% 내지 0.17%, 가장 바람직하게 0.0034% 내지 0.17%의 농도로 바람직하게 투여될 것이다. 성인에게 경구로 투여될 때, 양은 바람직하게 약 1 ng/일 내지 약 100 ㎎/일 것이고, 더욱 바람직하게 양은 약 1 ㎎/일 내지 약 100 ㎎/일 것이며, 가장 바람직하게 양은 약 10 ㎎/일 내지 약 90 ㎎/일 것이고, 하루에 두번 동일한 용량으로 바람직하게 투여된다. 추가적으로, 다나졸은 세포 및 조직에 축척될 것으로 예상되고, 따라서 초기[도입(loading)] 량(예를 들어, 하루에 100 ㎎)은 유의적인 부작용 없이, 아마도 어떠한 부작용도 없이 무기한으로 투여될 수 있게 더 낮은 유지량(lower maintenance dose)(예를 들어, 하루에 1 ㎎)으로 일정기간 이후(예를 들어, 2-4주)에 감소할 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다나졸 화합물의 "혈관 투과성 항진 억제량(vascular hyperpermeability inhibiting amount)"은 이 문단에서 상기 서술한 이런 양을 의미하기 위해 정의된다.

본 발명은 또한 동물에서 내피세포의 세포골격 조절의 개선된 방법을 제공한다. 상기 방법은 동물에 다나졸 화합물의 효율적인 투여량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예는 다나졸 화합물이 F-액틴 스트레스 섬유 형성을 억제, 피질의 액틴고리의 형성 원인, 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1 phosphate, S1P)에 의한 피질의 액틴고리의 형성 촉진 및 지속, RhoA의 억제, VE-카드헤린(VE-cadherin)의 인산화 증가, 장벽-안정화 GTP아제(barrier-stabilizing GTPases)의 활성을 위해 나타남 및 미세소관(microtubules)의 안정화를 위해 나타남을 발견한데 기초한다. 세포골격의 조절은 혈관 투과성 항진을 감소 및 혈관 저투과성(vascular hypopermeability)(즉, 기저수준 아래의 투과성)을 증가시킬 수 있고, 그렇게 함으로써 내피의 항상성을 돌린다. 따라서, 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 이들 질병 및 상태는 치료될 수 있고(상기 참조), 혈관 저투과성에 의해 매개되는 이들 질병 및 상태 또한 치료될 수 있다. 질병 또는 상태의 후자형태(latter type)는 노화 간(aging liver), 아테롬 발생, 아테롬성 동맥경화증, 간경변, 간의 섬유증, 간부전 및 1차 및 전이성 간암을 포함한다.

본 발명은 추가적으로 동물의 체지방 함량 결정 및 동물의 체지방 함량에 상응하는 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량의 동물 투여에 의한 동물에서 내피세포의 세포골격 조절 방법을 제공한다. 한 측면에서, 결정 단계는 동물의 체지방 함량을 계산하는 것을 포함한다. 논의된 바와 같이, 동물의 체지방 함량은 동물의 체질량 지수(BMI), 체지방률, 지방제외 체지방 및 신체 표면영역을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 체지방 함량은 동물의 BMI에 의해 측정된다.

내피세포의 세포골격 조절 방법은 동물에 다나졸 화합물의 효율적인 투여량을 투여하는 것을 포함한다. "다나졸 화합물" 및 "동물(aminal)"은 상기 서술된 바와 동일한 의미를 갖는다.

세포골격 조절을 위한 본 발명의 화합물(즉, 다나졸, 다나졸의 프로드러그 또는 이들 중 하나의 약학적으로 허용가능한 염)효율적인 투여 형태, 투여 방법 및 투여량은 본 명세서에서 제공된 안내에 따라 경험적으로 결정될 것이다. 투여량은 의학 및 수의학 기술분야에 잘 알려진 치료될 특정 질병 또는 상태, 질병 또는 상태의 심각성, 투여 경로, 처치 기간, 동물에 투여될 어떤 다른 약물의 정체, 나이, 동물의 크기 및 종(species) 등에 따라 매우 달라질 것임이 통상의 기술분야에서 기술자에게 잘 이해된다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 적절한 일일량은 치료학적 영향을 생산할 수 있는 효율적인 최소량인 화합물의 양일 것이다. 그러나, 일일량은 올바른 의학적 판단 범위내에서 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다. 원하는 경우, 효율적인 일일량은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그 이상의 서브도즈(sub-dose)로서 투여될 수 있고, 하루에 걸쳐 적절한 간격으로 나누어서 투여될 수 있다. 화합물의 투여는 허용가능한 반응이 달성될 때까지 계속 지속되어야 한다.

특히, 내피세포의 세포골격 조절을 위한 다나졸 화합물의 유효한 투여량은 0.1 ng/㎏/일 내지 35 ㎎/㎏/일, 바람직하게는 40 ng/㎏/일 내지 5.0 ㎎/㎏/일, 가장 바람직하게는 100 ng/㎏/일 내지 1.5 ㎎/㎏/일것이다. 유효한 투여량은 또한 관련된 체액(예를 들어, 혈액)의 농도의 결과로, 0.0001 μM 내지 5 μM , 바람직하게는 0.1 μM 내지 1.0 μM, 더욱 바람직하게는 0.1 μM 내지 0.5 μM, 가장 바람직하게는 약 0.1 μM일 수 있다. 유효한 투여량은 또한 0.17%(무게/무게) 또는 그 이하, 바람직하게는 0.00034% 내지 0.17%, 가장 바람직하게는 0.0034% 내지 0.017%의 처리될 조직 또는 장기에서 농도의 결과일 수 있다. 국소(topically) 또는 국부적으로(locally) 투여될 때, 다나졸 화합물은 0.0001 μM 내지 5 μM, 바람직하게 0.1 μM 내지 1.0 μM, 더욱 바람직하게 0.1 μM 내지 0.5 μM, 가잘 바람직하게 약 0.1 μM의 농도 또는 약 0.17%(무게/무게) 또는 그 이하, 바람직하게 0.00034% 내지 0.17%, 가장 바람직하게 0.0034% 내지 0.17%의 농도로 바람직하게 투여될 것이다. 성인에게 경구로 투여될 때, 양은 바람직하게 약 1 ng/일 내지 약 100 ㎎/일 것이고, 더욱 바람직하게 양은 약 1 ㎎/일 내지 약 100 ㎎/일 것이며, 가장 바람직하게 양은 약 10 ㎎/일 내지 약 90 ㎎/일 것이고, 하루에 두번 동일한 용량으로 바람직하게 투여된다. 추가적으로, 다나졸은 세포 및 조직에 축척될 것으로 예상되고, 따라서 초기[도입(loading)] 량(예를 들어, 하루에 100 ㎎)은 유의적인 부작용 없이, 아마도 어떠한 부작용도 없이 무기한으로 투여될 수 있게 더 낮은 유지량(lower maintenance dose)(예를 들어, 하루에 1 ㎎)으로 일정기간 이후(예를 들어, 2-4주)에 감소할 것이다.

본 발명의 화합물(즉, 다나졸, 이의 프로드러그 및 이들 중 하나의 약학적으로 허용가능한 염은 경구(orally), 비강(nasally), 비경구(parenterally)[예를 들어, 정맥내(intravenously), 복강내(intraperitoneally), 피하(subcutaneously) 또는 근육(intramuscularly)], 경피(transdermally), 안구내(intraocularly) 및 국소[구강(buccally) 및 혀밑(sublingually)포함]를 포함하는 어떤 적절한 투여경로에 의해 치료를 위해 동물 환자에 투여될 것이다. 일반적으로 본 발명에 따르면 치료가능한 어떤 질병 또는 상태를 위해 경구 투여가 바람직하다. 눈의 질병 및 상태의 처치를 위한 바람직한 투여 경로는 경구, 안구내 및 국소이다. 가장 바람직하게는 경구이다. 이전에 보고되지 않은 약물의 경구 투여에 의해 이와 같은 질병 및 상태의 성공적인 처치 이후, 눈의 질병이 다나졸 화합물의 경구 투여에 의해 치료될 수 있음을 매우 예상밖이고, 놀랍다.

뇌의 질병 및 상태를 처치하기 위한 바람직한 투여 경로는 경구 및 비경구이다. 가장 바람직하게는 경구이다.

본 발명의 화합물이 단독으로 투여될 수 있는 동안, 약학적 제형(pharmaceutical formulation)(조성물)으로 화합물을 투여하는 것은 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분으로 본 발명의 화합물, 또는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로, 하나 또는 그 이상의 다른 화합물, 약물 또는 다른 물질(material)과 함께 혼합물(admixture)에서 활성 성분으로서의 화합물을 포함한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 함께 호환이 될 수 있는 "허용가능한(acceptable)" 이어야하고, 동물에 손상을 주지 않아야 한다. 약학적으로 허용가능한 염은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 선택된 투여 경로에 개의치 않고, 본 발명의 화합물은 통상의 기술분야에서 기술자에게 잘 알려진 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여형태로 제형화된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences를 참조하라.

경구투여를 위해 적합한 본 발명의 제형은 캡슐, 카쳇(cachets), 알약(pill), 정제(tablet), 가루(powder), 과립(granules) 또는 용액 또는 수용성 또는 비-수용성 액체에의 현탁액(suspension)으로, 또는 수중유적(oil-in-water) 또는 유중수적(water-in-oil) 액체 에멀젼(emulsion)으로, 또는 묘약(elixir) 또는 시럽(syrup)으로, 또는 사탕형 알약(pastilles)[젤라틴(gelatin) 및 글리세린(glycerin)과 같은 불활성 염기(inert base), 또는 수크로즈(sucrose) 및 아카시아(acacia)] 등의 형태일 것이고, 각각은 화합물의 미리 결정된 양 또는 활성성분으로 본발명의 화합물을 포함한다. 화합물 또는 본 발명의 화합물은 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트(paste)로 투여될 것이다.

경구 투여[캡술, 정제, 알약, 드라제(dragee), 가루, 과립 등)를 위한 본 발명의 고체 투여형태에서, 유효성분(즉, 다나졸, 다나졸의 프로드러그, 이들 중 하나의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기의 조합)은 시트르산 나트륨(sodium citrate) 또는 인산이칼슘(dicalcium phosphate)과 같은 한 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 하기의 어떤 것과 혼합된다: (1) 전분(starches), 락토즈(lactose), 수크로즈(sucrose), 글루코스(glucose), 만니톨(mannitol) 및/또는 규산(silicic acid)과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카복실메틸셀룰로즈(carboxymethylcellulose), 알지네이트(alginates), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 수크로즈 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤(glycerol)과 같은 습윤제; (4) 아가-아가(agar-agar), 탄산칼슘(calcium carbonate), 전분(potato) 또는 타피오카 전분(tapioca starch), 알긴산(alginic acid), 특정 실리케이트(silicates) 및 탄산나트륨(sodium carbonate)과 같은 분해제제(disintegrating agents); (5) 파라핀(paraffin)과 같은 용액지연 제제(solution retarding agents); (6) 4가 암모늄 화합물(quaternary ammonium compounds)과 같은 흡수촉진제; (7) 예를 들어, 세틸알콜(cetyl alcohol) 및 글리세롤 모노스테레이트(glycerol monosterate)와 같은 습윤제; (8) 카올린(kaolin) 및 벤토나이트 점토(bentonite clay)와 같은 흡수제; (9) 탈크(talc), 칼슘 스테아레이트(calcium stearate), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 고체 폴리에틸렌 글리콜(solid polyethylene glycols), 라우릴 황산 나트륨(sodium lauryl sulfate) 및 이의 혼합물과 같은 윤활제; (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약학적 조성물은 또한 완충화제를 포함할 것이다. 유사한 형태의 고체 조성물은 락토오즈 또는 유당(milk sugar)뿐만 아니라 고분자 화합물 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 첨가제를 사용하여 소프트(soft) 및 하드(hard)-채워진 젤라틴 캡슐에서 충전제가 첨가될 것이다.

정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 보조적인 성분과 함께 압축 또는 주형(molding)으로 만들어질 것이다. 압축된 정제는 바인더(binder)[예를 들어, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈(hydroxypropylmethyl cellulose)], 윤활제(lubricant), 불활성 희석제(inert diluent), 방부제, 붕해제[예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트(sodium starch glycolate) 또는 가교 결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈(cross-linked sodium carboxymethyl cellulose), 계면활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 것이다. 주형화된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 가루화된 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 주형화에 의해 제조될 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 정제, 및 다른 고체 투여 형태, 예를 들어, 드라제, 캡슐, 알약 및 과립은 장용성 제피(enteric coating)과 같은 코팅(coating) 및 껍질(shell)과 함께 선택적으로 만들어지고, 제조될 것이며, 다른 코팅은 약학적 제형화 기술분야에 잘 알려져 있다. 그들은 또한 그들의 사용에서 유효성분의 느린 또는 조절된 방출을 제공하기 위해 예를 들어, 이상적인 방출 프로필(profile)을 제공하기 위한 다양한 비율의 하이드록시프로필메틸, 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 마이크로스피어(microsphere)로 제형화될 것이다. 이들은 멸균, 예를 들어, 박테리아-유지 필터(bacteria-retaining filter)를 통해 여과될 것이다. 이들 조성물은 또한 불투명화제를 선택적으로 포함할 것이고, 상기 조성물은 바람직하게 선택적인 지연방법에서 위장과(gastrointestinal tract)의 특정 위치에서 유효성분만 방출될 것이다. 사용될 수 있는 포매한(embedding) 조성물의 예는 중합물질(polymeric substance) 및 왁스(waxes)를 포함한다. 상기 유효성분은 또한 마이크로캡슐 제형일 수 있다.

본 발명의 화합물의 경구투여를 위한 액체 투여형태는 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼(microemulsion), 용액(solutions), 현탁액(suspension), 시럽 및 묘약을 포함한다. 유효성분에 추가적으로, 액체 투여형태는 예를 들면, 물 또는 다른 용액(solvent), 가용화제 및 에틸알콜(ethyl alcohol), 이소프로필알콜(isopropyl alcohol), 에틸 카보네이트(ethyl carbonate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 벤질알콜(benzyl alcohol), 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-butylene glycol), 오일[특히, 면실유(cottonseed), 땅콩(groundnut), 옥수수, 세균, 올리브, 캐스터(castor) 및 참깨 오일], 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜(tetrahydrofuryl alcohol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols) 및 소르비탄(sorbitan)의 지방산 에스테르(fatty acid ester)와 같은 유화제 및 이들의 혼합물과 같이 통상의 기술분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함할 것이다.

불활성 희석제에 비해, 경구 조성물은 또한 습윤제, 에멀젼화(emulsifying)와 같은 아쥬반트(adjuvant) 및 현탁제(suspending agents), 감미료(sweetening), 향료, 색소, 향료 및 방부제를 포함할 수 있다.

유효성분에 더하여 현탁액은 예를 들면, 에톡실화 이소스테아릴 알콜(ethoxylated isostearyl alcohols), 폴리옥시에틸렌 소르비톨(polyoxyethylene sorbitol) 및 소르비탄 에스테르(sorbitan esters), 결정 셀룰로즈(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이드록시드(aluminum metahydroxide), 벤토나이트(bentonite), 아가-아가 및 트라가칸트(tragacanth), 및 이의 혼합물과 같은 현탁제를 포함할 것이다.

본 발명의 한 실시예에서, 다나졸 화합물은 시간-방출 제형이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "시간-방출(time-release)"은 다나졸 화합물 및/또는 약학적 조성물이 예를 들어, 다당류, 생체적합성 중합체(biocompatible polymers), 다른 중합체 매트릭스(other polymeric matrices), 캡슐, 마이크로 캡슐, 미립자(microparticles), 불루스 제제, 삼투펌프(osmotic pumps), 확산장치(diffusion devices), 리포좀(liposomes), 리포스페어(lipospheres), 건조분말, 또는 경피전달 시스템과 함께 제형화될 때, 수득된 방출을 조절 또는 지속되는 것을 나타낸다. 본 발명의 다른 조절된 방출 조성물은 동물에 투여되기 위한 액체, 제 자리에서(in situ) 고체 또는 겔(gel) 형태를 포함한다. 게다가, 상기 용어 "시간-방출 제형(time-release formulation)"은 약물의 조절된 방출을 성취하기 위해 유용한 생분해성 중합체의 종류, 예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체(copolymer), 폴리입실론 카프로락톤(polyepsilon caprolactone), 폴리하이드록시 부틸산(polyhydroxy butyric acid), 폴리오쏘에스테르(polyorthoesters), 폴리아세탈(polyacetals), 폴리디하이드로피란(polydihydropyrans), 폴리시아노아실레이트(polycyanoacylates), 및 하이드로겔(hydrogel)의 가교 또는 양친매성 블록 공중합체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 시간-방출 제형은 리포좀, 다당류 및 이의 조합물과 같은 요소를 포함한다.

본 발명은 또한 눈의 처치를 위해 적절한 약학적 제품을 제공한다. 이와 같은 약학적 제품은 약학적 조성물, 장치 및 임플란트(implant)(조성물 또는 장치인)를 포함한다.

화합물 또는 본 발명의 화합물을 안구안으로 안구내 주입을 위한 약학적 제형(조성물)은 용액, 에멀젼, 현탁액, 소립자(particle), 캡슐, 마이크로스피어, 리포좀, 매트릭스 등을 포함한다. 본 명세서에 참조로 통합되어 전체공개된 미국 등록특허 6,060,463, 미국 출원특허 2005/0101582, 및 PCT 출원번호 WO 2004/043480를 참조하라. 예를 들어, 안구내 주입을 위한 약학적 제형은 조합물에서, 항산화제, 완충제, 서스펜션화제(suspending agent), 농조화제(thickening agent) 또는 점도 증강제(viscosity-enhancing agent)[히아루론산 중합체(hyaluronic acid polymer)와 같은] 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 살균한 등장성 수용액 또는 비등장성 수용액, 현탁액 또는 에멀젼과 함께 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다. 적절한 수용성 및 비수용성 담체의 예는 물, 살린(saline)(바람직하게 0.9%), 물에 있는 포도당(dextrose in water)(바람직하게 5%), 완충용액, 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide), 알콜 및 폴리올(polyol)(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은)을 포함한다. 이들 조성물은 습윤제, 에멀젼화(emulsifying) 및 분산제와 같은 아쥬반트(adjuvant)를 또한 포함할 것이다. 추가적으로, 주입가능한 약학적 형태의 지속된 흡수는 중합체 및 젤라틴과 같은 흡수 지연 제제에 포함되어 가져올 것이다. 주입가능한 데포(depot) 형태는 폴리락타이드-폴리글리코라이드(polylactide-polyglycolide)와 같은 생분합성 중합체로 만들어진 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어 안으로 약을 삽입하여 만들것이다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오소에스테르)[poly(orthoester)], 폴리(글리콜릭)산[poly(glycolic) acid], 폴리(락틱)산[poly(lactic) acid], 폴리카프로락톤(polycaprolactone) 및 폴리(안하이드라이드)[poly(anhydrides)]를 포함한다. 데포 주입가능한 제형은 눈 조직과 맞는 리포좀[디팔미토일 포스포파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine)과 같은 일반 성분으로 구성된] 또는 마이크로에멀젼에 약물을 포집하여 또한 제조된다. 약물에 대한 중합체 또는 지질의 비율에 의존하여, 특정 중합체 또는 지질 요소의 성질, 사용된 리포좀의 형태, 및 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어로 코팅되었는지 아닌지에 따라, 마이크로캡슐, 마이크로스피어 및 리포좀으로부터 약물의 방출률이 조절된다.

본 발명의 화합물은 또한 안구 임플란트로서 외과적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리비닐 알콜 또는 폴리비닐 아세테이트의 확산성의 벽을 갖고 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 저장용기는 공막(sclera)안에 또는 위에 임플란트될 수 있다. 다른 예로서, 화합물 또는 본 발명의 화합물은 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리(글리콜릭)산, 폴리(락틱)산, 폴리(안하이드라이드)[poly(anhydrides)]와 같은 중합체, 또는 세바스산(sebacic acid)과 같은 지질로 만들어진 중합체 매트릭스에 삽입될 수 있고, 공막 위 또는 눈안에 임플란트될 것이다. 이는 일반적으로 국소 또는 국부 마취제를 맞거나, 각막(cornea) 뒤로 만들어진 소절개(small incision)을 사용한 동물에 동반될 수 있다. 매트릭스는 그리고나서 절개를 통해 삽입되고, 공막으로 봉합된다.

본 발명의 화합물은 또한 눈에 국소적으로 투여될 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예는 눈에 적용하기 위해 적합한 국부의 약학적 조성물이다. 눈에 적용하기 위해 적합한 국소의 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 분산(dispersion), 방울(drop), 겔(gel), 하이드로겔(hydrogel) 및 연고(ointment)를 포함한다. 본 명세서에 참조로 통합되어 전체공개된 미국 등록특허 5,407,926 및 PCT 출원번호 WO 2004/058289, WO 01/30337 및 WO 01/68053을 참조하라.

눈에 적용하기 위한 국소적 제형은 수용성 또는 비수용성 염기에 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다. 국소적 제형은 흡수증강제(absorption enhancers), 투과 향상제(permeation enhancers), 증점제(thickening agents), 점도 증강제(viscosity enhancers), pH 조절 및/또는 유지를 위한 제제(agents for adjusting and/or maintaining the pH), 삼투압을 조절하기 위한 제제(agents to adjust the osmotic pressure), 방부제(preservatives), 계면활성제(surfactants), 완충용액, 염(바람직하게는, 염화나트륨), 현탁제, 분산제, 가용화제, 안정화제 및/또는 등장화제를 포함한다. 눈에 적용하기 위한 국소적 제형은 바람직하게 눈으로 화합물 또는 본 발명의 화합물의 흡수 또는 투과를 촉진하기 위한 흡수 또는 투과 촉진제 및/또는 눈에서 화합물 또는 본 발명의 화합물의 체류 시간을 증가시킬 수 있는 증점제 또는 점도 증강제를 포함할 것이다. PCT 출원번호 WO 2004/058289, WO 01/30337 및 WO 01/68053을 참조하라. 흡수/투과 촉진제의 예는 메틸술포닐메탄(methylsulfonylmethane), 디메틸술폰사이드(dimethylsulfoxide), 카르복실산(carboxylic acid) 및 계면활성제의 단독 또는 조합물을 포함한다. 증점제 및 점도 증강제의 예는 덱스트란(dextran), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 다당류 겔, Gelrite®, 셀룰로스의 중합체(cellulosic polymers)[하이드록시프로필 메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose)와 같은], 카복실-포함 중합체(carboxyl-containing polymer)(아크릴산의 중합체 또는 공중합체와 같은), 폴리비닐 알콜 및 히알루론산 또는 이의 염을 포함한다.

눈의 처치를 위해 적합한 액체 투여형태(예를 들어, 용액, 현탁액, 확산 및 방울)는 용액, 분산 또는 현탁액의 형태를 위해 예를 들어, 물, 살린, 수용성 포도당, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 전달매체에 화합물 또는 본 발명의 화합물을 용해, 분산, 현탁시켜 제조될 수 있다. 원하는 경우, 약학적 제형은 또한 예를 들어, 나트륨 아세테이트(sodium acetate), 솔비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate), 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트(triethanolamine sodium acetate), 트리에탄올아민 올레이트(triethanolamine oleate) 등과 같은 습윤제 또는 윤화제, pH 완충제와 같은 비독성 보조물질(non-toxic auxillary substances)의 소량을 포함할 것이다.

눈의 처치를 위해 적합한 수용성 용액 및 현탁액은 화합물 또는 본 발명의 화합물에 추가적으로, 방부제, 계면활성제, 완충용액, 염(바람직하게는, 염화나트륨), 탄력성 제제(tonicity agents) 및 물을 포함할 수 있다. 만약 현탁액이 사용되었다면, 입자 크기는 눈에 자극을 최소화하기 위해 10 ㎛보다 작아야 한다. 만약 용액 또는 현탁액이 사용되었다면, 눈에 전달되는 약은 눈으로부터 과도한 유출을 피하기 위해 50 ㎕를 넘으면 안된다.

눈의 처치를 위해 적합한 콜로이드 현탁액은 마이크로입자[즉, 마이크로스피어, 나노스피어(nanosphere), 마이크로캡슐 또는 나노캡슐(nanocapsule), 여기서 마이크로스피어 및 나노스피어는 마이크로캡슐 및 나노캡슐 제형이 실제적으로 압축되는 동안 일반적으로 제형에 잡히거나, 흡수된 또는 그렇지않으면 포함된 중합체 매트릭스의 하나로된 입자이다)로부터 일반적으로 형성된다. 이들 마이크로입자의 최대 크기제한은 약 5 μ 내지 약 10 μ이다.

눈의 처치를 위해 적합한 눈의 연고는 미네랄 오일(mineral oil), 액체 라놀린(liquid lanolin), 백색 바셀린(white petrolatum), 이들의 둘 또는 셋 모두의 조합물, 또는 폴리에틸렌 미네랄 오일 겔(polyethylene-mineral oil gel)과 같은 적절한 염기에 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함한다. 방부제가 선택적으로 포함된다.

눈의 처치를 위해 적합한 눈의 겔은 카포볼-940(Carpobol-940)과 같은 친구성 염기 또는 에탄올, 물 및 프로필렌 글리콜의 조합물(예를 들어, 40:40:20의 비율), 하이드록시에틸셀룰로스(hydroxylethylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로스(hydroxypropylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropylmethylcellulose) 또는 암모니아화된 글리시리지네이트(ammoniated glycyrrhizinate)과 같은 겔화제(gelling agent)에 현탁된 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함한다. 방부제 및/또는 탄력성 제제가 선택적으로 포함될 것이다.

눈의 처치를 위해 적합한 하이드로겔은 팽창가능한(swellable), 증점제 또는 점도 증강제와 같이 상기 서술된 것과 같은 겔-형성 중합체(gel-forming polymer)의 삽입에 의해 형성되고, 이때, "하이드로겔"로서 통상의 기술분야에 언급된 제형이 "농화된(thickened)" 용액 또는 현탁액으로 언급된 제형보다 일반적으로 높은 점성을 갖는 것은 제외된다. 이와 같이 전형성된(preformed) 하이드로겔과 반대로, 제형은 제 자리에서(in situ) 하이드로겔을 형성하기 위해 제조된 뒤, 눈에 적용될 것이다. 이와 같은 겔은 상온에서 액체이나, 체액에 접촉한 장소에서와 같이 높은 온도에서 겔이다[그러므로, "열가역적(thermoreversible)"으로 불린다). 이런 특징을 전하는 생체적합한 중합체는 아크릴산 중합체 및 공중합체를 포함한다. N-이소프로필아크릴아마이드(N-isopropylacrylamide) 유도체 및 ABA는 에틸렌 옥시드(ethylene oxide) 및 프로필렌 옥시드(propylene oxide)["폴록사머(poloxamer)"로 일반적으로 언급되고, BASF-Wayndotte의 상품명 Pluronic®으로 이용가능한)의 공중합체를 막는다.

바람직한 분산은 리포좀내 둘러싸인 제형인 리포좀(liposomal)이다(미세한 소포는 수용성 부분 및 지질 이중층의 변형으로 구성된다).

점안액(eye drop)은 하나 또는 그 이상의 분산제, 가용화제 또는 현탁제로 또한 구성되는 수용성 또는 비수용성 염기와 함께 제형화될 수 있다. 점안액은 간단하게 닫힌 병의 눈 점적기(simple eye dropper-capped bottle) 또는 액체 내용물을 전달하기 위해 적응된 플라스틱 병, 특별한 모양의 폐쇄(specially shaped closure)에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 눈으로 삽입되는 약물이 함유된 고체 담체에 의해 국소적으로 적용될 수 있다. 약물 방출은 중합체, 삼투(osmosis), 또는 이의 조합의 용해 또는 생물침식(bioerosion)에 의해 일반적으로 영향을 받는다. 몇몇의 매트릭스 형태 전달 시스템이 사용될 수 있다. 이와 같은 시스템은 원하는 본 발명의 화합물과 함께 침윤된(impregnated) 또는 흡수된(soaked) 친수성 소프트 콘택트렌즈뿐만 아니라, 눈에 위치한 후 제거될 필요가 없는 생분해성 또는 수용성 장치를 포함한다. 이들 수용성 안구 삽입제는 눈에 의해 용인될 수 있는 어떤 분해가능한 물질로 구성될 수 있고, 투여될 본 발명의 화합물과 호환이 된다. 이와같은 물질은 폴리(비닐알콜), 폴리아크릴아마이드의 중합체 및 공중합체, 에틸아크릴레이트 및 비닐피롤리돈(vinylpyrrolidone)뿐만 아니라, 키틴(chitin)과 같은 교차결합된 폴리펩타이드 또는 다당류를 포함하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 화합물의 국소투여(즉, 눈이 아닌) 또는 경피(transdermal) 투여의 다른 종류를 위한 투여 형태는 가루, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 점안액 및 흡입제를 포함한다. 유효성분은 약학적으로 허용가능한 담체, 및 다른 완충용액, 또는 필요한 압축가스와 함께 멸균상태로 혼합될 것이다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 유효성분에 추가적으로, 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스(tragacanth), 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘(silicones), 벤토나이드(bentonite), 규산, 황석(talc) 및 산화아연(zinc oxide), 또는 이의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 것이다. 가루 및 스프레이는 유효성분에 추가적으로, 락토오즈, 황석, 규산, 수산화 알루미늄(aluminum hydroxide), 규산 칼슘(calcium silicate) 및 폴리아마이드 가루 또는 이들 물질의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 스프레이는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본(chlorofluorohydrocarbon)과 같은 통상적인(customary) 압축가스 및 부탄(butane) 및 프로판(propane)과 같은 휘발성의 치환되지 않은 탄화수소(volatile unsubstituted hydrocarbon)를 포함할 수 있다. 경피 패치(transdermal patches)는 신체로 본 발명의 화합물의 조절된 배달을 제공하는 것에서 추가의 이점을 갖는다. 이와 같은 투여 형태는 엘라스토머 매트릭스 물질(elastomeric matrix material)과 같은 적절한 배지에서 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 용해, 분산 또는 그렇지 않으면 삽입하여 만들 수 있다. 흡수 증강제는 피부를 통한 화합물의 유동(flux)을 증가시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 이와 같은 유동률은 중합체 매트릭스 또는 겔에서 제공되는 속도조절 막(rate-controlling membrane) 또는 화합물의 분산 중 하나에 의해 조절될 수 있다. 약물이 함유된 고체담체[예를 들어, 드레싱(dressing)]는 국소적 투여를 위해 또한 사용될 수 있다.

약학적 제형은 흡입제(inhalation) 또는 흡입제(insufflation) 또는 코로 투여에 의한 투여를 위해 적절한 것들을 포함한다. 흡입제에 의한 위쪽(upper)(코의) 또는 아래쪽(lower) 기도에 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 취입기(insufflator), 분무기(nebulizer) 또는 가압팩(pressurized pack) 또는 에어로졸 스프레이(aerosol spray)를 전달의 다른 편리한 방법으로 편리하게 전달된다. 가압팩은 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리틀로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소, 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 압축가스로 구성될 것이다. 가압 에어로졸의 경우, 투여유닛(dosage unit)은 정량된 양을 전달하기 위한 밸브(valve)의 제공에 의해 결정될 것이다.

그렇지 않으며, 흡입제(inhalation) 또는 흡입제(insufflation)에 의한 투여를 위해, 조성물은 건조가루의 형태, 예를 들면, 가루는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적절한 가루염기의 가루와 혼합된다. 상기 가루 조성물은 예를 들면, 캡슐 또는 카트리지(cartridge), 또는 예를 들어, 흡입기(inhalator), 취입기(insufflator) 또는 정량된 양 흡입기(inhaler)의 지원과 함께 투여될 것인 가루로부터의 젤라틴 또는 블리스터팩(blister pack)에서 형성된 유닛 투여량을 나타낼 것이다.

비강내의 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 점비약(nose drop) 또는 액체 스프레이에 의해, 플라스틱 병 분무기 또는 정량된 양의 흡입기와 같은 것에 의해 투여될 것이다. 액체 스프레이는 가압팩으로부터 편리하게 전달된다. 분무기의 전형은 Mistometer(Wintrop) 및 Medihaler(Riker)이다.

점비약은 또한, 하나 또는 그 이상의 분산제, 가용화제 또는 현탁제를 포함하는 수용성 또는 비수용성 염기와 함께 제형화될 것이다. 점비약은 간단하게 닫힌 병의 눈 점적기 또는 액체 내용물을 전달하기 위해 적응된 플라스틱 병, 특별한 모양의 폐쇄에 의해 전달될 수 있다.

비경구 투여를 위해 적절한 본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균된 등장성의 수용성 또는 비수용성 용액, 분산, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용되기 바로 직전에 멸균된 주입가능한 용액 또는 분산안으로 재구성될, 항산화제, 완충용액, 의도적인 받는사람의 혈액과 등장성인 제형을 만든 용제(solute) 또는 현탁제 또는 증점제를 포함한 것과 함께 조합으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다. 또한, 약물-코팅된 스텐트(stent)가 사용될 것이다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용된 적절한 수용성 및 비수용성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은), 및 이의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물 오일, 및 에틸올레이트(ethyl oleate)와 같은 주입가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적절한 유동성(fluidity)은 예를 들어, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산의 경우에서 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 습윤제, 에멀젼화 및 분산제와 같은 아쥬반트를 포함할 것이다. 이는 또한 조성물에서 당(sugar), 염화나트륨 등과 같은 등장성 제제를 포함하기 위해 바람직할 것이다. 추가적으로, 주입가능한 약학적 형태의 지속된 흡수는 알루미늄 모노스터레이트(aluminum monosterate) 및 젤라틴과 같은 흡수를 늦추는 제제의 포함에 의해 가져와질 것이다.

어떤 경우에, 약물의 효과를 연장시키기 위하여, 피하의 또는 근육내의 주입으로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 낮은 수용성을 갖는 크리스탈 또는 무정형의(amorphous) 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 동반될 것이다. 약물의 흡수율은 이의 용해율에 의존적이고, 차례로 크리스탈 크기 및 크리스탈 형태에 의존적이다. 그렇지 않으면, 비경구적으로투여된 약물의 연장된 흡수는 오일 전달매체에 약물의 용해 또는 현탁에 의해 동반된다.

주입가능한 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에서 약물의 마이크로캡슐 매트릭스 형성에 의해 만들어진다. 약물에 대한 중합체의 비율, 및 사용된 특정 중합체의 본질에 근거하여, 약물 방출율은 조절될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오쏘에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 데포 주입가능한 제형은 또한 신체 조직과 호환가능한 리포좀 또는 마이크로에멀전에의 약물 포집에 의해 준비된다. 주입가능한 물질은 멸균, 예를 들어, 박테리아-유지 필터를 통한 여과될 것이다.

제형은 유닛-투여(unit-dose) 또는 다중-투여(multi-dose) 봉합된 용기, 예를 들어, 앰플(ampules) 및 바이알(vials)에 나타날 수 있고, 사용 바로 직전에 오직 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주입을 위한 물을 추가하는 것이 요구되는 냉동건조된 상태로 보관될 것이다. 즉석 주입 용액 및 현탁액은 상기 서술된 형태의 멸균된 가루, 과립 및 정제로 준비될 것이다.

다나졸 화합물은 혈관 투과성 항진 또는 세포골격의 기능장애를 치료하기 위해 단독으로 처리될 것이다. 그렇지 않으면, 다나졸 화합물은 질병 또는 상태의 치료를 위해 적절한 하나 또는 그 이상의 다른 처리 또는 약물과 함께 조합으로 처리될 것이다. 예를 들어, 다나졸 화합물은 다른 처치 또는 약물의 전, 동시에[일제히(simultaneously) 포함), 또는 후에 투여될 수 있다. 다른 약물의 경우, 약물 및 다나졸 화합물은 약학적 화합물 각각 또는 동일한 약학적 조성물의 부분으로써 투여될 것이다. 적절한 약물은 본 명세서에 참조로 통합되어 전체공개된 미국 출원번호 12/820,325에 서술되었다.

예의 일부에서 증명된 바와 같이, 본 발명자들은 빛 간섭성 단층촬영법(optical coherence tomography, OCT)에 의해 측정된 바와 같이 중심 서브필드 망막두께(central subfield retinal thickness)에서 감소의 결과인 당뇨성 황반부종 환자에 경구 처치로서 투여될 때 다나졸 화합물을 결정하였다. 추가적으로, 인간 내피세포에 다나졸 화합물을 처리한 시험관 내(in vitro) 전임상 연구는 혈관 투과성에서 감소에 상응하는 내피장벽 기능의 촉진을 증명하였다. VEGF를 표적으로하는 약물의 안내 주입과 달리, 다나졸은 경구로 투여되고, 안전 프로필이 강하게 증명되었다.

혈관 투과성에 다나졸의 영향은 또한 망막의, 배꼽의(umbilical), 뇌, 및 신장의 미세혈관 원점의 인간 내피세포를 사용하여 연구되었다. 이들 발견은 이상성 용량반응(biphasic dose-response)이 혈관 투과성에 다나졸 화합물을 위해 존재함을 나타낸다(도 1). 트랜스웰 시스템에서 인간 내피세포의 단층을 통한 HRP(horseradish peroxidase)의 이동 추적은 100- 내지 500- 나노몰(nanomolar) 농도로 나타내고, 다나졸은 세포를 통한 계대를 감소시킨다. 농도의 증가는 그러나, 다나졸 화합물의 유익한 영향의 반대 및 부세포적 투과성에서 증가를 유도한다. 다나졸 화합물의 유익한 영향은 또한 매우 빠르게 나타난다. 다나졸의 장벽 강화 농도에의 노출된 분내에서, 내피세포는 F-액틴 피질의 고리 형성이 존재하고, 팔로이딘 염색(phalloidin ataining) 및 통과전기 내피 저항(transelectrical endothelial resistance, TEER) 모델에 의해 증명된 바와 같이 내피장벽 기능이 증가한다(도 2 및 도 3). 추가적으로, 이들 농도에서 다나졸 화합물은 TNF-α 또는 트롬빈(thrombin)과 같은 염증성 분자(proinflammatory molecules)와 함께 스트레스 섬유의 자극에 의해 형성된다(도 3).

본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 신규한 특징이 하기의 비-제한적인 실시의 고려에 의해 통상의 기술분야에 나타날 것이다.

실시예

실시예 1:

본 실시예는 당뇨성 황반부종(DME)를 가진 환자에게 다나졸의 경구투여가 부작용의 증거가 없음과 함께 안전하다는 것을 증명한다. 다나졸은 체질량 지수(BMI)에 따른 투여량 조절 방법에서 당뇨성 부종황반부종을 감소시킬 수 있으며 시력을 개선시키는 경향이 있다. 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이 다나졸은 내피 세포에 이상성 효과(biphasic effect)를 가질 수 있다: 다나졸은 더 높은 농도에서 혈관 투과성의 증가가 관찰되는 반면에, 저용량에서 혈관 누출(vascular leakage)을 감소시킨다. 상기 이상성 효과는 하기 설명된 상이한 BMI에 따른 생체 내에서 다나졸의 효과에 의해 설명된다.

DME를 위한 다나졸의 안정성 및 효과를 측정하기 위한 12주간 무작위 위약대조군 이중맹검 연구는 캐나다의 St. Michael's Hospital에서 수행되었다. DME 및 중심 부분 망막 두께(central subfield retinal thickness)가 300 ㎛ 또는 그 이상인 환자들을 포함하였다. 총 34명의 환자가 안정성 실험 대상(safety set population)으로 구성되었다. 효능평가 인구(n=23)는 치료 4주에서 약물 연구가 80% 완료되거나 더 좋은 안정성 실험 대상인 환자로 구성되었다. 첫 번째 엔드포인트(endpoint)는 12주 치료에서 기준선으로부터 중심 부분 망막 두께의 변화이며, 두 번째 엔드포인트은 12주 치료에서 베이스라인으로부터 망막 부피 및 조기 치료 당뇨성 망막증 연구(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study; ETDRS) 최대 교정 시력(best corrected visual acuity; BCVA)의 변화이다. 다나졸 3 종류의 용량 10 mg(하루 두 회 5 mg), 30 mg(하루 두 회 15 mg), 및 90 mg(하루 두 회 45 mg)에 따라 분석하였다. 모든 처리는 하루 두 번 경구 투여하였다.

첫 번째 중요한 발견은 망막 두께에서 다나졸의 효과는 체질량지수(BMI; P = .01) 기준선에 의존적인 것이었다. 낮은 BMI 지수에서, 다나졸의 낮은 용량은 망막 두께를 효과적으로 감소시킨 반면에, 높은 BMI에서 다나졸의 높은 용량은 더 효과적이었다(도 4). 사전에 정의된, 망막 두께의 감소가 11% 이상이면 임상적으로 유의한 것으로 간주하였다. 15 mg 용량을 투여받은 거의 모든 개체들(86%, 7 환자 중 6)은 위약 대조군(29%, 7환자 중 2)과 비교하여 12주 째에서 망막 두께에서 유의적인 감소를 나타내었다. 망막 부피는 또한 위약 대조군((P = .05)과 비교하여 15 mg 투여 그룹에서 감소하였다.

ICD-9-CM 시력 상실에서 최대 시력 교정(BCVA) 변화를 위해, 개체의 36%는 적어도 치료 카테고리중 하나를 향상시켰다. 위약대조군은 개선된 개체(14%)의 가장 낮은 비율을 가진 반면, 다나졸로 처리된 모든 환자의 47%는 적어도 하나의 카테고리에서 향상되었다.

기준점 또는 12주에서 어떤 그룹도 안압증이 검출되지 않았으며, 임상 의료 제품과 관련된 심각한 부작용은 보고되지 않았다. 세 가지 치료 관련한 부작용(말초 부종, 건선 및 악화 우울증)이 발생하였는데, 이는 활성 화합물과 관련이 있을 가능성이 고려되었다.

30 mg의 다나졸을 투여받은 거의 모든 환자들은 위약 대조군에서 7 환자의 2명과 비교하여 치료 12주 후(6/7) OCT에서 임상적으로 변화를 보였다. 치료군 Visit 4(12주)에서 ETDRS 라인(5레터)와 함께 적어도 하나의 BCVA의 개선의 경향이 명확이 있었다. 이러한 경향은 시력은 망막 두께의 변화보다 부피의 변화에 더 큰 연관이 있기 때문에 망막 부피의 변화를 더욱 관찰할 수 있다. 이는 또한 다나졸의 효과는 BMI에 의존적임이 관찰되는데, 즉 다나졸 30 mg 용량의 망막 두께에서의 효과는 기준선 BMI의 증가와 함께 더욱 유의적이게 되며(즉, 망막 두께의 감소가 보다 감소), 반면에 10 mg 용량은 기준선 BMI의 증가와 함께 덜 유의적이게 된다. 이는 친유성(lipophilic) 본질과 일치한다. 이는 또한, 망막 두께의 변화에 있어서 치료 효과는 기준선의 망막 두께에 의존한다는 것을 나타낸다. 무작위의 모든 환자의 중간 기준선 망막 두께는 400 ㎛였다. 기준선 망막 두께가 400 ㎛보다 큰 환자는 망막 두께가 400 ㎛보다 작거나 같은 환자보다 다나졸의 치료 효과가 큰 것을 보여주었다. 이러한 상호작용은 BCVA에서는 관찰되지 않았다.

실시예 2:

본 실시예는 DME 환자에서 다나졸의 두 가지 상이한 용량의 경구투여에 따른 효과 및 안정성을 보여준다.

무작위, 위약대조, 평행, 이중 맹검 연구는 DME 성인 환자에서 다나졸의 두 용량(하루에 BMI당 0.5 mg 및 하루에 BMI당 1.0 mg)의 효과 및 안정성을 증명하기 위해 수행되었다. 450명의 무작위의 환자는 샘플의 크기를 나타낸다. 효능은 위약군(락토스 및 마그네슘 스테아레이드(magnesium stearate))과 비교하여 향상된 시력에 의해 결정되었다. 또한, BMI와 관련된 다나졸의 두 가지 경구 투여의 효능 및 내약성은 위약군(락토스 및 마그네슘 스테아레이드)과 비교하여 복부 황반 두께(ventral macular thickness; CMT) 및 VA 응답자 상태에서 변화에 의해서 관찰되었다.

환자가 연구 등록 기준에 충족되고 동의서가 수득되면 환자의 BMI 및 허리/엉덩이 비율이 계산된다. 다나졸(또는 위약군)의 구 가지 경구 용량은 효과의 회귀분석을 위해 약효 세척 4주 후 DME 성인 환자에 12주 간 투여되었다. 세척기간 이후, 12 주 Open Label Extension Study는 다나졸의 최적 용량 효과의 지속 기간을 평가하기 위해 환자들에게 제공하였다. 다나졸의 최적 용량은 환자의 30%가 주 연구 초기 12주에서 치료 4주가 완료되면 결정하였다. 혈장 다나졸 레벨은 수집되어 모니터링 하였다.

용법, 모드 및 관리: 다나졸은 두 일일 투여량으로 나누어 BMI 당 1 mg 또는 BMI 당 0.5 mg를 경구투여하였다. 다나졸 및 이에 매칭되는 위약군은 12주 동안 매일 두 번 식사 한 시간 전 또는 두 시간 후 공복에서 두 개의 캡슐로 아침에 한번 및 저녁에 한번 투여하였다. 하루 총 다나졸의 용량은 주 12주 연구(Main 12-week Study) 단계 동안 하루에 BMI 당 0.5 mg 및 BMI 당 1 mg를 섭취하였다. 중간 분석(후술)에 의해 결정된 것과 같이, 다나졸이 최적 용량은 Open Label Extension Study의 12주 동안 매일 두 번 투여될 것이다.

위약(락토오스 및 스테아린산 마그네슘)은 경구투여 및 하루 두 번 용량으로 나뉘었다.

표준 당뇨병 치료 약물은 다나졸과 함께 병용 투여될 수 있다. 이러한 약물은 환자의 일반적인 당뇨병, 항고혈압 및 항지질 약물을 포함할 수 있다.

환자는 4주의 약물 세척 기간 후 12주 동안 다나졸 또는 위약군이 투여되었고, 16주에서 환자는 12주간의 Open Label Extension Study에서 시력 회귀가 평가되고 등록이 제공된다.

하루 복용량(4 캡슐)은 하루 위약 투여량과 같으며, BMI 당 0.5 mg 그룹 또는 BMI 당 1.0 mg 그룹은 하기 표 2 내지 4에 나타내었다("Cap"은 캡슐을 의미).

BMI 당 1 mg 다나졸

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	Total
<25	10	0	7.5	7.5	25
25-29.99	7.5	7.5	7.5	7.5	30
30-34.99	7.5	10	7.5	10	35
35+	10	10	10	10	40

BMI 당 0.5 mg 다나졸

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	Total
<25	7.5	0	5	0	12.5
25-29.99	7.5	0	7.5	0	15
30-34.99	10	0	7.5	0	17.5
35+	10	0	10	0	20

위약대조군(Placebo Group)

BMI	AM Cap 1	AM Cap 2	PM Cap 1	PM Cap 2	Total
<25	0	0	0	0	0
25-29.99	0	0	0	0	0
30-34.99	0	0	0	0	0
35+	0	0	0	0	0

효능 측정: 12주 기준선으로부터 초기 치료 당뇨성 망막증 연구(ETDRS)에 따른 최대 교정 시력(BCVA) 문자 읽기의 변화는 위약군과 비교되었다. 두 번째 측정은 12주의 기준선으로부터 빛 간섭 단층 촬영(optical coherence tomography; OCT)으로 측정된 중심 황반 두께(CMT), 12주에서 10개 이상의 문자 최대 교정 시력(BCVA)의 기준선으로부터 시력(VA)의 변화, 및 임상적으로 유의한 비정상적인 실험 결과를 포함하는 부작용의 빈도 및 심각성을 포함한다.

통계 방법: 일차 분석은 다음과 같은 두 가지에서 12주의 기준선으로부터 변경된 BCVA 문자의 다중 비교이다: (1) BMI 당 다나졸 0.5 mg vs. 위약군; (2) BMI 당 다나졸 1.0 mg vs. 위약군. 공변량과 같은 기준선 문자 읽기(baseline letters read) 및 치료의 주 효과와 함께 공분산 분석(ANCOVA)의 혼합 효과는 기본 분석으로 수행되었다. 혼합 효과는 두 눈으로부터의 데이터가 어떤 개체를 위해 사용될 수 있는 바와 같이 사용된다. 다중성(Multiplicity)은 위약군에 대한 각 활성 성분의 Dunnett 비교로 해결될 것이다.

2차 분석은 12주의 기준선으로부터 CMT에서의 변화에 처리군 및 위약군 사이의 차이를 조사한다. 기준선 CMT의 공변량 조정과 함께, 효과적인 혼합 모델은 CMT 변화를 평가하는데 사용된다; Dunnett 비교는 다중성의 오류를 수정하기 위해 만들어진 것이다.

공변량을 포함하는 기준선 BCVA 문자 읽기와 함께, 논리 연결 함수(logistic link function)를 이용한 일반적인 추정 공식(general estimation equation; GEE) 모델은 12주에서 응답자 상태(10개 이상의 문자를 얻은)를 평가하는데 사용된다.

실시예 3: 혈관신생( Angiogenesis )에서의 다나졸의 효과(비교)

A. HUVEC 세포 증식

프로토콜:

주요 인간 제대 정맥 내피 세포(Primary human umbilical vein endothelial cells; HUVECs) 및 EGM-2 성장 배지는 Cambrex(Walkersville, MD)으로부터 얻었다. 상기 세포는 2% fetal calf serum (FCS)로 보충된 배지에서 세포 배양 플라스크로 37? 및 5% CO₂ 에서 계대되었다. 60-80% 채워졌을 때 트립신을 사용하여 전배양을 수행하였다.

냉동보존된 passage 2 HUVECs의 앰플은 녹여서 96 웰 조직 배양 플레이트에 5,000 cells/cm² 이 되도록 뿌렸다. 다나졸 50 mM 스탁 용액을 에탄올로 제조한 후, 배지의 FCS는 다나졸 용액에서 5%가 유지되도록 증가시켰다. 세포는 다나졸의 최종 농도가 0.1 내지 100 μM 범위로 포함된 배지로 세 번 처리하였다. 24, 48 및 72시간 배양을 수행하고 세포 증식은 프로메가(Madison, WI)로부터 Celltiter 96 AQ_ueous One Solution Cell Proliferation assay를 이용하여 분석하였다. 즉, 배지는 각 웰로부터 흡인하고, 세포는 37℃로 유지된 200 ㎕의 Cambrex 사의 Hepes buffered saline (HBSS)로 세척하였다. 100 ㎕의 celltiter희석 용액(15 ㎕ stock + 85 ㎕ EGM-2 containing 0.1% FCS)은 각 웰에 첨가되었으며 추가적으로 4시간 동안 배양되었다. 광학밀도는 마이크로플레이트 리더 530 nm 필터를 이용하여 블랭크를 감산한 후 측정하였으며 데이터는 OD + 표준편차(standard deviation)로 나타내었다. 웰 안의 에탄올 최종 농도는 0.2%보다 적었으며 세포 증식 또는 생존에 영향을 미치지 않았다.

모든 데이터는 세 번 반복으로 수행하여 대표적인 실험으로 나타내었다. 서브셋 사이의 차이는 student t-test in Microsoft Excel를 이용하여 분석하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과, 관찰 및 토론:

다나졸의 존재 하에서 일차 배양된 HUVECs는 시간 및 농도 의존적 방식으로 Promega celltiter 세포 증식 분석으로부터 얻은 OD가 감소하였다(도 1). celltiter assay은 세포 수와 직접적으로 관련 있는 포르마잔 염료의 탈수소 효소에 의한 분석 용액의 환원에 기초한다.

다나졸 24시간 처리는 매우 높은 용량에서 효과를 보였다. OD 분석에서 유의적인 감소(p value < 0.05) 가 다나졸 10 μM 또는 그 이상의 농도에서 보여졌다. 빈 웰에서 검출된 OD는 0.414 + 0.06이며, 10 μM 다나졸로 처리한 것은 0.288 + 0.037로 감소한 반면에 100 μM의 다나졸은 0.162 + 0.017로, 각각의 저해율은 30% 및 65%이다.

48시간에서, 관찰된 저해율은 1 μM의 수준에서 유의한 것이 관찰되었다. 배양 후 48시간 후의 빈 웰의 리딩값은 0.629 + 0.095로 증가하였으며, 1 μM에 의해 0.378 + 0.037, 10 μM에 의해 0.241 + 0.012, 100 μM에 의해 0.19 + 0.033 감소하였다(또는 저해율은 각각 60%, 61% 및 70% 이다).

72시간 후, 테스트한 모든 다나졸 처리군은 HUVEC 증식에서 유의적인 감소를 나타내었다. 빈 웰에서 얻은 OD는 1.113 + 0.054이며, 0.1 μM 처리 후 0.798 + 0.037, 1 μM 처리 후 0.484 + 0.022, 10 μM 처리 후 0.229 + 0.016, 100 μM 처리 후 0.156 + 0.018로 떨어졌다(각각의 저해율은 28%, 57%, 80% 및 86%이다).

모든 100 μM 다나졸 용량으로부터 얻은 OD 검사는 상기 농도에서 세포 증식의 정지 완료를 나타내는 모든 시점에서 일치하였다.

요약하면, 다나졸은 내피 세포 증식의 강력한 억제는 나타내었다.

B. HUVEC 관 형성( Tube Formation )

프로토콜:

혈관 시스템(Angiogenesis System)인 HUVECs에 의한 모세혈관과 같은 구조의 형성을 알아보고자 하였다: 내피 세포 관 형성 분석(Endothelial Cell Tube Formation Assay)은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 구입하였으며 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. 요컨데 100,000 HUVECs가 관 형성을 유도하기 위해 5% FCS가 존재하는 96 웰 세포 배양 플레이트에서 재수화된 마트리젤 플러그 상에 뿌려졌다. 다나졸의 최종 농도가 1 μM, 10 μM, 또는 50 μM, 그리고 LY294002(양성대조군) 50 μM를 첨가하였다. 18시간 후 웰은 반전된 현미경에 장착된 Kodak DCS Pro SLR/N digital camera (Rochester, NY)을 이용하여 촬영하였다. 에탄올이 처리된 웰은 세포 증식에 있어서 어떤 영향을 나타내는지 확인하기 위해 포함하였다.

결과, 관찰 및 토론:

다나졸이 HUVEC에 의한 튜브 형상 구조체의 형성을 방지할 수 있는지 확인하기 위해, 마트리젤 플러그를 포함하는 96 웰 플레이트를 사용하였다. 혈관 신생 물질이 존재하고 세포 외 매트릭스 지지체가 보충되어 배양된 내피 세포는 느슨하게 모세 혈관을 닮은 구조로 분화한다. 다나졸과 함께 성장된 HUVECs는 대조군보다 ?고 작은 배선과 함께 적은 수의 조직 구조를 나타내었다(도 2, A=대조군, B=1 μM 다나졸, C=10 μM 다나졸, D= D = 50 μM, 및 E=50 μM LY294002). 50 μM 다나졸 처리를 통해 작고 얇은 배선 및 혈관 내강 공간을 가진 플러그에 위치한 HUVEC 콜로니를 분리하였다. 다나졸의 효과는 양성 대조군인 화합물 LY294002과 매우 유사하였다. 사용되는 용매대조군(vehicle)의 영향이 없음을 확인하기 위해, 웰을 다나졸의 가장 높은 용량과 상응하는 농도의 에탄올을 처리하였으며 관 형성에 영향을 미치지 않은 것을 확인하였다(데이터 없음). 이러한 데이터는 다나졸은 50 μM에서 관 형성의 효과적인 억제제인 것을 나타낸다. 다나졸은 1 μM 또는 10 μM에서는 관 형성에 영향을 미치지 않는다.

C. HUVEC 침윤( Invasion )

프로토콜:

BioCoat 마트리젤 침윤 챔버(Matrigel Invasion Chambers)는 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 구입하였다. 삽입부(Inserts)는 500 ㎕ HBSS를 사용 전 2시간 동안 37℃ 가습 배양기에서 재수화(rehydrate) 하였다. 트립신 처리된 HUVECs는 두번 0.1% FCS가 포함된 따뜻한 EGM-2로 세척하였으며, 침윤 삽입부(invasion insert) 챔버 상부에 100,000 세포를 총 부피 250 ㎕로 하여 첨가하였다. 다나졸 및 대조군 화합물들은 최종 농도 10 μM 및 100 μM으로 침전지(reservoir) 상부에 첨가하였다. 5% FCS 로 보충된 750 ㎕ EGM-2은 침윤 개시를 위해 챔버 하부에 추가되으며 플레이트는 24시간 동안 배양하였다. 비침윤성 세포는 적신 면봉으로 상부 챔버로부터 제거된 후, 삽입부는 HBSS로 두 번 세척하였다. 상기 삽입부는 HBSS에서 준비된 10 μM calcein AM에 침수시키고 4시간 동안 배양하였다. 형광물질은 마이크로플레이트 리더기 485 nm의 여기(excitation) 및 595nm 발광(emission)에서 확인하였다. LY294002 및 구조적으로 유사하나 비활성 화합물인 LY303511를 양성대조군 및 음성 대조군으로 각각 실험에 사용하였다.

결과:

결과는 도 7에 나타내었다. 모든 데이터는 세 번 반복으로 수행된 대표적인 실험으로 나타내었다. 서브셋(subsets) 간의 차이는 student t-test in Microsoft Excel를 이용하여 분석하였다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

다공성, 마트리젤로 코팅된 삽입부는 다나졸 내피 세포의 침윤 및 이동을 방해할 수 있는지 확인하기 위해 사용되었다(도 7). 연구에 사용된 시스템에 있어서, 내피 세포에 대항하는 챔버에 FCS의 첨가 후 형광 염료에 의해 세포에서 유의적인 증가가 검출되었다(5674 FU + 77 에서 7143 + 516). 10 μM 및 100 μM 농도에서 다나졸은 효과가 없는 반변에 LY294002는 거의 완벽한 세포 침윤의 감쇄를 나타내었다(5814 + 153). 이러한 데이터는 화학 주성 구배(chemotactic gradient)를 따른 이동한 후 HUVECs에 의해 FCS에 존재하는 요소는 세포 외 기질을 분해하는 프로테아제의 생산을 유도하는 것을 나타낸다. 다나졸은 본 모델에서 HUVECs의 침윤 및 이동에 있어서 뚜렷한 억제 효과가 나타나지 않았다.

D. HUVEC 이동( Migration )

프로토콜:

스크래치 이동 분석(scratch migration assay)으로 HUVECs의 이동에 있어서 다나졸의 효과를 확인하기 위해 분석을 실시하였다. 통로 8 HUVECs(Passage 8 HUVECs), lot 번호 8750(Lonza에서 구입)는 내피 성장 배지-2(EGM-2) 완전 배지(Lonza에서 구입)의 6 웰 플레이트(ICS BioExpress)에 뿌려졌다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 의 37℃ 인큐베이터에서 48-72시간 동안 confluent 단층(monolayers)이 수득될 때까지 배양하였다. 상기 단층은 1000 ? 피펫 팁(pipet tip)으로 "scratched"하였고 따뜻하게 만든 EGM-2 배지로 두 번 세척하였다. 마지막 세척 배지는 흡인하고 신선한 EGM-2 배지 또는 다나졸 농도 범위를 함유하고 있는 EGM-2 배지(Sigma, # D8399)로 교체하였다. 손상된 단층의 사진을 촬영하고 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃ 인큐베이터에서 추가로 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰은 다시 사진찍었다. 간격(gap)은 Adobe Photoshop software을 이용하여 각 사진에서 측정하고, 간격 측정은 간격에서 픽셀의 수로 나타내었다.

결과:

세 개의 분리된 실험의 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 표 5에서 보이는 바와 같이, 다나졸 50 μM, 75 μM 및 100 μM에서 유의적으로 HUVEC 이동 저해를 확인하였다. 본 분석에 사용한 EGM-2 배양 배지는 상기 C 섹션에서 기재한 마트리젤 모델에서 사용된 FCS와 비교하여 성장인자의 혼합제를 포함한다. 성장인자에서의 이러한 차이는 두 모델을 사용하여 얻어진 결과에서의 차이를 설명할 수 있다.

화합물(s)	다나졸 농도	평균 픽셀 (Mean pixels)	평균 저해율 (Mean % Inhibition)	STD	SEM
희석 대조군(에탄올)		1264
다나졸	10 μM	1004	21.14	14.87	8.59
다나졸	25 μM	1184	5.5	8.8	5.08
다나졸	50 μM	895.33	27.64	17.63	10.18
다나졸	75 μM	317.33	74.62	6.8	3.93
다나졸	100 μM	178.67	85.9	0.92	0.53

실시예 4: HUVEC 단층( Monolayers )의 혈관 투과성( Vascular Permeability )에 대한 다나졸의 효과

프로토콜:

HUVEC 단층의 투과성에 있어서 다나졸의 효과를 확인하기 위해 분석을 실시하였다. Passage 5-10 HUVECs, lot number 7016 (Lonza로부터 구입)은 내피 세포 성장 배지(EGM-2) (Lonza로부터 구입)을 사용하여 24 웰 플레이트(Greiner BioOne 24-well Thincert cell culture inserts, #662610, or ISC BioExpress, # T-3300-15)의 웰에 위치한 1-micron-pore-size 삽입부에 접종하였다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃ 인큐베이터에서 48-72시간 동안 꽉 차서 단층이 타이트해질 때까지 배양하였다. 상기 배지는 제거한 후 신선한 배지 또는 다나졸 농도 범위를 포함하는 신선한 배지(Sigma, # D8399)로 교체하였다. 종양 괴사 인자 α(Tumor necrosis factor α TNFα Pierce Biotechnology, # RTNFAI) 및 인터루킨(interleukin-1β IL-1β Sigma, # I-9401)를 각각 최종농도 10 ng/ml로 적절한 웰에 첨가하였다. TNFα및 IL-1β 투과성을 유도하며; 이들은 투과성을 10배 이상 증가시킬 수 있는 요인이다. 마지막으로, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)(Pierce Biotechnology, # N100, 1.25 mg/ml)에 접합된 스트렙타빈(streptavidin)을 1:250의 최종 희석비율로 각 웰에 첨가하였다. HRP는 약 44,000의 분자량을 가지는 큰 분자이다. 최종 부피는 각 웰에서 상부 챔버에서 300 ㎕, 하부 챔버에서 700 ㎕이었다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃ 인큐베이터에서 추가적으로 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 삽입부는 제거하고 폐기하였다. 삽입부에서의 세포의 시각적인 검사 결과 모든 단층이 그대로인 것으로 나타났다.

HRP 통과액을 측정하기 위해, 챔버 하부의 생성된 용액의 15 ㎕를 96 웰 플레이트에 옮겼다(각 반응은 세 반복으로 행해졌다). 다음으로, 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine; TMB) 용액(Pierce) 100 ㎕을 각 웰에 첨가하고, 상온에서 5분 간 발색하게 하였다. 발색은 0.18 N 산성용액(acidic solution) 100 ㎕을 첨가하여 정지시켰다. OD는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 내지 530 nm에서 각 웰을 측정하였다. 투과성의 억제율은 대조군과 비교하여 계산하였으며, 세 개의 분리된 실험의 평균을 표 6에 나타내었다.

표 6에서 알 수 있는 것처럼, 25.0 μM 또는 그 이상의 다나졸의 농도에서 실제로 혈관 투과성이 증가하였다. 10.0 μM의 농도는 혈관 투과성에 있어서 효과가 없거나 미미하였다. 0.1 μM 내지 0.5 μM의 최적인, 0.1 μM 내지 5.0 μM의 농도에서 다나졸은 혈관 투과성을 감소시켰다. 용량 의존적 곡선에서 0.001 μM (또는 이보다 더 낮은) 내지 0.005 μM의 농도에서 억제되는 두 번째 피크가 존재한다는 것은 매우 흥미롭다. 따라서, 다나졸은 혈관 투과성에 대해 매우 놀랍고 예기치 못한 용량 반응 곡선을 나타낸다.

실시예 3에 나타낸 바와 같이, 50 μM 내지 100 μM의 농도의 다나졸이 상기 다나졸과 함께 18-24시간 배양하였을 때 HUVEC의 증식, 이동 및 관 형성 억제를 위해 요구된다. 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 이러한 혈관 신생을 억제하기 위한 최적 농도는 24시간 후 혈관 투과성이 급격하게 증가하였다(표 2 참조). 반대로, 혈관 투과성을 억제하기 위해 사용되는 최적의 농도(0.1 μM 내지 0.5 μM)는 24시간에서 혈관 신생에 미미한 영향을 미쳤다.

화합물(s)	다나졸 농도	평균 저해율 (Mean % Inhibition)	STD	SEM
다나졸	0.001 μM	19.35	5.39	3.11
다나졸	0.005 μM	16.37	8.04	4.64
다나졸	0.01 μM	-2.74	14.56	8.4
다나졸	0.05 μM	7.67	8.83	5.1
다나졸	0.1 μM	35.59	23.08	11.54
다나졸	0.5 μM	30.95	12.01	6.01
다나졸	1.0 μM	21.2	31.13	13.92
다나졸	5.0 μM	14.63	15.3	7.65
다나졸	10.0 μM	14.29	36.85	13.03
다나졸	25.0 μM	-1.06	22.6	11.3
다나졸	50.0 μM	-377.36	384.5	171.95
TNFα + IL-1β + 다나졸	0.1 μM	31.3	25.26	12.63
TNFα + IL-1β + 다나졸	1.0 μM	29.22	16.17	7.23
TNFα + IL-1β + 다나졸	10.0 μM	8.47	20.45	9.14
TNFα + IL-1β + 다나졸	25.0 μM	-39.93	15.53	7.76
TNFα + IL-1β + 다나졸	50.0 μM	-117.16	29.2	14.6

실시예 5: 혈관 투과성( Vascular Permeability )에 대한 다나졸의 효과

Passage 9 인간 망막 내피 세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)는 80%가 채워질 때까지 EGM-2 medium (Lonza, Walkersville, MD)에서 계대 배양하였다. 상기 세포는 Trypsin-EDTA를 이용하여 배양 플라스크로부터 방출시키고, 생성된 현탁액 중의 세포는 세포 생존률 및 세포수를 결정하기 위해 계산되었다. 본 실험의 세포의 생존률은 90% 이상이었다.

세포는 300 ㎕ EGM-2 완전 배지에서 24 웰 플레이트(Greiner BioOne 24-well Thincert cell culture inserts, #662610)의 웰에 위치한 주입부(1 micron pore size)에 배양하였다. 그리고, 700 ㎕ EGM-2는 챔버 하부에 위치되었으며, 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃의 인큐베이터에서 48시간 동안 단층이 꽉 찰 때까지 배양되었다. 트랜스 내피 전기 저항(Transendothelial electrical resistance; TER) 측정은 반 투과 장벽의 설립을 확인하기 위해 모든 삽입부에 대한 EVOM² voltohmmeter에 부착된 STX 100 전극(World Precision Instruments)을 사용하여 촬영하였다. 측정을 위해, 하나의 탐침을 챔버 상부에 전극 하나 및 챔버 하부에 하나와 함께 각 웰에 위치시켰다.

그런 다음, 상기 세포를 다음과 같이 이중으로 처리하였다. 삽입부로부터 EGM-2 배지는 조심스럽게 따라버리고 VEGF 및 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Lonza)를 제외한, 0.5% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) 및 EGM-2 보충제가 포함된 IMDM 배지로 교체하였다. 일부 웰에서, IMDM 배지는 10 배의 일련의 희석액의 다나졸(Sigma, # D8399)을 포함하고 있다. 상기 플레이트는 4% 형광이 표지된 인간 혈청 알부민을 포함하는 용액 30 ㎕를 각 웰의 챔버 상부에 추가하기 전 5% CO₂ 및 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃ 인큐베이터에서 추가적으로 18시 간동안 배양하였다.

상기 배양 후, 삽입부는 제거 및 폐기되고 챔버 하부로부터의 배지 200 ㎕을 94 웰 블랙 플루오로 플레이트(black fluoro-plates; Falcon)에 세 반복으로 옮겼다. 각 웰의 형광물질은 340 nm의 여기 및 470 nm의 방출 파장에서 측정하였다. 각 삽입부의 평균 형광 단위(FU)가 계산된 후, 중복 측정값은 평균화되었다. 상기 결과는 표 7에 나타내었다.

다나졸 농도	평균 FU	표준편차(STD)
None	767.13	8.38
0.01 μM	688.5	14.94
0.1 μM	743.9	8.95
1.0 μM	783.39	14.59
10.0 μM	768.99	18.85

이와 같이, 다나졸의 최소 농도(0.01 μM)는 최대 억제(약 10%)를 나타낸다. 세포 없이 수행된 대조군은 망막 내피 단일층을 선택적으로 투과하였다고 보여지므로, 하부 챔버에서 4000 FU 이상을 나타내었다.

실시예 6: 세 가지 다른 내피 세포 단일층의 TER 에 있어서 다나졸의 효과

인간 망막 혈관 내피 세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)의 트랜스 내피 세포 전기 저항(transendothelial electrical resistance; TER)에 있어서 다나졸의 효과를 확인하기 위해 분석을 수행하였다. 이를 위해, 150,000 passage 14 인간 망막 내피 세포를 300 ㎕ EGM-2 완전 배지의 24 웰 플레이트(Greiner BioOne 24-well Thincert cell culture inserts, #662610)의 웰에 위치하는 삽입부(1 micron pore size)에 접종하였다. 이러서, 상기 플레이트를 5% CO₂ 및 37℃의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 배양 배지는 조심스럽게 버리고 신선한 EGM-2 또는 다나졸 최종 농도 1 μM가 포함된 신선한 EGM-2 배지로 교체하였다. 상기 플레이트는 인큐베이터에 되돌려 놓은 후 추가적으로 144시간 동안 배양하였다. 분석은 passage 8 인간 뇌 내피 세포(human brain endothelial cells) 및 passage 8 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells)를 이용하여 동일한 방법으로 수행하였다.

초기 TER 측정은 STX100 전극에 연결된 EVOM² voltohmmeter(World Precision Instruments)를 이용하여 각 주입부에서 수행되었다. 측정은 24, 48, 72 및 144시간 수행되었다. 상기 결과는 하기 표 8, 9 및 10에 나타내었다. 모든 데이터는 감산된 빈 주입부의 TER과 함께 삽입부의 TER 측정/ cm² 로 나타내었다.

인간 망막 내피 세포(Human Retinal Endothelial Cells)

다나졸 농도	0 시간	24 시간	48 시간	72 시간	144 시간
None	32.3	96	144.4	148	219.7
1.0 μM	21.7	132.3	182.3	217.7	234.8

인간 두뇌 내피 세포(Human Brain Endothelial Cells)

다나졸 농도	0 시간	24 시간	48 시간	72 시간	144 시간
None	41.4	115.7	176.3	154	151.5
1.0 μM	32.3	139.9	188.4	149.5	125.8

인간 제대 정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)

다나졸 농도	0 시간	24 시간	48 시간	72 시간	144 시간
None	82.3	217.2	276.3	226.8	227.3
1.0 μM	70.2	246	364.1	270.7	286.4

이와 같이, 다나졸은 망막 및 제대 정맥 내피 세포 단층의 TER 측정을 향상시킨다(이온 투과성 감소). 다나졸은 초기 시점을 제외하고 뇌 내피 세포 단층의 TER에 있어서 큰 효과를 나타내지 않는다. TER은 세포 단층을 걸친 전기적 저항의 측정이다. 이는 장벽의 무결성을 나타내며 이온 투과성과 관련이 있다.

실시예 7: Akt 인산화( Phosphorylation )에 대한 다나졸의 효과

인간 망막 내피 세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)에서 Akt 인산화에 대한 다나졸의 효과를 확인하기 위해 분석을 수행하였다. 상기 세포는 2% 소 태아 혈청(Lonza)이 포함된 EGM-2 배지(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)에서 25 cm² 플라스크가 거의 꽉 찰 때까지 성장시켰다. 상기 세포는 Trypsin/EDTA를 이용하여 passage 플라스크로부터 방출되었다. 생성된 현탁액의 세포는 계수하여 96 웰 플레이트에 EGM-2배지로 1 x 10⁴ cells/well를 배양하였다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37^oC에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕ EGM-2배지(대조군) 또는 다양한 다나졸의 농도를 첨가하였으며, 상기 플레이트는 추가적으로 2시간 동안 배양되었다. 배양 후, 상기 세포들은 즉시 4% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정하여 냉장하였으며, 제조업자의 프로토콜에 따라 Akt Cellular Activation of Signaling ELISA Kit(CASEJ Kit for AKT S473; SABiosciences, Frederick, MD)를 이용하여 맛의 인산화 정도를 측정하였다. AKT S473를 위한 CASEJ Kit는 비색 검출을 종래의 ELISA 포맷을 이용하여 병렬 분석법으로 총 Akt 단백질의 상대적인 활성화된(인산화된) Akt 단백질의 양을 정량한다. Akt 인산화 부위는 세린 473이며 활성화된 Akt 단백질의 측정치를 제공하기 위해 두 개의 병렬 분석법 중 하나의 사용되는 하나의 항체에 의해 인식된다. 다른 병렬 분석에서 사용되는 다른 항체는 총 Akt 단백질의 측정을 제공하도록 Akt를 인식한다. 두 일차 항체는 서양고추냉이 과산화효(horseradish peroxidase)가 표지된 이차 항체에 의해 검출된다. 제조자의 Developing Solution을 10분간 추가한 후, 제조자의 정지용액(Stop Solution)을 추가하고, 비색 측정이 가능한 결과를 생산한다.

상기 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 이와 같이, 다나졸의 모든 농도에서 Akt 인산화(활성화)의 증가를 야기한다.

처리	대조군 대비 AKT 인산화의 증가율	표준편차
0.5 μM 다나졸	73.80%	92.90%
1.0 μM 다나졸	66.70%	11.70%
2.0 μM 다나졸	101.60%	9.10%
5.0 μM 다나졸	40.50%	17.70%
10.0 μM 다나졸	115.30%	112.90%
20.0 μM 다나졸	161.30%	128.70%
50.0 μM 다나졸	98.60%	61.20%

이러한 결과는 실시예 4에서 얻은 혈관 투과성 용량 반응 곡선의 설명을 가능하게 한다. 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 다나졸의 낮은 용량은 투과성을 감소시키는 반면에 높은 용량은 투과성을 증가시킨다. 이는 S473에서 Akt의 특정 인산화 정도가 투과성을 감소시키며(본 실험에서 0.5-5.0 ? 농도), 반면 S473에서 Akt의 과인산화(hyperphosphorylation)는 투과성을 증가시키는 것으로 사료된다(본 실험에서 10-50 μM 농도).

실시예 8: 망막 내피 세포 단일층( Retinal Endothelial Cell Monolayers )의 TER 에 대한 다나졸 및 스테로이드 수용체 길항제( Steroid Receptor Antagonists )의 효과

인간 망막 내피 세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)의 트랜스 내피 전기 저항(transendothelial electrical resistance; TER)에 있어서 다나졸 및 스테로이드 수용체 길항제의 효과를 확인하기 위하여 분석을 수행하였다. 이를 위해, 라이너 조직 배양 웰 삽입부(Greiner tissue culture well inserts; Greiner BioOne 24-well Thincert cell culture inserts, #662610)는 5 ㎍/cm²의 피브로넥틴(fibronectin; Sigma)으로 코팅하였다. 그리고, passage 12 인간 망막 내피 세포는 EGM-2 배지(Lonza) 300 ㎕의 부피로 주입부당 120,000 세포로 웰의 하부 챔버에 접종하였다. 하부 챔버의 부피는 EGM-2 배지의 700 ㎕이었다. 상기 플레이트는 5% CO₂ 및 37℃의 인큐베이터에서 48시간 동안 그대로 단층을 확립하기 위해 배양되었다. 배양 끝에, TER 측정은 내피 장벽의 무결성을 확인하기 위해 모든 삽입부에서 EVOM² voltohmmeter (World Precision Instruments)에 부착된 STX 2 탐침을 이용하여 측정하였다. 모든 주입부는 세포가 없는 주입부와 비교하여 증가된 저항성을 나타내었다.

이어서, 상기 배양 배지를 조심스럽게 버리고 여러 첨가제를 포함하거나 포함하지 않은 신선한 EGM-2 배지로 교체하였다. 상기 첨가제는 다나졸, 하이드록시플로타마이드(hydroxyflutamide; 안드로겐 수용체 길항제), 풀베스트란트(fulvestrant; 에스트로겐 길항제) 및 PI3 키나아제 억제제 LY 294002(대조군)이다. 모든 첨가제의 스탁 용액은 다나졸을 제외하고는 10 mM의 DMSO로 제조하였다. 다나졸 스탁 용액은 10 mM의 에탄올로 제조하였다. 그리고, 각 첨가제의 200 nM 희석액, 및 에탄올 및 DMSO(대조군)의 동량의 희석액은 EGM-2 배지에서 제조하였으며, 다나졸 및 각 다른 첨가제 또는 배지(대조군)은 하기 표에 나타낸 최종 농도 및 조합으로 웰에 첨가되었다. 상기 플레이트는 다시 인큐베이터도 되돌려놓고, 30분, 60분, 120분 및 24시간에서 각 삽입부를 위해 전술한 바와 같이 TER측정을 수행하였다. TER은 삽입부의 리딩(reading)으로부터 배경 측정(빈 삽입부) 감산 및 삽입부(0.33 cm²)의 표면적에 의해 나뉘어 계산되었다. 상기 결과는 하기 표 12에 나타내었다.

처리	30 분에서 TER	60분에서 TER	120분에서 TER	24시간에서 TER
None	216.22	249.25	234.23	312.31
0.1 μM 다나졸	255.26	267.27	249.35	366.37
0.1 μM Hydroxyflutamide	177.18	186.19	201.2	297.3
0.1 μM Fluvestrant	228.23	270.27	258.26	336.34
0.1 μM Hydroxyflutamide 처리 후 0.1 μM 다나졸	237.24	276.28	240.24	363.36
0.1 μM Fluvestrant 처리 후 0.1 μM 다나졸	195.2	309.31	255.26	393.39
10.0 μM LY294002	297.3	354.35	276.28	345.35
10.0 μM LY294002 처리 후 0.1 μM 다나졸	243.24	342.34	270.27	336.34

표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 다나졸 및 풀베스트란트는 대조군(무처리)와 비교하여 TER 측정을 증가(투과성 감소)시키는 반면, 하이드록시플로타마이드는 리딩(reading)을 감소(투과성을 증가)시킨다. 다나졸은 하이드록시플로타마이드에 의해 야기되는 감소를 방지하였다. 이는 다나졸이 이러한 세포에서 안드로겐 수용체를 점유하고 있다는 증거가 될 수 있다. 다나졸 및 플베스트란트는 일부 시점에서 첨가제 결과를 나타내었다.

실시예 9: 액틴(Actin)스트레스 섬유 형성에 대한 다나졸의 효과

경세포(paracellular)경로의 IEJs는 AJs 및 TJs를 포함한다. 액틴(Actin) 세포골격(cytoskeleton)은 각각의 경계(junction)에 결합하고 액틴(Actin) 개조(remodeling)를 통하여 경계(junctions)의 온전함을 조절한다. 액틴 필라멘트의 스트레스 섬유의 재편성은 이들을 여러 부분으로 뜯어내는 경계(junctions)로 기계적 힘의 적용, 세포내 수축의 원인 및 형태에서 변화의 결과를 가져온다. 액틴(Actin) 중합의 과정은 매우 역동적이고, 이는 액틴(Actin) 구조의 빠른 재편성 및 두꺼운 피질 액틴(Actin) 고리 및 스트레스 섬유의 부재에 의해 특징되는, 정지 표현형(quiescent phenotype)으로부터 가는 피질 액틴 피질 액틴 없이 및 풍부한 스트레스 섬유를 가지는 활성화된 세포 표현형으로 전이(transition)를 허가한다. 또한, 액틴 세포골격(Actin cytoskeleton)은 아마도 포낭(caveolae)의 이동(movement) 조절에 의해, 통과세포외배출(transcytosis)에 포함되는 것처럼 보인다.

인간망막내피세포(human retinal endothelial cells)(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)를 EGM-2 배지(Lonza)의 200 ㎕의 총부피에서 웰 당 1000 세포로 펠콘옵틸럭스분석플레이트(Falcon Optilux assay plates) (BD Biosciences)로 분주되었다. 플레이트를 48 시간 동안 5% CO₂로 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 0.1% 소태아혈청(Lonza로부터 모두)로 보충된 IMDM 배지의 200 ㎕로 대체되었고, 및 세포는 액틴 중합을 억제하기 위하여 1시간 동안 상기 성장인자 및 혈청없는상태 하에서 배양되었다. 이후, 다나졸 (0.1 μM 또는 10 μM 최종농도) 또는 PI3 카이나제 억제제 LY294002 (10 μM 최종농도) (양성대조군)을 첨가하였다. 즉시 상기 화합물 첨가후에, TNFα(50 ng/ml의 최종농도)를 첨가하였다. 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 30 분 동안 배양 후에, 배지를 빨아들이고, 세포를 상온에서 10분 동안 인산완충용액(phosphate buffered saline)(PBS)에서 3.6% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정하였다. 이후 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5 분 동안 PBS로 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 삼투화시켰다. 이후 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 세척하였고, PBS에서 로다민-팔로딘(rhodamine-phalloidin) (Invitrogen)의 1:40 희석의 50 ㎕를 F-액틴(Actin) 염색하기 위하여 세포에 첨가하였고 상온에서 20 분 동안 세포상에서 놔두었다. 그런 다음 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 이후 100 ㎕ PBS를 각각의 웰에 첨가하였고 세포를 관찰하였고 로다민필터 (ex530/em590)가 있는 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 사진을 찍었다. 결과는 다나졸이 발달시키는 스트레스 섬유의 능력에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 다나졸로 처리하였을 때, 세포는 용량 의존적으로, 상이한 염색 패턴을 나타냈다. 낮은 다나졸 용량(0.1 μM)에서, 세포질에 걸쳐 확산하는 염색, 가능하게는 안정화 사건(stabilizing event) 또는 휴식형(resting phenotype)의 지시(indicative)를 관찰하였다. 높은 다나졸 용량(10.0 μM)에서, 다수 초점을 가지는 스트레스 섬유를 검출하였다. 상기 발견은 낮은 다나졸 용량이 투과성을 억제하고 높은 다나졸 용량은 투과성을 증가시키는 기존의 결과(이전의 실시예를 참조하시오)와 상관(correlate with)하였다. TNFα는 세포를 자극하였고 강렬한 염색 초점을 가지는 강한 스트레스 섬유 발달을 유도하였다. 다나졸 및 LY294002는 TNFα로 스트레스 섬유 발달을 나타내는 세포 수를 감소시켰다.

실시예 10: 액틴 스트레스 섬유 형성 상에 대한 다나졸의 효과

인간망막내피세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)를 EGM-2배지(Lonza)의 200 ㎕의 총 부피에서 웰 당 3000 세포로 1 ㎍/cm² 파이브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 펠콘옵틸럭스분석플레이트(Falcon Optilux assay plates) (BD Biosciences)로 분주되었다. 플레이트를 48 시간 동안 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 2.0% 소태아혈청(Lonza로부터 모두)으로 보충된 초배양 배지의 200 ㎕로 대체되고, 세포는 액틴(Actin)중합을 억제하기 위하여 밤사이 동안 성장인자 및 혈청없는 상태 하에서 배양하였다. 이후, 상기 배지를 제거하였고 다나졸 (0.1 μM, 1 μM 또는 10 μM) 또는 PI3 카이나제 억제제 LY294002(10 μM) (양성대조군)을 포함하는 2.0% 소태아혈청이 보충된 신선한 초배양 배지로 대체되었다. 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 30분 동안 상기 화합물을 가지는 배양 후에, 혈관내피(vascular endothelial)성장인자 (VEGF) (최종농도 25 ng/ml)를 첨가하였다. 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 추가 30분 동안 배양 후에, 배지를 빨아들이고, 세포를 상온에서 10분 동안 인산완충용액(phosphate buffered saline) (PBS)에서 3.6% 포름알데하이드(formaldehyde)를 사용하여 고정시켰다. 이후 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5 분동안 PBS로 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 삼투화하였다. 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였고, PBS에 있는 로다민-팔로딘(rhodamine-phalloidin) (Invitrogen)의 1:40 희석의 50 ㎕를 F-액틴을 염색하기 위하여 세포에 첨가하였고 상온에서 20분 동안 세포 상에서 놔두었다. 이후, 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 핵을 대조-염색하기 위하여, 3 μM DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole, dilactate (Invitrogen)) 용액의 100 ㎕를 각각의 웰로 첨가하였다. 5분 후에, 세포를 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 이후 100 ㎕ PBS를 각각의 웰에 첨가하였고 상기 세포를 관찰하였고 로다민(ex530/em590) 및 DAPI (ex350/em460) 필터를 사용하여 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 사진을 찍었다.

결과는 다나졸이 발달하는 스트레스 섬유의 능력에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 다나졸로 처리할 때, 세포는 적용된 용량에 의존하여, 상이한 스트레스 섬유 형성 패턴을 나타낸다. 가장 낮은 다나졸 용량(0.1 μM)에서, 세포질에 걸쳐 확산 F-액틴 염색을 관찰하였다. 1.0 μM 다나졸에서, 확산 염색(diffuse staining)이 지속되었으나, 대부분의 세포 주위(perimeter)의 스트레스 섬유 및 초점이 육안으로 보였다. 가장 높은 다나졸 용량(10.0 μM)에서, 더이상 임의의 확산 염색 및 스트레스 섬유 발달 및 초점은 보이지 않았다. 낮은 용량의 다나졸로 보이는 염색은 핵주위 염색 패턴을 나타내고, 이는 파클리탁셀(paclitaxel)(안정 및 중합미세관(microtubules)으로 알려진 탁솔화합물)로 관찰된 것과 같이 유사한 미세관(microtubule)안정화를 나타낸다. VEGF로, 강한 스트레스 섬유 발달이 있다. 다나졸은 농도-의존적 방식으로 VEGF 패턴을 변화시켰다: (i) 가장 낮은 0.1 μM 다나졸 용량은 스트레스 섬유를 덜 현저하게 만들고 일부 확산 염색이 나타났다; (ii) 1.0 μM 용량은 거의 두꺼운 스트레스 섬유를 나타내지 않았으나, 초점(focal points)은 접촉 표면 상에 보였다; 및(iii) 가장 높은 10.0 μM 다나졸 용량은 초점을 가지는 강한 스트레스 섬유 발달을 나타냈다. LY294002는 VEGF로 보이는 강한 스트레스 섬유 발달을 차단하였고 확산 염색(diffuse staining)을 나타냈다.

실시예 11: 혈관내피( vascular endothelial ) 카드헤린 ( VE - 카드헤린 ) 인산화에 대한 다나졸의 효과

12번째 계대의 인간망막내피세포 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)를 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 EGM-2 배양배지(Lonza)를 사용하여 파이브로넥틴(fibronectin)-코팅된 (1 ㎍/cm²) 10 cm² 조직 배양 플레이트 상에 융합(confluence)으로 자라게 하였다. 완전한 융합이 얻어졌을 때, 상기 배지는 0.5% 소태아혈청 및 L-글루타민(모두 론자(Lonza)로부터)으로 보충된 초배양 배지(Ultraculture medium)로 대체되었고, 세포는 4 시간 동안 상기 성장인자 및 혈청없는 상태하에서 배양되었다. 이후, 배지는 제거되었고 다나졸(0.1 μM, 1 μM 또는 10 μM) 또는 에탄올 (비히클 대조군)을 포함하는 0.5% 소태아혈청 및 L-글루타민으로 보충된 신선한 초배양 배지(Ultraculture medium)로 대체되었다. 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 15분 동안 배양한 후에, 혈관내피(vascular endothelial) 성장인자 (VEGF) (50 ng/ml의 최종농도)를 첨가하고, 플레이트를 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 추가 15분 동안 배양되었다.

플레이트를 하기와 같이 세포를 용해하기 위해 즉시 처리하였다. PBS 및 용해버퍼(최종농도 2 mM로 포스파타제 억제제 용액 1 및 2(Sigma), 프로테아제 억제제 (Sigma) 및 소듐 오르쏘바나다테(sodium orthovanadate)로 보충된 % 트리톤 X-100을 포함하는 PBS)를 4℃로 냉각하였다. 세포를 얼음 저온(ice cold) PBS의 5 ml로 2회 세척하였고 이후 얼음 저온 용해버퍼의 500 ㎕에서 용해시켰다. 얻어진 단백질 추출물을 1.7 ㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 세포파편을 10 분 동안 10,000 rpm에서 4℃에서 스피닝(spinning)하여 제거하였다. 이후, 맑은 용액의 450 ㎕를 10 ㎕ C19 항-VE 카드헤린 다클론 항체(Santa Cruz Biotechnology) (제조사의 프로토콜에 따라 수행된 코팅)로 코팅된 25 ㎕의 단백질 디나비드(Dynabeds) (Invitrogen)를 포함하는 튜브로 옮겼다. 이후 추출물 및 비드를 추출물로부터 VE 카드헤린을 포착하기 위하여 오비탈 세이커(orbital shaker) 상에서 4℃에서 밤사이 배양하였다. 이후 비드를 얼음 저온 용해버퍼로 4회 세척하였다. 비드로부터 단백질을 방출하기 위하여, 20% 환원다이(reducing dye) (Invitrogen)를 포함하는 SDS 로딩다이(loading dye)로 75℃에서 10 분동안 가열하였다.

방출된 단백질을 1시간 동안 120볼트에서 4-20% 폴리아크릴아미드젤(polyacrylamidegel) (Invitrogen)으로 분리하였다. 젤에서 인산화 및 총단백질을 결정하기 위하여, 프로-Q 다이아몬드(Pro-Q Diamond) (Invitrogen) 및 SYPRO 루비 (Invitrogen) 단백질 염색을 하기의 제조사의 프로토콜에 따라 연속적으로 수행하였다. 젤을 사진을 찍고 농도계(densitometry)를 코닥 이미징 스테이션(Kodak imaging station)을 사용하여 수행하였다.

VE-카드헤린(cadherin)

	Nil (에탄올 대조군)	0.1 μM 다나졸	VEGF	0.1 μM 다나졸 다음에 VEGF
상대적 강도-ProQ 결과(인산화된 단백질	1.00	1.51	1.89	1.38
상대적 강도-SYPRO 결과(총단백질)	1.00	0.89	0.84	0.83
총단백질에서 인산화된 비율	0.215	0.365 (1.70배 증가)	0.481 (2.24배 증가)	0.358 (1.66배 증가)

나타낸 바와 같이, 다나졸은 VE-카드헤린 인산화에서 증가 원인이 되었다. VEGF는 다나졸에 의해 반대로 뒤집어지는(reversed), E-카드헤린인산화 (hyperphosphorylation)에서 심지어 큰 증가 원인이 되었다. VE-카드헤린은 AJs의 요소이고, VE-카드헤린의 인산화는 잔기에 따라 효과의 다양성을 가질 수 있다. 일반적으로, E-카드헤린의 타이로신(tyrosine) 인산화는 AJ 분해를 유도하였고 투과성(permeability)을 증가시켰다. 그러나, 세린(Serine) 665 인산화는 빠른 그러나 감소된 장벽 기능(barrier function)과 연관된 VE-카드헤린의 가역적 내재화(reversible nternalization)을 일으킨다. 피드백루프(loop)은 내재화된 VE-카드헤린이 세포질 p120, AJs와 복합체를 이루는 스캐폴딩 단백질에서 증가를 이끈다. 상기 상향-조절(up-regulation)은 Rac1, Rap-1,및 Cdc4와 같은 장벽-안정화 GTPases에서 증가와 공동으로 활성화 RhoA에서 감소를 유도한다. 상기 실험에서 관찰된 VE-카드헤린 인산화 증가는 GTPases를 안정화시키는 장벽 활성을 유도한다. 추가적으로, 다나졸은 VEGF에 의해 유도된 인산화 현상을 불안정하게 하는 것을 차단할 수 있다.

실시예 12: 망막내피세포단층( Retinal Endothelial Cell Monolayers )의 TER 에 대한 다나졸 및 스테로이드 수용체 길항제의 효과

분석은 인간망막내피세포의 트랜스엔도텔리얼 전기적 내성(transendothelial electrical resistance(TER)) 상에서 다나졸 및 스테로이드 수용체 길항제의 효과를 결정하기 위해서 수행되었다(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). 그렇게 하기 위해서, 그레이너 조직 배양 웰(Greiner tissue culture well) 삽입(Greiner BioOne 24-well Thincert cell culture inserts, #662610)을 5 ㎍/cm² 파이브로넥틴(fibronectin)으로 코팅하였다. 이후, 13번째 계대의 인간망막내피세포를 EGM-2배지(Lonza)의 300 ㎕의 부피에 있는 삽입(inserts) 당 120,000세포에서 웰의 상층챔버로 분주하였다. 낮은 챔버를 위한 부피는 EGM-2배지(Lonza)의 700 ㎕였다. 플레이트를 온전한 단층을 만들기 위해 48 시간 동안 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양의 말미 단계에서, TER 측정은 내피장벽의 온전함을 확인하기 위하여 모든 삽입을 위한 EVOM2 전압전류측정계(voltohmmeter) (모두는 World Precision Instruments로부터)를 사용하여 얻을 수 있다. 모든 삽입은 세포없는 삽입과 비교하여 상승된 내성을 나타냈다.

그런 다음, 배양 배지를 주의깊게 가만히 따르고, 몇 가지 첨가제와 같이 및 없이, 신선한 EGM-2으로 대체되었다. 첨가제는 다나졸, 하이드록시플루타미드(hydroxyflutamide) (안드로젠 수용체 억제제(androgen receptor antagonist)), 플루베스트랜트(fluvestrant) (에스트로젠 억제제(estrogen antagonist)), 테스토스테론(testosterone), 에스트레디올(estradiol) 및 PI3 카이나제 억제제 LY 294002 (control)이었다. 다나졸을 제외한, 모든 첨가제의 재고용액은 DMSO에서 10 mM로 만들어졌다. 다나졸 재고용액은 에탄올에서 10 mM이었다. 모든 첨가제의 200 μM 희석의 작용은 동일한 용매에서 만들어졌다. 이후, 200 nM 희석의 각각의 첨가제, 및 동일한 희석의 에탄올 및 DMSO (대조군)은 EGM-2 배지에서 만들어졌고, 다나졸 및 다른 첨가제 또는 배지(대조군)의 각각은 조합으로 웰에 첨가되었고 최종농도를 아래의 표에 나타냈다. 이후 플레이트를 배양기로 다시 배치하고, TER 측정은 5분, 30분, 60 분 및 24 시간에서 각각의 삽입에 대하여 상기 설명에 나타낸 바와 같이 얻었다. TER는 삽입의 눈금(reading)으로부터 배경측정(empty insert)을 빼고 삽입(0.33 cm²)의 표면적으로 나누어 계산하였다. 결과를 하기 표 14에 나타냈다.

표 14로부터 나타낸 바와 같이, 다나졸은 TER 측정을 증가시켰고, 하이드록시플루타미드(hydroxyflutamide)은 눈금(readings)을 감소시키고, 테스토스테론(testosterone)은 매우 약하게 눈금을 감소시키고, 플루베스트랜트(fluvestrant)은 대조군(처리 안함)과 비교하여, 필수적으로 효과를 가지지 않았다. 다나졸은 하이드록시플루타미드(hydroxyflutamide)에 의해 원인이 되는 감소와 테스토스테론(testosterone)으로 나타나는 매우 약한 감소를 차단시켰다. 실시예 8의 결과로서, 상기는 다나졸이 상기 세포에 있는 안드로젠 수용체를 차지한다는 증거일 수 있다.

처리	5분에서 TER	30분에서 TER	60분에서 TER	24시간에서 TER
None	250.30	262.31	251.00	287.09
0.1 μM 다나졸	280.03	311.56	313.06	348.35
0.1 μM 하이드록시플루타미드	190.44	207.46	215.97	267.27
0.1 μM 하이드록시플루타미드 다음에 0.1 μM 다나졸	230.48	275.53	262.01	312.31
0.1 μM 플루베스트랜트	223.47	251.50	243.99	279.28
0.1 μM 플루베스트랜트 다음에 0.1 μM 다나졸	219.47	279.53	273.02	343.34
10 nM 테스토스테론	257.51	240.49	225.98	267.27
100 nM 테스토스테론 다음에 0.1 μM 다나졸	273.52	287.54	259.01	283.28
10 nM 에스트레디올	246.50	545.50	250.00	328.33
10 nM 에스트레디올 다음에 0.1 μM 다나졸	276.53	307.56	282.03	363.36

실시예 13: 액틴 스트레스 섬유 형성에 대한 다나졸의 효과

6번째 계대의 인간 신장 사구체(renal glomerular) 미세혈관내피(vascular endothelial)세포(ACBRI 128, Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute를 위한 유일한 배급업자), Kirkland, WA) 및 12번째 계대의 인간망막내피세포(ACBRI 181, Cell Systems Corporation (Applied Cell Biology Research Institute를 위한 유일한 배급업자), Kirkland, WA)는 EGM-2배지(Lonza)의 200 ㎕의 총부피에서 웰 당 2000세포로 5 ㎍/cm² 파이브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 16-챔버 유리 슬라이드로 분주되었다. 플레이트를 매일 배지 변경으로 48 시간동안 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이후, Hanks Balanced Salt 용액 (HBSS; Lonza)에서 희석된, 테스트 화합물(다나졸, TNFα 및 S1P)는 하기의 최종농도를 주면서 첨가되었다: 다나졸(1 μM) (Sigma), TNFα (1 ng/ml) (Sigma),및 S1P (1 μM)(Sigma). 슬라이드는 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 15분, 30분 또는 24시간 동안 테스트 화합물로 배양되었다. 상기 배양 후, 배지를 빨아들이고, 세포를 상온에서 10분 동안 인산완충용액(phosphate buffered saline) (PBS)에서 3.6% 포름알데하이드(formaldehyde)를 사용하여 고정시켰다. 이후, 모든 웰은 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5 분 동안 PBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 삼투화하였다. 모든 웰을 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였고, PBS에 있는 로다민-팔로딘(rhodamine-phalloidin) (Invitrogen)의 1:40 희석의 50 ㎕를 F-액틴을 염색하기 위하여 세포에 첨가하였고, 상온에서 20 분 동안 세포 상에서 놔두었다. 이후, 모든 웰을 100 ㎕ PBS로 2회 세척하였다. 이후, 100 ㎕ PBS를 각각의 웰에 첨가하였고 세포를 관찰하였고 로다민(ex530/em590) 필터를 사용하여 도립현미경(inverted microscope)을 사용하여 사진을 찍었다.

결과는 다나졸이 신장 사구체(renal glomerular) 미세혈관내피(vascular endothelial) 세포에서 발달하는 스트레스 섬유의 능력에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 다나졸 단독을 처리하였을 때, 세포는 15분째에 핵주위(perinuclear) 염색, 3 시간째에 많은 세포 상의 주름있는 가장자리를 가지는 세포에 걸쳐 확산 염색, 및 24 시간째에 비처리된 대조군과 유사한 염색을 나타냈다. TNFα 단독으로, 스트레스 섬유를 나타내는 다수의 세포 및 시간이 증가하면서 섬유의 굵기를 가지면서, 스트레스 섬유는 항상 보였다. 다나졸은 항상 스트레스 섬유 형성 및 섬유 두께를 감소시켰고, 피질 액틴(Actin) 고리 및 주름있는 가장자리는 3 시간째에 초기에 보였다. S1P 단독으로 처리된 세포는 15 분에 초기 및 3 시간에 가장 강한 발달을 가지는, 액틴 피질 고리(Actin cortical rings)를 나타냈다. 세포는 24 시간에 비처리된 대조군과 유사한 형태로 되돌아갔다. 다나졸은 피질 고리를 증강시키는 것 같이 보였다. 또한, 확산 염색은 특히, 15 분 및 24 시간째에 관찰되었다.

다나졸 단독으로 처리된 망막내피세포에 대하여, 세포는 15 분에 핵주위염색, 3 시간에 많은 세포상의 주름있는 가장자리를 가지는 세포에 걸쳐 확산 염색, 및 24 시간에 비처리된 대조군과 유사한 염색을 나타냈다. TNFα 단독으로, 스트레스 섬유를 나타내는 다수의 세포 및 15분부터 3시간까지 증가하고 24시간 배양 후 감소되는 섬유의 굵기와 같이, 스트레스 섬유는 항상 보였다. 다나졸은 항상 스트레스 섬유 형성 및/또는 섬유의 굵기를 감소시켰다. 확산 염색은 15 분 및 24 시간에 관찰되었고, 피질 액틴 고리는 3 시간째에 보였다. S1P 단독으로 처리된 세포는 15 분에 초기 및 3 시간에 가장 강한 발달을 가지는, 액틴 피질 고리를 나타냈다. 세포는 24 시간에 비처리된 대조군과 유사한 형태로 되돌아갔다. 다나졸은 3 시간에 피질 고리를 증강시키는 것 같이 보였다. 또한, 확산 염색은 특히 15 분 및 24 시간에, 관찰되었다.

S1P (sphingosine-1 phosphate)는 혈관 내피의 형성 및 유지에서 매우 중요한 기능을 한다. S1P는 액틴 세포골격 상에 자체의 효과를 통하여 혈관 내피의 조직 및 장벽기능을 용이하게 하는 구성적 신호 주입이다. 특히, S1P는 피질 액틴섬유의 형성 및 부착 경계(adherens junctions)의 조직에 포함된다. S1P의 고갈은 혈관 유출 및 부종을 유도하고, S1P는 내피 기능장애를 뒤집을 수 있고 장벽기능을 회복할 수 있다.

상기 실험에서, 다나졸은 망막(retinal) 및 사구체(glomerular) 내피 세포 모두에서 S1P의 방어효과를 강하게 하는 능력을 나타냈다. 또한, 다나졸은 상기 형태의 내피 세포 모두에서 TNFα로 유도된 스트레스 섬유의 형성을 뒤집는다(reverse). 확산 핵주위 염색은 다나졸 단독으로 처리된 세포에서 나타난다.

실시예 14: ECIS 에 대한 다나졸의 효과

분석은 인간 신장 사구체(renal glomerular) 미세혈관내피(vascular endothelial)세포(ACBRI 128, Cell Systems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute를 위한 유일한 배급업자), Kirkland, WA) 또는 인간망막내피세포 (ACBRI 181, Cell Systems Corporation(Applied Cell Biology Research Institute위한 유일한 배급업자), Kirkland, WA)의 트랜스엔도텔리얼 전기적 내성(TER)의 효과를 결정하기 위하여 수행되었다. 전기적 내성은 8-웰 다수 전극(electrode)플레이트(8W10E)를 가지는 전지-기질 내성 검출(ECIS) 시스템 (ECISZθ, Applied Biophysics로부터 얻음)를 사용하여 측정되었다. 플레이트의 각각의 웰을 웰 당 100 ㎕의 부피로 파이브로넥틴(fibronectin)을 첨가하고 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 30 분동안 플레이트를 배양하여 HBSS에 있는 5 ㎍/cm² 파이브로넥틴(fibronectin)으로 코팅하였다. 파이브로넥틴 용액을 제거하고, EGM-2 배양배지(Lonza)의 400 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 연결하고 전기적으로 안정시켰다. EGM-2 배지를 빨아들이고 웰 당 100,000세포를 포함하는 EGM-2 배양배지의 200 ㎕로 대체되었다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 재연결하고 5% CO²가 있는 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. EGM-2배지를 빨아들이고 웰 당 신선한 EGM-2 배양배지 400 ㎕로 대체하였다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 재연결하고 5% CO²가 있는 37℃ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. HBSS에 있는 테스트화합물의 농축 용액을 준비하고 평형(equilibrate)하기 위해 배양기에 놔두었다. 이후, 테스트 화합물을 하기의 최종농도로 적절한 웰에 첨가하였다: 다나졸 (1 μM) (Sigma) 및 S1P (1 μM) (Sigma). ECIS(내성)을 90 시간 동안 모니터하였다.

망막내피세포에서, 1.0 μM 다나졸 단독은 5 시간 동안 처리 및 지속 후에 약 1.5-2.0 시간 초기 비처리된 세포와 비교하여 ECIS 증가를 나타냈다. S1P 단독은 약 3 시간 동안 처리 및 지속 후에 첫 번째 15 분 내에 시작한 비처리된 세포와 비교하여 ECIS의 증가를 나타냈다. 조합의 다나졸 및 S1P는 S1P 단독 및 비처리된 세포와 비교하여 ECIS를 증가시켰고, 상기 증가된 ECIS는 약 90 시간동안 지속되었다. 따라서, 다나졸은 S1P가 존재할 때 실험에 걸쳐 S1P의 초기 효과를 증강시키고 높은 내성을 유지하는 능력을 나타낸다.

사구체 내피세포(Glomerular endothelial cells)는 상이한 패턴을 나타냈다. 다나졸 단독은 처리 후 약 30 시까지 ECIS에 대한 효과를 가지지 않았다. 다나졸 단독은 약 60-90 시간 사이에 발생하는 큰 증가를 가지고, 약 30부터 약 90 시간까지 비처리된 세포와 비교하여 ECIS를 증가시켰다. 또한 S1P 단독은 처리 후 약 30 시간까지 ECIS에 대해 효과를 가지지 않았다. S1P 단독은 약 30부터 약 60 시간까지 비처리된 세포와 비교하여 ECIS 증가를 니타냈다. 다나졸 및 S1P의 조합은 처리 후 약 30 시간까지 ECIS에 대하여 효과를 가지지 않았다. 상기 조합은 비처리된 세포, S1P 단독 및 다나졸 단독과 비교하여 ECIS를 증가시켰다. 특히, 조합은 약 30부터 약 70 시간까지의 비처리된 세포와 비교하여 ECIS를 증가시켰고, 약 30 부터 75 시간까지의 S1P 단독과 비교하여 ECIS를 증가시켰고, 및 약 30부터 약 50 시간까지 다나졸 단독과 비교하여 ECIS를 증가시켰다.

실시예 15: ECIS 에 대한 다나졸의 효과

분석은 인간 신장 사구체(renal glomerular) 미세혈관내피(vascular endothelial)세포(ACBRI 128, Cell Biology Corporation (exclusive distributor for Applied Cell Biology Research Institute), Kirkland, WA)의 트랜스엔도텔리얼 전기적 내성 (TER)에 대한 다나졸의 효과를 결정하기 위하여 수행되었다. 전기적 내성은 8-웰 다수 전극 플레이트(8W10E)을 가지는 전지-기질 내성 검출 (ECIS) 시스템 (ECISZθ, obtained from Applied Biophysics)을 사용하여 측정하였다. 플레이트의 각각의 웰은 웰 당 50 ㎕의 부피로 파이브로넥틴을 첨가하고 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 30 분동안 플레이트를 배양하여 HBSS에 있는 5 ㎍/cm² 파이브로넥틴으로 코팅하였다. 파이브로넥틴 용액은 제거되었고, EGM-2 배양배지(Lonza)의 200 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 연결하였고 전기적으로 안정시켰다. EGM-2배지를 빨아들이고 웰 당 40,000 개의 6번 째 계대 세포를 포함하는 EGM-2 배양배지의 200 ㎕로 대체되었다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 연결하였고 5% CO²가 있는 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. EGM-2배지를 빨아들이고 웰 당 신선한 EGM-2 배양배지의 200 ㎕로 대체하였다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 재연결하였고 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 추가 24 시간동안 배양하였다. EGM-2배지를 빨아들이고 웰 당 덱사메타존(Dexamethasone)없이 신선한 EGM-2 배양배지의 200 ㎕로 대체되었다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 재연결하고 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 밤사이 동안 배양하였다. 최종적으로, EGM-2배지를 빨아들이고 웰 당 덱사메타존 없이 200 ㎕의 신선한 EGM-2 배양배지로 대체하였다. 플레이트를 ECISZθ 시스템에 재연결하고 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. HBSS에 있는 테스트 화합물의 농축 용액을 준비하고 평형시키기 위하여 배양기에 놔두었다. 이후, 테스트 화합물을 하기의 최종농도로 적절한 웰에 첨가하였다: 다나졸 (1 μM) (Sigma) 및 덱사메타존(Dexamethasone) (1 μM) (Sigma). ECIS(내성)을 90 시간동안 모니터하였다. 다나졸 단독은 약 3 시간째 초기 및 약 90 시간동안 지속하는 비처리된 세포와 비교하여 ECIS를 증가시켰다. 증가는 약 12 to부터 15 시간까지 더 컸다. 덱사메타존과 비교하였을 때, 다나졸은 유사한 패턴을 나타냈으나, ECIS (TER)의 증강은 크지 않았다.

실시예 16: RhoA 에 대한 다나졸의 효과

내피세포세포골격(endothelial cell cytoskeleton)의 개조는 내피의 많은 기능에 중심이다. 작은 GTP-결합 단백질(small GTP-binding proteins)의 Rho 페밀리는 F-액틴(Actin) 골격 역동성의 핵심 조절자로서 확인된다. Rho 페밀리는 3가지 동형(isoforms), RhoA, RhoB 및 RhoC로 구성된다. RhoA 활성도의 활성은 내피 세포에서 탁월한 스트레스 섬유형성을 유도한다. 트롬빈(thrombin)으로 내피세포의 자극은 Rho GTP 및 미오신(myosin) 인산화를 증가시키고, 증가된 세포 수축성과 일치한다. RhoA의 억제는 혈관 투과성에서 Rho에 대한 임계 역할을 나타내는, 상기 반응 및 장벽기능의 손실을 차단한다.

상기 실험은 Cytoskeleton, Denver, Colorado로부터 구입된 업적으로-활용가능한 Rho 활성 분석 (GLISA)을 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라, 수행되었다. 간단히, 8번째 또는 12번째 계대의 인간망막내피세포(ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA)는 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 24 시간동안 EGM-2 배양배지(Lonza)를 사용하여 파이브로넥틴(fibronectin)-코팅된 (1 ㎍/cm2) 6-웰 조직 배양플레이트에서 배양하였다(3 ml의 총부피에 있는 30,000 세포/웰). 이후, 배지를 빨아들이고 세포를 혈청없게(serum starved)하고 및 RhoA의 배경 수준을 감소하기 위하여 0.1% 소태아혈청, L-글루타민, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 및 ITSS (insulin, transferrin sodium selenium) (모두 론자(Lonza)로부터)으로 보충된 초배양배지로 대체되었다. 세포를 5% CO₂가 있는 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. HBSS에서 희석된 테스트 화합물을 세포에 첨가하기 전에 평형시키기 위하여 배양기에 놔두었다. 이후, 각각의 테스트 화합물의 150 ㎕를 적절한 배양 웰에 첨가하였고 플레이트를 추가 15 분동안 배양기에서 배양하였다. 이후, 트롬빈(thrombin)을 적절한 웰에 첨가하였다. 1 분 후, 세포를 1.5 ㎖ 인산완충용액(phosphate buffered saline)으로 1회 세척하였고 그런 다음 프로테아제 억제제로 보충된 100 ㎕ GLISA 용해버퍼로 용해하였다. 추출물을 긁어서(scrped), 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 RhoA의 활성화 형태로 보존하기 위하여 얼음으로 옮겼다. 모든 추출물을 4℃에서 2분 동안 10,000 rpms에서 스피닝(spinning)하여 파편(debris)을 제거하였다. 상등액을 새 튜브로 옮기고 얼음상에서 다시 배치하였다. 각각의 추출물의 엘리쿼트를 GLISA 분석 및 단백질결정을 위하여 제거되었다. 모든 단백질 농도는 10% 이내였고, 추출물은 얻어진 농도(웰 당 15 ㎍ 총단백질로 동일함)에서 사용되었다. GLISA 분석은 키트에서 공급된 시약을 사용하여 수행되었다.

12번째 계대의 망막내피세포에 대한 결과는 아래 표 15에 나타냈다. 예상한 바와 같이, 트롬빈(thrombin)에 위해 유도된 활성화 RhoA 수준은 매우 높았다. 테스트 화합물의 모두는 트롬빈(thrombin)-유도된 Rho A의 활성을 억제하였다. 8번째 계대의 망막내피세포에 대한 결과는 아래 표 16에 나타냈다. 예상한 바와 같이, 트롬빈(thrombin)에 의해 유도된 활성화 RhoA 수준은 매우 높았다. 테스트 화합물의 모두는 트롬빈(thrombin)-유도된 Rho A의 활성을 억제하였다.

처리	평균 OD	억제퍼센트 대 비처리 대조군	억제퍼센트 대 트롬빈
비처리	0.455	---	---
1.0 μM 다나졸	0.424	6.82	---
1.0 μM 덱사메타손	0.428	5.83	---
10.0 μM PI3 카이네이즈 억제제 LY294002	0.370	18.70	---
1.0 μM Src-1 억제제*	0.349	23.21	---
0.1 U/㎖ 트롬빈	1.013	---	---
0.1 U/㎖ 트롬빈+1.0 μM 다나졸	0.859	---	27.57
0.1 U/㎖ 트롬빈+1.0 μM 덱사메타손	0.826	---	33.48
0.1 U/㎖ 트롬빈+10.0 μM PI3 카이네이즈 억제제 LY294002	0.685	---	58.73
0.1 U/㎖ 트롬빈+1.0 μM Src-1 억제제	0.534	---	85.85

*시그마로부터 얻음

실시예 17: 혈관투과성항진의 동물모델

뉴질랜드 백색종 래빗(New Zealand white rabbits)은 7일 동안 일 당 2회 0.215 mg/kg의 다나졸을 경구적으로 섭취하였다. 이후, 래빗을 망막에 있는 혈관 누출을 생성하기 위하여 혈관내피(vascular endothelial)성장인자 A (VEGF-A)로 유리체내(intravitreally) 1회 주사하였다. 그런 다음, 24 시간 후, 플루오레신 소듐(fluorescein sodium)을 주사하였고, 눈의 형광(fluorescence)은 플루오로톤(Fluorotron)(Ocumetrics) (5개 측정 평균)을 사용하여 측정하였다. 단일 대조군(플래시보(placebo)) 래빗은 망막에서 250 형광 유닛을 가졌고, 이는 본 명세서에서 혈관 누출을 나타낸다. 단일 다나졸-처리된 래빗은 16개의 형광 유닛을 주었고, 이는 다나졸에 의해 원인이 되는 혈관 유출에서 94% 감소를 나타낸다.

본 발명의 앞선 설명은 설명 및 묘사의 목적을 위해 제시되었다. 추가적으로, 묘사는 본 명세서에 개시된 형태로 본 발명의 제한을 의도하는 것은 아니다. 결과적으로, 변형 및 수정은 상기 가르침에 어울리고, 관련된 업계의 기술 및 지식은 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 명세서에 설명된 실시형태는 추가적으로 본 발명을 연습하는 것으로 알려진 최상의 모드를 설명하고 당업계의 다른 기술자가 상기, 또는 다른, 실시형태 및 본 발명의 특정 응용 또는 용도에 의해 요구되는 다양한 수정으로 본 발명을 활용하게 할 수 있도록 의도하는 것이다. 첨부된 청구항은 이전의 기술에 의해 허가된 연장에서 대안적 실시형태를 포함하도록 해석하는 것으로 의도된다.

Claims (46)

1. 하기로 구성되는 이를 필요로 하는 동물에서 혈관 투과성 항진(vascular hyperpermeability)의 억제 방법:
   a. 동물의 체지방 함량을 결정하는 단계; 및
   b. 동물의 체지방 함량에 상응하는 다나졸(danazol) 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 동물에 투여하는 단계.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 결정 단계는 동물의 체질량 지수(body mass index, BMI) 계산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 다나졸 화합물은 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 2항에 있어서, 상기 다나졸 화합물은 약 0.5 ㎎/BMI 유닛(unit)/일 내지 약 1.0 ㎎/BMI 유닛(unit)/일 사이의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 다나졸 화합물은 하루에 2회 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 2항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26보다 적을 때, 약 2 ㎎/일 내지 약 15 ㎎/일 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26보다 적을 때, 약 5 ㎎/일인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 2항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26 내지 35 사이일 때, 약 2 ㎎/일 내지 약 15 ㎎/일 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 26 내지 35 사이일 때, 약 10 ㎎/일인 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 2항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 약 5 ㎎/일 내지 약 45 ㎎/일 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 10항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 양은 동물의 BMI가 35보다 높을 때, 약 15 ㎎/일인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 1항에 있어서, 상기 동물은 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 질병 또는 상태(condition)의 존재 때문에 다나졸 화합물을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 12항에 있어서, 상기 다나졸 화합물의 투여는 질병 또는 상태의 진단을 기반으로 바로 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제 12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 당뇨인 것을 특징으로 하는 방법.
    
15. 제 12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
16. 제 12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 고혈압인 것을 특징으로 하는 방법.
    
17. 제 12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 급성 폐손상(acute lung injury), 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome), 나이-관련 황반변성(age-related macular degeneration), 뇌부종(cerebral edema), 맥락막 부종(choroidal edema), 맥락막염(choroida), 관상동맥 미세혈관 질환(coronary microvascular disease), 뇌 미세혈관 질환(cerebral microvascular disease), 일스 질병(Eals disease), 부상으로 인한 부종(edema caused by injury), 고혈압과 관련된 부종(edema associated with hypertension), 사구체 혈관 누출(glomerular vascular leakage), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock), 어바인 개스 증후군(Irvine Gass Syndrome), 허혈(ischemia), 황반부종(macular edema), 신장염(nephritis), 신장병증(nephropathies), 신부종(nephrotic edema), 신증후군(nephrotic syndrome), 신경병증(neuropathy), 부종으로 인한 장기부전(organ failure due to edema), 자간전증(pre-eclampsia), 폐부종(pulmonary edema), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 신부전(renal failure), 망막부종(retinal edema), 망막출혈(retinal hemorrhage), 망막정맥폐쇄(retinal vein occlusion), 망막염(retinitis), 망막증(retinopathy), 무음 뇌경색(silent cerebral infarction), 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 이식사구체 신병증(transplant glomerulopathy), 포도막염(uveitis), 혈관 누출 증후군(vascular leakage syndrome), 유리체 출혈(vitreous hemorrhage) 또는 폰 히플 린다 질환(Von Hipple Lindau disease)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
18. 제 17항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 황반부종인 것을 특징으로 하는 방법.
    
19. 제 17항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 신경병증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
20. 제 17항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 망막증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
21. 제 12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 당뇨의 혈관 합병증(vascular complication)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
22. 제 21항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 부종(edema), 피하 공간에서 저밀도 지질단백질의 축적(accumulation of low density lipoproteins in subendothelial space), 가속된 아테롬성 동맥경화증(accelerated atherosclerosis), 뇌의 가속된 혈관벽의 노화(accelerated aging of vessel walls in the brain), 심근부종(myocardial edema), 심근 섬유증(myocardial fibrosis), 이완기 기능장애(diastolic dysfunction), 당뇨성 심근병증(diabetic cardiomyopathy), 당뇨병 산모 태아의 폐발달 지연(retardation of lung development in the fetuses of diabetic mothers), 하나 또는 그 이상의 폐 생리학적 파라미터 변경(alterations of one or more pulmonary physiological parameters), 감염에 대한 감수성 증가(increased susceptibility to infections), 장간막에서 혈관 과다형성증(vascular hyperplasy in the mesentery), 당뇨성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨성 황반부종(diabetic macular edema), 당뇨성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 및 피부의 발적(redness), 변색(discoloration), 건조(dryness) 및 궤양(ulcerations)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
23. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 부종인 것을 특징으로 하는 방법.
    
24. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 당뇨성 심근병증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
25. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 당뇨성 신경병증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
26. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 당뇨성 황반부종인 것을 특징으로 하는 방법.
    
27. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 당뇨성 망막증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
28. 제 27항에 있어서, 상기 당뇨성 망막증은 비증식성 당뇨성 망막증(nonproliferative diabetic retinopathy)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
29. 제 22항에 있어서, 상기 혈관 합병증은 당뇨성 신증(diabetic nephropathy)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
30. 제 1항에 있어서, 상기 동물은 혈관 투과성 항진에 의해 매개되는 질병 또는 상태(condition)의 발전을 위한 하나 또는 그 이상의 초기 신호, 또는 성향(predisposition) 때문에 다나졸 화합물을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
31. 제 30항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 당뇨, 고혈압 또는 아테롬성 동맥경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
    
32. 제 1항에 있어서, 상기 혈관 투과성 항진은 뇌(brain), 가로막(diaphragm), 십이지장 근육(duodenal musculature), 지방(fat), 심장, 신장, 큰혈관(large blood vessel), 폐, 장간막(mesentery), 신경, 망막, 골격근(skeletal muscle), 피부 또는 고환(testis)에서, 또는 주변에서 발견된 연속적인 내피(continuous endothelium)의 혈관 투과성 항진인 것을 특징으로 하는 방법.
    
33. 제 32항에 있어서, 상기 연속적인 내피는 뇌, 심장, 폐, 신경 또는 망막에서, 또는 그 주변에서 발견되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
34. 제 1항에 있어서, 상기 혈관 투과성 항진은 신장, 췌장(pancreas), 부신(adrenal), 내분비선(endocrine gland) 또는 소장(intestine)에서, 또는 그 주변에서 발견되는 창문 내피(fenestrated endothelium)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
35. 제 34항에 있어서, 상기 창문 내피는 신장에서 발견된 것을 특징으로 하는 방법.
    
36. 제 1항에 있어서, 상기 다나졸 화합물은 다나졸인 것을 특징으로 하는 방법.
    
37. 제 1항에 있어서, 상기 다나졸 화합물은 시간-방출 제형(time-release formulation)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
38. 제 37항에 있어서, 상기 시간-방출 제형은 리포좀(liposomes) 및 다당류(polysaccharides)로 구성된 군으로부터 선택된 요소(component)로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
    
39. 제 1항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
    
40. 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 동물에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 억제량은 동물의 체지방 함량에 상응하는 것인 이를 필요로 하는 동물에서 혈관 투과성 항진 억제 방법.
    
41. 하기로 구성되는 동물에서 내피세포(endothelial cell)의 세포골격(cytoskeleton) 조절 방법:
    a. 동물의 체질량(body mass)을 결정하는 단계; 및
    b. 동물의 체질량에 상응하는 다나졸 화합물의 혈관 투과성 항진 억제량을 동물에 투여하는 단계.
    
42. 제 41항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 동물의 체질량 지수 계산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
43. 제 41항에 있어서, 상기 세포골격의 조절은 액틴 스트레스 섬유 형성(actin stress fiber formation)의 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
44. 제 41항에 있어서, 상기 세포골격의 조절은 피질의 액틴 고리(cortical actin rings)의 형성의 요인(causing), 증가(increasing) 또는 지속(prolonging)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
45. 제 41항에 있어서, 상기 세포골격의 조절은 RhoA의 억제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
46. 제 41항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
    
    

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