KR20160098178A - 망막 색소 상피 세포의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 세포의 분화 유도 효율이 개선되어, 간이한 조작으로 높은 순도의 망막 색소 상피 세포를 단기간에 얻을 수 있는 망막 색소 상피 세포의 제조법, 세포를 안정적으로 증식 배양할 수 있는 망막 색소 상피 세포의 배양법, 및 이식 치료에 유용한 망막 색소 상피 세포를 사용한 독성·약효 평가법 그리고 망막 질환 치료약을 제공한다. 본 발명은, 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는 망막 색소 상피 세포의 제조법, 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재를 사용하여 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는 망막 색소 상피 세포의 배양법, 상기 방법에 의해 제조 또는 배양하여 얻어지는 망막 색소 상피 세포를 사용하는 독성·약효 평가법, 동 망막 색소 상피 세포를 함유하는 망막 질환 치료약에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 인간 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 효율적으로 제조하는 방법 및 망막 색소 상피 세포를 안정적으로 배양하는 방법 등에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 세포를 제조하는 방법으로서, SFEB 법으로 불리는 무혈청 배지에서 ES 세포를 부유 응집체로서 배양하는 방법 (특허문헌 1 등), 및 분화 유도 인자의 존재하, 약(弱)세포 접착성의 코팅제로 코팅된 배양 기재 상에서 다능성 줄기 세포를 분화 유도하는 방법 등이 알려져 있다 (비특허문헌 1 등). 그러나 이들 방법에서는, 분화 유도 효율이 낮기 때문에, 망막 색소 상피 세포의 고농도 세포 집단을 얻기 위해서, 접착 배양과 부유 배양을 조합하는 복수의 공정이 필요한 것이나, 또한 색소 세포의 콜로니를 광학 현미경하에서 선택적으로 픽업하는 등의, 작업 부담도 있고 시간도 걸리는 순화 (純化) 공정을 필요로 한다는 문제가 있었다. 이에 더하여 이들 방법에서는, 계대 배양 도중에 세포 손실이 발생하기 쉽다는 문제가 있었다. 이 때문에, 고순도의 망막 색소 상피 세포를 간이한 방법으로 안정적으로 취득할 수 있는 방법이 요구되고 있었다.
인간 다능성 줄기 세포의 유지 배양에 있어서, 피더 세포를 대신하여 세포외 매트릭스를 사용하는 방법이 널리 사용되고 있다. 그 중에서도 라미닌이 바람직하게 사용되고 있으며, 예를 들어 비특허문헌 2 에는, 라미닌 511 상에서 인간 ES 세포를 장기간 유지 배양할 수 있었다고 보고가 되어 있다. 또한 세포 접착 활성을 향상시킨 라미닌 개변체로서 알려져 있는 E8 프래그먼트에 대해서, 예를 들어, 특허문헌 2 나 비특허문헌 3 에는, 인간 라미닌 α5β1γ1 의 E8 프래그먼트 (라미닌 511E8, 이하 동일하게 표기) 및 인간 라미닌 322E8 을 사용한 인간 다능성 줄기 세포의 배양 방법이 개시되어 있다. 비특허문헌 4 에는, 라미닌 511E8 이 전장 (全長) 라미닌 511 과 같은 정도의 α6β1 인테그린에 대한 결합 활성을 유지하고 있는 것이 기재되어 있고, 또한 특허문헌 2 에는, 이 라미닌 511E8 을 사용함으로써 다능성 줄기 세포를 배양 접시 상에 안정적으로 고정시키고, 그 결과 그 세포의 분화 다능성을 유지한 상태로 유지 배양할 수 있는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 라미닌의 E8 프래그먼트를 다능성 줄기 세포의 배양 이외, 예를 들어 다능성 줄기 세포의 분화 유도 등에 이용하는 것에 대한 보고는 없다.
한편, 인간 다능성 줄기 세포를 피더 세포의 비존재하에서 망막 색소 상피 세포로 분화 유도하는 방법으로서, 라미닌을 사용한 방법이 알려져 있다. 예를 들어 비특허문헌 5 에는, 라미닌 111 및 매트리겔 (Matrigel) 위에서 다능성 줄기 세포를 접착 배양함으로써, 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도 효율이 현저히 상승한 것이 기재되어 있다. 그러나, 아직 라미닌의 E8 프래그먼트를 다능성 줄기 세포의 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도를 위해 사용했다는 보고는 없다.
비특허문헌 1 : PLoS One. 2012 ; 7(5) : e37342.
비특허문헌 2 : Nature Biotech. June 2010 ; 28(6) : 611-5
비특허문헌 3 : Nat. Commun. 3 : 1236 doi : 10.1038/ncomms 2231
비특허문헌 4 : J Biol Chem. 284 : 7820-7831, 2009
비특허문헌 5 : J. Tissue Eng Regen Med 2013 ; 7 : 642-653
본 발명의 목적은, 다능성 줄기 세포로부터의 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도 효율이 개선되어, 간이한 조작으로 높은 순도의 망막 색소 상피 세포를 단기간에 얻을 수 있는 망막 색소 상피 세포의 제조 방법, 세포를 안정적으로 증식 배양할 수 있는 망막 색소 상피 세포의 배양법, 및 이식 치료에 유용한 망막 색소 상피 세포를 사용한 독성·약효 평가법 및 망막 질환 치료약을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 인간 다능성 줄기 세포를 라미닌 E8 로 코팅한 배양 기재 상에서 배양하면, 파종한 다능성 줄기 세포가 배양 기재에 빠르게 접착되어, 이른 단계에서부터 다량의 색소 세포의 생성이 인정되어, 망막 색소 상피 세포의 수량 (收量) 을 현저히 향상시킬 수 있고, 뿐만 아니라, 배지 교환시에 세포가 잘 손실되지 않으며, 순화 공정을 간략화할 수 있으면서 또한 단기간에 높은 순도의 세포 집단이 얻어지는 것을 알아내었다. 이로써, 다능성 줄기 세포를 망막 색소 상피 세포로 분화 유도하는 데 있어서의 과제였던 조작성 및 경제성이 현저히 개선되어, 목적하는 망막 색소 상피 세포를 안정적으로 효율적으로 제조할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 제조 방법.
[2] 라미닌 E8 프래그먼트가 라미닌 511E8 프래그먼트인, [1] 의 방법.
[3] 접착 배양하는 공정이 분화 유도 인자의 존재하에서 실시되는, [1] 또는 [2] 의 방법.
[4] 인간 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, [1] ∼ [3] 중 어느 하나의 방법.
[5] 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양함으로써 제조되는, 망막 색소 상피 세포.
[6] 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양함으로써 제조되는, 망막 색소 상피 세포 시트.
[7] 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 증폭 방법.
[8] 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 순화 방법.
[9] [1] ∼ [4] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 망막 색소 상피 세포, 또는 [7] 의 방법에 의해 배양되는 망막 색소 상피 세포를 포함하는, 망막 질환 치료약.
본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 세포를 높은 수율로 제조할 수 있다. 또한, 분화 유도 효율이 개선되어, 망막 색소 상피 세포를 고농도로 포함하는 세포 집단을 얻을 수 있으며, 간이한 순화 조작으로 고순도의 망막 색소 상피 세포를 제조할 수 있다. 나아가, 본 발명에 의하면, 망막 색소 상피 세포를 안정적으로 접착할 수 있기 때문에, 배지 교환 도중에 세포가 잘 손실되지 않고, 안정적으로 계대 배양할 수 있다.
도 1 은 라미닌 E8 의 구조의 모식도를 나타낸다.
도 2 는 인간 iPS 세포 (201B7 및 1120C7) 로부터 유도한 RPE 세포에 있어서의 RPE 관련 유전자의 발현을 나타낸다.
도 3 은 비교예 3 에 있어서의, 라미닌 511-E8, 매트리겔 또는 라미닌 511 전장으로 코팅한 기재에 iPS 세포를 파종하고, 분화 유도를 시작하고 나서 1 일째, 2 일째 및 3 일째의 세포 접착의 모습을 나타낸다.
도 4 는 비교예 3 에 있어서의, 라미닌 511-E8, 매트리겔 또는 라미닌 511 전장으로 코팅한 기재에 iPS 세포를 파종하고, 분화 유도를 시작하고 나서 15 일째 및 40 일째쯤의 세포 집단의 모습을 나타낸다.
도 2 는 인간 iPS 세포 (201B7 및 1120C7) 로부터 유도한 RPE 세포에 있어서의 RPE 관련 유전자의 발현을 나타낸다.
도 3 은 비교예 3 에 있어서의, 라미닌 511-E8, 매트리겔 또는 라미닌 511 전장으로 코팅한 기재에 iPS 세포를 파종하고, 분화 유도를 시작하고 나서 1 일째, 2 일째 및 3 일째의 세포 접착의 모습을 나타낸다.
도 4 는 비교예 3 에 있어서의, 라미닌 511-E8, 매트리겔 또는 라미닌 511 전장으로 코팅한 기재에 iPS 세포를 파종하고, 분화 유도를 시작하고 나서 15 일째 및 40 일째쯤의 세포 집단의 모습을 나타낸다.
1. 망막 색소 상피 세포의 제조 방법
본 발명은, 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는 망막 색소 상피 세포의 제조 방법이다 (이하, 「본 발명의 제조 방법」이라고 한다).
본 발명에 있어서의 「다능성 줄기 세포」란, 자기 복제능과 분화 다능성을 갖는 줄기 세포를 의미하고, 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들어, 배성 (胚性) 줄기 세포 (ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등이 널리 이용된다. 바람직하게는 인간 ES 세포 또는 인간 iPS 세포가 이용되고, 보다 바람직하게는 인간 iPS 세포가 이용된다.
본 발명에 있어서의 「iPS 세포」란, 체세포 (예를 들어 섬유아 세포, 피부 세포, 림프구 등) 에 핵 초기화 인자를 접촉시킴으로써, 인위적으로 자기 복제능 및 분화 다능성을 획득한 세포를 말한다. 본 발명에 있어서의 iPS 세포의 제조법은, 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 「망막 색소 상피 세포」란, 망막 색소 상피를 구성하는 상피 세포, 및 그 전구 세포를 말한다. 망막 색소 상피 세포인지는, 예를 들어, 세포 마커 (RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1 등) 의 발현이나, 세포의 형태 (세포 내의 멜라닌 색소 침착, 다각형이고 편평상 (扁平狀) 의 세포 형태, 다각형의 액틴 다발의 형성 등) 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 망막 색소 상피 세포의 전구 세포란, 망막 세포로의 분화 유도가 방향지어진 세포를 의미하고, 당해 전구 세포인지는, 세포 마커 (Mitf, Pax6, Rx, Crx 등) 의 발현 등에 의해 확인할 수 있다. 또한 망막 색소 상피 세포의 기능 평가는, 예를 들어 사이토카인 (VEGF 나 PEDF 등) 의 분비능이나 탐식능 등을 지표로 하여 확인할 수 있다. 이들 기능 평가 및 확인 조작은, 당업자라면 적절히 조건을 설정하여 실시하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 「라미닌」이란, α, β, γ 사슬로 이루어지는 헤테로 삼량체 분자로, 서브유닛 사슬의 조성이 상이한 아이소폼이 존재하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는, 라미닌은 5 종의 α 사슬, 4 종의 β 사슬 및 3 종의 γ 사슬의 헤테로 삼량체의 조합으로 약 15 종류의 아이소폼을 갖는다. α 사슬 (α1 ∼ α5), β 사슬 (β1 ∼ β4) 및 γ 사슬 (γ1 ∼ γ3) 의 각각의 숫자를 조합하여, 라미닌의 명칭이 정해지고 있다. 예를 들어 α1 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 라미닌 111 이라고 하고, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 라미닌 511 이라고 하고, α5 사슬, β2 사슬, γ1 사슬의 조합에 의한 라미닌을 라미닌 521 이라고 한다. 라미닌으로는, 예를 들어 포유동물에서 유래하는 라미닌을 사용할 수 있다. 포유동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간을 들 수 있다. 인간에 대한 이식을 목적으로 하여 망막 색소 상피 세포를 제조하는 경우 등에는, 인간 라미닌이 바람직하게 사용된다. 현 단계에서 인간 라미닌에는 15 종류의 아이소폼이 알려져 있다.
라미닌 E8 프래그먼트는, 본래 마우스 라미닌 111 을 엘라스타아제로 소화시켜 얻어진 프래그먼트 중에서, 강한 세포 접착 활성을 갖는 프래그먼트로서 동정된 것이다 (EMBO J., 3 : 1463-1468, 1984., J. Cell Biol., 105 : 589-598, 1987.). 마우스 라미닌 111 이외의 라미닌에 대해서도 엘라스타아제로 소화시켰을 때에 마우스 라미닌 111 의 E8 프래그먼트에 상당하는 프래그먼트의 존재가 추정되지만, 마우스 라미닌 111 이외의 라미닌을 엘라스타아제로 소화하여 E8 프래그먼트를 분리·동정한 것은 지금까지 보고되어 있지 않다. 따라서, 본 발명에 사용되는 라미닌 E8 프래그먼트는, 각 라미닌의 엘라스타아제 소화 산물임을 필요로 하는 것이 아니라, 대응하는 각 라미닌과 동일한 세포 접착 활성을 갖고, 엘라스타아제로 소화시킨 E8 프래그먼트와 대응하는 구조를 갖는 라미닌의 프래그먼트이면 재조합체여도 된다. 즉 본 발명에 있어서의 「라미닌 E8 프래그먼트 (이하, 「라미닌 E8」로 기재하는 경우도 있다)」란, α 사슬, β 사슬, γ 사슬의 각 C 말단 영역에서 헤테로 삼량체를 구성하고, 인테그린에 대한 결합 활성을 유지함과 함께, 세포 접착 활성을 유지하고 있는 분자를 말한다. 라미닌 E8 은, 라미닌 아이소폼마다 상이한 인테그린 결합 특이성을 나타내어, 대응하는 인테그린을 발현하는 세포에 강한 접착 활성을 발휘할 수 있다.
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 이란, 구체적으로 설명하면,
(1) 기능상, 전장 라미닌과 적어도 동등한 세포 접착 활성을 가지면서 또한 적어도 동등한 인테그린 결합 활성을 갖고, 또한
(2) 구조상, 마우스 라미닌 E8 에 대응하는 구조를 갖는, 구체적으로는 라미닌 삼량체의 코일드 코일 C 말단 영역으로부터 G 도메인의 1 ∼ 3 번째에 대응하는 구조를 갖는 라미닌 프래그먼트를 말한다. 이하, (1) 기능면 및 (2) 구조면에서 더욱 상세히 설명한다.
(1) 라미닌 E8 의 기능에 관해서
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 로는, 예를 들어, 인간 다능성 줄기 세포 및/또는 인간 망막 색소 상피 세포의 표면에 발현하는 인테그린의 적어도 하나에 대한 결합 특이성을 나타내는 분자, 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포 및 인간 망막 색소 상피 세포의 양 세포의 표면에 발현하는 인테그린과, 인간 망막 색소 상피 세포의 표면에 발현하는 인테그린에 결합 특이성을 나타내는 분자가 바람직하게 사용된다. 인간 다능성 줄기 세포의 표면에 발현하는 인테그린으로는, α6β1 인테그린 등을 들 수 있고, 인간 망막 색소 상피 세포의 표면에 발현하는 인테그린으로는, 예를 들어 α6β1 인테그린, α3β1 인테그린, α7β1 인테그린 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 은, 각 라미닌과 적어도 동등한 인테그린에 대한 결합 특이성을 나타낸다. 또한, 특히 인테그린에 대한 친화성이 강한 것이 바람직하게 사용된다. 「인테그린에 대한 친화성이 강한 라미닌 E8」로는, 공지된 방법으로 측정된 해리 상수가 유의하게 낮은 것으로서, 예를 들어, The Journal of Biological Chemistry (2009) 284, pp.7820-7831 의 Table 1 에 나타내는 방법으로 측정된 해리 상수가, 예를 들어 10 nM 이하이다.
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 로는, 또, 세포 접착 활성이 강한 것이 바람직하게 사용된다. 「세포 접착 활성이 강한 라미닌 E8」이란, 공지된 방법으로 측정된 세포 접착성 시험에 있어서 유의하게 강한 접착 활성을 나타내는 것으로서, 예를 들어, The Journal of Biological Chemistry (2007) 282, pp.11144-11154 에 기재된 세포 접착 어세이를 실시한 경우에, 라미닌 E8 의 코팅 농도가 10 nM 이하에서 400 개/㎟ 이상의 접착 세포수가 얻어지는 것이다.
본 발명에서는, 라미닌 E8 로는, α6β1 인테그린에 대한 결합 특이성을 나타내고, 분화 유도 초기의 다능성 줄기 세포를 안정적으로 접착시키고, 분화 유도 후기의 망막 색소 상피 세포 또는 그 전구 세포를 안정적으로 접착할 수 있는 것이 바람직하게 사용된다. 이 관점에서, 라미닌 E8 중에서도, 특히 라미닌 511E8 은 α6β1 인테그린에 추가하여, α3β1 인테그린 및 α7β1 인테그린에 대한 결합 특이성을 갖기 때문에, 망막 색소 상피 세포에 대한 접착 활성을 향상시킴으로써, 다능성 줄기 세포를 망막 색소 상피 세포로 분화 유도하는 효율을 향상시키는 것에 기여하는 점에서, 혹은 망막 색소 상피 세포의 유지 배양의 안정화에 기여할 수 있는 점에서, 매우 바람직하다.
(2) 라미닌 E8 의 구조에 관해서
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 은, 전술한 바와 같이, 또는 도 1 에 나타내는 바와 같이, 마우스 라미닌 111 의 엘라스타아제 소화물에 있어서의 세포 접착 활성을 갖는 프래그먼트 (E8 프래그먼트) 에 구조상 대응하는 라미닌 프래그먼트이다. 즉 전장 라미닌에 있어서의 도메인 Ⅱ (3 가닥 사슬 코일드 코일 도메인) 의 일부를 유지 (도 1 의 E8 fragment 를 나타내는 그림에서는 그와 같이 기재되어 있지는 않지만, 실제로는 코일드 코일 구조를 유지하고 있다) 하고, E8 의 N 말단측에서는 β 사슬의 대응하는 프래그먼트 및 γ 사슬의 대응하는 프래그먼트로 짧은 코일드 코일 구조를 형성한다. 또한 E8 의 C 말단측에서는, α 사슬의 G1 ∼ G3 도메인 구조가 유지되어 있다. 또 β 사슬과 γ 사슬은, 각각의 C 말단측에 있는 시스테인 잔기를 개재하여 디술파이드 결합을 형성함으로써, 서로 결합되어 있다.
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 은, 전술한 바와 같이, 천연 라미닌을 엘라스타아제 처리하여 얻어지는 효소 처리체여도 되고, 또는 유전자 재조합에 의해 생성되는 재조합체여도 된다. 또 본 발명의 라미닌 E8 이 재조합체인 경우, 대응하는 전장 (천연) 라미닌에 있어서의 인테그린과의 결합 활성을 유지하고, 그 세포 접착성을 손상시키지 않는 범위에서, 정제하는 것 등을 목적으로 하여 N 말단에 태그가 결합되어 있어도 된다. 그와 같은 태그로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 His 태그, Flag 태그, HA 태그 등을 들 수 있다. 또한 태그와 라미닌 E8 의 링커 부분의 배열에 대해서도, 대응하는 전장 (천연) 라미닌에 있어서의 인테그린과의 결합 활성을 유지하고, 세포 접착성을 손상시키지 않는 한 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서의 라미닌 E8 은, 대응하는 라미닌에 있어서의 인테그린과의 결합 활성을 유지하고, 그 세포 접착성을 손상시키지 않는 범위에서, 아미노산 배열의 일부가 결실, 부가, 또는 치환된 것이어도 된다. E8 프래그먼트는, 일반적으로는 α 사슬 C 말단측의 G 도메인이 2 개 (G4 및 G5) 결실되어 있지만, 본 발명에서의 라미닌 E8 에 있어서는, 대응하는 전장 (천연) 라미닌에 있어서의 인테그린과의 결합 활성을 유지하고, 그 세포 접착성을 손상시키지 않는 범위에서, 이 G4, G5 도메인의 일부 또는 전부가 포함되어 있어도 된다. 예를 들어 라미닌 511E8 에 있어서는, 라미닌 511 과 동등한 인테그린 α6β1 에 대한 결합 활성을 유지하고, 세포 접착 활성이 손상되어 있지 않으면 G4, G5 도메인의 일부 또는 전부가 포함되어 있어도 된다.
한편으론, 라미닌 E8 은 전장 라미닌과 동일하게 β 사슬과 γ 사슬이 코일드 코일 부분의 C 말단측에서 시스테인을 개재하여 결합하고 있지만, 이 시스테인은 인테그린 결합 활성에 영향을 주기 때문에, 치환, 결실되지 않는 것이 바람직하다. 그리고 γ 사슬에 있어서의 당해 시스테인 이후의 C 말단측 아미노산도 인테그린 결합 활성에 영향을 주기 때문에, 적어도 결실되지 않는 것이 바람직하다 (J Biol Chem. 2007 Apr 13 ; 282 (15) : 11144-54.).
이러한 라미닌 E8 의 구체적인 예로는, WO2011/043405 의 실시예 (3) 에서 제작된 rhLM511E8 을 들 수 있다. 당해 라미닌 511E8 은, 본 발명의 라미닌 E8 로서 바람직하게 이용할 수 있다.
본 발명에 사용하는 「배양 기재」는, 본 발명의 라미닌 E8 을 배양기 표면에 코팅함으로써 제조할 수 있다. 여기서 배양기 표면에 대한 「코팅」이란, 라미닌 E8 과 배양기 표면과의 어떤 상호 작용을 통해서 라미닌 E8 을 배양기 표면에 흡착시키는 것을 말하고, 본 발명의 효과를 나타냄에 있어서 특별히 라미닌 E8 의 배향성은 문제가 되지 않는다. 배양기로는, 세포 배양에 사용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 디쉬 (배양 접시라고도 부른다), 샤알레나 플레이트 (6 구멍, 24 구멍, 48 구멍, 96 구멍, 384 구멍, 9600 구멍 등의 마이크로타이터 플레이트, 마이크로 플레이트, 딥 웰 플레이트 등), 플라스크, 챔버 슬라이드, 튜브, 셀 팩토리, 롤러 보틀, 스피너 플라스크, 할로우 화이버, 마이크로 캐리어, 비즈 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 배양 기재는, 라미닌 E8 에 의한 세포 접착 특성을 손상시키지 않는 한, 적절히 표면 처리가 실시되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「접착 배양」이란, 목적하는 세포가 라미닌 E8 을 통해서 배양기의 바닥면에 접착되고, 배양 중에 배양기를 가볍게 흔들어도 세포가 배양액 중으로 떠올라 오지 않는 상태에 있어서의 배양을 의미한다. 본 발명에 사용하는 라미닌 E8 은 극히 우수한 세포 접착성을 나타내기 때문에, 세포 파종 후, 빠르게 배양기를 진동시키는 등의 방법으로 균일하게 분산시키는 것이 바람직하다. 또 본 발명이 목적하는 범위 내이면, 접착 배양의 전후에서, 목적하는 세포를 라미닌 E8 이 존재하는 배양기 중에서 부유 배양해도 된다.
배지는, 기초 배지, 혈청 및/또는 혈청 대체물, 및 그 밖의 성분으로 구성된다. 기초 배지로는, 포유동물 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 합성 배지를 1 종 또는 복수 종을 조합하여 이용할 수 있고, 예를 들어, DMEM, GMEM 등의 시판품을 입수할 수 있다.
혈청은, 소, 인간 등의 포유동물에서 유래하는 혈청을 사용할 수 있다. 혈청 대체물이란, 세포 배양에 사용되는 FBS 등의 혈청의 대체가 되는 저단백질 대체품으로서, 시판품으로는 예를 들어, Knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco 사 제조), Glutamax (Gibco 사 제조) 등 외에, 신경 세포 배양용 혈청 대체물인 N2, B27 등을 입수할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 목적하는 세포의 품질 관리상의 관점에서 혈청 대체물이 바람직하고, 특히 KSR 이 바람직하다.
혈청 또는 혈청 대체물의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 30 ％ (v/v) 의 범위로부터 적절히 설정할 수 있고, 농도는 일정해도 되고 단계적으로 변화시켜 사용해도 되며, 예를 들어 농도를 1 ∼ 3 일 정도 (바람직하게는 2 일) 의 간격으로, 단계적으로 저하시켜 사용해도 된다. 예를 들어, 혈청 또는 혈청 대체물의 농도를 20 ％, 15 ％, 10 ％ 의 3 단계로 나눠서 첨가할 수 있다.
배지를 구성하는 그 밖의 성분으로서, 배양액 중에 분산된 인간 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 목적으로, Y-27632 등의 Rho 키나아제 저해제를 사용할 수 있다. Rho 키나아제 저해제의 첨가 기간은, 분화 유도 공정의 일부여도, 또는 전체 기간이어도 된다. 예를 들어, 분화 유도 공정의 후기는, Rho 키나아제 저해제를 첨가하지 않은 배지를 사용함으로써, 목적하는 세포로 분화되지 않은 불필요한 세포를 세포사에 의해 제거할 수 있다.
배지는 상기 서술한 것 이외에, 포유동물 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 그 밖의 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 제조법에 사용되는 인간 다능성 줄기 세포의 농도는, 다능성 줄기 세포를 균일하게 파종할 수 있고, 접착 배양 가능한 농도이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 ㎝ 디쉬를 사용하는 경우, 1 디쉬당 1×105 ∼ 1×108 세포, 바람직하게는 2×106 ∼ 5×107 세포, 보다 바람직하게는 5×105 ∼ 9×106 세포이다.
본 발명의 제조 방법에 있어서의 접착 배양은, 분화 유도 인자의 존재하에서 실시할 수도 있다. 분화 유도 인자로는, 목적하는 세포로의 분화 유도를 촉진하는 인자로서 공지된 것을 이용할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에서는, 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도를 실시하기 위해서, 망막 색소 상피 세포로의 분화 유도 인자를 사용하는 것이 바람직하다. 망막 색소 상피 세포의 분화 유도 인자로는, 예를 들어, Nodal 시그널 저해제, Wnt 시그널 저해제, 소닉·헤지호그 시그널 저해제, 및 Activin 시그널 촉진제 등을 들 수 있다.
Nodal 시그널 저해제는, Nodal 에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등을 사용할 수 있다. Nodal 시그널 저해제로는, 예를 들어, Lefty-A, 가용형 Nodal 수용체, 항 Nodal 항체, Nodal 수용체 저해제 등의 단백질, 펩티드, 또는 핵산 ; SB-431542 등의 저분자 화합물 등을 들 수 있고, 특히 입수가 용이하고 로트간 차이도 적은, SB-431542 등의 저분자 화합물이 바람직하다.
Wnt 시그널 저해제는, Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 단백질, 핵산, 저분자 화합물 등을 사용할 수 있다. Wnt 시그널 저해제로는, 예를 들어, Dkk1, Cerberus 단백질, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 도미넌트 네거티브 Wnt 단백질 등의 단백질, 펩티드, 또는 핵산 ; CKI-7 (N-(2-아미노에틸)-5-클로로-이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476 (4-{4-(2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일)-5-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일}벤즈아미드), IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 등의 저분자 화합물을 들 수 있고, 특히, 입수가 용이하고 로트간 차이도 적은 저분자 화합물이 바람직하다. 그 중에서도, 카세인 키나아제 Ⅰ 을 선택적으로 저해하는 활성을 갖는 저분자 화합물이 바람직하고, 예를 들어 CKI-7, D4476 등을 이용할 수 있다.
Activin 시그널 촉진제로는, 예를 들어, Activin 패밀리에 속하는 단백, Activin 수용체, Activin 수용체 아고니스트 등을 들 수 있다.
이들 분화 유도 인자의 농도는 분화 유도 인자의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있는데, 구체적으로는, Nodal 시그널 저해제로서 SB-431542 를 사용하는 경우, 예를 들어, 0.01 ∼ 50 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 μM, 보다 바람직하게는 5 μM 의 농도이고, Wnt 시그널 저해제로서 CKI-7 을 사용하는 경우, 0.01 ∼ 30 μM, 바람직하게는 0.1 ∼ 30 μM, 보다 바람직하게는 3 μM 의 농도로 첨가한다.
본 발명의 제조 방법에 있어서는, 바람직하게는 분화 유도 인자로서, Nodal 시그널 저해제 (예, SB-431542) 와 Wnt 시그널 저해제 (예, CKI-7) 가 조합하여 사용된다.
상기 서술한 방법에 따른 배양에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피 세포로의 분화를 유도하고, 그것에 의해, 다능성 줄기 세포의 파종으로부터 통상 25 ∼ 45 일째에 망막 색소 상피 세포를 생성시킬 수 있다. 망막 색소 상피 세포가 생성된 것의 확인은, 상기 서술한 방법에 따라서 실시할 수 있다. 망막 색소 상피 세포의 생성이 확인되면, 배지를 망막 색소 상피 세포의 유지 배지로 교환하고, 예를 들어 3 일에 1 회 이상의 빈도로 전량 배지 교환을 실시하면서 5 ∼ 10 일간 추가로 배양하는 것이 바람직하다. 그것에 의해, 더욱 분명히 멜라닌 색소 침착 세포군이나 기저막에 접착되는 다각 편평상의 형태를 갖는 세포군을 관찰할 수 있다.
망막 색소 상피 세포의 유지 배지는, 예를 들어 IOVS, March 2004, Vol. 45, No.3, Masatoshi Haruta, et. al., IOVS, November 2011, Vol. 52, No.12, Okamoto and Takahashi, J. Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakada, et. al., IOVS, February 2008, Vol. 49, No.2, Gamm, et. al.에 기재된 것을 사용할 수 있고, 기초 배지, 혈청 및/또는 혈청 대체물, 및 그 밖의 성분으로 구성된다. 기초 배지로는, 포유동물 세포의 배양에 일반적으로 사용되는 합성 배지를 1 종 또는 복수 종을 조합하여 이용할 수 있고, 예를 들어, DMEM, GMEM 등의 시판품을 입수할 수 있다.
혈청은, 소, 인간, 돼지 등의 포유동물에서 유래하는 혈청을 사용할 수 있다. 혈청 대체물이란, 세포 배양에 사용되는 FBS 등의 혈청의 대체가 되는 저단백질 대체품으로서, 시판품으로는 예를 들어, Knockout Serum Replacement (KSR), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco 사 제조), Glutamax (Gibco 사 제조) 등 외에, 신경 세포 배양용 혈청 대체물인 N2, B27 등을 입수할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 목적하는 세포의 품질 관리상의 관점에서 혈청 대체물이 바람직하고, 특히 B27 이 바람직하다.
그 밖의 성분으로는, 예를 들어, L-glutamine, 페니실린 나트륨, 황산 스트렙토마이신 등을 들 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 또한, 농축 조작에 의해 망막 색소 상피 세포를 순화하는 공정을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 제조 방법에 의하면, 분화 유도 효율이 현저하게 개선되기 때문에, 간이한 조작으로 고순도의 망막 색소 상피 세포를 짧은 제조 기간에 얻을 수 있다. 망막 색소 상피 세포를 농축하는 방법으로는, 일반적으로 세포를 농축하는 방법으로서 공지된 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 여과, 원심분리, 관류 (灌流) 분리, 플로 사이트메트리 분리, 항체 수식 담체에 의한 트랩 분리 등의 방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 나일론 메시를 사용한 여과 등의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 의하면, 세포 접착성이 우수한 라미닌 E8 을 통해서 인간 다능성 줄기 세포가 배양기에 빠르게 접착, 고정된 상태로 배양을 실시함으로써, 분화 유도 효율이 현저히 향상되고, 게다가 배지 교환 중의 세포 손실을 억제할 수 있다. 따라서, 고농도의 망막 색소 상피 세포의 세포 집단을 대량으로 얻을 수 있다. 나아가, 간이한 조작으로 세포 순화를 실시할 수 있어, 순화 공정에 걸리는 시간을 단축할 수 있고, 망막 색소 상피 세포를 매우 효율적으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 제조 방법에 의하면, 망막 색소 상피 세포는 서로 접착되어 시트상 구조를 취할 수 있다. 따라서 본 발명의 제조 방법에 의해 망막 색소 상피 세포의 시트를 제조하는 것이 가능하다. 이 망막 색소 상피 세포의 시트는, 3. 에서 후술되는 바와 같이, 망막 질환을 치료하는 세포 이식 치료약으로 사용되는 세포 집단으로서 유용하다.
2. 망막 색소 상피 세포의 증폭 방법
본 발명은 또한, 라미닌 E8 이 코팅된 배양 기재를 사용하여 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는 망막 색소 상피 세포의 증폭 방법에 관한 것이다 (이하, 「본 발명의 증폭 방법」이라고 한다). 본 발명의 증폭 방법에 의하면, 망막 색소 상피 세포를 간편한 방법으로 용이하게 증식시킬 수 있다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서의 망막 색소 상피 세포로는, 예를 들어 포유동물에서 유래하는 망막 색소 상피 세포를 사용할 수 있다. 포유동물로는, 예를 들어, 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간을 들 수 있다. 인간에 대한 이식 등을 목적으로 하여 망막 색소 상피 세포를 제조하는 경우 등에는, 인간 망막 색소 상피 세포가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서의 망막 색소 상피 세포는, 망막 색소 상피를 구성하는 상피 세포 및 그 전구 세포를 말하고, 예를 들어, 생체 유래의 망막 색소 상피 세포 ; 미분화 세포 (다능성 줄기 세포, 망막 색소 상피 세포의 전구체 등) 부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포 ; 분화 세포나 망막 색소 상피 세포 이외의 세포의 전구체로부터 분화 전환된 망막 색소 상피 세포 등, 바람직하게는 미분화 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포, 보다 바람직하게는 상기 본 발명의 제조 방법에 의해 얻은, 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 망막 색소 상피 세포이다.
본 발명의 증폭 방법에 사용되는 망막 색소 상피 세포의 농도는, 망막 색소 상피 세포를 균일하게 접착 배양 가능한 농도이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 10 ㎝ 디쉬를 사용하는 경우, 1 디쉬당 1×105 ∼ 1×108 세포, 바람직하게는 2×106 ∼ 5×107 세포, 보다 바람직하게는 5×105 ∼ 1×107 세포이다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서의 라미닌 E8 프래그먼트는 상기와 동일하고, 배양 기재에 대한 코팅 방법도 동일하다. 따라서, 상기 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 망막 색소 상피 세포를 동일한 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양기 상에서 배양함으로써, 얻어진 망막 색소 상피 세포를 그대로 증폭시켜, 대량으로 얻을 수 있는 것이다. 또한 본 발명의 증폭 방법에 의하면, 분화 유도한 망막 색소 상피 세포 안에 포함되는 분화 유도할 수 없었던 세포를 상대적으로 저감할 수 있기 때문에, 본 발명의 증폭 방법은, 망막 색소 상피 세포의 순화 방법으로도 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서 사용하는 라미닌 E8 로는, 특히 라미닌 511E8 이 α6β1 인테그린에 추가하여, α3β1 인테그린 및 α7β1 인테그린에 대한 결합 특이성을 갖기 때문에, 망막 색소 상피 세포에 대한 접착 활성의 향상에 의해, 망막 색소 상피 세포의 유지 배양의 안정화, 그리고 세포 증식에 기여할 수 있는 점에서 바람직하다.
본 발명의 증폭 방법에 의하면, 세포 접착성이 우수한 라미닌 E8 을 통해서 망막 색소 상피 세포가 배양기에 빠르게 고정되어, 배지 교환시의 세포 손실을 억제할 수 있고, 또한 계대에 의한 세포 형태의 변형을 억제할 수 있기 때문에, 안정적으로 망막 색소 상피 세포의 유지 배양, 그리고 배양 증식을 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 증폭 방법에 의하면, 막상의 망막 색소 상피 세포군을 그대로, 또는 배양 기재로부터 분리 회수함으로써, 하기에 나타내는 망막 질환 치료약으로서 이용할 수도 있다.
3. 망막 색소 상피 세포
본 발명의 제조 방법 또는 증폭 방법에 의해서 얻어진 망막 색소 상피 세포는 라미닌 E8, 특히 라미닌 511E8 상에서 배양하는 점에서, 세포 단독으로도, 그리고 시트로서도 배양 기재로부터 분리 회수하는 것이 용이하여, 우수한 특성을 갖고 있다.
4. 망막 질환 치료약
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포 및 본 발명의 증폭 방법에 의해 증폭된 망막 색소 상피 세포는, 현탁액이나 시트 형상에 의해 생체에 이식하여 망막 질환을 치료하는 세포 이식 치료약으로서 사용할 수 있다. 망막 질환이란, 망막에 관련된 안과 질환으로서, 당뇨병 등 다른 질환에 의한 합병증도 포함된다.
5. 독성·약효 평가약
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포는, 건강한 정상 및 질환의 모델 세포로서 망막계 질환 치료약 및·약효 평가 당뇨병 등 다른 합병증의 질환 치료약, 또한 그 예방약의 스크리닝, 화학 물질 등의 안전성 시험, 스트레스 시험, 독성 시험, 부작용 시험, 감염·혼입 시험에 활용이 가능하다. 한편, 망막 세포 특유의 광 독성, 망막 흥분 독성 등의 독성 연구, 독성 시험 등에 활용하는 것도 가능하다. 그 평가 방법으로는, 아포토시스 평가 등의 자극·독성 시험 외에, 전구 세포로부터 망막 색소 상피 세포 및 시세포로의 정상 분화에 미치는 영향을 평가하는 시험 (각종 유전자 마커의 RT-PCR, 사이토카인의 ELISA 등에 의한 발현 단백질 해석, 탐식능 시험), 광 독성 등의 독성 시험, 시기능에 대한 망막 전위나 경상피 전기 저항, 자기 면역 반응에서 기인하는 세포 상해 시험 등이 있다. 또한, 이러한 시험들을 위한 세포 재료로는, 망막 색소 상피 세포뿐만 아니라 그 전구 세포도 사용하는 것이 가능하고, 예를 들어, 세포를 파종 접착한 플레이트, 세포 현탁액, 그 시트 또는 성형체를 제공할 수 있다. 이것은, 인간 및 동물 시험의 외삽 시험으로서 사용할 수 있다.
본 명세서 중에서 거론된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함한 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해 그 전부가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 편입되는 것이다.
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하에 나타내는 실시예에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
iPS 세포 유래 RPE 세포의 제조
시약
·분화 유도 기본 배지 (GMEM 배지 (Invitrogen), KSR (Invitrogen), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액 (Invitrogen), 1 mM 피루브산나트륨 (SIGMA), 0.1M 2-메르캅토에탄올 (와코 쥰야쿠), 100 U/㎖ 페니실린 - 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Invitrogen))
·제 1 분화 유도 배지 (KSR 을 20 ％ 함유하는 분화 유도 기본 배지, 10 μM Y-27632 (와코 쥰야쿠), 5 μM SB431542 (SIGMA), 3 μM CKI-7 (SIGMA))
·제 2 분화 유도 배지 (KSR 을 15 ％ 함유하는 분화 유도 기본 배지, 10 μM Y-27632 (와코 쥰야쿠), 5 μM SB431542 (SIGMA), 3 μM CKI-7 (SIGMA))
·제 3 분화 유도 배지 (KSR 을 10 ％ 함유하는 분화 유도 기본 배지, 10 μM Y-27632 (와코 쥰야쿠), 5 μM SB431542 (SIGMA), 3 μM CKI-7 (SIGMA))
·제 4 분화 유도 배지 (KSR 을 10 ％ 함유하는 분화 유도 기본 배지)
·RPE 유지 배지 (67 ％ DMEM low glucose (SIGMA), 29 ％ F12 (SIGMA), 1.9 mM L-glutamine (Invitrogen), 1.9 ％ B-27 supplement (Invitrogen), 96 U/㎖ 페니실린 나트륨, 96 ㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신)
망막 색소 상피 세포의 제조 (분화 유도)
인간 말초혈 (단핵구) 유래 iPS 세포 (1120C7, 쿄토 대학 제공) 를 라미닌 코팅 배양 접시 (스미토모 베이크라이트사 제조) 에, 9×106 cells/9 ㎝ dish 가 되도록 파종하였다. 라미닌 코팅 배양 접시는, 9 ㎝ 배양 접시 (BD FALCON) 를 라미닌 511E8 프래그먼트 (WO2011043405 의 실시예 (3) 에 개시된 단백질. (닛피사 제조 (iMatrix-511, NIP-8920-02))) 의 0.5 ㎍/㎠ 수용액을 사용하여, 37 ℃에서 1 시간 이상 코팅하여 제작하였다. iPS 세포는 배양 접시 상에 빠르게 접착되고, 부유 응집체의 형성은 확인되지 않았다.
상기 분화 유도는 이하의 타임 라인으로 실시하고, 본 명세서 중의 실시예, 비교예에 있어서의 분화 유도는 전부 이것에 따랐다. 배양 첫날을 Day 0 으로 하여, 배양 개시 후 (Day 1) 부터 색소 세포가 확인되는 Day 40 경까지 매일, 전량 배지 교환을 실시하였다. 배지는, 다음에 나타내는 바와 같이 단계적으로 조성을 변경하였다. 즉 Day 1-4 는 제 1 차 분화 유도 배지 (20 ％ KSR), Day 5-8 은 제 2 차 분화 유도 배지 (15 ％ KSR), Day 9-12 는 제 3 차 분화 유도 배지 (10 ％ KSR), Day 13 부터 색소 세포가 확인되는 Day 40 경까지는 제 4 차 분화 유도 배지 (10 ％ KSR) 를 사용하였다.
Day 40 경에 색소 세포가 확인된 후에는, Day 47 까지, RPE 유지 배지를 사용하여 3 일에 1 회 이상, 전량 배지 교환을 실시하였다. 배양이 진행됨에 따라서 세포의 색소가 진해지고, Day 47 에는, 다수의 진한 색소를 갖는 세포군이 인정되었다. Day 47 에 색소 세포를 포함하는 세포 집단을 회수하였다.
코팅제로서 라미닌 511E8 프래그먼트를 사용한 것에 의해, 파종된 iPS 세포는 배양 접시에 고밀도로 빠르게 접착되고, 분화 유도 배지에 의한 배양 기간 중에도 접착 상태를 안정적으로 유지하고 있었다. 그 때문에, 전량 배지 교환을 반복했을 때에도 세포의 손실을 낮게 억제할 수 있었다. 또한, 콜라겐을 코팅한 배양기에 iPS 세포를 파종했을 때와 비교하여, 색소 세포가 생성되는 비율이 대폭 향상되어, 분화 유도 효율이 현저히 개선되었다.
실시예 2
RPE 세포의 제조 (다른 iPS 세포)
인간 말초혈 (단핵구) 유래 iPS 세포 (1120C7, 쿄토 대학 제공) 대신에, 인간 피부 (섬유아 세포) 유래 iPS 세포 (201B7, 쿄토 대학 제공) 을 사용한 점 이외에는 실시예 1 과 동일한 방법으로 색소 세포를 얻었다.
그 결과, 실시예 1 과 마찬가지로, 파종한 iPS 세포에 대하여 색소 세포가 생성되는 비율이 대폭 향상되어, 분화 유도 효율이 현저히 개선되었다.
실시예 3
iPS 세포 유래 RPE 세포의 증폭
실시예 1 및 실시예 2 에 있어서의 Day 47 의 색소 세포를 포함하는 세포 집단이 접착 배양된 배양 접시에, 0.01 ％ Trypsin - 0.53 mM EDTA 를 첨가하여 처리하고 배양 접시로부터 세포 덩어리를 박리하였다. 이어서 조심스러운 피펫팅에 의해, 세포간의 접착을 해리하였다. 또 원심분리에 의해 세포 혼합물 중의 단백질 분해 효소액과 그 잔사 불순물을 상청액과 함께 제거하고, 이어서, 셀 스트레이너 (DB Falcon Cell Strainer 40 ㎛ Nylon) 를 통해서 여과 분리에 의해 불필요한 세포를 분리하고, RPE 세포를 포함하는 세포 집단을 회수하였다 (Day 48).
얻어진 세포를, 9×106 cells/9 ㎝ dish 가 되도록, 실시예 1 에 기재된 RPE 유지 배지를 사용하여 실시예 1 에서 사용한 것과 동일한 라미닌 511E8 코팅 배양 접시 5 장에 파종하고, RPE 세포 콜로니의 접착이 확인되는 Day 50 경까지 정치 (靜置) 배양하였다.
Day 51 에서 Day 71 까지 3 일에 1 회 이상 3 주간, RPE 유지 배지를 사용한 전량 배지 교환을 실시하고, 이어서, 2 번째의 필터 여과 분리를 시킨 후 동일한 라미닌 511E8 코팅 배양 접시 각 5 장에 파종하고, 동일하게 2 주간 배양시킨 결과, 실시예 1 및 실시예 2 의 어느 세포 집단으로부터도, 망막 색소 상피 세포를 10 ㎝ 디쉬로 25 장분의 수량까지 증폭하였다. 얻어진 세포 집단의 순도 (n = 4) 는 각각 96.4 ％, 100 ％, 98.6 ％, 99.6 ％ 였다.
일례로서, 98.6 ％ 순도였던 디쉬의 순도 산출 데이터를 나타낸다.
순도는, Pax6, Bestrphin 의 면역 염색을 실시하여, 어느 하나가 염색된 경우에는 RPE 세포로 판정하고, 또한 형광이 보이지 않은 세포에 대해서는 세포내의 멜라닌 색소의 유무를 조사하여, 색소를 확인함으로써 RPE 세포로 판정하였다 (색소에 따라 형광 관찰이 저해되는 경우가 있기 때문에, 형광이 보이지 않더라도 색소가 존재하면 RPE 세포로 판정). 그리고 각각을 양성 세포에 가산하는 방법에 의해 구하였다.
또 본 실시예를 다른 라인 (201B7) 의 iPS 세포로 실시해도, 동일한 결과가 얻어졌다.
비교예 1
실시예 1 의 분화 유도 공정에 있어서, 라미닌 511E8 로 코팅한 배양 접시 (BD FALCON) 에 의한 접착 배양 대신에, MPC (2-Methacryloxylethyl Phosphoryl Choline) 처리된 비접착성 배양 접시 (Nunc) 를 사용하여 부유 배양을 실시한 점 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 분화 유도 공정을 실시하였다.
그 결과, 분화 유도 공정에서의 배지 교환 중에 거의 모든 색소 세포가 손실되어, Day 47 에는 색소 세포를 회수할 수 없었다.
비교예 2
실시예 1 의 분화 유도 공정에 있어서, 라미닌 511E8 로 코팅된 배양 접시 대신에, 폴리 D 리신 및 젤라틴으로 코팅한 배양 접시를 사용하여 접착 배양을 실시한 점 이외에는, 실시예 1 과 동일한 방법으로 분화 유도를 실시하였다.
라미닌 511E8 코팅 배양 접시와 비교하여, 폴리 D 리신/젤라틴 코팅 배양 접시에 대한 세포의 접착성은 약하여, 배지 교환 중에 세포가 손실되기 쉬웠다. 그 때문에, 배양 개시 후 Day 47 의 색소 세포의 비율은, 배양 접시 중의 전체 세포에 대한 색소 세포수를 육안 관찰한 결과, 실시예 1 의 1/20 이하로, 분화 유도 효율도 현저하게 낮았다.
(평가 1) RPE 세포 마커의 발현
실시예 1 ∼ 3 에서 얻어진 색소 세포에 대해서, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122 3169-79 에 기재된 방법에 따라서, 이하에 나타내는 배열의 프라이머를 사용하여 RT-PCR 해석을 실시한 결과, 시판되는 인간 RPE 세포주와 마찬가지로, RPE 세포 특이적 유전자 (RPE65, CRALBP, MERTK, BEST1) 의 발현이 보여, RPE 세포인 것이 확인되었다.
RPE65-F TCC CCA ATA CAA CTG CCA CT (배열 번호 1)
RPE65-R CCT TGG CAT TCA GAA TCA GG (배열 번호 2)
CRALBP-F GAG GGT GCA AGA GAA GGA CA (배열 번호 3)
CRALBP-R TGC AGA AGC CAT TGA TTT GA (배열 번호 4)
MERTK-F TCC TTG GCC ATC AGA AAA AG (배열 번호 5)
MERTK-R CAT TTG GGT GGC TGA AGT CT (배열 번호 6)
BEST1-F TAG AAC CAT CAG CGC CGT C (배열 번호 7)
BEST1-R TGA GTG TAG TGT GTA TGT TGG (배열 번호 8)
또 본 실시예를 다른 라인 (201B7) 의 iPS 세포로 실시해도, 동일한 결과가 얻어졌다. 대표적인 예로서, RPE65 로 실시한 결과를 도 2 에 나타낸다.
(평가 2) 사이토카인 분비능
실시예 1 ∼ 3 에서 얻어진 색소 세포에 대해서, IOVS. 2006 47 612-3624 에 기재된 방법에 준하여 ELISA 에 의해 PEDF 의 생성량을 검출하였다. 그 결과, 성인 망막의 RPE 세포와 마찬가지로 사이토카인 분비능이 있음이 확인되었다 (표 2).
또 본 실시예를 다른 라인 (201B7) 의 iPS 세포로 실시해도, 동일한 결과가 얻어졌다.
(평가 3) 탐식능
실시예 1 ∼ 3 에서 얻어진 색소 세포에 대해서, J Cell Sci. 1993 104 37-49 에 기재된 방법에 준하여, FluoSpheres (등록상표) 형광 마이크로스피어 (Invitrogen, F13081) 를 사용해서 탐식능을 해석한 결과, 시판되는 인간 RPE 세포주와 같은 정도의 탐식능이 있음이 확인되었다. 또 본 평가를 다른 라인 (201B7) 의 iPS 세포로 실시해도 동일한 결과가 얻어졌다. 또한 다른 라인 (201B7) 의 iPS 세포를 사용하여, The Lancet 2012 379 713-720 에 기재된 방법에 준하여 pHrod Green E. coli BioParticles (등록상표) Conjugate for Phagocytosisb (Molecular Probes, P35366) 를 사용해서 탐식능을 해석하여도, 동일한 결과가 얻어졌다.
비교예 3
실시예 2 와 동일하게 인간 피부 (섬유아 세포) 유래 iPS 세포 (201B7, 쿄토 대학 제공) 를 사용하고, 이하 1) ∼ 3) 중 어느 것으로 코팅된 배양 접시를 사용하여 실시예 1 과 동일한 방법으로 분화 유도를 실시하였다. 3 개의 기재를 동시에 분화 유도를 시킨 시험을 2 회 실시하여, 기재마다 따로 따로 추시를 한번 실시하였다.
1) 라미닌 511E8 (분자량 150,000) (iMatrix511 : 닛피사 제조 NIP-8920-02) 0.5 ㎍/㎠ 가 되도록 코팅을 시켰다.
2) 인간 재조합 라미닌 511 전장 (분자량 776,000) (판매 : 베리타스 (제조 : BioLamina)/BLA-LN511) 을 2.59 ㎍/㎠ 가 되도록 코팅을 시켰다.
3) 매트리겔 (BD 사 제조 354230 (총 단백 농도 : 9-12 mg/㎖)) (기저막 매트릭스, 마우스 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 육종 유래의 가용성 기저막 조제품. 기저막의 주요 분자, Ⅳ 형 콜라겐, 니도겐, 퍼레칸, 라미닌 111 을 포함한다) 을 사용하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 용해하고, 식힌 상태인 채로, 10 ㎖/57 ㎠ (0.175 ㎖/㎠) 가 되도록 배양 용기를 코팅시켰다.
분화 유도 개시 후 1 일째, 2 일째, 3 일째의 세포 접착의 모습을 도 3 에 나타낸다. 라미닌 511E8 코팅 기재의 경우, 파종 다음날부터 디쉬 전체면에 고르게 세포가 접착·증식되고, 빠르게 분화 유도 과정에 들어갔다. 매트리겔 (라미닌 111) 코팅 기재의 경우, 세포의 접착에 불균일함이 있어, 일부는 겔내에 침식되고, 마지막까지 전면층이 되지 않았다. 라미닌 전장 코팅 기재의 경우, 접착이 약하여 파종 다음날에는 세포가 일부 콜로니상으로 되어 있었다. 증식하여 디쉬 전체면으로 퍼지기 위해서는 4 ∼ 5 일을 필요로 하였다. 그 때문에 분화 유도 과정이 고르지 않게 되어 결과적으로 분화 유도가 진행되지 않은 부분이 인정되었다.
또한, 분화 유도 개시 후 15 일째 및 세포의 여과 분리 공정을 실시하기 전 (40 일경) 의 세포 집단의 모습을 도 4 에 나타낸다. 라미닌 511E8 코팅 기재의 경우, 15 일경, 전체면에 세포가 깔려 채워진 위에, 두껍게 중층 (重層) 세포가 쌓이고, 멜라닌 정색이 인정되었다. 40 일경에는, 세포가 두껍고 균일하게 중층되어 있고, 기저부의 파열이나 박리는 없었다. 중층의 상부에 확실한 멜라닌 함유 세포 덩어리가 인정되었다. 매트리겔 코팅 기재의 경우, 15 일경, 접착 세포의 균일층은 인정되지 않고, 세포는 겔 안으로 끌려 들어가 있었다. 40 일경에는, 명확하게 기저측에 한층의 세포막이 형성되지 않고, 멜라닌 정색도 없었다. 라미닌 전장 코팅 기재의 경우, 15 일경, 전체면에 접착 세포가 인정되었지만, 분화 유도가 진행되어 있지 않은 부분이 많이 인정되고, 다른 로트에서는 접착면층에 파열이나 박리가 보인 케이스도 있었다. 또한 상부의 중층 세포가 빈약하고 멜라닌 정색은 매우 약하였다. 중층되어 있던 세포는 20 일경부터 서서히 탈락되어, 40 일경에는, 기저측의 세포막의 파열이 현저화되었다.
이상의 사실로부터, 매트리겔 코팅 기재의 경우, 모두 생육 부전 및 분화 유도 부전이 인정되고, 라미닌 전장 코팅 기재의 경우, 모두 접착 세포수의 감소, 중층 세포수의 취약이 현저화되어, 멜라닌 정색에 의해 나타내는 RPE 세포의 출현 효율, 그 분화 유도 속도 모두 현저하게 낮고, 최종적으로 얻어지는 RPE 세포의 수율은 낮았다. 따라서, 본 발명의 라미닌 E8 프래그먼트로 코팅된 배양 기재에 의해, 망막 색소 상피 세포를 매우 효율적으로 제조할 수 있음이 분명해졌다.
산업상 이용가능성
본 발명의 제조법에 의하면, 라미닌 E8 프래그먼트로 코팅된 배양 기재에 의해, 망막 색소 상피 세포를 간이한 방법으로 효율적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 제조법은, 분화 유도 효율이 우수하고, 간이한 조작으로 망막 색소 상피 세포를 순화할 수 있으며, 나아가 공정 중의 세포 손실을 억제하여 높은 수량으로 망막 색소 상피 세포를 생성할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 망막 색소 상피 세포는 망막 질환의 치료뿐만 아니라, 건강한 정상 및 질환 모델 세포로서도 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허출원 제2013-212345호 (출원일 : 2013년 10월 9일) 를 기초로 하고 있고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Healios K.K.
RIKEN
OSAKA UNIVERSITY
<120> METHOD OF PRODUCING RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELL
<130> 092247
<150> JP 2013-212345
<151> 2013-10-09
<160> 8
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1
tccccaatac aactgccact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2
ccttggcatt cagaatcagg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 3
gagggtgcaa gagaaggaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 4
tgcagaagcc attgatttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 5
tccttggcca tcagaaaaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 6
catttgggtg gctgaagtct 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 7
tagaaccatc agcgccgtc 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 8
tgagtgtagt gtgtatgttg g 21
Claims (9)
- 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서,
라미닌 E8 프래그먼트가 라미닌 511E8 프래그먼트인, 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
접착 배양하는 공정이 분화 유도 인자의 존재하에서 실시되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 다능성 줄기 세포가 인간 iPS 세포인, 방법. - 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양함으로써 제조되는, 망막 색소 상피 세포.
- 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 인간 다능성 줄기 세포를 접착 배양함으로써 제조되는, 망막 색소 상피 세포 시트.
- 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 증폭 방법.
- 라미닌 E8 프래그먼트가 코팅된 배양 기재 상에서 망막 색소 상피 세포를 접착 배양하는 공정을 포함하는, 망막 색소 상피 세포의 순화 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 망막 색소 상피 세포, 또는 제 7 항에 기재된 방법에 의해 배양되는 망막 색소 상피 세포를 포함하는, 망막 질환 치료약.
Applications Claiming Priority (3)
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