WO2023149566A1 - 多能性幹細胞の分化誘導制御剤および分化誘導安定化剤 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Definitions
- the present invention relates to an agent for controlling differentiation induction of pluripotent stem cells and an agent for stabilizing differentiation induction of pluripotent stem cells.
- pluripotent stem cells may be used as a cell source.
- this cell production (differentiation induction) process it is necessary to induce differentiation of pluripotent stem cells into target cells as uniformly as possible, mature them, and maintain the target differentiation state.
- non-target cells may be generated.
- the speed of differentiation induction may differ between individual cells, and it may not be possible to obtain uniformly differentiated cells.
- the quality of the obtained cells may differ depending on the procedure.
- Patent Documents 1 and 2 By the way, in the process of inducing the differentiation of pluripotent stem cells, there are attempts to increase the production of specific target differentiated cells or to improve the efficiency of differentiation induction using E-cadherin inhibitors (Patent Documents 1 and 2). .
- Patent Document 1 discloses a method for increasing the production of human embryonic stem (ES) cells by causing an E-cadherin inhibitor to act on them, improving the efficiency of differentiation into definitive endoderm cells using TGF ⁇ , and increasing the production of the cells.
- Patent Document 2 discloses that in a method for inducing differentiation of ES or induced pluripotent stem (iPS) cells, E-cadherin inhibitors delay differentiation into most cell lineages, but delay differentiation into neural progenitor cells. As a result, E-cadherin inhibitors contribute to the induction of differentiation into neural progenitor cells.
- ES human embryonic stem
- iPS induced pluripotent stem
- Patent Documents 3 and 4 disclose methods for removing cells deviating from an undifferentiated state that have occurred or can occur during culturing of pluripotent stem cells using hemagglutinin and its variants. Further, Patent Document 4 discloses a method of dividing cell clusters in suspension culture of iPS cells into small clusters using hemagglutinin. Furthermore, Patent Document 5 discloses a method that enables mass culture of pluripotent stem cells using hemagglutinin or a variant thereof.
- Patent Documents 1 and 2 there are no reports that E-cadherin inhibitors contribute to differentiation induction of pluripotent stem cells other than the induction of differentiation into definitive endoderm cells or neural progenitor cells as shown in Patent Documents 1 and 2.
- the inventions described in Patent Documents 3 to 5 are techniques for maintaining, expanding and culturing pluripotent stem cells, and are not techniques for induction of differentiation.
- An object of the present invention is to provide pluripotent stem cells that can provide any desired differentiated cells from pluripotent stem cells as a uniform and homogeneous cell population by suppressing the generation of unintended cells.
- the objective is to provide means for controlling differentiation.
- Another object of the present invention is to provide a method for stably inducing the differentiation of pluripotent stem cells into target cells using the differentiation control means.
- the present inventors have so far developed a technique for removing "cells that have deviated from an undifferentiated state" generated during the culture of pluripotent stem cells, and a technique for mass production of pluripotent stem cells, "cells that maintain an undifferentiated state”. has been involved in the development of technology for cultivating
- the technology is based on the mechanism that hemagglutinin, which is an inhibitor of E-cadherin, a cell adhesion molecule, specifically binds to E-cadherin to inhibit intercellular adhesion, thereby alleviating intercellular adhesion. (WO2014/104207, WO2015/199243 and WO2018/117110). It is thought that the relaxation of cell-to-cell adhesion makes the culture environment of each cell in the colony of pluripotent stem cells uniform and homogenous, which makes it difficult for deviating cells to occur and facilitates cell proliferation.
- the present inventors have developed the above-described findings regarding the maintenance of an undifferentiated state of pluripotent stem cells, and have found that in inducing differentiation from pluripotent stem cells to cells of interest in vitro, when a conventional differentiation induction method is used, cells
- the reason why pluripotent stem cells grow and differentiate in different states, resulting in the generation of unintended cells is that during the process of pluripotent stem cell proliferation and formation of clumps (colonies), cell-to-cell adhesion depends on the position within the clumps. I thought it might be because the degree is different.
- the cells are not so crowded and the cell-cell adhesion is not strong, but inside the colonies and clumps, the cells are crowded and the cells adhere strongly to each other.
- the differentiation-inducing environment of the pluripotent stem cells that make up the colonies and aggregates is different, so we hypothesized that cells deviating from the desired differentiation state are generated.
- the present inventors added hemagglutinin, which can inhibit E-cadherin, a protein that controls intercellular adhesion, to the differentiation-inducing system of pluripotent stem cells, thereby equalizing the intercellular adhesion force in aggregates. tried to As a result, surprisingly, by changing the concentration of hemagglutinin, it is possible to control the direction of differentiation induction from pluripotent stem cells to any of the three germ layer lineages. It was found that it is possible to direct the differentiation of Furthermore, it was found that administration of hemagglutinin can improve differentiation induction efficiency.
- the present invention is as follows.
- (Section 1) An agent for directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells, containing an E-cadherin inhibitor.
- (Section 2) Item 2.
- the agent according to item 1, wherein the pluripotent stem cells are embryonic stem (ES) cells or induced pluripotent stem (iPS) cells.
- (Section 3) Item 3.
- the agent according to Item 1 or 2 wherein the directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells is a change in differentiation efficiency from pluripotent stem cells to any of the three germ layer lineages.
- (Section 5) Item 5.
- (Section 6) A method for controlling the direction of differentiation induction of pluripotent stem cells, comprising the step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing an E-cadherin inhibitor.
- (Section 8) Item 8.
- the agent according to Item 11, wherein the stabilization of induction of differentiation of pluripotent stem cells is improvement in efficiency of differentiation from pluripotent stem cells to any of the three germ layer lineages.
- Item 13 Item 12.
- the agent according to Item 11, wherein the stabilization of induction of differentiation of pluripotent stem cells is the reduction or removal of cells deviating from the intended differentiated cells.
- Item 14 Item 14.
- the agent according to any one of Items 11 to 13, wherein the E-cadherin inhibitor is hemagglutinin.
- a method for producing desired differentiated cells from pluripotent stem cells comprising the following steps.
- the direction of differentiation induction of pluripotent stem cells can be controlled.
- differentiation induction from pluripotent stem cells to target cells can be stabilized. That is, according to the present invention, by changing the concentration of an E-cadherin inhibitor (preferably hemagglutinin), the environment in which cells are induced to differentiate can be changed. You can direct the induction. Then, by using an E-cadherin inhibitor (preferably, hemagglutinin), a uniform intercellular adhesion environment suitable for the target differentiated cells is constructed in the entire culture system, resulting in the differentiation induction efficiency into the target differentiated cells. can be significantly improved.
- an E-cadherin inhibitor preferably, hemagglutinin
- RPE cells retinal pigment epithelial cells
- known RPE cell differentiation induction basal medium RPE cell maintenance medium containing no hemagglutinin or containing hemagglutinin at various concentrations
- the lower part of the photo is an enlarged part of the upper part.
- Human iPS cells were cultured in a medium containing various concentrations of hemagglutinin for 24 hours, and then further cultured in a medium for inducing differentiation into each of the three germ layers.
- Results of comparing the expression levels of target germ layer marker genes It is a figure which shows. The vertical axis indicates the relative expression level of each gene, with the expression level when cultured in a hemagglutinin-free medium being set to 1.
- FIG. 4 shows the results of comparing the expression levels of cardiomyocyte marker genes when human iPS cells were cultured in a medium containing various concentrations of hemagglutinin for 24 hours and then further cultured in a cardiomyocyte differentiation-inducing medium. .
- the vertical axis indicates the relative expression level of each gene, with the expression level when cultured in a hemagglutinin-free medium being set to 1.
- * p ⁇ 0.05, ** : p ⁇ 0.1
- IQR interquartile range
- Fig. 10 shows the results of comparing the expression levels of marker genes in various cells when human iPS cells were cultured in a medium containing hemagglutinin at various concentrations for 3 days and then further cultured in a medium for inducing differentiation into hepatocytes.
- (A) shows a comparison of expression levels of pluripotency marker genes, endoderm marker genes, and liver common marker genes 3 days after initiation of hepatocyte induction (after endoderm induction treatment).
- the present invention is at least partially based on the fact that in the maintenance and expansion culture of pluripotent stem cells, cells that deviate from an undifferentiated state are generated in the colony because the intercellular adhesion force due to E-cadherin has strength and weakness in the colony.
- the susceptibility of each pluripotent stem cell to a medium environment that supports maintenance of an undifferentiated state is due to heterogeneity.
- the present inventors focused on the inhibition of cell-cell adhesion by E-cadherin inhibitors based on the findings obtained from pluripotent stem cell maintenance and expansion techniques, It is speculated that this also contributes to the “homogenization and homogenization” of the intracellular environment in the pluripotent stem cells, resulting in the qualitative and quantitative improvement of the differentiated cells obtained in the differentiation induction system of pluripotent stem cells.
- This hypothesis may explain the seemingly contradictory phenomenon that E-cadherin contributes not only to the maintenance of the undifferentiated state of pluripotent stem cells but also to the induction of differentiation into specific differentiated cells.
- the degree of inhibition of intercellular adhesion by hemagglutinin, an E-cadherin inhibitor (specifically, differences in the concentration of hemagglutinin contained in the medium, the treatment time with hemagglutinin, the timing of hemagglutinin treatment, etc.) It was also found to affect phenotypic differences in the resulting differentiated cells. It is thought that this is because the difference in the strength of cell-to-cell adhesion affects the "direction of differentiation induction" in the early stages of differentiation induction. ), it is possible to efficiently (more uniformly and homogenously) induce differentiation into any desired cells.
- Control agent of the present invention provides an agent for directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells, which contains an E-cadherin inhibitor. Hereinafter, it may be referred to as "the control agent of the present invention”.
- pluripotent stem cells are undifferentiated cells that have "self-renewal ability" that can proliferate while maintaining an undifferentiated state and "pluripotency” that can differentiate into all three germ layer lineages. Examples include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). Pluripotent stem cells also include, for example, pluripotent stem cells derived from mammals. Pluripotent stem cells derived from mammals are not particularly limited, and examples thereof include human pluripotent stem cells. Human pluripotent stem cells are not particularly limited, and examples thereof include human iPS cells and human ES cells.
- differentiation induction in “directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells” means placing pluripotent stem cells in an environment that does not support maintenance of an undifferentiated state. Not only are pluripotent stem cells placed in the presence of a differentiation-inducing agent that supports differentiation into predetermined target cells, but also substances that simply support maintenance of an undifferentiated state (e.g., bFGF, SCF, LIF, etc.) Absence is also included.
- pluripotent stem cells formation of embryoid bodies from pluripotent stem cells, differentiation from pluripotent stem cells to any of the three germ layers (differentiation from pluripotent stem cells to ectoderm, differentiation from pluripotent stem cells to mesoderm) or differentiation from pluripotent stem cells to endoderm), and differentiation from pluripotent stem cells to ectodermal cells, mesodermal cells, or endoderm cells.
- ectodermal cells are not particularly limited, and include, for example, neural cells, epidermal cells, and the like. Specific examples thereof include retinal pigment epithelial cells and the like.
- Mesodermal cells are not particularly limited, and examples include blood cells (including hematopoietic cells), vascular cells (vascular endothelial cells, etc.), cardiomyocytes (e.g., atrial myocytes, ventricular myocytes, etc.), and osteocytes. , chondrocytes, tendon cells, adipocytes, skeletal muscle cells, smooth muscle cells and the like.
- Endoderm cells are not particularly limited, and examples include digestive system cells, pancreatic cells, liver cells, respiratory system cells, thyroid cells, and the like.
- the “directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells” performed using the control agent of the present invention refers to three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm) in the differentiation induction of pluripotent stem cells. ) refers to changing the efficiency of differentiation into cells of either lineage.
- the E-cadherin inhibitor contained in the control agent of the present invention has the function of alleviating intercellular adhesion by E-cadherin. Therefore, by adding the control agent of the present invention to the culture system, it is possible to “equalize” the strength of the physical intercellular adhesion in the cell cluster, and by adjusting the amount added, “equalize” the strength. It is possible to "control" the "direction” of cell differentiation induction by adjusting the strength of intercellular adhesion.
- the cell culture environment is homogenized by homogenizing the physical adhesion between cells. This is presumed to reduce the number of cells that deviate from the intended differentiated cells when pluripotent stem cells are induced to differentiate. Furthermore, according to the studies of the present inventors, by controlling the physical intercellular adhesion force, in the initial stage of differentiation induction, "direction of differentiation induction" to one of the three germ layer lineages (herein, "differentiation It was found that it is possible to control the directional control of induction). This is because by changing the amount of the control agent of the present invention in the differentiation induction system, the intracellular environment is affected by changing the intercellular adhesion force, and the efficiency of differentiation into any of the desired three germ layer lineages changes.
- the E-cadherin inhibitory substance may be any substance capable of inhibiting intercellular adhesion by E-cadherin, such as hemagglutinin, nucleic acids capable of inhibiting expression of E-cadherin (e.g., antisense oligonucleotides, etc.), Examples thereof include antibodies against E-cadherin.
- hemagglutinin is used as E-cadherin inhibitor.
- Hemagglutinin (HA) is not particularly limited in its acquisition method or origin, as long as it can inhibit intercellular adhesion by E-cadherin.
- Clostridium botulinum can be any of A, B, C, and D types.
- Hemagglutinin refers to neurotoxin complexes (also referred to as hemagglutinin complexes) unless otherwise specified.
- the hemagglutinin may be a wild type, a variant of hemagglutinin, or a miniaturized hemagglutinin.
- hemagglutinin may be a variant of hemagglutinin to the extent that it has the effect of contributing to directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells.
- One or more embodiments of the variant include, for example, those in which one, two or three amino acid sequences of the subcomponents have at least one amino acid mutation.
- Specific examples of the variants include mutant hemagglutinin (HA) complex proteins described in WO2015/199243.
- hemagglutinin may be miniaturized hemagglutinin as long as it has the effect of contributing to directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells.
- Miniaturized hemagglutinins include, for example, HA complex proteins that retain cadherin function-inhibiting activity and lack all or part of subcomponents.
- Specific examples of miniaturized hemagglutinin include miniaturized hemagglutinin complex proteins having E-cadherin function-inhibiting activity described in WO2019/103111.
- hemagglutinin includes “variants of hemagglutinin” and “downsized hemagglutinin”.
- hemagglutinin variant and “miniaturized hemagglutinin” refer to those having the effect of contributing to directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells.
- the control agent of the present invention may further contain a differentiation-inducing agent suitable for the target differentiated cells.
- the differentiation-inducing agent may be provided as a separate reagent from the control agent of the present invention and formed into a kit together with the control agent of the present invention.
- culturing pluripotent stem cells using the control agent of the present invention it is possible to control the direction of differentiation induction of pluripotent stem cells.
- “Directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells” is as described above.
- a person skilled in the art can determine the differentiation induction efficiency to the obtained differentiated cells by appropriately determining the amount of the regulatory agent of the present invention that is suitable for the target differentiated cells and the differentiation-inducing system (differentiation-inducing agent) to be used. can be changed. For example, when hemagglutinin is used as an E-cadherin inhibitor, the hemagglutinin concentration is appropriately varied between 1 and 80 nM to test the efficiency of inducing differentiation into target cells.
- the amount of control agent of the invention can be determined.
- the amount of the control agent of the present invention used in differentiation induction varies depending on the scale, culture conditions, culture environment, etc. of the differentiation-inducing system to be applied. It's not something you can do.
- the control agent of the present invention is useful only in the sense that a person skilled in the art can change the differentiation induction efficiency by applying the control agent of the present invention to a differentiation-inducing system that he/she implements based on his/her own experience. It is something to have.
- control agent of the present invention can be used to reduce or eliminate cells that deviate from the intended differentiated cells in the differentiation-inducing system.
- the use of the control agent of the present invention homogenizes the physical intercellular adhesive force in the cell culture mass, thereby homogenizing the cell culture environment. This is presumed to reduce the number of cells that deviate from the intended differentiated cells in the differentiation-inducing system.
- “cells that deviate from the target differentiated cells” refer to cells that have been induced to become different cells from the target differentiated cells in an unspecified differentiation induction system, or intermediate cells that have not been sufficiently induced to differentiate. A cell that is mixed with a target differentiated cell.
- Such deviant cells can be identified by cell morphology and the expression of differentiation markers, and should be removed in the production of cell pharmaceuticals. has a very high value.
- Control method of the present invention also provides a method for directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells, comprising the step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing an E-cadherin inhibitor. .
- the control method of the present invention it may be referred to as "the control method of the present invention”.
- the medium used for culturing pluripotent stem cells is not particularly limited as long as it can maintain, proliferate and/or induce differentiation of pluripotent stem cells.
- the medium used for culturing pluripotent stem cells can be a medium that contains an E-cadherin inhibitor and supports maintenance of the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- Such a medium can be prepared by adding an E-cadherin inhibitor to a known pluripotent stem cell maintenance medium.
- the medium used for culturing pluripotent stem cells may be a medium that contains an E-cadherin inhibitor and does not support maintenance of the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- Such a medium is not particularly limited as long as it contains an E-cadherin inhibitor and does not support maintenance of the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- a medium containing a substance preferably hemagglutinin (especially hemagglutinin derived from Clostridium botulinum), and other components.
- the medium preferably does not contain substances (e.g., bFGF, SCF, LIF, etc.) that support the maintenance of the undifferentiated state, but if the medium as a whole does not support the maintenance of the undifferentiated state of the pluripotent stem cells, This is not the case.
- the basal medium one or a combination of a plurality of synthetic media commonly used for culturing mammalian cells can be used, such as Glasgow MEM (GMEM), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), DMEM.
- GMEM Glasgow MEM
- IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
- DMEM DMEM
- NeuroBasal medium NeuroBasal-A medium
- F12-Ham F12-Ham
- Serum derived from mammals such as bovines and humans can be used.
- a serum substitute is a low-protein substitute for serum such as FBS used in cell culture, and commercially available products include, for example, Knockout Serum Replacement (KSR) and Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco). , Glutamax (manufactured by Gibco), and N2 and B27, which are serum substitutes for nerve cell culture.
- KSR Knockout Serum Replacement
- Glutamax manufactured by Gibco
- N2 and B27 which are serum substitutes for nerve cell culture.
- the concentration of serum or serum substitute can be appropriately set, for example, in the range of 0.5 to 30% (v/v), and the concentration may be constant or may be changed stepwise.
- the concentration of the E-cadherin inhibitor is not particularly limited, from the viewpoint of reducing the number of cells deviating from the target differentiated cells in the induction of differentiation from pluripotent stem cells to any of the three germ layers, and from the viewpoint of changing the efficiency of differentiation induction. It is possible for a person skilled in the art to set it as appropriate from the point of view. For example, when hemagglutinin is used as an E-cadherin inhibitor, the hemagglutinin suitable for the differentiation induction system to be used is determined by appropriately varying the concentration of hemagglutinin between 1 and 80 nM and assaying the efficiency of differentiation induction into the target cells. Concentration can be determined.
- the concentration is not particularly limited for the same reason as above. It can be set low overall.
- the concentration is not particularly limited for the same reason as above, but the miniaturized hemagglutinin generally tends to have a lower activity in the function of relieving intercellular adhesion. Therefore, the target concentration can be set to be high as a whole.
- the medium can contain other components commonly used for culturing mammalian cells.
- the medium that contains an E-cadherin inhibitor and does not support the maintenance of the undifferentiated state of pluripotent stem cells may further contain a differentiation inducer suitable for the target differentiated cells.
- an E-cadherin inhibitor may be added to (1) the medium during expansion culture in which pluripotent stem cells are maintained in an undifferentiated state, in order to achieve uniform and homogenous induction of differentiation.
- (2) may be added to the medium in the induction of differentiation from pluripotent stem cells to specific differentiated cells of interest, or (3) contains an E-cadherin inhibitor and does not induce differentiation into specific differentiated cells It may be added to a medium (without a differentiation inducer) that does not support maintenance of an undifferentiated state.
- the cells obtained by the culturing step can be further cultured in a medium (containing a differentiation-inducing agent) for inducing differentiation into specific target differentiated cells.
- the differentiation-inducing medium may or may not contain an E-cadherin inhibitor.
- an E-cadherin inhibitor by contacting pluripotent stem cells with an E-cadherin inhibitor at an early stage of differentiation induction (for example, at a stage where differentiation into specific differentiated cells such as embryoid body formation is not induced), any three germ layers It is possible to direct the cells to this lineage, and the subsequent culture using a differentiation inducer can improve the homogeneity and homogeneity of the desired differentiated cells obtained, and also improve the yield. can. That is, the E-cadherin inhibitor can be applied to the "stabilization method of the present invention" described later from the same viewpoint.
- the E-cadherin inhibitor achieves uniform intercellular adhesion and direction of differentiation induction into the desired differentiated cells, and E-cadherin It can be appropriately set within a range in which long-term contact with the inhibitor does not adversely affect cells.
- E-cadherin inhibitor was added from day 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 days or more) can continue to be added.
- an E-cadherin inhibitor is added, for example, for several hours to several days, preferably can be cultured for 1 to several days (eg, 5, 4, 3, 2) and then further cultured in medium B, which may or may not contain an E-cadherin inhibitor.
- the adherent culture method includes, for example, a method using an adherent cell culture vessel, a method in which pluripotent stem cells are cultured while adhered to feeder cells (for example, WO2001/088100), and a culture medium coated with a laminin E8 fragment.
- a method using a material for example, WO2015/053375 is known, but it is not limited to these.
- a group of pluripotent stem cells that aggregate to form a clump is cultured in a suspended state in a culture medium (for example, WO2008/087917, Nature. 2011 Apr 7;472( 7341):51-6), but are not limited to these.
- the density of the pluripotent stem cells used for culture is not particularly limited as long as the pluripotent stem cells can be uniformly seeded and adherently cultured. It is desirable that the cell density is such that the degree of cell-to-cell adhesion is homogenized and the state of differentiation induction is appropriately controlled, and such a cell density can be set as appropriate. Other culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can also be set appropriately.
- the culture period is not particularly limited as long as the induction of differentiation of pluripotent stem cells can be controlled, but the culture period is such that the E-cadherin inhibitor maintains the uniforming effect of intercellular adhesion and the induction of differentiation can be controlled. It is desirable to have This culture period can be appropriately changed depending on the number of pluripotent stem cells used for culture, culture equipment, culture substrate, culture method, and the like.
- the culture substrate used in the adherent culture method is not particularly limited, and includes known culture substrates such as culture substrates coated with laminin E8 fragments.
- the culture may be suspension culture in addition to the adhesion culture described above.
- the number of pluripotent stem cells forming aggregates used for suspension culture is such that the degree of cell-to-cell adhesion is homogenized by administering an E-cadherin inhibitor, and the state of differentiation induction can be appropriately controlled. , and can be appropriately set depending on the target differentiated cells and the differentiation induction method to be applied. Other culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can also be set appropriately.
- the culture period is not particularly limited as long as the induction of differentiation of pluripotent stem cells can be controlled, but the culture period is such that the E-cadherin inhibitor maintains the uniforming effect of intercellular adhesion and the induction of differentiation can be controlled. It is desirable to have This culture period can be appropriately changed depending on the number of pluripotent stem cells used for culture, culture equipment, culture substrate, culture method, and the like.
- the incubator used in the suspension culture method is not particularly limited as long as it allows cells to be cultured in suspension.
- Such incubators include, for example, flasks, tissue culture flasks, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, micropores, multiplates, multiwell plates, chamber slides, tubes, Examples include trays, culture bags, roller bottles, and the like.
- the differentiation-inducing agent used in the control method of the present invention is not particularly limited, and a known differentiation-inducing agent suitable for the target differentiated cells can be used as appropriate. Examples include Nodal signal inhibitors, Wnt signal inhibitors, Sonic hedgehog signal inhibitors, Activin signal promoters, and the like, but these are illustrative and not limiting.
- Stabilizing agent of the present invention also provides an agent for stabilizing differentiation induction from pluripotent stem cells to target differentiated cells, which contains an E-cadherin inhibitor.
- the stabilizer of the present invention it may be referred to as "the stabilizer of the present invention”.
- the E-cadherin inhibitor, pluripotent stem cells, and directional control of differentiation induction of pluripotent stem cells in the stabilizing agent of the present invention refer to the contents described in "1. Regulator of the present invention" as appropriate.
- stabilizing agent of the present invention “differentiation induction” in “stabilization of differentiation induction of pluripotent stem cells” refers to the content described in "1. Regulator of the present invention”.
- stabilization of differentiation induction of pluripotent stem cells” performed using the stabilizer of the present invention means that in the above-mentioned induction of differentiation of pluripotent stem cells, the efficiency of differentiation induction into target cells is improved. and/or the ability to reproducibly induce differentiation into target cells.
- the stabilizing agent of the present invention By adding the stabilizing agent of the present invention to a culture system, the strength of physical intercellular adhesion in cell clusters is homogenized to control the direction of differentiation induction of cells, and the addition amount is adjusted. By adjusting the strength of the intercellular adhesion that has been homogenized by , it is possible to stabilize the induction of differentiation into the desired differentiated cells.
- the above-mentioned "directional control of differentiation induction" As described, it is possible to increase the efficiency of induction of differentiation into any lineage of the desired three germ layers and the reproducibility thereof.
- Those skilled in the art can appropriately determine the amount of the stabilizing agent of the present invention that is suitable for the target differentiated cells, thereby improving the efficiency of induction of differentiation into differentiated cells and the reproducibility thereof.
- the hemagglutinin concentration of the present invention suitable for the differentiation-inducing system to be used is determined by appropriately varying the concentration between 1 and 80 nM and assaying the efficiency of differentiation into target cells. can be determined.
- the amount of the stabilizing agent of the present invention used in the induction of differentiation varies depending on the scale, culture conditions, culture environment, etc. of the differentiation-inducing system to be applied.
- the stabilizing agent of the present invention is useful in the sense that a person skilled in the art can improve the differentiation induction efficiency by applying the stabilizing agent of the present invention to a differentiation-inducing system that he or she implements based on his/her own experience. It has a nature.
- the stabilizing agent of the present invention can be used to reduce or eliminate cells that deviate from the target cells in the differentiation-inducing system.
- the use of the stabilizing agent of the present invention homogenizes the physical intercellular adhesive force in the cell culture mass, thereby homogenizing the cell culture environment. This is presumed to reduce the number of cells deviating from target cells in the differentiation-inducing system.
- the “cells deviating from the target cells” are as described above.
- the present invention also provides a method for efficiently producing target differentiated cells from pluripotent stem cells, in other words, a method for stabilizing differentiation induction into target cells.
- this method may be referred to as the "stabilization method of the present invention”.
- the method includes (1) the steps of forming aggregates of pluripotent stem cells, and (2) culturing the aggregates obtained in step (1) in a medium containing an E-cadherin inhibitor, It is not particularly limited as long as it includes a step of stabilizing the induction of differentiation into the target cells.
- the stabilization method of the present invention uses pluripotent stem cells as starting cells and stabilizes the induction of differentiation into target differentiated cells. is a method of manufacturing Since pluripotent stem cells are preferably in a state where cell-to-cell adhesion exists, the induction method of the present invention includes the step of (1) forming aggregates of pluripotent stem cells.
- “Aggregate” in step (1) refers to a mass formed by aggregating cells dispersed in the medium and in a state in which the cells adhere to each other. Therefore, colonies, aggregates, cell clusters, embryoid bodies, spheres, and spheroids are also included in aggregates, and in a cell culture system, cells are in a confluent state to the extent that they adhere to each other. If it is, that state is also included. Aggregates of pluripotent stem cells are formed, for example, by bringing cells to a confluent state by an adherent culture method, or by culturing pluripotent stem cells by a suspension culture method. Such media and culture methods include those described above.
- the medium and culture method used in step (2) include those described in "2. Control method of the present invention”. That is, in the same manner as in the aspect described in "2. Control method of the present invention", the stabilization method of the present invention also uses an E-cadherin inhibitor in each step of inducing differentiation into the target differentiated cells. , can stabilize induction of differentiation into target differentiated cells.
- Target differentiated cells include, for example, ectodermal cells, mesoderm cells, and endoderm cells.
- Ectodermal cells are not particularly limited, and include, for example, nervous system cells and epidermal cells. Specific examples thereof include retinal pigment epithelial cells and the like.
- Mesodermal cells are not particularly limited, and examples include blood cells (including hematopoietic cells), vascular cells (vascular endothelial cells, etc.), cardiomyocytes (e.g., atrial myocytes, ventricular myocytes, etc.), and osteocytes. , chondrocytes, tendon cells, adipocytes, skeletal muscle cells, smooth muscle cells and the like.
- Endoderm cells are not particularly limited, and examples include digestive system cells, pancreatic cells, liver cells, respiratory system cells, thyroid cells, and the like.
- the concentration of the E-cadherin inhibitor is not particularly limited, and from the viewpoint of reducing the number of cells deviating from the target cells in the induction of differentiation from pluripotent stem cells to any of the three germ layers, the differentiation induction efficiency and its reproducibility are improved. That is, from the viewpoint of stabilizing the induction of differentiation into the desired differentiated cells, a person skilled in the art can set it as appropriate. For example, when hemagglutinin is used as an E-cadherin inhibitor, the concentration of hemagglutinin is appropriately varied between 1 and 80 nM, and the efficiency of induction of differentiation into the target cells and its variation are tested. A suitable hemagglutinin concentration can be determined.
- the concentration is not particularly limited for the same reason as above. It can be set low overall.
- the concentration is not particularly limited for the same reason as above, but the miniaturized hemagglutinin generally tends to have a lower activity in the function of relieving intercellular adhesion. Therefore, the target concentration can be set to be high as a whole.
- Example 1 Direction of differentiation induction using hemagglutinin
- a basal medium for inducing differentiation into retinal pigment epithelial cells RPE cells
- Induction of retinal pigment epithelial cells was promoted without using a differentiation-inducing agent (for example, SB431542, CKI-7, etc.) that promotes differentiation induction of retinal pigment epithelial cells.
- a differentiation-inducing agent for example, SB431542, CKI-7, etc.
- botulinum-derived hemagglutinin was added at different concentrations to observe the effect on induction of differentiation. Specific operations are as follows.
- the reagents used are as follows. ⁇ Differentiation-inducing basal medium (Glasgow's MEM (GMEM) medium (Invitrogen), KnockOut TM Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), 0.1 mM MEM non-essential amino acid solution (Invitrogen), 1 mM sodium pyruvate (SIGMA), StemSure (registered Trademark) 10 mmol/l 2-mercaptoethanol ( ⁇ 100) (Wako Pure Chemical), 100 U/ml penicillin-100 ⁇ g/ml streptomycin (Invitrogen)) ⁇ First differentiation-inducing medium (differentiation-inducing basal medium containing 20% KSR, 10 ⁇ M Y-27632 (Wako Pure Chemical), predetermined concentration of hemagglutinin (Table 1)) ⁇ Second differentiation induction medium (differentiation induction basal medium containing 15% KSR, 10 ⁇ M Y-27632 (Wako Pure Chemical), pre
- Human skin-derived iPS cells (253G1, provided by Kyoto University) were seeded on a laminin-coated culture dish (manufactured by Sumika Bakelite Co., Ltd.) at 9 ⁇ 10 6 cells/9 cm dish.
- a laminin-coated culture dish was prepared by coating a 9 cm culture dish (BD FALCON) with a 0.5 ⁇ g/cm 2 solution of laminin 511E8 fragment (protein disclosed in Example (3) of WO2011043405, provided by Osaka University) at 37° C. for 1 hour. Created by coating above. The iPS cells quickly adhered to the culture dish, and formation of floating aggregates was not confirmed.
- the first day of culture was Day 0, and the entire amount of medium was changed every day from the start of culture (Day 1) to around Day 40, when melanocytes were confirmed.
- the composition of the medium was changed stepwise as shown below. That is, Day 0 is a differentiation-inducing basal medium, Days 1-4 is a primary differentiation-inducing medium (20% KSR), Days 5-8 is a secondary differentiation-inducing medium (15% KSR), and Days 9-12 is a tertiary differentiation-inducing medium. (10% KSR), and from Day 13 to Day 40, a quaternary differentiation induction medium (10% KSR) was used. By adding different concentrations of hemagglutinin to each medium, the effect on differentiation induction was observed. Experimental conditions (Conditions 1 to 3) are shown in Table 1, and the results are shown in Table 1 and FIG.
- retinal pigment epithelial cells which are cells with a gradually darker pigment, were gradually induced from cell aggregates of pluripotent stem cells (Table 1 (condition 1), left column in FIG. 1). ).
- hepatocyte-like cells were formed at a concentration of 10 nM (Table 1 (condition 2), center column in FIG. 1), and at a concentration of 30 nM.
- muscle cells and cardiomyocytes (Table 1 (condition 3), Fig. 1 right column) were induced, respectively.
- Example 2 Examination of direct differentiation of pluripotent stem cells using hemagglutinin Next, cell aggregates of pluripotent stem cells were treated with hemagglutinin at different concentrations for 24 hours, and then treated with the STEMdiff Trilineage Differentiation Kit (STEMCELL Technologies). Co.) was used to induce differentiation into each of the three germ layers, and the differentiation ability was examined by RT-PCR. 1383D2 human iPS cells were seeded on an Elplasia round-bottom plate with an ultra-low adhesion surface (manufactured by Corning) at 200 cells/dimple, and cultured in StemFit AK02N medium containing ROCK inhibitor for 1 day.
- STEMdiff Trilineage Differentiation Kit STEMdiff Trilineage Differentiation Kit
- the cells were cultured in ROCK inhibitor-free StemFit AK02N medium for 5 days, and then cultured in StemFit AK02N medium containing varying concentrations of hemagglutinin for 24 hours. After that, they were differentiated into each germ layer using the STEMdiff Trilineage Differentiation Kit, and gene analysis was performed by RT-PCR 6 days later. The result is shown in figure 2.
- Example 3 Stabilization of cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells using hemagglutinin (1)
- Hemagglutinin treatment test before differentiation induction test of culture system suitable for mass culture
- 1383D2 human iPS cells were seeded onto Elplasia round-bottom plates with an ultra-low adhesion surface at 200 cells/dimple, and cultured in a ROCK inhibitor-containing medium for 1 day. Thereafter, the cells were cultured in ROCK inhibitor-free StemFit AK02N medium for 2 days, and then cultured in StemFit AK02N medium containing varying concentrations of hemagglutinin for 24 hours.
- the cells were cultured in a known cardiomyocyte differentiation-inducing medium for 14 days to induce differentiation into cardiomyocytes. Differentiation was performed with reference to the description of Sougawa et al., Methods Mol Biol. 2320: 23-27 (2021). Genetic analysis of cardiomyocyte markers was performed by RT-PCR 18 days after iPS cell seeding. The results are shown in Figure 3.
- cardiomyocyte differentiation induction system by introducing the hemagglutinin treatment step, cardiomyocyte populations can be efficiently obtained, and it has the effect of reducing the variation in the results from culture to culture (stabilization of cardiomyocyte differentiation induction). It was suggested that
- Example 4 Stabilization of hepatocyte differentiation of pluripotent stem cells using hemagglutinin (test of culture system suitable for mass culture) 1383D2 human iPS cells were seeded onto Elplasia round-bottom plates with an ultra-low adhesion surface at 200 cells/dimple, and cultured in a ROCK inhibitor-containing medium for 1 day. Thereafter, the cells were cultured in ROCK inhibitor-free StemFit AK02N medium for 1 day, and then cultured in hemagglutinin-containing StemFit AK02N medium with varying concentrations of 0 nM, 1 nM, 5 nM and 10 nM for 3 days.
- the effect of loosening intercellular adhesion by adding hemagglutinin has the effect of changing differentiation induction to retinal pigment epithelial cells to hepatocytes and muscle cells, and furthermore, induction of cardiomyocytes and hepatocytes It was also shown to have the effect of stabilizing the process and efficiently obtaining cardiomyocytes and hepatocytes. From this, when pluripotent stem cells are induced to differentiate into target cells under arbitrary differentiation conditions, it is possible to efficiently induce differentiation into target cells by adding hemagglutinin at an appropriate concentration. can be done.
- compositions according to the present disclosure are useful, for example, in the field of regenerative medicine.
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Abstract
本発明は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤を提供する。
Description
本発明は、多能性幹細胞の分化誘導の制御剤、および多能性幹細胞の分化誘導安定化剤に関する。
再生医療を含む幹細胞産業では、目的とする分化細胞を大量かつ均一および均質に生体外で生産する必要がある。この際の細胞ソースとして多能性幹細胞を用いる場合がある。この細胞生産（分化誘導）プロセスにおいて、多能性幹細胞を目的の細胞に出来る限り均一に分化誘導し、成熟させ、目的とする分化状態を維持することが必要である。
しかしながら、生体外で多能性幹細胞から目的の細胞への分化を誘導する過程で目的外の細胞が生じることがある。また、分化誘導のスピードにも個々の細胞で違いが生じることがあり、均一な分化細胞が得られない場合がある。さらに、同じ条件で分化誘導を行ったとしても、手技ごとに得られる細胞の質に違いが生じることがある。
このように生体外で多能性幹細胞から目的の細胞への分化を誘導しようとする場合、均一および均質な分化細胞集団を得ることは非常に困難な場合がある。分化誘導の手法やその誘導効率を上げる方法は多々報告されているものの、均一な細胞集団を得るための普遍的な方法としては未だ有用なものはなく、このことが均一および良質な細胞医薬品を製造するうえで大きな障害となっている。
ところで、多能性幹細胞の分化誘導プロセスにおいて、Ｅカドヘリン阻害物質を用いてある特定の目的とする分化細胞の産生量を増やす、あるいは分化誘導効率を向上させる試みがある（特許文献１および２）。
特許文献１は、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞にＥカドヘリン阻害物質を作用させ、ＴＧＦβを用いて胚体内胚葉細胞への分化効率を向上させ、当該細胞の産生量を増やす方法を開示する。また特許文献２は、ＥＳまたは人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の分化誘導方法において、Ｅカドヘリン阻害物質は大部分の細胞系列への分化を遅延させるが、神経前駆細胞への分化は遅延させず、結果としてＥカドヘリン阻害物質が神経前駆細胞への分化誘導に寄与することを開示する。
一方、本発明者らは、多能性幹細胞の維持培養プロセスにおいて、Ｅカドヘリン阻害物質であるヘマグルチニンまたはその改変体を用いて未分化状態を維持し、多能性幹細胞の大量培養を可能にしたことを報告している(特許文献３～５)。
特許文献３および４は、ヘマグルチニンおよびその改変体を用いて、多能性幹細胞の培養中に発生した、または発生し得る未分化状態を逸脱した細胞を除去する方法を開示する。また特許文献４は、ヘマグルチニンを用いてｉＰＳ細胞の浮遊培養における細胞集塊を小塊に分割する方法を開示する。さらに特許文献５は、ヘマグルチニンまたはその改変体を用いて、多能性幹細胞の大量培養を可能とする方法を開示する。
しかしながら、特許文献１または２に示されるような胚体内胚葉細胞または神経前駆細胞への分化誘導以外にＥカドヘリン阻害物質が多能性幹細胞の分化誘導に寄与するという報告はない。また特許文献３～５に記載された発明は、多能性幹細胞の維持増幅培養に関する技術であり、分化誘導に関する技術ではない。
本発明の課題は、多能性幹細胞から任意の目的とする分化細胞を、目的外の細胞の発生を抑制して均一かつ均質な細胞集団として提供することを可能とする、多能性幹細胞の分化制御手段を提供することにある。また、本発明の課題は、当該分化制御手段を用いて、多能性幹細胞から目的の細胞への分化を安定的に誘導する方法を提供することにある。
本発明者らは、これまで、多能性幹細胞の培養中に発生する「未分化状態から逸脱した細胞」を取り除く技術や、多能性幹細胞の大量製造を目指し「未分化状態を維持した細胞」を培養する技術の開発に携わってきた。当該技術は、細胞接着分子であるＥカドヘリンの阻害物質であるヘマグルチニンがＥカドヘリンに特異的に結合することで細胞間接着を阻害し、そのために細胞間接着を緩和するというメカニズムに依るものであると推測している（ＷＯ２０１４／１０４２０７、ＷＯ２０１５／１９９２４３およびＷＯ２０１８／１１７１１０）。細胞間接着の緩和により、多能性幹細胞のコロニー内の各細胞の培養環境が均一および均質化され、逸脱細胞が発生しにくい環境、細胞増殖がしやすい環境となり得ると考えられる。
本発明者らは、多能性幹細胞の未分化状態維持に関する上記知見を発展させ、生体外における多能性幹細胞から目的の細胞への分化誘導において、従来の分化誘導方法を用いた場合、細胞の育ちや分化状態のばらつきが生じ、結果として目的外の細胞が生じ得る理由は、多能性幹細胞が増殖し凝集塊（コロニー）を形成する過程で、凝集塊内の位置によって細胞間接着の程度が異なるためではないかと考えた。より具体的には、コロニーや凝集塊の辺縁部では、細胞はそれほど込み入っておらず細胞間接着も強くないが、コロニーや凝集塊の内部では細胞が込み入っており細胞同士が強固に接着しており、それらの結果としてコロニーや凝集塊を構成する多能性幹細胞の分化誘導環境が異なる状態となるために、目的とする分化状態から逸脱した細胞が生じるという仮説を立てた。
そこで、本発明者らは、細胞間接着をつかさどるタンパク質であるＥカドヘリンを阻害することができるヘマグルチニンを、多能性幹細胞の分化誘導系に加えることにより、凝集塊中の細胞間接着力を均一化することを試みた。その結果、驚くべきことに、ヘマグルチニン濃度を変化させることによって、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化誘導の方向性を制御できること、即ち、目的とする三胚葉いずれかの系統への分化の方向付けができることが分かった。さらにヘマグルチニンを投与することで分化誘導効率を向上させられることが分かった。これらの結果は、Ｅカドヘリン阻害が単に凝集塊中の細胞間接着力を均一化するのみならず、その阻害活性に応じて細胞間接着力を変化させることにより、多能性幹細胞の細胞内環境の質的変化をもたらし、分化誘導の方向性を変化させ得ることを強く示唆するものである。
本発明者らはこれらの知見に基づき、さらに鋭意研究を進めることで本発明を完成させた。
本発明者らはこれらの知見に基づき、さらに鋭意研究を進めることで本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（項１）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤。
（項２）
多能性幹細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項１に記載の剤。
（項３）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、項１または２に記載の剤。
（項４）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、項１または２に記載の剤。
（項５）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１～４のいずれか１項に記載の剤。
（項６）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導の方向性を制御する方法。
（項７）
培養が分化誘導剤の存在下で行われる、項６に記載の方法。
（項８）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程において、該阻害物質の濃度を調整することを特徴とする、項６または７に記載の方法。
（項９）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、項６～８のいずれか１項に記載の方法。
（項１０）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項６～９のいずれか１項に記載の方法。
（項１１）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導を安定化させるための剤。
（項１２）
多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の向上である、項１１に記載の剤。
（項１３）
多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、項１１に記載の剤。
（項１４）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１１～１３のいずれか１項に記載の剤。
（項１５）
以下の工程を含む、多能性幹細胞から目的とする分化細胞を製造する方法。
（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、および
（２）工程（１）で得られた凝集体を、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で培養することにより、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させる工程
（項１６）
培養が分化誘導剤の存在下で行われる、項１５に記載の方法。
（項１７）
多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、項１５または１６に記載の方法。
（項１８）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
（項１）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤。
（項２）
多能性幹細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項１に記載の剤。
（項３）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、項１または２に記載の剤。
（項４）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、項１または２に記載の剤。
（項５）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１～４のいずれか１項に記載の剤。
（項６）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導の方向性を制御する方法。
（項７）
培養が分化誘導剤の存在下で行われる、項６に記載の方法。
（項８）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程において、該阻害物質の濃度を調整することを特徴とする、項６または７に記載の方法。
（項９）
多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、項６～８のいずれか１項に記載の方法。
（項１０）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項６～９のいずれか１項に記載の方法。
（項１１）
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導を安定化させるための剤。
（項１２）
多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の向上である、項１１に記載の剤。
（項１３）
多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、項１１に記載の剤。
（項１４）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１１～１３のいずれか１項に記載の剤。
（項１５）
以下の工程を含む、多能性幹細胞から目的とする分化細胞を製造する方法。
（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、および
（２）工程（１）で得られた凝集体を、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で培養することにより、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させる工程
（項１６）
培養が分化誘導剤の存在下で行われる、項１５に記載の方法。
（項１７）
多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、項１５または１６に記載の方法。
（項１８）
Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
本発明によれば、多能性幹細胞の分化誘導の方向性を制御することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞から目的の細胞への分化誘導を安定化することができる。即ち、本発明によれば、Ｅカドヘリン阻害物質（好ましくは、ヘマグルチニン）の濃度を変化させることにより、細胞の分化誘導における環境を変化させることができ、結果として、三胚葉いずれの細胞にも分化誘導を方向づけることができる。そして、Ｅカドヘリン阻害物質（好ましくは、ヘマグルチニン）を用いることで目的とする分化細胞に適しかつ培養系全体において均一な細胞間接着環境を構築することによって、目的とする分化細胞への分化誘導効率を顕著に向上させることが可能となる。
本発明は、少なくとも部分的には、多能性幹細胞の維持増幅培養において、コロニー内に未分化状態から逸脱した細胞が生じるのは、Ｅカドヘリンによる細胞間接着力にコロニー内で強弱があり、その結果、未分化状態の維持を支持する培地環境に対する各多能性幹細胞の感受性が不均一化することによるとの、本発明者らの従前の研究成果を基礎としている。即ち、本発明者らは、多能性幹細胞の維持増幅技術で得られた知見に基づき、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着の阻害に注目し、該阻害が、多能性幹細胞の分化誘導時における細胞内環境の「均一化および均質化」にも寄与し、その結果、多能性幹細胞の分化誘導系においても、得られる分化細胞の質的および量的な向上をもたらすと推測した。この仮説は、Ｅカドヘリンが多能性幹細胞の未分化状態維持だけでなく、ある特定の分化細胞への分化誘導にも寄与するという一見矛盾する事象を説明し得るかもしれない。
さらに驚くべきことに、Ｅカドヘリン阻害物質であるヘマグルチニンによる細胞間接着の阻害の程度（具体的には、培地に含まれるヘマグルチニンの濃度、ヘマグルチニンによる処理時間、ヘマグルチニン処理のタイミング等の違い）が、結果として得られる分化細胞の表現型の違いに影響を及ぼすことも明らかとなった。これは細胞間接着の強さの違いが、分化誘導の初期段階における「分化誘導の方向付け」に影響を及ぼすためであると考えられるが、Ｅカドヘリンの阻害活性（Ｅカドヘリン阻害物質の添加濃度）を適宜変更することにより、任意の目的とする細胞へと効率よく（より均一かつ均質に）分化誘導することができることを示している。
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
１．本発明の制御剤
本発明は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤を提供する。以下、「本発明の制御剤」と称する場合がある。
本発明は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤を提供する。以下、「本発明の制御剤」と称する場合がある。
［多能性幹細胞］
本明細書において、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に限定されず、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、多能性幹細胞としては、例えば、哺乳動物に由来する多能性幹細胞が挙げられる。哺乳動物に由来する多能性幹細胞は特に限定されず、例えば、ヒ卜多能性幹細胞が挙げられる。ヒ卜多能性幹細胞は特に限定されず、例えば、ヒ卜ｉＰＳ細胞またはヒ卜ＥＳ細胞が挙げられる。
本明細書において、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に限定されず、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が挙げられる。また、多能性幹細胞としては、例えば、哺乳動物に由来する多能性幹細胞が挙げられる。哺乳動物に由来する多能性幹細胞は特に限定されず、例えば、ヒ卜多能性幹細胞が挙げられる。ヒ卜多能性幹細胞は特に限定されず、例えば、ヒ卜ｉＰＳ細胞またはヒ卜ＥＳ細胞が挙げられる。
本発明の制御剤において、「多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御」における「分化誘導」とは、多能性幹細胞を未分化状態の維持を支持しない環境下におくことを意味し、多能性幹細胞を所定の目的とする細胞への分化を支持する分化誘導剤の存在下におくだけでなく、単に未分化状態の維持を支持する物質（例えば、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＬＩＦなど）の非存在下におくことも包含される。具体的には、例えば、多能性幹細胞から胚様体の形成、多能性幹細胞から三胚葉いずれかへの分化（多能性幹細胞から外胚葉への分化、多能性幹細胞から中胚葉への分化、または多能性幹細胞から内胚葉への分化）、および多能性幹細胞から外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞への分化等が挙げられる。
ここで、外胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、神経系細胞、表皮系細胞等が挙げられる。具体的には、例えば、網膜色素上皮細胞等が挙げられる。
中胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、血球系細胞（造血系細胞を含む）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
内胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、消化器系細胞、膵細胞、肝細胞、呼吸器系細胞、甲状腺細胞等が挙げられる。
本発明の制御剤を用いて実施される、「多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御」とは、上記した多能性幹細胞の分化誘導において、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）いずれかの系統の細胞への分化効率を変化させることをいう。後述するように、本発明の制御剤に含まれるＥカドヘリン阻害物質はＥカドヘリンによる細胞間接着を緩和させる機能を有する。そのため、本発明の制御剤を培養系に添加することによって細胞集塊における物理的な細胞間接着の強度を「均一化」することができ、またその添加量を調節することによって「均一化」された細胞間接着の強度を調整することで、細胞の分化誘導の「方向性」を「制御する」ことができる。
物理的な細胞間接着力が均一化されることにより、細胞の培養環境が均一化される。このことによって、多能性幹細胞を分化誘導した場合に、目的とする分化細胞から逸脱する細胞を減少させることができると推測される。さらに本発明者らの研究により、物理的な細胞間接着力を制御することによって、分化誘導の初期段階における、三胚葉いずれかの系統への「分化誘導の方向付け」（本明細書において「分化誘導の方向性制御」という場合もある）ができることが分かった。これは、分化誘導系における本発明の制御剤の量を変えることにより細胞間接着力が変化することで細胞内環境が影響をうけ、目的とする三胚葉いずれかの系統への分化効率が変化するためであると推測される。当業者は、目的とする分化細胞に適した本発明の制御剤の量、本発明の制御剤の処理時間、本発明の制御剤の添加タイミング等を適宜決定することにより、得られる分化細胞への分化誘導効率を変化させることができる。
［Ｅカドヘリン阻害物質］
本明細書において、Ｅカドヘリン阻害物質は、Ｅカドヘリンによる細胞間接着を阻害可能な物質であればよく、例えば、ヘマグルチニン、Ｅカドヘリンの発現を阻害し得る核酸（例：アンチセンスオリゴヌクレオチド等）、Ｅカドヘリンに対する抗体等が挙げられる。好ましくは、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンが用いられる。
本明細書において、Ｅカドヘリン阻害物質は、Ｅカドヘリンによる細胞間接着を阻害可能な物質であればよく、例えば、ヘマグルチニン、Ｅカドヘリンの発現を阻害し得る核酸（例：アンチセンスオリゴヌクレオチド等）、Ｅカドヘリンに対する抗体等が挙げられる。好ましくは、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンが用いられる。
［ヘマグルチニン（ＨＡ）］
本明細書において、ヘマグルチニンは、Ｅカドヘリンによる細胞間接着を阻害し得る限り、その取得方法や由来等については、特に限定されないが、例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその類縁菌由来のヘマグルチニンが挙げられる。ボツリヌス菌は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型のいずれであってもよい。ヘマグルチニンは、特に言及がない場合、神経毒素複合体（ヘマグルチニン複合体ともいう）をいう。
本明細書において、ヘマグルチニンは、Ｅカドヘリンによる細胞間接着を阻害し得る限り、その取得方法や由来等については、特に限定されないが、例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）またはその類縁菌由来のヘマグルチニンが挙げられる。ボツリヌス菌は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型のいずれであってもよい。ヘマグルチニンは、特に言及がない場合、神経毒素複合体（ヘマグルチニン複合体ともいう）をいう。
ヘマグルチニンは、野生型であってもよく、ヘマグルチニンの改変体であってもよく、小型化されたヘマグルチニンであってもよい。
［ヘマグルチニンの改変体］
本明細書において、ヘマグルチニンは、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御に寄与する効果を有する範囲で、ヘマグルチニンの改変体であってもよい。該改変体の一または複数の実施形態として、例えば、サブコンポーネントの１つ、２つまたは３つのアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するものが挙げられる。該改変体の具体例としては、ＷＯ２０１５／１９９２４３に記載の変異型ヘマグルチニン（ＨＡ）複合体タンパク質等が挙げられる。
本明細書において、ヘマグルチニンは、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御に寄与する効果を有する範囲で、ヘマグルチニンの改変体であってもよい。該改変体の一または複数の実施形態として、例えば、サブコンポーネントの１つ、２つまたは３つのアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するものが挙げられる。該改変体の具体例としては、ＷＯ２０１５／１９９２４３に記載の変異型ヘマグルチニン（ＨＡ）複合体タンパク質等が挙げられる。
［小型化されたヘマグルチニン］
また、本明細書において、ヘマグルチニンは、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御に寄与する効果を有する範囲で、小型化されたヘマグルチニンであってもよい。小型化されたヘマグルチニンとしては、例えば、カドヘリン機能阻害活性を保持し、かつサブコンポーネントの全部または一部を欠失したＨＡ複合体タンパク質等が挙げられる。小型化されたヘマグルチニンの具体例としては、ＷＯ２０１９／１０３１１１に記載のＥ－カドヘリンの機能阻害活性を有する小型化されたヘマグルチニン複合体タンパク質等が挙げられる。
また、本明細書において、ヘマグルチニンは、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御に寄与する効果を有する範囲で、小型化されたヘマグルチニンであってもよい。小型化されたヘマグルチニンとしては、例えば、カドヘリン機能阻害活性を保持し、かつサブコンポーネントの全部または一部を欠失したＨＡ複合体タンパク質等が挙げられる。小型化されたヘマグルチニンの具体例としては、ＷＯ２０１９／１０３１１１に記載のＥ－カドヘリンの機能阻害活性を有する小型化されたヘマグルチニン複合体タンパク質等が挙げられる。
本明細書において、特に言及のない場合、「ヘマグルチニン」は、「ヘマグルチニンの改変体」および「小型化されたヘマグルチニン」を含む。また、本明細書において、特に言及のない場合、「ヘマグルチニンの改変体」および「小型化されたヘマグルチニン」は、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御に寄与する効果を有するものをいう。
本発明の制御剤は、さらに目的とする分化細胞に適した分化誘導剤等を含有してもよい。あるいは、分化誘導剤は、本発明の制御剤と別個の試薬として提供され、本発明の制御剤とともにキット化されていてもよい。目的とする分化細胞に適した分化誘導剤を用いた分化誘導系において本発明の制御剤を使用することで、得られる分化細胞への分化誘導効率を変化、好ましくは向上させることができる。
本発明の制御剤を用いて多能性幹細胞の培養を行うことにより、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が可能となる。「多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御」とは、前述のとおりである。そして当業者であれば、目的とする分化細胞と、用いる分化誘導系（分化誘導剤）に適した本発明の制御剤の量を適宜決定することにより、得られる分化細胞への分化誘導効率を変化させることができる。例えば、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンを用いる場合、ヘマグルチニン濃度として１～８０ｎＭの間で適宜濃度を振って目的とする細胞への分化誘導効率を検定することにより、使用する分化誘導系に適した本発明の制御剤の量を決定することができる。分化誘導において用いられる本発明の制御剤の量は、適用する分化誘導系の規模・培養条件・培養環境等によって異なるものであり、本発明の制御剤をこの範囲で使用するとこの細胞系に誘導することができるという類のものではない。あくまでも当業者が自らの経験のもと本発明の制御剤を自らが実施する分化誘導系に適用することでその分化誘導効率を変化させることができる意味で、本発明の制御剤は有用性を持つものである。
さらに本発明の制御剤を用いて、分化誘導系における目的とする分化細胞から逸脱する細胞を減少、もしくは除去することができる。本発明の制御剤を用いることで細胞培養塊における物理的な細胞間接着力が均一化されることにより、細胞の培養環境が均一化される。このことによって、分化誘導系において目的とする分化細胞から逸脱する細胞を減少させることができると推測される。なお、「目的とする分化細胞から逸脱する細胞」とは、特定されないある分化誘導系において、目的の分化細胞とは異なる細胞に誘導されてしまった細胞、あるいは分化誘導が十分にされなかった中間細胞であって、目的の分化細胞に混在しているものをいう。このような逸脱細胞は細胞の形態や分化マーカーの発現により確認することができるが、細胞医薬品の製造において除去されるべき細胞であり、このような逸脱細胞を分化誘導段階で除くことができる技術は極めて高い価値を有する。
多能性幹細胞の培養は、後述の「２．本発明の制御方法」に記載の内容を援用するものとする。
２．本発明の制御方法
本発明は、また、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための方法を提供する。以下、「本発明の制御方法」と称する場合がある。
本発明は、また、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための方法を提供する。以下、「本発明の制御方法」と称する場合がある。
本発明の制御方法におけるＥカドヘリン阻害物質、多能性幹細胞、および多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御は、適宜、「１．本発明の制御剤」に記載の内容を援用するものとする。
多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、多能性幹細胞を維持、増殖及び／又は分化誘導可能な培地であれば特に限定されない。一態様において、多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有し、多能性幹細胞の未分化状態の維持を支持する培地であり得る。かかる培地は、自体公知の多能性幹細胞維持培地にＥカドヘリン阻害物質を添加することで調製することができる。また、別の一態様において、多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有し、多能性幹細胞の未分化状態の維持を支持しない培地であり得る。かかる培地は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有し、多能性幹細胞の未分化状態の維持を支持しない培地である限り特に限定されず、例えば、基礎培地、血清および／または血清代替物、Ｅカドヘリン阻害物質、好ましくはヘマグルチニン（特に、ボツリヌス菌由来のヘマグルチニン）、およびその他の成分を含む培地等が挙げられる。当該培地は、未分化状態の維持を支持する物質（例えば、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＬＩＦなど）を含有しないことが好ましいが、培地全体として多能性幹細胞の未分化状態の維持を支持しなければ、この限りではない。
基礎培地としては、哺乳動物細胞の培養に一般的に用いられる合成培地を一種または複数種を組み合わせて利用でき、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ－Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｆ１２－Ｈａｍ、Ｋａｉｇｈｎ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆ１２等の市販品が使用可能である。
血清は、ウシ、ヒトなどの哺乳動物に由来する血清を使用できる。血清代替物とは、細胞培養に用いられるFBS等の血清の代わりとなる低タンパク質代替品であって、市販品として、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）などのほか、神経細胞培養用血清代替物であるＮ２、Ｂ２７などが入手可能である。血清または血清代替物の濃度は、例えば、０．５～３０％（ｖ／ｖ）の範囲から適宜設定でき、濃度は一定でもよく、段階的に変化させて用いても良い。
Ｅカドヘリン阻害物質の濃度としては特に限定されず、多能性幹細胞から三胚葉いずれかへの分化誘導において目的とする分化細胞から逸脱する細胞を減少させるという観点や、分化誘導効率を変化させるという観点において当業者が適宜設定することが可能である。例えば、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンを用いる場合、ヘマグルチニン濃度として１～８０ｎＭの間で適宜濃度を振って目的とする細胞への分化誘導効率を検定することにより、使用する分化誘導系に適したヘマグルチニン濃度を決定することができる。
ヘマグルチニンがヘマグルチニンの改変体の場合であっても上記と同様の理由により濃度は特に限定されないが、改変体は細胞間接着力を緩和するという機能において高活性型であり得るため、目安とする濃度は全体的に低く設定され得る。
ヘマグルチニンが小型化されたヘマグルチニンの場合であっても上記と同様の理由により濃度は特に限定されないが、小型化されたヘマグルチニンは一般的に細胞間接着力を緩和するという機能において活性が低くなる傾向にあるため、目安とする濃度は全体的に高く設定され得る。
培地は、上述以外に、哺乳動物細胞の培養に一般的に使用されるその他の成分を含むことができる。また、Ｅカドヘリン阻害物質を含有し、多能性幹細胞の未分化状態の維持を支持しない培地は、目的の分化細胞に適した分化誘導剤等をさらに含有してもよい。
本発明の制御方法において、均一および均質な分化誘導を実現するために、Ｅカドヘリン阻害物質は、（１）多能性幹細胞の未分化状態を維持した拡大培養時の培地に添加してもよく、（２）多能性幹細胞から目的とする特定の分化細胞への分化誘導における培地に添加してもよく、あるいは（３）Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、特定の分化細胞へは分化誘導しない（分化誘導剤を含まない）が未分化状態の維持を支持しない培地に添加してもよい。（３）の場合、当該培養工程により得られた細胞を、目的とする特定の分化細胞へと分化誘導するための（分化誘導剤を含有する）培地中でさらに培養することができる。当該分化誘導用培地は、Ｅカドヘリン阻害物質を含有してもよいし、含有しなくてもよい。特に分化誘導の初期段階（例えば、胚様体の形成等の特定の分化細胞への分化を誘導していない段階など）で多能性幹細胞をＥカドヘリン阻害物質と接触させることにより、三胚葉いずれかの系統への方向づけを行うことができ、その後の分化誘導剤を用いた培養により、得られる目的の分化細胞の均一性・均質性を向上させることができ、また収率も向上させることができる。すなわち、後述する「本発明の安定化方法」にも同様の観点でＥカドヘリン阻害物質を適用することができる。
Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する期間は、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着力の均一化・目的とする分化細胞への分化誘導の方向づけが達成され、かつＥカドヘリン阻害物質との長期接触により細胞に悪影響を及ぼさない範囲で適宜設定することができる。例えば、特定の分化細胞へは分化誘導しないが未分化状態の維持を支持しない培地中で多能性幹細胞を培養する場合、例えば、当該培地への播種直後か播種後１～数（例：２、３、４、５）日目からＥカドヘリン阻害物質を添加し、１日間以上（例：1、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０日間もしくはそれ以上）添加し続けることができる。あるいは、例えば、上記培地（培地Ａ）中で３～７日間程度多能性幹細胞を培養した後、分化誘導剤を含む分化誘導用培地（培地Ｂ）を用いて目的とする分化細胞へと分化誘導する場合には、例えば、培地Ａへの播種直後か播種後１～数（例：２、３、４、５）日目からＥカドヘリン阻害物質を添加し、例えば数時間～数日間、好ましくは１～数（例：５、４、３、２）日間培養した後、Ｅカドヘリン阻害物質を含有してもよいし、含有しなくてもよい培地Ｂ中でさらに培養することができる。
本発明の制御方法における多能性幹細胞の培養条件としては、公知の分化誘導方法を用いることができ、例えば、接着培養法、浮遊培養法などの方法が挙げられる。接着培養法としては、例えば接着性の細胞培養器を用いる方法、多能性幹細胞をフィーダー細胞上に接着させた状態で培養する方法（例えばＷＯ２００１/０８８１００）、ラミニンＥ８フラグメントがコーティングされた培養基材を用いる方法（例えばＷＯ２０１５／０５３３７５）などが知られているが、これらに限定されるものではない。浮遊培養法としては、集合し塊を形成した多能性幹細胞群（浮遊凝集体）を、培養培地中において浮遊させた状態で培養する方法（例えばＷＯ２００８／０８７９１７、Nature． 2011 Apr 7;472(7341):51-6）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
［接着培養法］
培養に用いられる多能性幹細胞の密度は、多能性幹細胞を均一に播種でき、接着培養可能な密度であれば特に限定されないが、均一に播種され接着培養した際にＥカドヘリン阻害物質を投与することで細胞間接着の程度を均一化し、かつ分化誘導状態を適切に制御させられる程度の細胞密度であることが望ましく、そのような細胞密度は、適宜設定することが可能である。また培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件も適宜設定できる。培養の期間は、多能性幹細胞の分化誘導を制御しうる限り特に限定されないが、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着の均一化効果を保ち、分化誘導を制御することができる程度の培養期間であることが望ましい。この培養期間は、培養に用いられる多能性幹細胞の細胞数、培養器具、培養基材、培養方法などにより適宜変更することが可能である。
培養に用いられる多能性幹細胞の密度は、多能性幹細胞を均一に播種でき、接着培養可能な密度であれば特に限定されないが、均一に播種され接着培養した際にＥカドヘリン阻害物質を投与することで細胞間接着の程度を均一化し、かつ分化誘導状態を適切に制御させられる程度の細胞密度であることが望ましく、そのような細胞密度は、適宜設定することが可能である。また培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件も適宜設定できる。培養の期間は、多能性幹細胞の分化誘導を制御しうる限り特に限定されないが、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着の均一化効果を保ち、分化誘導を制御することができる程度の培養期間であることが望ましい。この培養期間は、培養に用いられる多能性幹細胞の細胞数、培養器具、培養基材、培養方法などにより適宜変更することが可能である。
接着培養法で用いられる培養基材としては特に限定されず、公知の培養基材、例えば、ラミニンＥ８フラグメントがコーティングされた培養基材等が挙げられる。
［浮遊培養法］
培養は、前述した接着培養のほかに浮遊培養であってもよい。浮遊培養に用いられる凝集体を形成する多能性幹細胞の数は、Ｅカドヘリン阻害物質を投与することで細胞間接着の程度を均一化し、かつ分化誘導状態を適切に制御させられる程度の細胞数であることが望ましく、目的とする分化細胞や適用する分化誘導法によって適宜設定することができる。また培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件も適宜設定できる。培養の期間は、多能性幹細胞の分化誘導を制御しうる限り特に限定されないが、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着の均一化効果を保ち、分化誘導を制御することができる程度の培養期間であることが望ましい。この培養期間は、培養に用いられる多能性幹細胞の細胞数、培養器具、培養基材、培養方法などにより適宜変更することが可能である。
培養は、前述した接着培養のほかに浮遊培養であってもよい。浮遊培養に用いられる凝集体を形成する多能性幹細胞の数は、Ｅカドヘリン阻害物質を投与することで細胞間接着の程度を均一化し、かつ分化誘導状態を適切に制御させられる程度の細胞数であることが望ましく、目的とする分化細胞や適用する分化誘導法によって適宜設定することができる。また培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件も適宜設定できる。培養の期間は、多能性幹細胞の分化誘導を制御しうる限り特に限定されないが、Ｅカドヘリン阻害物質による細胞間接着の均一化効果を保ち、分化誘導を制御することができる程度の培養期間であることが望ましい。この培養期間は、培養に用いられる多能性幹細胞の細胞数、培養器具、培養基材、培養方法などにより適宜変更することが可能である。
浮遊培養法で用いられる培養器としては、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されない。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を挙げることができる。
本発明の制御方法において用いられる分化誘導剤としては、特に限定されず目的とする分化細胞に応じた公知の分化誘導剤を適宜使用することができる。例えば、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤、ソニック・ヘッジホッグシグナル阻害剤、およびＡｃｔｉｖｉｎシグナル促進剤などが挙げられるが、これらは例示であり、これらに限定されるものではない。
３．本発明の安定化剤
本発明はまた、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞から目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させるための剤を提供する。以下、「本発明の安定化剤」と称する場合がある。
本発明はまた、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞から目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させるための剤を提供する。以下、「本発明の安定化剤」と称する場合がある。
本発明の安定化剤におけるＥカドヘリン阻害物質、多能性幹細胞、および多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御は、適宜、「１．本発明の制御剤」に記載の内容を援用するものとする。
本発明の安定化剤において、「多能性幹細胞の分化誘導の安定化」における「分化誘導」とは、「１．本発明の制御剤」に記載の内容を援用するものとする。また本発明の安定化剤を用いて実施される「多能性幹細胞の分化誘導の安定化」とは、上記した多能性幹細胞の分化誘導において、目的とする細胞への分化誘導効率を向上させること、および／または再現性良く目的とする細胞へ分化誘導できることをいう。本発明の安定化剤を培養系に添加することによって、細胞集塊における物理的な細胞間接着の強度を均一化して細胞の分化誘導の方向性を制御するとともに、その添加量を調節することによって均一化された細胞間接着の強度を調整することで、目的とする分化細胞への分化誘導の安定化を図ることができる。
すなわち、物理的な細胞間接着力が均一化されることによって、細胞の培養環境が均一化され、このことによって多能性幹細胞を分化誘導した場合に、前述の「分化誘導の方向性制御」において記載したように、目的とする三胚葉いずれかの系統への分化誘導効率およびその再現性を高めることが可能となる。当業者は、目的とする分化細胞に適した本発明の安定化剤の量を適宜決定することにより、得られる分化細胞への分化誘導効率およびその再現性を向上させることができる。例えば、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンを用いる場合、ヘマグルチニン濃度として１～８０ｎＭの間で適宜濃度を振って目的とする細胞への分化効率を検定することにより、使用する分化誘導系に適した本発明の安定化剤の量を決定することができる。分化誘導において用いられる本発明の安定化剤の量は、適用する分化誘導系の規模・培養条件・培養環境等によって異なるものであり、本発明の安定化剤をこの範囲で使用するとこの細胞系に誘導することができるという類のものではない。あくまでも当業者が自らの経験のもと本発明の安定化剤を自らが実施する分化誘導系に適用することでその分化誘導効率を向上させることができる意味で、本発明の安定化剤は有用性を持つものである。
さらに本発明の安定化剤を用いて、分化誘導系における目的細胞から逸脱する細胞を減少、もしくは除去することができる。本発明の安定化剤を用いることで細胞培養塊における物理的な細胞間接着力が均一化されることにより、細胞の培養環境が均一化される。このことによって、分化誘導系において目的細胞から逸脱する細胞を減少させることができると推測される。なお、「目的細胞から逸脱する細胞」とは、上記した通りである。
４．本発明の安定化方法
本発明は、また、多能性幹細胞から目的の分化細胞を効率よく製造する方法、言い換えれば、目的の細胞への分化誘導を安定化する方法を提供する。以下、「本発明の安定化方法」と称する場合がある。当該方法は、（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、および（２）工程（１）で得られた凝集体を、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で培養することにより、目的の細胞への分化誘導を安定化させる工程を含む限り、特に限定されない。
本発明は、また、多能性幹細胞から目的の分化細胞を効率よく製造する方法、言い換えれば、目的の細胞への分化誘導を安定化する方法を提供する。以下、「本発明の安定化方法」と称する場合がある。当該方法は、（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、および（２）工程（１）で得られた凝集体を、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で培養することにより、目的の細胞への分化誘導を安定化させる工程を含む限り、特に限定されない。
本発明の安定化方法における多能性幹細胞およびＥカドヘリン阻害物質は、適宜、「１．本発明の制御剤」に記載の内容を援用するものとする。
［多能性幹細胞から目的の細胞への分化誘導］
本発明の安定化方法は、多能性幹細胞を出発細胞として、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化することにより、最終的に効率よく（より均一かつ均質な）目的の分化細胞集団を製造する方法である。多能性幹細胞は、細胞どうしの細胞間接着が存在する状態であることが好ましいため、本発明の誘導方法は（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程を含む。
本発明の安定化方法は、多能性幹細胞を出発細胞として、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化することにより、最終的に効率よく（より均一かつ均質な）目的の分化細胞集団を製造する方法である。多能性幹細胞は、細胞どうしの細胞間接着が存在する状態であることが好ましいため、本発明の誘導方法は（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程を含む。
工程（１）における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している状態にあるものをいう。したがって、コロニー、凝集塊、細胞塊、胚様体（Embryoid body）、スフェア（Sphere）およびスフェロイド（Spheroid）も凝集体に包含されるし、細胞培養系において、細胞同士が接着するほどコンフルエントな状態になっていればその状態も含まれる。多能性幹細胞の凝集体は、例えば、接着培養法により細胞をコンフルエントな状態にすることにより形成されるし、浮遊培養法により多能性幹細胞を培養することによっても形成される。そのような培地および培養法としては、上記と同様のものが挙げられる。
工程（２）に用いられる培地および培養方法としては、「２．本発明の制御方法」の記載と同様のものが挙げられる。すなわち、「２．本発明の制御方法」に記載された観点と同様に、本発明の安定化方法においても目的とする分化細胞への分化誘導における各工程においてＥカドヘリン阻害物質を使用することで、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させうる。
目的とする分化細胞としては、例えば、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、および内胚葉系細胞が挙げられる。
外胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、神経系細胞、表皮系細胞等が挙げられる。具体的には、例えば、網膜色素上皮細胞等が挙げられる。
中胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、血球系細胞（造血系細胞を含む）、脈管系細胞（血管内皮細胞等）、心筋細胞（例えば心房筋細胞、心室筋細胞等）、骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
内胚葉系細胞は特に限定されず、例えば、消化器系細胞、膵細胞、肝細胞、呼吸器系細胞、甲状腺細胞等が挙げられる。
Ｅカドヘリン阻害物質の濃度としては特に限定されず、多能性幹細胞から三胚葉いずれかへの分化誘導において目的細胞から逸脱する細胞を減少させるという観点や、分化誘導効率およびその再現性を向上させるという観点、すなわち目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させるという観点において当業者が適宜設定することが可能である。例えば、Ｅカドヘリン阻害物質としてヘマグルチニンを用いる場合、ヘマグルチニン濃度として１～８０ｎＭの間で適宜濃度を振って目的とする細胞への分化誘導効率とそのばらつきを検定することにより、使用する分化誘導系に適したヘマグルチニン濃度を決定することができる。
ヘマグルチニンがヘマグルチニンの改変体の場合であっても上記と同様の理由により濃度は特に限定されないが、改変体は細胞間接着力を緩和するという機能において高活性型であり得るため、目安とする濃度は全体的に低く設定され得る。
ヘマグルチニンが小型化されたヘマグルチニンの場合であっても上記と同様の理由により濃度は特に限定されないが、小型化されたヘマグルチニンは一般的に細胞間接着力を緩和するという機能において活性が低くなる傾向にあるため目安とする濃度は全体的に高く設定され得る。
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ヘマグルチニンを用いた分化誘導の方向付け
ヘマグルチニンを用いて分化誘導の方向付けがなされるかを検討するために、網膜色素上皮細胞(RPE細胞)への分化誘導基本培地を用い、網膜色素上皮細胞の分化誘導を促進する分化誘導剤（例えば、SB431542およびCKI-7等）を用いることなく、網膜色素上皮細胞の誘導を促した。この際、ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを濃度を変えて添加することで、その分化誘導に対する影響を観察した。具体的な操作は以下の通りである。
ヘマグルチニンを用いて分化誘導の方向付けがなされるかを検討するために、網膜色素上皮細胞(RPE細胞)への分化誘導基本培地を用い、網膜色素上皮細胞の分化誘導を促進する分化誘導剤（例えば、SB431542およびCKI-7等）を用いることなく、網膜色素上皮細胞の誘導を促した。この際、ボツリヌス菌由来ヘマグルチニンを濃度を変えて添加することで、その分化誘導に対する影響を観察した。具体的な操作は以下の通りである。
使用した試薬は、以下の通りである。
・分化誘導基本培地（Glasgow's MEM (GMEM) 培地(Invitrogen)、KnockOutTMSerum Replacement (KSR) (Invitrogen)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、StemSure (登録商標) 10 mmol/l 2-メルカプトエタノール (×100) (和光純薬)、100 U/ml ペニシリン-100μg/ml ストレプトマイシン(Invitrogen)）
・第1分化誘導培地（KSRを20%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第2分化誘導培地（KSRを15%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第3分化誘導培地（KSRを10%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第4分化誘導培地（KSRを10%含む分化誘導基本培地、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・RPE維持培地 (67% DMEM low glucose (SIGMA)、29% F12 (SIGMA)、1.9 mM L-glutamine(Invitrogen)、1.9% B-27 supplement (Invitrogen)、96 U/mL ペニシリンナトリウム、96μg/mL 硫酸ストレプトマイシン)
・分化誘導基本培地（Glasgow's MEM (GMEM) 培地(Invitrogen)、KnockOutTMSerum Replacement (KSR) (Invitrogen)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen)、1 mM ピルビン酸ナトリウム(SIGMA)、StemSure (登録商標) 10 mmol/l 2-メルカプトエタノール (×100) (和光純薬)、100 U/ml ペニシリン-100μg/ml ストレプトマイシン(Invitrogen)）
・第1分化誘導培地（KSRを20%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第2分化誘導培地（KSRを15%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第3分化誘導培地（KSRを10%含む分化誘導基本培地、10μM Y-27632(和光純薬)、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・第4分化誘導培地（KSRを10%含む分化誘導基本培地、所定濃度のヘマグルチニン（表１））
・RPE維持培地 (67% DMEM low glucose (SIGMA)、29% F12 (SIGMA)、1.9 mM L-glutamine(Invitrogen)、1.9% B-27 supplement (Invitrogen)、96 U/mL ペニシリンナトリウム、96μg/mL 硫酸ストレプトマイシン)
ヒト皮膚由来iPS細胞（253G1、京都大学提供）をラミニンコーティング培養皿（住化ベークライト社製）へ、9×106 cells/9cm dishになるように播種した。ラミニンコーティング培養皿は、9 cm培養皿(BD FALCON)をラミニン511E8フラグメント(WO2011043405の実施例（３）に開示のタンパク質。大阪大学提供) の0.5μg/cm2溶液を用い、37℃で1時間以上コーティングして作成した。iPS細胞は、培養皿上に速やかに接着し、浮遊凝集体の形成は確認されなかった。
培養初日をDay0とし、培養開始後(Day1)から色素細胞が確認されるDay40ごろまで毎日、全量培地交換を行った。培地は、次に示す通り段階的に組成を変更した。すなわちDay0は分化誘導基本培地、Day1-4は第1次分化誘導培地(20% KSR)、Day5-8は第2次分化誘導培地(15% KSR)、Day9-12は第3次分化誘導培地(10% KSR)、Day13からDay40ごろまでは第4次分化誘導培地(10% KSR)を用いた。各培地において、ヘマグルチニンの濃度を変えて添加することで、分化誘導に対する影響を観察した。実験条件（条件1～3）を表１に、結果を表１および図１に示す。
ヘマグルチニンを添加せず分化誘導を行った場合、多能性幹細胞の細胞凝集体から徐々に濃い色素を有する細胞である網膜色素上皮細胞が誘導された（表１（条件１）、図１左列）。一方、ヘマグルチニンを培養系に添加して細胞凝集体における細胞間接着の強度を緩めることで、１０ｎＭの濃度では肝細胞様細胞が（表１（条件２）、図１中央列）、３０ｎＭの濃度では筋肉系の細胞や心筋細胞（表１（条件３）、図１右列）がそれぞれ誘導された。
［実施例２］ヘマグルチニンを用いた多能性幹細胞の直接分化の検討
次に、多能性幹細胞の細胞凝集体に対し24時間濃度を変えたヘマグルチニンで処理したのち、STEMdiff Trilineage Differentiation Kit（STEMCELL Technologies 社)を用いて三胚葉由来のそれぞれに分化誘導しRT-PCRにより分化能を検討した。
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレート（Corning社製）へ、200 cells/dimpleになるように播種し、ROCKインヒビター含有StemFit AK02N培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で5日間培養したのち、濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で24時間培養した。その後、STEMdiff Trilineage Differentiation Kitで各胚葉へ分化させ、6日後にRT-PCRで遺伝子解析を行った。結果を図2に示す。
次に、多能性幹細胞の細胞凝集体に対し24時間濃度を変えたヘマグルチニンで処理したのち、STEMdiff Trilineage Differentiation Kit（STEMCELL Technologies 社)を用いて三胚葉由来のそれぞれに分化誘導しRT-PCRにより分化能を検討した。
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレート（Corning社製）へ、200 cells/dimpleになるように播種し、ROCKインヒビター含有StemFit AK02N培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で5日間培養したのち、濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で24時間培養した。その後、STEMdiff Trilineage Differentiation Kitで各胚葉へ分化させ、6日後にRT-PCRで遺伝子解析を行った。結果を図2に示す。
外胚葉系への分化誘導において、ヘマグルチニン濃度が低い（0 nM～1 nM）とき、外胚葉系マーカーのPAX6、OTX2、SOX1、MAP2といった遺伝子の発現量が有意に増加した。一方、中胚葉系への分化誘導においては、ヘマグルチニン濃度が中程度の場合（1 nM～2 nM）、中胚葉系マーカーのCDX2、HAND1といった遺伝子の発現量が有意に増加した。さらに、内胚葉系への分化誘導においては、ヘマグルチニン濃度が高い（2.5 nM）とき、内胚葉系マーカーのSOX17、FOXA2、GATA6といった遺伝子の発現量が有意に低下したことから、ヘマグルチニン濃度が低い方（0 nM～1 nM）が内胚葉系への方向づけがされ易いことが示唆された。
以上の結果から、ヘマグルチニンの添加濃度を調整することにより、三胚葉のいずれかへの分化誘導の方向性を制御し得ることが明らかとなった。
以上の結果から、ヘマグルチニンの添加濃度を調整することにより、三胚葉のいずれかへの分化誘導の方向性を制御し得ることが明らかとなった。
［実施例３］ヘマグルチニンを用いた多能性幹細胞の心筋細胞分化の安定化
（１）分化誘導前にヘマグルチニン処理した試験（大量培養に適した培養システムの試験）
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレートへ、200 cells/dimple になるように播種し、ROCKインヒビター含有培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で2日間培養したのち、濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で24時間培養した。その後、既知の心筋細胞への分化誘導培地において14日間培養することで心筋細胞へ分化誘導した。分化誘導は、Sougawa et al., Methods Mol Biol. 2320: 23-27 (2021)の記載を参考に実施した。iPS細胞播種後18日後にRT-PCRで心筋細胞マーカーの遺伝子解析を行った。結果を図3に示す。
・第1分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、Y-27632、BMP-4）
・第2分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、BMP-4、ActivinA、bFGF）
・第3分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、IWP-3, SB431542, Dorsomorphin, VEGF）
・第4分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、bFGF, VEGF）
ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、心筋細胞特有の遺伝子発現量が向上していることが分かった。すなわちこのことにより、細胞集塊であっても安定に分化誘導することができ、大量培養システムにおいてもヘマグルチニンを添加することで分化誘導工程を安定化できることが示唆された。
（１）分化誘導前にヘマグルチニン処理した試験（大量培養に適した培養システムの試験）
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレートへ、200 cells/dimple になるように播種し、ROCKインヒビター含有培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で2日間培養したのち、濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で24時間培養した。その後、既知の心筋細胞への分化誘導培地において14日間培養することで心筋細胞へ分化誘導した。分化誘導は、Sougawa et al., Methods Mol Biol. 2320: 23-27 (2021)の記載を参考に実施した。iPS細胞播種後18日後にRT-PCRで心筋細胞マーカーの遺伝子解析を行った。結果を図3に示す。
・第1分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、Y-27632、BMP-4）
・第2分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、BMP-4、ActivinA、bFGF）
・第3分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、IWP-3, SB431542, Dorsomorphin, VEGF）
・第4分化誘導培地（C液不含StemFit AK02N培地、bFGF, VEGF）
ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、心筋細胞特有の遺伝子発現量が向上していることが分かった。すなわちこのことにより、細胞集塊であっても安定に分化誘導することができ、大量培養システムにおいてもヘマグルチニンを添加することで分化誘導工程を安定化できることが示唆された。
（２）ヘマグルチニンを添加して分化誘導した試験
心筋細胞への分化誘導前にヘマグルチニンで処理することなく、既知の心筋細胞への分化誘導培地にヘマグルチニンを添加することを除いて、上記（１）と同様に試験し、心筋細胞特有の遺伝子であるcTnTの発現細胞の比率を測定し（ｎ＝９）、その結果を箱ひげ図で示した（図4）。
心筋分化誘導マーカーcTnTを指標とした場合、ヘマグルチニンを添加しない従来の分化誘導に比べ、ヘマグルチニンを添加した分化誘導系では、cTnTマーカー陽性細胞の割合が増加傾向を示し、かつその際の分散も少なくなった。すなわち心筋細胞への分化誘導系において、ヘマグルチニン処理工程を導入することによって効率よく心筋細胞集団が得られるとともに、培養ごとの結果のばらつきを小さくする作用がある（心筋細胞への分化誘導を安定化させ得る）ことが示唆された。
心筋細胞への分化誘導前にヘマグルチニンで処理することなく、既知の心筋細胞への分化誘導培地にヘマグルチニンを添加することを除いて、上記（１）と同様に試験し、心筋細胞特有の遺伝子であるcTnTの発現細胞の比率を測定し（ｎ＝９）、その結果を箱ひげ図で示した（図4）。
心筋分化誘導マーカーcTnTを指標とした場合、ヘマグルチニンを添加しない従来の分化誘導に比べ、ヘマグルチニンを添加した分化誘導系では、cTnTマーカー陽性細胞の割合が増加傾向を示し、かつその際の分散も少なくなった。すなわち心筋細胞への分化誘導系において、ヘマグルチニン処理工程を導入することによって効率よく心筋細胞集団が得られるとともに、培養ごとの結果のばらつきを小さくする作用がある（心筋細胞への分化誘導を安定化させ得る）ことが示唆された。
［実施例４］ヘマグルチニンを用いた多能性幹細胞の肝細胞分化の安定化（大量培養に適した培養システムの試験）
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレートへ、200 cells/dimple になるように播種し、ROCKインヒビター含有培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で1日間培養したのち、0 nM、1 nM、5 nM、10 nMと濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で3日間培養した。次いで培地を洗浄したのち肝細胞への分化誘導を開始した。分化誘導は、Kajiwara et al., Proc Natl Acad Sci USA. 109(31): 12538-43の記載を参考に実施した。具体的には、まず1 x B27 supplement（Gibco）、100 ng/mL アクチビンA（R&D systems）、50 ng/mL Wnt3a（R&D systems）および0.5 mM NaB（Sigma）入りRPMI1640培地（Nacalai）中で3日間培養して内胚葉誘導を実施した。培地を洗浄したのち、次に20% (v/v) KSR（Gibco）、1 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEAA、0.1 mM 2-メルカプトエタノールおよび1% (v/v) DMSO入り Knockout-DMEM（Gibco)中で7日間培養して肝細胞誘導を実施した。培地を洗浄したのち、最後に20 ng/mL HGF(PeproTech)、20 ng/mL オンコスタチンM(PeproTech)入りHepatocyte Culture Medium BulletKit(Lonza社製)中で7日間培養して肝細胞を成熟させた。
肝細胞誘導3日後（内胚葉誘導後）さらに17日後（肝細胞成熟後）にRT-PCRで肝細胞マーカーの遺伝子解析を行った。結果を図5に示す。
3日後（A）では、ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、Oct3/4の発現量が低下する一方で、内胚葉特有の遺伝子（Sox17）発現量が増加していることが分かった。さらに17日後(B)では、ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、肝前駆細胞マーカー（CK19）の発現量が低下する一方で、成熟した肝細胞に特有の遺伝子群（ALB、AAT、CYP34）の発現量が向上していることがわかった。すなわち肝細胞への分化誘導系において、ヘマグルチニン処理工程を導入することによって効率よく肝細胞集団が得られる（肝細胞への分化誘導を安定化させ得る）ことが示唆された。
ヒトiPS細胞である1383D2を超低接着表面のElplasiaラウンドボトムプレートへ、200 cells/dimple になるように播種し、ROCKインヒビター含有培地で1日間培養した。その後ROCKインヒビター不含StemFit AK02N培地で1日間培養したのち、0 nM、1 nM、5 nM、10 nMと濃度を変えたヘマグルチニン含有StemFit AK02N培地中で3日間培養した。次いで培地を洗浄したのち肝細胞への分化誘導を開始した。分化誘導は、Kajiwara et al., Proc Natl Acad Sci USA. 109(31): 12538-43の記載を参考に実施した。具体的には、まず1 x B27 supplement（Gibco）、100 ng/mL アクチビンA（R&D systems）、50 ng/mL Wnt3a（R&D systems）および0.5 mM NaB（Sigma）入りRPMI1640培地（Nacalai）中で3日間培養して内胚葉誘導を実施した。培地を洗浄したのち、次に20% (v/v) KSR（Gibco）、1 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEAA、0.1 mM 2-メルカプトエタノールおよび1% (v/v) DMSO入り Knockout-DMEM（Gibco)中で7日間培養して肝細胞誘導を実施した。培地を洗浄したのち、最後に20 ng/mL HGF(PeproTech)、20 ng/mL オンコスタチンM(PeproTech)入りHepatocyte Culture Medium BulletKit(Lonza社製)中で7日間培養して肝細胞を成熟させた。
肝細胞誘導3日後（内胚葉誘導後）さらに17日後（肝細胞成熟後）にRT-PCRで肝細胞マーカーの遺伝子解析を行った。結果を図5に示す。
3日後（A）では、ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、Oct3/4の発現量が低下する一方で、内胚葉特有の遺伝子（Sox17）発現量が増加していることが分かった。さらに17日後(B)では、ヘマグルチニン濃度を高くするにつれて、肝前駆細胞マーカー（CK19）の発現量が低下する一方で、成熟した肝細胞に特有の遺伝子群（ALB、AAT、CYP34）の発現量が向上していることがわかった。すなわち肝細胞への分化誘導系において、ヘマグルチニン処理工程を導入することによって効率よく肝細胞集団が得られる（肝細胞への分化誘導を安定化させ得る）ことが示唆された。
以上のことから、ヘマグルチニンを添加することによる細胞間接着を緩める効果は、網膜色素上皮細胞への分化誘導を肝細胞や筋肉系細胞に変化させる効果を有し、さらに心筋細胞や肝細胞の誘導工程を安定化し、効率よく心筋細胞や肝細胞を得る効果をも有することが示された。このことから、多能性幹細胞を任意の分化誘導条件で目的とする細胞へと分化誘導する際に、ヘマグルチニンを適切な濃度で添加することで目的とする細胞へと効率的に分化誘導することができる。
本開示に係る方法および組成物は、例えば、再生医療の分野に有用である。
本出願は、日本で出願された特願2022-017548（出願日:2022年2月7日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (18)
- Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御のための剤。
- 多能性幹細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１に記載の剤。
- 多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、請求項１または２に記載の剤。
- 多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、請求項１または２に記載の剤。
- Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、請求項１または２に記載の剤。
- Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞の分化誘導の方向性を制御する方法。
- 培養が分化誘導剤の存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
- Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で多能性幹細胞を培養する工程において、該阻害物質の濃度を調整することを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
- 多能性幹細胞の分化誘導の方向性制御が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の変化である、請求項６または７に記載の方法。
- Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、請求項６または７に記載の方法。
- Ｅカドヘリン阻害物質を含有する、多能性幹細胞の分化誘導を安定化させるための剤。
- 多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、多能性幹細胞から三胚葉いずれかの系統への分化効率の向上である、請求項１１に記載の剤。
- 多能性幹細胞の分化誘導の安定化が、目的とする分化細胞から逸脱する細胞の減少もしくは除去である、請求項１１に記載の剤。
- Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の剤。
- 以下の工程を含む、多能性幹細胞から目的とする分化細胞を製造する方法。
（１）多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程、および
（２）工程（１）で得られた凝集体を、Ｅカドヘリン阻害物質を含有する培地中で培養することにより、目的とする分化細胞への分化誘導を安定化させる工程 - 培養が分化誘導剤の存在下で行われる、請求項１５に記載の方法。
- 多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１５または１６に記載の方法。
- Ｅカドヘリン阻害物質がヘマグルチニンである、請求項１５または１６に記載の方法。
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| JPWO2023149566A1 (ja) | 2023-08-10 |
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