JP2015536143A - 細胞分化 - Google Patents
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Abstract
Description
特異的細胞型の再現性があり、費用対効果が高く、測定可能な産生は、薬物の効果および毒性検査のための信頼できるin vitroアッセイから細胞療法までの幅広い応用に影響を与えることができる。この様式で神経前駆細胞および/または神経系細胞を産生する能力は、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの疾患および神経系損傷を含む神経系に悪影響を及ぼす状態に関するアッセイ、検査および療法などを利用可能にする可能性を開くことができる。
・ 神経潜在性(neural potential)を有する細胞の集団にE−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ;
・ 細胞の集団の間に生理学的ストレスを誘導するステップ;および
神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ
を含む。
・ 神経潜在性を有する細胞の集団にE−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ;
・ 細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ;
・ 神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ;
・ 場合により、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップ;および
・ 神経前駆細胞または神経系細胞を患者への投与のために好適な組成物中に配合する(formulating)ステップ
を含む。
・ E−カドヘリン活性の阻害物質;
・ 血清不含細胞培地;および
・ 血清または血清代替組成物
を含むキットも提供する。
本発明がより良く理解される目的で、次の用語は本開示の文脈においてここにさらに定義される。文脈上別段に必要とする場合を除いて、次の定義において考慮されるすべての実施形態が、実施形態および態様の詳細な組合せが具体的に開示されているかどうかに関わらず、本発明のすべての態様における使用のために好適であると考えられるべきであることは理解される。
本開示の目的のためにこの用語は、分化し、それにより神経前駆細胞を生じる能力を有するあらゆる細胞を包含すると理解されるべきである。幹細胞は、本開示の文脈において神経潜在性を有する好適な細胞の例である。
上で言及したとおり幹細胞は、本発明の方法において使用できる神経潜在性を有する細胞の好適な形状を表す。
本文脈において、神経前駆細胞は、自己複製および神経系列に関わる能力を示すあらゆる細胞を含んで理解されてよい。神経前駆細胞の好適な例は、神経系細胞;および神経細胞;およびオリゴデンドロサイトまたは星状細胞などのグリア細胞からなる群から選択される細胞型を生じることができる細胞を含んでよい。
E−カドヘリン活性の多数の異なる阻害物質は、本発明による使用のために好適である。単なる例として、E−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、E−カドヘリン中和抗体;E−カドヘリンHAVドメインの阻害物質;E−カドヘリンの細胞外ドメインでのトリプトファン2の阻害物質;およびアミノ酸配列CHAVC(配列番号3)を含むペプチドからなる群から選択されてよい。
1 材料および方法
1.1 マウスENPS細胞の接着培養
マウスE−カドヘリン陰性多能性幹細胞(ENPS)細胞はDr Wardによって誘導され(未公開データ)、10%ウシ胎仔血清(FBS)、2mM L−グルタミン、非必須アミノ酸(NEAA)(1×)、および50μM 2−メルカプトエタノール(すべてInvitrogenから)ならびに1,000ユニット/ml LIF(ESGRO;Millipore)を補充されたノックアウトダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)でのゼラチン処置プレート上で、37℃、5% CO2で他に述べる場合を除いて培養された。培地は48時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンス(2日間)前に継代された。ゼラチン処置プレートは滅菌ddH2O中0.1%w/vゼラチン(Sigma)の組織培養処置プレート(Griener−Bio)への添加によって作製され、4℃で一晩インキュベートされた。
マウスENPS細胞はトリプシン−EDTA(Sigma)を使用して接着培養から解離され、125ml三角振とうフラスコ(Corning)中の分化培地(10%血清(3:7分割FBS:KSR)、2mM L−グルタミン、非必須アミノ酸(100×、1:100希釈)、50μM 2−メルカプトエタノールを補充されたノックアウトDMEM)25mlに1mlあたり生細胞1.0E5個/ml(vc/ml)で振とうフラスコに播種され、振とうプラットホームで37℃/5% CO2(1’’軌道140rpm;Satorius、Surrey、UK)、140rpmで15日間撹拌された。細胞計数および培地補充は72時間ごとに実施された。
ヒトES細胞株、HUES7(継代数39〜44)、H9(継代数50〜55)およびMAN7(継代数18〜21)を分化の誘導前に接着フィーダー不含培養条件下で増殖させた。細胞はDMEM/F−12+GlutaMAX、8ng/ml FGF塩基性因子(Peprotec)、STEMPRO(登録商標) hESC SFM増殖補充物(1×)、1.8% BSAおよび0.1mM 2−メルカプトエタノールを含むSTEMPRO(登録商標)(Invitrogen −完全培地)中で培養された。細胞はMatrigel(商標)−(BD Biosciences 356234)またはGeltrex(商標)−(Invitrogen 12760−021)のいずれかでコートされた組織培養グレードプレートで培養された。Matrigel処置プレートは予め希釈したMatrigel(商標)(DMEM/F12培地中1:100)でコートされ、使用前に室温でインキュベートされた。Geltrex(商標)コートプレートは予め希釈したGeltrex(商標)(DMEM/F12培地中1:29)でコートされ、使用前に1時間、37℃でインキュベートされた。培地は24時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンスで継代された。望まれない残存マウス線維芽細胞フィーダー細胞を除去するためにすべての細胞は最少で2継代数フィーダー不含培養物として増殖された。細胞は使用されたES細胞株に応じてトリプシン−EDTA(Sigma)またはコラーゲナーゼIV(Sigma−1mg/ml最終濃度)を使用して解離された。
コンフルエント未分化細胞は解離され、Devemy & Blashuk (2009)に公開のとおり、分化培地のみ(DMEM/F−12+GlutaMAX(Invitrogen)、10%ノックアウト血清代替物(KSR)(Invitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1×)(PAA)での0.1%w/vゼラチンコートウエルに低密度で(細胞2.0E5個/962mm2)、E−カドヘリン阻害ペプチド(H−Ser−Trp−Glu−Leu−Tyr−Tyr−Pro−Leu−Arg−Ala−Asn−Leu−NH2、>95%純度、酢酸塩バックグラウンド)(Bachem)での培地補充の24時間前に播種された。ペプチドはヒトE−カドヘリンの阻害のための実行濃度500μMで滅菌ddH2O(20mM保存濃度)中30mg/mlに再構成された。培地(およびペプチド)は2日ごとに6〜7日間補充された。この後、ペプチドはもはや必要ではない。神経前駆細胞およびさらなる成熟神経系細胞についての形態学的分析およびマーカーでの免疫染色は一連の分化プロトコールの際に実施された。
神経前駆細胞(NPC)の自己再生を維持するために7日目以後培養物は新鮮ゼラチンコートプレートに移され、増殖培地(DMEM/F12 Glutamax、10%FBS(両方ともInvitrogen)、8ng/ml FGF塩基性因子(Peprotec)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1×)(PAA)で培養された。培地は2〜3日ごとに補充され、細胞は<70%コンフルエンスを維持するように分割された。
未成熟ニューロン/NPCをInvitrogenから商業的に入手可能な確立されたプロトコール細胞培養培地を使用して分化させた。簡潔には、コンフルエントNPC(4.5〜5.5×105/962mm2)はトリプシンEDTAを使用して解離され、関連分化培地中の0.1%w/vゼラチン処置6−ウエルプレート(他に述べる場合を除く)に再播種された。培地は2/3日ごとに補充された。培養物を>21日間増殖させた。追加的に、3種すべての体細胞系列についての陽性対照として役立てるために、未分化ヒトES細胞培養物は10%FBSの存在下での高コンフルエント培養物によって自発的に分化誘導された。
1.6.1.1 星状細胞分化
コンフルエントNPC(4.5〜5.5×105/962mm2)はトリプシンEDTAを使用して解離され、Geltrex(商標)コート6−ウエルプレートに再播種され、DMEM+GlutaMAX、N2、1%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン(1×)(PAA)で培養された。培地は2/3日ごとに補充された。培養物は>21日間増殖された。
コンフルエントNPC(4.5〜5.5×105/962mm2)はトリプシンEDTAを使用して解離され、Geltrex(商標)コート6−ウエルプレートに再播種され、神経基礎(Neurobasal)培地、B27(1×)、安定グルタミン(1×)(すべてInvitrogen)、T3(30ng/ml Sigma)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1×)(PAA)で培養された。培地は2/3日ごとに補充された。培養物は>21日間増殖された。
組織培養グレードプレートはポリ−L−オルニチン(Sigma−20μg/ml)を使用して一晩、室温で予めコートされた。過剰なポリ−L−オルニチンは除去され、細胞培養前にプレートはラミニンで4時間、37℃(Invitrogen−10μg/ml)でコートされた。コンフルエントNPC(4.5〜5.5×105/962mm2)はトリプシンEDTAを使用して解離され、10μg/mlラミニン処置6−ウエルプレートに再播種され、Neurobasal(登録商標)培地、B27(1×)、安定グルタミン(1×)、非必須アミノ酸(1×)(すべてInvitrogen)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1×)(PAA)で培養された。培地は2/3日ごとに補充された。培養物は>21日間増殖された。
細胞は4%w/vパラホルムアルデヒドで固定され、その場所で染色された(Mohamet et al、2010)。一次抗体は次のとおり;マウス抗ネスチン(1:250)、マウス抗ニューロン特異的β−IIIチューブリン(β−III TUB)(1:1000)マウス抗NEUROD1(1:00)、ウサギ抗PAX6(1:100)、マウス抗α平滑筋アクチン(ASMA)(1:50)、ヤギ抗FOXA2(1:50)、マウス抗ビメンチン(1:20),ウサギ抗MAP2(1:200)、マウス抗A285(1:500)、ニワトリ抗GFAP(1:500)(すべてAbeam、Cambridge、UK)、ウサギ抗神経フィラメント(1:500)(Enzo Life Sciences)およびマウス抗O4(1:500)(R&D Systems)。Alexa Fluors488または546でコンジュゲートした適切な二次抗体が使用され(1:500、Invitrogen、Paisley、UK)、すべての試料はDAPIベクターシールド(Vector Laboratories、Peterborough、UK)を使用してマウントされた。細胞はLeica DM500蛍光顕微鏡下で観察された。
細胞は解離緩衝液(Invitrogen、Paisley、UK)を使用して接着培養から解離された。簡潔には、細胞はPBSで洗浄され、1%w/vパラホルムアルデヒド中、10分間、室温で固定され、70%v/v氷冷メタノールを使用する−20℃、30分間の細胞浸透が続いた。細胞は一次抗体、抗マウスネスチン(1:100 Abeam)またはIgG対照アイソタイプを含有するPBS中の0.2%w/v BSAに再懸濁され、30分間、氷上でインキュベートされた。細胞は洗浄され、適切なフィコエリトリンコンジュゲート二次抗体(1:100 Santa Cruzバイオテクノロジー)に再懸濁され、30分間、氷上でインキュベートされた。細胞は洗浄され、1%w/vパラホルムアルデヒド中に再固定された。細胞蛍光はBecton Dickinson FACScaliberを使用して分析された。生細胞を前方および側方散乱を使用してゲート開閉し、すべてのデータがこの集団からの細胞を表した。
RNeasyキット(Qiagen、West Sussex、UK)をメーカーの説明書に従って使用して細胞から全RNAは単離された。RNA調製物はNanodrop spectrophotometer (Labtech Intl.、E.Sussex、UK)を使用して260nm(A260)での吸光度によって定量された。cDNAの合成はApplied Biosystems High capacity RNA to cDNAキットをメーカーの説明書により1μg RNA(Invitrogen)を利用して使用して実施された。PCRは1μlのcDNAを使用し、最適アニーリング温度、35サイクルで実施された。試料は400ng/ml臭化エチジウムを含有する2%w/vアガロースゲル上で実行され、Labworks4ソフトウェア(UVP、CA、USA)を備えるEpi Chemi II Darkroom and Sensicam imagerを使用して視覚化された。プライマー配列およびアニーリング温度は、下の表に示すとおりであった。
2.1 手動流加培養振とうフラスコでのENPS細胞の分化
未分化ENPS細胞は懸濁培養の前に標準的接着培養条件下で維持された。3回重複でフラスコは25ml分化培地中の1×105vc/mlで接種され、140rpmで撹拌された。最適細胞播種密度は、Mohamet et al (2010)において以前実証された。フラスコは72時間ごとに試料採取され、生細胞数が決定された(図1a)。平均生細胞数は、懸濁培養中で3日後にピーク(1.19×106 vc/ml)になり15日の培養期間にわたって7.65×105vc/mlに減少した。これは細胞生存率にも反映され、それにより全細胞生存率は培養物で3日後にピークになった(平均生存率77±6.3%)。しかし、3日目から細胞生存率における顕著な減少が観察された(実験期間について平均生存率21±7%)。値は、平均±SEM、n=3を表す。ENPS細胞はFBSを加えないことを除いて上に記載のとおり培養されたが、細胞の大部分は3日目まで生存していなかった。位相差顕微鏡(図1b、×20倍)は、振とうフラスコ培養で維持された細胞は分散増殖を有し、および6日目までに細胞塊(cell sphere)の形成が観察されることを示している。15日目に細胞はゼラチン処置プレートに移され、分析の前に一晩接着された。培養形態は、これらの細胞が神経系細胞型と類似の形態を示し、それ自体が接着し、ニューロン様突起を示すことを示している。
15日間手動流加培養で増殖させたENPS細胞が神経表現型であるかどうかを決定するために、本発明者らはニューロン系列の多数のマーカーの発現を検討した。15日間振とうフラスコで増殖させたENPS細胞はゼラチンコートプレートに蒔かれ、分化培地中で通例の培養条件下で24時間接着された。位相差画像は、線維束を形成する主な細胞体(塊)から突き出している神経様突起を示している(図2a)。ENPS細胞の分化した表現型をネスチン;β−IIIチューブリン、NEURO−D1、神経フィラメントおよびPAX6に対する陽性免疫反応性を有するタンパク質レベルで検証した(それぞれ図2(b)、(c)、(d)、(e)および(f))。これらの結果は、手動流加培養振とうフラスコで15日間にわたって培養されたENPS細胞が神経系細胞型に付随するマーカーを発現することを実証している。
ヒトES細胞株HUES7、H9およびMAN7を標準的接着フィーダー不含培養条件で分化の誘導前増殖させた、典型的培養形態を図3aおよびbに示す。分化を開始するためにコンフルエント未分化細胞は解離され、分化培地のみ(図3a)またはE−カドヘリン阻害ペプチドを補充された培地(図3b)でのゼラチンコートウエルに低密度で播種された。位相差画像は、培地のみで6〜7日間培養された細胞の大部分が平板化した「ギザギザの」形態(分化している細胞に伴う)を示すが、未分化細胞のわずかなコロニーが残っていることを示している(図3aii)。ペプチドを補充された培地で6〜7日間培養された細胞は、類似の形態を示すが、未分化コロニーは観察されなかった(図3bii)。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は7日目に回収され、神経前駆細胞マーカーの免疫蛍光分析が実施された。培地のみで分化した細胞は、高い割合の細胞において陽性ネスチン(緑)(図3aiii)およびビメンチン(緑)(図3aiv)発現を示すが、ペプチドの存在下で培養された細胞はネスチンおよびビメンチンの均質な発現を示す(それぞれ図3biiiおよび3biv)。すべての細胞は、DAPI(青)を使用して視覚化された。培地のみで培養されたネスチン陽性細胞の数の定量は、ペプチドを補充された培地中の分化の7日後の95.3±%と比較して71.1±2.2%であった(図4a、n=3)。培養7日後にペプチドを除去し、ES由来神経前駆細胞は分化培地のみでさらに21日間増殖された。位相差画像は、培地のみおよびペプチド補充培地で増殖させた細胞において9日目に神経系細胞系列に関連する典型的形態を示している(それぞれ図5aiおよびbi)。培養物はニューロンマーカーの二重免疫蛍光のために9日目に回収された。培地のみで増殖させた細胞は、ネスチン(赤)を発現し、β−IIIチューブリン(緑)を発現し始めているが、少ない割合の陰性細胞(青)がまだ観察できる(図5aii)。ペプチド補充培地に由来する細胞は、均一なレベルのネスチン(赤)およびβ−IIIチューブリンの線維状発現(緑)(図5bii)を発現する。培地のみ(図5ciおよびcii)ならびにペプチド補充培地(図5diおよびdii)の両方で12〜15日間分化させた細胞の免疫蛍光画像分析は、汎神経コミットメントのマーカーを発現し;ニューロン特異的β−IIIチューブリン(緑)および神経フィラメント(赤)発現が培地のみ由来の神経前駆細胞中に観察できるが、陰性細胞も観察できる(それぞれ図5ciおよびcii)。ペプチド含有培地由来の神経前駆細胞は、β−IIIチューブリン(図5di)および神経フィラメント(図5dii)のさらに成熟した線維状発現を発現している。全細胞はDAPI(青)を使用して視覚化された。
15日目に回収された分化細胞は非ニューロン系列に関連するマーカーで並行して染色された。培地のみに由来する細胞の小集団は、α平滑筋アクチン(中胚葉)発現(赤)を示したが(図6ai)、ペプチドを補充された培地由来の細胞では、α平滑筋アクチン発現は評価したすべての培養物から細胞1個でだけ検出された(図6bi)(n=3)。さらに、15日間分化させた培地またはペプチド処置細胞は、内胚葉マーカー、フォークヘッドボックスタンパク質A2(foxA2−緑)の陽性染色を示さなかった(それぞれ図6aiiおよびbii)。接着未分化細胞を3種すべての体細胞系列についての陽性対照として役立てるために高コンフルエント培養によって血清存在下、15日間、分化させた。並行してこれらの細胞の免疫蛍光分析は、強いα平滑筋アクチン発現(赤)(図6c)およびfoxA2(緑)に対する陽性核免疫反応性(図6d)を実証している。全細胞はDAPI(青)を使用して視覚化された。
ペプチド補充培地中で7日間いずれかの分化を誘導された神経前駆細胞は、ネスチン発現の蛍光フローサイトメトリー分析によって決定されたとおり8ng/ml FGF2の存在下で培養された場合に長期間(90日間)自己再生できる(図4b)。
ES細胞由来神経前駆細胞が接着培養において成熟神経細胞型を形成できるかどうかを決定するために、本発明者らは多数のグリアおよび神経限定マーカーを検討した。(a)培地のみまたは(b)ペプチド補充培地で(7日間)培養されたヒトES細胞は規定の培地中で培養することによってグリア系列への分化を誘導され、Geltrex−コートプレートに蒔かれた。細胞は21および28日目に回収され、グリア細胞サブセットのマーカーについて評価された。培地のみ(図7ai)およびペプチド補充培地(図7bi)に由来する神経前駆細胞由来の星状細胞(21日目)の位相差画像。細胞だけ(それぞれ図7aiiおよびaiii)ならびにペプチド由来細胞(図7biiおよび7biii)の培地中での21日目のA2B5(赤)、初期星状細胞マーカーおよび28日目のGFAP(赤)汎星状細胞マーカーの陽性免疫反応性。ペプチド補充培地由来細胞がタンパク質のさらに線維性の局在を示すことは注目される。培地のみ(図7aiv)およびペプチド補充培地(図7biv)に由来する神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト細胞の位相差画像。21日目のO4(緑)(オリゴデンドロサイト前駆体マーカー)の陽性免疫反応性はすべての処置において広範に見られた(図7avおよびbv)。全細胞はDAPI(青)を使用して視覚化された。分化した表現型は、グリア分化培地中で21日間培養された細胞でのRT−PCRによってGFAP(星状細胞)、Sβ100(星状細胞)、OLIGO2(オリゴデンドロサイト)およびGAPDH(ハウスキーピング)の転写物発現分析によってさらに確認された(図7c)。
さらなる研究が本発明の種々の態様における使用のためのE−カドヘリン活性の阻害物質の適合性範囲を例示するために実行された。2個の対照(ペプチドBおよび水)と共に本研究で使用されたE−カドヘリン活性の阻害物質は次のとおりであった:
1.ペプチドA*−SWELYYPLRANL(細胞間接着を阻害する12アミノ酸長)
2.ペプチドB*−SRELYYPLRANL(WがRによって置き換えられた12アミノ酸長、細胞間接着を変化させないが、いくらかの細胞性効果を有する).
3.ペプチドC−SWELYYPL(7アミノ酸長、細胞間接着を阻害する、Aと比較して低い効果).
4.E−カドヘリン中和抗体(SHE78.7クローン、Invitrogen 13−5700から入手可能)
5.実験用ビヒクル対照(水)。
多能性ヒトiPS細胞の培養
ヒトiPS細胞(hiPSC)は接着フィーダー不含培養条件下で増殖された。望まれない残存マウス線維芽細胞フィーダー細胞を除去するためにすべての細胞を最少で2継代数フィーダー不含培養物として増殖させた。細胞はMTesR完全培地(Stem Cell Technologies)で培養された。細胞はMatrigel(商標)(BD Biosciences 356234)コート組織培養グレードプレートで培養された。Matrigel処置プレートは予め希釈したMatrigel(商標)(DMEM/F12培地中1:100)でコートされ、使用前に室温でインキュベートされた。培地は24時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンスに応じて継代された。細胞はトリプシン−EDTAを使用して解離された。
ヒトiPSCを既に記載のとおり分化させた。ペプチドA、BまたはCは培地に最終濃度1mMで補充され、E−カドヘリン中和抗体は培地に2μg/mlで毎日6〜7日間補充された。当量の水がビヒクル対照として培養物に加えられた。
下に記載の結果は図9および10に例示される。
ヒトiPS細胞を分化の誘導前に標準的接着フィーダー不含培養条件下で増殖させた。図9は、(A)ペプチドA、(B)E−カドヘリン中和抗体、(C)ペプチドC、(D)ペプチドBおよび(E)対照を補充された培地において48時間増殖させた細胞の典型的培養形態を示している。位相差顕微鏡画像は、ペプチドAおよびE−カドヘリン中和抗体と共に培養された場合に細胞間接着の喪失が大部分の細胞(>85%)において達成されることを示しており(それぞれ図9AおよびBに示す)、hiPSCの典型的な緻密な「コロニー」形態と比較して細胞は、ほとんどは単一の細胞であるようである(図9Eに示す)。これらの結果から、ペプチドBの存在下で培養された細胞が、細胞間接着の喪失を伴うことなくhiPSCの緻密な形態を保持している(図9Dに示す)ことは明らかである。hiPSCの培養物は、ペプチドCの存在下でおよそ50〜60%の細胞集団において細胞間接着の喪失を示しているが、しかしこれは、ペプチドAまたは中和抗体と比較して顕著に低い。
分化を開始させるために、コンフルエント未分化細胞は解離され、E−カドヘリン阻害物質を補充された/されていない分化培地で低密度でゼラチンコートウエル中に7日間播種された。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は7日目に回収され、神経前駆体細胞マーカー、ネスチンの免疫蛍光分析が実施された(図10)。
[表2−1]
ヒトE-カドヘリン配列
配列番号23 DNA配列 − NCBI NM_00436D
[表2−2]
配列番号23続き
[表2−3]
配列番号23続き
[表3−1]
配列番号4 タンパク質配列 − NCBI AAY68225
[表3−2]
配列番号4続き
[表4−1]
マウスE-カドヘリン
配列番号25 DNA配列 − NCBI BC098501由来
[表4−2]
配列番号25続き
[表5]
配列番号24 タンパク質配列 − NCBI NP_033994由来
[表6−1]
配列番号5 Slug−ヒト
配列番号22 Slug−マウス
配列番号6 Snail−ヒト
配列番号7 Snail−マウス
配列番号8 SIP1−ヒト
[表6−2]
配列番号8続き
[表7]
配列番号9 SIP1−マウス
[表8]
配列番号10 E2A-ヒト-アミノ酸配列
[表9−1]
配列番号11 E2A-ヒト-DNAコード配列
[表9−2]
配列番号11続き
[表9−3]
配列番号11続き
[表10−1]
配列番号12 E2A-マウス-アミノ酸配列
[表10−2]
配列番号12続き
[表11−1]
配列番号13 E2A-マウス-DNAコード配列
[表11−2]
配列番号13続き
[表12]
[表13]
Claims (31)
- 神経前駆細胞を産生する方法であって、
・ 神経潜在性を有する細胞の集団にE−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ;
・ 細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ;および
神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ
を含む、方法。 - 治療用途のためにin vitroで細胞を適応させる方法であって、
・ 神経潜在性を有する細胞の集団にE−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ;
・ 細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ;
・ 神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ;
・ 場合により、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップ;および
神経前駆細胞または神経系細胞を患者への投与のために好適な組成物中に配合するステップ
を含む方法。 - 神経潜在性を有する細胞が幹細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 幹細胞が、複能性細胞;全能性細胞;および多能性細胞からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 幹細胞が、胚性幹細胞;臍帯血幹細胞;間葉幹細胞;および人工多能性幹細胞(iPSC)からなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 幹細胞がヒト胚の破壊を必要とせずに産生されるヒト胚性幹細胞株の細胞である、請求項3に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質がE−カドヘリン活性の外来性阻害物質である、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の外来性阻害物質が細胞培養培地に供給される、請求項7に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドSWELYYPLRANL(配列番号1)およびペプチドSWELYYPL(配列番号26)からなる群から選択される、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドSWELYYPLRANL(配列番号1)、またはペプチドSWELYYPL(配列番号26)を含む、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質が、E−カドヘリン中和抗体;E−カドヘリンHAVドメインの阻害物質;トリプトファン2結合部位の阻害物質;E−カドヘリン中和アプタマー;E−カドヘリンを阻害するRNAi分子;Slug;Snail;SIP1;E2A;Trp156を含むペプチド;およびアミノ酸配列CHAVC(配列番号3)を含むペプチドからなる群から選択される、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質がE−カドヘリン活性の内在性阻害物質である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質が、E−カドヘリン中和抗体;E−カドヘリンHAVドメインの阻害物質;トリプトファン2結合部位の阻害物質;およびアミノ酸配列CHAVC(配列番号3)を含むペプチドからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- E−カドヘリン中和抗体がSHE78.7である、請求項13に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質が細胞ストレスの誘導より前に細胞に供給される、請求項1〜14の何れか一項に記載の方法。
- E−カドヘリン活性の阻害物質が細胞ストレスの誘導と同時に細胞に供給される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 生理学的ストレスを誘導する手段が、培養細胞に有益である薬剤の使用中止;細胞の集団が曝される温度の上昇;細胞の集団が増殖する培地のpHの上昇または低下;および細胞の集団への細胞傷害性薬剤の供給からなる群から選択される、請求項1〜16の何れか一項に記載の方法。
- 細胞ストレスが、細胞集団に供給される血清を培地から取り除くことによって誘導される、請求項17に記載の方法。
- 細胞ストレスが、細胞の集団の間で細胞死を引き起こす、請求項1〜18の何れか一項に記載の方法。
- 産生された神経前駆細胞がネスチンを発現する、請求項1〜19の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から20の何れか一項に記載の方法によって産生される、神経前駆細胞。
- 請求項1から20の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、および神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、神経系細胞を産生する方法。
- 請求項22に記載の方法によって産生される、神経系細胞。
- 請求項1から20の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、およびグリア細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、グリア細胞を産生する方法。
- 請求項24に記載の方法によって産生される、グリア細胞。
- 請求項1から18の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、および神経細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、神経細胞を産生する方法。
- 請求項26の方法によって産生される、神経細胞。
- ・ E−カドヘリン活性の阻害物質;
・ 血清不含細胞培地;および
・ 血清または血清代替組成物
を含む、キット。 - E−カドヘリン活性の阻害物質が請求項9から13の何れかで言及したものである、請求項28に記載のキット。
- およそ450μMからおよそ1.1mMの間の濃度でE−カドヘリン活性の阻害物質を含む、細胞培養培地。
- E−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドSWELYYPLRANL(配列番号1)を含む、請求項30に記載の細胞培養培地。
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