KR20220041206A

KR20220041206A - 종양발생을 억제하면서 유도 만능 줄기 세포를 생성하기 위한 pcbp1의 용도

Info

Publication number: KR20220041206A
Application number: KR1020227007418A
Authority: KR
Inventors: 노만 젠난 라이; 알베르토 무라트 크로치; 마이클 조셉 칼린; 주니어. 비달 펠릭스 드 라 크루즈; 웨빈 탄
Original assignee: 아이벡스 바이오사이언시스, 엘엘씨
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2022-03-31
Also published as: CA3149640A1; EP4010471A2; IL290162A; CN114402072A; AU2020325311A1; EP4010471A4; WO2021026488A2; JP2022544117A; US20220228126A1; WO2021026488A3

Abstract

본 개시내용은 암 또는 종양형성을 유도하지 않고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성하기 위한 유전자 치료법을 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법은 암 바이오마커 및 수반되는 종양발생의 발현을 억제하는 PCBP1과 같은 항-종양 유전자 및 전사 인자를 함유하는 벡터 및 플라스미드를 사용한다.

Description

종양발생을 억제하면서 유도 만능 줄기 세포를 생성하기 위한 PCBP1의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 8월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/883,815호의 이익을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

전자 제출된 텍스트 파일의 설명

본원과 함께 전자 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록 내 컴퓨터로 판독 가능한 포맷 사본 (파일명: IBEX_002_06WO_SeqList_ST25.txt, 기록 날짜: 2020년 8월 7일) 파일 크기 7kb.

분야

본 개시내용은 종양발생을 억제하면서 만능 줄기 세포를 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 하나 이상의 줄기 세포 전사 인자 및/또는 PCBP1로 분화 세포를 형질도입하면 분화 세포로부터 iPSC의 형성을 초래하지만, PCBP1와 같은 항-종양유전자의 존재는 이러한 줄기 세포 전사 인자의 사용에 의해 야기될 수 있는 종양의 형성 및 암의 발달을 억제한다. 조성물은 시험관내, 생체내, 또는 원 위치에서 투여될 수 있다.

줄기 세포는 자가 재생 능력 및 다양한 체세포 유형으로 분화할 수 있는 능력에 의해 정의된다. 증식, 효능, 및 세포 운명 결정에 관한 세포 프로그램은 전사 인자 발현 및/또는 활성화를 조절하는 신호 전달 이벤트에 의해 매개될 수 있다.

줄기 세포는 다양한 질병, 부상 및 기타 건강-관련 상태를 이해하고 치료할 수 있는 엄청난 가능성을 가지고 있다. 아마도 인간 줄기 세포의 가장 중요한 잠재적 응용은 세포-기반 치료에 사용할 수 있는 세포와 조직을 생성하는 것이다. 오늘날, 기증된 기관과 조직은 병들거나 파괴된 조직을 대체하기 위해 자주 사용되지만, 이식 가능한 조직과 기관의 필요성은 사용 가능한 공급량을 훨씬 능가한다. 특정 세포 유형으로 분화하도록 지시된 줄기 세포는 황반 변성, 척추 손상, 뇌졸중, 화상, 심장 질환, 당뇨병, 골관절염, 및 류마티스 관절염을 포함하지만 이제 한정되지 않는 질병을 치료하기 위한 대체 세포 및 조직의 재생 가능한 공급원의 가능성을 제공한다.

새로운 세포-기반 치료의 가능성을 실현하기 위해서는 줄기 세포가 성공적인 분화, 이식 및 생착에 필요한 특성을 갖추도록 조작되어야 한다. 예를 들어, 이식 목적에 유용하기 위해, 줄기 세포는 광범위하게 증식하고 조직을 형성하기에 충분한 양의 세포를 생성하고, 원하는 세포 유형(들)으로 분화하고, 이식 후 수용자에서 생존하고, 이식 후 주변 조직에 통합되고, 수용자의 평생 동안 적절하게 기능하며, 면역 거부 반응을 피할 수 있도록 재생 가능해야 한다.

줄기 세포 치료법을 성공적으로 사용하는 데 있어 가장 큰 장애물 중 하나는 이러한 세포가 일단 이식되면 암이 될 수 있다는 것이다. 또한, 당해 분야에 공지된 줄기 세포 치료법은 성공적인 치료제를 만들기 위해 주입 또는 이식 전에 생체외 변형을 필요로 한다. 이것은 일반적으로 실험실에서 분리된 세포에 대해 수행되지만, 본 개시내용은 원 위치에서, 즉 기관에서 직접 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성하기 위한 접근 방식을 제공한다.

여기서, 유전자 치료법은 PCBP1, 이의 변이체, 또는 돌연변이체를 단독으로 또는 하나 이상의 전사 인자와 함께 체내 조직에 도입하여 줄기 세포의 형성을 유도하는데 사용된다.

본 개시내용은 PCBP1, 이의 변이체 또는 이의 돌연변이체의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 제공하고, 상기 만능 줄기 세포의 유도는 종양형성(tumorigenesis)을 동반하지 않는다. 또한, 본 개시내용은 PCBP1, 이의 변이체, 또는 돌연변이체 및 하나 이상의 다른 전사 인자의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법을 제공하고, 상기 만능 중기 세포의 유도는 종양형성을 동반하지 않는다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생체외에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 원 위치에서 수행된다.

일부 구현예에서 상기 분화 세포는 포유류이다. 일부 구현예에서 상기 포유류 세포는 인간이다. 일부 구현예에서 상기 포유류 세포는 기관 세포, 조직 세포, 또는 혈액 세포이다. 일부 구현예에서 조직 세포는 망막 세포이다.

일부 구현예에서, 상기 벡터는 PCBP1, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 벡터는 PCBP1, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체, 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 벡터는 PCBP1, 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체, 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체, SOX2, OCT4, 및 KTL4의 핵산 서열을 포함한다.

도 1a-c는 본 개시내용에 유용한 벡터의 예를 도시한다. 치료유전자 벡터는 PCBP1 및 줄기 세포 유도 전사 인자 (Sox2, Oct4, 및 Klf4)를 암호화할 수 있다. 이 벡터 시스템은 인간 신장 인자-1-알파 (EFP 프로모터를 사용하여 절단가능한 단백질 세그먼트를 통해 녹색 형광 단백질 (GFP)과 융합된 유전자의 발현을 유도한다. 그런 다음, 이 LVV 벡터 시스템은 CF로 형질도입되었다. 실시예 1에서 입증된 바와 같이, PCBP1은 종양형성에 관여하는 다운스트림 단백질인 PRL3를 하향 조절하고 비활성화하며, 따라서 종양발생 부작용을 감소시키는 임상 적용을 위한 유용한 안전 장치를 제공한다. TRE: 테트라사이클린 (서열 번호: 5); rtTA: 역 테트라사이클린-조절 전이 활성제 (reverse　tetracycline-controlled　trans　activator); tTS: 전사 사일런서 (transcription silencer)는 Tet 억제 단백질 (TetR)과 KRAB 사일런싱 도메인의 융합이다. tTS는 1세대 Tet-On 유도 발현 시스템에서 기초 발현을 유의하게 낮추는데 사용될 수 있다. 독시사이클린이 없는 경우, tTS는 TRE 프로모터 내의 tet-오퍼레이터 서열에 결합하여 유전자 발현을 억제한다. 독시사이클린을 첨가하면, tTS는 구조적 변화를 일으켜 프로모터에서 방출되어 Tet-On 전이활성제로 대체된다.
도 2a는 시험관내에서 치료 유전자로 형질감염시킨 후 망막 세포 (ARPE-19, ATCC™) 배양물에서 GFP⁺ 세포 계수의 비교를 나타낸다. 모든 GFP 양성 세포수는 10³ 세포를 기준으로 추정된다.
도 2b는 녹색 형광 단백질을 공동 발현하는 치료 유전자 벡터에 의해 형질감염되고 형광 현미경 (10x)으로 모니터링되는 망막 세포를 도시한다. 결과 (사진)은 PCBP1-GFP, Oct4, Sox2, 및 Klf4가 치료 벡터 시스템에 의해 성공적으로 전달되었고 형질감염된 세포에서 공동 발현되었음을 나타낸다.
도 3은 유전자 치료법 (GT) 벡터에 의해 형질감염된 세포와 GT가 없는 대조군 세포 간의 PCBP1의 mRNA 수준을 비교하기 위한 실시간 PCR 결과를 나타낸다. GT 형질감염 세포의 PCBP1 mRNA 수준은 대조군 세포보다 3배 이상 더 높다 (ddCt = 3.37).
도 4a-b는 인간 CRX-1에 대한 항체에 의한 망막 줄기 세포의 바이오마커의 면역조직화학 염색을 도시한다 (적색 형광 빛 참조). 이는 분화된 망막 세포에 PCBP1과 SOX2, OCT4, KLF4 전사 인자를 포함하는 벡터를 형질도입한 후 일부 세포가 망막 줄기 세포-유사 세포로 변했음을 의미한다.
도 5a-d는 인간 SOX2에 대한 항체에 의한 망막 줄기 세포의 바이오마커의 면역조직화학 염색을 도시한다 (적색 형광 빛). 다중 염색이 수행되었다. 먼저, CRX의 망막 줄기 세포 바이오마커를 검출하였다. 그 다음, PCBP1-벡터에 의해 형질도입된 세포 및 벡터 SOX 2에 의해 형질도입된 세포를 염색하여 이들 세포가 CRX 발현과 중첩됨을 나타내었다. 이는 분화된 세포에 PCBP1과 SOX2, OCT4, KLF4 전사 인자를 포함하는 벡터를 형질도입한 후 일부 세포가 망막 줄기 세포-유사 세포로 변했음을 의미한다.
도 6a-b는 대조군 (GFP 단독) 또는 PCBP1-GFP로 형질감염된 피부암 세포를 도시한다 (도 6a). 암 세포의 발암 인자인 PRL-3의 단백질 수준을 하향 조절할 수 있는 PCBP1 및 이의 돌연변이체로 처리된 피부암 세포에 대한 웨스턴 블롯 분석. 레인 1: GFP 단독; 레인 2: mPCBP1_1로 하나의 돌연변이가 있는 PCBP1; 레인 3: wPCBP1_0와 같은 PCBP1 와이드형; 레인 4: mPCBP1_2로 2개의 돌연변이가 있는 PCBP1. 베타 액틴은 이 분석에서 하우스-키핑 단백질의 대조군 세트로 사용되었다.
도 7은 암 세포에서 PCBP1 및 PRL-3 둘 모두의 발현 수준을 검출하기 위한 실시간 qRT-PCR 반응을 도시한다. 왼쪽 패널은 PCBP1이 처리군에서 높게 발현되었음을 나타낸다. 오른쪽 패널은 PRL-3이 암세포의 치료군에서 유의하게 하향 조절되었음을 보여준다. 처리되지 않은 군은 GFP 벡터에 의해서만 형질도입되었다.
도 8은 실험 설계의 대표적인 개략도를 도시한다.
도 9는 안구의 망막층으로 약물을 전달하기 위한 대표적인 전달 방법을 도시한다 (적색 사각형). Park et al. (2015) 참조.
도 10은 황반 변성 질환에 대한 유전자 치료 후 시력을 테스트하기 위한 생체내 전임상 연구의 예를 도시한다. Lu et al. (2009) 참조.
도 11a-b는 PCBP1이 전이 및 암과 관련된 바이오마커의 발현을 억제한다는 것을 입증하기 위한 대표적인 실험 설계를 도시한다 (예를 들어, PRL-3/STAT3).
도 12는 PCBP1이 PRL-3/STAT3 발현을 억제하는 추정 메커니즘을 도시한다.
도 13a-b는 본 개시내용의 벡터로 심장 섬유아세포 (CF)의 형질감염으로부터의 결과를 나타낸다. 도 13a는 PCBP1 및 GFP를 발현하는 LVV로 형질 도입된 CF를 도시한다. GFP 발현은 형광 현미경 (x10)에 의해 검출된다. (a): PCBP1-IRES-GFP (b): PCBP1-IRES-GFP 및 Sox2/Oct4/Klf4 (P+SOK) 공동 형질도입 (c):대조군으로서 GFP가 없는 LV 벡터; (d) GFP 벡터 대조군. 형광 현미경 하에서 GFP를 검출하여 형질도입된 세포의 약 80% 이상으로 형질도입 효율을 계수하였다. 도 13b는 qRT-PCR에 의한 PCBP1-IRES-GFP 벡터에 의해 형질도입된 CF와 대조군 (형질감염 없음) 간의 PCBP1 mRNA 수준의 비교를 도시한다. PCBP1 발현은 처리군에서 99배 보다 더 높다 (ddCt=99.9); p<0.05.
도 14a-f는 심장 줄기 세포 바이오마커에 대한 면역조직화학 염색을 도시한다. CF는 인간 c-Kit에 대한 항체를 사용하여 형질도입되고 표지되었고 NorthernLights-접합 2차 항체로 검출되었다 (A, B). 적색 형광 필터 (A) 및 명시야 (B)하에 형질도입 대조군 그룹 없음; (C, D) 적색 형광 필터 (C) 및 명시야 (D) 하에 PCBP1-IRES-GFP (c-Kit 염색); 적색 형광 필터 (E) 및 명시야 (F) 하에 관찰된 PCBP1-IRES-GFP 및 전사 인자 Sox2, Oct4, Klf4 (P+SOK) 공동 형질도입 군 (c-Kit 염색). 세부 사항을 위해 확대된 관심 영역을 보여주는 삽화. 스케일 바: 100μm.
도 15는 iPSC 유도 후 심장 바이오마커의 mRNA 발현을 검출하기 위한 실시간 RT-PCR 반응을 도시한다. 위에서 아래로: COL1a1, c-Kit, TNNT2. 좌측 열: LVV PCBP1-GFP 및 Sox2/Oct4/Klf4 (P + SOK) 공동 형질도입; 오른쪽 열: 형질도입 대조군 없음. *p<0.05.
도 16은 심근경색의 뮤린 모델에서 본 개시내용의 시스템을 테스트하기 위한 예시적인 동물 모델을 도시한다.
도 17a-b: MCF-7 및 MCF-7 (CSC) (BCSC)에서 CD44 및 CD24의 유동 세포 분석 검출. A: CD44 염색. B: CD24 염색.
도 18a-d: 이중-색상 산점도 (CD44 대 CD24)에 의해 확인된 바이오마커에 대한 FACS 분석. 이중-색상 산점도를 통한 MCF-7 및 MCF-7 (CSC)에서 CD24 및 CD44의 유동 세포 분석 검출. A: MCF-7 (CSC)의 동형 대조군, B: MCF-7 (CSC)의 CD44-PE & CD24-APC 염색, C: MCF-7의 동형 대조군, D: MCF-7의 CD44-PE & CD24-APC 염색. 이들 데이터는 추가 명확성을 위해 이중-색상 산점도로 분석한 도 17과 동일하다.
도 19a-d: MCF-7 (CSC) 및 MDA-MB-231에서 CD133의 유동 세포 분석 검출. A: 동형 대조군, B: MCF-7 (CSC), C: MDA-MB-231, D: 병합. 세포를 항-인간 CD133 APC-접합 모노클로날 항체 (10uL/10⁶　세포)로 염색하여 수득하였다. 비-특이적 항체가 동형 대조군으로 사용되었다.
도 20: TGF-베타의 유무과 관계없이 처리된 MCF-7 및 U87-MG에서 CD133, CD44 및 CD24의 웨스턴 블롯 (WB) 분석. 레인 1: MCF-7 (TGF-베타 없음), 레인 2: MCF-7 (TGF-베타 포함); 레인 3: U87-MG (TGF-베타 없음), 레인 4: U87-MG (TGF-베타 포함).
도 21a-c: GAPDH에 의해 정규화되고 시각화된 웨스턴 블롯 데이터. A): 웨스턴 블롯 (WB)의 GAPDH-정규화 신호는 선형 눈금으로 표시된다. B) 정규화된 CD24 및 CD44 신호 순 변화 [TGF-베타 (+) - TGF- 베타 (-)]. C) WB 신호 분석 요약 표. 표에는 WB 분석의 신호를 호환가능한 데이터-세트로 계산하여 변환한 데이터가 포함되어 있으며, 셀에 TGF-베타가 기본 세트인 "1"이 포함되지 않은 경우 더 높은 숫자 (굵은 텍스트)는 상향 조절되고 "1" (기준선) 아래의 숫자는 하향 조절 (기울임꼴 텍스트)되는 것으로 간주된다.
도 22a-c: PCBP1-GT로 처리한 후 암 줄기 세포에서 PCBP1 전사체의 qRT-PCR 분석. 표시된 작제물로 형질감염된 U87-MG (CSC) (A), DU-145 (CSC) (B), 및 MCF-7 (CSC) (C) 세포에서 PCBP1 mRNA 발현의 배수 변화. y축의 점선은 1.5배 차이를 나타내며, 일반적으로 통계적 유의성을 고려한 수준을 나타낸다. 분자 검정 정량화의 통계적 분석은 RStudio 또는 JMP에 의한 양측 스튜던트 t　테스트를 사용하여 분석되었다. 모든 유의성은 p　< 0.05로 정의되었다.
도 23a-c: 표시된 유전자 작제물으로 형질감염된 DU-145, MCF-7, U87-MG에서 CD133, CD44 및 CD24의 웨스턴 블롯 분석. 패널 A: U87-MG (CSC); 패널 B: DU-145 (CSC); 패널 C: MCF-7 (CSC).
도 24a-c: 웨스턴 블롯에 의한 CD44 및 CD133의 측정. 웨스턴 블롯 신호는 백터 액틴에 대해 정규화되었다. 패널 A는 CD 44 발현을 도시한다. 패널 B는 CD133 발현을 도시한다. 요약 표 (C)는 LV-GFP로 형질감염된 세포에 대해 정규화된 신호로 데이터를 도시한다. 증가된 발현 수준은 굵게 표시되고 낮은 발현 수준은 기울임꼴로 표시된다.
도 25: 니클로사미드는 NF-kB를 표적으로 하고 반응성 산소종 (ROS) 수준을 향상시킨다. 니클로사미드는 TNFα-유도된 IB 인산화, p65의 전위, 및 NF-kB 조절 유전자의 발현을 차단한다. 반대로, 니클로사미드는 세포 내 ROS 함량을 향상시킨다.
도 26: 니클로사미드 (1μM, 2μM, 5μM 및 10μM)로 처리된 U87-MG (CSC)의 웨스턴 블롯 분석. 세포를 표시된 농도의 니클로사미드와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다 (동일 부피의 DMSO는 비히클 대조군으로 제공됨).
도 27a-c: A) 베타 액틴에 대해 정규화된 c-Myc 신호는 선형 눈금으로 도시한다. B) 정규화된 c-Myc 신호는 순 변화로 도시한다 (즉, DMSO 신호를 뺀 상태). C) 상향조절이 굵게 (>0) 표시되고 하향조절이 기울임꼴로 표시된 WB 신호 분석의 요약표.
도 28a-b: DMSA 또는 10 μM 니클로사미드로 처리된 U87-MG(CSC) 세포에서 c-Myc 및 BCL-2 발현의 qRT-PCR 정량화. 계산을 위해: DMSO를 패널 A의 기준선으로 이용하였다. 모의-형질감염을 패널 B의 기준선으로 이용하였다. 점선은 통계적 유의성에 대한 벤치마크로 간주되는 y축의 1.5배 변화를 표시한다.
도 29a-b: DMSA 또는 10 μM 니클로사미드로 처리된 DU-145 (CSC) 세포에서 c-Myc 및 BCL-2 발현의 qRT-PCR 정량화. 계산을 위해: DMSO를 패널 A의 기준선으로 이용하였다. 모의-형질감염을 패널 B의 기준선으로 이용하였다. 점선은 통계적 유의성에 대한 벤치마크로 간주되는 y축의 1.5배 변화를 표시한다.
도 30a-b. DMSA 또는 10 μM 니클로사미드로 처리된 DU-145 (CSC) 세포에서 c-Myc 및 BCL-2 발현의 qRT-PCR 정량화. 계산을 위해: DMSO를 패널 A의 기준선으로 이용하였다. 모의-형질감염을 패널 B의 기준선으로 이용하였다. 점선은 통계적 유의성에 대한 벤치마크로 간주되는 y축의 1.5배 변화를 표시한다.

연령-관련 황반 변성 (AMD)은 노인들에게 비가역적 실명을 초래하는 주요 원인들 중 하나이다. 신생혈관성 AMD (습성 AMD)의 관리가 비약적으로 발전하였지만, 비-신생혈관성 AMD (위축성, 또는 건성 AMD) 및 심각한 안구 건조를 동반한 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 질환에 대한 효과적인 치료법은 아직 존재하지 않는다.

줄기 세포 치료법의 임상 시험은 망막 색소 상피 (RPE) 세포 이식에 대해 유망한 전망을 보여주었다. 예를 들어, 2011년, Advanced Cell Technology (Santa Monica, CA, USA) 는 건성 AMD 및 스타가르트병 환자에서 hESC-유래 RPE 세포 이식의 효능을 설명하기 위해 I/II 단계 임상 시험을 수행하였다. 그 후, Schwartz et al. (2016)은 건성 AMD 또는 스타가르트병 환자 18명을 대상으로 한 2개의 I/II 단계 시험 결과를 공개하였다. 4년 후, 치료 받은 환자 중 절반 이상이 시력의 지속적인 개선을 경험하였으며 가능한 세포 생착의 증거를 입증하였다. 그러나, 이식 기술, 면역 거부 반응, 이종-비함유 성분을 포함한 주요 문제들은 여전히 더 조사되고 개선되어야 한다. 또한, 세포의 원치 않는 면역원성을 유발하거나 환자를 특정 병원체에 노출시킬 수 있는 시알산 또는 Neu5Gc 와 같은 인자를 전달할 수 있는 인간 또는 동물-유래 줄기 세포 성분의 사용을 고려할 필요가 있다. 따라서, iPSC 기술에 의한 줄기 세포 치료와 유전자 발현의 망막 미세 환경 조절은 건성 AMD 치료에 대한 잠재적인 새로운 접근 방식을 나타낸다.

iPSC를 생성하는 기술은 Oct4, Sox2, cMyc, 또는 Klf4와 같은 단백질을 유도하는 줄기 세포의 외인성 투여 없이 숙주 (또는 환자) 분화 조직을 줄기 세포-유사 세포로 직접 유도할 수 있는 새로운 기회를 제공한다. 이러한 전사 인자는 iPSC를 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 종양발생을 유발할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 조성물 방법은 종양발생을 감소시키거나 예방하기 위해 PCBP1과 같은 항-종양유전자를 사용한 세포 형질도입을 포함한다.

이론에 얽매이지 않고, PCBP1 자체가 분화 세포를 줄기 세포로 형질전환시키는 역할을 할 수 있기 때문에 PCBP1은 본 개시내용의 벡터에서 c-Myc를 대신할 수 있다. PCBP1는 다른 전사 인자와 함께, 또는 단독으로 세포를 줄기 세포로 형질전환할 수 있다. 중요하게도, PCBP1는 c-Myc에서 관찰된 것과 동일한 종양발생을 나타내지 않는다.

이러한 두 가지 진보된 특징 (예를 들어, 줄기 세포-유도제 또는 줄기 세포 발달 유지에 관여하는 전사 인자 및 PCBP1)은 유전자 치료용 벡터 시스템에 통합되어 질환의 치료를 위해 세포를 줄기 세포-유사 세포로 직접 전환을 유도한다. 이러한 기능은 줄기 세포 발달 동안 활성화될 수 있는 종양형성 경로를 포함할 가능성을 최소화한다.

폴리피리미딘 관-결합 단백질 1 (PCBP1)

일부 양태에서, 본 개시내용은 종양형성을 억제하거나 지연시킬 수 있는 전사 인자 폴리(rC)-결합 단백질 1 (PCBP1, 또한 hnRNP-E1 및 αCP1로 알려져 있음)을 함유하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, PCBP1는 포유류 PCBP1이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 인간 PCBP1, 이의 단편, 또는 변이체이다.

일부 구현예에서, PCBP1는 하나 이상의 암 바이오마커의 발현을 변경한다. 일부 구현예에서, 암 바이오마커는 유방암 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 암 바이오마커는 전립선암 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 암 바이오마커는 폐암 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 암 바이오마커의 발현이 증가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 암 바이오마커의 발현이 감소된다. 일부 구현예에서, 암 바이오마커는 전이와 관련된다. 일부 구현예에서, 암 바이오마커는 PRL-3, STAT3, CD44 변이체, CD133, CD24, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, HER2, CA27, CA29, CA25, CEA, CA125, Ki-67, ERα, 사이클린 (Cyclin) D1, 사이클린 E, ERβ, PSA, PCA3, AR-V7, E-카데린, 및 비멘틴을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 작제물로 암 세포의 형질도입은 CD44의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 작제물로 암 세포의 형질도입은 CD133의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, PCBP1는 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 1의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 1의 전장 (full-length) 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 1의 핵산 서열의 단편이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 1의 핵산 서열의 변이체이다. 이론에 얽매이지 않고, PCBP1 내의 각각의 KH 도메인은 상이한 단백질의 mRNA에 결합하는 것으로 나타났으며, 하나 이상의 KH 도메인의 사용은 주어진 단백질의 번역을 선택적으로 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, PCBP1 핵산은 모든 3개의 K-상동성 (KH) 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, PCPB1 핵산은 2개의 KH 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, PCPB1 핵산은 하나의 KH 도메인을 암호화한다.

추가로, 핵 위치화 신호에서의 돌연변이는 PCBP1이 핵 내로 전위하는 능력을 변경하고, 이에 따라 이후의 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, PCBP1는 하나 또는 2개의 핵 위치화 신호에 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 또는 2개의 핵 위치화 신호에서의 변화는 PCBP1이 핵 내로 전위하는 능력을 억제한다.

인산화는 또한 PCBP1의 활성에서 역할을 담당한다 (예를 들어, 인산화되지 않은 PCBP1은 활성이 부족할 수 있다). 일부 구현예에서, PCBP1 뉴클레오티드 서열은 PCBP1 폴리펩타이드가 인산화되는 능력에 영향을 미치는 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, PCBP1 뉴클레오티드 서열은 PCBP1 폴리펩타이드 인산화를 방지한다. 일부 구현예에서, 인산화되지 않은 PCBP1 또는 완전히 인산화되지 않은 PCBP1 폴리펩타이드는 야생형 수준에서 활성이 아니다.

일부 구현예에서, PCBP1 뉴클레오티드 서열은 야생형 PCBP1 (서열 번호: 1) 대비 점 돌연변이 (point mutation)를 함유한다. 일부 구현예에서, PCPB1 뉴클레오티드 서열은 인산화에 영향을 미치는 점 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, PCBP1 뉴클레오티드 서열은 핵막 전위에 영향을 미칠 수 있는 돌연변이(들)을 함유한다. 일부 구현예에서, 점 돌연변이는 G13A, T299C, T299A, G326A, G527A, C652T, C688T, G781T, G814T, C947T, G1033C, C1034T, 또는 G1048C를 포함하는 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 PCBP1 (서열 번호: 1)의 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1의 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 핵산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 1 내지 20개의 핵산이 치환된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)의 핵산 서열과 비교하여 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 핵산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 핵산 결실을 함유한다.

일부 구현예에서, 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)와 비교하여 1 내지 20개의 핵산이 결실된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)의 핵산 서열과 비교하여 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 핵산 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)의 핵산 서열과 비교하여 1 내지 10개의 핵산이 어느 한 말단에서 결실된다. 일부 구현예에서, 고유 PCBP1의 핵산 서열과 비교하여 1 내지 10개의 핵산이 양 말단으로부터 결실된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 핵산 서열은 고유 PCBP1의 핵산 서열과 약 70% 내지 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 핵산 서열은 고유 PCBP1의 핵산 서열과 적어도 약 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 핵산 서열은 고유 PCBP1 (예를 들어, 서열 번호: 1)의 핵산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90% 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하다. 백분율 동일성은 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/에서 제공하는 얼라인먼트 프로그램 EMBOSS Needle 을 사용하여 계산할 수 있다.

일부 구현예에서, PCBP1는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 2의 전장 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 2의 아미노산 서열의 단편이다. 일부 구현예에서, PCB1는 서열 번호: 2의 아미노산 서열의 변이체이다. 일부 구현예에서, PCBP1는 서열 번호: 2의 아미노산 서열의 기능적 단편 또는 변이체이다. 일부 구현예에서, PCBP1 폴리펩타이드는 모든 3개의 K-상동성 (KH) 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, PCPB1 폴리펩타이드는 2개의 KH 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, PCPB1 폴리펩타이드는 하나의 KH 도메인을 함유한다.

일부 구현예에서, PCBP1 폴리펩타이드 서열은 야생형 PCBP1 (서열 번호: 2) 대비 아미노산 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, PCPB1 폴리펩타이드 서열은 인산화에 영향을 미치는 아미노산 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 V5M, L100P, L100Q, C109Y, G176E, P218S, S223L, D261Y, A272S, A316V, A345P, A345V, 또는 E350Q를 포함하는 군으로부터 선택되며, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 PCBP1 (서열 번호: 2)의 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 1 내지 20개의 아미노산이 치환된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 비교하여 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 아미노산 치환을 함유한다.

일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 치료 펩타이드 제제의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 결실을 함유한다. 일부 구현예에서, 고유 단백질 제제의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 20개의 아미노산이 결실된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체는 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 비교하여 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10개의 아미노산 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 10개의 아미노산이 어느 한 말단에서 결실된다. 일부 구현예에서, 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 10개의 아미노산이 양 말단으로부터 결실된다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1의 모든 또는 대부분의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1 대비 감소하거나 변경된 활성을 갖는다.

일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1의 모든 또는 대부분의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1의 모든 또는 대부분의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1과 비교하여 감소하거나 변경된 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 모사체, 유사체, 유도체, 변이체, 또는 돌연변이체의 아미노산 서열은 고유 PCBP1 (서열 번호: 2)의 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열과 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79% 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 약 99.2%, 약 99.3%, 약 99.4%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9% 동일하며 고유 PCBP1와 비교하여 감소하거나 변경된 활성을 갖는다. 백분율 동일성은 http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/에서 제공하는 얼라인먼트 프로그램 EMBOSS Needle 을 사용하여 계산할 수 있다. 페어식 얼라인먼트를 위해 하기 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다: 단백질 가중치 매트릭스 = BLOSUM62; 갭 개방 = 10; 갭 연장 = 0.1.

전사 인자

전사 인자는 배반포의 내부 세포 괴 (inner cell mass)에서 파생된 배아 줄기 (ES) 세포가 외배엽, 중배엽, 및 내배엽의 세 가지 척추동물 배엽 모두의 줄기 또는 전구 세포로 분화되는 것을 촉진한다. 또한, 특정 전사 인자의 발현은 체세포를 다능성 상태로 재프로그래밍하기에 충분하다. 유도 만능 줄기 (iPSC) 세포는 ES 세포와 같이 신경 및 상피 줄시 세포와 같은 분화된 줄기 세포를 생성한다. 분화된 줄기 세포는 그들이 발견되는 조직의 세포를 보충하는 기능을 한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 전사 인자는 줄기 세포 유도와 관련된 것으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 전사 인자는 줄기 세포 재생 및/또는 다능성과 관련된 것으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 재생 및/또는 다능성과 관련된 하나 이상의 추가 전사 인자는 다음으로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다: 브라큐리 (Brachyury), FoxD3, GBX2, Max, NFkB1, Pax6, c-Jun, c-Maf, c-Myc, FoxF1, 구스코이드, Mef2c, NFkB2, PRDM14, FoxH1, HES-1, MIXL1, Oct-3/4, Rex-1/ZFP42, FoxO1/FKHR, HNF-3 알파/FoxA1, MTF2, OCT4, SALL1, C/EBP 알파, GATA-2, KLF2, Nanog, Otx2, SALL4, EOMES, GATA-3, KLF4, NFkB/IkB 활성제, p53, Smad1, FoxC2, Gata4 , KLF5, NFkB/IkB 억제제, Pax2, Smad1/5, Smad2, Smad 2/3, Smad 3, Smad 4, Smad 5, Smad 8, Snail, SOX15, SUZ12, UTF1, SOX17, SEMA 6A-1, WDR5, SOX2, SFRP1, WT1, SOX7, Tbx5, ZNF206, STAT 활성제, TBX6, ZNF281, STAT 억제제, TCF-3/E2A, Snail, STAT3 및 THAP11.=

일부 구현예에서, 전사 인자는 하나 이상의 종양발생 경로에 관여한다. 일부 구현예에서, 전사 인자의 과발현은 하나 이상의 종양발생 경로에 관여한다 (예를 들어, SOX2 과발현은 폐암 조직에서 설명되었다). 일부 구현예에서, 전사 인자의 발현 변화는 암의 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 암은 간암 또는 폐암이다.

다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적절한 전사 인자가 사용될 수 있다: ASCL2/Mash2, ASCL1/Mash1, CDX2, DNMT1, ELF3, Ets-1, FoxM1, FoxN1, 헤어리스 (Hairless), HNF-4, 알파/NR2A1, IRF6, MITF, Miz-1/ZBTB17, MSX1, MSX2, MYB, 뉴로게닌-3, NFATC1, NKX3.1, Nrf2, p53, p63/TP73L, Pax2, Pax3, Pax4, Pax6, RUNX1/CBFA2, RUNX2/CBFA1, RUNX3/CBFA3, Smad1, Smad1/5, Smad2, Smad2/3, Smad3, Smad4, Smad5, Smad7, Smad8, Smad9, Snail, SOX9, STAT 활성제, STAT 억제제, STAT1, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT6, SUZ12, TCF-3/E2A, TCF7/TCF1, 브라큐리, GATA-1, GATA-2, GATA-3, GATA-4, GATA-6, LMO2, LMO4, SCL/Tal1, AHR, 아이올로스 (Aiolos)/IKZF3, CDX4, CREB, DNMT3A, DNMT3B, EGR1, FoxO3, 헬리오스 (Helios), HES-1, HHEX, HIF-1 알파, HMGB1/HMG-1, HMGB3, 이카로스 (Ikaros), c-Jun, LMO2, LMO4, c-Maf, MafB, MEF2C, MYB, NFATC2, NFIL3/E4BP4, PITX2, PRDM16/MEL1, Prox1, PU.1/Spi-1, SALL4, SCL/Tal1, Spi-B, TSC22, HNF-3 알파/FoxA1, HNF-3 베타/FoxA2, ONECUT2/OC-2, TBX3, TBX5, TBX18, TCF-2/HNF-1 베타, PDX-1/IPF1, PTF1A, RFX6, EBF-1, EBF-2, EBF-3, ETV5, FoxC2, FoxF1, HMGA2, MYF-5, 미오카딘 (Myocardin), MyoD, 미오제닌 (Myogenin), PLZF, Twist-1, Twist-2, ATF2, Brg1, CSL, EMX2, FosB/G0S3, GLI-1, GLI-2, HOXB1, MCM2, MCM7, NeuroD1, NeuroD2, 뉴로게닌-1, 뉴로게닌-2, NKX2.2,, NKX6.1, Olig1, Olig2, Olig3, RCOR1/CoREST, SOX1, SOX2, SOX3, SOX5, SOX6, TCF-12/HTF4, ZIC1, ZIC3, EOMES, FoxD3, FoxH1, FoxO1/FKHR, GBX2, Goosecoid, KLF2, KLF4, KLF5, Max, MIXL1, MTF2, NFkB/IkB 활성제, NFkB/IkB 억제제, NFkB1, NFkB2, Oct-3/4, Otx2, PRDM14, Rex-1/ZFP42, SALL1, SOX7, SOX15, SOX17, SOX18, TBX6, THAP11, UTF1, WDR5, WT1, ZNF206, ZNF281, ATBF1/ZFHX3, HIPK1, HIPK2, PIAS2, PIAS3, TRIM21, TRIM32, WTX, ZMIZ1/Zimp10, Carm1, CBP, Cbx2, CHD1, CHD7, CTCF, DEK, MBD3, NCOA2, NCOA3PIWIL1/HIWI, PIWIL2, PIWIL4, RBBP4, SATB1, SIN3A, SMARCA5/SNF2H, TAF5L, ARA54, ATAD2, 베타-카테닌, Bcl-9, BTF3, CBFB, 사이클린 A1, 사이클린 A2, 사이클린 B1, 사이클린 B2, 사이클린 D3, DDX17, DDX5, IKK 알파, IKK 베타, LEDGF, LITAF, LXR 알파/NR1H3, MED4, Park7/DJ-1, PGC1 알파, Pygopus-1, Pygopus-2, RNF4, TACC3, 탄키라아제 1, 탄키라아제 억제제, TAZ/WWTR1, TORC1, TORC2, TORC3, TRRAP ,YAP1, ACLP, ATN1, BASP1, Bcl-6, CDP/CUTL1, CIS-1, Cited-2, COMMD1, CREG, CtBP1, DEPTOR/DEPDC6, FHL1, FHL2, FIH-1/HIF-1AN, GFI-1, 숙주 세포 인자 1/HCFC1, Hexim 1, 히스톤 탈아세틸화효소 2/HDAC2, 히스톤 탈아세틸화효소 8/HDAC8, ID1, ID2, IkB-알파, IkB-베타, IkB-엡실론, IRF2BP1, KAP1, Keap1, LCoR, NCOR1, NCOR2, p15INK4b/CDKN2B, p16INK4a / CDKN2A, p18INK4c/CDKN2C, PA2G4, 프로히비틴 2, SMURF2, SOCS-1, SOCS-2, SOCS-3, SOCS-4, SOCS-5, SOCS-6, SOCS-7/Nck/NAP4, TANK, TLE1, TLE2, TLE3, TMEM18, TMEM87A, ZBTB38, ZBTB7A/포케몬, ZFP90Oct4, Sox 2, Nodal, FGF, TGF-β, LIF, BMP4, KLF4, KLF2, Myc, LIN28A, TUBB, HAP90AB1, PELI1, SEMA6A, SLC7A5, RGMB, TUBB6, HSPA4, SFRP1, LRRN1, PRDM14, C/EBP 알파, EOMES, 및 Nanog, 또는 이의 단편. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 전사 인자는 SOX2, Oct4, 및/또는 Klf4 또는 이의 단편 또는 변이체이다.

벡터 및 플라스미드

표적 조직 또는 세포에 대한 치료 유전자를 효율적으로 전달하는 것은 성공적인 유전자 치료법에 있어서 가장 유의한 장애물이다. 네이키드 DNA는 식균 면역 세포 또는 세포외 뉴클레아제에 의해 생체내에서 신속히 제거되거나 분해되기므로, 트랜스유전자를 보호하는 수단이 요망될 수 있다. 또한, 불량한 자발적인 DNA 흡수 효율로 인해, 조직 또는 세포 진입을 일으키기 위한 비히클도 요구된다. 따라서, DNA는 보통 관심 유전자를 효과적으로 보호하고 이의 조직 또는 세포 진입을 매개하기 위해 벡터로 일반적으로 알려져있는 일부 유형의 유전자 전달 비히클과 조합된다.

유전자 전달 시스템은 비-생물학적(예를 들어, 플라스미드 DNA를 포유류 세포에 도입하는 화학적 및 물리적 접근) 또는 생물학적(예를 들어, 바이러스 및 박테리아)으로 분류할 수 있다. 비-바이러스성 유전자 전달 시스템에는 보통 플라스미드 DNA 상에서 운반되는 유전자의 전달이 관여된다. 이용되는 플라스미드는 일반적으로 포유류 세포에서 복제되지 않는다.

가장 일반적으로, 재조합 바이러스 또는 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체가 사용된다. 예를 들어, 바이러스는 실험실에서 변형되어 교정된 치료 DNA를 세포 내로 운반하는 벡터를 제공할 수 있고, 여기서 게놈 내로 통합되어 비정상적 유전자 발현을 변경하고 유전 질환을 교정할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 염색체외로 유지되어 일시적으로 발현될 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 바이러스성 벡터를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 유전자 치료법에서 사용될 수 있는 바이러스에는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 복제-적격 벡터, 백시니아 바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 비-바이러스성 벡터를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 박테리아 벡터를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자 치료 방법에는 네이키드 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA)를 주사하는 것이다. 이는 당업계에 공지된 임의의 적절한 수단을 사용하여 수행될 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 비-바이러스성 및 비-박테리아 벡터를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스성 및 비-박테리아 벡터는 진핵생물 벡터이다. 일부 구현예에서, 유전자 치료 방법은 CRISPR, TALEN, 또는 아연 집게 단백질 (zinc finger protein, ZFN)를 제공한다. 일부 구현예에서, 진핵생물 벡터는 트랜스포존 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존 시스템은 Tn5, CRISPR-관련, 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty), 또는 piggyBac 트랜스포존 시스템이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 나노입자를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 지질-기반 나노입자이다. 일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 고체 지질-나노입자 (SLN)이다. 일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 비-구조화된 지질 담체 (NLC)이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 중합체-기반 나노입자이다. 일부 구현예에서, 중합체-기반 나노입자는 나노스피어 또는 나노캡슐이다.

플라스미드 DNA-기반 벡터는 유전자 치료법에서 일반적으로 사용되며 큰 DNA 절편을 수용할 수 있고 유전자 전달 및 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 요소의 조작을 허용한다. 그 가장 기본 상태에서, 발현 플라스미드는 발현 카세트 및 백본을 함유한다. 발현 카세트는 관심 유전자 또는 유전자들 및 표적 세포에서의 발현을 위해 요구되는 임의의 조절 서열을 함유하는 전사 단위이다. 백본은 박테리아에서 플라스미드의 생산을 위해 요구되는 선별 마커 (예로 항생제 내성 유전자 또는 영양요구성 선택 유전자) 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 선별 마커 또는 종래의 복제 성분 (예를 들어, 미니서클, 자가-복제 미니서클, 미니스트링, 선형 DNA 등)을 포함하지 않는다.

임의의 적절한 플라스미드가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 대표적 플라스미드가 도 1에 개시되어 있다.

임의의 적절한 프로모터가 발현 카세트에서 유전자 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 조절 및/또는 유도성 프로모터는 임상 적용에서 요구될 수 있는 다양한 조건에 따라 원 위치에서 줄기 세포의 유도를 허용하므로 중요하다. 이러한 프로모터는 줄기 세포가 무한정 복제/유도되고 논-스톱으로 성장하는 것을 방지할 수 있다.

일부 구현예에서, 플라스미드는 레트로바이러스 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 바이러스 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 포유류 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 포유류 프로모터는 인간 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 또는 세포 특이적이다. 일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 표 1에 나열된 것들 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 망막 조직 또는 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조혈 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 조직 또는 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 폐 조직 또는 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 근육 조직 또는 세포에 특이적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 HIV-감염 세포에 대해 특이적이다.

일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 표 2에 나열된 것들 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터는 구성적이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 합성 프로모터이거나 인핸서 요소를 함유한다. 일부 구현예에서, 프 로모터는 하이브리드 프로모터이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 프로모터는 유전자의 조절 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Ef1a, CAG, sv40, CMV, RSV, Oct4, Rex1, Nanog, GANT2, VMD2, hIRBP, TET 프로모터, CAAT 박스, CG 박스, GT-1 모티프, I-박스, AT-풍부 서열, RBCS1, TRE3G, GAL1, Lap267, 라파마이신, CD11a, CD11b, CD18, 베타-글로빈 프로모터/LCR, 면역글로불린 프로모터, PEPCK 프로모터, 알부민 프로모터, hAAT, SPC, SP-A, MCK, VLC1, HIV-LTR, tTS (테트라사이클린 전사 사일런서 (silencer)), Tat/Rev-반응성 요소, Tat-유도성 요소, 및 FMR1를 포함하는 군으로부터 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, 플라스미드는 유전자 치료법을 통해 도입될 모든 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 항-종양유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 항-종양유전자 및 하나 이상의 전사 인자를 함유한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 하나의 플라스미드에 모든 원하는 유전자를 도입한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 플라스미드를 이용한다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 하나의 플라스미드 상에 있고 하나 이상의 전사 인자는 다른 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자 및 하나의 전사 인자는 하나의 플라스미드 상에 있고, 하나 이상의 전사 인자는 다른 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자 및 둘 이상의 전사 인자는 하나의 플라스미드 상에 있고 하나 이상의 전사 인자는 다른 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자 및 다른 전사 인자는 하나의 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자 및 3개의 다른 전사 인자가 하나의 플라스미드 상에 있다.

일부 구현예에서, 항-종양유전자는 PCBP1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 전사 인자는 Oct4, Sox2, 및/또는 Klf4이다.

질환 및 장애

본원에 개시된 방법은 임의의 적절한 세포 또는 조직 유형에 대해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 생체외에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 분리된 세포 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 세포 배양에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 분리된 세포 또는 세포 배양 세포는 대상체로부터 채취한 다음 iPSC 유도 후 이식된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 생체내에서 이용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 원 위치에서 이용된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 눈, 망막, 심장, 혈액, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 유리체, 공막, 망막, 홍채, 각막, 골격근, 심장근, 평활근, 연골, 힘줄, 뼈, 표피, 기관, 간, 심장, 신장, 폐, 위, 위장관, 결장, 방광, 난소, 정소, 췌장, 골수, 뇌, 뉴런, 및/또는 샘을 포함하지만 이에 한정되지 않는 신체의 임의의 적절한 부분에서 iPSC를 유도하는데 사용된다.

본원에 개시된 방법은 임의의 적절한 질환을 치료하거나, 예방하거나, 완화하거나, 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료되거나, 예방되거나, 완화하거나, 지연될 수 있는 질환은 손상 및/또는 퇴행을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 황반 변성, 연령-관련 황반 변성, 신생혈관성 AMD (습성 AMD), 색소성 망막염 (RP), 스타가르트 (Stargardt) 질환 망막 변성, 심장마비, 심근경색, 자가면역 장애, 전신성 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 심장병, 심근병증, 낭포성 섬유증, 다발성 경화증, 이식편대숙주병, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병, 척추 손상, 관절염, 폐기종, 크론 (Crohn) 병, 장기부전, 노화 및 기타 병리학적 상태로 인한 장기 변성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 PCBP1을 단독으로 세포에 도입함으로써 암을 치료하거나 암 세포의 성장/이동을 억제하는 조성물 또는 방법을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 2019년 2월 5일자로 출원된 PCT/US2019/016688의 주제를 포함하지 않는다.

투여

본 개시내용의 조성물은 임의의 적절한 수단을 통해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 경피, 주사, 근육내, 피하, 경구, 비강, 질내, 직장, 경점막, 장, 비경구, 국소, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 동맥내, 관절위, 피내, 병소내, 안내, 골내, 복강내, 경막내, 자궁내, 정맥내, 방광내 주입, 또는 유리체내로 투여된다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 줄기 세포 유도에서 역할을 하는 하나 이상의 추가 전사 인자를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 하나 이상의 추가 전사 인자와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 2개의 추가 전사 인자와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 3개 이상의 추가 전사 인자와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 PCBP1이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 전사 인자는 Sox2, Oct4, 및/또는 Klf4이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 iPSC는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성된 iPSC는 질환 또는 장애의 발병을 치료하거나, 예방하거나, 완화하거나, 지연시키기 위해 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 또는 플라스미드의 투여는 대상체에서 iPSC를 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 또는 플라스미드의 투여는 대상체에서 iPSC를 유도하고 질환 또는 장애의 발병을 치료하거나, 예방하거나, 완화하거나, 지연시킨다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 퇴행성 질환 또는 장애이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포는 환자에게 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포는 환자에게 약 2회, 약 3 회, 약 4회, 약 5회, 약 6회, 약 7회, 약 8회, 약 9회, 약 10회, 약 20회, 약 40회 이상 투여된다. 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포는 질환 또는 장애 증상이 개선될 때까지 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 또는 플라스미드의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자와 비교하여 치료 받은 환자에서 iPSC를 유도한다. 일부 구현예에서, iPSC는 1주 내지 10년 간 치료 받은 환자에서 유도된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드 또는 벡터의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 iPSC 유도와 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 iPSC를 유도한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드 또는 벡터의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 iPSC 유도와 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 iPSC를 유도한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 핵산, 또는 세포는 시험관내에서 처리된 세포에서 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 핵산, 또는 세포의 투여는 치료 받은 환자에서 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 핵산, 또는 세포의 투여는 1일 내지 10년 간 치료 받은 환자 또는 시험관내 세포에서 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 핵산, 또는 세포의 투여는 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 일차에 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, iPSC 유도는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 iPSC 유도와 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 증가한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드 또는 벡터의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자 또는 시험관내 세포와 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 iPSC를 유도한다. 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 iPSC 유도. 일부 구현예에서, 플라스미드 또는 벡터의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 iPSC 유도와 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 iPSC를 유도한다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포의 투여는 치료 받은 환자에서 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포의 투여는 1주 내지 10년 간 치료 받은 환자에서 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년차에 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 암 바이오마커 발현을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 암 바이오마커 발현은 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자 또는 시험관내 세포와 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자 또는 시험관내 세포와 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 암 바이오마커 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 다른 iPSC 유도 방법은 PCBP1, 이의 단편 또는 변이체를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포의 투여는 치료 받은 환자에서 전이 또는 종양형성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터, 플라스미드, 또는 세포의 투여는 1주 내지 10년 간 치료 받은 환자에서 전이 또는 종양형성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 전이 또는 종양형성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 전이 또는 종양형성을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 전이 또는 종양형성은 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자, 또는 시험관내 또는 생체외 기관 또는 조직과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 전이 또는 종양형성 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자, 또는 시험관내 또는 생체외 기관 또는 조직과 비교하여 약 1 일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 전이 또는 종양형성을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 전이 또는 종양형성은 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자와 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산, 벡터 또는 세포의 투여는 대조군 또는 다른 iPSC 유도 방법으로 치료 받은 환자, 또는 시험관내 또는 생체외 기관 또는 조직과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 전이 또는 종양형성 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 다른 iPSC 방법은 PCBP1, 이의 단편 또는 변이체를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자와 비교하여 질환 또는 장애 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애 증상은 1주 내지 10년 간 치료 받은 환자에서 측정된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 질환 또는 장애 증상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 질환 또는 장애 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 질환 또는 장애 증상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 질환 또는 장애 증상을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 질환 또는 장애 증상은 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 질환 또는 장애 증상과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 질환 또는 장애 증상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 질환 또는 장애 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 질환 또는 장애 증상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 질환 또는 장애 증상을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 또는 플라스미드의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자와 비교하여 치료 받은 환자에서 AMD의 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 증상은 흐릿한 시야, 시력 감소, 부분적인 시력 상실 및/또는 희미한 빛에서 볼 수 없는 것이다. 일부 구현예에서, AMD 증상은 1주 내지 10년 간 치료 받은 환자에서 측정된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 AMD 증상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 AMD 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 AMD 증상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 AMD 증상을 감소시킨다.

일부 구현예에서, AMD 증상은 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 AMD 증상과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 AMD 증상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 AMD 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 AMD 증상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 AMD 증상을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 벡터 또는 플라스미드의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자와 비교하여 치료 받은 환자에서 심장마비로 인한 손상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 손상은 흉터 조직 증가, 세포 사멸, 또는 비효율적인 심장 활동이다. 일부 구현예에서, 심장마비 손상은 1주 내지 10년간 치료 받은 환자에서 측정된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 심장마비 손상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 심장마비 손상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 심장마비 손상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 심장마비 손상을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 심장마비 손상은 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 심장마비 손상과 비교하여 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 심장마비 손상과 비교하여 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 약 9주, 약 10주, 약 20주, 약 30주, 약 40주, 약 50주, 약 60주, 약 70주, 약 80주, 약 90주, 약 100주, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년 차에 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 심장마비 손상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 플라스미드, 벡터, 또는 세포의 투여는 치료받지 않은 환자 또는 치료 전의 해당 환자에서의 심장마비 손상과 비교하여 약 1주, 약 1 개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 이상 동안 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100%만큼 심장마비 손상을 감소시킨다.

키트

본 개시내용은 또한 iPSC 유도를 위한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 개시내용의 벡터 또는 플라스미드를 포함한다. 키트는 기재된 시약의 사용을 지시하는 라벨 또는 인쇄된 지침을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 테스트할 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 시험관내 및 생체내 iPSC 유도를 위해 적용된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서의 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질 이 본 개시의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.

본원에서 사용된 "항-종양유전자"는 종양유전자의 발현 또는 활성을 방지하거나, 지연시키거나, 억제하거나, 달리 변경하는 임의의 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항-종양유전자는 종양 억제 유전자이다. 일부 구현예에서 항-종양유전자는 줄기 세포 발달에 관여하는 전사 인자 또는 요소를 암호화한다.

"a," "an," 및 "the"와 같은 단수 형태는 편의를 위해 본 출원에 전반에 걸쳐 사용되지만, 맥락 상 또는 명시적 언급으로 다르게 나타내는 경우를 제외하고, 단수 형태는 복수 형태를 포함하는 것으로 의도됨을 이해되어야 한다. 모든 수치 범위는 수치 범위 내의 각각의 모든 수치 포인트를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 각각의 모든 수치 포인트를 개별적으로 언급하는 바와 같이 해석되어야 한다. 동일한 성분 또는 특성에 대한 모든 범위의 종결점은 포괄적이며, 독립적으로 조합 가능한 것으로 의도된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단어 "포함된다" 및 그 변형은 목록에 있는 품목의 언급이 본 기술의 물질, 조성물, 장치, 및 방법에서 또한 유용할 수 있는 다른 품목의 제외가 아니도록 하는, 비제한적인 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "할 수 있다" 및 "일 수 있다" 및 그 변형은 하나의 구현예가 특정 요소 또는 특징을 포함할 수 있다는 언급이 이들 요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 발명의 기술의 다른 구현예를 배제하지 않도록 하는 비제한적인 것으로 의도된다. 포함되는, 함유하는, 또는 갖는과 같은 용어의 동의어인 개방형 용어 "포함하는"이 본원에서 본 개시를 설명하고 청구하기 위해 사용되지만, 본 발명의 기술, 또는 이의 구현예는 대안적으로 인용된 성분으로 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"과 같은 보다 제한적인 용어를 사용하여 설명될 수 있다.

수치량을 지칭하기 위해 본원에서 사용된 용어 "약"은 참조된 수치 표시의 "정확히" 플러스 또는 마이너스 10%까지를 포함된다. 용어 "약"이 값의 범위와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "약"은 그 범위의 최소값 및 최대값을 모두 나타낸다 (예를 들어, "약 1-50 μm"는 "약 1 μm 내지 약 50 μm"를 의미함). 조성물의 2 개 이상의 성분 간 공간적 상관관계를 설명하기 위해 본원에서 사용된 용어 "밀접하게 관련된"은 예를 들어, 혼합물, 코팅, 및 매트릭스에서와 같이 친밀하게 혼합된 성분을 지칭한다.

인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

실시예 1 - 망막 줄기 세포에서 PCPB1 및 전사 인자의 역할

망막 변성은 망막 세포의 진행성 및 궁극적 사멸에 의해 발생하는 망막의 악화이다. 이러한 망막병증은 전 세계적으로 약 2000명 중 1명에게 영향을 미친다.

현재, 줄기 세포 치료법과 유전자 치료법은 시력에 영향을 미치는 질환을 치료할 수 있는 잠재력으로 헤드라인을 장식하고 있지만, 이러한 줄기 세포 치료법은 성공적인 치료제를 만들기 위해 주입 또는 이식 전에 생체외 변형이 필요하다. 이는 세포 유전자 발현 패턴을 재프로그래밍하고 만능 줄기 세포 (iPSC)를 유도하는 분자를 전달해야 하는 여러 가지 이유 때문이며, 그 중 주된 이유이다. 이것은 일반적으로 실험실에서 분리된 세포에 대해 수행되지만, 본원은 원 위치에서, 예를 들어 눈에서 직접 iPSC를 생성하기 위한 접근 방식을 개시하고 있다.

망막 퇴생성 질환을 치료하기 위한 유전자 치료 벡터 시스템 구축: iPSC 생성에 관여하는 모든 유전자를 하나의 벡터에 삽입하여 망막세포에 형질도입하였다. 도 1은 PCBP1, GFP에 대한 유전자 (도 1a) 뿐만 아니라 전사 인자 SOX2, Oct4, 및 KLF4에 대한 유전자 (도 1b)의 공동 발현을 유도하는 강력한 인간 신장 인자-1 알파 (EF) 프로모터를 포함하는 벡터 시스템을 도시한다. 최종 제품은 단일 전달 벡터 시스템 (도 1c)에서 이들 전사 인자에 대한 모든 카세트를 포함하는 벡터이다. 각 치료 유전자의 턴-온 (turn-on)은 조절 또는 유도 가능한 방식 하에 프로모터(들)에 의해 구동된다.

결과: 분화된 망막 세포를 줄기 세포 유사 세포로 유도하는 시험관내 치료 효능: 분화된 망막 세포 배양주 (ARPE-19)를 ATCC™로부터 얻었고, FBS가 없는 배지에서 성장시켰다. 세포 배양물은 이후에 유전자 형질감염 및 감염을 위해 분할되었다.

PCBP1 유전자 및 전사 인자 유전자의 망막 세포로의 발현: 망막 세포를 분할하고 3개의 그룹으로 나누었다: 제1 그룹은 PCBP1 및 GFP의 공동 발현을 위해 PCBP1-GFP (녹색 형광 단백질)를 포함하는 벡터로 형질감염되었다. 24-28 시간 후, GFP의 발현이 관찰되었으며, 이는 벡터 시스템이 모든 유전자 (전사 인자)를 망막 세포로 전달하는데 성공했음을 나타낸다 (도 2a & 2b); 제2 그룹은 실시간 RT-PCR 반응이 이루어진 총 RNA를 추출하여 망막 세포에서 PCBP1의 발현 수준을 확인하는데 사용되었다 (도 3); 그리고 제3 그룹은 분화된 망막 세포에서 iPSC 유도를 위해 사용되었으며 다음과 같이 입증되었다. 도 2a에서, 숫자는 90% 이상의 GFP 양성 세포를 도시한다. 이 도면은 형광 현미경 하에 도 2b와 같은 선택 영역 (좌측 상단 (TL), 좌측 하단 (BL), 우측 상단 (TR), 우측 하단 (BR) 및 중앙 (C))에서 비교 연구를 보여준다. 각 웰에서, 5개의 개별 영역을 선택하고 형광 현미경 카메라로 캡처하였다 (좌측 상단 (TL), 좌측 하단 (BL), 우측 상단 (TR), 우측 하단 (BR) 및 중앙 (C)). 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 5개 영역 각각에서 사진을 관찰/캡처하였다. GFP 양성 세포를 각 영역에서 계수하고, 5개 영역에서 평균을 계산하였다. 이 5개 영역의 평균에 10³을 곱하였다 (현미경 캡처영역이 전체 세포 영역의 약 0.1%이기 때문). 따라서, 이 방법의 공식은 다음과 같다:

유전자 벡터에 의한 망막 세포 형질감염 28시간 내지 72시간 후, 세포를 수득하고 그들의 RNA 추출을 퀴아젠(Qiagen) 추출 키트로 수행하였다. 분리된 총 RNA를 향후 사용을 위해 -80C°에서 보관하였으며 표준 실험실 기술을 사용하여 RT-PCR을 위해 cDNA 라이브러리를 생성하였다.

실시간 PCR은 시험관내 망막 세포에서 PCBP1 발현 수준을 확인하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, PCBP1은 PCBP1를 암호화하는 벡터에 의해 표적 세포에서 성공적으로 고도로 발현되었다.

줄기 세포 배양 : 망막 세포를 세포 배양 플레이트 상에서 배양하였다. PCBP1 (GFP 포함) 및 다른 전사 인자 (SOX2/OCT4/KLF4)를 리포펙타민에 의해 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 2-3일 동안 배양하고, 매트리겔 (Matrigel)에 파종하고, 줄기 세포 성장 배지 (StemRD 카탈로그 번호 SPGro-free)로 배양하였다.

전사 인자 (PCBP1/OCT4/KLF4/SOX2)에 의해 유도된 줄기 세포: 3개의 상용화된 레트로바이러스 전사 인자(OCT4/KLF4/SOX2)가 사용되었다. 바이러스 형질도입 2일 전에 20μg의 C/EBP 알파 단백질을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 망막 배양 세포에 첨가하였다. 바이러스 형질도입 당일, 적당량의 베타-에스트라디올(최종 농도는 10 μM)을 세포에 첨가하여 C/EBP 알파-에스트로겐 수용체를 활성화하고, 전사 인자 (OCT4/KLF4/SOX2)가 있는 레트로바이러스에 의해 세포를 감염시켰다. 세포를 2-3일 동안 배양한 다음, 상층액을 수집하고 배양물을 500 μl PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 상층액/PBS를 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 새로운 재프로그래밍 배지 (인간 iPS 세포 성장 배지)에 재현탁하고 새로운 24웰 플레이트(매트리리겔로 잘 준비됨)에 분주하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하고 매일 줄기 세포 배지를 교체하였다. 세포의 일일 관찰은 4일차에 시작하였다. 10-12일차에, 콜로니는 분석, 분리 및 재파종을 위해 적절한 크기로 성장해야 한다. (도 4a).

항체 염색 및 재구성: 바이오마커 CRX-1은 망막 줄기 세포 재구성/분화를 위한 마커로 사용될 수 있다. 도 4b는 본 실험에서 유도된 iPSC 세포가 CRX-1 발현함을 도시한다. 인간 항-CRX 항체 (AF7085, R&D 시스템)를 배양된 세포에 도포하고 접합된 2차 항체 (NL010, R&D시스템)를 인간 항-CRX 항체에 염색 신호로서 첨가하였다. 항체의 성공적인 결합은 적색 형광 신호를 초래하였다.

슬라이드의 세포를 PBS (0.145M NaCl, 0.0027M KCl, 0.0081M Na2HPO4, 0.0015M KH2PO4, pH7.4)로 2회 세척한 다음 고정 완충액 (PBS 중 4% 파라포름알데히드)으로 고정하였다. 고정 후, 고정된 세포를 포함하는 슬라이드를 400 μL 의 세척 완충액 (PBS 중 0.1% BSA (소 혈청 알부민))으로 2회 세척한 후, 상온에서 투과 완충액(PBS 중 0.5% 트리톤 (Triton) X-100)에서 5분간 인큐베이션한 다음 400 μL의 차단 완충액 (PBS 중 5% BSA)을 첨가하여 비-특이적 염색을 차단하였다. 슬라이드를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고 차단 완충액을 제거하였다. 비접합 1차 항체 (또는 형광-접합 1차 항체)를 제조업체의 지침에 따라 희석 완충액 (PBS 중 1% BSA, 0.3% 트리톤 X-100, 및 0.01% 아지드화 나트륨)에 희석하였다. 표적 세포에 결합된 1차 항체를 설명하기 위해 2차 항체도 유사하게 희석하고 첨가하였다. 사용된 라벨에 적합한 형광 현미경과 필터 세트를 사용하여 슬라이드를 시각화하였다. 슬라이드는 추후 검사를 위해 <　-20 ℃의 슬라이드 상자에 보관하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 일부 세포는 PCBP1 및SOX2, OCT4, KLF4 전사 인자를 함유하는 벡터로 형질도입된 후 망막 줄기 세포-유사 세포로 변하였다. 도 5에 도시된 망막 줄기 세포 마커 중 하나를 사용한 항체 염색은 PCBP1 및 SOX2, OCT4, KLF4 전사 인자를 포함하는 벡터 (대조군 그룹: PCBP, SOX2, OCT4, KLF4 없이 형질감염)로 형질감염시킨 후 일부 세포가 망막 줄기 세포-유사 세포로 바뀌었음을 입증한다.

게다가, 벡터 상의 PCBP1의 존재는 암 바이오마커 발현을 방지한다. 도 6은 유전자 벡터 산물이 시험관내에서 피부암 세포를 형질도입할 수 있음을 도시한다. 도 7은 췌장암 세포에서 PCBP1 및 PRL-3 발현을 도시한다. PCBP1을 사용한 췌장압 세포의 형질도입은 전이성 마커 PRL-3의 발현을 억제한다. 대조군 그룹과 비교했을 때, PRL-3은 PCBP1 mRNA의 과발현에 의해 하향 조절되었다. 이것은 또한 웨스턴 블롯에 의해 단백질 수준에서 확인되었다 (도 6b).

실시예 2 - 동물 모델의 눈에 치료 벡터의 주입 및 생체내 치료 효능에 대한 연구:

이식된 RPE 세포는 인간의 눈에서 제한된 유착과 생존을 보이며, 노화된 Bruch의 막은 이식된 RPE 세포의 접착, 생존, 분화, 및 기능을 지원하지 않을 가능성이 높다. 따라서, RPE 세포에서 인테그린 또는 인테그린 활성제를 과발현하기 위한 유전 공학의 사용 또는 스캐폴드에서 성장하는 RPE 세포의 사용은 유망한 전망을 보여줄 수 있다. 또한, 망막 밑 공간이 한때 면역 특권을 갖는 것으로 간주되었지만, 연구에 따르면 숙주의 눈에 이식된 줄기 세포의 장기 생존에는 여전히 면역 억제가 필요하다. 면역 억제 과정과 면역 억제에 사용되는 약물은 향후 임상 적용에서 고려되고 있다.

따라서, 망막 세포 재생 및 손상을 복구하기 위한 재생을 촉진하기 위한 iPSC 기술의 원 위치 사용은 상술한 부작용이 최소화되거나 전혀 없는 황반 변성 질환 환자를 치료하기 위한 실용적이고 개선된 전략이 될 것이다. 망막 질환을 치료하기 위한 본원에 개시된 시스템의 효능은 동물 모델에서 테스트될 것이다. 유전자-트랩 벡터는 생체내 줄기 세포를 연구하는데 사용될 것이다. 예를 들어, AAV 및 렌티바이러스 바이러스 (lentiviral viruses) 모두를 사용하여 본 개시내용의 플라스미드를 전달 할 수 있다. 벡터는 본 개시내용의 플라스미드로 형질감염된 후 표준 실험실 기술을 사용하여 정제될 수 있다.

동물 모델: C57Bl/6 및 DBA/2J 마우스를 이 조사에 사용하였다. C57Bl/6 및 DBA/2J 마우스의 경우, 동물을 대조군 (GFP 단독), PCBP1만 있는 벡터, 및 3개의 전사 인자 SOX2, OCT4 및 KLF4와 조합된 PCBP1 벡터를 포함하는 세가지 주요 용량 군에 배치하였다. (표 3 참조).

모든 동물은 12시간 명/암 주기 하게 NIH 지침에 따라 동물 시설에 보관될 것이다.

동물의 눈으로 생체내 약물 전달: 랫트 및 마우스 모델에서 눈의 망막층으로의 벡터 작제물의 투여는 망막하 주사에 의한 것일 것이다 (도 9).

공간 시력: 유전자 벡터의 전달에 의한 손상된 망막 세포의 복구가 황반 생성으로부터 시력을 회복할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 검안 태스트 장치 (Cerebral Mechanics, Lethbridge, Canada)를 사용하여 동물의 시력에 대해 테스트할 것이다. 이 테스트는 수직 사인파 격자가 늘어선 회전하는 실린더의 가상 3차원 공간을 투영하는 정사각형으로 배열된 4개의 컴퓨터 모니터를 포함한다. 억제되지 않은 동물은 정사각형 중앙의 플랫폼에 배치되며 반사적인 머리 움직임으로 격자를 추적한다. 격자의 공간 주파수는 동물의 머리에 "실린더"를 중앙에 배치하여 관찰 위치에 고정된다. 다음 응답이 손실될 때까지 심리 물리학 계단 진행을 사용하여 격자의 공간 주파수를 증가시켜 시력 임계값을 정량화하여 시력을 정의한다. 랫트는 매월 간격으로 테스트하였다. Elovl4 마우스는 또한 주사 후 3, 5, 7, 및 11 주차에 이 장치에서 테스트하였다. (도 10 참조). 버전 결과는 주기/도에 의해 조정/분석될 수 있다. 더 높은 주기/도 (cycle/degree)는 더 나은 버전 복구를 나타낸다 (즉, 일반 랫트 버전은 0.6 주기/도이다).

처리된 동물의 암 발달 평가: 기형종 형성의 장기 위험을 면역 결핍 상태로 선택된 NIH III 마우스 모델에서 테스트하였다. 누드 마우스는 T 세포, NK 세포, 및 성숙한 T-비의존적 B 림프구가 없는 3개의 돌연변이를 갖는다. 그러나, NIH III 마우스는 눈 착색을 유지하여 망막하 주사에 대한 더 나은 시각화를 제공한다. 수술 기술은 RCS 연구에서 수행된 것과 동일하다. 이 연구는 1, 3, 및 9개월의 세 가지 시점에 걸쳐 대조군 그룹과 치료를 비교한다 (동물의 대략적인 수명, 코호트 당 n = 6. 하기 연구에 의한 안전성 연구에서 바이러스 유전자 벡터를 주사한 동물에서 기형종 또는 종양 형성이 발견되지 않았다. 기형종 또는 종양 형성은 하기에 논의된 바와 같이 조직화학 또는 약물 분포 연구를 통해 평가될 수 있다.

조직화학 (암 또는 종양, 조직 구조): 기능 연구가 끝나면, 모든 동물을 과량의 펜토바르비탈 나트륨으로 죽이고 인산염-완충 식염수로 관류시킨다. 눈을 제거하고, 2% 파라포름알데히드에 1시간 동안 담그고, 자당을 침투시키고, 광학 절단 온도에 포매하고, 저온 유지 장치 (cryostat)에서 15 μm 수평 섹션으로 절단하였다. 슬라이드 당 4개의 섹션 (50 μm 간격)이 수집되어, 수집된 4번째 섹션마다 5개의 시리즈가 제공되었다. 하나는 주사 부위와 망막 적층의 무결성을 평가하기 위해 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 나머지 슬라이드는 항체 염색, 암/종양 검출, 및 조직 구조 분석에 사용하였다.

망막 조직에서 약물 분포 및 약물 작용 경로 분석: 전체 유전자 발현 분석은 약물 전달과 관련된 다양한 기관/조직의 PCBP1 발현에 대해 인간 및 마우스 또는 랫트 아피매트릭스 (Affymetrix) HG- U133 플러스 2.0 마이크로어레이 플랫폼 (Santa Clara, CA)을 사용하여 수행하였다. 추가적으로, ARPE-19 (American Type Culture Collection™, Manassas, VA), 및 망막모세포종 (American Type Culture Collection™) 세포주 및 정상 망막 세포는 처리군과 비교할 때 대조군으로 분석된다. 데이터 분석은 통계 소프트웨어에 의해 지원된다.

PCBP1 및 다른 전사 인자의 면역블롯 분석은 Bio-Rad Mini-Protean 및 Mini-Transblot Cell (Hercules, CA)을 사용하는 표준 SDS-PAGE 방법을 사용하여 수행하였다. 단백질 밴드는 Western Lightning Chemiluminescence Reagent (PerkinElmer Life 및 Analytical Sciences, Boston) 및 Kodak 4000MM digital imaging station (Rochester, NY)을 사용하여 시각화되었다.

실시예 3 - PCBP1은 PRL3/STAT3 경로를 통해 Sox2, Oct4, KLF4등과 상호작용한다:

PCBP1과 다른 줄기 세포 전사 인자의 상호 작용을 연구하고 상호작용하는 경로를 결정하기 위해, 다음과 같이 망막세포에 대한 연구를 수행할 수 있다. 4개의 세포 배양물을 본 개시내용의 다양한 벡터로 처리하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, 암 세포의 배양물은 대조군으로 사용되고 어떠한 벡터로도 형질감염되지 않는다. 이 배양물의 qRT-PCR은 암 및 전이와 관련된 바이오마커의 발현을 보여줄 것이다 (PRL-3/STAT3). 망막 세포를 포함하는 3개의 배양물은 도 11a에 도시된 바와 같이 형질감염될 것이다. PCBP1 및 SOX2/KLF4/OCT4 줄기 세포 전사 인자를 함유하는 벡터로 형질감염된 세포 배양에서, 암 세포 또는 형질감염되지 않은 망막 세포에서의 발현 수준에 비해 PRL-3/STAT3의 발현이 억제될 것으로 예상된다. SOX2/KLF4/OCT4 줄기 세포 전사 인자를 함유하는 벡터로 형질감염된 세포 배양에서, PRL-3/STAT3의 발현은 형질감염되지 않은 망막 세포 및 PCBP1로 추가로 형질감염된 망막 세포에 비해 증가될 것으로 예상된다. 도 11b는 이 실험에 사용된 대표적인 플레이트를 도시한다.

도 12는 줄기 세포 전사 인자 및 PRL-3/STAT3 경로가 상호작용하는 추정 메커니즘을 도시한다. iPSC 생성 동안, PCBP1은 줄기 세포 전사 인자 (예를 들어, SOX2, OCT4, KLF4)와 함께 작용하여 줄기 세포 발달을 유지한다. 그러나, PCBP1은 또한 종양형성을 증가시키지 않으면서 표적 세포 또는 조직으로의 전구 세포 분화를 촉진하기 위해 STAT3 신호의 하향 조절과 연결된 PRL-3을 억제하는 경로에 작용한다.

실시예 4 - 시험관내 심장 섬유아세포 줄기 세포 유도

미국에서는 매년 150만 건 이상의 심근경색이 발생하고 있는데, 산소 공급 부족으로 인한 심근세포 (CMC)의 비가역적 사망으로 인해 심각한 부상을 입는 것으로 나타났다. 심장의 CMC는 재생 능력이 제한되어 있어, 결과적으로 급성 심근경색에서 살아남은 약 500만 명의 환자가 허혈성 심근병증을 앓아 심부전을 유발한다. 따라서, 손상된 CMC를 보충하여 흉터 조직을 복구하기 위한 급성 심근경색에 대한 효과적인 치료법이 필요하다.

직접적인 섬유아세포 재프로그래밍은 GATA4, Mef2C, 및 Tbx5 (GMT)와 같은 김근형성 인자의 바이러스 과발현을 통해 처음 시도되었다 (Chen JX et al. (2012)). 최근, Ma et al. (2017)은 성숙한 CMC 생성에서 더 높은 효율성을 달성하기 위해 단백질 화학양론을 변화시켜 전력을 더욱 최적화하였다. 치료 전략의 후속 수정은 전섬유화 신호 전달의 소분자 억제를 통해 재프로그래밍 효율을 최대 60%까지 증가시켰다. 그러나, GATA4 유전자 발현의 변경은 여러 암 유형과 관련되어 있어 종양형성 가능성이 증가한다.

손상된 세포를 특이적으로 표적화하기 위해 원 위치에서 유도된 줄기 세포는 조직 복구를 촉진시킨다. 원 위치 유도는 표적 영역의 부정확성 및 병원체 오염과 같은 이식 전 현장 외 줄기 세포 유도와 관련된 일반적인 문제를 피할 수 있다. 심장 섬유아세포 (CF)를 CMC로 직접 전환하여 종양형성을 비롯한 부작용의 위험을 유의하게 낮추는 것이 본원에 도시되어 있다.

줄기 세포-유사 세포로 심장 섬유아세포의 시험관내 유도

개별 렌티바이러스 벡터는 표적 유전자(PCBP1-IRES-GFP)의 다운스트림에서 PCBP1 및 GFP를 동시 발현하고 Oct4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc를 별도로 발현하도록 구성되어 있다. 인간 태아 심장 섬유아세포 (FCF)를 FBS가 없는 배지에서 성장시킨 다음 렌티바이러스 형질도입을 위해 분할하였다. 이 후, 그들을 3개의 그룹으로 나누었다. 그룹 1은 GFP 시각화를 위해 Sox2/Oct4/Klf4가 있거나 없는 LVV PCBP1-IRES-GFP에 의해, 또는 또는 양성 대조군으로 사용된 GFP-단독 벡터로 형질도입되었다 (도 13a). 그룹 2는 총 RNA 추출 및 qRT-PCR 분석에 의해 심장 섬유아세포에서 PCBP1 mRNA의 발현을 확인하는데 사용되었다 (도 13b). 도 13b는 PCBP1-IRES-GFP 벡터에 의해 형질도입된 CF와 qRT-PCR에 의한 대조군 (형질감염 없음)의 PCBP1 mRNA 수준의 비교를 보여준다. 형질감염된 세포는 99배 이상 더 높은 PCBP1 발현을 나타낸다 (ddCt=99.9; p-<0.05).

다른 전사 인자의 mRNA 또한 qRT-PCR에 의해 확인되었다 (데이터는 표시되지 않음). 그룹 3은 FCF의 심장 줄기 세포-유사 세포로의 iPSC 유도에 사용되었다.

그룹 3의 FCF를 연속적으로 성장시킨 다음 72시간 동안 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입한 후 기질로서 매트리겔을 함유하는 새로운 플레이터로 옮기고, c/EBP-알파 및 베타 에스트라디올의 존재 하에 FBS가 없는 줄기 세포 배지에서 16일 동안 성장시켰다.

c-Kit 수용체 티로신 키나제는 배양된 심장 세포가 CM, 평활근 및 내피 세포로 분화할 수 있도록 하는 것으로 나타났으며 심장 줄기 세포 마커로 사용되었다. c-Kit에 특이적인 항체는 도 14에서와 같이 새로운 심장 줄기 세포 바이오마커를 감지하고 심장 줄기 세포-유사 세포를 식별하는데 사용되었다. 형질 도입 16일 후, FCF는 전형적인 스핀들 구조 (spindle structure)를 상실하고 표현형 심장 줄기 세포 구형-유사 구조로 표시되었다. 이러한 FCF는 또한 c-Kit 항체에 의해 양성으로 검출되었다 (도 14). 흥미롭게도,PCBP1를 단독으로 발현하는 LVV를 사용한 CF의 형질도입은 심장 섬유아세포가 표현형을 고전적인 스핀들 구조에서 심장 줄기 세포의 공급원이자 재생 능력이 있는 것으로 입증된 심장공 (cardiosphere)에 대해 설명된 것과 유사한 구조로 변경하도록 효과적으로 유도하였다 (도 14c 및 d).

CF는 줄기 세포와 유사해지면서 섬유아세포에 특이적인 바이오마커를 점차 잃어버리고 세포 표면에 심장 줄기 세포 바이오마커를 발현한다. 예를 들어, COL1a1는 심장 섬유아세포 특이적 마커 유전자이다. 심장 금육 트로포닌 T를 암호화하는 TNNT2는 CMC에 대한 바이오마커이며, 심장 반월형-단계 (crescent-stage) 전구 세포가 풍부하다. 도 15에 도시한 바와 같이, PCBP1, Sox2, Oct4, 및 Klf4를 함유하는 LVV를 사용한 형질도입은 COL1a1 mRNA 수준의 5배 이상 감소를 초래하였다. 게다가, LVV로 형질도입하면 c-Kit 발현이 30배 이상 증가하고 TNN2 발현이 거의 8배 증가하였다.

이러한 결과는 CF가 시험관내에서 PCBP1, Sox2, Oct4, 및 Klf4를 함유하는 LVV에 의해 유도되어 심장 줄기 세포-유사 세포를 생성할 수 있음을 입증한다.

실시예 5 - 원 위치에서 심장 섬유아세포 줄기 세포 유도

분화된 섬유아세포는 다능성을 유도하고 줄기 세포가 되도록 재프로그래밍될 수 있다. 현재 줄기 세포 치료법은 주로 유전자 발현 패턴을 재프로그래밍하고 만능 줄기 세포 (iPSC)를 유도하는 분자를 전달할 필요가 있기 때문에 주입 또는 이식 전에 생체외 변형이 필요하다. 이것은 일반적으로 실험실에서 단리된 세포에 대해 수행되지만, 생체외 조작 중에 줄기 세포 상태를 유지하기가 어렵다. 여기에서, 생체외에서 iPSC를 유도하는 대신에, 예를 들어 PCPB1 및 하나 이상의 전사 인자의 공동 발현을 사용하여 심장에서 직접 유도가 원 위치에서 일어날 것이다. PCBP1 및 iPSC 전사 인자의 조합된 발현은 심장 섬유아세포를 줄기 세포-유사 세포로 전환시키고 결국 심근 경색을 치료하기 위한 CMC로 직접 전환을 유도할 것이다.

분자 복제 기술을 사용하여, iPSC에 관여하는 4가지 전사 인자가 단일 벡터 시스템에 의해 발현되도록 설계되어 전사 인자의 전달을 촉진하고 재현 가능한 결과를 가능하게 한다. 각 개별 유전자의 발현은 mRNA에 대해 qRT-PCR에 의해, 및 단백질 분석에 대해 웨스턴 블롯에 의해 테스트될 것이다.

마우스 심장 조직은 심근 경색을 유발하기 위해 외과적으로 치료될 것이다. 그런 다음 본 개시내용의 벡터 시스템은 CF의 줄기 세포로의 형질전환을 촉발하기 위해 원 위치에서 분화된 섬유아세포에서 형질도입될 것이며, 이는 줄기-세포 특이적 마커에 의해 검출될 것이다. 몇 가지 시험관내 기능 분석이 다음과 같이 수행된다:

면역세포화학: iPSC는 배양된 CF에서 유도되고, 브라이트 필드 (bright filed)에 의해 시각화되고 심장 줄기 세포 바이오마커의 검출에 의해 확인되었다. FCF는 시험관내에서 풀링된 개별 바이러스 및 폴리시스트론성 PCBP1, Sox2, Oct4, 및 Klf4 바이러스를 발현하는 LVV 벡터 시스템에 의해 형질도입될 것이다. 추가적으로, PCBP1만을 함유하는 LVV 벡터 (즉, 다른 전사 인자가 없음)는 실시예 4의 연구에서 관찰된 심장공 구조로 인해 테스트될 것이다. 형질도입 4일 후, 세포는 매트리겔 코팅 접시로 옮겨지고 15일 동안 배양되어 심장 줄기 세포를 유도한다. 심장 줄기 세포 클러스터가 눈에 보인 후 (대조군 그룹과 비교하여, c-Kit에 특이적인 항체를 사용한 면역조직화학을 수행하여 형관 현미경 하에서 c-Kit 발현 수준을 검출한다.

시험관내 심장 재프로그래밍 평가 - CMC 박동 검정: iPSC는 상술한 바와 같이 유도될 것이다. 세포내 칼슘 농도의 형광 이미지화는 자동화된 신호전달 (signaling) 분석 소프트웨어에 의해 분석될 것이다. CMC는 심장 생리학을 나타내는 매개변수의 분석과 함께 자발적으로 수축하는 세포의 표현형 반응을 입증할 것으로 예상된다.

시험관내 종양형성 가능성 평가 - 신호전달 경로 분석: 간 재생 인산분해효소 3(Phosphatase of Regenerating Liver 3, PRL3)은 발암 (oncogenic) 인자이며, 이의 활성화는 종종 종양형성과 관련된다. 마찬가지로, Stat3는 다양한 암의 발암현상에 관여한다. 이러한 종양 단백질의 평가는 현재 LVV 시스템에 의해 조절되는 신호전달 경로를 맵핑하는데 중요하다. 총 RNA 및 단백질을 추출한 다음 인산화/활성화된 형태에 대한 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 사용하여 c-Kit, COL1a1, TNNT2, PRL3, 및 Stat3와 같은 특정 바이오마커에 대해 분석될 것이다. PRL3 전체 및 활성화된 단백질 수준의 하향 조절 및 다운스트림 표적 STAT 3의 감소된 활성화는 종양발생 가능성을 감소시킴을 나타낸다.

심근 경색 뮤린 모델에서의 효능: 생체내 시스템의 적용 가능성을 확인하기 위해 동물 실험을 수행한다 (도 16 참조). 렌티바이러스 벡터는 MI 동물 모델의 심장 조직에 주입되어 CMC 재생을 유도한다. 성공적인 심장 기능 회복은 행동 연구, 생리학적 및 조직학적 분석에 의해 모니터링될 것이다. 분자 수준에서의 신호전달 경로 성분의 평가도 수행될 것이다.

생체내 모델: MI에 대한 좌전하행 (left anterior descending, LAD) 동맥-결찰 뮤린 모델은 인간 심장마비에서 전형적인 국소 허혈성 심근 조직 손상을 재현하는데 사용되었다. 마우스 MI 모델을 사용한 이전 연구에서는 레트로바이러스 벡터를 통해 Gata4, Mcf2c, 및 Tbx5를 단일 mRNA로 전달하였다. Balb/C 마우스에서 LAD-결찰을 사용한 동물 연구를 위한 4개의 코호트가 있을 것이다: 1) PCBP1; 2) PCBP1/Oct4/Klf4/Sox2; 3) c-Myc/Oct4/Klf4/S0x2; 및 4) 음성 대조군으로서 GFP를 발현하는 대조군 벡터. 5마리의 동물이 각 코호트에 포함될 것이며, 실험은 3회 반복될 것이다. 바이러스 주입 20일 후, 동물의 행동은 심장마비로부터 회복하기 위해 기록될 것이다. 그런 다음 동물을 마취하고 희생시킬 것이다. 이식된 심장은 허혈성 영역에서 회복을 위해 면역조직화학에 의해 분석될 것이다. 전체 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링은 PCBP1 및 Sox2, Oct4, Klf4 전사 인자의 다운스트림 신호 경로 성분에 대해 모니터링될 것이다.

생체내 직접 재프로그래밍 평가 - 흉터 크기 결정: 심장 조직을 MI 후 8주차에 표준 Masson-Trichrome 염색으로 염색하였다. 경색된 영역을 파란색으로 표시하고 생존가능한 심근을 빨간색으로 표시하였다. 결찰 바로 아래에 있는 첫 번째 수준이 있는 일련의 횡단면 상의 흉터 영역을 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

생체내 직접 재프로그래밍 평가 - 심장 기능: 실험 동물에 대한 심장초음파, 혈역학, 및 MRI를 분석하여 LVV 주입 여부에 관계없이 MI 후 4, 8, 및 12주차에 김장 기능을 평가하였다.

생체내 직접 재프로그래밍 평가 - 유전자 조절: CMC를 MI 후 상이한 심장 영역 및 시점에서 단리하고 소화 및 FACS로 처리하였다. 총 RNA 및 단백질을 Stat3 및/또는 PRL3와 같은 신호전달 경로 성분에 대해 수득하고 분석할 것이다. PCBP1, Sox2, Oct4, 및 Klf4를 함유하는 LVV를 주사한 그룹은 c-Myc, Sox2, Oct4, 및 Klf4 군과 비교하여 심장 기능의 회복이 유사하거나 훨씬 더 우수할 것이다. 두 LVV 전사 인자 군 모두 대조군 그룹보다 더 잘 회복될 것으로 예상되며, GFP와 식염수 대조군 그룹 사이에 유의한 차이가 없어야 한다.

대체 벡터 작제 전략: 4개의 전사 인자 단백질의 축적된 큰 크기로 때문에 페이로드 용량 제한으로 인해 개별적으로 전달해야 할 수 있다. 따라서, 다음과 같은 대체 작제 옵션을 사용할 수 있다. (1) "PCBP1-2A-Sox2" 및 "Oct4-2A-KLF4"의 2개의 융합 단백질을 생성함으로써 작제물을 재설계, 이들 2개의 융합 단백질의 발현은 2개의 개별 EF 프로모터에 의해 구동될 것이며, 각 단백질은 전달 후 세포 내에서 동등하게 방출될 것이다; (2) 각각의 전사 인자를 각각 발현하는 4개의 개별 벡터를 작제.

단일 벡터를 사용하여 생체내 모델에서 줄기 세포-유사 세포를 유도할 수 없는 경우, 다음과 같은 대체 계획을 적용할 수 있다: (1) 다른 작제물을 사용 - 개별 벡터가 이전에 만든 작제물에서 전사 인자를 발현하는 것으로 입증되었기 때문에 표적 조직으로 전달하기 위해 4개의 개별 벡터를 함유하는 바이러스를 풀링한다; (2) 아데노-관련 바이러스 벡터 (Adeno-associated Virus vector, AAV)와 같은 다른 전달 시스템의 선택은 또 다른 대안이다. 4개의 AAV 벡터가 작제될 수 있으며, 각각은 하나의 전사 인자를 암호화한다, AAV 벡터의 이점은 훨씬 더 높은 바이러스 역가와 국소 단백질 농도를 전달할 수 있어 표적 세포에서 더 높은 효능을 나타낼 수 있다는 것이다. 또한, AAV 벡터는 진행성 심부전 환자를 위한 치료제에 대한 임상 시험을 위해 FDA의 승인을 받았다; (4) 효율성을 증가시키기 위해 TGF 베타 및 ROCK 신호전달과 같은 전섬유화 신호의 억제제를 추가한다.

실시예 6 -MCF-7 (CSC) 유방암 줄기 세포 (BCSC) 대 MCF-7 암 세포에서 CD44 및 CD24의 FACS 검출

TGF-베타 배양: MCF-7 유방암 세포 줄기 세포 및 MCF-7 암세포를 배양 후 7일 동안 TGF-베타 (5 ng/mL)가 보충된 완전 배지를 사용하여 처리하여 CD44+ 및 CD24- 서브-집단에 대한 선택에 의한 암 줄기 세포 생산 및 정제를 강화하였다. 세포수가 실험에 충분할 때까지 (일반적으로, 단리 후 약 4 내지 5일) 선택된 세포를 배양 (예를 들어, TGF-beta+ 배지 포함) 하였다. 대조군 세포 (즉, TGF=베타가 투여되지 않음)는 권장 배지를 사용하여 정상으로 처리하였다. 모든 형질감염은 Lipofectamine 3000으로 수행하였다. 벡터 DNA 없이 Lipofectamine 처리를 사용하여 모의 형질감염을 수행하였다.

수득한 세포를 항-인간 CD44 PE-접합 모노클로날 항체 (10μL/106 세포) 및 항-인간 CD24 APC-접합 모노클로날 항체 (10μL/106 세포)로 공동-염색하였다. 비특이적 항체를 동형 대조군으로 사용하였다.

도 17은 MCF-7 (CSC) (BCSC)이 CD44 발현이 높지만 CD24 발현은 감소하여, 이 방법을 사용하여 유방암 줄기 세포 집단 (CD24-; CD44+) 의 농축을 입증함을 보여준다.

또한, 세포를 이중-색상 산점도를 통해 CD24 및 CD44의 발현에 대해 분석하였다. 세포를 수득하고 항-인간 CD44 PE-접합 모노클로날 항체 (10μL/10⁶ 세포) 및 CD24 APC-접합 모노클로날 항체 (10μL/10⁶ 세포)로 공동-염색하였다. 비특이적 항체를 대조군으로 사용하였다. 도 18a-d. 또한, 도 19a-d는 MCF7 세포주가 MDA-231 유방암 세포주보다 더 적은 CD133을 발현함을 도시한다.

다양한 세포주에 대한 TGF-베타의 효과를 결정하기 위해, MCF-7 및 U87-MG (인간 교모세포종) 세포를 RIPA 용해 완충액으로 용해시키고 세포 용해물의 35 mcg 단백질 (BCA 검정에 의해 결정됨)을 웰당 로딩하였다. 토끼 항-CD133 항체 (1:1000), 뮤린 항- CD44 모노클로랄 항체 (1:1000), 및 양 항-CD24 항체 (1μg/mL)를 1차 항체로 사용하였다. 2차 시약은 염소-항-토끼 HRP-접합 항체 (1:1000); 염소-항-마우스 HRP-접합 항체 (1:1000); 및 당나귀-항-양 HRP-접합 항체 (1:1000)였다. 정규화 및 정량화를 위해, 1차 프로빙 후 블롯을 제거하고 토끼 항-GAPDH 항체 (내부 대조군으로서) (1:3000)와 함께 인큐베이션하였다. GAPDH에 대한 2차 항체는 염소-항-토끼 HRP-접합 항체 (1:1000)였다. 도 20은 TGF-베타 처리 후 MCF7/U87MG 암 세포주의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 이러한 웨스턴 블롯 데이터는 GAPDH에 의해 정규화되었다. 도 21a-c 참조.

실시예 7 - 암 줄기 세포에서 PCBP1과발현의 효과

다양한 암 세포주를 본원에 기재된 바와 같이 PCBP1 작제물, LV-GFP, wPCBP1_0, m_PCBP1_1, mPCBP1_2로 형질감염시키거나 모의-형질감염시켰다. 형질감염된 세포에서 PCBP1 전사체의 양을 qRT-PCR로 분석하였다. 도 22. 총 RNA를 형질감염 48시간 후 세포에서 추출한 다음 역-전사 PCR를 사용하여 cDNA로 전환하였다. PCBP1 및 변이체를 PCBP1-특이적 Taqman 프로브를 사용한 qPCR로 측정하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 제공되었다. 세 가지 세포주 모두에서 LV-wPCBP1-GFP (야생형), LV-PCBP1_mutant_1-GFP 및 LV-PCBP1_mutant_2-GFP 간에 PCBP1 mRNA 발현에는 유의한 차이가 없다. 모의-형질감염은 계산을 위한 기준선으로 사용하였다.

본 개시내용의 PBCBP1 작제물로 형질감염된 후 암 줄기 세포에서의 바이오마커 발현은 도 23에 도시되어 있다. 세포를 RIPA 용해 완충액으로 용해시키고 세포 용해물의 35 mcg 단백질 (BCA 검정에 의해 결정됨)을 웰당 로딩하였다. 토끼-항-CD133 항체, (1:500) 및 뮤린 항-CD44 모노클로랄 항체 (1:1000)를 1차 항체로 사용하였다. 염소-항-토끼 HRP-접합 항체 (1:1000) 및 염소-항-마우스 HRP- 접합 항체 (1:1000)를 2차 시약으로 사용하였다. 정규화 및 정량화를 위해, 1차 프로빙 후 블롯을 제거하고 마우스 항-베타 액틴 모노클로랄 항체 (0.01 μg/mL)로 프로빙하였다. 베타 액틴에 대한 2차 항체는 염소-항-마우스 HRP- 접합 항체 (1:1000)였다. 도 23a-c는 CD44 및 CD133 둘 모두가 처리 후 유의하게 하향 조절됨을 도시한다. 도 24a-c는 형질감염된 세포에서 CD44 및 CD133의 정규화된 (베타-액틴에 대한) 발현을 도시한다.

요약: TGF-베타 처리 및 CD24- 및 CD44+ 집단에 대한 분류를 사용하여 암 줄기 세포를 생성 및 단리하였다 (FACS 및 웨스턴 블롯에 의해 확인됨). 단리된 암 줄기 세포를 야생형 또는 돌연변이 형태의 PCBP1로 형질감염시킨 후, CD44 및 CD133는 야생형 또는 돌연변이 형태의 PCBP1 발현 후 암 줄기 세포에서 유의하게 감소하였다. CD44는 암 줄기 세포 바이오마커로 사용될 수 있고 CD133은 암 세포 바이오마커로 사용될 수 있다. 그러나, 여기에서 입증된 바와 같이, 야생형 또는 돌연변이 PCBP1의 발현은 CD44 및 CD133의 발현을 차단하여 암 줄기 세포의 종양형성 가능성 및 줄기세포능 (stemness)을 방지할 수 있다. 이는 PCBP1이 iPCS 생성 과정에서 조절인자 (regulator)로서 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다.

실시예 8 - 니클로사미드 또는 PCBP1 발현은 BCL-2 및 c-Myc를 하향 조절한다

니클로사미드는 다양한 경로와 관련된 암 줄기 세포에 대한 억제 가능성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자는 암 줄기 세포 억제제로서 니클로사미드를 연구하였다. 암 줄기 세포 및 줄기 세포 사이에는 많은 관련 경로가 공유되어 있다 (예를 들어, PSC의 생성을 유도하는 대신 미분화 상태를 유지). 여기서, NF-kB 경로에 대한 니클로사미드의 효과를 연구하였다. 도 25.

U87-MG (CSC)를 사용하여 NF-kB 경로를 검증하였다. 세포를 RIPA 용해 완충액으로 용해시키고 35 mcg 세포 용해물 단백질 (BCA 검정에 의해 결정됨)을 웰당 로딩하였다. 뮤린 항-c-Myc 모노클로랄 항체 (2ug/mL) 및 또끼 항-베타 액틴 항체 (0.5ug/mL)를 1차 항체로 사용하였다. 염소-항-마우스 HRP-접합 항체 (1:1000) 및 염소-항-토끼 HRP-접합 항체 (1:1000)를 2차 항체로 사용하였다. 웨스턴 블롯으로 측정한 세포에서 c-Myc의 발현은 정상화되었다. 도 27a. U87-MG (CSC) 세포를 대조군으로서 DMSA 또는 10μM 니클로사미드로 처리하였다. 형질감염 48시간 후 세포로부터 총 RNA를 추출한 후 RT-PCR를 통해 RNA를 cDNA로 전환시켰다. RNA 수준은 c-Myc 및 BCL-2에 대한 유전자-특이적 Taqman 프로브를 사용하여 qPRC에 의해 측정하였다. 도 28a-b는 니클로사미드 또는 PCBP1 형질감염으로 처리된 U87-MG (CSC) 세포에서의 c-Myc 및 BCL-2 발현을 도시한다. 유사하게 처리된 DU-145 (CSC) 및 MCF-7 (CSC) 세포에서 c-Myc 및 BCL-2의 발현은 도 29a-b 및 도 30a-b에 도시되어 있다.

요약: Both BCL-2 및 c-Myc 둘 모두는 PCBP1 (및 돌연변이체) 또는 니클로사미드 처리에 의해 유의하게 하향조절되었다. 니클로사미드는 암 줄기 세포의 억제제로 사용되었기 때문에, 이러한 데이터는 PCBP1 유전자 치료법의 유사한 효과를 뒷받침한다. 따라서 이러한 데이터는 PCBP1이 NF-kB 경로에 대한 니클로사미드의 효과와 유사하게 BCL-2 및 c-Myc 둘 모두의 발현의 하향 조절을 통해 CD44 및 CD133의 발현을 차단할 수 있기 때문에 암 줄기 세포 억제제로도 작용함을 나타낸다. 이러한 데이터는 iPSC 생성동안 종양형성을 억제하고 예방하는데 있어 PCBP1 및 돌연변이체 사용을 뒷받침한다.

본 개시내용의 비-제한적인 구현예의 예

본원에 개시된 본 주제의 구현예는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 실시예와 조합하여 유익할 수 있다. 전술한 설명을 제한하지 않고, 1 내지 24로 번호가 매겨진 본 개시내용의 특정 비제한적인 구현예가 아래에 제공된다. 본 개시내용을 판독할 시 당업자에게 명백한 바와 같이, 각각의 개별적으로 번호가 매겨진 구현예들은 개별적으로 번호가 매겨진 선행 또는 다음의 구현예들 중 임의의 것과 조합되거나 사용될 수 있다. 이것은 이러한 모든 구현예의 조합에 대한 지원을 제공하기 위한 것이며 아래에 명시적으로 제공된 구현예의 조합으로 제한되지 않는다.

구현예 1. PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 또는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 하나 이상의 다른 전사 인자의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법으로서, 상기 만능 줄기 세포의 유도는 종양형성을 동반하지 않는, 방법.

구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.

구현예 3. 구현예 1에 있어서, 상기 방법은 생체외에서 수행되는, 방법.

구현예 4. 구현예 1에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 수행되는, 방법.

구현예 5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 분화 세포는 포유류인, 방법.

구현예 6. 구현예 5에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간인, 방법.

구현예 7. 구현예 5 또는 6에 있어서, 상기 포유류 세포는 기관 세포, 조직 세포, 또는 혈액 세포인, 방법.

구현예 8. 구현예 7에 있어서, 상기 조직 세포는 망막 또는 심장 세포인, 방법.

구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체, SOX2, OCT4, 및 KTL4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 12. PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 벡터를 도입시키는 단계를 포함하는, 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법으로서, 상기 만능 줄기 세포의 유도는 종양형성을 동반하지 않는, 방법.

구현예 13. 구현예 12에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.

구현예 14. 구현예 12에 있어서, 상기 방법은 생체외에서 수행되는, 방법.

구현예 15. 구현예 12에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 수행되는, 방법.

구현예 16. 구현예 12 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 분화 세포는 포유류인, 방법.

구현예 17. 구현예 16에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간인, 방법.

구현예 18. 구현예 16 또는 17에 있어서, 상기 포유류 세포는 기관 세포, 조직 세포, 또는 혈액 세포인, 방법.

구현예 19. 구현예 18에 있어서, 상기 조직 세포는 망막 또는 심장 세포인, 방법.

구현예 20. 구현예 12 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 하나 이상의 다른 전사 인자의 핵산 서열을 포함하는 방법.

구현예 21. 구현예 12 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 22. 구현예 12 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 23. 구현예 12 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1, SOX2, OCT4, 및 KTL4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.

구현예 24. 구현예 12 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 추가의 전사 인자를 포함하지 않는, 방법.

참조에 의한 통합

인용된 모든 공보, 특허 및 특허 공보는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 2월 5일자로 출원된 PCT/US2019/016688의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 통합된다.

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Claims

PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 또는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 하나 이상의 다른 전사 인자의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법으로서, 상기 만능 줄기 세포의 유도는 종양형성을 동반하지 않는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 생체외에서 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 분화 세포는 포유류인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 포유류 세포는 기관 세포, 조직 세포, 또는 혈액 세포인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 조직 세포는 망막 또는 심장 세포인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체, SOX2, OCT4, 및 KTL4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 포함하는 벡터를 도입시키는 단계를 포함하는, 분화 세포로부터 만능 줄기 세포를 유도하는 방법으로서, 상기 만능 줄기 세포의 유도는 종양형성을 동반하지 않는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은 생체외에서 수행되는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 수행되는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 분화 세포는 포유류인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 포유류 세포는 기관 세포, 조직 세포, 또는 혈액 세포인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 조직 세포는 망막 또는 심장 세포인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 하나 이상의 다른 전사 인자의 핵산 서열을 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1 및 SOX2, OCT4, 및 KTL4로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자 중 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 벡터는 PCBP1, SOX2, OCT4, 및 KTL4의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 벡터는 추가의 전사 인자를 포함하지 않는, 방법.