TW202216158A - 網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑 - Google Patents

Abstract

本發明提供促進為了治療黃斑部病變或網膜色素病變(RP：retinitis pigmentosa)等之網膜病變疾病而經移植之RPE細胞的存活之方法，及使該經移植之異體RPE細胞不會被接受者側之淋巴球所排斥之方法。

Description

網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑

本發明係關於網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑、移植用免疫抑制劑，及網膜色素上皮細胞之移植用醫藥組成物。

網膜色素上皮(RPE)細胞係於網膜之最外層，作為伴有色素的一層上皮細胞組織存在，在職掌視覺之眼球網膜的機能維持上扮演極重要的角色。其代表性的機能，可列舉吞噬機能所致之網膜視細胞外節之新生、於視細胞外節特異性存在的光感性蛋白即視物質之循環利用及各種細胞激素之分泌所致之RPE鄰接組織即視細胞及脈絡膜的保護效果等。因此，已知RPE細胞因年齡增長或其基因異常等，造成機能不全或伴隨於其之病變進而細胞死亡，而會引起老年性黃斑部病變(AMD)及斯特格氏病(Stargardt's disease)等之黃斑部病變或網膜色素病變(RP)等嚴重的網膜病變。特別是AMD係會引起高齡者之中央視力降低或失明的眼疾病，於迎接今後未曾有的高齡化社會之包含日本之先進國家成為重要之社會問題。目前，對AMD之治療法，一般而言為對症療法之抗體醫藥的眼內投予，尚未確立有效的治療法，故作為其替代之根治治療法的開發受到期望。進一步地，對斯特格氏病及RP而言，至目前為止，有效的治療法完全尚未確立。 近年來，作為對AMD或RP之新的治療法，補充或置換由多能性幹細胞所分化誘導的RPE細胞之細胞移植治療受到注目，故作為細胞治療用移植材料之RPE細胞的活用受到期待。例如，Ocata Therapeutics公司(舊Advanced Cell Technology(ACT)公司)，係在進行使用了來自人類胚胎幹細胞(ES細胞)之RPE細胞的老年性黃斑部病變(AMD)及斯特格氏病之臨床研究。於日本國亦在2014年實施將來自人類人工多能性幹細胞(iPS細胞)之RPE細胞薄片移植至滲出型AMD患者之手術，作為世界首次之iPS細胞移植治療而大幅受到注目，有報告目前其治療過程亦為順利。

目前，RPE細胞之移植，係有(1)將所調製之RPE細胞薄片或於支架材播種RPE細胞而調製的附支架之RPE細胞薄片，由形成於網膜之切創移植於網膜色素上皮之病變或缺損部位的方法，與(2)將RPE細胞懸浮液注入於相同之部位的方法。移植用細胞之培養，必需以GMP等級來實施，因此前者的情況，會成為於RPE細胞薄片之製造後，由細胞調製設施(CPC；Cell Processing Center)輸送至進行移植手術的設施(醫院)。另一方面，後者的情況，例如於Ocata Therapeutics公司的臨床試驗中，係將於CPC所製造，經冷凍保存之RPE細胞輸送至醫院，於醫院解凍，於懸浮於移植用介質之後立即送往手術室而實施移植。在可將細胞於冷凍狀態下由CPC輸送至醫院的觀點，可認為後者的便利性較高。

但是，移植RPE細胞之懸浮液的方法從以往即有複數之問題。例如，有報告將異體RPE細胞以細胞懸浮液形態投予時，所移植之細胞因排斥反應而不於移植場所存活(非專利文獻1)。又，有報告將RPE細胞以細胞懸浮液形態移植時，有所移植之細胞逆流而形成黃斑前膜之事例(非專利文獻2)。又，發明者等人亦確認到將使用食蟹猴之異體RPE細胞以細胞懸浮液形態投予之數例的事例中，所移植之細胞於玻璃體內逆流而形成黃斑前膜(非專利文獻3)。又，實際之人類臨床試驗中，亦報告了來自iPS細胞之異體RPE細胞之細胞懸浮液移植中，引起黃斑前膜所致之網膜浮腫(非專利文獻4)。

而於含有ROCK阻礙劑之培養基中，培養RPE細胞時，雖有報告RPE細胞之接著性增強、細胞死亡之抑制、成熟度之亢進(非專利文獻5)，但並無報告移植RPE細胞時於RPE細胞懸浮液中含有ROCK阻礙劑。又，專利文獻1於段落0223中有記載「本揭示之組成物･･･亦可含有ROCK阻礙劑。」，但並無具體的濃度揭示，亦無實際上投予ROCK阻礙劑之實施例的揭示。又，雖有報告將角膜內皮細胞與ROCK阻礙劑同時移植之方法(非專利文獻6)，但本毫無提及關於RPE細胞與ROCK阻礙劑之同時投予，角膜內皮細胞之移植所使用的ROCK阻礙劑之最終濃度亦為100μM，係使用較高的濃度。如以上所述，就解決將RPE細胞以細胞懸浮液形態移植時所產生的不良事件之方法而言，依然並無報告。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特表2014-533289號公報 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Steven D Schwartz et al., Lancet. 2015 Feb 7；385(9967)：509-16 [非專利文獻2]J M Weisz et al., Retina.1999；19(6)：540-5 [非專利文獻3]Fujii S et al., Int J Mol Sci. 2020 Apr 27；21(9)：3077 [非專利文獻4]Sugita S et al., J Clin Med. 2020, in press. [非專利文獻5]Ni Y et al., Current Molecular Medicine 2017；17：637-646 [非專利文獻6]Kinoshita S et al., New England Journal of Medicine 2018；378：995-1003

[發明所欲解決之課題]

本發明之目的，為提供促進為了治療黃斑部病變或網膜色素病變(RP：retinitis pigmentosa)等之網膜病變疾病所移植的RPE細胞之存活的方法，及使該經移植之異體RPE細胞不被接受者側之淋巴球排斥的方法。 [用以解決課題之手段]

本發明者等人，對來自所移植之iPS細胞的RPE細胞懸浮液添加ROCK阻礙劑，移植於猴子之網膜。其結果，可確認於移植後之網膜，RPE細胞之逆流未發生，形成單層構造而存活。另一方面，於未添加ROCK阻礙劑地移植RPE細胞之猴子的網膜，雖可見細胞之存活，但確認到係作為細胞塊而存活，而非單層構造。又，經ROCK阻礙劑處理之RPE細胞，增殖被促進，細胞凋亡被抑制。進一步地，確認到經ROCK阻礙劑處理之RPE細胞，顯示出發炎性細胞激素及趨化介素之產生量，及HLA類型II之表現量變少。進一步地，確認到ROCK阻礙劑，藉由抑制輔助性T細胞、細胞毒性T細胞及單核球之增殖，來抑制發炎反應的效果。 本發明者等人基於此等之見解，發現ROCK阻礙劑之使用，於RPE細胞之移植治療中，有用於存活的促進、RPE細胞為異體細胞時之免疫反應的抑制，而完成本發明。

亦即，本發明提供如以下者。 [1]一種網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑，其含有ROCK阻礙劑。 [2]如[1]之移植用存活促進劑，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。 [3]如[1]或[2]之移植用存活促進劑，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。 [4]如[3]之移植用存活促進劑，其中多能性幹細胞為iPS細胞。 [5]一種網膜色素上皮細胞之移植用免疫抑制劑，其含有ROCK阻礙劑。 [6]如[5]之移植用免疫抑制劑，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。 [7]如[5]或[6]之移植用免疫抑制劑，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。 [8]如[7]之移植用免疫抑制劑，其中多能性幹細胞為iPS細胞。 [9]一種移植用醫藥組成物，其含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑。 [10]如[9]之移植用醫藥組成物，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。 [11]如[9]或[10]之移植用醫藥組成物，其中ROCK阻礙劑之濃度為0.01μM以上且未達100μM。 [11-2]如[9]或[10]之移植用醫藥組成物，其中ROCK阻礙劑之濃度為0.01~10μM。 [12]如[9]~[11]、[11-2]中任一項之移植用醫藥組成物，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。 [13]如[12]之移植用醫藥組成物，其中多能性幹細胞為iPS細胞。 [14]一種網膜色素上皮細胞之存活促進方法，其包含於網膜色素上皮細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予。 [15]一種ROCK阻礙劑，其係使用於促進經移植之網膜色素上皮細胞之存活。 [16]一種ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑。 [17]包含於網膜色素上皮細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予、對網膜色素上皮細胞之免疫反應抑制方法。 [18]一種ROCK阻礙劑，其係使用於抑制對經移植之網膜色素上皮細胞的免疫反應。 [19]一種ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造網膜色素上皮細胞之免疫反應抑制劑。 [20]一種網膜色素上皮細胞之移植方法，其包含將含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物對網膜疾病患者之網膜下投予。 [21]一種含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物，其係使用於網膜色素上皮細胞之移植。 [22]一種網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造移植用醫藥組成物。 [發明之效果]

依照本發明，藉由使用ROCK阻礙劑，所移植之RPE細胞懸浮液之於網膜下之存活被促進，可妨礙來自移植部位之RPE細胞之逆流或黃斑上皮之形成。又，藉由使用ROCK阻礙劑，可使移植於網膜下之RPE細胞形成與正常的網膜色素上皮相同之單層構造而存活，而非細胞塊狀。進一步地，移植所使用之RPE細胞為來自異體iPS細胞時，預期因HLA不一致而會有排斥反應，藉由使用ROCK阻礙劑，而透過經移植之RPE細胞的發炎性細胞激素及趨化介素之產生抑制效果以及接受者之淋巴球(輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、單核球)的增殖抑制效果，可期待免疫抑制作用。

本發明提供含有ROCK阻礙劑的網膜色素上皮(RPE)細胞之移植用存活促進劑(本發明之移植用存活促進劑)。又，本發明提供含有ROCK阻礙劑的RPE細胞之移植用免疫抑制劑(本發明之移植用免疫抑制劑)。

本發明中，ROCK阻礙劑只要係阻礙Rho激酶(ROCK)之作用的物質則不限制。Rho激酶(ROCK)，係作為位於低分子量G蛋白質Rho之下游的絲胺酸/蘇胺酸激酶而被發現。Rho/ROCK訊息傳導路徑，係與肌動蛋白細胞骨架或細胞接著等各種細胞機能相關。ES細胞或iPS細胞之繼代培養中，必需使細胞分散，但已知此等之幹細胞當在分散之狀態下培養時，因細胞凋亡而會引起細胞死亡。有報告因分散而引起的細胞凋亡，與Rho/ROCK訊息傳導路徑相關，藉由添加ROCK阻礙劑，會抑制細胞凋亡(細胞凋亡抑制作用)。進一步地，有報告將細胞冷凍保存時若添加ROCK阻礙劑，則解凍後之細胞生存率上昇(細胞生存率改善作用)。由於此等之報告，於ES細胞或iPS細胞之增殖培養時係添加ROCK阻礙劑。另一方面，通常於再生醫療用製品，係使用平衡鹽類溶液或DMEM/F12培養基等之基本培養基，而不含外來性之成分，此時本發明者等人發現於上述作用以外，如後述實施例所述，ROCK阻礙劑會促進經移植之RPE細胞懸浮液於網膜下之存活，妨礙RPE細胞自移植部位之逆流或黃斑上皮之形成(經移植之RPE細胞之存活促進作用)。又，確認到ROCK阻礙劑，於網膜下會使經移植之RPE細胞形成單層構造而存活，而非細胞塊狀(經移植之RPE細胞之存活促進作用)。進一步地，ROCK阻礙劑，可抑制經移植之異體RPE細胞之發炎性細胞激素及趨化介素之產生、HLA類型II之表現，且抑制接受者之淋巴球(輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、單核球)之增殖(對經移植之RPE細胞之免疫反應抑制作用)。

本發明中，ROCK阻礙劑，只要與新發現的上述作用(經移植之RPE細胞之存活促進作用及對經移植之RPE細胞之免疫反應抑制作用)同質或實質上同質，則不管何種分子皆可。「實質上同質」，係表示該等之作用在定性觀點上(例如生理學或藥理學上)相同。因此，前述作用較佳為同等，但此等作用之程度(例如約0.1~約10倍、較佳為約0.5~約2倍)亦可相異。前述作用之測定可根據本身公知之方法進行。如此之ROCK阻礙劑，例如可列舉Y-27632 dihydrochloride、Y-27632、Fasudil Hydrochloride、Netarsudil、Chroman 1、SLx-2119、HSD1590、GSK269962A hydrochloride、Exoenzyme C3, clostridium botulinum、Ripasudil、Afuresertib、Thiazovivin、GSK269962A、RKI-1447、Y-33075、GSK429286A、AT13148、H-1152 dihydrochloride、Y-33075 dihydrochloride、LX7101、SAR407899、ROCK-IN-2、Afuresertib hydrochloride、Hydroxyfasudil、GSK180736A、BDP5290、SR-3677、CCG-222740、CMPD101、Rho-Kinase-IN-1、SAR407899 hydrochloride、ROCK inhibitor-2、ZINC00881524、H-1152、Hydroxyfasudil hydrochloride、Fasudil、ROCK2-IN-2、Verosudil、SB-772077B dihydrochloride、GSK-25、CRT0066854 hydrochloride、Ripasudil free base、ROCK-IN-1等，較佳可列舉作為眼科用醫藥而市售或開發中或暗示該有用性之化合物，如此之化合物之具體例子可列舉Y-27632 dihydrochloride、Y-27632、Ripasudil等。

ROCK阻礙劑可藉由本身公知之方法。又，ROCK阻礙劑亦可購入市售品來使用。例如，Y-27632可由富士軟片和光純藥股份有限公司等購入。又，Ripasudil係以Glanatec(註冊商標)(Kowa)、Fasudil Hydrochloride係以Eril(註冊商標)(Asahi Kasei Pharma)等之商品名市售。

如上所述，ROCK阻礙劑具有經移植之RPE細胞之存活促進作用及對經移植之RPE細胞之免疫反應抑制作用，因此係作為RPE細胞之移植用存活促進劑或RPE細胞之移植用免疫抑制劑而被提供。

本發明中，RPE細胞係指構成網膜色素上皮之上皮細胞，及其前驅細胞。是否為網膜色素上皮細胞，例如可藉由細胞標記(RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1等)之表現，或細胞之形態(細胞內之黑色素沈積、多角形且扁平之類上皮之細胞形態、多角形之肌動蛋白束之形成等)等而確認。又，網膜色素上皮細胞之前驅細胞，意指其方向為對網膜細胞之分化誘導的細胞，是否為該前驅細胞，可藉由細胞標記(Mitf(色素上皮細胞、色素上皮前驅細胞)、Pax6(色素上皮前驅細胞)、Rx(網膜前驅細胞)、OTX2(網膜前驅細胞)、RPE65(色素上皮細胞)、BEST1(色素上皮細胞))之表現等而確認。又，網膜色素上皮細胞之機能評估，例如能夠以細胞激素(VEGF或PEDF等)之分泌能力或吞噬能力等為指標來確認。此等之機能評估及確認操作，所屬技術領域中具有通常知識者可設定適當條件來實施。

RPE細胞，可由保有RPE細胞的任意動物得到、亦可藉由自多能性幹細胞以本身公知之方法進行分化誘導而得到，更佳為自多能性幹細胞分化誘導之細胞。作為多能性幹細胞，只要係具有可分化為存在於生物體之全部細胞的多能性，且亦一併具有增殖能力之幹細胞，則不特別限定，例如包含胚胎幹細胞(ES細胞)、藉由核移植所得之核移植胚來源的胚胎幹細胞(ntES細胞)、精子幹細胞(GS細胞)、胚生殖細胞(EG細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、培養纖維母細胞或骨髓幹細胞來源的多能性細胞(Muse細胞)等。較佳的多能性幹細胞為ES細胞及iPS細胞，更佳為iPS細胞。多能性幹細胞之來源不特別限制，例如可列舉下述任一者之被報告樹立了多能性幹細胞的任意動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類、小鼠、大鼠等，最佳為人類。

ES細胞為來自受精卵之8細胞期，桑椹胚後之胚的胚盤囊之內部細胞塊的來自胚之幹細胞，具有分化為構成成體之任何細胞的能力即所謂的分化多能性，與自我複製之增殖能力。ES細胞係於1981年於小鼠被發現(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292：154-156)，之後於人類、猴子等之靈長類亦樹立了ES細胞株(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282：1145-1147；J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92：7844-7848；J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55：254-259；J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38：133-165)。

ES細胞可藉由自對象動物之受精卵之胚盤囊中取出內部細胞塊，並將內部細胞塊於纖維母細胞之滋養層(feeder)上培養而樹立。又，以繼代培養來維持細胞，可使用添加了白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、鹼性纖維母細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))等之物質的培養液來進行。關於人類及猴子之ES細胞之樹立與維持之方法，例如記載於USP5,843,780；Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92：7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282：1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345：926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103：9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222：273-279；H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99：1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444：481-485等。

iPS細胞，為可藉由將特定之初始化因子以DNA或蛋白質之形態導入於體細胞而製作的具有與ES細胞大致同等之特性例如分化多能性與自我複製之增殖能力的來自體細胞之人工之幹細胞(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126：663-676；K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131：861-872；J. Yu et al. (2007), Science, 318：1917-1920；Nakagawa, M.等,Nat. Biotechnol. 26：101-106 (2008)；國際公開WO 2007/069666)。

本說明書中所使用之體細胞之用語，係指卵子、卵母細胞、ES細胞等之生殖系列細胞或分化全能性細胞以外的任何動物細胞(較佳為包含人類之哺乳動物細胞)。體細胞係非限定地包含胎兒之體細胞、新生兒之體細胞，及成熟之健全或疾病性之體細胞的任意者，又，亦包含初代培養細胞、繼代細胞，及株化細胞之任意者。具體而言，體細胞例如例示有(1)神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、齒髓幹細胞等之組織幹細胞(體幹細胞)；(2)組織前驅細胞；(3)淋巴球、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、纖維母細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃黏膜細胞、腸細胞、脾臟細胞、胰臟細胞(胰臟外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等之經分化之細胞等。

初始化因子，可藉由於ES細胞特異性表現之基因、其基因產物或non-cording RNA或對於ES細胞之未分化維持扮演重要角色之基因、其基因產物或non-cording RNA，或低分子化合物所構成。初始化因子中所包含之基因，例如例示有Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等，此等之初始化因子可單獨使用、亦可組合使用。初始化因子之組合，例示有WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26：795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2：525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26：2467-2474、Huangfu D,et al. (2008), Nat Biotechnol. 26：1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3：475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11：197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27：459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106：8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461：649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5：491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6：167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463：1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28：713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474：225-9.記載之組合。

由ES細胞分化誘導RPE細胞之方法，例如可列舉SDIA法(PNAS, 99：1580-1585, 2002)、SFEB法(Nat. Biotechnol., 26：215-224, 2008)等，但不限定於此等。又，由iPS細胞亦可藉由相同之方法來分化誘導RPE細胞(例如Neurosci. Lett., 458：126-131, 2009；PLoS One, 8：409-412, 2011)。或者亦可使用WO2015/053375、WO2015/053376、WO2015/125941、WO2017/043605等記載之方法。

本發明之移植用存活促進劑，可促進經移植於網膜下之RPE細胞之集團的存活。存活係指經移植之RPE細胞之集團，於移植部位透過布氏膜(Bruch's membrane)而與脈絡膜接著的狀態。存活的RPE細胞之集團的比例，為經移植之RPE細胞之集團的至少50%以上(例：50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或以上)。接著之RPE細胞之集團的形態，只要係接著於布氏膜則不特別限制，例如可列舉細胞塊、多層構造、單層構造等，較佳為形成單層構造。

當被移植的RPE細胞為異體細胞時，通常預期因接受者之淋巴球，而對RPE細胞會有排斥反應，但本發明之移植用免疫抑制劑，可抑制該排斥反應。排斥反應之抑制，於接受者，係指抑制淋巴球(輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、B細胞、樹狀細胞等)之增殖、活化。又，於捐贈者，係指抑制被移植之異體RPE細胞之發炎性細胞激素及趨化介素的產生、HLA類型II的表現。發炎性細胞激素例如可列舉TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、IFNγ等，但不限定於此等。又，發炎性趨化介素，例如可列舉CXCL11/I-TAC、CCL2/MCP-1、CXCL8/IL-8等，但不限定於此等。

又，本發明之移植用免疫抑制劑，亦可進一步含有別的免疫抑制劑。如此之免疫抑制劑，例如可列舉環孢素、咪唑立賓(mizoribine)、環磷醯胺、硫唑嘌呤、他克莫司(tacrolimus)及黴菌酚酸(mycophenolate mofetil)等，但不限定於該等。

本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑投予的對象，例如可列舉具有黃斑部病變(例如萎縮型及滲出型老年性黃斑部病變、斯特格氏病)、網膜色素病變等之網膜疾病的哺乳動物(例如人類、小鼠、大鼠等，較佳為人類)。

本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑可進一步適當選擇例如緩衝劑、等張化劑、黏性基劑、鉗合劑、pH調整劑、抗氧化劑等，只要是醫藥上容許之藥物載體則不特別限制，且在不對RPE細胞之存活率、免疫抑制效率造成影響的範圍內含有。 緩衝劑例如可列舉磷酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、檸檬酸緩衝劑、酒石酸緩衝劑、乙酸緩衝劑、胺基酸等。 等張化劑，可列舉山梨醇、葡萄糖、甘露醇等之糖類、甘油、丙二醇等之多元醇類、氯化鈉等之鹽類、硼酸等。 黏性基劑，可列舉聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、聚乙烯醇等之水溶性高分子；羥基乙基纖維素、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉等之纖維素類等。 鉗合劑可列舉乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸等。 pH調整劑例如可列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硼酸或其鹽(硼砂)、鹽酸、檸檬酸或其鹽(檸檬酸鈉、檸檬酸二氫鈉等)、磷酸或其鹽(磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等)、乙酸或其鹽(乙酸鈉、乙酸銨等)、酒石酸或其鹽(酒石酸鈉等)等。 抗氧化劑例如可列舉麩胱甘肽、亞硫酸氫鈉、乾燥亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、生育酚等。

本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑之pH，通常調整為約5.0~約8.5、較佳調整為約7.0~約8.0，較佳可進行使用了膜濾器等之過濾滅菌等之滅菌處理。

本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑，係於對前述對象移植RPE細胞之同時或其前後進行投予。本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑之投予量，亦依投予對象、對象疾病、症狀等而異，例如使用於成人時，較適宜為將本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑，以1次量為通常50~500μL、較佳為100~ 300μL，於1次的手術，於對對象之網膜下移植RPE細胞之同時或其前後進行投予。將本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑於RPE細胞之移植前後進行投予時，可於RPE細胞之移植前後5分鐘~30分鐘以內投予本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑。又，於本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑之投予後，較佳將投予之對象以臉朝上的狀態將頭部固定。藉此，對網膜下投予之RPE細胞容易接著，RPE細胞之逆流被抑制。固定的時間，只要是為了使對網膜下投予之RPE細胞接著所充分的時間則不特別限制，通常可列舉30分鐘~5小時、較佳可列舉1小時~4小時、更佳可列舉2小時~3小時。本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑，亦可依需要錯開時間複數次投予。

又，本發明提供一種RPE細胞之存活促進方法(本發明之存活促進方法)，其包含於RPE細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予。又，本發明提供一種對RPE細胞之免疫反應抑制方法(本發明之免疫反應抑制方法)，其包含於RPE細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予。本發明之存活促進方法或免疫反應抑制方法之投予對象、對象疾病、投予方法等，可與本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑之投予對象、對象疾病、投予方法等相同。

本發明之存活促進方法或免疫反應抑制方法，可進一步包含將經投予ROCK阻礙劑之網膜疾病患者以臉朝上的狀態固定頭部。固定之時間，只要是為了使對網膜下投予之RPE細胞接著所充分的時間則不特別限制，通常可列舉30分鐘~5小時、較佳可列舉1小時~4小時、更佳可列舉2小時~3小時。

又，本發明提供含有RPE細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物(本發明之移植用醫藥組成物)。

本發明之移植用醫藥組成物中所含有的RPE細胞及ROCK阻礙劑，可與本發明之移植用存活促進劑或移植用免疫抑制劑中記載的RPE細胞及ROCK阻礙劑相同。

本發明之移植用醫藥組成物中所含有的ROCK阻礙劑之濃度，只要係在保持經移植之RPE細胞之存活促進作用及對經移植之RPE細胞的免疫反應抑制作用之同時，對該RPE細胞不造成損傷之濃度，則不特別限制，但ROCK阻礙劑之濃度過低時，不會發揮存活促進作用及免疫反應抑制作用，ROCK阻礙劑之濃度過高時，有對RPE細胞造成不良影響的情況。因此，本發明之移植用醫藥組成物中所含有的ROCK阻礙劑之下限濃度，通常為0.01μM以上、較佳為0.1μM以上、更佳為1μM以上。又，本發明之移植用醫藥組成物中所含有的ROCK阻礙劑之上限濃度，通常為未達100μM、較佳為50μM以下。可適當組合上限值與下限值。又，ROCK阻礙劑之濃度，可依ROCK阻礙劑之種類，適當選擇適合的範圍。例如，Y-276320之濃度，通常為1~50μM、較佳為10μM。又，例如，Ripasudil之濃度，通常為0.1~50μM、較佳為0.5~10μM。

作為本發明之移植用醫藥組成物所調製之RPE細胞，可為由培養自保有RPE細胞之任意動物所得之細胞而得的細胞或多能性幹細胞，藉由本身公知之方法於分化誘導條件下培養所得之細胞，亦可為由冷凍保存狀態剛解凍後之細胞。

所調製之RPE細胞為經培養之RPE細胞時，作為用於培養之基本培養基，例如包含StemFit(例：StemFit AK03N、StemFit AK02N)(味之素公司)、PECM (Primate ES Cell Medium)、GMEM(格拉斯哥最低限度必需培養基：Glasgow Minimum Essential Medium)、IMDM(依斯克夫氏修改達爾伯克氏培養基：Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、199培養基、伊格爾氏最低限度必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM)、αMEM、達爾伯克氏修改伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、費雪氏培養基(Fischer's medium)，及此等之混合培養基等。

基本培養基中，可適當添加血清(例：胎牛血清(FBS)、人類血清、馬血清等)或血清替代物、胰島素、各種維生素、L-麩醯胺、非必需胺基酸等之各種胺基酸、2-巰基乙醇、各種細胞激素(介白素類(IL-2、IL-7、IL-15等)、幹細胞因子(SCF(Stem cell factor))、活化素等)、各種激素、各種增殖因子(白血病抑制因子(LIF)、鹼性纖維母細胞增殖因子(bFGF)、TGF-β等)、各種細胞外基質、各種細胞接著分子、盤尼西林/鏈黴素、嘌呤黴素等之抗生素、酚紅等之pH指示藥等。血清替代物，包含白蛋白、運鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、Knockout Serum Replacement(KSR)、ITS-補充劑及此等之混合物等。

培養溫度不特別限定，為約30~約40℃、較佳為約37℃，係在含CO ₂之空氣的存在下進行培養，CO ₂濃度較佳為約2~5%。

經培養之RPE細胞，可與ROCK阻礙劑一起直接作為本發明之移植用醫藥組成物而調製，亦可經適當稀釋劑稀釋，並藉由離心分離洗淨。稀釋劑可使用生理食鹽水或PBS。稀釋及洗淨步驟可於室溫至約37℃進行、亦可於約4℃之冷卻下進行。洗淨操作可僅1次、亦可重複2至數次。

所調製之RPE細胞，為經冷凍保存之RPE細胞時，較期望於剛解凍後，藉由適當之稀釋劑稀釋，並藉由離心分離而洗淨。稀釋劑可使用生理食鹽水或PBS。稀釋及洗淨步驟可於室溫至約37℃進行、亦可於約4℃之冷卻下進行。洗淨操作可僅1次、亦可重複2至數次。

本發明之移植用醫藥組成物可進一步含有醫藥上容許之藥物載體，其不特別限制，例如可適當選擇培養基、抗生劑、胺基酸、血清替代物等，於不對RPE細胞之存活率、免疫抑制效率造成影響的範圍內含有。 培養基可使用培養所使用之前述培養基。 抗生劑例如可列舉阿司黴素(astromicin)、卡納黴素、建它黴素、紫蘇黴素(sisomycin)、盤尼西林、鏈黴素、奇黴素、護樂黴素(fradiomycin)、安比西林等。 胺基酸可列舉必需胺基酸(纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、蘇胺酸、組胺酸)、非必需胺基酸(精胺酸、甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺、脯胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸)，以及牛磺酸等。 血清替代物，包含白蛋白、運鐵蛋白、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、Knockout Serum Replacement (KSR)、ITS-補充劑及此等之混合物等。

又，本發明之移植用醫藥組成物，亦可進一步含有別的免疫抑制劑。如此之免疫抑制劑例如可列舉環孢素、咪唑立賓、環磷醯胺、硫唑嘌呤、他克莫司及黴菌酚酸等，但不限定於該等。

本發明之移植用醫藥組成物中之RPE細胞之密度，只要係於疾病部位亦即黃斑部病變或網膜色素病變中之網膜色素上皮之缺損部位所注入的懸浮液(例如50~500μL、較佳為100~300μL)中，含有治療上有效量之RPE細胞，則不特別限制，例如可懸浮為100~20,000細胞/μL、較佳為1,000~10,000細胞/μL之細胞密度。本發明之移植用醫藥組成物，相較於不含有ROCK阻礙劑之RPE細胞之懸浮液而言，RPE細胞之存活性更優良，亦可抑制免疫反應，因此可減低使與以往法同等量之活RPE細胞到達移植部位所需的起始RPE細胞數，且可削減移植所必要的RPE細胞之調製所需的成本或時間。

本發明之移植醫藥組成物，可藉由使用適當之注射器及含針之移植用裝置(例如MedOne0(註冊商標) Poly Tip(註冊商標)Cannula 25g/38g等)，例如注入於具有黃斑部病變(例如萎縮型及滲出型老年性黃斑部病變、斯特格氏病)、網膜色素病變等之網膜疾病的哺乳動物(例如人類、小鼠、大鼠等，較佳為人類)之網膜下，而進行移植。

本發明之移植醫藥組成物之投予量，雖亦依投予對象、對象疾病、症狀等而異，例如使用於成人時，較適合將本發明之移植醫藥組成物以1次量通常為50~500μL、較佳為100~300μL，以1次之手術對於對象之網膜下投予。又，本發明之移植醫藥組成物之投予後，係將所投予之對象以臉朝上的狀態固定頭部，維持3小時。藉此，對網膜下所投予之RPE細胞容易接著，且RPE細胞之逆流被抑制。

又，本發明提供一種網膜色素上皮細胞之移植方法，其包含將含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物對網膜疾病患者之網膜下投予(本發明之移植方法)。本發明之移植方法之投予對象、對象疾病、投予方法等，可與本發明之移植用醫藥組成物之投予對象、對象疾病、投予方法等相同。

本發明之移植方法，可進一步包含將經投予本發明之移植用醫藥組成物的網膜疾病患者以臉朝上的狀態固定頭部。固定之時間，只要是為了使對網膜下投予之RPE細胞接著所充分的時間則不特別限制，通常可列舉30分鐘~5小時、較佳可列舉1小時~4小時、更佳可列舉2小時~3小時。

以下顯示實施例，以更具體說明本發明，但本發明並不受此等任何限定。 [實施例]

實施例1 Y-27632 ROCK阻礙劑之利用 (實驗方法) iPS由來RPE(iPS-RPE)細胞之培養之準備 為了分化為RPE細胞，係如Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20；56(2)：1051-62所記載般培養人類iPS細胞(TLHD2、Ff-I01、453F2及253G1株)。確立iPS-RPE細胞後，培養基係使用經補充B27補充劑(Invitrogen)及2mM L-麩醯胺(Sigma)的達爾伯克氏修改伊格爾氏培養基(DMEM)，將RPE群落移至於經補充basic FGF(Wako)及SB431542(Sigma)的B27培養基中經CELLstart ^TM(Invitrogen)被覆的培養盤或培養皿中，培養至成為滿盤(confluent)。於數個分析中係將Y-27632 ROCK阻礙劑(1、10、50及100μM：Wako)添加於DMEM培養基+10%胎牛血清(FBS)中。研究係遵照赫爾辛基宣言之宗旨，而被理化學研究所 生命機能科學研究中心(BDR)之倫理委員會認可。

於Y-27632存在下之iPS-RPE細胞之形態、增殖及色素沈積 將由iPS細胞(Ff-I01、TLHD2、453F2、454E2：健康捐贈者)所誘導的2 x 10 ⁵RPE細胞於未被覆之24孔培養盤中，於10μM Y-27632之存在下或非存在下培養3日。藉由FACS分析或顯微鏡像中之Ki-67陽性細胞，來評估該RPE細胞之增殖。培養基(總量2mL)係使用DMEM+10% FBS。又，為了評估RPE細胞(454E2)中之色素沈積，係於Y-27632之存在下或非存在下，以上述條件培養該細胞4週。發明者等人在4週培養期間，每週添加Y-27632一次。

經Y-27632處理之iPS-RPE細胞中之細胞間接著分析 發明者等人調查了經Y-27632處理之RPE細胞(Ff-I01、TLHD2及253G1)之細胞接著。於10μM Y-27632之存在下或非存在下，以上述條件培養RPE細胞48小時。將細胞回收後，發明者等人以羧基螢光素 琥珀醯亞胺酯(CFSE, Cayman Chemical Company)標示2種RPE細胞，將1 x 10 ⁵RPE細胞於未被覆之24孔培養盤中進行4小時再培養。將細胞洗淨2次後，發明者等人藉由FACS或顯微鏡，測定培養盤上之CFSE陽性RPE細胞(螢光、綠)。發明者等人於不同RPE細胞株亦進行5次相同的實驗。

經Y-27632處理之iPS-RPE細胞中之細胞凋亡分析 將iPS-RPE細胞(24孔盤中2 x 10 ⁵/孔；Ff-I01、TLHD2及253G1株)以Y-27632(10μM)處理24小時。為了評估培養中之細胞死亡，藉由流式細胞儀分析測定膜聯蛋白V (Annexin V)陽性RPE細胞。為了染色，將該RPE細胞(經Y-27632處理或未處理之iPS-RPE細胞)以細胞染色緩衝液(BioLegend)洗淨，以膜聯蛋白V結合緩衝液(BioLegend：catalog no. 420201)再懸浮。將該細胞以FITC標示抗膜聯蛋白V抗體(BioLegend：catalog no. 640906)於室溫染色15分鐘。使用FACSCanto ^TMII流式細胞儀(BD Biosciences)解析樣品。發明者等人於不同RPE細胞株亦進行5次相同的實驗，將數據以FlowJo軟體(version 9.3.1)解析。

經Y-27632處理之iPS-RPE細胞上之HLA類型II分子之表現 於分析前，將iPS-RPE細胞以重組人類IFN-γ(100 ng/mL：R&D systems)進行48小時前處理。以FACS解析來評估經Y-27632處理之iPS-RPE細胞(控制組為非處理細胞)上之HLA類型II分子之表現。於染色前以人類Fc block (Miltenyi Biotec)將該細胞於4℃培置15分鐘(incubate)。以人類Fc block染色後，將該RPE細胞以FITC標示抗HLA類型II抗體(HLA-DR、DQ、DP：BioLegend：catalog no. 361705)於4℃進行30分鐘室溫染色。將RPE細胞進一步以FITC標示抗小鼠IgG於4℃進行30分鐘室溫染色。使用FACSCanto ^TMII解析RPE樣品。

淋巴球-移植片細胞免疫反應(LGIR)試驗 購入來自健康人數人(全部的HLA對RPE細胞並未一致)之末梢血單核球(PBMC)(stock PBMC：Precision for Medicine)，以LGIR分析為目的而調製。又，發明者等人調製了經Y-27632處理或未處理TLHD2 iPS-RPE細胞之2種RPE細胞。該RPE株之單倍型，為HLA-A*26：01/31：01；HLA-B*39：01/51：01；HLA-C*07：02/14：02；HLA-DRB1*09：01/15：01；HLA-DQB1*03：03/06：02；HLA-DPB1*02：01/05：01。於該RPE細胞之存在下，將該PBMC以含有10% FBS、人類重組IL-2(BD)，及其他物質(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：619-634)之RPMI1640培養基，以in vitro進行共培養。包含抗體資訊之LGIR分析(Ki-67 FACS分析)之方法，係遵照Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：619-634之記載。亦調製EBV轉形B細胞作為陽性控制組(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：619-634)。使用FACSCanto ^TMII解析PBMC樣品。

經Y-27632處理iPS-RPE細胞所致之吞噬作用 將iPS-RPE細胞與經FITC標示之豬的脫落感光受體桿體外節(ROS, 10μg/cm ²)一起於37℃培養24小時，使用流式細胞儀分析進行解析。亦調製於FITC-ROS非存在下培養的iPS-RPE細胞(控制組細胞) (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20；56(2)：1051-62)。

經Y-27632處理iPS-RPE細胞中之RPE特異性標記及發炎性細胞激素之表現 為了確認經Y-27632處理iPS-RPE細胞中之RPE特異性標記或發炎性細胞激素/趨化介素，發明者等人藉由定量RT-PCR、ELISA，及免疫組織化學調查了數種類之因子。使用定量RT-PCR 來評估對VEGF-A、PEDF、Bestrophin-1 (Best1)、RPE65、Pax6及酪胺酸酶(RPE特異性標記)以及IL-6、TNF-α、CXCL11/I-TAC及CCL2/MCP-1 (發炎性細胞激素/趨化介素)之mRNA之表現。由經Y-27632處理iPS-RPE細胞株(TLHD2)單離全部RNA。cDNA合成後，藉由使用qPCR Mastermix及高特異性Universal ProbeLibrary分析(全部為Roche Diagnostics)，並以LightCycler 480裝置進行qRT-PCR，以於3種樣品解析上述因子及β-肌動蛋白之表現。對於Best1、RPE65、Pax6及β-肌動蛋白(控制組)之試驗用引子及Universal Probe，以及PCR條件，係遵照Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015 Jan 20；56(2)：1051-62之記載。另一引子及探針係如以下所述：

將結果以分子之相對性表現來表示(ΔΔCt：control cells= 1)。藉由使用人類CCL2/MCP-1 ELISA (R&D Systems)，測定經Y-27632處理iPS-RPE細胞株(TLHD2)、Y-27632未處理控制組RPE細胞之上清液中的CCL2/MCP-1之濃度。 亦藉由免疫組織化學來測定iPS-RPE細胞(TLHD2)中之VEGF之表現。將經Y-27632處理iPS-RPE細胞或Y-27632未處理控制組RPE細胞以4% PFA-PBS於室溫固定15分鐘，以0.3% Triton X-100-PBS進行透過處理。1次抗體係使用抗人類VEGF抗體(abcam：catalog no. ab52917)或同型控制組(兔子)，二次抗體係使用Alexa Fluor-488抗兔子IgG (Invitrogen：catalog no. A11034)。將細胞核以DAPI進行對比染色。如Stem Cell Reports. 2017 Nov 14；9(5)：1501-1515所記載，發明者等人係藉由使用了共軛焦顯微鏡之抗體或平均螢光強度之測定，來評估RPE染色。

對由來自人類iPS/ES細胞之3D網膜所確立的網膜神經節細胞及神經網膜之Y-27632毒性in vitro分析 為了確認Y-27632對網膜中之網膜神經節細胞(RGC)及神經網膜(NR)的毒性，發明者等人，係由來自人類iPS細胞之3D網膜調製RGC、由來自人類ES細胞之3D網膜調製NR。將由來自TLHD2 iPS細胞之3D網膜所誘導的1 x 10 ⁴RGC，於12孔盤中，於10 μM Y-27632之存在下或非存在下培養24小時或7日。如Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Feb 1；59(2)：776-787所記載，確立由3D網膜所純化之RGC，調查如Brn-3b般的RGC特異性標記。又，亦調製NR (來自ES細胞之3D網膜：CRX：：Venus)。具體而言，係於10 μM Y-27632存在下，於24孔盤中將5 x 10 ⁴細胞/孔進行培養7日，如Cell Stem Cell. 2012 Jun 14；10(6)：771-785所記載，確立由3D網膜所純化之NR。以顯微鏡評估該RGC及NR之形態。又，發明者等人係藉由流式細胞儀分析，於Y-27632之存在下，測定膜聯蛋白V陽性RGC或NR。

In vivo動物模式中之移植 猴子之操作及維持，係與理化學研究所 生命機能科學研究中心(BDR)之動物實驗倫理委員會之指引同樣地，遵照眼及視覺研究中之動物之使用及對實驗動物之使用的ARVO宣言。發明者等人，首先由正常之食蟹猴(Macaca fascicularis)調製2種之iPS細胞、(1) 來自Cyn46 MHC異型合子猴子之46a iPS細胞及(2) 來自HT-1 MHC同型合子猴子之1121A1 iPS細胞(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：635-648)。正常之食蟹猴(Hekoayu, Utsubo, Ukigori)係由Eve Bioscience Ltd. (Wakayama, Japan)購入，MHC調節猴子(單倍型為一致：DrpZ11)係由Ina Research Inc. (Nagano, Japan)購入。為了進行iPS-RPE細胞之移植，係實施完全的玻璃體切除(Accurus, Alcon)，如(Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：635-648)所詳細記載的，係將iPS-RPE細胞以成為單一細胞懸浮液的方式，懸浮於猴子移植培養基(SFRM-B27培養基；DMEM 350mL (SIGMA D6046), F12 Ham, 150mL (SIGMA N6658), L-Glutamine 5 mL (SIGMA G7513), P/S 5mL (GIBCO 15140-122), B27 10 mL (GIBCO 17504-044))中，以成為1 x 10 ⁶cells/eye的方式移植於網膜下之空間。具體而言，係添加ROCK阻礙劑Y-27632 (10μM)於單一細胞懸浮液中，以手術對網膜插入Y-27632移植片RPE細胞。亦調製Y-27632未處理RPE細胞作為控制組(Hekoayu右眼)。外科手術後，將經手術的猴子頭部藉由麻醉將臉朝上固定3小時。 手術後1、2、4、8週(DrpZ11猴子)以及12週及6個月(Hekoayu)，藉由彩色眼底照片、FA (RetCamII及Clarity雙方)及OCT (Nidek)，監測經移植之細胞。發明者等人，於MHC單倍型不一致之Hekoayu猴子中之食蟹猴的眼中，移植含環孢素A之免疫抑制劑以及同種異體(allogenic) iPS-RPE細胞。發明者等人，於手術前後監測來自猴子之血清中之環孢素A之濃度。又，發明者等人對Utsubo猴子進行局部類固醇之丙酮特安皮質醇之Tenon囊下注射(STTA)。又，發明者等人於經移植之猴子Hekoayu、Utsubo、Ukigori及DrpZ11中，調查MHC對偶基因分型(Mafa-class I及class II)(Immunogenetics. 2015 Oct；67(10)：563-78)。又，發明者等人於移植後藉由NIH影像J軟體計算移植片面積(pixcel/mm ²)。 為了確認Y-27632對網膜組織之毒性，發明者等人對正常猴子之眼(Ukigori 右眼)注射10 μM Y-27632。發明者等人對左眼僅注射不含Y-27632之生理食鹽水作為控制組。發明者等人於手術後藉由彩色眼底、OCT、焦點ERG，及蘇木素及伊紅(H&E)染色之試驗評估毒性。

對網膜切片之免疫組織化學(IHC) 將猴子犠牲後，於第8週(DrpZ11)或第6個月(Hekoayu、Utsubo)將回收之眼固定，以石蠟(Sigma-Aldrich)包埋。將網膜切片以5%山羊血清進行阻隔(blocking)。將切片與抗免疫細胞/因子(CD3、CD4、CD8、CD20、CD40、MHC-類型II、IgG、NKG2A及Iba1)的一次抗體一起於4℃培置一晩。實施網膜切片之染色。抗體資訊記載於Stem Cell Reports. 2017 Nov 14；9(5)：1501-1515及Stem Cell Reports. 2016 Oct 11；7(4)：635-648。為了追蹤移植後之移植片，發明者等人以PKH (567 nm：Sigma-Aldrich：catalog no. PKH26GL)將RPE細胞染色。影像係由共軛焦顯微鏡(LSM700, Zeiss)取得。

經Y-27632處理iPS-RPE細胞中之pMLCII IHC染色 使利用TrypLE Select(ThermoFisher)所分化的QHJIs01-01 iPSC來源之RPE細胞分散，於RPE儲備溶液中，於10 μM Y-27632 (Wako)存在下或非存在下，播種於未被覆或經Laminin E8片段(iMatrix511, Matrixosome)被覆之24孔盤(Falcon)中。培置15分鐘至24小時後，將RPE細胞以4% PFA於4℃固定30分鐘。將該經Y-27632處理之RPE細胞以Alexa Fluor 594接合Phalloidin (x1000：Thermo A12381)及Phospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗體(x200：Cell Signaling, # 3671S)染色。作為對pMLCII染色之二次抗體，係使用Alexa Fluor 488接合驢子抗兔子IgG。為了進行time-course分析，發明者等人調製經Y-27632處理或未處理RPE細胞，培置時間為15分鐘、30分鐘、60分鐘、3小時、6小時及24小時。為了進行濃度分析，發明者等人又調製0、0.01、0.1、1、10、100 μM之經Y-27632處理之Y-27632處理RPE細胞。將細胞核以DAPI進行對比染色。使用螢光顯微鏡BZ-X800 (Keyence)觀察全樣品。

統計評估 以Student’st檢定 (適當進行兩側檢定或單側檢定)實施全統計解析。P未達0.05時，認為值在統計上為顯著。

(結果) 併用Y-27632之異體iPS-RPE細胞混濁液移植食蟹猴模式(Hekoayu)之左眼術後經過 於移植後第23週之左眼之彩色眼底影像(Color)及自發螢光眼底影像(AF)之觀察中，於移植部位可見具有色素之移植片RPE細胞之擴展、存活(圖1)。於自發螢光眼底影像之後期影像(FA late)中，並無螢光自移植片RPE細胞漏出亦即排斥反應，於網膜斷層影像(OCT)中移植片RPE細胞亦為存活，未觀察到排斥反應，於網膜未見到異常(圖1)。於移植後第23週之左眼之蘇木素及伊紅(H&E)染色像，亦可確認到移植片RPE細胞形成單層構造而存活(圖2)。又，以PKH之免疫組織染色影像中，亦可見到移植片RPE細胞之存活(圖3)。進一步地，於使用該網膜切片之免疫病理學的觀察中亦未見到排斥反應，網膜及脈絡膜近於正常。又，於彩色眼底影像、網膜斷層影像、免疫組織染色像之任意者中均未見到移植後之黃斑前膜之形成。

未使用Y-27632之異體iPS-RPE細胞混濁液移植食蟹猴模式(Hekoayu)之右眼術後經過 於移植後第24週之右眼之彩色眼底影像(Color)及自發螢光眼底影像(AF)之觀察中，雖於移植部位見到具有色素之移植片REP細胞之存活，但非單層構造而形成細胞塊。惟，於自體螢光眼底影像之後期影像(FA late)中，並無螢光自移植片RPE細胞漏出(排斥反應)，於網膜斷層影像(OCT)移植片RPE細胞亦為存活，未觀察到排斥反應，於網膜未見到異常(圖4)。又，於該網膜切片之蘇木素及伊紅(H&E)染色像中，亦可確認到移植片RPE細胞為細胞塊(圖5)。

併用Y-27632之異體iPS-RPE細胞與未使用ROCK阻礙劑之異體iPS-RPE細胞之存活面積 使用NIH影像J軟體計算使用Y-27632而存活的iPS-RPE細胞之存活面積與未使用Y-27632而存活的iPS-RPE細胞之存活面積。使用Y-27632之細胞的面積為4.594mm ²，另一方面，未使用Y-27632之細胞的面積為0.846mm ²。因此，可知併用Y-27632之異體iPS-RPE細胞係形成單層構造而存活(圖6)。

經Y-27632處理iPS-RPE細胞中之Phospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)之檢測 發明者等人調查於Y-27632前處理RPE細胞中，ROCK活性如何被控制。免疫組織化學解析中，顯示出iPS-RPE細胞中之pMLCII之表現被Y-27632阻礙(圖7)。於將RPE細胞以Y-27632處理後15分鐘係開始磷酸化的停止，至少持續24小時(圖8A)。於濃度解析中，添加100μM Y-27632後，顯示出RPE細胞被傷害(蠅虎蕈鹼之染色變弱)，可見10μM之濃度最為適切(圖8B)。

經Y-27632前處理之iPS-RPE細胞其發炎性細胞激素/趨化介素產生係被抑制 發明者等人調查iPS-RPE細胞於Y-27632存在下，發炎性細胞激素/趨化介素的產生。發明者等人係使用定量RT-PCR及ELISA，調查經Y-27632處理iPS-RPE細胞產生之IL-6、TNF-α、CXCL11/I-TAC及CCL2/MCP-1。於定量RT-PCR解析之數據中，經Y-27632處理之iPS-RPE細胞，IL-6、CXCL11/I-TAC及CCL2/MCP-1之mRNA表現較少，未表現TNF-α mRNA(圖9)。於Y-27632之用量依賴性分析中，經Y-27632處理之iPS-RPE細胞，相較於未處理之RPE細胞而言，CCL2/MCP-1 mRNA(圖10)及蛋白質(圖11)之表現較少。由此等之結果，顯示出經Y-27632處理之RPE細胞其發炎性細胞激素/趨化介素的產生量變少。

ROCK阻礙劑係直接抑制活化淋巴球 發明者等人調查Y-27632是否於in vitro直接抑制淋巴球之活化。結果，實施混合淋巴球反應(MLR)時，Y-27632係直接抑制CD4 ⁺/Ki-67 ⁺細胞(增殖性輔助性T細胞)、CD8 ⁺/Ki-67 ⁺細胞(增殖性細胞毒性T細胞)及CD11b ⁺/Ki-67 ⁺細胞(增殖性單核球)之細胞增殖(圖12、13)。又，Y-27632係統計上顯著地抑制發炎性細胞激素IFN-γ的產生(圖14)。由以上，顯示出Y-27632具有發炎阻礙能力。

實施例2 Ripasudil(Ripasudil) ROCK阻礙劑之利用 使用Ripasudil(Toronto Research Chemicals)作為ROCK阻礙劑，以取代Y-27632 (Wako)，遵照如下所述之方法進行各分析。

Ripasudil存在下之iPS-RPE細胞之形態及增殖 將由iPS細胞(253G1：健康捐贈者)所誘導的2 x 10 ⁵RPE細胞於未被覆之24孔培養盤中，於Ripasudil(0.01、0.1、1、10μM)或作為控制組用之Y-27632 (10μM)之存在下或非存在下進行培養，藉由24小時後之FACS分析，及培養3日後之顯微鏡像中之Ki-67陽性細胞，來評估該RPE細胞之增殖。培養基(總量2mL)係使用Opti-MEM。又，為了評估iPS-RPE細胞(253G1)之細胞形態，係於Ripasudil (10μM)或作為控制組用之Y-27632(10μM)之存在下或非存在下培養該細胞72小時。培養基係使用Opti-MEM。 (結果) Ki-67陽性細胞之比例，於Ripasudil及Y-27632非存在下係50.5%，於Ripasudil 0.01μM係67.1%，於Ripasudil 0.1μM係60.0%，於Ripasudil 1μM係78.9%，於Ripasudil  10μM係85.1%，於Y-27632 10μM係87.2%，Ripasudil之RPE細胞增殖效果係與Y-27632類似。於Ripasudil 10μM存在下3日之培養，細胞數相較於控制組約增加為6倍。培養3日後之顯微鏡像中之RPE細胞，於Ripasudil 10μM 係如長根般地增加，形態亦為完整，與Y-27632 10μM為相同形態。

經Ripasudil處理之iPS-RPE細胞中之細胞凋亡分析(1) 將iPS-RPE細胞(24孔盤中2 x 10 ⁵/孔；TLHD2株)於Ripasudil (0.01、0.1、1及10μM)或Y-27632 (10μM)之存在下或非存在下處理24小時。為了評估培養中之細胞死亡，係藉由流式細胞儀分析測定膜聯蛋白V陽性RPE細胞。為了染色，將該RPE細胞(Ripasudil處理、Y-27632處理或未處理iPS-RPE細胞)以細胞染色緩衝液(BioLegend)洗淨，以膜聯蛋白V結合緩衝液(BioLegend：catalog no. 420201)再懸浮。將該細胞以FITC標示抗膜聯蛋白V抗體(BioLegend：catalog no. 640906)於室溫染色15分鐘。使用FACSCanto ^TMII 流式細胞儀 (BD Biosciences)解析樣品。發明者等人將數據以FlowJo軟體(version 9.3.1)解析。 (結果) Ripasudil對RPE之細胞凋亡抑制效果係於1μM及10μM可見到。經Ripasudil 10μM處理過的iPS-RPE細胞之膜聯蛋白V陽性細胞率(=細胞凋亡細胞率)為5.7%，無處理之iPS-RPE細胞之膜聯蛋白V細胞率為14.6%，可見強的RPE細胞細胞凋亡抑制效果。另一方面，經Y-27632之10μM處理過的iPS-RPE細胞之膜聯蛋白V陽性細胞率為3.9%，故Ripasudil與Y-27632之細胞凋亡抑制效果為同等之結果。

經Ripasudil處理的iPS-RPE細胞中之細胞凋亡分析(2) 將iPS-RPE細胞(24孔盤中2 x 10 ⁵/孔；253G1株)於Ripasudil (10、100、200μM)之存在下或非存在下處理24小時，除了此點以外，係藉由與前述細胞凋亡分析(1)相同之方法解析，探討Ripasudil效果之最佳濃度。 (結果) 細胞凋亡細胞之比例，於Ripasudil非存在下為3.6%，於Ripasudil 10µM為3.1%，於Ripasudil 100μM為3.6%，於Ripasudil 200μM為6.5%，但外觀上，Ripasudil當於100μM以上之高濃度時，RPE之細胞構造崩壞而誘導形態變化，細胞死亡。Ripasudil 10μM時無問題。

經Ripasudil處理之iPS-RPE細胞中之pMLCII IHC染色(磷酸化抑制試驗) 使iPS-RPE細胞(TLHD2)分散，於RPE儲備溶液中，於10μM Ripasudil存在下或非存在下，播種於經Laminin E8片段(iMatrix511, Matrixosome)被覆的24孔盤(Falcon)中。24小時培置後，將RPE細胞以4% PFA於4℃固定30分鐘，以phospho-Myosin Light Chain 2 (pMLCII)抗體(x200：Cell Signaling, # 3671S)染色。作為對pMLCII染色之二次抗體，係使用Alexa Fluor 488接合驢子抗兔子IgG。將細胞核以DAPI進行對比染色。使用螢光顯微鏡BZ-X800 (Keyence)觀察全樣品。 (結果) 相較於Ripasudil非存在下之控制組，添加了Ripasudil之RPE細胞中，pMCLII染色係減弱。由此可確認添加了Ripasudil之RPE細胞中，下游之磷酸化停止，作為ROCK阻礙劑發揮機能。

經Ripasudil處理之iPS-RPE細胞中之Phalloidin IHC染色(毒性試驗) 使用TrypLE Select(ThermoFisher)，使經分化之iPS-RPE細胞(TLHD2)分散，於RPE儲備溶液中，於Ripasudil (1、10及100 μM)存在下或非存在下播種於24孔盤(Falcon)中。24小時培置後，將RPE細胞以4% PFA於4℃固定30分鐘。將該經Ripasudil處理之RPE細胞以Alexa Fluor 594接合Phalloidin (x1000：Thermo A12381)染色。將細胞核以DAPI進行對比染色。使用共軛焦顯微鏡(型號：LSM700、ZEISS)觀察全樣品。 (結果) 於Ripasudil 1μM與10μM可見完美之染色像。另一方面，於Ripasudil 100μM，細胞骨架之染色相當程度地減弱，判斷於100μM程度的高濃度下具有毒性。

以Ripasudil所為之活化淋巴球抑制試驗 將健康人末梢血細胞5人的量混合，實施促進淋巴球活化之方法即混合淋巴球反應(MLR)。於Ripasudil(1、10、50μM)或Y-27632(1、10、50μM)之存在下或非存在下，混合末梢血細胞，於96小時後進行FACS解析，評估淋巴球增殖。 (結果) 於Ripasudil及Y-27632非存在下，可見到淋巴球(CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、CD11b單核球)之增殖。另一方面，於Ripasudil 10μM、50μM添加時，淋巴球之活化受到抑制，為與Y-27632相同之效果。

經Ripasudil處理之iPS-RPE細胞上的HLA類型II分子之表現 於分析前，將iPS-RPE細胞(TLHD2)以重組人類IFN-γ (100 ng/mL：R&D systems)進行48小時前處理。以FACS解析來評估經Ripasudil 10μM或Y-27632 10μM處理過的iPS-RPE細胞(控制組為非處理細胞)上之HLA類型II分子之表現。於染色前以人類Fc block(Miltenyi Biotec)將該細胞於4℃培置15分鐘。以人類Fc block染色後，將該RPE細胞以FITC標示抗HLA類型II抗體(HLA-DR、DQ、DP：BioLegend：catalog no. 361705)於4℃進行30分鐘室溫染色。將RPE細胞進一步以FITC標示抗小鼠IgG於4℃進行30分鐘室溫染色。使用FACSCanto ^TMII解析RPE樣品。 (結果) HLA類型II表現細胞之比例，僅有培養基係16.8%，於Ripasudil 10μM處理為10.6%，於Y-27632 10μM處理為10.5%。如此地，經Ripasudil 10μM處理之RPE的HLA類型II之表現係降低，與Y-27632 10μM為相同之效果。 [產業上之可利用性]

依照本發明，藉由使用ROCK阻礙劑，所移植之RPE細胞懸浮液之於網膜下的存活被促進，可妨礙RPE細胞自移植部位之逆流或黃斑上皮之形成。又，藉由使用ROCK阻礙劑，可使經移植於網膜下之RPE細胞形成為與正常之網膜色素上皮相同的單層構造而存活，而非細胞塊狀。進一步地，移植所使用之RPE細胞為來自異體iPS細胞時，預期因HLA之不一致而產生排斥反應，藉由ROCK阻礙劑之使用，藉由抑制經移植之RPE細胞之發炎性細胞激素及趨化介素之產生的效果以及抑制接受者之淋巴球(輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、單核球)之增殖的效果，可期待免疫抑制作用。本申請案係以於日本申請的日本特願2020-119312(申請日：令和2(2020)年7月10日)為基礎，其內容全部包含於本說明書中。

[圖1]顯示ROCK阻礙劑併用異體iPS-RPE細胞移植後第23週之左眼之彩色眼底影像(Color)、自發螢光眼底影像(AF)、自發螢光眼底影像之後期影像(FA late)、網膜斷層影像(OCT)的圖。 [圖2]顯示ROCK阻礙劑併用異體iPS-RPE細胞移植後第23週之左眼之蘇木素及伊紅(H&E)染色像的圖。 [圖3]顯示ROCK阻礙劑併用異體iPS-RPE細胞移植後第23週之左眼之以PKH之免疫組織染色影像的圖。 [圖4]顯示不使用ROCK阻礙劑的異體iPS-RPE細胞移植後第24週之右眼之彩色眼底影像(Color)、自發螢光眼底影像(AF)、自發螢光眼底影像之後期影像(FA late)、網膜斷層影像(OCT)的圖。 [圖5]顯示不使用ROCK阻礙劑之ROCK阻礙劑異體iPS-RPE細胞移植後第24週之右眼之蘇木素及伊紅(H&E)染色像的圖。 [圖6]顯示ROCK阻礙劑併用異體iPS-RPE細胞移植後第23週之左眼之自發螢光眼底影像(AF)及不使用ROCK阻礙劑之異體iPS-RPE細胞移植後第24週之右眼之自發螢光眼底影像(AF)之存活面積的圖。 [圖7]顯示經10μM Y-27632處理(右)或未處理(左)之人類iPS-RPE細胞中對pMLCII之免疫組織化學的圖。上段：經Laminin E8片段(iMatrix511)被覆之培養盤、中段：未經被覆之培養盤、下段：蠅虎蕈鹼(phalloidin)染色 [圖8](A)顯示經10μM Y-27632處理(右)或未處理(左)之人類iPS-RPE細胞中對pMLCII的免疫組織化學之time-course分析的圖。(B)顯示經0、0.1、1、10及100μM Y-27632處理(右)或未處理(左)之人類iPS-RPE細胞中對pMLCII及蠅虎蕈鹼的免疫組織化學之濃度分析的圖。 [圖9]顯示以定量RT-PCR所得之經Y-27632處理iPS-RPE細胞之發炎性細胞激素/趨化介素的mRNA表現量的圖。ND：未檢測 [圖10]顯示以定量RT-PCR所得之經Y-27632處理iPS-RPE細胞之CCL2/MCP-1 mRNA的Y-27632之用量依存性表現量的圖。 [圖11]顯示以ELISA所得之經Y-27632處理iPS-RPE細胞之CCL2/MCP-1蛋白質的Y-27632之用量依存性表現量的圖。**P＜0.005, ***P＜0.0005 [圖12]顯示於混合淋巴球反應中，對輔助性T細胞、細胞毒性T細胞及單核球之Y-27632之增殖抑制效果的圖。 [圖13]顯示於混合淋巴球反應中，對輔助性T細胞、細胞毒性T細胞及單核球之Y-27632之用量依存性的(1、10、50μM)增殖抑制效果的圖。 [圖14]顯示於混合淋巴球反應中，對IFN-γ之產生的Y-27632之用量依存性的(1、10、50μM)抑制效果的圖。*P＜0.05, **P＜0.005

Claims (22)

1. 一種網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑，其含有ROCK阻礙劑。
2. 如請求項1之移植用存活促進劑，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。
3. 如請求項1或2之移植用存活促進劑，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。
4. 如請求項3之移植用存活促進劑，其中多能性幹細胞為iPS細胞。
5. 一種網膜色素上皮細胞之移植用免疫抑制劑，其含有ROCK阻礙劑。
6. 如請求項5之移植用免疫抑制劑，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。
7. 如請求項5或6之移植用免疫抑制劑，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。
8. 如請求項7之移植用免疫抑制劑，其中多能性幹細胞為iPS細胞。
9. 一種移植用醫藥組成物，其含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑。
10. 如請求項9之移植用醫藥組成物，其中ROCK阻礙劑為Y-27632或Ripasudil。
11. 如請求項9或10之移植用醫藥組成物，其中ROCK阻礙劑之濃度為0.01μM以上且未達100μM。
12. 如請求項9~11中任一項之移植用醫藥組成物，其中網膜色素上皮細胞係來自多能性幹細胞。
13. 如請求項12之移植用醫藥組成物，其中多能性幹細胞為iPS細胞。
14. 一種RPE細胞之存活促進方法，其包含於網膜色素上皮細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予。
15. 一種ROCK阻礙劑，其係使用於促進經移植之網膜色素上皮細胞之存活。
16. 一種ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造網膜色素上皮細胞之移植用存活促進劑。
17. 一種對RPE細胞之免疫反應抑制方法，其包含於RPE細胞之移植的同時或其前後，將ROCK阻礙劑對網膜疾病患者之網膜下投予。
18. 一種ROCK阻礙劑，其係使用於抑制對經移植之網膜色素上皮細胞的免疫反應。
19. 一種ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造網膜色素上皮細胞之免疫反應抑制劑。
20. 一種網膜色素上皮細胞之移植方法，其包含將含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物對網膜疾病患者之網膜下投予。
21. 一種含有網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之移植用醫藥組成物，其係使用於網膜色素上皮細胞之移植。
22. 一種網膜色素上皮細胞及ROCK阻礙劑之使用，其係用於製造移植用醫藥組成物。

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