JP6928479B2

JP6928479B2 - 拒絶反応抑制剤

Info

Publication number: JP6928479B2
Application number: JP2017095113A
Authority: JP
Inventors: 武範猪俣; 俊成舟木
Original assignee: Kowa Co Ltd; Juntendo University
Current assignee: Kowa Co Ltd; Juntendo University
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2021-09-01
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: JP2018188410A; US20180325913A1; US10537579B2

Description

本発明は、角膜移植後の拒絶反応抑制剤に関する。

角膜移植は年間日本で約２０００件、米国で約４００００件行われる最も多い臓器移植である。通常の角膜移植では、その９０％以上が生着すると考えられている。しかし、血管新生、感染症、自己免疫疾患や再移植例などのハイリスク角膜では、その４０−９０％に拒絶反応を起こすことが問題となっている。これに対して現在では、ステロイドやシクロスポリンなどの免疫抑制剤により、急性拒絶反応は減少し、その成績は向上したが、免疫抑制剤の副作用（感染症、薬剤毒性）や慢性拒絶反応に無効であるなど、未だ問題が多いのが現状である。また、本邦においてはドナー角膜が十分に充足しているとは言えず、移植臓器において長期的に免疫寛容（免疫抑制剤を中止しても移植臓器が十分に機能する状態）が成立することが臨床的に重要である。

免疫寛容については、免疫応答に抑制的に働く制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ：Ｔｒｅｇ）が注目されている。角膜移植においては、Ｔｒｅｇの分化に必須の遺伝子であるＦｏｘｐ３の発現の低下が、拒絶反応の主座を担うエフェクターＴ細胞の抑制能の低下や抑制性サイトカインの減少を引き起こし、拒絶反応に影響を与えていることが明らかとなっている（非特許文献１）。また、低用量のＩＬ−２を投与することでＴｒｅｇを増幅し、角膜移植片の生存を延長させることが知られている（非特許文献２）。

Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）は、分子量約１６０ｋＤａのセリンスレオニンリン酸化酵素であり、その遺伝子は線虫やショウジョウバエなどの下等動物からヒトなどまで広く保存されている。Ｒｈｏキナーゼは平滑筋細胞の収縮だけでなく、細胞の形態制御や、遊走や、遺伝子発現の制御などの生理機能に関与しており、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は循環器疾患などの治療薬として開発が進められている。

また、近年では、緑内障の治療など眼疾患のための局所投与薬としても開発されており、緑内障・高眼圧症治療剤として、リパスジル塩酸塩水和物（４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン一塩酸塩二水和物）を有効成分とする「グラナテック（登録商標）点眼液０．４％」が市販されている。

リパスジルは、緑内障・高眼圧症への治療効果の他、眼底疾患治療（特許文献１）、角膜厚調節（特許文献２）や白内障術後合併症の予防治療（特許文献３）に有用であることが知られている。しかし、角膜移植後の拒絶反応に対するリパスジルの作用については何ら知られていない。

特許第５５５７４０８号公報国際公開第２０１６／０４７６４７号パンフレット特開２０１７−６１４４０号公報

ＣｈａｕｈａｎＳ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，１８２，１４８−１５３（２００９）ＴａｈｖｉｌｄａｒｉＭｅｔａｌ．, Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１００，５２５−５３２（２０１５）

本発明の課題は、角膜移植後の拒絶反応抑制のための新たな手段を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｒｈｏナキーゼ阻害剤、特にリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物が、移植後角膜の血管新生や炎症反応を抑制すると共に、抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を促し、角膜移植後の拒絶反応を抑制することを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下の（１）〜（１７）を提供するものである。
（１）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含有してなる角膜移植後の拒絶反応抑制剤。
（２）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤がリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である前記（１）に記載の拒絶反応抑制剤。
（３）リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物が、リパスジル塩酸塩水和物である前記（２）に記載の拒絶反応抑制剤。
（４）リパスジル塩酸塩水和物が、リパスジル一塩酸塩二水和物である前記（３）に記載の拒絶反応抑制剤。
（５）液剤である、前記（１）から（４）のいずれかに記載の拒絶反応抑制剤。
（６）点眼剤である、前記（１）から（５）のいずれかに記載の拒絶反応抑制剤。
（７）角膜が、霊長類の角膜である、前記（１）から（６）のいずれかに記載の拒絶反応抑制剤。
（８）角膜が、ヒトの角膜である、前記（１）から（７）のいずれかに記載の拒絶反応抑制剤。
（９）リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物、及び製薬上許容される担体を混合する工程を含有してなる、前記（１）から（８）のいずれかに記載の拒絶反応抑制剤の製剤を製造する方法。
（１０）必要な患者に有効量のＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することを特徴とする角膜移植後の拒絶反応抑制方法。
（１１）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤がリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である前記（１０）に記載の方法。
（１２）リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物が、リパスジル塩酸塩水和物である前記（１１）に記載の方法。
（１３）リパスジル塩酸塩水和物が、リパスジル一塩酸塩二水和物である前記（１２）に記載の方法。
（１４）液剤の投与によるものである、前記（１０）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）点眼剤の投与によるものである、前記（１０）から（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）角膜が、霊長類の角膜である、前記（１０）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）角膜が、ヒトの角膜である、前記（１０）から（１６）のいずれかに記載の方法。

本発明は、角膜移植後の拒絶反応を抑制し、移植片の生存率を向上させるための角膜移植後の拒絶反応抑制剤を提供するものである。
また、本発明の角膜移植後の拒絶反応抑制剤は、患者の負担が少ない点眼剤として提供することができる。

図１は、マウス移植角膜の経日変化に対するリパスジルの効果を示す写真である。図２は、マウス移植角膜の血管新生に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図３は、マウス移植角膜の混濁に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図４は、マウス移植角膜の生存期間に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図５は、移植後５６日目のマウス移植角膜におけるＣＤ３１（Ａ）、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂ）及びＬｙｖｅ−１（Ｃ）発現量に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図６は、移植後１４日目のマウス頸部リンパ節におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ａ）の割合並びにＩＦＮγ（Ｂ）及びＩＬ−１７（Ｃ）の発現に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図７は、移植後１４日目のマウス頸部リンパ節におけるＴｒｅｇ（Ａ）、ｅｘＴｒｅｇ（Ｂ）の割合及びＦｏｘｐ３（Ｃ）の発現に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図８は、移植後１４日目のマウス移植角膜におけるｆｏｘｐ３（Ａ）、ＩＬ−１０（Ｂ）及びＴＧＦβ１（Ｃ）の発現に対するリパスジルの効果を示すグラフである。図９は、ヒト移植角膜の血管新生に対するリパスジルの効果を示す写真である。図１０は、ヒト移植角膜の血管新生に対するリパスジルの効果をスコア化したグラフである。

本発明の拒絶反応抑制剤に用いられるＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、Ｒｈｏキナーゼの阻害活性を有する物質が挙げられる。このようなＲｈｏキナーゼ阻害剤としては例えば、次の一般名やコード番号で示される化合物が挙げられる。リパスジル（ｒｉｐａｓｕｄｉｌ）、ＡＲ−１３３２４（化学名：４−［（２Ｓ）−３−アミノ−１−（６−イソキノリニルアミノ）−１−オキソ−２−プロパニル］ベンジル２，４−ジメチルベンゾエート）、ＡＲ−１２２８６（化学名：（２ＲＳ）−２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−６−イル）−２−（チオフェン−３−イル）アセタミド）、ＡＳ１８９２８０２（化学名：Ｎ−［（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−フェニルエチル］−Ｎ’−［４−（４−ピリジニル）フェニル］−尿素）、ＤＬ０８０５（化学名：５−ニトロ−１（２）Ｈ−インダゾール−３−カルボニトリル）、ＤＷ１８６５（化学名：２−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミノ−４−メトキシ−６−ピペラジノトリアジン）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（化学名：１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、ＧＳＫ−２６９９６２Ａ（化学名：［Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４, ５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルフォリニル）エチル］オキシ｝ベンズアミド］）、ＧＳＫ−４２９２８６Ａ（化学名：Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−２−メチル−６−オキソ−４−［４−（トリフルオルメチル）フェニル］−１，４，５，６−テトラヒドロ−３−ピリジンカルボキサミド）、Ｈ−１１５２（化学名：５−［［（２Ｓ）−ヘキサヒドロ−２−メチル−１Ｈ−１，４−ジアゼピン−１−イル］スルホニル］−４−メチル−イソキノリン）、ＫＤ０２５(ＳＬｘ−２１１９)（化学名：２−（３−（４−（（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミノ）キナゾリン−２−イル）フェノキシ）−Ｎ−イソプロピルアセタミド）、ＰＴ−２６２（化学名：７−クロロ−６−ピペリジン−１−イル−キノリン−５,８−ジオン）、ＲＫＩ−１４４７（化学名：１−［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−３−（４−ピリジン−４−イル−１,３−チアゾール−２−イル）尿素）、ＳＡＲ４０７８９９（化学名：６−（ピペリジン−４−イルオキシ）イソキノリン−１（２Ｈ）−オン）、ＳＢ−７７２０７７Ｂ（化学名：（３Ｓ）−１−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−７−イル］カルボニル］−３−ピロリジンアミンジヒドロクロリド）、ＳＮＪ−１６５６（Ｙ−３９９８３）（化学名：（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−（１−アミノエチル）ベンズアミド）、Ｗｆ−５３６（化学名：（＋）−（Ｒ）−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）ベンズアミド）、Ｙ−２６７３２（化学名：（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）、ＡＭＡ００７６、ＡＭＡ０４２８（３−［２−（アミノメチル）−５−［（ピリジン−４−イル）カルバモイル］フェニル］ベンゾエート）、ＢＡ−１０４９、ＢＦ−６６８５１、ＢＦ−６６８５２、ＢＦ−６６８５３、ＫＩ−２３０９５、ＡＲ−１３５０３、ＡＲ−１３５３４、ＩＮＳ−１１７５４８、ＬＸ７１０１、（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、（１−ベンジルピペリジン−４−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、Ｎ−［２−（４−フルオロフェニル）−６，７−ジメトキシ−４−キナゾリニル］−Ｎ−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、Ｎ−４−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−２−ピリジン−４−イル−キナゾリン−２，４−ジアミン、４−メチル−５−（２−メチル−［１，４］ジアゼパン−１−スルホニル）イソキノリン等の化合物又はその光学異性体およびそれらの塩並びにそれらの溶媒和物などが挙げられる。さらに、次の特許文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７号、同第９７／２３２２２号、同第９８／０６４３３号、同第９９／２０６２０号、同第９９／６１４０３号、同第００／０９１６２号、同第０１／５６９８８号、同第０２／０７６９７６号、同第０２／０７６９７７号、同第０２／０８３１７５号、同第０２／１００８３３号、同第０３／０５９９１３号、同第０３／０６２２２５号、同第０３／０６２２２７号、同第２００４／００９５５５号、同第２００４／０２２５４１号、同第２００４／０３９７９６号、同第２００４／１０８７２４号、同第２００５／００３１０１号、同第２００５／０３４８６６号、同第２００５／０３７１９７号、同第２００５／０３７１９８号、同第２００５／０３５５０１号、同第２００５／０３５５０３号、同第２００５／０３５５０６号、同第２００５／０３９５６４号、同第２００５／０８０３９４号、同第２００５／１０３０５０号、同第２００６／０５７２７０号、同第２００７／０２６６６４号に開示された化合物又はその光学異性体およびそれらの塩並びにそれらの溶媒和物が挙げられる。また、ＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターも挙げられる。

これらのＲｈｏキナーゼ阻害剤の中の好ましいＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、リパスジル、ファスジル、ＡＲ−１３３２４、ＡＲ−１２２８６、Ｙ−３９９８３やＹ−２６７３２などが挙げられ、より好ましいＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、リパスジルが挙げられる。
以下、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の代表的な化合物の１種であるリパスジルを例にして説明する。

リパスジルは、サブスタンスＰ拮抗作用、ロイコトリエンＤ４拮抗作用及びＲｈｏキナーゼ阻害作用を有する化合物であり、リパスジルを有効成分として含有する薬剤は、緑内障、高眼圧症の治療薬として製造・販売されている。なお、リパスジルは、公知の方法、例えば、国際公開第９９／２０６２０号に記載の方法により製造することができる。

リパスジルの塩としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、フッ化水素酸、臭化水素酸等の無機酸の塩、又は酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸の塩が挙げられ、特に塩酸塩が好ましい。

リパスジル又はその塩は、非溶媒和物のみならず水和物等の溶媒和物としても存在することができる。水和物が好ましいが、本発明においては、全ての結晶型及び水和若しくは溶媒和物を含むものである。特に好ましいリパスジルの塩は、リパスジル一塩酸塩二水和物である。

本発明において、「角膜移植後の拒絶反応抑制剤」とは、移植後の角膜に生じる拒絶反応を抑制して、移植片の生存率を向上させ、機能を維持させる医薬である。具体的には、血管新生の抑制、炎症反応の抑制、免疫寛容の誘導等のそれぞれ単独作用により、又はこれらの複合作用により、移植後の角膜に生じる拒絶反応を抑制して、移植片の生存率を向上させ、機能を維持させる効果を発揮することができる。

本発明において、角膜移植とは、全層角膜移植（ＰＫＰ）の他、病態を呈する部分だけを移植する「角膜パーツ移植」も対象となる。角膜パーツ移植としては、例えば、表層角膜移植（ＬＫＰ）、層状角膜移植（ＤＬＥＰ）、デスメ膜剥離（ＤＳＥＫ）、全部層状角膜移植（ＡＬＫ）、深層層状角膜移植（ＤＬＫＰ．ＤＡＬＫ）、角膜上皮移植（ＫＥＰ）、角膜内皮移植（ＤＳＡＥＫ）等が挙げられる。移植角膜としては、日本においては通常アイバンクを通じて提供される提供眼球から得られるが、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導させた角膜片、あるいは角膜を構成する上皮、Ｂｏｗｍａｎ膜、実質、Ｄｅｓｃｅｍｅｔ膜及び内皮等の各種細胞をそれぞれ単独に、又は適宜組み合わせて用いることもできる。

また、本発明において、角膜移植の適応としては、角膜混濁に起因する視力障害があり、保存的治療にて角膜の透明化が期待できない状態や、コンタクトレンズなどで対応困難な高度の角膜形状異常が対象となる。具体的な適応疾患としては、例えば、円錐角膜、水泡性角膜症、角膜白斑、ヘルペス角膜、角膜変性症（ジストロフィ）等が挙げられる。

本発明において、角膜移植後の拒絶反応としては、最も重篤なものとして内皮型拒絶反応が挙げられるが、これに限らず、血管新生、炎症反応、免疫反応等の因子それぞれ単独に、又はこれらの複合作用に起因して、移植片の混濁、脱落等を招き、正常な機能を保持できなくなった状態も含まれる。

また、後記実施例に示すように、本発明のリパスジルは免疫反応に対して抑制性に働く制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増加させ、免疫寛容を誘導することから、角膜移植のみならず、他の臓器移植に対しても「移植後の拒絶反応抑制剤」として利用することができる。対象となる臓器移植としては、例えば、心臓移植、肺移植、腎移植、肝移植、膵移植、小腸移植、骨髄移植に代表される造血幹細胞移植等が挙げられる。

本発明の「角膜移植後の拒絶反応抑制剤」は、当該分野で汎用されている通常の製剤化技術により、眼局所投与に適した剤型に製剤化される。剤型としては、例えば、前房内注射液、眼灌流液、又は点眼液等の液剤が好ましいが、これに限定されるものではない。好ましい製剤としては、前房内注射液や眼灌流液は治療効果の点から好ましい剤型ではあるが患者の負担も大きく、投与の容易さから点眼剤が挙げられる。
本発明の点眼薬は、本発明の有効成分であるリパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物、及び点眼薬に許容される担体を含有するものであり、市販品である「グラナテック点眼液０．４％」をそのまま用いることもできる。

点眼剤を調製する場合、例えば、所望な上記成分を滅菌精製水、生理食塩水等の水性溶剤、又は綿実油、大豆油、ゴマ油、落花生油等の植物油等の非水性溶剤に溶解又は懸濁させ、所定の浸透圧に調整し、濾過滅菌等の滅菌処理を施すことにより行うことができる。なお、眼軟膏剤を調製する場合は、前記各種の成分の他に、軟膏基剤を含むことができる。前記軟膏基剤としては、特に限定されないが、ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレン等の油性基剤；油相と水相とを界面活性剤等により乳化させた乳剤性基剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール等からなる水溶性基剤等が好ましく挙げられる。

リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を本発明の「角膜移植後の拒絶反応抑制剤」に用いる場合、その投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して、リパスジルとして、１日０．０２５〜１００００μｇ、好ましくは０．０２５〜２０００μｇ、より好ましくは０．１〜２０００μｇ、さらに０．０２５〜２００μｇ、０．０２５〜１００μｇの範囲が挙げられる。
点眼剤として使用する場合には、有効成分を約０．０００１〜５ｗ／ｖ％、好ましくは約０．０１〜４ｗ／ｖ％の濃度で使用することができる。投与期間は、角膜移植当日から継続投与が好ましい。

また、投与回数は、特に限定されないが、１日に１回又は数回に分けて投与するのが好ましく、液体点眼剤の場合は、１回に１〜数滴点眼すればよい。

本発明の「角膜移植後の拒絶反応抑制剤」の投与対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。好ましい哺乳動物としてはヒト、サルなどの霊長類が挙げられる。特に好ましくはヒトが挙げられる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

（実施例１）
角膜移植モデルマウスに対するリパスジルの作用（１）
文献（ＪＢｉｏｌＭｅｔｈｏｄｓ２０１５２（３）；ｅ２７、以下文献Ａ）に記載の方法に従って角膜移植モデルマウスを作成し、実験に供した。即ち、６−８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスから６−８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し同種異型角膜移植を行った。
角膜移植を行ったマウスは、ＰＢＳ点眼２回／日（Ｐ群：コントロール群）、リパスジル点眼２回／日（Ｒ２群）及びリパスジル点眼３回／日（Ｒ３群）の３群（各群５匹）に群分けした。
点眼量は一回一眼あたり０．１μＬ／とし、リパスジルとしては、グラナテック点眼液０．４％を用いた。
移植後、５６日目まで毎日点眼を行い、この間７日毎に細隙灯顕微鏡にて角膜移植片の血管新生スコア、混濁スコア（各スコア化の方法は文献Ａによる）並びに生存期間を評価した。実験最終日の５６日目には、上記の評価に加え、角膜の血管内皮細胞（ＣＤ３１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）及びリンパ管（Ｌｙｖｅ−１）発現量をｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法にて計量した。

結果を図１〜図５に示す。図１は各群の実験７日目、１４日目、２８日目及び５６日目の代表写真であり、上段がＰ群、中段がＲ２群及び下段がＲ３群を示す。Ｒ３群では特に混濁並びに血管新生が抑制され、５６日目まで透明度が保たれていることがわかる。また、スコア化して評価した図２（血管新生スコア）、図３（混濁スコア）及び図４（生存期間）の結果から支持されるように、Ｒ３群では血管新生スコア、混濁スコアのいずれもＰ群に比して有意な低下を示し、また、生存期間においても有意に延長させた（ｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡｔｅｓｔ，Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＴｅｓｔ、＊：ｐ＜０．０５）。
さらに、図５に示すように、５６日目のＣＤ３１（Ａ）、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｂ）及びＬｙｖｅ−１（Ｃ）のいずれも、Ｐ群に比べてＲ３群では有意な減少を示した（ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ，Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＴｅｓｔ、＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
以上の結果から、リパスジル点眼が移植後角膜の定着に有用であることが判明した。

（実施例２）
角膜移植モデルマウスに対するリパスジルの作用（２）
実施例１と同様の処置（手術並びに点眼）、群構成（Ｐ群、Ｒ２群及びＲ３群）の角膜移植モデルマウスを用い、移植後１４日目の頸部リンパ節細胞を採取し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）にて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞並びに炎症性サイトカインであるＩＦＮγ及びＩＬ−１７の発現を計測し、また、免疫寛容に関与するＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３⁻制御性Ｔ細胞（ｅｘＴｒｅｇ）及びＦｏｘｐ３の発現量（ＭｅａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｎｔｅｎｓｉｔｙ, ＭＦＩ）を計測した。さらに、同じく移植後１４日目の角膜におけるｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０及びＴＧＦβ１の発現量をｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ（ｑＰＣＲ）で測定した。

結果を図６〜図８に示す。移植後１４日目の頸部リンパ節細胞において、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γの有意な減少がＲ３群で確認された（図６Ｂ）。さらに、同じく移植後１４日目の頸部リンパ節細胞において、角膜移植の免疫反応に対し抑制性に働くＴＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がＲ３群で有意に増加しており（図７Ａ）、Ｔｒｅｇの転写因子であるＦｏｘｐ３はＲ２群、Ｒ３群共に有意に増加し（図７Ｃ）、一方、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３⁻制御性Ｔ細胞（ｅｘＴｒｅｇ）はＲ３群で有意に減少していた（図７Ｂ）（ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ，Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＴｅｓｔ、＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
また、角膜移植後１４日目の角膜において、ｆｏｘｐ３はＲ２及びＲ３群で（図８Ａ）、ＩＬ−１０（図８Ｂ）及びＴＧＦβ１（図８Ｃ）はいずれもＲ３群で有意に発現が増加していた（ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ，Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＴｅｓｔ、＊＊：ｐ＜０．０１，＊＊＊：ｐ＜０．００１）。
以上の結果から、リパスジル点眼が移植後角膜において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することにより、免疫反応を抑制していることが判明した。

（実施例３）
ヒト移植角膜に対する効果
角膜ヘルペスで角膜穿孔を起こした症例（６９歳男性）に対し、角膜移植を施術したところ、術後１ヶ月後に強い充血を認め、角膜移植片内にも血管侵入を認めた。周辺虹彩前癒着を認め、２次性緑内障を認めたためグラナテック点眼液０．４％を処方した。点眼後３週間では、図９のように血管新生が抑制された。図９における黄色い点線の枠内の新生血管をＩｍａｇｅ Jで解析し数値化したものが図１０である。図１０からも、リパスジルが血管新生抑制効果を示すことが支持された。

Claims

リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する角膜移植後の拒絶反応抑制剤。
リパスジル若しくはその塩又はそれらの溶媒和物が、リパスジル一塩酸塩二水和物である請求項１に記載の拒絶反応抑制剤。
点眼剤である、請求項１又は２に記載の拒絶反応抑制剤。