KR102177610B1 - 청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법 - Google Patents

청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법, 분화된 배아줄기세포 및 이를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법, 분화된 배아줄기세포 및 이를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물은 줄기세포의 분화 기술 및 감각신경성 난청 치료 분야에서 줄기세포를 유모세포 표현형으로 분화시킬 수 있는 효과적인 분화 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법{Method of differentiation of embryonic stem cell into inner ear cell using co-culture with auditory cell}
본 발명은 배아줄기세포의 분화 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
달팽이관 내의 유모세포나 청신경은 한번 손상되면 자발적으로 회복되지 못하는 특성이 있으며, 이러한 달팽이관 내의 유모세포나 청신경 손상으로 야기되는 감각신경성 난청을 극복하기 위하여 다양한 연구가 진행되고 있다. 최근 줄기세포를 이용한 감각신경성 난청을 극복하기 위한 치료 기술의 적용 가능성이 제시되고 있다.
최근 줄기세포로부터 내이 유모세포로의 분화를 유도하기 위해서는 BMP4, TGF-β1, FGF2 및 Wnt와 같은 몇 가지 외인성 생체 활성 분자들이 필요하다는 것이 체외(in vitro) 연구를 통해 알려지고 있으며, 이러한 분자를 배양 시스템에 전달하는 가장 직접적이고 일반적인 방법은 시간에 잘 맞추어 점진적으로 첨가하는 것이다. 몇몇 연구에서 줄기세포가 특정 세포와 함께 배양되거나 특정 조건부 배지에서 배양되면 특정 조직 세포로 분화될 수 있음이 보고되고 있다. HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1) 세포는 트랜스제닉 및 마우스의 청각 기관에서 유래된 것으로, 달팽이관 유모 세포(cochlear hair cell)와 지지 세포(supporting cell)의 특징들을 가지고 있어 코르티관(Corti) 내의 감각세포와 지지세포를 대표할 수 있는 세포로 청각 연구에 많이 쓰이고 있다. 몇몇 연구들은 이독성 약물로 손상된 HEI-OC1을 대상으로 줄기세포의 치료 효과를 제시하고 있으나, HEI-OC1 세포가 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)의 분화를 촉진시킬 수 있는지 여부에 대하여는 알려지지 않았다.
한국특허공개 제10-2019-0007700호 (2019년01월23일) 한국특허공개 제10-2008-0016000호 (2008년02월21일) 한국특허공개 제10-2008-0015033호 (2008년02월15일) 한국특허공개 제10-2018-0117628호 (2018년10월29일)
본 발명의 발명자들은 배아줄기세포를 유모세포 표현형으로 분화시킬 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 외인성 생체활성 분자들의 첨가가 없어도 HEI-OC1 세포와 배아줄기세포와 공배양함으로써 HEI-OC1 세포로부터 분비되는 내인성 유도 인자로 인해 배아줄기세포를 유모세포 표현형으로 분화시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 LIF(ES-M)가 없는 ESC 유지 배지(조건 배지, CM)에 배양하여 생존하는 HEI-OC1 세포들을 얻어 미토마이신-C(mytomycin-C)로 2시간 동안 불활성화 시킨 플레이트에 마우스 배아줄기세포를 단일층(monolayer) 방법으로 처리한 것과 현적법(hanging drop technique)으로 형성된 배아체를 공배양하면서 시간에 따른 분화 정도를 확인하였다. 또한, HEI-OC1 세포를 조건 배지에서 48시간 동안 배양한 후 상등액 배지만 이용하여 비접촉식 공배양 시스템을 통한 분화도 같이 확인하였다. 분화는 2일마다 배지를 교체하면서 14일 째까지의 변화를 살펴보았다.
이에 따라, 본 발명은 청각세포와의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법, 분화된 배아줄기세포 및 이를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, (a) 청각세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 배양된 상기 청각세포와 배아줄기세포를 공배양하여 내이 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 분화 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(a)의 상기 청각세포는 HEI-OC1 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 단계(a)의 상기 청각세포는 배아줄기세포 유지 배지에서 생존한 세포일 수 있으며, 상기 배아줄기세포 유지 배지는 LIF가 없는 배지일 수 있다.
일 구현예에서, 단계(a)의 상기 배양 후에 미토마이신-C로 불활성화 시킬 수 있다.
일 구현예에서, 단계(b)의 상기 배아줄기세포는 단일층(monolayer) 방법으로 배양되어 분리된 세포이거나, 현적법에 의하여 형성된 배아체일 수 있으며, 상기 배아체는 현적법에 의해 1 ~ 3일간 배양되어 형성된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 단계(b)의 상기 공배양은 10 ~ 20일 유지될 수 있으며, 상기 내이 세포는 내이 유모세포 표현형일 수 있다.
일 구현예에서, 단계(b)의 상기 내이 세포는 MyosinVIIa, Sox2, Pax2 및 Pax8로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 발현하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 배아줄기세포의 분화 방법에 의해 얻어진 분화된 배아줄기세포가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 분화된 배아줄기세포는 내이 유모세포 표현형일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 분화된 배아줄기세포를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 발명자들은 HEI-OC1 세포와 현적법(hanging drop technique)을 이용한 배아체의 공배양 시스템을 이용하여 배아줄기세포로부터 내이 관련 조직 분화 정도를 형광(epifluorescence, MyosinVIIa, Sox2) 및 RT-qPCR(Oct4, Sox2, E-Cad, Laminin-β1, Pax2, Pax8, Atoh1, Myosin7a)로 분석하였을 때 내이 관련 세포로의 분화 관련 마커들의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 공배양 시스템을 이용한 분화 방법이 내이 관련 유모 세포로의 효율적인 분화를 유도할 수 있는 분화방법임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 공배양을 이용한 배아줄기세포의 내이 세포로의 분화 방법, 분화된 배아줄기세포 및 이를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물은 줄기세포의 분화 기술 및 감각신경성 난청 치료 분야에서 줄기세포를 유모세포 표현형으로 분화시킬 수 있는 효과적인 분화 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 HEI-OC1 및 mGFP-ES 세포를 이용한 접촉식 공배양 시스템을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 내이 HC 유사 세포의 유도에 대한 대조군 ESC 분화의 표준 프로토콜 및 (B) ESC 배아체의 공배양에서 HEI-OC1 세포를 피더 세포로 도입하는 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 3은 HEI-OC1와의 공배양에 있어서 분리된 ESC와 EB의 비교 결과이다. 분리된 ESC는 14일 배양 후 자연적으로 회전타원체(spheroid)를 형성하였으나 작은 크기였고 오가노이드를 형성하지 않았다(A). 공배양된 EB는 이와는 상이하였다(B). 14일의 공배양 후(C, D), 회전타원체(C)와 EB(D)는 신경 다능성 마커인 Sox2와 내이 유모세포 마커인 Myo7a로 면역염색 되었다. 공배양된 ESC 셋업 모두 형성된 구조의 주변에 Sox2가 발현되었다. 한편, Myo7a는 HEI-OC1 세포 및 GFP 양성 ESC에서 발현되었다.
도 4는 미분화된 HEI-OC1, 미분화된 ESC, 공배양 7일 시점, 공배양 14일 시점, 표준 분화 프로토콜에 따른 양성 대조군 배양의 7일 시점 및 14일 시점의 세포에 대한 귀 연계 조직(otic lineage) 마커 유전자의 정량적 RT-PCR 분석 결과이다. 공배양된 ESC 및 HEI-OC1 세포의 유전자 발현을 미분화된 ESC와 비교하여 분석하고 유모 세포 분화의 표준 프로토콜과 비교하였다. 공배양된 세포는 표준 분화군과 비교하여 초기 단계에서 외배엽성 마커(E-Cad, Laminin)를 발현하지 않았다(C, D). 귀의 전구(progenitor) 마커(Pax2, Pax8)는 이미 초기 단계에서 뚜렷하였으며, 후기 단계에서 더 상향조절되었다(E, F). 공배양된 ESC는 표준 분화군과 유사하게 후기 단계에서 최종적으로 유모 세포 마커를 발현하였다. n=3, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001.
도 5는 HEI-OC1 세포의 조건 배지를 사용한 ESC의 비접촉식 공배양 결과이다. 세포 간 상호 작용없이 HEI-OC1 세포에 의해서만 배양 배지로 방출된 용해성 인자만으로 ESC 분화를 유도할 수 있는지 알아보기 위해 HEI-OC1의 전처리 배지를 수집하여 ESC 배양에 사용하였다(A). 그러나, 분리된 ESC는 회전타원체를 형성하지 않았고 EB는 퇴화되었다. 녹색=GFP, 빨간색=Sox2.
본 발명은 (a) 청각세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 배양된 상기 청각세포와 배아줄기세포를 공배양하여 내이 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 분화 방법을 제공한다.
본 발명의 배아줄기세포의 분화 방법은 청각세포를 배양하는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다. 단계(a)에서, 상기 청각세포는 HEI-OC1 세포일 수 있다. HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1) 세포는 트랜스제닉 및 마우스의 청각 기관에서 유래된 것으로, 달팽이관 유모 세포(cochlear hair cell)와 지지 세포(supporting cell)의 특징들을 가지고 있어 코르티관(Corti) 내의 감각세포와 지지세포를 대표할 수 있는 세포로 청각 연구에 많이 쓰이고 있다.
상기 청각세포는 배아줄기세포 유지 배지에서 생존한 세포일 수 있으며, 상기 배아줄기세포 유지 배지는 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)가 없는 ESC 유지 배지(embryonic stem sell maintenance media, ES-M)일 수 있다. HEI-OC1 세포를 배아줄기세포 유지 배지에서 배양하여 생존하는 세포를 선택하고, 선택된 HEI-OC1 세포를 배양 배지 플레이트에 접종하여 적정 밀집도(confluency)가 될 때까지 배양한 후, 미토마이신-C로 불활성화 시켜 공배양을 위한 피더(feeder) 세포로서 준비한다.
본 발명의 배아줄기세포의 분화 방법은 단계(a)에서 배양된 상기 청각세포와 배아줄기세포를 공배양하여 내이 세포로 분화시키는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다. 단계(b)에서, 상기 배아줄기세포는 단일층(monolayer) 방법으로 배양되어 분리된 세포이거나, 현적법에 의하여 형성된 배아체일 수 있다. 이 때, 상기 배아체는 현적법에 의해 1 ~ 3일간 배양되어 형성된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 단계(b)의 상기 공배양은 배아줄기세포에 내이 세포 특이적 마커가 발현되는 기간이라면 제한없이 유지될 수 있으며, 예를 들어, 10 ~ 20일 동안, 바람직하게는 12 ~ 16일 동안 유지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공정으로 청각세포와 배아줄기세포를 공배양하면 배아줄기세포가 내이 세포의 특성을 갖는 내이 유모세포 표현형으로 분화될 수 있다. 배아줄기세포로부터 분화된 상기 내이 세포는 내이 세포 특이적 마커를 발현하며, 예를 들어, MyosinVIIa, Sox2, Pax2 및 Pax8로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 발현하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이상의 결과로, 배아줄기세포와 청각세포(HEI-OC1 세포) 사이의 세포 상호작용이 배아줄기세포의 내이 유모세포 유사 세포로의 분화를 자극한다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 배아줄기세포의 분화 방법에 의해 얻어진 분화된 배아줄기세포를 제공한다. 이 때, 상기 분화된 배아줄기세포는 내이 유모세포 표현형일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 분화된 배아줄기세포를 포함하는 감각신경성 난청의 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 접촉식 공배양
HEI-OC1 세포는 전처리하여, LIF(Leukemia Inhibitory Factor)가 없는 ESC 유지 배지(embryonic stem sell maintenance media, ES-M)에서 생존하는 세포를 선택하였으며, 90 % 습도에서 5 % CO2로 37 ℃에서 배양하였다. 전처리된 HEI-OC1 세포를 6-웰 배양 배지 플레이트에 접종하여 적정 밀집도(confluency)가 될 때까지 배양하고, 10 μg/mL 미토마이신-C(시그마-알드리치)를 사용하여 2 시간 동안 불활성화 시켰다. 한편, 배아체(embryonic body, EB)는 GFP-양성 배아줄기세포(GFP-positive embryonic stem cell, mGFP-ESC)를 이용하여 현적법을 통해 형성하였다. 접촉식 공배양 시스템으로서 EB 또는 분리된 ESC를 HE1-OC1 세포의 불활성화된 층과 함께 ES-M에서 공배양하거나, 비접촉식 공배양 시스템으로서 CM에서 단독으로 배양하였다. 배지의 절반을 2 일마다 새로운 배지로 교환하면서 14 일 동안 유지하였다.
2. 비접촉식 공배양
HEI-OC1 세포가 세포-세포 상호작용 없이 단독으로 배양 배지에 방출하는 용해성 인자만으로 ESC 분화를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 전처리된 HEI-OC1 세포를 48 시간 배양한 후 상등액으로부터 조건 배지(conditioned media, CM)를 수집한 다음 원심분리하고 여과하였다. 분리된 ESC 또는 EB는 37 ℃에서 5 % CO2 및 90 % 습도로 CM에서 배양하였다. 배지의 절반을 2 일마다 새로운 배지로 교환하면서 14 일 동안 유지하였다.
3. 분화된 내이-유사 구조에 대한 양성 대조군
ESC는 선행문헌[Koehler KR, Hashino E. 3d mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nature protocols 2014;9: 1229-44]에 기재된 방법에 따라 내이-유사 오가노이드(organoid)로 분화시켰다. 요약하면, 분화 2 일째에 배양된 세포에 10 ng/mL의 재조합 BMP4(Stemgent, Beltsville, MD, USA)와 1 μM SB431542(Stemgent)를 첨가하여 비 신경 외배엽을 유도하였다. 3 일째, 25 ng/mL FGF-2(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)와 1 μM LDN-193189(Stemgent)를 첨가하여 전기원판성(preplacodal) 외배엽을 유도하였다. 세포를 2 일 동안 배양하고 배지를 6 일째에 1 % 마트리젤(Matrigel)을 함유하는 성숙 배지로 대체하였다. 18 일까지 격일로 배지의 절반을 마트리겔 없는 성숙 배지로 대체하였다. 상기 분화 과정의 개략도를 도 2(A)에 나타내었다.
4. 형광 분석(Epifluorescence analysis)
이미징용 EB를 준비하기 위하여 동결절편(cryosection)을 만들었다. 요약하면, EB를 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고, 차가운 PBS로 10 분 동안 3 회 세척하였다. 10, 20 및 30 %(wt/vol) 수크로오스-PBS 용액에서 각 30 분 동안 항온 처리하여 세포를 동결 보존하고 냉동주형(cyromold)으로 옮겼다. 수크로오스 용액을 광학 절단 온도(optimal cutting temperature,　OCT) 화합물(Sakura Finetek, Torrence,　CA, USA)로 대체하였다. 샘플을 드라이아이스로 급속 냉동하여 블록을 만들고 저온 유지 장치 조직절단기(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 5 μm 두께로 절단하였다. 절편 샘플을 슬라이드에 장착하고 이미징을 위하여 염색하였다. 장착 후, 실온(RT)에서 10 분 동안 PBS 중의 0.25 % Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 세포를 투과시키고, 비특이적 결합을 방지하기 위하여 10% 정상 염소 혈청(NGS; Vector Laboratories, Burlington , ON, Canada) 및 0.1 % Triton X-100으로 블록킹시켰다. EB는 4 ℃에서 하룻밤 동안 3 % NGS와 0.1 % Triton X-100을 포함하는 PBS 중의 MyosinVIIa(마이오신VIIa) 또는 Sox2 1차 항체(1:200, rabbit polyclonal; Millipore)와 함께 배양하였다. 세포를 각각 5 분 동안 PBS로 3 회 세척한 다음, 1 시간 동안 Alexa Fluor 568(1:1000, Abcam, Cambridge, UK) 접합된 항-토끼 2차 항체와 함께 배양하였다.
5. RT-qPCR
내이 유사 구조 유전자의 발현을 분석하기 위하여 GeneAll Hybrid-RTM(GeneAll Biotechnology, Songpa-gu, Korea)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 분리하였다. 정방향 및 역방향 프라이머(Oligomer, Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 하기 프라이머를 사용하였다(정방향, 역방향).
Oct4　(5'-GCCTTGCAGCTCAGCCTTAA-3', 5'-AAGCCAGGAATGGAAGCAGC-3')
Sox2　(5'-CACCCCTAGCCAACTTGCTG-3', 5'-CTTTGTTCTCCTCACCCGGC-3')
E-Cad (5'-TCTTAGGCACCCAGTAGGCC-3', 5'-TTCCAGGGAGACTGCTAGGC-3')
Laminin-β1 (5'-CACCCCTAGCCAACTTGCTG-3', 5'-CTTTGTTCTCCTCACCCGGC-3')
Pax2 (5'-GACAGCACCAGACAAGAGGC-3', 5'-TAGCCAAAAGCCTCGGCAG-3')
Pax8 (5'-CTTTGCAGTCCCCAGCTCAG-3', 5'-GCCAAGTGCTCTCCTGTGTC-3')
Atoh1 (5'-TCCTATGAAGGAGGTGCGG-3', 5'-TTAGGGCCCTGTCCTCGAAG-3')
Myosin7a　(5'-CACCAAGGGAGATTGTGGCC-3', 5'-CCTTGGACACCATGACACGG-3')
GAPDH　(5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3', 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3')
AB Applied Biosystem-7500 실시간 PCR 시스템(Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA)으로 RT-qPCR을 수행하여 유전자 발현을 평가하였다.
6. 결과
mGFP-ES 세포를 HEI-OC1와 접촉식으로 공배양하는 시스템을 도 1에 개략적으로 나타내었다. mGFP-ES 세포는 분리된 ESC와 현적법으로 배양한 EB와 각각 공배양하였고, 그 비교 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 분리된 ESC는 14일 배양 후 자연적으로 회전타원체(spheroid)를 형성하였으나 작은 크기였고 오가노이드를 형성하지 않았다(A). 공배양된 EB는 이와는 상이하게 배양 14일째에는 오가노이드를 형성하는 것으로 보였다(B). 14일의 공배양 후(C, D), 회전타원체(C)와 EB(D)는 신경 다능성 마커인 Sox2와 내이 유모세포 마커인 Myo7a로 면역염색되었다. 공배양된 ESC 셋업 모두 형성된 구조의 주변에 Sox2가 발현되었고, Myo7a는 HEI-OC1 세포 및 GFP 양성 ESC에서 발현되었다.
또한, 미분화된 HEI-OC1, 미분화된 ESC, 공배양 7일 시점, 공배양 14일 시점, 표준 분화 프로토콜에 따른 양성 대조군 배양의 7일 시점 및 14일 시점의 세포에 대하여 귀 연계 조직(otic lineage) 마커 유전자의 정량적 RT-PCR 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 공배양된 세포는 표준 분화 양성 대조군과 비교하여 초기 단계에서 외배엽성 마커(E-Cad, Laminin)를 발현하지 않았다(C, D). 귀의 전구(progenitor) 마커(Pax2, Pax8)는 이미 초기 단계에서 뚜렷하였으며, 후기 단계에서 더 상향조절되었다(E, F). 공배양된 ESC는 표준 분화군과 유사하게 후기 단계에서 최종적으로 유모 세포 마커를 발현하여, 접촉식 공배양 시스템에 의해 ESC가 유모 세포로 분화될 수 있음을 확인하였다.
7. 결론
상기 결과로부터 ES 세포와 HEI-OC1 세포 사이의 세포 상호작용이 ES 세포의 HC 유사 세포로의 분화를 자극할 수 있음을 알 수 있다. 그러나, 분화된 세포가 생체 내에서 더 발전할 수 있는 생존 활성효율과 기능 가능성 여부를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요하다.

Claims (14)

  1. (a) 코르티기관 내의 청각세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 배양된 상기 코르티기관 내의 청각세포와 배아줄기세포를 공배양하는 단계를 포함하는, 배아줄기세포를 내이 유모 세포 표현형 세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 코르티기관 내의 청각세포가 HEI-OC1 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 코르티기관 내의 청각세포가 배아줄기세포 유지 배지에서 생존한 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배아줄기세포 유지 배지가 LIF가 없는 배지인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 배양 후에 미토마이신-C로 불활성화 시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 배아줄기세포가 단일층(monolayer) 방법으로 배양되어 분리된 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 배아줄기세포가 현적법에 의하여 형성된 배아체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 배아체가 현적법에 의해 1 ~ 3일간 배양되어 형성된 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 공배양이 10 ~ 20일 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 내이 유모 세포 표현형 세포가 MyosinVIIa, Sox2, Pax2 및 Pax8로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 분화 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
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