JP6870681B2 - 細胞の調製方法、細胞培養装置及びキット - Google Patents
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-
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Description
[1]
細胞の調製方法であって、
細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程を含み、
ここで前記ポリイミド多孔質膜は、
複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、
ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、そして
マクロボイド層中の少なくとも1つの隔壁は、マクロボイド同士を連通する1つ又は複数の孔を有し、
以下の工程:
(1)ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
(2)前記工程(1)で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程
を含む方法で製造されるポリイミド多孔質膜である、細胞の調製方法。
[2]
前記ポリイミド多孔質膜が、
(1)ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
(2)前記工程(1)で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む方法で製造される、[1]に記載の細胞の調製方法。
[3]
前記ポリアミック酸が、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸二無水物と、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス(アミノフェノキシ)フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンとから得られる、[1]又は[2]に記載の細胞の調製方法。
[4]
細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]
前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[6]
前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[7]
生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、[6]に記載の方法。
[8]
前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、[6]又は[7]に記載の方法。
[9]
細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び1又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10]
2以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、[9]に記載の方法。
[11]
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、[9]又は[10]に記載の方法。
[12]
前記ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法。
[13]
細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、[12]に記載の方法。
[14]
2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[15]
[4]〜[14]のいずれか1つに記載の方法の2種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[16]
細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、[1]〜[15]のいずれか1つに記載の方法。
[17]
細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、[1]〜[16]のいずれか1つに記載の方法。
[18]
動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、[17]に記載の方法。
[19]
細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、[17]に記載の方法。
[20]
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、[1]〜[16]のいずれか1つに記載の方法。
[21]
細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、[1]〜[16]のいずれか1つに記載の方法。
[22]
ポリイミド多孔質膜を含む、[1]〜[21]のいずれか1つに記載の細胞の調製方法に使用するための細胞培養装置。
[23]
2以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層している、[22]に記載の細胞培養装置。
[24]
ポリイミド多孔質膜を含む、[1]〜[21]のいずれか1つに記載の細胞の調製方法に使用するためのキット。
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜中の表面層A(以下で、「A面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ)に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、0.01〜50μm、0.01μm〜40μm、0.01μm〜30μm、0.01μm〜20μm、又は0.01μm〜15μmであり、好ましくは、0.01μm〜15μmである。
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜は、
(1)ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
(2)前記工程(1)で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程
を含む方法で製造される。
本発明で使用されるポリイミド多孔質膜の製造方法では、まず、ポリアミック酸溶液を、フィルム状に流延する。流延方法は特に限定されず、例えば、ポリアミック酸溶液をドープ液として使用し、ブレードやTダイなどを用いてガラス板やステンレス板等の上に、ポリアミック酸溶液をフィルム状に流延することができる。また、連続の可動式のベルト又はドラム上に、ポリアミック酸溶液をフィルム状に断続的又は連続的に流延して、連続的に個片又は長尺状の流延物を製造することができる。ベルト又はドラムは、ポリアミック酸溶液及び凝固溶液に影響を受けないものであればよく、ステンレスなどの金属製、ポリテトラフルオロエチレンなどの樹脂製を用いることができる。また、Tダイからフィルム状に成形したポリアミック酸溶液をそのまま凝固浴に投入することもできる。また、必要に応じて流延物の片面又は両面を、水蒸気などを含むガス(空気、不活性ガスなど)と接触させてもよい。
次に、流延物を、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸を析出させて多孔質化を行うことで、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する。得られたポリアミック酸の多孔質膜は、必要に応じて洗浄及び/又は乾燥を行う。
次に、得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化してポリイミド多孔質膜を製造する。熱イミド化処理は、特に限定されないが、好ましくは当該処理後の膜の縦方向(長手方向)及び横方向の収縮率をそれぞれ、40%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは15%以下、一層好ましくは8%以下、特に好ましくは5%以下に抑制するように行われる。特に限定されないが、例えば、ポリアミック酸の多孔質膜を、ピン、チャック若しくはピンチロールなどを用いて支持体に固定し、大気中にて加熱することにより行うことができる。反応条件は、例えば280〜600℃、好ましくは300〜550℃の加熱温度で、1〜120分間、好ましくは2〜120分間、より好ましくは3〜90分間、さらに好ましくは5〜30分の加熱時間から適宜選択して行うことが好ましい。
(1)テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなる極限粘度数が1.0〜3.0であるポリアミック酸3〜60質量%と有機極性溶媒40〜97質量%とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
(2)前記工程で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、ここで、熱処理後の膜の縦方向及び横方向の収縮率をそれぞれ8%以下に抑制して、かつ前記熱処理において200℃以上の温度域での昇温速度が25℃/分以上である、
を含む。
(1)テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなる極限粘度数が1.0〜3.0であるポリアミック酸3〜60質量%と有機極性溶媒40〜97質量%とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
(2)前記工程で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び、
(3)前記工程(2)で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む。
本発明の細胞の調製方法は、細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養することを含む。本発明の方法は、ポリイミド多孔質膜に細胞を適用し、ポリイミド膜の表面又は内部で細胞を培養することを含むことを特徴とするものである。
細胞のポリイミド多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリイミド多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(A)細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様;
(B)前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
本発明の方法に利用し得る細胞の種類は特に限定されず、任意の細胞の増殖に利用可能である。
本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。動物細胞、植物細胞、及び細菌の各細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリイミド多孔質膜に細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
培養ユニットは細胞を担持するための1又は複数のポリイミド多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
本発明はまた、ポリイミド多孔質膜を含む、本発明の調製方法に使用するための細胞培養装置に関する。本発明の細胞培養装置において、ポリイミド多孔質膜は固定されて用いられても良く、あるいは細胞培養培地中に浮遊して用いられても良い。細胞培養装置において、2以上のポリイミド多孔質膜が、上下又は左右に積層してもよい。
本発明はさらに、ポリイミド多孔質膜を含む、細胞の調製方法に使用するためのキットに関する。
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞数の経時変化
(1)ポリアミック酸溶液組成物Aの調製
500mlのセパラブルフラスコに、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)を溶媒として用いて、酸無水物として3,3’,4,4’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物(s−BPDA)を、ジアミンとして4,4’−ジアミノジフェニルエーテルを、酸無水物/ジアミンのモル比0.994、ポリマー濃度が8質量%になる量を測り取って投入した。その後、撹拌羽、窒素導入管、排気管を取り付けたセパラブルカバーで蓋をし、撹拌操作を30時間継続した。撹拌を終了し、フラスコ内のドープを加圧ろ過器(濾紙:アドバンテック東洋(株)製:粘稠液用濾紙No.60)でろ過して、ポリアミック酸溶液組成物Aを得た。溶液組成物Aは粘稠な液体であり粘度は320ポイズであった。また、極限粘度数は1.6であった。
室温下で、卓上の自動コーターを用いて、表面に鏡面研磨を施したステンレス製の20cm角の基板上に、ポリアミック酸溶液組成物Aを厚さ約100〜300μmの範囲の厚みで均一に流延塗布した。その後、90秒間、温度23℃、湿度40%の大気中に放置し、その後、凝固浴(水80質量部/NMP20質量部、室温)中に基板全体を投入した。投入後、8分間静置し、基板上にポリアミック酸膜を析出させた。その後、基板を浴中から取りだし、基板上に析出したポリアミック酸膜を剥離した後に、純水中に3分間浸漬し、ポリアミック酸膜を得た。このポリアミック酸膜を温度23℃、湿度40%の大気中で乾燥させた後、10cm角のピンテンタ−に張りつけて四辺を拘束した。電気炉内にセットして約10℃/分の昇温速度で150℃まで加熱し、その後は最高温度340℃となるまで加熱し、そのまま3分間保持する温度プロファイルで熱処理を行い、厚みの異なるポリイミド多孔質膜1(25μm)ポリイミド多孔質膜3(48μm)を調製した。ポリイミド多孔質膜1及び3を、それぞれ以下で「膜1」及び「膜3」とも呼ぶ。いずれも、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、当該表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であった。
(1)ポリアミック酸溶液組成物Bの調製
500mlのセパラブルフラスコに、N−メチル−2−ピロリドン(NMP)を溶媒として用いて、酸無水物として3,3’,4,4’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物(s−BPDA)を、ジアミンとして4,4’−ジアミノジフェニルエーテルを、酸無水物/ジアミンのモル比0.996、ポリマー濃度が8質量%になる量を測り取って投入した。その後、撹拌羽、窒素導入管、排気管を取り付けたセパラブルカバーで蓋をし、撹拌操作を30時間継続した。撹拌を終了し、フラスコ内のドープを加圧ろ過器(濾紙:アドバンテック東洋(株)製:粘稠液用濾紙No.60)でろ過して、ポリアミック酸溶液組成物を得た。溶液組成物は粘稠な液体であり粘度は452ポイズであった。また、極限粘度数は2.4であった。
室温下で、卓上の自動コーターを用いて、表面に鏡面研磨を施したステンレス製の20cm角の基板上に、ポリアミック酸溶液組成物Bを厚さ約100〜200μmで、均一に流延塗布した。その後、90秒間、温度23℃、湿度40%の大気中に放置し、その後、凝固浴(水80質量部/NMP20質量部、室温)中に基板全体を投入した。投入後、8分間静置し、基板上にポリアミック酸膜を析出させた。その後、基板を浴中から取りだし、基板上に析出したポリアミック酸膜を剥離した後に、純水中に3分間浸漬し、ポリアミック酸膜を得た。このポリアミック酸膜を温度23℃、湿度40%の大気中で乾燥させた後、10cm角のピンテンタ−に張りつけて四辺を拘束した。電気炉内にセットして約10℃/分の昇温速度で150℃まで加熱し、その後に最高温度340となるまで加熱し、そのまま3分間保持する温度プロファイルで熱処理を行い、ポリイミド多孔質膜を得た。
その後、得られたポリイミド多孔質膜の片面に常圧プラズマ処理を60秒間施し、ポリイミド多孔質膜2、4を得た。以下で「膜2」及び「膜4」とも呼ぶ。いずれの膜も、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、当該表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であった。
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社 cat.103)にヒト線維芽細胞用培地(LONZA社、CC-3132)1mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形の膜1〜膜4を、メッシュ構造のA面もしくは大穴構造のB面を上にして静置した。1枚のシートあたり4×104個のヒト皮膚線維芽細胞(LONZA社、CC-2511)を播種し、CO2インキュベータ内で培養を継続的に行った。週2回培地(1ml)交換を行った。培養開始後、5日、7日、12日、19日、27日後にCell Counting Kit-8(同仁化学研究所製、以下で「CCK8」と呼ぶ)を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図1に示す。膜1〜4において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたCHO DP−12細胞の細胞数の経時変化
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に細胞培養培地(和光純薬工業株式会社 IMDM 098−06465)0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形の膜1〜膜4(実施例1で調製されたもの)を、メッシュ構造のA面を上に据え、1枚のシートあたり4×104個の、抗ヒトIL−8抗体産生CHO DP−12細胞(ATCC CRL−12445)を播種した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回定期的に培地を交換した。培養開始後、3日間、7日間、15間、22日間、29間後にCCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図2に示す。安定した細胞の生育が観測された。膜1〜4において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト間葉系幹細胞の細胞数の経時変化
2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、cat.103)に間葉系幹細胞培養培地(LONZA社製、MSCBM)0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形の膜1〜膜4(実施例1で調製されたもの)を、メッシュ構造のA面を上に据え、1枚のシートあたり4×104個のヒト間葉系幹細胞を播種した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回定期的に培地を交換する。培養開始後、3日間、7日間、15間、22日間、29間後にCCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図3に示す。膜1〜4において、同程度の数の細胞を安定に培養できることが確認された。
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の長期培養
ヒト間葉系幹細胞を口内径6cmのタイプIコラーゲンコートディッシュ(IWAKI製)に播種して培養後、トリプシン処理により剥離し、細胞懸濁液を調製した。2cm×2cmの滅菌された正方形容器(Thermo Fisher Scientific社、 cat.103)に細胞培養培地(GIBCO製、DMEM+FBS10%)0.5mlを加え、滅菌した1.4cm角の正方形のポリイミド多孔質膜1及び2(実施例1で調製されたもの)を、メッシュ構造のA面を上にして容器に据え、1枚のポリイミド多孔質膜あたり4×104個のヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔膜上部に添加した。CO2インキュベータ内で培養を継続し、週2回培地を交換した。培養開始後、定期的にCCK8を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察しつつ培養した。106日間までの培養細胞数推移を図4に示す。安定した細胞の生育が観察された。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導
実施例4の培養開始後120日目における、細胞の生着したポリイミド多孔質膜1を、骨芽細胞分化誘導培地(PromoCell社製、C-28013)に移し、22日間骨芽細胞に誘導(週2回培地交換)した後、更に骨芽細胞石灰化培地(PromoCell社製、C-28020)に移して14日間培養した。石灰化染色キット(コスモバイオ社製)にて染色した。光学顕微鏡観察を行い、石灰化部位の観察を行なった。顕著な赤変部位が観察され、石灰化の進行が確認された(図6)。間葉系幹細胞の持つ幹細胞特性の維持が確認された。
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導
実施例4の培養開始後127日目における、細胞の生着したポリイミド多孔質膜2を、脂肪細胞誘導培地(PromoCell社製、C-28016)に移して、15日間培養した。その後、細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、脂肪細胞の油滴をBODIPYにて蛍光染色した。光学観察、並びに共焦点レーザー顕微鏡による同視野の光学及び蛍光観察の結果を図7に示す。黄白色ポリイミド多孔質膜の有する高視認性により、蛍光染色のみならず、光学観察においても、油滴の存在が観察された。間葉系幹細胞の持つ幹細胞特性の維持が確認された。
ポリイミド多孔質膜上で長期培養されたヒト間葉系幹細胞の遺伝子解析
1.サンプルの調製
実施例4の培養開始後154日目における膜1の部材培養細胞サンプルを遺伝子解析用サンプルとして使用した。また、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は実施例4と同様の条件で、タイプIコラーゲンコートディッシュ(IWAKI製)中でヒト間葉系幹細胞を7日間培養した。培養された細胞を遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。
得られたサンプルに関し、以下の手順で遺伝子解析を行なった。
(1)RNA抽出
RNeasy Plus micro Kit(Qiagen)を用いて付属のプロトコール通りにRNAの抽出を行った。RNAは30μLのNuclease Free Waterで抽出し、その後、TURBO DNA free Kit(Life Technologies)を用いてDNaseによるゲノムDNAの分解処理を行った。分解処理後、RNA 溶液の濃度をNano Drop 2000(ThermoFishier Scientific)で測定した。
(2)cDNA合成
濃度測定後のRNA 溶液を12.5ng/μLに調製し、100ngをテンプレートとしてcDNA合成を行った。合成にはSuperScript(商標) III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Life Technologies)を使用した。cDNA 溶液の濃度をNano Drop 2000で測定した。
(3)q-PCR 反応
cDNA 溶液を200ng/μLに調製し、200ngをテンプレートとしてとしてリアルタイムPCRによる測定を行った。PCRはCFX connect(Bio-Rad)で行い、試薬はSsoAdvanced(商標) Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を使用した。間葉系幹細胞陽性マーカー(CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71)、間葉系幹細胞陰性マーカー(CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86)について、発現量を測定し、内部標準遺伝子としてはbeta-Actinを使用した。
(4)測定データ解析
測定で求められた各遺伝子のCt値を、内部標準遺伝子として測定したbeta-ActinのCt値で引いた値から、相対発現量を算出して比較した。また、通常培養サンプルと部材培養サンプルで遺伝子発現の経時変化を比較するために、7日間通常培養したサンプルの発現量を1とした場合の変化をそれぞれ算出して比較した。陽性マーカーに関する結果を図8に示す。なお、陰性マーカーの発現量は全て低値であることを確認した。遺伝子発現量の結果から、実施例1で調製された膜を用いて長期培養した後であっても、幹細胞特性が維持されることが確認された。
ポリイミド多孔質膜を用いた、ヒト皮膚線維芽細胞の長期培養
実施例1にて実施した実験を更に継続し、約1年間の長期培養を実施した。培地交換は、週2回継続的に実施し、適宜、CCK8を用いて生育細胞数の測定を行った。結果を図9に示す。長期間培養した場合であっても、ヒト皮膚線維芽細胞の安定した増殖及び生育が観察された。
ポリイミド多孔質膜を用いて培養されたヒト皮膚線維芽細胞からの物質産生
実施例8の培養開始後397日目における部材培養細胞サンプルからのフィブロネクチン産生を、ヒトフィブロネクチン測定用ELISAキット(タカラバイオ製、Cat# MK115)を用いて測定した。結果を図10に示す。なお、コントロールサンプルとして、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は実施例8と同様の条件で、細胞培養用シャーレ(住友ベークライト製)中で8日間培養したヒト皮膚線維芽細胞を用いて、当該細胞のフィブロネクチン産生を測定した(図中のDish1及び2)。長期培養後においても、安定したフィブロネクチン産生が確認され、ヒト皮膚線維芽細胞の特性が維持されていることを確認した。ポリイミド多孔質膜で培養された細胞からの物質産生の効率は、通常培養で培養された細胞からの物質産生の効率と比較して非常に高いことが確認された。
Claims (21)
- 細胞の調製方法であって、
細胞をポリイミド多孔質膜に適用し、培養する工程を含み、
ここで前記ポリイミド多孔質膜は、
複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、
ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、そして
マクロボイド層中の少なくとも1つの隔壁は、マクロボイド同士を連通する1つ又は複数の孔を有し、
以下の工程:
(1)テトラカルボン酸単位及びジアミン単位からなる極限粘度数が1.0〜3.0であるポリアミック酸3〜60質量%と有機極性溶媒40〜97質量%とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、及び
(2)前記工程で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、ここで、熱処理後の膜の縦方向及び横方向の収縮率をそれぞれ8%以下に抑制して、かつ前記熱処理において200℃以上の温度域での昇温速度が25℃/分以上である、
を含む方法で製造されるポリイミド多孔質膜である、細胞の調製方法。 - 前記ポリイミド多孔質膜が、
(1)ポリアミック酸と有機極性溶媒とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製する工程、
(2)前記工程(1)で得られたポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化する工程、及び
(3)前記工程(2)で得られたポリイミド多孔質膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施す工程
を含む方法で製造される、請求項1に記載の細胞の調製方法。 - 前記ポリアミック酸が、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸二無水物と、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス(アミノフェノキシ)フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンとから得られる、請求項1又は2に記載の細胞の調製方法。
- 細胞を前記ポリイミド多孔質膜の表面に播種する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリイミド多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
前記ポリイミド多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリイミド多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ポリイミド多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養培地又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリイミド多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記ポリイミド多孔質膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 生細胞が前記ポリイミド多孔質膜内に留まり、死細胞は水分とともに流出する、請求項6に記載の方法。
- 前記滅菌された液体が、滅菌水若しくは滅菌された緩衝液である、請求項6又は7に記載の方法。
- 細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び1又はそれ以上の前記ポリイミド多孔質膜を入れる、ここにおいて、ポリイミド多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である、ことを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 2以上の前記ポリイミド多孔質膜の小片を用いることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記ポリイミド多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 細胞が、前記ポリイミド多孔質膜に自発的に接着する、請求項12に記載の方法。
- 2以上のポリイミド多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いることを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項4〜14のいずれか1項に記載の方法の2種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞がポリイミド多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 動物細胞が、脊椎動物門に属する動物由来の細胞である、請求項17に記載の方法。
- 細菌が、乳酸菌、大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリアからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
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