JPWO2018174186A1 - 神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリマー多孔質膜上で神経幹細胞を培養することによって、神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法に関する。

Description

本発明は、神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法に関する。

神経幹細胞の培養について
神経幹細胞は、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有するため、神経再生医療の分野で注目されている。しかし、分化能を維持したまま神経幹細胞を長期培養することは困難であることが知られている。例えば、成体海馬由来の野生型の神経幹細胞は、継代に伴い自己複製能及び多分化能を著しく低下させることが報告されている（非特許文献１）。

ハニカム状多孔質体を用いて、凝集塊を形成していない（スフェロイド化していない）未分化の神経幹細胞を調製することができることが報告されている（特許文献１）。特許文献１で使用されているハニカム状多孔質体とは、膜の垂直方向に向けられた微少な孔（くぼみを含む）が膜の平面方向に蜂の巣状に設けられている薄膜構造体のことである。

ポリイミド多孔質膜
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。

細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。

特開２００８−０５４６２１号公報 国際公開第２０１０／０３８８７３号 特開２０１１−２１９５８５号公報 特開２０１１−２１９５８６号公報 国際公開第２０１５／０１２４１５号

Seaberg, M. et al., The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1784-1793

本発明は、従来とは全く異なる手段を用いて神経幹細胞の分化を抑制し、当該神経幹細胞を大量に供給可能な方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、複数の孔を有する２つの表面層と、当該２つの表面層との間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜上で神経幹細胞を培養することで、驚くべきことに、神経幹細胞の分化を抑制できることを見出し、本発明に至った。当該ポリマー多孔質膜は、特許文献１に開示されているようなハニカム状多孔質体とは全く異なる立体形状を有する。

すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
［２］
神経幹細胞が野生型細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
前記工程（２）が少なくとも７０日間実施される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記工程（２）において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０×１０⁵個以上となるまで増殖させる、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
前記ポリイミド多孔質膜を
ｉ）折り畳んで、
ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
前記表面層Ａの平均孔径が、５μｍ〜５０μｍである、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１１］に記載の方法。
［１３］
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］
神経幹細胞を調製する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
［１６］
前記工程（２）で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
（３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。

本発明によれば、神経幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給することができる。

図１は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。 図２は、ポリイミド多孔質膜上で培養を開始してから１０日経過後の神経幹細胞のスフェロイドの光学顕微鏡写真を示す。 図３は、培養開始１０日経過後にポリイミド多孔質膜から培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを免疫染色したときの顕微鏡写真である。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（核染色マーカー）：青、ネスチン（神経幹細胞のマーカー）：緑、ＳＯＸ２（神経幹細胞のマーカー）：赤。 図４は、培養開始７０日経過後にポリイミド多孔質膜から培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ネスチン：緑、ＳＯＸ２：赤。 図５は、培養開始３０日経過後にポリイミド多孔質膜内及び上で培養されている神経幹細胞の細胞塊にＤＮＡ合成の指標としてＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）を取り込ませた後に、当該ＥｄＵを蛍光標識したときの顕微鏡写真である（中央及び右）。ＤＡＰＩによって細胞核を免疫染色したときの顕微鏡写真も示す（左及び右）。 図６は、培養開始３０日経過後にポリイミド多孔質膜内及び上で培養されている神経幹細胞の細胞塊にＤＮＡ合成の指標としてＥｄＵを取り込ませた後に、当該ＥｄＵを蛍光標識したときの顕微鏡写真である（中央及び右）。ＳＯＸ２を免疫染色したときの顕微鏡写真も示す（左及び右）。 図７は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤である血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor（ＰＤＧＦ））を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、Milli-Mark Pan Neuronal Marker（商標）（Neuronal mark）（成熟ニューロンのマーカー）：緑、グリア線維酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein（ＧＦＡＰ））（アストロサイトの分子マーカー）：赤。 図８は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、microtubule-associated protein ２（ＭＡＰ２）（ニューロンの樹状突起のマーカー）：緑、γ-aminobutyric acid（ＧＡＢＡ）（ＧＡＢＡ作動性ニューロンの分子マーカー）：赤。 図９は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、Ｇｌｕ（グルタミン酸）（グルタミン酸作動性ニューロンの分子マーカー）：赤。 図１０は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、Neuronal mark：緑、ＧＦＡＰ：赤。 図１１は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、ＧＡＢＡ：赤。 図１２は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、Ｇｌｕ：赤。 図１３は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、アストロサイト優位な分化誘導剤であるbone morphogenetic protein ２（ＢＭＰ２）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＧＦＡＰ：赤。 図１４は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＧＦＡＰ：赤。 図１５は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＧＦＡＰ：赤、ＭＡＰ２：緑、ＤＡＰＩ：青。 図１６は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＮＧ２（幼若オリゴデンドロサイトの分子マーカー）：赤、Ｏ４：（成熟オリゴデンドロサイトの分子マーカー）：緑、ＤＡＰＩ：青。

本発明の一態様は、神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の分化抑制方法」とも呼ぶ。

また、本発明の別の態様は、神経幹細胞を調製する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の調製方法」とも呼ぶ。

また、本発明の別の態様は、神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
（３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。

「本発明の分化抑制方法」、「本発明の調製方法」及び「本発明の分化誘導方法」を、以下で「本発明の方法」とも呼ぶ。

１．本発明の方法で使用される神経幹細胞について
本明細書において「神経幹細胞」とは、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有する細胞のことである。

本発明に利用し得る神経幹細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の神経幹細胞であり、より好ましくは霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの神経幹細胞であり、特に好ましくはヒトの神経幹細胞である。

本発明の方法で使用される神経幹細胞の取得方法は特に限定されない。例えば、動物の中枢神経組織から単離されてもよい。中枢神経組織としては、海馬、側脳室及びその周辺の組織が好ましい。また、動物の発生・発達段階は特に限定されず、胎仔（胎児）、未成熟個体、成体などのいずれであってもよい。あるいは、本発明の方法で使用される神経幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ＭＵＳＥ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）などの多能性幹細胞を分化誘導して取得されてもよい。

本発明の方法で使用される神経幹細胞は、野生型細胞であってもよいし変異細胞（例えば、ｐ３８αヘテロ接合体マウス由来の細胞（Yoshioka, K. et al., FEBS Open Bio 5(2015)437-444を参照））であってもよい。

２．本発明で使用される神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程について
限定されるわけではないが、本発明の方法において、神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。

（Ａ）神経幹細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に神経幹細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、神経幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に神経幹細胞懸濁液を装填し、そして、
神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。

（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞又は細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を神経幹細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。

ポリマー多孔質膜の表面に播種された神経幹細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、神経幹細胞はポリマー多孔質膜に自発的に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された神経幹細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。神経幹細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。

（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に神経幹細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、神経幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、神経幹細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の神経幹細胞懸濁液が装填された箇所に神経幹細胞が吸い込まれて播種される。

あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に神経幹細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、神経幹細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。

例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に神経幹細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、神経幹細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。

（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞の濃度を濃縮する、神経幹細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。

（Ａ）の態様を「自然播種」、（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。

限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。

態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。

さらに、本発明の方法において、神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある神経幹細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより神経幹細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、神経幹細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、神経幹細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、神経幹細胞は、ポリマー多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、神経幹細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。

上述した神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用してもよい。

３．本発明で使用される神経幹細胞を培養し、増殖させる工程について
本発明で使用される神経幹細胞の培養は、細胞をポリマー多孔質膜に接着させる接着培養で行われても良いし、細胞を培養培地中に浮遊させる浮遊培養で行われても良い。大量培養が可能であるという観点から、浮遊培養が好ましい。

本発明の方法において、ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリマー多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリマー多孔質膜は立体的でフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの培養可能な表面積を有するポリマー多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明の方法におけるポリマー多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリマー多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリマー多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。また、ポリマー多孔質膜は従来の平面培養とは全く異なり、立体的かつフレキシブルな構造を有する細胞培養基材であるため、接着性を有する細胞を培養容器の形状を選ばず、様々な形状、材質、大きさの培養容器内でも培養可能である（例えば、シャーレ、フラスコ、タンク、バッグ等）。

ポリマー多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。

本発明の方法で使用されるポリマー多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリマー多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）〜ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。

小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリマー多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に神経幹細胞を培養することが可能になる。既に神経幹細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。積層するポリマー多孔質膜の数は特に限定されない。

本発明の方法において、好ましくは、神経幹細胞はポリマー多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。

本発明の方法において、従来のようにトリプシン処理等を行う継代操作を行う事なく、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも５０日間、少なくとも７０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも２００日間、少なくとも２２５日間、または少なくとも３００日間の長期にわたって、分化を抑制しながら神経幹細胞を培養することができる。また、本発明の方法により、従来の平面培養で培養することができる期間以上、例えば、平面培養期間の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上の期間、分化を抑制しながら神経幹細胞を培養することができる。本発明によれば、シャーレ等の平面培養での長期間の細胞培養で発生するスフェロイドの変形や細胞の分化能の消失等を生じる事なく、休止状態ではなく動的であり、かつ本来の特性を維持した神経幹細胞を長期間維持する事ができる。また、本発明によれば、長期培養した神経幹細胞であってもセルバイアビリティ又は神経幹細胞の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現量等）が、長期培養前の神経幹細胞と比較してほとんど変化しない。また、本発明によれば、神経幹細胞がポリマー多孔質膜内において三次元的に増殖するため、従来の平面培養で見られるような培養領域の制限及び平面環境によりおこるコンタクトインヒビションが起こりにくいため、長期間、生育させる培養が可能となる。また、本発明によれば、神経幹細胞が接着したポリマー多孔質膜に別のポリマー多孔質膜を接触させることによって、細胞培養可能な空間を任意に増加することが可能であり、従来のようなトリプシン処理を伴った継代操作を行うことなく、コンタクトインヒビションが引き起こされるコンフルエント状態を回避しながら長期間、増殖させる培養が可能となる。また、本発明によれば、神経幹細胞を凍結等行うことなく、生きたまま長期間保存するという新たな保存方法までも提供される。

４．本発明で使用されるポリマー多孔質膜について
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、その下限は、０．０１μｍ以上、０．１μｍ以上、１μｍ以上、２μｍ以上、３μｍ以上、４μｍ以上、５μｍ以上、６μｍ以上、７μｍ以上、８μｍ以上、９μｍ以上又は１０μｍ以上であり、その上限は、２００μｍ未満、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下又は１５μｍ以下である。表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、好ましくは０．０１μｍ〜５０μｍであり、より好ましくは１μｍ〜５０μｍであり、特に好ましくは５μｍ〜５０μｍである。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、その下限は５μｍ超、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上又は６０μｍ以上であり、その上限は、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下又は７０μｍ以下である。表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は、好ましくは２０μｍ〜１００μｍである。

ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）

表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。

ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。

本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ³とする。）

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の多孔質膜である。

ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。

一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。

ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。

ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。

ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。

本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。

着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。

炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。

また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。

着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。

これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。

これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。

例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１−２１９５８５、又は特開２０１１−２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。

アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。

二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。

ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。

ポリエーテルスルホンの対数粘度は、ＰＥＳ多孔質膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。

また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。

５．細胞培養と培養体積
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の神経幹細胞が生育するため、大量の神経幹細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の神経幹細胞を培養することが可能となる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。

本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。そして、ポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に神経幹細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、神経幹細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、神経幹細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。

本発明の方法において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。

つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する神経幹細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、神経幹細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。

本発明の方法において、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる神経幹細胞の数が、神経幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０⁵個以上、１．０×１０⁶個以上、２．０×１０⁶個以上、５．０×１０⁶個以上、１．０×１０⁷個以上、２．０×１０⁷個以上、５．０×１０⁷個以上、１．０×１０⁸個以上、２．０×１０⁸個以上、５．０×１０⁸個以上、１．０×１０⁹個以上、２．０×１０⁹個以上、または５．０×１０⁹個以上となるまで培養することをいう。

なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる神経幹細胞の数を、神経幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。たとえば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、神経幹細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。

また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０⁵個以上、２．０×１０⁵個以上、１．０×１０⁶個以上、２．０×１０⁶個以上、５．０×１０⁶個以上、１．０×１０⁷個以上、２．０×１０⁷個以上、５．０×１０⁷個以上、１．０×１０⁸個以上、２．０×１０⁸個以上、または５．０×１０⁸個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。

６．神経幹細胞の培養システム及び培養条件

本発明の方法において、神経幹細胞の細胞培養培地は、当該細胞が培養できるのであれば特に限定されないが、例えば、DMEM/F-12HAMに対し、1×N2 supplement、0.5×B27 supplement、25ng/ml bFGF、及び25ng/ml EGFを添加した培地が使用され得る。

ポリマー多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。

本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。なお、浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養システムも使用することが可能である。

本発明の方法は、
ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている、細胞培養モジュールを用いて行われても良い。本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システム、特に浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材をいう。神経幹細胞を含む懸濁液を当該細胞培養モジュールと接触させることにより、神経幹細胞がポリマー多孔質膜に接着する。神経幹細胞を増殖させた後、スフェロイドとして放出されるものを回収もしくは再播種することで、大量の神経幹細胞の回収が実行可能となる。

ポリマー多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリマー多孔質膜がケーシング内で、継続的に形態が変形することが防止される。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される神経幹細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の神経幹細胞を培養することが可能となる。

上記細胞培養モジュールが備えるケーシングは、２以上の培地流出入口を有することで、細胞培地がケーシングの内部へ供給及び外部へ排出される。該ケーシングの培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、培地流出入口の径が、該培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本明細書において、「メッシュ形状の構造」とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。

上記細胞培養モジュールが備えるケーシングは、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振とう培養条件における培地の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましく、非可撓性素材から形成されていることが好ましい。また、ケーシングは、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。ケーシングにある程度強度があることにより、ケーシング内部のポリマー多孔質膜の形状が継続的に変更することが防止される。本明細書において、「ケーシングが変形しない」とは、通常の培養環境下で受ける負荷において変形しないことを意味するものであり、絶対的に変形しないことを意味するものではない。

上記細胞培養モジュールは、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立したポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている。

本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立したポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。上記細胞培養モジュールにおいて、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、正方形が好ましい。上記細胞培養モジュールにおいて、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。なお、ひも状のポリマー多孔質膜の場合、後述するように、（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、該ケーシングに収容されてもよい。

本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。

本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また本明細書において、「縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜」とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立したポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。

本明細書において、「ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、細胞培養モジュールを細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等による細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。

上記細胞培養モジュールは、細胞を浮遊状態で培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性のバッグからなる培養装置にも適用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また、上記細胞培養モジュールは、例えば、スピナーフラスコ等の攪拌培養型容器に適用し、培養することが可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。

７．培養された細胞の回収
一実施形態において、本発明の方法で培養された神経幹細胞は回収される。回収方法は特に限定されないが、例えば、スフェロイドを形成してポリマー多孔質膜上から培養培地中に遊離した神経幹細胞を回収してもよい。あるいは、ポリマー多孔質膜上に接着している神経幹細胞のスフェロイドをピペッティングなどによりポリマー多孔質膜から遊離させることによって回収しても良い。また、アキュターゼ（商標）（ナカライテスク社）等の酵素によりポリマー多孔質膜を処理する方法によっても、効率的に神経幹細胞を回収、もしくは再播種する事が可能となる。

８．本発明の分化誘導方法について
本発明の分化誘導方法において、ポリマー多孔質膜上で増殖した神経幹細胞は、分化誘導条件下で培養することで分化誘導がなされる。神経幹細胞の分化誘導に関する具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程を含め、膜状の担体に生育する神経幹細胞を分化誘導培地等の分化誘導環境に接触させるのに適した任意の手法を採用することが可能である。

限定されるわけではないが、神経幹細胞からニューロン及びグリア細胞への分化は、当業者に周知の方法で行うことができる。特に限定されないが、例えばＰＤＧＦ、フォルスコリン、ＢＭＰ２などを用いて行うことが可能である。

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。

実施例１
ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の培養
野生型マウス（C57BL/6J、日本クレア社より入手）の歯状回を含む海馬から神経幹細胞を採取した。細胞培養培地（D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製）１０ｍｌを含む容器（ベントキャップ付組織培養用フラスコ（付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製）中で、上記で採取した神経幹細胞を８日間培養した。神経幹細胞のスフェロイドを培地から回収し、それを酵素（アキュターゼ （商標）（ナカライテスク社））で処理することよってスフェロイドを分解し、神経幹細胞を含む細胞培養培地懸濁液を調製した。滅菌した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜と培養培地（D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製）とを含む容器（組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製）に上記の神経幹細胞の懸濁液を添加し、培養を開始した。培養を開始してから１０日後にポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。その後は３日経過するごとに、ポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。培養を開始してから１０日後の神経幹細胞の光学顕微鏡写真を図２に示す。また、培養開始１０日後及び７０日後に、培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを回収し、免疫染色を行った。免疫染色は４％ＰＦＡで細胞を固定の上、０．１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理し、ブロッキングを行った後、一次抗体を４℃にて一晩反応させ、二次抗体を室温にて一時間反応させた。顕微鏡写真を図３及び４に示す。７０日経過後であっても、神経幹細胞が未分化のままで維持された（図４）。また、培養開始３０日後にポリイミド多孔質膜上で成長しているスフィロイドにＤＮＡ合成指示薬であるＥｄＵを短時間取り込ませ、スフィロイド中の分裂Ｓ期細胞核を蛍光ラベルした（図５及び６）。ポリイミド多孔質膜内外で細胞が増殖していることが示された。

実施例２
ポリイミド多孔質膜上で培養した神経幹細胞の分化誘導
上記実施例１で培養開始１０日後および７０日後に回収された神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤（ＰＤＧＦ、フォルスコリンまたはＢＭＰ２）を添加し、５日間培養した後に免疫染色を行った。顕微鏡写真を図７〜１３に示す。培養を開始してから７０日経過後の神経幹細胞であっても、分化能を維持していることが示された（図１０〜１３）。

実施例３
ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の長期間培養、及び長期間培養後の神経幹細胞の分化誘導
上記実験例１に準じて、１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜上で神経幹細胞を培養した。培養開始３０日後、別途用意した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のＡ面同士が重なるように配置し、培養を継続した。新たに追加したポリイミド多孔質膜によって、細胞培養可能な空間が増大した。その後７日毎に、別途用意した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のＡ面同士が重なるように配置して培養空間を適宜増大させながら培養を継続することにより、最終的に神経幹細胞を２２５日間培養することができた。

培養開始２２５日後に回収された神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤（ＰＤＧＦ、またはＢＭＰ２）を添加し、５日間培養した後に免疫染色を行った。顕微鏡写真を図１４〜１６に示す。培養開始から２２５日経過後の神経幹細胞であっても、分化能を維持していることが示された。

本発明の方法は、神経幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給するために利用することができる。

Claims (17)

1. 神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
   （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
   （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
   を含み、
   ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
2. 神経幹細胞が野生型細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（２）が少なくとも７０日間実施される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記工程（２）において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０×１０⁵個以上となるまで増殖させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. ２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ポリイミド多孔質膜を
   ｉ）折り畳んで、
   ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
   ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
   ｉｖ）縄状に結んで
   細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記表面層Ａの平均孔径が、５μｍ〜５０μｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１１に記載の方法。
13. ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
15. 神経幹細胞を調製する方法であって、
    （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
16. 前記工程（２）で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
    （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
    （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
    （３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。