KR101461133B1

KR101461133B1 - 헤파린 기반 수화젤을 포함하는 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101461133B1
Application number: KR1020120056725A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 김미혜
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2014-11-13
Also published as: KR20130133461A

Abstract

본 발명은 헤파린 기반 수화젤을 포함하는 줄기세포 배양기판, 특히 성체 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 헤파린 및 수용성 고분자를 포함하는 줄기세포 배양기판으로서, 상기 헤파린의 함량은 상기 배양기판 총 중량에 대해서 1 중량% 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법에 관한 것이다:
본 발명에 따른 줄기세포 배양기판은 줄기세포의 부착과 증식에 최적화된 환경을 제공할 수 있으며, 특히 배양된 줄기세포가 다분화능 (pluripotency)을 그대로 유지하므로, 줄기세포 증식 및 연구에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

헤파린 기반 수화젤을 포함하는 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법 {Matrix platform for culturing stem cell including heparin-based hydrogel and method for preparing the same}

본 발명은 헤파린 기반 수화젤을 포함하는 줄기세포 배양기판, 특히 성체 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법에 관한 것이다.

자가-재생능력 뿐 아니라 다양한 세포 형태로 분화하는 능력을 가진 줄기세포는 조직 공학과 재생 의학용으로 가장 기대되고 있는 세포원 중 하나이다. 이러한 줄기세포 중에서도, 특히 배아 줄기세포에 대한 윤리적인 우려로 인해 성체 줄기세포가 집중적으로 이용되어 왔고, 그 중에서도 인간 지방-유래 줄기세포 (human adipose-derived stem cells: hADSC)는 다량으로 쉽게 이용가능하고 다분화능을 보유하고 있어 많은 관심을 받아왔다. hADSC의 성공적인 이용은 크게 배양 중에 또한 주입 후에 세포 운명을 제어하는 능력에 달려 있다. hADSC를 세포원으로서 구현하기 위해서 배양 기질로서 고려해야 할 중요한 점은 세포 부착의 안정성, 충분한 세포 증식과 분화 제어성이다. hADSC 배양을 위한 종래의 방법은 대표적으로 조직 배양용 폴리스티렌 (Tissue Culture Polystyrene: TCP)을 사용하는 것이지만, TCP를 이용하면 배양 중에 TCP가 제공하는 비특이적이고 비생물학적인 상호작용으로 인해 통상적으로 증식능 제한, 다분화능 손실이 나타나고 세포 증식을 효율적으로 제어할 수 없게 된다. 이에 따라 주로 배아 줄기세포에 대한 세포의 운명을 제어하기에 적당한 미세환경을 제공하는 다양한 생체재료들이 고안되어 왔다 (J.I. Huang, P.A. Zuk, N.F. Jones, M. Zhu, H.P. Lorenz, M.H. Hedrick, P. Benhaim, Plast Reconstr. Surg. 2004, 113, 585; K.C. Hicok, T.V. Du Laney, Y.S. Zhou, Y.D.C. Halvorsen, D.C. Hitt, L.F. Cooper, J.M. Gimble, Tissue Eng. 2004, 10, 371).

몇몇 수화젤이 줄기세포용 생체모방 배양 플랫폼으로서 채용되어 왔다 (A. J. Putnam, D. J. Mooney, Nature Medicine 1996, 2, 824.; L.G. Griffith, G. Naughton, Science 2002, 295, 1009). 천연 폴리머를 기재로 하고 있는 수화젤은 세포 배양을 위해 적당한 미세환경을 제공할 수 있었지만, 이것들은 물성을 조절 (예를 들면 화학적/기계적 특성을 제어)하기가 곤란하고 잠재적인 면역원성이 있다 (A. M. Kloxin, C. J. Kloxin, C. N. Bowman, K. S. Anseth, Adv Mater. 2010, 22, 3484). 이에 비해서, 합성 수화젤은 용이하게 조작할 수 있어 명확하게 특정되는 재료를 생성할 수 있지만, 세포와의 적당한 상호작용을 제공하는 것에는 한계가 있다 (G. H. Underhill, A. A. Chen, D. R. Albrecht, S. N. Bhatia, Biomaterials 2007, 28, 256).

관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2011-30030호는 헤파린 결합 도메인 (heparin-binding domain, HBD)을 이용한 지방줄기세포의 지방세포로의 분화방법을 개시하고 있으며, 구체적으로는, ADSC에 대한 접착활성을 갖는 HBP가 표면에 고정되어 있는 배양용기; 및 상기 배양용기에 지방줄기세포를 접종하여 지방줄기세포를 배양용기 표면에 접착된 상태로 배양하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 지방세포로의 분화방법을 개시하고 있다. 또한, 티올화된 헤파린 (Hep-SH)과 디아크릴화된 PEG(PEG-DA)를 반응시켜 '조합형' 생체활성 헤파린계 수화젤을 개발하고자 한 논문도 보고된 바 있다 (G. Tae, Y. J. Kim, W. I. Choi, M. Kim, P. S. Stayton,A. S. Hoffman, Biomacromolecules, 2007, 8, 1979; S. S. Shah, M. Kim, K. Cahill-Thompson, G. Tae, A. Revzin, Soft Matter 2011, 7, 3133).

헤파린계 수화젤은 체내 연골 결손의 재생뿐 아니라 (M. Kim, S. E. Kim, S. S. Kang, Y. H. Kim, G. Tae, Biomaterials 2011, 32, 7883), 간세포와 연골세포의 배양에 효과적임이 보고되었다 (M. Kim, J. Y. Lee, C. N. Jones, A. Revzin, G. Tae, Biomaterials 2010 3, 3596; M. Kim, Y. Shin, B. H. Hong, Y. J. Kim, J. S. Chun, G. Tae, Y. H. Kim, Tissue Eng Part C Methods 2010, 16, 1). 또한, 헤파린은 다양한 성장 인자, ECM 단백질 및 세포와 특이적인 친화성이 있는 것으로 알려져 있고 (G. Tae, M. Scatena, P. S. Stayton, A. S. Hoffman, J. Biomater . Sci., Polym . Ed ., 2006, 17, 187; I. Capila, R. J. Linhardt, Angew . Chem ., Int. Ed ., 2002, 41, 391), 몇몇 연구는 헤파린-개질된 표면에 대한 줄기세포의 양호한 세포-부착 친화성을 보고한 바도 있다 (I. S. Park, M. Han, J. W. Rhie, S. H. Kim, Y. Jung, I. H. Kim, S. H. Kim, Biomaterials 2009, 30, 6835; J. W. Bae, J. H. Choi, T. E. Kim, K. D. Park, J. Y. Kim, Y. D. Park, K. Sun, J Bioact Compat Polym . 2009, 24, 493).

이에 반해, 대부분의 수화젤은 전형적으로 생체비활성이어서 우수한 세포-부착성을 갖기 위해서는, 수화젤 성분 함량의 조절, 단백질 또는 세포 부착성 펩티드에 의한 추가 개질 및 표면 경도 조절 등이 필요하다.

따라서, 본 발명은 인간 지방유래줄기세포의 배양에 적합하고, 세포 증식에 우수한 환경을 제공해줄 수 있을 뿐만 아니라, 배양된 줄기세포가 다분화능 (pluripotency)을 그대로 유지하고 있으므로, 줄기세포 증식 및 연구에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있는 헤파린 기반 수화젤을 포함하는 줄기세포 배양기판 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위해서,

헤파린 및 수용성 고분자를 포함하는 줄기세포 배양기판으로서, 상기 헤파린의 함량은 상기 배양기판 총 중량에 대해서 1 중량% 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수용성 고분자는 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 배양기판의 젤 탄성도는 100 Pa 내지 1,000,000 Pa일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 줄기세포는 인간 지방유래줄기세포일 수 있다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위해서,

용매 중에 광개시제, 티올화 헤파린 및 수용성 고분자를 용해시키되, 최종 용액 중 티올화 헤파린의 함량이 1 중량% 내지 40 중량%가 되도록 용해시키는 단계; 및

상기 용액에 광을 조사해 줌으로써 수화젤을 형성하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양기판의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양기판은 줄기세포의 부착과 증식에 최적화된 환경을 제공할 수 있으며, 특히 배양된 줄기세포가 다분화능 (pluripotency)을 그대로 유지하므로, 줄기세포 증식 및 연구에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 접종 3시간 경과 후, WST-1 분석에 의해서 측정한 다양한 표면에 대한 hADSC 부착 정도를 나타내는 그래프이고 (평균 ± 표준편차, n=4; NS는 유의성이 없음을 의미하고, *p< 0.05), 도 1b는 부착된 hADSC의 광학 사진이며 (스케일바: 100 ㎛), 도 1c는 hADSC의 증식 정도를 나타내는 그래프이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
도 2a 및 2b는 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 동일하게 하거나 (2a), 또는 Hep-SH의 양을 고정시켜서 (2b) 광가교에 의해 제조한 헤파린계 수화젤의 젤화 동태를 도시한 그래프 및 도표이고, 도 2c 및 2d는 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 동일하게 하거나 (2c), 또는 Hep-SH의 양을 고정시켜서 (2d) 제조한 헤파린계 수화젤의 팽윤 전후 최종 젤 강도를 도시한 그래프 및 도표이다.
도 3a 및 3b는 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 동일하게 하거나 (3a), 또는 Hep-SH의 양을 동일하게 해서 제조한 헤파린계 수화젤에 접종하고 3시간이 경과한 후, hADSC 부착과 세포 형태를 도시한 그래프 및 사진이고 (평균 ± 표준편차, n=4; NS는 유의성이 없음을 의미하고 **p< 0.001. 스케일바: 100㎛), 도 3c 및 3d는 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 동일하게 하거나 (3c), 또는 Hep-SH의 양을 동일하게 해서 제조한 헤파린계 수화젤 위의 hADSC 증식을 나타낸 그래프이다 (*p< 0.05, **p< 0.001, #p< 0.0001).
도 4는 WST-1 분석에 의해 7일간 측정한 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 위에서 인간 골수 줄기세포 (hBMSC), 인간 골아세포 (MG63)와 인간 신경세포 (PC12)의 증식 정도를 나타낸 그래프이다 (평균 ± 표준편차, n=4).
도 5a는 WST-1 분석에 의해 측정한 항체를 이용한 5.3 중량% 헤파린계 수화젤에 대한 hADSC 부착의 저해시험 결과를 나타낸 그래프이고 (대조군: 항체 없음, 모두: 모든 항체가 있음; 대조군 대비 부착된 세포의 비율: 평균 ± 표준편차, n=4, **p< 0.001, #p<0.0001), 도 5b는 7일에 헤파린계 수화젤 위에서 배양한 hADSC의 인테그린 β1 (적색, 위)과 셀렉틴 (적색, 아래)의 면역형광 염색 결과를 도시한 사진이다 (액틴 염색용 팔로이딘-FITC (녹색)와 핵 염색용 DAPI (청색). 스케일바: 100 ㎛).
도 6은 7일간 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 위에서 배양한 hADSC의 인테그린 β1 (적색)의 면역 형광 염색 결과를 도시한 사진이다 (액틴-검출용 팔로이딘-FITC (녹색)와 핵 염색용 DAPI (청색). 스케일바: 100 ㎛).
도 7은 7일간 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 위에서 배양한 hADSC의 셀렉틴 (적색)의 면역 형광 염색 결과를 도시한 사진이다 (액틴-검출용 팔로이딘-FITC (녹색)와 핵 염색용 DAPI (청색). 스케일바: 100 ㎛).
도 8a는 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 또는 TCP 위에서 배양한 hADSC에 대한 다분화능 표지 유전자 발현의 실시간 RT-PCR 분석 결과를 그래프로 도시한 것이고 (평균 ± 표준편차, n=4, *p<0.05, 유전자 발현은 β-액틴으로 표준화하였다. P#는 hADSC의 계대수 #를 의미한다), 도 8b는 3일과 7일에 헤파린계 수화젤 또는 TCP 위에서 배양한 hADSC 위의 다분화능 표지자 SSEA4 (옥색)의 면역형광 염색 결과를 도시한 사진이며 (핵 염색용 DAPI (청색), 스케일바: 100 ㎛), 도 8c는 7일과 14일에 헤파린계 수화젤 위에서 지방세포 분화 유도 조건에서 hADSC의 지방세포 분화 결과를 도시한 사진이다 (Oil Red-O로 염색함. 스케일바: 100 ㎛).
도 9는 실시간 RT-PCR에 의해 분석한 7일간 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 위에서 배양한 hBMSC에 대한 다분화능 표지 유전자 (Oct4 , Sox2 , Nanog)의 발현 정도를 그래프로 도시한 것이다 (평균 ± 표준편차, n=4, 유전자 발현은 하우스 키핑 유전자인 β-액틴으로 표준화하였다. P#은 hBMSC의 계대수를 의미한다).
도 10은 7일과 14일간 지방세포 분화 유도 조건에서 5.3 중량% 헤파린계 수화젤 위에서 Oil Red-O에 의해 염색한 hBMSC의 지방세포 분화 정도를 관찰한 사진이다 (스케일바: 100 ㎛).

이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 헤파린 및 수용성 고분자를 포함하는 줄기세포 배양기판으로서, 상기 헤파린의 함량은 상기 배양기판 총 중량에 대해서 1 중량% 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판을 제공한다.

본 발명에서는, 헤파린 기반 수화젤의 헤파린 부분과 줄기세포의 직접적인 상호관계로 인해서, 본 발명에 따른 배양기판이 줄기세포 배양기판으로서 우수한 배양 기질이 될 수 있다는 가설 하에 본 발명을 완성하게 되었다. 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 헤파린 기반 수화젤 위에서 헤파린 부분과 줄기세포 사이의 상호작용이 강력하다는 것과 헤파린 부분에 의해 매개되는 세포의 증식이 양호하다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명에서는 특정 분화 배지에 의해 헤파린 기반 수화젤 위에서 줄기세포의 분화가 유도될 뿐 아니라, 일반 배양 조건에서는 줄기세포의 다분화능이 유지된다는 것을 확인하였다.

특히, 본 발명에서는, 줄기세포의 우수한 부착과 증식을 위해서는, 젤 탄성 및 수화젤 내 헤파린 함량이 중요한 영향을 미친다는 사실을 발견하였다. 본 발명에서는 다양한 범위의 헤파린 함량에 대해서 줄기세포 증식능 및 다분화능을 테스트하였으며, 그 결과 헤파린의 함량이 배양기판 총 중량에 대해서 1 중량% 내지 40 중량%, 바람직하게는 3 중량% 내지 4 중량%인 경우에 이러한 효과가 가장 우수함을 알아내었다.

또한, 본 발명에 따른 배양기판의 주된 2가지 성분은 수용성 고분자 및 헤파린으로서, 상기 수용성 고분자는 헤파린과 결합하여 배양기판을 형성할 수 있는 고분자 물질이라면 제한없이 사용될 수 있지만, 예를 들어 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 물질이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서 배양기판의 중요한 패러미터 중 다른 하나인 배양기판의 탄성은 수화젤 형성을 위한 전구체의 전체 농도 변화 또는 전구체 성분들 사이의 상대적 함량 변화에 의해서 용이하게 조절될 수 있는데, 상기 배양기판의 젤 탄성도는 100 Pa 내지 1,000,000 Pa인 경우, 바람직하게는 400 Pa 내지 500 Pa인 경우 가장 우수한 성능의 배양기판을 제조할 수 있었다. 배양기판의 젤 탄성도가 100 Pa 미만인 경우에는 수화젤의 안정성이 떨어진다는 문제점이 있으며, 1,000,000 Pa를 초과하는 경우에는 헤파린 및 수용성 고분자의 용해성에 문제점이 있다.

본 발명에 따른 줄기세포 배양기판은 다양한 유형의 줄기세포 배양에 사용될 수 있으며, 특히 성체 줄기세포, 그 중에서도 인간 지방유래줄기세포의 배양에 사용되는 경우, 우수한 증식능 및 다분화능을 보유한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포 배양기판의 제조방법을 제공하며, 본 발명에 따른 제조방법은, 용매 중에 광개시제, 티올화 헤파린 및 수용성 고분자를 용해시키되, 최종 용액 중 티올화 헤파린의 함량이 1 중량% 내지 40 중량%가 되도록 용해시키는 단계; 및 상기 용액에 광을 조사해 줌으로써 수화젤을 형성하는 단계를 포함한다.

전술한 바와 같이, 상기 수용성 고분자는 헤파린과 결합하여 배양기판을 형성할 수 있는 고분자 물질로서, 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있으며, 배지의 젤 탄성도 및 배양가능한 줄기세포의 종류는 전술한 바와 같다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 될 것이다.

본 발명에 따른 수화젤의 제조

Hep-SH와 PEG-DA를 이용한 티올-아크릴레이트 광중합에 의해 헤파린 기반 수화젤을 제조하였다. 구체적으로, 70 v/v% 에탄올 중에 광개시제로서 Irgacure 2959를 0.1 w/v% 함유하는 PBS에 40% Hep-SH와 6 kDa PEG-DA를 용해시킨 다음, 365 nm, 18 W/cm² UV광에 10초간 노출시켰다.

대조군 수화젤의 제조

대조군으로서 TCP, PEG 수화젤, 알기네이트 수화젤 및 I형 콜라겐 또는 피브로넥틴으로 개질시킨 헤파린 수화젤을 사용하였다. PEG 수화젤은 4관능성 폴리(에틸렌 글리콜) 설프히드릴(PEG-SH4, 10 kDa)과 3.4 kDa PEG-DA(티올기와 아크릴레이트기의 몰비 1:1)를 이용하여 헤파린 기반 수화젤과 비슷한 망상 상태를 가져 기계적 특성이 유사하도록 제조하였다. 알기네이트 수화젤은 0.15 M NaCl, 0.025 M HEPES와 0.1M CaCl₂를 함유한 1.2% 알기네이트 용액에서 제조하였다. 헤파린 기반 수화젤은 0.1 mg/mL의 I형 콜라겐(sigma-Aldrich, MO, USA) 또는 피브로넥틴(Invitrogen, CA, USA) 용액과 37℃에서 12시간 배양함으로써 개질시켰다.

인간지방유래줄기세포의 배양

인간 hADSC (Invitrogen, CA, USA)를 10%(v/v) FBS와 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 37℃의 DMEM에서 표준 세포 배양 조건으로 배양하였다. 4 계대의 세포를 2 x 10⁴ 세포/cm²의 양으로 수화젤에 접종하고 7일간 세포 배양기판에서 배양하였다. 수화젤 위의 세포수를 WST-1 분석을 이용하여 대사 활성에 의해 평가하였다 (Roche Ltd, Basel, Switzerland).

수용체 차단에 의한 세포 부착 억제

hADSC 상의 인테그린 β 또는 셀렉틴 수용체를 차단함으로써 저해 시험을 수행하였다. 50 ㎍/mL의 항-인테그린 β1, β2, β3 또는 셀렉틴 항체 (Abcam Inc., MA, USA)를 수화젤에 접종하기 전에 37℃에서 30분간 세포와 함께 전배양하였다. 양성 대조군으로서 미처리 hADSC를 수화젤에 접종하였다.

인테그린 β와 셀렉틴 수용체의 면역형광 염색

세포를 10% 포르말린에 고정하고 0.25% 트리톤 X-100 용액에서 투과처리한 후, 1% BSA로 차단하였다. 이어서 시료를 항인테그린 β1, β2, β3 또는 셀렉틴 일차 항체 (1:100) (Abcam Inc.)와 배양하고 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 IgG-H&L (Texas Red 또는 FITC) (1:200) (Abcam Inc.)과 배양하였다. 다음, 부착된 세포를 액틴-검출용 팔로이딘-FITC (sigma-Aldrich, MO, USA)로 염색하고 세포핵용 DAPI (Invitrogen)로 대조 염색하였다. 염색된 세포를 형광현미경을 이용하여 촬영하였다 (TE2000-U, Nikon Co, Tokyo, Japan).

실시간 RT - PCR 과 면역형광 염색에 의한 다분화능 분석

다분화능 표지 유전자 (Oct4 , Sox2, Nanog)의 발현을 실시간 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 총 RNA는 규정 지침을 이용하여 분석하였으며 (S. P. Massia, J. A. Hubbell, J Biomed Mater Res 1991, 25, 223), 프라이머의 서열을 하기 표 1에 요약하였다.

항-SSEA4 일차 항체 (1:100) (Santa Cruz, CA, USA)와 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 IgG-H&L (Texas Red) (1:200)과 배양하여 일차 다분화능 표지자인 배아 발생단계 특이적 항원-4 (SSEA4)의 면역형광 염색을 실시하였다.

지방세포 분화

유도를 위해 지방세포 분화 유도 배지 (Invitrogen)를 이용하였다. 7 또는 14일 후에 지질 소적의 검출을 위해 Oil Red-O(sigma)로 염색하여 지방세포 분화를 분석하였다.

헤파린 기반 수화젤의 특성분석

헤파린 기반 수화젤의 탄성률을 37℃로 설정된 온도제어기와 용매 트랩을 구비한 유량계 (Gemini, Malvern Instruments, UK, USA)를 이용하여 측정하였다. 시료를 샌드블라스트 평행판 구조 (sandblast parallel plate geometry)를 이용하여 분석하였다. 각 진동수 ω = 1 rad/s와 변형률 γ = 0.1%를 선택하여 진동 변형의 선형 영역을 확보하였다. 시료 홀더 내에서 젤화시킨 후에 팽윤되지 않은 젤의 탄성률을 측정하였다. 팽윤된 젤의 경우에는 미리 형성한 젤을 PBS 중에서 2일간 37℃에서 팽윤시키고 시료 홀더 구조에 맞게 절단하여 측정하였다.

상기 수화젤의 팽윤비는 20 mL PBS (pH 7.4)를 함유하는 50 mL 튜브에 침지시키고 37℃의 배양기에 2일간 방치하여 측정하였다. 완전히 팽윤된 수화젤은 습윤 박엽지로 말아서 과량의 물을 제거한 직후에 무게를 측정하였다 (Ws). 다음, 상기 수화젤을 동결건조하고 무게를 측정하였다 (Wd). 팽윤비는 Ws/Wd에 의해 계산하였다 (n = 4).

헤파린 기반 수화젤 내 티올화된 헤파린 함량 측

수화젤 내 티올화된 헤파린 양은 디메틸메틸렌 블루 (DMMB) 이염색성 분석법 (Sigma)을 이용하여 평가하였다 (T. Keler, A. Nowotny, Anal Biochem 1986, 156, 189). 간단히, 상기 착색 시약은 3.04 g의 글리신, 2.37 g의 NaCl과 95 mL의 0.1 mol/l HCl을 함유하는 용액 (1000 mL, pH 3.0)에 16 mg의 DMMB를 용해시켜 제조하였다. 5 mM Na₂EDTA와 5 mM 시스테인-HCl을 함유한 0.1M 인산나트륨 (pH 6.2) 중에 500 ㎍/mL 파파인을 함유한 분해 용액에 각종 헤파린 기반 수화젤을 침지시켰다. 분해를 위해 밤새 60℃에서 배양한 후, 15분간 13,000 g에서 원심 분리하였다. 상청액을 모아 -20℃에서 DMMB 분석을 실시할 때까지 보관하였다. 525 nm에서 흡광도를 측정하고 0-50 ㎍/mL 범위에서 샤크 인티미트 (shark intimate) 헤파린의 표준 그래프 곡선과 비교함으로써 티올화된 헤파린의 총량을 측정하였다.

헤파린 기반 수화젤 위에서 각종 형태의 세포 증식

인간 골수 줄기세포 (hBMSC) (Lonza, MD, USA), 인간 골아세포 (MG63) (한국세포주은행, 서울, 대한민국)와 인간 신경세포 (PC12) (ATCC, VA, USA)를 헤파린 기반 수화젤 위에서 배양하고 세포증식시약 (Cell Proliferation Reagent) WST-1 분석 (Roche Ltd, Basel, Switzerland)으로 세포 대사활성을 측정함으로써 특성 분석하였다. 각 측정점에서 WST-1을 1시간 동안 첨가하고 생존 세포의 총수에 직접 비례하는 생성 포르마잔의 450 nm 비색 흡광도를 멀티웰 분광광도계 (FL600, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 세포를 함유하지 않는 수화젤을 대조군으로 이용하였다.

통계분석

Student's t-test에 의해 데이터를 통계적으로 평가하였다. 최소 유의수준은 p < 0.05로 설정되었다.

결과 분석

다양한 표면에 대한 hADSC의 부착성 분석 결과 (도 1a 내지 1c 참조), 세포 접종 3시간에는 PEG 또는 알기네이트 수화젤 보다는 헤파린 기반 수화젤 위에서 더 많은 hADSC가 발견되었는데, 이는 hADSC가 헤파린 친화성을 통해 헤파린 기반 수화젤에 선택적이면서 빠르게 부착한다는 것을 나타낸다 (도 1a 및 1b 참조). 추가 개질하지 않은 순수한 헤파린 기반 수화젤 (5.3 중량%)에 대한 세포 부착 정도와 형태는 단백질 코팅한 수화젤 뿐 아니라 TCP에 대한 세포 부착 정도와 형태와 유사하면서 비견할 만하였다.

다양한 표면에 부착한 세포의 증식성을 7일간 분석한 결과, 세포 부착 결과로부터 기대되는 바대로, TCP와 단백질-흡착된 수화젤과 유사하게 헤파린 기반 수화젤 (5.3중량%) 위에서도 세포의 증식이 현저하게 증가하는 것이 관찰되었다. 반면에, PEG 또는 알기네이트 수화젤 위에서 세포는 제대로 증식하지 않았다 (도 1c 참조). 이들 결과로부터 헤파린 기반 수화젤은 hADSC를 배양하기에 적합한 좋은 세포 부착성 표면을 제공할 뿐 아니라, 줄기세포의 증식이 유도된다는 것이 명백하게 입증되었다.

다음, 본 발명에서는, hADSC 부착과 증식을 위한 헤파린 기반 수화젤의 중요 파라미터, 즉 (i) 젤 탄성과 (ii) 수화젤 내 헤파린 양을 조사하였다. 기질의 탄성은 세포 운명을 조절하는 중요한 역할을 하는 것 중 하나이다. 헤파린 기반 수화젤의 탄성은 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 동일한 몰비에서 전구체의 전체 농도를 변화시키거나, 또는 PEG-DA가 과량이어도 광중합에 의해 젤 형성을 위한 효율적인 가교가 이루어질 수 있었기 때문에 헤파린의 양을 고정시키고 PEG-DA의 양을 조정함으로써 단순하게 제어할 수 있었다. 이에 따라, 본 발명에서는 100 내지 1000,000 Pa에 이르는 가변적인 탄성을 갖는 헤파린 기반 수화젤을 얻을 수 있었다 (도 2a 내지 2d 참조). 팽윤비 또한 젤 탄성에 따라 규칙적으로 변화하였다 (하기 표 2 및 표 3 참조).

더욱 중요한 것은 가변적인 탄성을 갖는 수화젤 내 헤파린의 양은 Hep-SH와 PEG-DA 사이의 동일한 몰비에서 전체 고분자 농도를 변화시킴으로써 달라지거나 (상기 표 2 참조), 헤파린 양을 고정하고 PEG-DA 양을 변화시킨 경우 헤파린 양이 일정하게 유지되었기 때문에 (상기 표 3 참조), 헤파린 양과 관계없는 젤 탄성의 효과를 분석할 수 있었다.

Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 고정시키고 젤 전구체의 농도를 증가시킨 경우에 (도 3a 참조), hADSC의 초기 부착도는 젤 전구체의 농도 (따라서, 젤 탄성)와 관계없이 비슷하였다. 헤파린 양이 고정된 경우에 (도 3b 참조), hADSC 부착도는 젤 탄성이 증가함에 따라 분명하게 감소하였는데, 이는 상대적으로 약한 강도의 젤 기판이 상대적으로 강한 강도의 젤 기판에 비해 hADSC 부착용으로 상당히 좋다는 것을 의미한다. 400 Pa 정도의 비슷한 탄성을 가진 약한 수화젤의 경우에서도, 상대적으로 헤파린의 양이 적은 (10 mg/ml) 수화젤 (도 3a에서 3 중량%)보다도 상대적으로 헤파린의 양이 많은 (33.3 mg/ml) 수화젤 (도 3b에서 5.3 중량%)로부터 세포 부착이 훨씬 높다는 것이 관찰되었다. 더 나아가 젤 탄성과 헤파린 양의 동일한 효과가 hADSC 증식에 대해서도 관찰되었다 (도 3c 및 3d 참조).

이들 결과를 통해 분명하게 알 수 있었던 것은 헤파린계 수화젤 위에서 hADSC의 부착과 증식은 젤 탄성 (음의 관계) 뿐만 아니라, 헤파린 양 (양의 관계)에 의해서도 크게 영향을 받는다는 것이다. Hep-SH와 PEG-DA 사이의 몰비를 고정시키는 경우에 다른 탄성을 갖는 젤 기판으로의 hADSC 부착 결과 (도 3a)는 젤 탄성 증가에 따른 음의 영향과 전체 농도 증가로 인해 헤파린 양의 증가에 따른 양의 영향이 복합적인 기여에 기인한 것임에 알 수 있다.

본 발명에 따른 헤파린 기반 수화겔 위에서 그 밖의 다른 종류의 세포의 부착과 증식에 대한 추가 연구를 통해, 인간 골수 줄기세포 (hBMSC)도 hADSC와 유사하게 헤파린기반 수화젤 위에서 높은 부착과 증식을 확인할 수 있었다 (도 4). 이에 비해서, 골아세포 (MG63)와 신경세포 (PC12)는 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤 위에 낮은 부착과 증식률이 확인되었다. 따라서, 세포의 부착과 증식은 어떠한 추가 개질 없이 헤파린 기반 수화젤 자체에서 모든 종류의 세포에 대해서가 아닌 간엽 줄기세포에 대해서 선택적으로 유효하였다.

헤파린 기반 수화젤과 hADSC 사이의 분자 수준의 상호작용에 대한 단서를 찾기 위해서 헤파린 친화성을 갖는 세포 부착 리간드를 조사하였다. 인테그린과 셀렉틴은 세포 표면에서 헤파린 설페이트 (설페이트화된 GAG)에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 보고되어 있는 바대로 항-인테그린 β1, β2, β3 또는 셀렉틴 항체를 가진 세포 표면 수용체를 차단하는 것을 이용하는 경쟁 부착 저해 시험에 의해 헤파린 기반 수화젤과 hADSC 사이의 상호작용을 분석하였다.

그 결과, 인테그린 β1이나 셀렉틴 수용체 중 어느 하나를 차단하면 수화젤에 대한 hADSC 결합의 80%가 억제된 반면에 인테그린 β2나 β3 수용체 중 어느 하나를 차단하면 40% 정도 억제되는 것으로 나타났다. 이들 모든 수용체를 차단하였을 때에는 hADSC 결합을 거의 완전하게 억제하는 것으로 관찰되었다 (도 5a). hADSC 상의 인테그린 β1 또는 셀렉틴 수용체에 대해 면역형광 염색을 실시하여 헤파린 기반 수화젤 위에 배양된 hADSC에 이들 수용체가 존재함을 확인하였다 (도 5b). 인테그린 β1 (적색) 또는 셀렉틴 (적색)의 존재를 의미하는 양성 염색된 사진을 세포 부착 매개체인 F-액틴 (녹색)과 공-편재화하였다. 수화젤 위에서 hADSC의 인테그린 β1과 셀렉틴의 발현 수준은 배양 중에 지속적으로 증가하였다 (도 6 및 도 7). 이에 비해서, hADSC를 TCP 위에서 배양할 때에는 셀렉틴 수용체의 발현은 관찰되어지지 않는데 (도 7), 이는 hADSC의 헤파린 기반 수화젤에 대한 친화적인 셀렉틴-헤파린에 의해 매개되는 특이적 상호작용을 시사하는 것이다.

통상적으로, 줄기세포는 일반 배양방법인 TCP 위에서 다분화능이 손실되지 쉽다. 따라서, 줄기세포의 전분화능 유지할 수 있는 적합한 기질이 필요하다. 본 발명에서는, Oct4, Sox2와 Nanog와 같은 다분화능 표지 유전자의 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다 (도 8a). 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤 상에서 hADSC의 Sox2와 Nanog의 발현 수준은 3일에서 7일로 증가하는 것으로 밝혀졌고 Oct4는 배양 중에 비슷하게 유지되었다. 한편, 이들 유전자의 발현이 TCP 상 배양 중에는 감소됨이 관찰되었다. 더 나아가, 또 다른 전분화능 표지자인 SSEA4의 면역 형광 염색한 결과, 3일과 7일에 헤파린 기반 수화젤 위에서 hADSC (청색: DAPI 염색)를 둘러싸는 뚜렷한 염색 (녹색)을 나타낸 반면에, TCP 상에서 SSEA4의 염색은 3일에서 7일로 가면서 현저하게 감소됨을 확인하였다 (도 8b). 배양 중 헤파린 기반 수화젤 위에서 hBMSC의 전분화능 역시 확인하였다 (도 9). 이들 결과로부터, 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤은 TCP 배양에 의해 쉽게 손실되는 간엽 줄기세포의 전분화능을 잘 유지할 수 있는 적합한 환경을 효율적으로 제공함을 확인할 수 있었다.

마지막으로, 본 발명에서는 지방세포 분화 유도 조건에서 헤파린 기반 수화젤 위에서의 hADSC의 분화능을 특성 분석하였다. 오일 레드-O 염색에 의해 확인한 hADSC의 지질 축적도는 TCP보다 헤파린 기반 수화젤 위에서 분명하게 더 높았고 7일에서 14일로 증가하였다 (도 8c). 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤 위에서 BMSC의 지방세포 분화도 유사하게 관찰되었다 (도 10). 이러한 효율적인 지방세포로의 분화는 TCP의 딱딱한 기질보다 지방세포로의 분화에 더 적합한 강도 (~400 Pa)의 수화젤 미세환경과 더불어, 헤파린이 지방세포로의 분화를 유도한다는 사전 연구와도 관련된 것일 수 있다. 결론적으로, 적절한 배지 조건에서 TCP 보다는 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤 위에서 간엽 줄기세포가 훨씬 효율적으로 분화되는 것이 관찰되었다.

요약하면, 세포 부착의 분석 결과, 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤은 젤 내의 헤파린 부분을 통해 hADSC 부착을 위한 우수한 기질을 제공하였음을 알 수 있었다. 헤파린 기반 수화젤 위에서 hADSC의 부착과 증식은 헤파린 양 (양의 관계)과 젤 탄성 (음의 관계) 모두에 의해 크게 영향을 받았다. hADSC의 부착과 증식 측면에서 최적화된 헤파린 기반 수화젤은 TCP에 비견할 만하였다. 그러나, 다분화능과 특이적 분화 유지 측면에서는 헤파린 기반 수화젤이 TCP에 비해 훨씬 우수하였다. 본 발명에 따른 헤파린 기반 수화젤은 줄기세포의 특이적 분화를 위해 필수적인 성장인자를 수화겔 내로 봉입하여 서방출을 유도할 수 있고, 기계적 물성을 쉽게 조절할 수 있다는 점에서, 줄기세포의 배양 및 다양한 세포로의 분화와 응용을 위해 더없이 좋은 배양 기판을 제공할 수 있다.

Claims

헤파린 및 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 줄기세포 배양기판으로서, 상기 배양기판 중 상기 헤파린 및 상기 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜의 중량 합은 상기 배양기판 총 중량 대비 5.3 내지 6.7 중량%이고, 상기 배양기판의 젤 탄성도는 10 Pa 내지 500 Pa이며, 상기 헤파린 1몰에 대해서 상기 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜이 0.1 내지 0.5몰인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판.
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제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 지방유래줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판.
용매 중에 광개시제, 티올화 헤파린 및 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜을 용해시키되, 최종 용액 중 상기 티올화 헤파린 및 상기 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜의 중량 합이 상기 최종 용액 총 중량 대비 5.3 내지 6.7 중량%가 되고, 상기 티올화 헤파린 1몰에 대해서 상기 디아크릴화 폴리에틸렌글리콜이 0.1 내지 0.5몰이 되도록 용해시키는 단계; 및
상기 용액에 광을 조사해 줌으로써 젤 탄성도 10 Pa 내지 500 Pa의 수화젤을 형성하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양기판의 제조방법.
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제5항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 지방유래줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양기판의 제조방법.