KR101662790B1 - 표면 탄성 조절된 배양 용기 및 그를 사용한 역분화줄기세포 생산 효율 증가 방법 - Google Patents

Abstract

표면 탄성 조절된 배양 용기 및 그를 사용한 역분화줄기세포 생산 효율 증가 방법에 관한 것으로, 표면 탄성 조절된 배양 용기를 사용하여 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 E-카드헤린의 발현에 의한 MEF의 유도가 유도됨으로써, 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

Description

표면 탄성 조절된 배양 용기 및 그를 사용한 역분화줄기세포 생산 효율 증가 방법{Elasticity-controlled cell culture plate and method for enhancing efficient production of induced pluripotent stem cells using the same}

표면 탄성 조절된 배양 용기 및 그를 사용한 역분화줄기세포 생산 효율 증가 방법에 관한 것이다.

야마나카에 의해 처음으로 제작된 역분화줄기세포는 배아줄기세포가 가지고 있는 윤리적 및 면역학적 단점을 극복할 수 있다는 장점을 가지고 있어, 2006년 이후 역분화줄기세포 생산을 위한 연구들이 기하급수적으로 증가하였다. 하지만 이러한 역분화줄기세포 생산은 그 제작 효율이 극히 낮다는 단점이 존재한다.

역분화 줄기세포 생산 효율을 증가시키고 향후 임상에 적용하기 위해 현재 다양한 바이러스, 케미칼, 사이토카인 등을 이용하여 역분화 줄기세포를 생산 효율을 증가시키려는 연구가 시도되었다. 예를 들면, 센다이 바이러스를 이용하여 숙주 염색체에 인테그레이션되지 않도록 하거나 (Fusaki et al, 2009) 혹은 융합 단백질 형질도입이나 mRNA를 이용하는 연구(Zhou et al, 2009; Warren et al, 2010)가 있다. 그러나 이러한 시도들은 생물학적으로 유전자를 조절하거나 화학적으로 배양 배지 성분을 조절하는 데에 그쳤다.

물리적인 성질을 조절하여 역분화줄기세포 생산에 적용한 연구는 나노구조를 역분화줄기세포 생산에 적용한 연구(Downing et al, 2013) 외에는 없으며, 따라서, 배양 용기의 물리적인 성질을 조절함으로써 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시키는 것에 대한 요구가 존재한다.

일 양상은 탄성계수 0.05 kPa 내지 0.7 kPa를 갖는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 표면에 코팅된, 역분화줄기세포 생산용 배양 용기를 제공하는 것이다.

다른 양상은 분리된 체세포에 역분화줄기세포 유도 인자를 도입하는 단계; 및 상기 배양 용기에 상기 역분화줄기세포 유도 인자가 도입된 체세포를 배양하는 단계를 포함하는 역분화줄기세포 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 탄성계수 0.05 kPa 내지 0.7 kPa를 갖는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 표면에 코팅된, 역분화줄기세포 생산용 배양 용기를 제공한다.

용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 망상구조물을 의미할 수 있다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것일 수 있다.

용어 "폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)(PAM)"는 아크릴아마이드 단량체로 형성된 폴리머(-CH₂CHCONH₂-)를 의미할 수 있다. 상기 폴리아크릴아마이드 하이드로겔은 아크릴아마이드 및 비스(bis)-아크릴아마이드가 가교 결합되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 내에, 상기 아크릴아마이드는 1.5 내지 3.5 중량부, 2 내지 3.5 중량부, 2.5 내지 3.5 중량부, 2.7 내지 3.2 중량부, 또는 3.0 중량부 일 수 있다. 또한, 상기 비스-아크릴아마이드는 0.05 내지 0.15 중량부, 0.05 내지 0.12 중량부, 0.07 내지 0.12 중량부, 또는 0.1 중량부로 포함될 수 있다.

하이드로겔의 제조 방법은 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 이온 가교(ionic cross-linking), 공유 가교(covalent cross-linking), 광 가교(photo cross-linking) 또는 세포 가교(cell cross-linking)로 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 제조할 수 있다. 이온 가교는 고분자 수용액과 2가 양이온 수용액의 혼합으로 생성될 수 있다. 2가 양이온은 예를 들면, Ca²⁺일 수 있고, 염화칼슘, 황산칼슘, 또는 탄산칼슘 등을 포함할 수 있다. 공유 결합을 이용한 가교는 이온 결합을 이용한 가교보다 높은 물성을 가진 하이드로겔을 형성할 수 있다. 예를 들면 다양한 분자량의 PEG-디아민을 가교제로 사용할 수 있다. 광 가교는 in situ로 겔을 형성할 수 있는 방법으로 특정 파장의 자외선에 노출시켜 하이드로겔을 제조할 수 있다. 세포 가교는 세포 자체가 가교제 역할을 하는 가교법으로, 예를 들면 RGD(arginine-glycine-aspartic acid) 펩티드를 고분자 주사슬에 도입하여 특이적인 상호작용을 유발시킴으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다.

상기 줄기세포는 생체를 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장 가능한 일종의 모세포 또는 전능세포를 의미하며, 배아줄기세포 및 성체줄기세포를 포함할 수 있다.

배양 용기 표면에 체세포의 결합 활성을 증가시키기 위해 상기 배양 용기 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면, 또는 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다. 상기 고분자로는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1 종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명에 적합한 배양 용기는 배양 용기의 표면에 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 젤라틴(gelatin), 엘라스틴(elastin), 오스티오칼신(osteocalcin), 피브리노겐(fibrinogen), 피브로모듈린(fibromodulin), 테나신(tenascin), 라미닌(laminin), 오스티오폰틴(osteopontin), 오스티오넥틴(osteonectin), 퍼레칸(perlecan), 베르시칸(versican), 본 윌리브랜드 팩터(von Willebrand factor), 피브린(fibrin) 및 비트로넥틴(vitronectin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 고정화되어 있는 것일 수 있다.

상기 하이드로겔의 탄성 계수(elasticity modulus) 또는 저장 계수(storage modulus)는 0.05 kPa 내지 0.7 kPa 일 수 있으며, 0.05 kPa 내지 0.5 kPa, 0.05 kPa 내지 0.3 kPa, 또는 0.05 kPa 내지 0.2 kPa 일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 범위의 탄성 계수를 갖는 배양 표면에서 체세포가 배양되었을 시에, E-카드헤린의 발현이 증가하고, MET(mesenchymal-epithelial transition)(MET)가 유발됨으로써, 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

다른 양상은 분리된 체세포에 역분화줄기세포 유도 인자를 도입하는 단계; 및 탄성계수 0.05 kPa 내지 0.7 kPa를 갖는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 표면에 코팅된 배양 용기에 상기 역분화줄기세포 유도 인자가 도입된 체세포를 배양하는 단계를 포함하는 역분화줄기세포 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

배양 용기에 관하여는 상기한 바와 같다.

세포에서 언급된 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 내의 환경과는 다른 환경에 존재하는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포는 자연적으로 다세포 기관에서 발생하고, 상기 세포가 다세포 기관으로부터 제거되었다면 세포는 "분리된" 것이다.

용어 "체세포"는 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미할 수 있다. 상기 체세포는 포유류의 신경, 근육, 피부, 모발, 지방을 구성하는 체세포일 수 있고, 예를 들면, 섬유아세포일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 분리된 체세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 및 토끼 등의 다양한 동물로부터 유래한 세포일 수 있으며, 일 구체예에 따른 방법에 의해 역분화줄기세포로 역분화시킬 수 있는 분리된 체세포가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "역분화(de-differentiation)"란 분화능이 없는 세포 또는 일정부분 분화능이 있는 세포 등 서로 다른 양태로 존재하는 분화돤 세포로부터 최종적으로 새로운 유형의 분화잠재력을 갖는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 이러한 세포의 역분화 또는 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학(뉴클레오타이드 서열에서의 변화 없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 상기 '역분화'란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함될 수 있고, 예를 들면, 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "역분화줄기세포 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)"는 재프로그램 인자 또는 역분화줄기세포 유도 인자의 발현 또는 발현 유도에 의해 체세포를 재프로그램하여 생성된 유도 다능성 줄기 세포(iPS 세포)를 포함한다. 역분화줄기세포는 태아, 출생후(postnatal), 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 역분화줄기세포는 RPE 세포 또는 다른 세포 타입으로의 분화가 시작되기 전에 새로이 생성될 수 있다(당업계 공지 방법에 의해). 역분화줄기세포는 조직-매칭된 RPE 세포를 생성할 목적으로 특정 환자 또는 매칭된 공여자로부터 온 물질을 사용하여 특이적으로 생성될 수 있다. 역분화줄기세포는 의도된 수여자에서 실질적으로 면역원성이 아닌 세포, 예를 들면 자가세포 또는 의도된 수여자에 세포 조직적합한 세포에서 제조된 세포에서 제조될 수 있다. 추가적 예시로서, 역분화줄기세포는 체세포 또는 다른 세포를 하나 이상의 재프로그램 인자로 세포를 접촉하여 재프로그램함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 재프로그램 인자는 세포에 의해, 예를 들면, 세포에 부가된 외인성 핵산으로부터, 또는 소분자, microRNA, 등 그 유전자 발현을 촉진 또는 유도하는 인자에 반응하는 내인성 유전자로부터 발현될 수 있다(Suh and Blelloch, Development 138, 1653-1661 (2011); Miyosh et al., Cell Stem Cell (2011), doi:10.1016/j.stem.2011.05.001; Sancho-Martinez et al., Journal of Molecular Cell Biology (2011) 1-3; Anokye-Danso et al., Cell Stem Cell 8, 376-388, April 8, 2011; Orkin and Hochedlinger, Cell 145, 835-850, June 10, 2011 참조) 재프로그램 인자는 외인성 공급원, 예를 들면, 배양 배지에 추가하고 세포 내로 당업계에 알려진 방법 예컨대 세포 도입 펩타이드, 단백질 또는 핵산 트랜스팩션제, 리포펙틴과의 커플링, 전기천공, 유전자총, 마이크로주입법 등에 의해 도입됨으로써 제공될 수 있다. 체세포를 역분화줄기세포로 재프로그램 또는 유도하는데 사용되는 인자들은 예를 들면, Oct4(Oct 3/4로도 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함한다. 또한, 체세포를 역분화줄기세포로 재프로그램 또는 유도하는데 사용되는 인자들은 예를 들면, Oct-4, Sox2, Nanog, 및 Lin28로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함한다. 체세포는 적어도 두 개의 재프로그램 인자, 적어도 세 개의 재프로그램 인자, 또는 네 개의 재프로그램 인자를 발현시킴으로써 재프로그램될 수 있다. 특정 역분화줄기세포주는 그 발현 프로파일이 다양할 수 있으나, 역분화줄기세포는 통상적으로 배아 줄기 세포와 동일한 마커의 발현에 의해 동정할 수 있다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 재프로그램 인자를 발현함으로써 재프로그램된다. 재프로그램 인자는 Oct 3/4, Sox2, NANOG, Lin28, c-Myc 및 Klf4로부터 선택될 수 있다. 재프로그램 인자의 발현은 재프로그램 인자의 발현을 유도하는 소 유기분자물질과 같은 적어도 하나의 물질과 체세포를 접촉함으로써 유도될 수 있다.

체세포는 또한 재프로그램인자가 발현되고(예, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여) 재프로그램인자의 발현이 유도되는(예를 들면 소 유기분자를 사용하여) 조합적 시도를 사용하여 재프로그램될 수 있다. 예를 들면, 재프로그램 인자는 체세포에서 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 발현될 수 있다. 또한, 재프로그램 인자는 체세포에서 에피소말 플라스미드와 같은 비-통합적 벡터를 사용하여 발현될 수 있다(Yu et al., Science. 2009 May 8;324(5928):797-801 참조). 재프로그램 인자가 비-통합적 벡터를 사용하여 발현될 때, 인자는 전기천공, 형질감염 또는 벡터로의 체세포 형질전환을 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 마우스 또는 인간 세포에서 통합적 바이러스 벡터를 사용한 네 개의 인자(Oct3/4, Sox2, c myc, 및 Klf4)들의 발현은 체세포를 재프로그램하는데 사용될 수 있다.

일단 재프로그램 인자가 세포내에서 발현되면, 세포는 배양될 수 있다. 시간이 경과되면서 배아줄기세포 특성을 지닌 세포가 배양 접시에 출현한다. 세포는 예를 들면, 배아줄기세포 형태에 기초하여 또는 선택 및 검출가능한 마커의 발현에 기초하여 선택 및 계대배양될수 있다. 역분화줄기세포는 예를 들면, Oct-4, 알칼리 포스파타제, SSEA 3 표면 항원, SSEA 4 표면 항원, TRA 1 60, 및/또는 TRA 1 81를 발현할 수 있다.

역분화줄기세포의 다능성을 확인하기 위해, 세포는 하나 이상의 다능성 어세이에서 검사될 수 있다. 예를 들면, 세포는 배아줄기세포 마커의 발현에 대해 검사될 수 있다; 세포는 SCID 마우스에 이식시 기형종을 제조할 수 있는 능력에 대해 평가될 수 있으며; 모든 세 배엽의 세포 타입을 생성하도록 분화하는 능력에 대해 평가될 수 있다.

역분화줄기세포의 회수 방법은 역분화줄기세포의 일반적인 이차배양법에서 이용가능한 공지된 효소 분해를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 역분화 줄기세포를 배양하는 배양 용기의 배지를 제거하고, PBS로 세척하여, 적당한 단백질분해 효소를 포함하는 용액(예, 트립신이나 디스파아제 등의 단백질분해 효소를 포함하는 용액)을 첨가하고, 37℃에서 적정 시간 배양한 후, 상기의 역분화줄기세포 배양용 배지 등의 적정 용액에 현탁하여, 단일 세포 상태로 만들 수 있다. 또한, 효소를 이용하지 않는 방법도 사용할 수 있으며, 예컨대, 역분화줄기세포를 배양하고 있는 배양 용기에서 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 EGTA 용액을 O.O1 내지 1OO mM 농도로 첨가하고, 37℃에서 적정 시간 처리하여 세포를 박리시킨 다음, 역분화줄기세포 배양용 배지 등의 적정 용액에 현탁하여, 단일세포 상태로 만들 수 있다.

일 구체예에 따른 배양 용기에서 재프로그래밍 인자가 도입된 체세포를 배양 한 후에, 역분화줄기세포를 성장시키기 위하여 피더 세포(feeder cell)를 사용하여 배양하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 이 외에도 피더 세포를 사용하지 않고 공지의 방법으로 줄기세포를 증식시켜, 역분화줄기세포의 임상적 적용시의 피더 세포의 오염을 막을 수 있다.

상기 체세포를 배양하기 위해, 일 구체예에 따른 배양 용기에 포함된 배양 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12(1:2)일 수 있으며, 예를 들면, 섬유아세포성장인자, 글루타민, 또는 베타머캅토에탄올을 첨가한 기본 배지에 혈청대체물(serum replacement, Invitrogen Inc.)을 20％ 첨가하거나 우태아혈청 20％와 인슐린, 트란스페린, 셀레늄을 첨가할 수 있다. 용어 "피더 세포"는 지지 세포라고도 하며, 단독으로는 생존·배양할 수 없는 세포를 배양할 때, 미리 배양하여 배지에 부족한 영양분이나 증식 인자의 보급 등의 역할을 담당하는 세포를 의미할 수 있다. 동물 또는 사람 유래이거나, 태아 또는 성인 조직으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들면 섬유아세포 또는 STO 세포 등의 간질계(stromal line) 세포를 포함할 수 있다.

상기 배양은 일 구체예에 따른 배양 용기에서 0.5 내지 7일 동안 배양하여 역분화줄기세포를 유도할 수 있으며, 피더 세포로 옮긴 후에는 7 내지 21일 동안 배양하여 역분화줄기세포를 증식시킬 수 있다.

일 구체예에 따른 배양 용기의 물리적 특성을 조절하여, 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 E-카드헤린의 발현 증가에 의한 MEF를 유도함으로써, 역분화줄기세포 생산의 효율을 증가시킬 수 있다. 즉, 일 구체예에 있어서, 배양 용기 표면 상에 코팅된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 내에, 상기 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 탄성계수 0.05 kPa 내지 0.7 kPa를 갖도록 아크릴아마이드 및 비스-아크릴아마이드의 함량을 조절하여, 배양 용기 표면의 탄성 계수를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 E-카드헤린의 발현 및 MEF의 유도를 조절할 수 있어, 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시킬 수 있는 방법을 제공한다.

일 구체예에 따른 탄성 조절된 배양 용기에 의하면, 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 E-카드헤린의 발현에 의한 MEF의 유도가 유도됨으로써, 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서의 세포의 모양을 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서의 세포 및 세포 핵의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서 배양된 마우스 배아 섬유아세포의 E-카드헤린 및 N-카드헤린의 발현을 면역염색법 및 RT-PCR법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서 역분화유도줄기세포의 생산 효율을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 : 표면 탄성 조절된 배양 용기 및 그를 이용한 역분화줄기세포 유도

1. 하이드로겔이 코팅된 배양 용기의 제조

(1.1) 폴리아크릴아마이드 하이드로겔의 제조

다양한 강도의 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 제조하기 위하여, 하이드로겔의 아크릴아마이드 및 bis-아크릴아마이드(Sigma-Aldrich) 비율을 다양하게 조절하였다 (표1).

구체적으로, 40% 아크릴아마이드 용액 및 2% bis-아크릴아마이드 용액을 최종 비율이 표 1과 같도록 1X HEPES 용액에 혼합하여 아크릴아마이드 혼합 용액을 제조하였다. 상기 용액에 전체 부피의 1% (v/v)의 10% 과황산암모늄(APS) 용액과 0.2% (v/v)의 N,N,N'N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 넣고 잘 섞어준 뒤 아미노실란화된(aminosilanized) 25 mm 지름의 커버글라스 위에 올리고 그 위에 같은 크기 커버글라스를 하나 더 올린 뒤, 30분 동안 고분자를 중합하여 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 제조하였다.

(1.2) 폴리아크릴아마이드 하이드로겔의 탄성률 분석

다양한 농도의 아크릴아마이드 및 하이드로겔로 제조된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔의 저장 탄성률은 유동계(rheometer)를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 25℃로 설정된 온도제어기와 용매 트랩을 구비한 유동계 (Rheometer RS1; Thermo Haake)를 이용하여 측정하였다. 표1에 명시된 비율로 섞인 고분자 수용액에 전체 부피의 1% (v/v)의 10% 과황산암모늄(APS) 용액과 0.2% (v/v)의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 넣고 잘 섞어준 뒤 25 mm 지름 및 0.5 mm 간격의 평행 평판(parallel plate) 사이에 위치시키고 20분 동안 충분히 중합시켰다. 형성된 하이드로겔의 저장 탄성률은 진동수 범위 0.1-10 rad/s, 전단응력 10 τ 조건에서 측정하였고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	Acrylamide (%)	Bis-acrylamide (%)	저장 탄성률 (kPa)
1	3.0	0.10	0.1
2	4.0	0.15	1
3	5.0	0.23	4
4	8.0	0.26	10
5	8.0	0.48	20

표 1에 나타낸 바와 같이, 아크릴아마이드 및 bis-아크릴아마이드의 함량을 조절하여 하이드로겔의 저장 탄성률을 조절할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 아크릴아마이드 및 bis-아크릴아마이드의 함량이 낮을수록 저장 탄성률이 감소하고, 함량이 높을수록 저장 탄성율이 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 상기의 함량을 조절함으로써 배양 용기 표면의 탄성을 조절할 수 있다.

(1.3) 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 코팅된 배양 용기의 제조

상기 실시예 1의 1.1에서와 같이 커버글라스 위에 제조한 다양한 탄성을 갖는 하이드로겔을 제조하고 표면에 젤라틴을 코팅하여 다양한 탄성을 갖는 세포 배양 용기를 제조하였다.

구체적으로, 1.1에서와 동일하게 40% 아크릴아마이드 용액 및 2% bis-아크릴아마이드 용액을 최종 비율이 표1과 같도록 1X HEPES 용액에 혼합하여 아크릴아마이드 혼합 용액을 제조하였다. 상기 용액에 전체 부피의 1% (v/v)의 10% 과황산암모늄(APS) 용액과 0.2% (v/v)의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 넣고 잘 섞어준 뒤 아미노실란화 25 mm 지름의 커버글라스 위에 올리고 그 위에 동일한 크기의 커버글라스를 하나 더 올린 뒤, 30분 동안 고분자를 중합하여 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 제조하였다. 이후 가교제인 N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH. Thermo Scientific) 0.25 mg/mL 농도의 용액을 사용하여 하이드로젤 표면에 젤라틴을 코팅해 주었다.

2. 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast) (MEF)의 배양 및 분석

(2.1) 세포 모양 및 크기 분석

다양한 탄성을 가지는 하이드로겔 위에서 마우스 배아 섬유아세포를 배양하여 세포의 모양과 크기에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.

구체적으로, CF1 마우스 암수를 교배시킨 후 12.5일 째에 배아를 꺼내어 머리 및 사지, 내장을 제거한 다음 트립신을 처리하여 일차 배양하여 마우스 배아 섬유아세포를 얻는다. 마우스 배아 섬유아세포 10%(v/v) FBS와 1% 비필수 아미노산, 0.1% 베타머캅토에탄올, 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 37℃의 DMEM(Invitrogen, CA, USA)에서 표준 세포 배양 조건으로 배양하였다. 4 계대의 세포를 2 x 10⁴세포/cm²의 양으로 하이드로겔이 코팅된 배양 용기에 접종하고 7일간 배양 용기에서 배양하였다. 상기 배양된 세포를 면역염색 방법 등을 통하여 세포 및 핵의 모양과 크기를 분석하였다.

하이드로젤이 코팅된 배양용기에 배양한 마우스 배아 섬유아세포를 광학현미경을 통해 관찰한 다음 로다민 팔로이딘, DAPI 염색을 통해 세포와 핵의 모양 및 크기를 관찰하였다. 구체적으로, 10% 포르말린에 20분간 고정한다음 0.3% 트리톤-X 100을 처리하여 투과화 시킨 후 로다이 결합된 팔로이딘을 1시간동안 처리하여 세포 골격을 염색하였다. 상기 염색된 세포에 DAPI를 처리하여 핵을 염색한 다음 형광 현미경을 통해 관찰하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2로 나타내었다. 도 2는 도 1에서 염색하여 관찰한 세포 이미지를 ImageJ 프로그램을 이용하여 세포와 핵의 크기를 정량화 하였다. 정량화 한 수치를 토대로 세포 대비 핵 크기 비율도 비교하였다.

도 1은 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서의 세포의 모양을 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 낮은 탄성을 갖는 배양 용기에서 배양된 세포가 모양이 동그랗게 변하는 것을 확인할 수 있다.

도 2는 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서의 세포 및 세포 핵의 크기를 나타낸 그래프이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 세포의 전분화능(pluripotency)을 갖는 척도로서, 낮은 탄성을 갖는 배양 용기에서 세포 모양이 동그랗게 변하고 핵의 크기가 작아짐에 따라 세포 크기 대비 핵의 비율(N/C ratio)이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

(2.2) E-카드헤린 및 N-카드헤린 발현 분석

다양한 탄성을 가지는 하이드로겔 위에서 마우스 배아 섬유아세포를 배양하여, MET(mesenchymal-epithelial transition) 또는 EMT(epithelial-mesenchymal transition)가 일어나는지 확인하였다.

구체적으로 면역염색과 RT-PCR 방법으로 E-카드헤린 및 N-카드헤린의 발현을 확인하였다. 면역염색은 MEF를 다양한 탄성을 갖는 배양용기 위에서 키운 뒤, PBS로 세척, 10% 포르말린 용액에서 고정, 0.3% 트리톤X-100 용액에서 투과, 1% BSA가 들어있는 PBS 용액에서 1시간 동안 반응하여 불특정 반응을 막아준 뒤, E-카드헤린 또는 N-카드헤린 항체(Abcam, Cabridge, MA, USA)와 반응시켰다. 핵은 DAPI (Molecular Probes)로 염색하였고 Gel/Mount (Biomedia, Foster City, CA, USA)로 봉입하여 Zeiss LSM 510 Meta laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss Microimaging GmbH)로 관찰하였다. RT-PCR은 TRIzol (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 cDNA를 합성하였고 Power SYBR® Green PCR Mater Mix (Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 PCR을 하였다. E-카드헤린과 N-카드헤린의 발현양은 향존 유전자(house keeping gene)인 GAPDH로 노말라이즈하여 나타내었고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서 배양된 마우스 배아 섬유아세포의 E-카드헤린 및 N-카드헤린의 발현을 면역염색법 및 RT-PCR법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 낮은 탄성을 갖는 배양 용기에서는 E-카드헤린의 발현이 증가하고 N-카드헤린의 발현이 감소하는 반면, 높은 탄성을 갖는 배양 용기에서는 E-카드헤린의 발현이 감소하고 N-카드헤린의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는 유전자 도입 또는 화학적 처리 없이 E-카드헤린의 발현이 일 구체예에 따른 배양 용기의 물리적 특성만을 조절함으로써 증가될 수 있음을 나타낸다.

3. 역분화줄기세포 유도 및 생산 효율 분석

실시예 1의 (2.2)의 결과에 기초하여 낮은 탄성을 갖는 하이드로겔에서 유도되는 E-카드헤린의 발현 증가가 역분화줄기세포 생산 효율을 증가시킬 수 있을 것으로 가정하여, 마우스 배아 섬유아세포를 다양한 탄성을 갖는 배양 용기에서 역분화줄기세포를 유도하였고, 그의 생산 효율을 분석하였다.

구체적으로, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 각각 유전자의 레트로바이러스 벡터(Addgene, Cambridge, MA, USA)를 GP2-293 패키징 세포에 VSV-G와 함께 ConvoyTM 형질주입 시약(ACTGene Inc., Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 형질주입시킴으로써 바이러스를 제작하였다. 이 바이러스를 8 μg/mL 폴리브렌(Sigma-Aldrich) 존재 하에 Oct4-GFP(green fluorescent protein) 마우스로부터 얻어진 배아 섬유아세포에 감염시켜 상기 유전자의 발현을 유도하였다. 이후, 상기 감염된 마우스 배아 섬유아세포를 트립신으로 떼어 다양한 탄성을 갖는 하이드로겔 위에서 하루 동안 배양하였다. 그 다음, 미토마이신 C을 처리하여 성장이 억제된 피더(feeder) 세포를 준비하고 그 위에 하이드로젤에서 배양한 세포를 떼어 옮겨 접종하였다. 배지는 leukemia inhibitory factor (LIF)를 함유한 마우스 배아줄기세포 배지로 옮겨 18일 동안 배양하였다. 이후, 생산된 배아줄기세포와 유사한 콜로니 중 형광 현미경을 통해 GFP 양성 콜로니를 계수한 다음 알칼리 포스포타아제(alkaline phosphatase, AP; Sigma-Aldrich) 염색을 통해 AP 활성 양성 콜로니를 계수하여 역분화줄기세포의 생산 효율을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 일 구체예에 따른 표면 탄성 조절된 배양 용기에서 역분화유도줄기세포의 생산 효율을 나타낸 도면이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 낮은 탄성을 갖는 배양 용기에서는 GFP 양성 콜로니와 알칼리 포스파타아제(AP) 양성 콜로니의 개수가 약 2 배 정도 증가한 것을 확인할 수 있다.

상기의 결과로 일 구체예에 따른 폴리아크릴아마이드 하이드로겔은 배양 용기 표면의 탄성을 조절할 수 있으며, 상기 낮은 탄성을 갖도록 표면 탄성 조절된 배양 용기는 역분화유도줄기세포를 효율적으로 유도함을 확인할 수 있다.

Claims (15)

1. 탄성계수 0.05 kPa 내지 0.3 kPa를 갖는 폴리아크릴아마이드 하이드로겔이 표면에 코팅된, 역분화줄기세포 생산용 배양 용기.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리아크릴아마이드 하이드로겔은 아크릴아마이드 및 비스(bis)-아크릴아마이드가 가교 결합되어 있는 것인 배양 용기.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 아크릴아마이드는 1.5 내지 3.5 중량부, 및 비스-아크릴아마이드는 0.05 내지 0.15 중량부로 포함되어 있는 것인 배양 용기.
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기의 표면에 코팅된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 상에 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 젤라틴(gelatin), 엘라스틴(elastin), 오스티오칼신(osteocalcin), 피브리노겐(fibrinogen), 피브로모듈린(fibromodulin), 테나신(tenascin), 라미닌(laminin), 오스티오폰틴(osteopontin), 오스티오넥틴(osteonectin), 퍼레칸(perlecan), 베르시칸(versican), 본 윌리브랜드 팩터(von Willebrand factor), 피브린(fibrin) 및 비트로넥틴(vitronectin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 고정화되어 있는 것인 배양 용기.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기의 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 및 금속 표면으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표면인 것인 배양 용기.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 E-카드헤린의 발현을 증가시키는 것인 배양 용기.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기 내에서 배양되는 체세포의 MET(mesenchymal-epithelial transition)(MET)를 유발하는 것인 배양 용기.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 배양 용기는 역분화줄기세포 생산 효율을 증가시키는 것인 배양 용기.
10. 분리된 체세포에 역분화줄기세포 유도 인자를 도입하는 단계; 및
    청구항 1의 배양 용기에 상기 역분화줄기세포 유도 인자가 도입된 체세포를 배양하는 단계를 포함하는 역분화줄기세포 생산하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 역분화줄기세포 유도 인자는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 역분화줄기세포의 생산 효율을 증가시키는 것인 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 체세포는 인간 또는 마우스 유래의 체세포인 것인 방법.
14. 삭제
15. 삭제

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