JP7315652B2 - 細胞培養基材 - Google Patents
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Description
40モル%を超えて100モル%未満の下記式(1)で表されるカルボキシアルキル(メタ)アクリレート由来の構成単位(1)および0モル%を超えて60モル%未満の水酸基を有するエチレン性不飽和単量体由来の構成単位(2)を有する共重合体(前記構成単位(1)および前記構成単位(2)の合計は100モル%である)を含む被覆層を有する、細胞培養基材によって達成できる:
40モル%を超えて100モル%未満の下記式(1)で表されるカルボキシアルキル(メタ)アクリレート由来の構成単位(1)および0モル%を超えて60モル%未満の水酸基を有するエチレン性不飽和単量体由来の構成単位(2)を有する共重合体(前記構成単位(1)および前記構成単位(2)の合計は100モル%である)を含む被覆層を有する、細胞培養基材である:
本発明の細胞培養基材は、高分子基材の少なくとも一方の面に、上記共重合体を含む被覆層が形成されてなる。本発明に係る共重合体は、膜厚が変化しても良好な細胞増殖性(細胞伸展性)を有する。また、本発明に係る共重合体は、膜厚が変化しても、良好な細胞接着性を維持できる。加えて、被覆層は、共重合体を溶媒に溶解し、この溶液を高分子基材表面に塗布することによって簡便に形成できる。このため、本発明に係る共重合体を使用することにより、細胞培養基材(細胞培養容器)の形状・設計によらず、基材表面に細胞増殖性(さらには細胞接着性)を有する被覆層(細胞増殖層)を形成できる。このとき、本発明に係る共重合体は、上記のように、膜厚が変化しても良好な細胞増殖性(さらには細胞接着性)を示すことから、高分子(共重合体)を一定の厚みで被覆することが難しい複雑化した構造を有する細胞培養基材(細胞培養容器)に対して一定の細胞増殖性(さらには細胞接着性)を付与することができ、有用である。
本発明に係る共重合体は、40モル%を超えて100モル%未満の式(1)で表されるカルボキシアルキル(メタ)アクリレート由来の構成単位(1)および0モル%を超えて60モル%未満の水酸基を有するエチレン性不飽和単量体由来の構成単位(2)を有する。ここで、構成単位(1)および構成単位(2)の合計は100モル%である。
本発明では、高分子基材の少なくとも一方の面に、上記共重合体を含む被覆層が形成される。ここで、被覆層は、高分子基材の細胞が接触する(例えば、細胞を含む液を流す、細胞を培養する)側の面に少なくとも形成される。また、被覆層は高分子基材表面全体に形成される必要はない。被覆層は、細胞が接触する(例えば、細胞を含む液を流す、細胞を培養する)高分子基材表面部分(一部)に形成されればよいが、細胞増殖性(さらには細胞接着性)のさらなる向上効果の観点から、被覆層が、細胞が接触する(例えば、細胞を含む液を流す、細胞を培養する)側の高分子基材表面全体に形成されることが好ましい。
本発明の細胞培養基材は、膜厚が変化しても(特に、膜厚が厚い場合であっても)、優れた細胞増殖性に優れる。また、本発明の細胞培養基材は、膜厚が変化しても(特に、膜厚が大きい場合であっても)、良好な細胞接着性を有する。このため、本発明の細胞培養基材は、バイオリアクターに好適に使用できる。すなわち、本発明は、本発明の細胞培養基材を有するバイオリアクターを提供する。ここで、バイオリアクターは、平面型バイオリアクターであっても中空糸型バイオリアクターであってもよいが、中空糸型バイオリアクターが特に好ましい。このため、以下では、好ましい実施形態として、中空糸型バイオリアクターについて説明するが、本発明のバイオリアクターは平面型バイオリアクターであってもよく、この場合でも下記実施の形態を適宜変更することによって適用できる。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
上述したように、本発明のバイオリアクターは、細胞増殖性(さらには細胞接着性)に優れる細胞培養基材を備えている。ここで、本発明のバイオリアクターで培養できる細胞は、接着(足場依存)性細胞、非接着性細胞、またはこれらの任意の組み合わせのいずれであってもよいが、優れた細胞接着性(さらには細胞増殖性)もまた有することから、本発明のバイオリアクターは、接着(足場依存)性細胞の培養に特に好適に使用できる。ここで、接着(足場依存)性細胞としては、間葉系幹細胞(MSC)等の幹細胞、線維芽細胞などの、動物の細胞などがある。上述したように、幹細胞が再生医療や創薬の開発にあたって注目が集めている。このため、本発明のバイオリアクターは、幹細胞の培養に好適に使用できる。すなわち、本発明は、本発明のバイオリアクターを用いて幹細胞を培養する、幹細胞の培養方法を提供する。ここで、幹細胞の培養方法は、特に制限されず、通常の培養方法が同様にしてあるいは適宜修飾して適用できる。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)1.05g(0.0073mol)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)0.95g(0.0073mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(1)を調製した。このモノマー溶液(1)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(1)を得た。この重合液(1)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(CEA:HEMA=50:50(モル比))(共重合体(1))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)1.24g(0.0086mol)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)0.76g(0.0058mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(2)を調製した。このモノマー溶液(2)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(2)を得た。この重合液(2)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(CEA:HEMA=60:40(モル比))(共重合体(2))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)1.63g(0.0113mol)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)0.37g(0.0028mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(3)を調製した。このモノマー溶液(3)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(3)を得た。この重合液(3)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(CEA:HEMA=80:20(モル比))(共重合体(3))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)1.80g(0.0125mol)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)0.20g(0.0015mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(4)を調製した。このモノマー溶液(4)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(4)を得た。この重合液(4)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(CEA:HEMA=90:10(モル比))(共重合体(4))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)0.85g(0.0059mol)、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)1.15g(0.0088mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(5)を調製した。このモノマー溶液(5)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(5)を得た。この重合液(5)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(CEA:HEMA=40:60(モル比))(共重合体(5))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、メトキシエチルアクリレート(MEA)2.0g(0.0154mol)、およびメタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(6)を調製した。このモノマー溶液(6)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(6)を得た。この重合液(6)をエタノール50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、メトキシエチルアクリレートのホモポリマー(MEA重合体(6))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)2.0g(0.0154mol)、およびメタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(7)を調製した。このモノマー溶液(7)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(7)を得た。この重合液(7)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマー(HEMA重合体(7))を得た。
20ml容量のガラス製耐圧試験管に、カルボキシエチルアクリレート(CEA)2.0g(0.0139mol)、およびエタノール3gを加えた後、窒素ガスを10秒間バブリングして、モノマー溶液(8)を調製した。このモノマー溶液(8)に、重合開始剤として、2,2’-アゾビス(4-メトキシ-2,4-ジメチルバレロニトリル)(2,2'-Azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile))0.004g(0.013mmol)を加えた後、45℃に設定したヒートブロックで6時間加熱して、重合反応を行い、重合液(8)を得た。この重合液(8)をn-ヘキサン50mlに加え、析出したポリマー成分を回収、減圧乾燥し、カルボキシエチルアクリレートのホモポリマー(CEA重合体(8))を得た。
上記製造例1で得られた共重合体(1)をメタノールに1.0重量%濃度となるように溶解して、コーティング液(1-1)を作製した。このコーティング液(1-1)50μLを、市販の96穴組織培養用ポリスチレンディッシュ(プラズマ処理無し、FALCON社製、商品名:Non-Tissue Culture Treated Plate, 96Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid)の各ウェルに添加し、20℃で360分間乾燥し、ウェル表面にポリマー被膜(乾燥時の厚み:13μm)を作製して、細胞培養皿(1-1)を得た。
上記製造例1で得られた共重合体(1)をメタノールに0.005重量%濃度となるように溶解して、コーティング液(1-2)を作製した。このコーティング液(1-2)25μLを、市販の96穴組織培養用ポリスチレンディッシュ(プラズマ処理無し、FALCON社製、商品名:Non-Tissue Culture Treated Plate, 96Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid)の各ウェルに添加し、20℃で360分間乾燥し、ウェル表面にポリマー被膜(乾燥時の厚み:0.030μm)を作製して、細胞培養皿(1-2)を得た。
実施例1-1において、共重合体(1)の代わりに、共重合体(2)~(4)をそれぞれ使用する以外は、実施例1-1と同様の方法に従って、ウェル表面にポリマー被膜を作製して、細胞培養皿(2-1)~(4-1)を得た。
実施例1-2において、共重合体(1)の代わりに、共重合体(2)~(4)をそれぞれ使用する以外は、実施例1-2と同様の方法に従って、ウェル表面にポリマー被膜を作製して、細胞培養皿(2-2)~(4-2)を得た。
実施例1-1において、共重合体(1)の代わりに、共重合体(5)、MEA重合体(6)、HEMA重合体(7)およびCEA重合体(8)をそれぞれ使用する以外は、実施例1-1と同様の方法に従って、ウェル表面にポリマー被膜を作製して、比較細胞培養皿(1-1)~(4-1)を得た。
実施例1-2において、共重合体(1)の代わりに、共重合体(5)、MEA重合体(6)、HEMA重合体(7)およびCEA重合体(8)をそれぞれ使用する以外は、実施例1-2と同様の方法に従って、ウェル表面にポリマー被膜を作製して、比較細胞培養皿(1-2)~(4-2)を得た。
市販の96穴組織培養用ポリスチレンディッシュ(プラズマ処理およびポリマー被膜無し、FALCON社製、商品名:Non-Tissue Culture Treated Plate, 96Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid)を未処理の細胞培養皿として準備した。
上記実施例1-1~4-1、1-2~4-2および比較例1-1~4-1、1-2~4-2で得られた細胞培養皿(1-1)~(4-1)、(1-2)~(4-2)および比較細胞培養皿(1-1)~(4-1)、(1-2)~(4-2)ならびに参考例1としての未処理の細胞培養皿を用いて、下記に従って、細胞を培養し、細胞増殖活性(細胞増殖性)を評価した。なお、細胞は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(ロンザ、ウォーカーズビル、メリーランド州、アメリカ合衆国)を使用した。ドナーは22歳男性で、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166≧90%、CD14、CD31、CD45≦5%であった。
上記実施例1-1~4-1、1-2~4-2および比較例1-1~4-1、1-2~4-2で得られた細胞培養皿(1-1)~(4-1)、(1-2)~(4-2)および比較細胞培養皿(1-1)~(4-1)、(1-2)~(4-2)ならびに参考例1としての未処理の細胞培養皿を用いて、下記に従って、細胞を培養し、細胞接着活性(細胞接着性)を評価した。なお、細胞は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞(ロンザ、ウォーカーズビル、メリーランド州、アメリカ合衆国)を使用した。ドナーは22歳男性で、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166≧90%、CD14、CD31、CD45≦5%であった。
2…細胞培養基材、
3…細胞培養チャンバー、
4,8…入口ポート、
6,10…出口ポート。
Claims (5)
- 高分子基材の少なくとも一方の面に、
50モル%以上90モル%以下の下記式(1)で表されるカルボキシアルキル(メタ)アクリレート由来の構成単位(1)および10モル%以上50モル%以下の下記式(2)で表されるヒドロキシアルキル(メタ)アクリレート由来の構成単位(2)から構成される共重合体(前記構成単位(1)および前記構成単位(2)の合計は100モル%である)を含む被覆層を有する、細胞培養基材:
ただし、R1は、水素原子またはメチル基であり、R2は、炭素原子数2~3のアルキレン基である;
ただし、R 3 は、水素原子またはメチル基であり、R 4 は、炭素原子数2~3のアルキレン基である。 - 前記共重合体が、60モル%以上90モル%以下の前記構成単位(1)および10モル%以上40モル%以下の前記構成単位(2)を有する共重合体(前記構成単位(1)および前記構成単位(2)の合計は100モル%である)である、請求項1に記載の細胞培養基材。
- 前記高分子基材が多孔質膜である、請求項1または2に記載の細胞培養基材。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の細胞培養基材を有する、バイオリアクター。
- 請求項4に記載のバイオリアクターを用いて幹細胞を培養する、幹細胞の培養方法。
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