JPWO2017110923A1 - 樹脂組成物、基材および細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
基材表面を被覆することにより、該基材表面に多種多様な標的物質を該標的物質に特異的に結合するリガンドを介して選択的に捕捉できる樹脂組成物を提供する。本発明の樹脂組成物は、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、下式(1)で表される基、下式(2)で表される基および下式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)を有する重合体(A)と、下式(1)で表される基、下式(2)で表される基および下式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)を有する重合体(B)と、を含む。[化1]
Description
本発明は、特に、特定の細胞を選択的に捕捉するための基材等の被覆材として好適な樹脂組成物、基材および細胞培養方法に関する。
疎水性高分子(ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、シリコン樹脂、ポリメタクリル酸エステル、含フッ素樹脂等)や、親水性高分子(ポリビニルアルコール、ポリ(メタクリル酸2−ヒドロキシエチル)、ポリアクリルアミド等)等の合成高分子材料は、医用材料として広く用いられている。たとえば、細胞培養容器、カテーテル、人工臓器、アフィニティー精製用担体等の医療用デバイスが知られている。
しかし、前記合成高分子材料は生体適合性が不充分である場合が多い。すなわち、フィブリノーゲン、免疫グロブリンG(IgG)、インスリン、ヒストン、炭酸脱水酵素等の蛋白質がデバイス表面に吸着しやすい。前記蛋白質がデバイス表面に吸着すると、その部分にさらに細胞(血球、血小板等)が接着しやすくなる。そのため、血栓形成、炎症反応等の生体への悪影響や、デバイスの劣化等の問題が引き起こされる。
そこで、合成高分子材料を用いた医療用デバイスでは、生体膜類似構造を有する2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体や、ポリオキシエチレングリコールを含む高分子等の合成高分子材料から形成される被覆層を表面に形成し、生体適合性を高めている。
そこで、合成高分子材料を用いた医療用デバイスでは、生体膜類似構造を有する2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体や、ポリオキシエチレングリコールを含む高分子等の合成高分子材料から形成される被覆層を表面に形成し、生体適合性を高めている。
また、近年、多能性幹細胞に用いる細胞培養容器として、マウス肉腫細胞から抽出した蛋白質を培養容器に塗付する技術が開発されている(非特許文献1参照)。しかしながら、再生医療の分野においては、異種動物や非自己由来の細胞や血清、蛋白質等の不純物は、人体に対し、予期せぬ悪影響をもたらす可能性がある。これらの不特定因子によってもたらされるリスクを排除するために、異種動物や非自己由来の成分を含まず、含有する組成が明確であり、多能性幹細胞を培養可能な容器が求められている。
特許文献1には、基材表面にカルボキシ基を有する(メタ)アクリレートモノマー等を重合させて積層し、カルボキシ基に細胞接着性のペプチドを共有結合させた細胞培養器具が開示されている。該細胞培養器具では、幹細胞および未分化幹細胞を含む真核細胞は、該ペプチドを介して固定化して培養できる。
Xu, Chunhui., et al., Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells, Nat. Biotech., 19(10), 971-979, 2001.
特許文献1に記載の細胞培養器具では、基材表面に細胞由来の蛋白質等が非特異的に吸着し、細胞培養に悪影響を及ぼす可能性がある。また、カルボキシ基と共有結合可能な官能基(アミノ基等)しか固定化することができない。
本発明は、前記事情に鑑みてなされたものであって、基材表面を被覆することにより、蛋白質等の非特異的な吸着を抑制しつつ、該基材表面に、多種多様な標的物質を、該標的物質に特異的に結合するリガンドを介して選択的に捕捉できる樹脂組成物を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
[1]マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、下記一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、前記単位(a)を有する重合体(A)と、前記単位(b)を有する重合体(B)と、を含む、樹脂組成物。
[1]マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、下記一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、前記単位(a)を有する重合体(A)と、前記単位(b)を有する重合体(B)と、を含む、樹脂組成物。
[前記式中、アスタリスク(★)は重合体主鎖との直接的結合部位または連結基を介した間接的結合部位を示す。前記式(1)中、nは1〜10の整数を示し、R11は水素原子、メチル基またはエチル基を示す。前記式(2)中、R21およびR22はそれぞれ独立に炭素数1〜5のアルキレン基を示し、R23〜R25はそれぞれ独立に炭素数1〜5のアルキル基を示す。前記式(3)中、R31は炭素数1〜20のアルキレン基を示し、R34は炭素数1〜5のアルキレン基を示し、R32およびR33はそれぞれ独立に炭素数1〜5のアルキル基を示す。X−は下記式(4)で表される基または下記式(5)で表される基を示す。下記式(4)および(5)中、アスタリスクはR34との結合部位を示す。]
[2]さらに、下記一般式(6)で表される基を有する単位(c)を有する重合体(C)を含む、または、前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体が、下記一般式(6)で表される基を有する単位(c)を有する、もしくは、前記重合体(A)および前記重合体(B)の少なくともいずれか一方が、下記一般式(6)で表される基を有する単位(c)を有する[1]に記載の樹脂組成物。
[前記式(6)中、アスタリスクは重合体主鎖との直接的結合部位を示し、Y61は単結合または2価の有機基を示し、R61は炭素数1〜20のアルキル基を示す。]
[3]前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(A)中に含まれる単位(a)が組成物を構成する単位の総数に対して0.001〜5mol%である[1]または[2]に記載の樹脂組成物。
[4]前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(B)中に含まれる単位(b)が組成物を構成する単位の総数に対して5〜60質量%である[1]〜[3]のいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[5]前記一般式(6)で表される基を有する単位(c)が、組成物を構成する単位の総数に対して30〜90質量%含まれる[2]〜[4]のいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[6]さらに、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、エポキシ基、(メタ)アクリル基またはグリシジル基からなる架橋性基を有する単位(d)が含まれる[2]〜[5]のいいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[7]前記単位(a)が0.002〜3質量%、前期単位(b)が10〜45質量%、前記単位(c)が50〜80質量%、および前記単位(d)が0〜2.5質量%含まれる[6]に記載の樹脂組成物。
[8][1]〜[7]のいずれか一つに記載の樹脂組成物によって、少なくとも表面の一部が被覆された基材。
[9]前記基材が細胞培養用である、[8]に記載の基材。
[10][8]に記載の基材の表面上のマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基に、標的細胞の細胞表面と特異的に結合する部位を有するリガンドを結合させる工程と、前記リガンドを結合させた基材に、標的細胞を接触させて、前記リガンドに前記標的細胞を結合させる工程と、前記リガンドに結合した前記標的細胞を培養する工程と、を有する、細胞培養方法。
[3]前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(A)中に含まれる単位(a)が組成物を構成する単位の総数に対して0.001〜5mol%である[1]または[2]に記載の樹脂組成物。
[4]前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(B)中に含まれる単位(b)が組成物を構成する単位の総数に対して5〜60質量%である[1]〜[3]のいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[5]前記一般式(6)で表される基を有する単位(c)が、組成物を構成する単位の総数に対して30〜90質量%含まれる[2]〜[4]のいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[6]さらに、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、エポキシ基、(メタ)アクリル基またはグリシジル基からなる架橋性基を有する単位(d)が含まれる[2]〜[5]のいいずれか一つに記載の樹脂組成物。
[7]前記単位(a)が0.002〜3質量%、前期単位(b)が10〜45質量%、前記単位(c)が50〜80質量%、および前記単位(d)が0〜2.5質量%含まれる[6]に記載の樹脂組成物。
[8][1]〜[7]のいずれか一つに記載の樹脂組成物によって、少なくとも表面の一部が被覆された基材。
[9]前記基材が細胞培養用である、[8]に記載の基材。
[10][8]に記載の基材の表面上のマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基に、標的細胞の細胞表面と特異的に結合する部位を有するリガンドを結合させる工程と、前記リガンドを結合させた基材に、標的細胞を接触させて、前記リガンドに前記標的細胞を結合させる工程と、前記リガンドに結合した前記標的細胞を培養する工程と、を有する、細胞培養方法。
本発明に係る樹脂組成物で表面を被覆した基材は、標的物質以外の非特異的な吸着を抑えつつ、標的物質を、該物質と特異的に結合しかつ単位(a)中の官能基と共有結合可能な官能基を有するリガンドを介して、該基板表面に選択的に捕捉することができる。
以下の用語の定義及び表現法は、本明細書および特許請求の範囲において適用される。
「一般式(7)で表されるモノマー」は、「モノマー(7)」とも記す。他の一般式で表されるモノマーも、これに準じて同様に記す。
「一般式(1)で表される基」は、「基(1)」とも記す。他の一般式(1)で表される基も、これに準じて同様に記す。
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味し、好ましくは、塩素原子またはフッ素原子である。
「単位」とは、重合体中に存在して重合体を構成する、単量体に由来する部分(重合単位)を意味する。炭素−炭素不飽和二重結合を有する単量体の付加重合により生じる、該単量体に由来する単位は、該不飽和二重結合が開裂して生じた2価の単位である。また、ある単位の構造を重合体形成後に化学的に変換したものも単位という。なお、以下、場合により、個々の単量体に由来する単位をその単量体名に「単位」を付した名称で呼ぶ。
「(メタ)アクリレート」とは、アクリレートおよびメタクリレートの総称である。
「一般式(7)で表されるモノマー」は、「モノマー(7)」とも記す。他の一般式で表されるモノマーも、これに準じて同様に記す。
「一般式(1)で表される基」は、「基(1)」とも記す。他の一般式(1)で表される基も、これに準じて同様に記す。
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味し、好ましくは、塩素原子またはフッ素原子である。
「単位」とは、重合体中に存在して重合体を構成する、単量体に由来する部分(重合単位)を意味する。炭素−炭素不飽和二重結合を有する単量体の付加重合により生じる、該単量体に由来する単位は、該不飽和二重結合が開裂して生じた2価の単位である。また、ある単位の構造を重合体形成後に化学的に変換したものも単位という。なお、以下、場合により、個々の単量体に由来する単位をその単量体名に「単位」を付した名称で呼ぶ。
「(メタ)アクリレート」とは、アクリレートおよびメタクリレートの総称である。
「生体親和性基」とは、蛋白質が重合体に吸着することまたは細胞が重合体に接着して動かなくなることを抑制する性質を有する基を意味する。
「生体適合性」とは、蛋白質等の生体試料が吸着しない、または細胞が接着しない性質を意味する。
「蛋白質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質、またはこれらを断片化した状態のものを含む。天然物由来の蛋白質であってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされず、中でも、天然物由来の蛋白質は、細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため、好ましい。
「生体適合性」とは、蛋白質等の生体試料が吸着しない、または細胞が接着しない性質を意味する。
「蛋白質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質、またはこれらを断片化した状態のものを含む。天然物由来の蛋白質であってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされず、中でも、天然物由来の蛋白質は、細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため、好ましい。
「細胞」とは、生体を構成する最も基本的な単位であり、細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものを意味する。DNAを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。
動物由来の細胞には、生殖細胞(精子、卵子等)、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞(細胞株)、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。
動物由来の細胞には、生殖細胞(精子、卵子等)、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞(細胞株)、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。
生体を構成する体細胞には、線維芽細胞、骨髄細胞、Bリンパ球、Tリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞(たとえば、平滑筋細胞、骨格筋細胞)、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、単核細胞等が含まれる。
「体細胞」には、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が含まれる。
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
「前駆細胞」とは、前記幹細胞から特定の体細胞または生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。
「前駆細胞」とは、前記幹細胞から特定の体細胞または生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
「癌細胞」とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。
「細胞株」とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、HCT116、Huh7、HEK293(ヒト胎児腎細胞)、HeLa(ヒト子宮頸癌細胞株)、HepG2(ヒト肝癌細胞株)、UT7/TPO(ヒト白血病細胞株)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C−33A、HT−29、AE−1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five、Vero等が含まれる。
「リガンド」とは、標的物質と特異的に結合可能な物質を意味する。リガンドとしては、たとえば、蛋白質、糖鎖、脂質複合体、低分子化合物等が挙げられる。
「細胞株」とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、HCT116、Huh7、HEK293(ヒト胎児腎細胞)、HeLa(ヒト子宮頸癌細胞株)、HepG2(ヒト肝癌細胞株)、UT7/TPO(ヒト白血病細胞株)、CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C−33A、HT−29、AE−1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five、Vero等が含まれる。
「リガンド」とは、標的物質と特異的に結合可能な物質を意味する。リガンドとしては、たとえば、蛋白質、糖鎖、脂質複合体、低分子化合物等が挙げられる。
<樹脂組成物>
本発明は、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、上記した一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、前記単位(a)を有する重合体(A)と、前記単位(b)を有する重合体(B)と、を含む、樹脂組成物を提供する。
本発明の樹脂組成物(以下、特定樹脂組成物ともいう。)は、単位(a)と単位(b)とを有する共重合体を含む樹脂組成物であってもよく、重合体(A)と重合体(B)とを含む樹脂組成物であってもよい。また、特定樹脂組成物は単位(a)または単位(b)以外の単位(c)及び単位(d)を含んでいてもよい。
特定樹脂組成物において各単位の割合を調節しやすい点から、特定樹脂組成物は重合体(A)と重合体(B)とを含む樹脂組成物であることが好ましい。重合体(A)は単位(a)のみからなっていてもよく、他の単位(c)や単位(d)を有していてもよい。特定樹脂組成物の耐水溶性が向上しやすい点から重合体(A)は単位(a)および単位(c)を有することが好ましい。また重合体(B)は単位(b)のみからなっていてもよく、他の単位(c)や単位(d)を有していてもよい。特定樹脂組成物の耐水溶性が向上しやすい点から重合体(B)は単位(b)および単位(c)を有することが好ましい。すなわち特定樹脂組成物は、単位(a)と単位(c)とを有する重合体(A)及び単位(b)と単位(c)とを有する重合体(B)の混合物であることが好ましい。
本発明は、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、上記した一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、前記単位(a)を有する重合体(A)と、前記単位(b)を有する重合体(B)と、を含む、樹脂組成物を提供する。
本発明の樹脂組成物(以下、特定樹脂組成物ともいう。)は、単位(a)と単位(b)とを有する共重合体を含む樹脂組成物であってもよく、重合体(A)と重合体(B)とを含む樹脂組成物であってもよい。また、特定樹脂組成物は単位(a)または単位(b)以外の単位(c)及び単位(d)を含んでいてもよい。
特定樹脂組成物において各単位の割合を調節しやすい点から、特定樹脂組成物は重合体(A)と重合体(B)とを含む樹脂組成物であることが好ましい。重合体(A)は単位(a)のみからなっていてもよく、他の単位(c)や単位(d)を有していてもよい。特定樹脂組成物の耐水溶性が向上しやすい点から重合体(A)は単位(a)および単位(c)を有することが好ましい。また重合体(B)は単位(b)のみからなっていてもよく、他の単位(c)や単位(d)を有していてもよい。特定樹脂組成物の耐水溶性が向上しやすい点から重合体(B)は単位(b)および単位(c)を有することが好ましい。すなわち特定樹脂組成物は、単位(a)と単位(c)とを有する重合体(A)及び単位(b)と単位(c)とを有する重合体(B)の混合物であることが好ましい。
上記一般式(1)〜(3)中の各記号の定義は、それぞれ、前記したとおりである。なかでも、nは1〜5が好ましい。R11はメチル基またはエチル基が好ましい。R21およびR22はエチレン基が好ましい。R23〜R25はメチル基が好ましい。R31およびR34はエチレン基が好ましい。R32およびR33はメチル基が好ましい。X−は−SO3 −が好ましい。
本発明において固定化基とは、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を意味する。
単位(a)中の固定化基は、生物由来の多くの分子が有している、他の分子との結合性を担う基、具体的には、アミノ基、チオール基、カルボキシ基、およびアルデヒド基と共有結合可能な基である。特定樹脂組成物は、構成(a)中の固定化基により、多種多様な物質と非可逆的に結合できる。
また、特定樹脂組成物は、生体親和性基を有する単位(b)を含むため、該固定化基と特異的に結合する物質以外の物質、特に蛋白質等の生物由来の分子の非特異的な吸着が抑制されている。
単位(a)中の固定化基は、生物由来の多くの分子が有している、他の分子との結合性を担う基、具体的には、アミノ基、チオール基、カルボキシ基、およびアルデヒド基と共有結合可能な基である。特定樹脂組成物は、構成(a)中の固定化基により、多種多様な物質と非可逆的に結合できる。
また、特定樹脂組成物は、生体親和性基を有する単位(b)を含むため、該固定化基と特異的に結合する物質以外の物質、特に蛋白質等の生物由来の分子の非特異的な吸着が抑制されている。
生物から採取された生体試料のように複数の細胞や様々な生体分子を含む試料から、目的の細胞(標的細胞)のみを選択的に培養するためには、細胞培養容器に、標的細胞のみを選択的に捕捉し、かつその他の生体分子の該細胞培養容器への非特異的吸着を抑制する必要がある。特定樹脂組成物は、標的物質と特異的に結合するリガンドと固定化基で非可逆的に結合できる上に、生体親和性基により蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる。このため、特定樹脂組成物で表面を被覆した後、表面上の固定化基に、選択的に捕捉したい目的の標的物質に対するリガンドを共有結合させた基材に生体試料を接触させることにより、生体試料から標的物質を、蛋白質等の他の生体分子から分離して選択的に捕捉できる。
特定樹脂組成物で表面を被覆した細胞培養用基材は、生体試料に由来する蛋白質等の他の生体分子から分離した状態で特定の標的細胞のみを培養するための細胞培養容器として好適である。
特定樹脂組成物で表面を被覆した細胞培養用基材は、生体試料に由来する蛋白質等の他の生体分子から分離した状態で特定の標的細胞のみを培養するための細胞培養容器として好適である。
特定樹脂組成物は、エチレン系不飽和重合性モノマー由来の単位を基本構造として有することが好ましい。エチレン系不飽和重合性モノマーとしては、たとえば、(メタ)アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂(たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等)、スチレン系樹脂(たとえば、ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等)、塩素含有樹脂(たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン等)、フッ素含有樹脂等の樹脂を構成可能なモノマー単位が挙げられる。
特定樹脂組成物において、単位(a)を有する重合体は、前記エチレン系不飽和重合性モノマー由来の単位から選択される1種を基本構造とする重合体であってもよく、複数種のモノマー単位を組み合わせた重合体であってもよい。その他単位(b)、単位(c)または単位(d)を有する重合体においても、同様である。
特定樹脂組成物において、単位(a)を有する重合体は、前記エチレン系不飽和重合性モノマー由来の単位から選択される1種を基本構造とする重合体であってもよく、複数種のモノマー単位を組み合わせた重合体であってもよい。その他単位(b)、単位(c)または単位(d)を有する重合体においても、同様である。
≪単位(a)≫
特定樹脂組成物において、単位(a)は固定化基として、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種を有する。単位(a)中の固定化基は、生物由来の多くの分子が有している、他の分子との結合性を担う基、具体的には、アミノ基、チオール基、カルボキシ基、およびアルデヒド基と共有結合可能な基である。該樹脂組成物は、構成(a)中の固定化基により、多種多様な標的物質に対するリガンドと非可逆的に結合できる。
特定樹脂組成物において、単位(a)は固定化基として、マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種を有する。単位(a)中の固定化基は、生物由来の多くの分子が有している、他の分子との結合性を担う基、具体的には、アミノ基、チオール基、カルボキシ基、およびアルデヒド基と共有結合可能な基である。該樹脂組成物は、構成(a)中の固定化基により、多種多様な標的物質に対するリガンドと非可逆的に結合できる。
特定樹脂組成物中の単位(a)中の固定化基は、1種類のみであってもよく、2種類以上を適宜組み合わせて有していてもよい。たとえば、標的物質が2種類以上である場合、2種類のリガンドを結合させられるように、特定樹脂組成物は、2種類の単位(a)(たとえば、マレイミド基を有する単位(a)とスクシンイミド基を有する単位(a))を備えていてもよい。
固定化基がマレイミド基である場合、システイン残基を有するリガンドを固定化することができる。固定化基がスクシンイミド基である場合、アミノ基を有するリガンドを固定化することができる。固定化基がチオール基である場合、カルボキシ基を有するリガンドを固定化することができる。固定化基がヒドラジノ基である場合、アルデヒド基を有するリガンドを固定化することができる。中でも、固定化できるリガンドについて汎用性が高いことから、固定化基はスクシンイミド基またはチオール基が好ましい。
前記固定化基を有する単位(a)の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記一般式(7)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(7)中、R71は水素原子、ハロゲン原子またはメチル基を示す。Y71は単結合、−O−、−S−、−NH−、−CO−、−COO−、−CONH−、炭素数1〜10のアルキレン基または炭素数1〜10のアルキレングリコール基を示し、pは1〜10の整数を示す。1分子のモノマー(7)中に複数あるY71は(pが2以上のとき)同じあってもよく異なっていてもよい。Wはマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基またはヒドラジノ基を示す。
前記モノマー(7)において、R71は水素原子またはメチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
前記モノマー(7)において、R71は水素原子またはメチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Y71における炭素数1〜10のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、n−プロピレン基、n−ブチレン基、n−ペンチレン基、n−へキシレン基、n−ヘプチレン基、n−オクチレン基、n−ノニレン基、n−デシレン基等の直鎖状のアルキレン基、2−メチルプロピレン基、2−メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基等が挙げられる。また、アルキレン基は、1または数個の水素原子がハロゲン原子に置換されていてもよい。中でも、炭素数1〜10の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、またはヘキシレン基がより好ましい。
上記アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール(HO−R−OH、ここでRはアルキレン基)の片側末端または両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基(−R−O−、ここでRはアルキレン基)をいう。たとえば、メチレングリコール(HO−CH2−OH)の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基(−CH2−O−)であり、エチレングリコール(HO−CH2CH2−OH)の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基(−CH2CH2−O−)である。また、アルキレングリコール残基は、1または数個の水素原子がハロゲン原子に置換されていてもよい。
Y71における炭素数1〜10のアルキレングリコール残基としては、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、n−プロピレンオキシ基、n−ブチレンオキシ基、n−ペンチレンオキシ基、n−へキシレンオキシ基、n−ヘプチレンオキシ基、n−オクチレンオキシ基、n−ノニレンオキシ基、n−デシレンオキシ基等の直鎖状のアルキレンオキシ基、2−メチルプロピレンオキシ基、2−メチルへキシレンオキシ基、テトラメチルエチレンオキシ基等の分岐鎖状のアルキレンオキシ基等が挙げられる。中でも、炭素数1〜10の直鎖状のアルキレンオキシ基が好ましく、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、ブチレンオキシ基、ペンチレンオキシ基、またはへキシレンオキシ基がより好ましく、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、またはブチレンオキシ基がさらに好ましい。
アルキレングリコール残基は、それ自体が蛋白質の非特異吸着を抑制する性質を有する。そのため、前記モノマー(7)において、リンカーY71がアルキレングリコール残基である場合、モノマー(7)から誘導される単位(a)は、リガンドを固定化する性質と、細胞由来の蛋白質等の非特異吸着を抑制する性質とを併せ持つ。
pは、1〜10の整数であってよい。Y71がアルキレングリコール残基の場合、pは、1〜8が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。
特定樹脂組成物において、重合体に含まれる単位(a)が、pの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、pは、該樹脂組成物全体における平均値として特定される。pが2以上の場合は、Y71は同一でも、異なっていてもよい。
特定樹脂組成物において、重合体に含まれる単位(a)が、pの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、pは、該樹脂組成物全体における平均値として特定される。pが2以上の場合は、Y71は同一でも、異なっていてもよい。
前記モノマー(7)において、リンカーY71がアルキレン基である場合、p個分のアルキレン基((Y71)p)の炭素数の合計が1〜100が好ましく、1〜20がより好ましい。pが2以上の場合は、Y71は同一でも、異なっていてもよい。
固定化基Wとしては、上述した通り、固定化できるリガンドについて汎用性が高いことから、スクシンイミド基またはチオール基が好ましい。
前記モノマー(7)として、より具体的には、下記一般式(8)で表されるモノマー、下記一般式(9)で表されるモノマー、下記一般式(10)で表されるモノマー、下記一般式(11)で表されるモノマーと呼ぶ。)、下記一般式(17)で表されるモノマーまたは、下記一般式(18)で表されるモノマー等が挙げられる。
各モノマー中、Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181は単結合、−O−、−S−、−NH−、−CO−、−COO−、−CONH−、炭素数1〜10のアルキレン基または炭素数1〜10のアルキレングリコール基を示す。q、r、s、t、uおよびvは1〜10の整数を示す。1分子のモノマー中に複数あるY81、Y91、Y101、Y111、Y171またはY181は(q、r、s、t、uまたはvが2以上のとき)、同じあってもよく異なっていてもよい。
Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181における炭素数1〜10のアルキレン基および炭素数1〜10のアルキレングリコール残基としては、上述のY71と同様のものが挙げられる。
各モノマーにおいて、リンカーY81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181は、リンカーの可動性が良い点から、単結合、メチレン基、エチレン基またはエチレンオキシ基が好ましく、単結合、メチレン基またはエチレンオキシ基がさらに好ましい。
繰り返し数q、r、s、t、uおよびvは、それぞれ、1〜10の整数であってよい。
Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181がアルキレングリコール残基の場合、前記Y71のpと同様に、q、r、s、t、uおよびvは、1〜8の整数が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。樹脂組成物において、q、r、s、t、uおよびvの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、q、r、s、t、uおよびvは、それぞれ当該樹脂組成物全体における平均値として特定される。q、r、s、t、uおよびvが2以上の場合は、Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181はそれぞれ同一であっても、異なっていてもよい。
Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181がアルキレングリコール残基の場合、前記Y71のpと同様に、q、r、s、t、uおよびvは、1〜8の整数が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。樹脂組成物において、q、r、s、t、uおよびvの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、q、r、s、t、uおよびvは、それぞれ当該樹脂組成物全体における平均値として特定される。q、r、s、t、uおよびvが2以上の場合は、Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181はそれぞれ同一であっても、異なっていてもよい。
リンカーY81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181がアルキレン基である場合、リンカーY71と同様に、q、r、s、t、uまたはv個分のアルキレン基の炭素数の合計が1〜100が好ましく、1〜20がより好ましい。q、r、s、t、uおよびvが2以上の場合は、Y81、Y91、Y101、Y111、Y171およびY181は同一であっても、異なっていてもよい。
前記モノマー(8)として、より具体的には、下式(8−1)で表されるモノマーまたは下式(8−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(9)として、より具体的には、下式(9−1)で表されるモノマー、下式(9−2)で表されるモノマーまたは下式(9−3)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(10)として、より具体的には、下式(10−1)で表されるモノマーまたは下式(10−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(9)として、より具体的には、下式(9−1)で表されるモノマー、下式(9−2)で表されるモノマーまたは下式(9−3)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(10)として、より具体的には、下式(10−1)で表されるモノマーまたは下式(10−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(11)として、より具体的には、下式(11−1)で表されるモノマーまたは下式(11−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(17)として、より具体的には、下式(17−1)で表されるモノマーまたは下式(17−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(18)として、より具体的には、下式(18−1)で表されるモノマー、下式(18−2)で表されるモノマーまたは下式(18−3)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(17)として、より具体的には、下式(17−1)で表されるモノマーまたは下式(17−2)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(18)として、より具体的には、下式(18−1)で表されるモノマー、下式(18−2)で表されるモノマーまたは下式(18−3)で表されるモノマー等が挙げられる。
下記モノマー(8−1)、(8−2)、(9−2)、(9−3)、(10−1)〜(11−2)、(17−1)、(17−2)、(18−2)、(18−3)中、aは1〜10の整数を示し、bは1〜6の整数を示す。
固定化基を有するモノマーを重合して組成物を得ることが困難である場合、固定化基が予め保護基で保護されたモノマーを用いて重合を行い、重合体を得た後に保護基を外してもよい。
固定化基がマレイミド基またはスクシンイミド基である場合、保護基としては、たとえばフラン等が挙げられる。保護基がフランである場合、加熱により容易に脱離させることができる。
固定化基がチオールである場合、保護基としては、たとえばトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert−ブチルジメチルシリル基等が挙げられる。これらの基が保護基である場合、水溶液中において酸または塩基により容易に脱離させることができる。
固定化基がマレイミド基またはスクシンイミド基である場合、保護基としては、たとえばフラン等が挙げられる。保護基がフランである場合、加熱により容易に脱離させることができる。
固定化基がチオールである場合、保護基としては、たとえばトリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert−ブチルジメチルシリル基等が挙げられる。これらの基が保護基である場合、水溶液中において酸または塩基により容易に脱離させることができる。
固定化基がヒドラジノ基である場合、保護基としては、アミノ基を保護できるものであれば、特別な制限はなく、たとえば、t―ブトキシカルボニル基(Boc基)やベンジロキシカルボニル基(Z基、Cbz基)、9−フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc基)等が挙げられる。保護基がBoc基である場合、水溶液中においてトリフルオロ酢酸等の強酸により容易に脱離させることができる。また、保護基がZ基である場合、活性炭に担持させたパラジウム等を触媒として水素ガスを吹き込むことにより容易に脱離させることができる。また、保護基がFmoc基である場合、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン等の二級アミンにより容易に脱離させることができる。
固定化基を有する単位(a)の割合は、特に限定されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、0.001〜5mol%が好ましく、0.005〜0.5mol%がより好ましく、0.01〜0.1mol%がさらに好ましい。ただし「組成物を構成する単位の総数」とは、特定樹脂組成物に含まれる重合体(単位(a)と単位(b)とを有する重合体、重合体(A)、及び重合体(B))が有する全ての単位の総数を意味する。
固定化基を有する単位(a)の割合は、特に限定されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、0.0004〜3質量が好ましく0.002〜0.6質量%がより好ましく、0.004〜0.3質量%がさらに好ましい。
固定化基を有する単位(a)の割合は、特に限定されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、0.0004〜3質量が好ましく0.002〜0.6質量%がより好ましく、0.004〜0.3質量%がさらに好ましい。
≪単位(b)≫
特定樹脂組成物において、単位(b)は生体親和性基を有する。特定樹脂組成物は生体親和性を有する基を有することにより、蛋白質等の非特異的な吸着を抑制することができる。
生体親和性基は、蛋白質の非特異的な吸着防止効果が高い被覆層を形成しやすい点から、上記した一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種が好ましい。生体親和性基としては、蛋白質の非特異的な吸着防止効果が得られやすい点から、基(1)のみ、または、基(2)および基(3)のいずれか一方若しくは両方が好ましく、基(1)、基(2)または基(3)のいずれか1つが特に好ましい。生体親和性基としては、入手容易性の点から基(1)が特に好ましい。
特定樹脂組成物において、単位(b)は生体親和性基を有する。特定樹脂組成物は生体親和性を有する基を有することにより、蛋白質等の非特異的な吸着を抑制することができる。
生体親和性基は、蛋白質の非特異的な吸着防止効果が高い被覆層を形成しやすい点から、上記した一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種が好ましい。生体親和性基としては、蛋白質の非特異的な吸着防止効果が得られやすい点から、基(1)のみ、または、基(2)および基(3)のいずれか一方若しくは両方が好ましく、基(1)、基(2)または基(3)のいずれか1つが特に好ましい。生体親和性基としては、入手容易性の点から基(1)が特に好ましい。
上記一般式(1)〜(3)中の各記号のそれぞれの定義、およびそれぞれの好ましい態様は、前記したものと同じである。
[基(1)]
基(1)は、特定樹脂組成物からなる被覆層の表面に結合しようとする細胞由来の蛋白質等の非特異的吸着を抑制できる。基(1)は、単位(b)の主鎖に含まれていてもよく、側鎖に含まれていてもよい。
基(1)は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。細胞由来の蛋白質等の非特異的な吸着を抑制する効果がより高い点から、基(1)は直鎖状であることが好ましい。基(1)におけるR11は、耐水性に優れる点から、メチル基またはエチル基が好ましい。
基(1)は、特定樹脂組成物からなる被覆層の表面に結合しようとする細胞由来の蛋白質等の非特異的吸着を抑制できる。基(1)は、単位(b)の主鎖に含まれていてもよく、側鎖に含まれていてもよい。
基(1)は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。細胞由来の蛋白質等の非特異的な吸着を抑制する効果がより高い点から、基(1)は直鎖状であることが好ましい。基(1)におけるR11は、耐水性に優れる点から、メチル基またはエチル基が好ましい。
基(1)におけるnは、基(1)が単位(b)の側鎖に含まれる場合、耐水性に優れる点から、1〜10が好ましく、1〜5が特に好ましい。
基(1)におけるnは、基(1)が単位(b)の主鎖に含まれる場合、耐水性に優れる点から、2〜10が好ましく、4〜10が特に好ましい。
基(1)におけるnは、基(1)が単位(b)の主鎖に含まれる場合、耐水性に優れる点から、2〜10が好ましく、4〜10が特に好ましい。
[基(2)]
基(2)は、血液中等に含まれるリン脂質に対して強い親和性を持つ一方、血漿蛋白質に対する相互作用力は弱い。そのため、単位(b)が基(2)を有することで、たとえば特定樹脂組成物からなる被覆層上にリン脂質が優先して吸着し、該リン脂質が自己組織化して吸着層が形成されると考えられる。その結果、表面が血管内皮表面に類似した構造となるために、フィブリノーゲン等の蛋白質の非特異的な吸着が抑制される。
基(2)は、特定樹脂組成物の側鎖に含まれることが好ましい。
基(2)は、血液中等に含まれるリン脂質に対して強い親和性を持つ一方、血漿蛋白質に対する相互作用力は弱い。そのため、単位(b)が基(2)を有することで、たとえば特定樹脂組成物からなる被覆層上にリン脂質が優先して吸着し、該リン脂質が自己組織化して吸着層が形成されると考えられる。その結果、表面が血管内皮表面に類似した構造となるために、フィブリノーゲン等の蛋白質の非特異的な吸着が抑制される。
基(2)は、特定樹脂組成物の側鎖に含まれることが好ましい。
R21は、炭素数1〜5のアルキレン基であり、たとえば、メチレン基、エチレン基、n−プロピレン基、n−ブチレン基、n−ペンチレン基等の直鎖状のアルキレン基、2−メチルプロピレン基、トリメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基が挙げられる。中でも、原料の入手容易性の点から、炭素数1〜5の直鎖状のアルキレン基が好ましく、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、またはペンチレン基がより好ましく、エチレン基がさらに好ましい。
R22は、炭素数1〜5のアルキレン基であり、たとえば、前記R21と同様のものが挙げられる。中でも、蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる点から、炭素数1〜5の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、またはブチレン基がより好ましく、エチレン基がさらに好ましい。
R23〜R25は、それぞれ独立に炭素数1〜5のアルキル基であり、たとえば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、n−ブチル基、n−ペンチル基等の直鎖状のアルキル基、2−メチルプロピル基、トリメチルエチル基等の分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。中でも、原料の入手容易性の点から、炭素数1〜5の直鎖状のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
単位(b)が基(2)を有する場合、基(2)は、1種でもよく、2種以上でもよい。
単位(b)が基(2)を有する場合、基(2)は、1種でもよく、2種以上でもよい。
[基(3)]
単位(b)が基(3)を有することで、単位(b)が基(2)を有する場合と同様の理由から細胞由来の蛋白質等の非特異的な吸着が抑制される。
基(3)は、単位(b)の側鎖に含まれることが好ましい。
R31は、炭素数1〜20のアルキレン基であり、たとえば、メチレン基、エチレン基、n−プロピレン基、n−ブチレン基、n−ペンチレン基、n−へキシレン基、n−ヘプチレン基、n−オクチレン基、n−ノニレン基、n−デシレン基、n−ドデシレン基等の直鎖状のアルキレン基、2−メチルプロピレン基、2−メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基等が挙げられる。特定樹脂組成物が柔軟性に優れる点から、炭素数1〜20の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ドデシレン基、トリデシレン基、テトラデシレン基、またはペンタデシレン基がより好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、またはデシレン基がさらに好ましく、エチレン基が特に好ましい。
単位(b)が基(3)を有することで、単位(b)が基(2)を有する場合と同様の理由から細胞由来の蛋白質等の非特異的な吸着が抑制される。
基(3)は、単位(b)の側鎖に含まれることが好ましい。
R31は、炭素数1〜20のアルキレン基であり、たとえば、メチレン基、エチレン基、n−プロピレン基、n−ブチレン基、n−ペンチレン基、n−へキシレン基、n−ヘプチレン基、n−オクチレン基、n−ノニレン基、n−デシレン基、n−ドデシレン基等の直鎖状のアルキレン基、2−メチルプロピレン基、2−メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基等が挙げられる。特定樹脂組成物が柔軟性に優れる点から、炭素数1〜20の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、デシレン基、ドデシレン基、トリデシレン基、テトラデシレン基、またはペンタデシレン基がより好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、へキシレン基、ヘプチレン基、オクチレン基、ノニレン基、またはデシレン基がさらに好ましく、エチレン基が特に好ましい。
R34は、炭素数1〜5のアルキレン基であり、たとえば、前記R21と同様のものが挙げられる。中でも、蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる点から、炭素数1〜5の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基またはブチレン基がより好ましく、エチレン基がさらに好ましい。
R32およびR33は、それぞれ独立に炭素数1〜5のアルキル基であり、たとえば、前記R23〜R25と同様のものが挙げられる。中でも、蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる点から、炭素数1〜5の直鎖状のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
単位(b)が基(3)を有する場合、基(3)は、1種でもよく、2種以上でもよい。
また、単位(b)が基(3)を有する場合、蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる点から、単位(b)は、X−が基(4)である基(3)を有するか、またはX−が基(5)である基(3)を有するかのいずれかであることが好ましい。
また、単位(b)が基(3)を有する場合、蛋白質の非特異的な吸着を抑制できる点から、単位(b)は、X−が基(4)である基(3)を有するか、またはX−が基(5)である基(3)を有するかのいずれかであることが好ましい。
前記生体親和性基を有する単位(b)の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記一般式(12)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー(12)中、R121は水素原子、ハロゲン原子またはメチル基を示す。Y121は単結合、−O−、−S−、−NH−、−CO−、−COO−、−CONH−、炭素数1〜10のアルキレン基または炭素数1〜10のアルキレングリコール基を示す。cは1〜10の整数を示す。1分子のモノマー(12)中に複数あるY121は(cが2以上のとき)同じあってもよく異なっていてもよい。Zは前記基(1)、前記基(2)および前記基(3)からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を示す。
前記モノマー(12)において、R121は水素原子またはメチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Y121における炭素数1〜10のアルキレン基としては、たとえば、前記Y71と同様のもの等が挙げられる。また、アルキレン基は、水素原子がハロゲン原子に置換されていてもよい。中でも、炭素数1〜10の直鎖状のアルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、またはヘキシレン基がより好ましい。
Y121における炭素数1〜10のアルキレングリコール残基としては、たとえば、前記Y71と同様のもの等が挙げられる。中でも、炭素数1〜10の直鎖状のアルキレンオキシ基が好ましく、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、ブチレンオキシ基、ペンチレンオキシ基、またはへキシレンオキシ基がより好ましく、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基、またはブチレンオキシ基がさらに好ましく、エチレンオキシ基が特に好ましい。
Y121の繰り返し数cは、1〜10の整数であってよい。
Y121がアルキレングリコール残基の場合、1〜8の整数が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。樹脂組成物において、cの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、cは、該樹脂組成物全体における平均値として特定される。cが2以上の場合は、Y121は同一であっても、異なっていてもよい。
Y121がアルキレングリコール残基の場合、1〜8の整数が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。樹脂組成物において、cの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、cは、該樹脂組成物全体における平均値として特定される。cが2以上の場合は、Y121は同一であっても、異なっていてもよい。
前記モノマー(12)において、リンカーY121がアルキレン基である場合、c個分のアルキレン基((Y121)c)の炭素数の合計が1〜100が好ましく、1〜20がより好ましい。cが2以上の場合は、Y121は同一であっても、異なっていてもよい。
生体親和性基Zとしては、上述した通り、蛋白質の非特異的な吸着を抑制する効果が得られやすい点から、基(1)のみ、または、基(2)および基(3)のいずれか一方若しくは両方が好ましく、基(1)、基(2)または基(3)のいずれか1つが特に好ましい。
前記モノマー(12)として、より具体的には、下記一般式(13)で表されるモノマー、下記一般式(14)で表されるモノマー)または下記一般式(15)で表されるモノマー等が挙げられる。
前記モノマー中、Y131、Y141およびY151は前記Y101と同様のものを示す。d、eおよびfは1〜10の整数を示す。1分子のモノマー中に複数あるY131、Y141またはY151は(d、eまたはfが2以上のとき)、同じあってもよく異なっていてもよい。mは1〜10の整数を示す。R141、R142およびR152は炭素数1〜5のアルキレン基を示す。R151は炭素数1〜20のアルキレン基を示す。
Y131、Y141およびY151における炭素数1〜10のアルキレン基および炭素数1〜10のアルキレングリコール残基としては、たとえば、前記Y71と同様のものが挙げられる。
各モノマーにおいて、リンカーY131、Y141およびY151は、耐水性に優れ、モノマーを合成しやすい点から、単結合、−O−、−CO−、−COO−、−CONH−、メチレン基、エチレン基、またはエチレンオキシ基が好ましく、単結合、メチレン基またはエチレンオキシ基がさらに好ましい。
d、eおよびfは、それぞれ1〜10の整数であってよい。
d、eおよびfは、それぞれ1〜10の整数であってよい。
前記Y121のcと同様に、Y131、Y141およびY151がアルキレングリコール残基の場合、d、eおよびfは、1〜8が好ましく、1〜7がより好ましく、1〜6がさらに好ましい。特定樹脂組成物において、d、eおよびfの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、d、eおよびfは、それぞれ該樹脂組成物全体における平均値として特定される。d、eおよびfが2以上の場合は、Y131、Y141およびY151はそれぞれ同一でも、異なっていてもよい。
リンカーY131、Y141およびY151がアルキレン基である場合、リンカーY71と同様に、d、eおよびf個分のアルキレン基の炭素数の合計が1〜100好ましく、1〜20がより好ましい。d、eおよびfが2以上の場合は、Y131、Y141およびY151は同一であっても、異なっていてもよい。
前記モノマー(13)、前記モノマー(14)および前記モノマー(15)として、より具体的には、下記式(13−1)で表されるモノマー、下記式(14−1)で表されるモノマーおよび下記式(15−1)で表されるモノマー等が挙げられる。モノマー(13−1)中、kは1〜10の整数を示す。
生体親和性基を有する単位(b)の割合は、特に限定されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、5〜60質量%が好ましく10〜50質量%がより好ましく、10〜45質量%がさらに好ましい。
≪単位(c)≫
また、特定樹脂組成物において、疎水性基を有する単位(c)を備えていてもよい。特定樹脂組成物は、単位(c)を有することにより、親水性の物質との非特異的な結合が抑制される。さらに、耐水性が向上する。
また、特定樹脂組成物において、疎水性基を有する単位(c)を備えていてもよい。特定樹脂組成物は、単位(c)を有することにより、親水性の物質との非特異的な結合が抑制される。さらに、耐水性が向上する。
[基6]
疎水性基としては、たとえば、下記一般式(6)で表される基等が挙げられる。
疎水性基としては、たとえば、下記一般式(6)で表される基等が挙げられる。
基(6)中、アスタリスクは結合部位を示す。Y61は単結合または2価の有機基を示す。R61は炭素数1〜20のアルキル基を示す。
基(6)は、単位(c)の主鎖に含まれていてもよく、側鎖に含まれていてもよい。基(6)は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
基(6)におけるY61は、合成の容易さの点から、以下の基が挙げられる。
−O−、−S−、−NH−、−SO2−、−PO2−、−CH=CH−、−CH=N−、−N=N−、−N(O)=N−、−OCO−、−COO−、−COS−、−CONH−、−COCH2−、−CH2CH2−、−CH2−、−CH2NH−、−CO−、−CH=CH−COO−、−CH=CH−CO−、直鎖状または分岐鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アルキレンオキシ基、2価の4〜7員環の置換基、2価の6員環の芳香族炭化水素基、2価の4〜6員環の脂環式炭化水素基、2価の5または6員環の複素環基、これらの縮合環、2価の連結基の組み合わせから構成される基等。
基(6)におけるY61は、合成の容易さの点から、以下の基が挙げられる。
−O−、−S−、−NH−、−SO2−、−PO2−、−CH=CH−、−CH=N−、−N=N−、−N(O)=N−、−OCO−、−COO−、−COS−、−CONH−、−COCH2−、−CH2CH2−、−CH2−、−CH2NH−、−CO−、−CH=CH−COO−、−CH=CH−CO−、直鎖状または分岐鎖状のアルキレン基、アルケニレン基、アルキレンオキシ基、2価の4〜7員環の置換基、2価の6員環の芳香族炭化水素基、2価の4〜6員環の脂環式炭化水素基、2価の5または6員環の複素環基、これらの縮合環、2価の連結基の組み合わせから構成される基等。
2価の有機基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、水酸基、ハロゲン原子、シアノ基、アルコキシ基(メトキシ基、エトキシ基、ブトシキ基、オクチルオキシ基、メトキシエトキシ基等)、アリーロキシ基(フェノキシ基等)、アルキルチオ基(メチルチオ基、エチルチオ基等)、アシル基(アセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等)、スルホニル基(メタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基等)、アシルオキシ基(アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基等)、スルホニルオキシ基(メタンスルホニルオキシ基、トルエンスルホニルオキシ基等)、ホスホニル基(ジエチルホスホニル基等)、アミド基(アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等)、カルバモイル基(N,N−ジメチルカルバモイル基、N−フェニルカルバモイル基等)、アルキル基(メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、2−カルボキシエチル基、ベンジル基等)、アリール基(フェニル基、トルイル基等)、複素環基(ピリジル基、イミダゾリル基、フラニル基等)、アルケニル基(ビニル基、1−プロペニル基等)、アルコシアシルオキシ基(アセチルオキシ基、ベンゾイルオキシ基等)、アルコシキカルボニル基(メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等)、重合性基(ビニル基、アクリロイル基、メタクロイル基、スリリル基、桂皮酸残基等)が挙げられる。
基(6)におけるY61としては、単結合、−O−、−(CH2CH2O)γ−(ただし、γは1〜10の整数である。)、−COO−、6員環芳香族炭化水素基、直鎖状または分岐状のアルキレン基、水素原子の一部が水酸基に置換された直鎖状または分岐状のアルキレン基、これら2価の連結基の組み合わせから構成される基が好ましく、単結合、炭素数1〜5のアルキレン基、−COO−、−COOA1−が特に好ましい。
A1としては、−(CH2)δ−、−(CH2)δ−CH(OH)−(CH2)ε−、−(CH2)δ−NA2−SO2−が挙げられ、−(CH2)δ−が特に好ましい。ただし、δは1〜5の整数であり、εは1〜5の整数であり、A2は水素原子または炭素数1〜3のアルキル基である。
A1としては、−(CH2)δ−、−(CH2)δ−CH(OH)−(CH2)ε−、−(CH2)δ−NA2−SO2−が挙げられ、−(CH2)δ−が特に好ましい。ただし、δは1〜5の整数であり、εは1〜5の整数であり、A2は水素原子または炭素数1〜3のアルキル基である。
基(6)におけるR61としては、合成しやすい点から、炭素数1〜15のアルキル基で好ましく、炭素数1〜12のアルキル基がより好ましく、炭素数2〜10のアルキル基がさらに好ましい。
前記疎水性基を有する単位(c)の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記一般式(16)で表されるモノマー等が挙げられる。
モノマー(16)中、Y161は前記Y61と同様のものを示し、R161は水素原子、ハロゲン原子またはメチル基示し、R162は前記R61と同様のものを示す。
Y161は単結合、−O−、−(CH2CH2O)γ−(ただし、γは1〜10の整数である。)、−COO−、6員環芳香族炭化水素基、直鎖状または分岐状のアルキレン基、水素原子の一部が水酸基に置換された直鎖状または分岐状のアルキレン基、これら2価の連結基の組み合わせから構成される基が好ましく、単結合、炭素数1〜5のアルキレン基、−COO−、−COOA1−が特に好ましい。
A1としては、−(CH2)δ−、−(CH2)δ−CH(OH)−(CH2)ε−、−(CH2)δ−NA2−SO2−が挙げられ、−(CH2)δ−が特に好ましい。ただし、δは1〜5の整数であり、εは1〜5の整数であり、A2は水素原子または炭素数1〜3のアルキル基である。
R161は、ハロゲン原子またはメチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
Y161は単結合、−O−、−(CH2CH2O)γ−(ただし、γは1〜10の整数である。)、−COO−、6員環芳香族炭化水素基、直鎖状または分岐状のアルキレン基、水素原子の一部が水酸基に置換された直鎖状または分岐状のアルキレン基、これら2価の連結基の組み合わせから構成される基が好ましく、単結合、炭素数1〜5のアルキレン基、−COO−、−COOA1−が特に好ましい。
A1としては、−(CH2)δ−、−(CH2)δ−CH(OH)−(CH2)ε−、−(CH2)δ−NA2−SO2−が挙げられ、−(CH2)δ−が特に好ましい。ただし、δは1〜5の整数であり、εは1〜5の整数であり、A2は水素原子または炭素数1〜3のアルキル基である。
R161は、ハロゲン原子またはメチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
前記モノマー(16)として、より具体的には、以下のモノマーが挙げられる。
n−ブチル(メタ)アクリレート、iso−ブチル(メタ)アクリレート、sec−ブチル(メタ)アクリレート、t−ブチル(メタ)アクリレート、n−ネオペンチル(メタ)アクリレート、iso−ネオペンチル(メタ)アクリレート、iso−ネオペンチル(メタ)アクリレート、ネオペンチル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、n−ヘキシル(メタ)アクリレート、iso−ヘキシル(メタ)アクリレート、ヘプチル(メタ)アクリレート、n−オクチル(メタ)アクリレート、iso−オクチル(メタ)アクリレート、2−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、n−ノニル(メタ)アクリレート、iso−ノニル(メタ)アクリレート、n−デシル(メタ)アクリレート、iso−デシル(メタ)アクリレート、n−ドデシル(メタ)アクリレート、iso−ドデシル(メタ)アクリレート、n−トリデシル(メタ)アクリレート、iso−トリデシル(メタ)アクリレート、n−テトラデシル(メタ)アクリレート、iso−テトラデシル(メタ)アクリレート、n−ペンタデシル(メタ)アクリレート、iso−ペンタデシル(メタ)アクリレート、n−ヘキサデシル(メタ)アクリレート、iso−ヘキサデシル(メタ)アクリレート、n−オクタデシル(メタ)アクリレート、iso−オクタデシル(メタ)アクリレート、イソボニル(メタ)アクリレート、CH2=C(CH3)COO(CH2)2(CF2)5CF3、CH2=CHCOO(CH2)2(CF2)5CF3、CH2=C(CH3)COOCH2CF3、CH2=CHCOOCH2CF3、CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF2CF3、CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF(CF3)2、CH2=CR6COOCH(CF3)2、CH2=CR6COOC(CF3)3等。
n−ブチル(メタ)アクリレート、iso−ブチル(メタ)アクリレート、sec−ブチル(メタ)アクリレート、t−ブチル(メタ)アクリレート、n−ネオペンチル(メタ)アクリレート、iso−ネオペンチル(メタ)アクリレート、iso−ネオペンチル(メタ)アクリレート、ネオペンチル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、n−ヘキシル(メタ)アクリレート、iso−ヘキシル(メタ)アクリレート、ヘプチル(メタ)アクリレート、n−オクチル(メタ)アクリレート、iso−オクチル(メタ)アクリレート、2−エチルヘキシル(メタ)アクリレート、n−ノニル(メタ)アクリレート、iso−ノニル(メタ)アクリレート、n−デシル(メタ)アクリレート、iso−デシル(メタ)アクリレート、n−ドデシル(メタ)アクリレート、iso−ドデシル(メタ)アクリレート、n−トリデシル(メタ)アクリレート、iso−トリデシル(メタ)アクリレート、n−テトラデシル(メタ)アクリレート、iso−テトラデシル(メタ)アクリレート、n−ペンタデシル(メタ)アクリレート、iso−ペンタデシル(メタ)アクリレート、n−ヘキサデシル(メタ)アクリレート、iso−ヘキサデシル(メタ)アクリレート、n−オクタデシル(メタ)アクリレート、iso−オクタデシル(メタ)アクリレート、イソボニル(メタ)アクリレート、CH2=C(CH3)COO(CH2)2(CF2)5CF3、CH2=CHCOO(CH2)2(CF2)5CF3、CH2=C(CH3)COOCH2CF3、CH2=CHCOOCH2CF3、CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF2CF3、CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF(CF3)2、CH2=CR6COOCH(CF3)2、CH2=CR6COOC(CF3)3等。
疎水性基を有する単位(c)の割合は、特に限定されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、0〜90質量%が好ましく、30〜80質量%がより好ましく、50〜80質量%がさらに好ましい。
≪単位(d)≫
また、特定樹脂組成物は、架橋基を有する単位(d)を有していてもよい。架橋基は、たとえば各単位の主鎖を架橋させることにより、組成物に不溶性を付与することができる。また、基材等の固相表面に架橋することにより、該樹脂組成物と基材表面をより強固に接着させることができる。
架橋基は、単位同士を架橋する基、または単位と固相表面とを架橋する基であれば特に限定されない。
このような架橋基は、架橋可能な官能基を有するモノマーを重合させた後、架橋可能な官能基を反応させて、各単位同士を架橋することによって生じさせることができる。
また、特定樹脂組成物は、架橋基を有する単位(d)を有していてもよい。架橋基は、たとえば各単位の主鎖を架橋させることにより、組成物に不溶性を付与することができる。また、基材等の固相表面に架橋することにより、該樹脂組成物と基材表面をより強固に接着させることができる。
架橋基は、単位同士を架橋する基、または単位と固相表面とを架橋する基であれば特に限定されない。
このような架橋基は、架橋可能な官能基を有するモノマーを重合させた後、架橋可能な官能基を反応させて、各単位同士を架橋することによって生じさせることができる。
架橋可能な官能基としては、モノマーの重合反応中には反応しない架橋性基であれば特に限定されない。たとえば、加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、(メタ)アクリル基、グリシジル基等が挙げられる。
単位(d)の割合は、特に制限されず、たとえば、組成物を構成する単位の総数に対して、0〜10質量%が好ましく、0〜5質量%がより好ましく、0〜2.5質量%がさらに好ましい。
本発明の樹脂組成物は、単位(a)を0.002〜3質量%、単位(b)を10〜45質量%、単位(c)を50〜80質量%、および単位(d)を0〜2.5質量%含むことが好ましい。
本発明の樹脂組成物は、単位(a)を0.002〜3質量%、単位(b)を10〜45質量%、単位(c)を50〜80質量%、および単位(d)を0〜2.5質量%含むことが好ましい。
≪製造方法≫
特定樹脂組成物は、たとえば、原料となるモノマーを有機溶媒に溶解し、重合させることにより、重合体を得る方法により製造してもよい。重合体の各モノマーの結合方式は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態であってもよい。
特定樹脂組成物は、たとえば、原料となるモノマーを有機溶媒に溶解し、重合させることにより、重合体を得る方法により製造してもよい。重合体の各モノマーの結合方式は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態であってもよい。
有機溶媒としては、たとえば、2−ブタノン、エタノール、メタノール、t−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。
特定樹脂組成物は、それぞれ単一のモノマーを有機溶媒に溶解し、重合して単独重合体を製造した後に、混合して製造してもよく、2種以上のモノマーを共重合させた共重合体を2種類以上製造した後に、得られた2種類以上の共重合体を混合して製造してもよく、全ての原料モノマーを共重合させた共重合体として製造してもよい。
すなわち、特定樹脂組成物は、単位(a)の由来元となるモノマーを重合させて得られた重合体(A)と、単位(b)の由来元となるモノマーを重合させて得られた重合体(B)とを混合して製造してもよく、また単位(a)の由来元となるモノマーと、単位(b)の由来元となるモノマーとの共重合体を製造してもよい。
すなわち、特定樹脂組成物は、単位(a)の由来元となるモノマーを重合させて得られた重合体(A)と、単位(b)の由来元となるモノマーを重合させて得られた重合体(B)とを混合して製造してもよく、また単位(a)の由来元となるモノマーと、単位(b)の由来元となるモノマーとの共重合体を製造してもよい。
また、特定樹脂組成物は、単位(b)の由来元となるモノマーを重合させて得られた重合体(B)に固定化基を導入して、固定化基と生体親和性基とを有する共重合体を製造してもよい。さらに特定樹脂組成物が単位(c)を有する場合、単位(b)の由来元となるモノマーまたは疎水性基を有する単位(c)の由来元となるモノマーを重合させて単位(b)と単位(c)を有する共重合体を製造した後に、該共重合体中の生体親和性基または疎水性基の一部に既知の化学反応を用いて固定化基を修飾することにより、固定化基を有する単位(a)をも有する共重合体を製造してもよい。
それぞれの単位の割合の調節しやすい点から、重合体に固定化基を導入する方法よりも、各単位の原料モノマーを重合させて製造する方法により製造することが好ましい。なかでも、2成分以上の前記モノマーを共重合させることにより、共重合体を得る方法、または、2成分以上の前記モノマーを共重合させた共重合体を2種類以上製造した後に、得られた2種類以上の共重合体を混合する方法により製造することが好ましい。さらに特定樹脂組成物が単位(c)を有する場合、特に単位(a)と単位(c)とを有する共重合体、および、単位(b)と単位(c)とを有する共重合体を混合して樹脂組成物を得ることが好ましい。
特定樹脂組成物は、その他の樹脂組成物と同様に、基材表面を被覆して薄膜を形成したり、成形体を形成できる。
特定樹脂組成物は、その他の樹脂組成物と同様に、基材表面を被覆して薄膜を形成したり、成形体を形成できる。
<基材>
本発明は、実施形態として、特定樹脂組成物で少なくとも表面の一部が被覆された、基材を提供する。
本発明は、実施形態として、特定樹脂組成物で少なくとも表面の一部が被覆された、基材を提供する。
本発明の基材によれば、より多種多様なリガンドを基材表面上に固定化することができる。さらに、リガンドが固定化された基材を使用することで、リガンドと特異的に結合する標的物質を選択的に捕捉するために使用することができる。たとえば、リガンドを結合させた該基材は、標的物質を選択的に捕捉するためのアフィニティークロマトグラフィのカラム充填材としても利用できる。
基材の形状としては、特別な限定はなく、たとえば、平板状、球状等が挙げられる。基材の材質としては、たとえば無機物質としてシリカ、アルミナ、ガラス、金属等が挙げられる。また、有機高分子物質として熱可塑性樹脂等が挙げられる。より具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン樹脂:環状ポリオレフィン樹脂:含フッ素樹脂等が挙げられる。
飽和環状ポリオレフィン樹脂としては、環状オレフィン構造を有する単独重合体または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体に水素添加した飽和重合体が挙げられる。
また、基材が細胞培養用である場合、材質は、細胞を培養するのに適した任意の材料であれば特別な限定はなく、たとえば、ソーダ石灰ガラス、パイレックス(商品名)ガラス、バイコール(商品名)ガラス、石英ガラス等のガラス材料;シリコン;ポリ(塩化ビニル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリ(酢酸ビニル−共−無水マレイン酸)、ポリ(ジメチルシロキサン)モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン等の樹状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー;ポリ(酢酸ビニル−共−無水マレイン酸)、ポリ(スチレン−共−無水マレイン酸)、ポリ(エチレン−共−アクリル酸)またはこれらの誘導体等のコポリマー等が挙げられる。
基材として、より具体的には、担体(たとえば、磁気担体、アフィニティーカラム精製用担体等)、細胞培養用基材、プレパラート、マイクロデバイス、膜等が挙げられる。細胞培養用基材としては、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、たとえば、6、12、24、96、384、1,536個等が挙げられる。
また、基材が球状の粒子である場合、粒子の平均粒径0.1〜500μmのポリマー粒子がより好ましい。前記範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、フィルタ等による回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために標的物質との反応効率も高いと考えられる。平均粒径が500μm以下の場合、表面積が小さ過ぎず、蛋白質との反応効率が高い。平均粒径0.1μm以上の場合、フィルタによる粒子の回収を効率よく行うことができ、粒子をカラムに充填して用いる場合に、通液の際の圧力損失が大きくなるおそれがない。
≪被覆方法≫
基材表面に特定樹脂組成物を被覆する方法としては、たとえば有機溶媒に溶解した前記高分子化合物を、前記基材上に、浸漬、スプレー、スピンコーティング等により塗布した後、10〜120℃程度の環境下で乾燥させることにより行うことができる。前記有機溶媒としては、たとえば、上述の≪製造方法≫において、例示したものと同様のもの等が挙げられる。
基材表面に特定樹脂組成物を被覆する方法としては、たとえば有機溶媒に溶解した前記高分子化合物を、前記基材上に、浸漬、スプレー、スピンコーティング等により塗布した後、10〜120℃程度の環境下で乾燥させることにより行うことができる。前記有機溶媒としては、たとえば、上述の≪製造方法≫において、例示したものと同様のもの等が挙げられる。
被覆層の厚さは、1nm〜1mmが好ましく、5nm〜800μmが特に好ましい。厚さが前記下限値以上であれば、細胞由来等の不要な蛋白質等の非特異的な吸着を抑制できる。厚さが前記上限値以下であれば、被覆層が基材表面に密着しやすい。
≪リガンドの固定化方法≫
特定樹脂組成物で表面を被覆した基材にリガンドを固定化することにより、標的物質を選択的に捕捉可能な基材を製造できる。リガンドを固定化する方法については、共有結合により、基材上の被覆層が有する固定化基に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。たとえば、リガンドを含有する溶液を、リガンドと共有結合する固定化基を備えた被覆層を有する基材に接触させる方法等が挙げられる。
基材表面上の固定化基がスクシンイミド基であり、アミノ基を有するリガンドを固定化する場合には、たとえば、基材表面が、リガンドをpH7.0〜10.0の一般的な緩衝液に混合した溶液に接触する状態で所定時間インキュベートすることにより、リガンドを固定化基に結合させられる。該緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
特定樹脂組成物で表面を被覆した基材にリガンドを固定化することにより、標的物質を選択的に捕捉可能な基材を製造できる。リガンドを固定化する方法については、共有結合により、基材上の被覆層が有する固定化基に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。たとえば、リガンドを含有する溶液を、リガンドと共有結合する固定化基を備えた被覆層を有する基材に接触させる方法等が挙げられる。
基材表面上の固定化基がスクシンイミド基であり、アミノ基を有するリガンドを固定化する場合には、たとえば、基材表面が、リガンドをpH7.0〜10.0の一般的な緩衝液に混合した溶液に接触する状態で所定時間インキュベートすることにより、リガンドを固定化基に結合させられる。該緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
基材が細胞培養用である場合、固定化するリガンドとしては、標的細胞の細胞表面に特異的に結合する物質であれば特別な限定はなく、たとえば、抗体、抗体断片、アプタマー、細胞接着性因子等が挙げられる。
抗体は、たとえば、マウス等のげっ歯類の動物に標識ペプチドを抗原として免疫することによって作製することができる。また、たとえば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。
アプタマーとは、目的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー等が挙げられる。目的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、たとえば酵母を用いたTwo−hybrid法等により選別することができる。
細胞接着性因子は、細胞の接着を担う分子の総称である。細胞接着性因子としては、たとえば、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジン等が挙げられ、これらに限定されない。細胞接着性因子は、培養する細胞によって適宜選択することができる。
天然物由来の細胞接着性因子は、天然物から公知の回収法および精製法により直接得てもよいし、または、公知の遺伝子組換え技術により、当該蛋白質をコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法および精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、たとえば、試薬キットPROTEIOSTM(東洋紡)、TNTTM System(プロメガ)、合成装置のPG−MateTM(東洋紡)およびRTS(ロシュ・ダイアグノスティクス)等を用いた無細胞蛋白質合成系により当該蛋白質を産生し、公知の回収法および精製法により得てもよく限定されない。
また、化学合成した細胞接着性因子は、公知の蛋白質合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、たとえば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、カルボイミダゾール法および酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができる。市販の蛋白質合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィ等の公知の精製法を組み合わせて細胞接着性因子を精製することができる。
リガンドと結合する標的物質としては、特別な限定はなく、たとえば、抗原、抗体、薬剤(合成化合物または天然由来の化合物)、核酸、細胞等が挙げられる。
基材は、リガンドと固定化基が共有結合しているため、標的物質と結合させる場合でも、リガンドは基材に安定的に固定されており、不用意に遊離することはない。
≪固定化基の不活性化処理≫
リガンド固定後は、リガンドと固定化基との反応のための溶液を除去後、リガンドの固定化に関与しなかった固定化基を不活性化処理することが好ましい。不活性化処理は、固定化基の種類に応じ、蛋白質との結合性を有さない他の基に変更させることによって行うことができる。たとえば、固定化基がマレイミド基またはスクシンイミド基である場合は、メルカプトエタノール等の還元剤で不活化処理することができる。固定化基がチオール基である場合は、ヨード酢酸、N−エチルマレイミド等で不活性化処理することができる。固定化基がヒドラジノ基である場合は、無水酢酸、無水コハク酸等の酸無水物で不活化処理することができる。
リガンド固定後は、リガンドと固定化基との反応のための溶液を除去後、リガンドの固定化に関与しなかった固定化基を不活性化処理することが好ましい。不活性化処理は、固定化基の種類に応じ、蛋白質との結合性を有さない他の基に変更させることによって行うことができる。たとえば、固定化基がマレイミド基またはスクシンイミド基である場合は、メルカプトエタノール等の還元剤で不活化処理することができる。固定化基がチオール基である場合は、ヨード酢酸、N−エチルマレイミド等で不活性化処理することができる。固定化基がヒドラジノ基である場合は、無水酢酸、無水コハク酸等の酸無水物で不活化処理することができる。
<細胞培養方法>
一実施形態として、本発明は、基材の表面上のマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基に、標的細胞の細胞表面と特異的に結合する部位を有するリガンドを結合させる工程と、前記リガンドを結合させた基材に、標的細胞を接触させて、前記リガンドに前記標的細胞を結合させる工程と、前記リガンドに結合した前記標的細胞を培養する工程と、を有する、細胞培養方法を提供する。
一実施形態として、本発明は、基材の表面上のマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基に、標的細胞の細胞表面と特異的に結合する部位を有するリガンドを結合させる工程と、前記リガンドを結合させた基材に、標的細胞を接触させて、前記リガンドに前記標的細胞を結合させる工程と、前記リガンドに結合した前記標的細胞を培養する工程と、を有する、細胞培養方法を提供する。
本発明の細胞培養方法によれば、固定化されたリガンドと特異的に結合する標的細胞を含む生体試料を基材表面上に接触させることで、標的細胞のみを選択的に捕捉して純化培養することができる。また、固定化するリガンドの種類を適宜選択することで、多種多様な細胞を培養することができる。
≪リガンドの結合工程≫
上述の≪リガンドの固定化方法≫と同様の方法により、リガンドを基材表面上に固定化することができる。また、リガンドとしては、上記と同様のものを用いることができる。
上述の≪リガンドの固定化方法≫と同様の方法により、リガンドを基材表面上に固定化することができる。また、リガンドとしては、上記と同様のものを用いることができる。
≪標的細胞の結合工程≫
続いて、リガンドが固定化された基板に、標的細胞を含む生体試料を接触させて、標的細胞を基材表面上のリガンドと結合させることによって選択的に捕捉する。リガンドと標的細胞の結合は、可逆的であってもよく、非可逆的であってもよい。
生体試料としては、特別な限定はなく、たとえば、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、涙液、尿、汗等の体液、組織片から調製された細胞の懸濁液等が挙げられる。該基板に接触させる生体試料としては、生物から採取されたものを緩衝液等で希釈する等の前処理を行ったものであってもよい。
標的細胞と基材とを接触させる時間は、1〜24時間であればよい。
続いて、リガンドが固定化された基板に、標的細胞を含む生体試料を接触させて、標的細胞を基材表面上のリガンドと結合させることによって選択的に捕捉する。リガンドと標的細胞の結合は、可逆的であってもよく、非可逆的であってもよい。
生体試料としては、特別な限定はなく、たとえば、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、涙液、尿、汗等の体液、組織片から調製された細胞の懸濁液等が挙げられる。該基板に接触させる生体試料としては、生物から採取されたものを緩衝液等で希釈する等の前処理を行ったものであってもよい。
標的細胞と基材とを接触させる時間は、1〜24時間であればよい。
≪培養工程≫
続いて、充分量の培地を加えて、標的細胞を培養する。培養する時間は、細胞の種類によって適宜設定することができる。培養前に、培地を用いて、標的細胞以外の物質、例えば、生体試料に含まれていた蛋白質、死細胞、標的細胞以外の細胞等を洗浄してもよい。
続いて、充分量の培地を加えて、標的細胞を培養する。培養する時間は、細胞の種類によって適宜設定することができる。培養前に、培地を用いて、標的細胞以外の物質、例えば、生体試料に含まれていた蛋白質、死細胞、標的細胞以外の細胞等を洗浄してもよい。
使用する培地は、細胞の生存増殖に必要な成分(無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン)等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。たとえば、DMEM、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI−1640、Basal Medium Eagle(BME)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F−12(DMEM/F−12)、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)等が挙げられる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
[製造例1]
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
1L(リットル)の3つ口フラスコに、ヘキサエチレングリコール45.2g(160mmol)、パラトルエンスルホン酸クロリド7.63g(40mmol)およびクロロホルム400mlを加えた。続いて、得られた混合物にトリエチルアミン5.70g(56mmol)、クロロホルム100mLの混合物を0℃、窒素雰囲気下で滴下し、その後室温で16時間攪拌した。続いて、得られた反応混合物を1L分液ロートに移し、1N塩酸水溶液で1回、飽和食塩水で2回有機層を洗浄した。続いて、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した後、酢酸エチル:メタノール=9:1(vol)を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。無色透明液体(下記化合物A)が得られ、収量は13.0g、収率は74.7%であった。
[製造例1]
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
1L(リットル)の3つ口フラスコに、ヘキサエチレングリコール45.2g(160mmol)、パラトルエンスルホン酸クロリド7.63g(40mmol)およびクロロホルム400mlを加えた。続いて、得られた混合物にトリエチルアミン5.70g(56mmol)、クロロホルム100mLの混合物を0℃、窒素雰囲気下で滴下し、その後室温で16時間攪拌した。続いて、得られた反応混合物を1L分液ロートに移し、1N塩酸水溶液で1回、飽和食塩水で2回有機層を洗浄した。続いて、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した後、酢酸エチル:メタノール=9:1(vol)を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。無色透明液体(下記化合物A)が得られ、収量は13.0g、収率は74.7%であった。
次に、1L2つ口フラスコに、マレイミド29.1g(300mmol)、フラン61.3g(900mmol)、ジブチルヒドロキシトルエン22mg(0.1mmol)およびトルエン600mLを加えた。続いて、得られた混合物を60℃、窒素雰囲気下で24時間撹拌し、反応液を氷冷した後、析出した結晶をろ過し、冷トルエンで洗浄した。白色粉末(下記化合物B)が得られ、収量は43.5g、収率は87.8%であった。
次に、500mL2つ口フラスコに、化合物A13.0g(30mmol)、化合物B7.43g(45mmol)、炭酸カリウム20.7g(150mmol)およびアセトニトリル300mLを加えた。続いて、得られた混合物を窒素雰囲気下で2時間還流撹拌した。続いて、得られた反応混合物を1L分液ロートに移し、クロロホルム500mLを加え、1N塩酸水溶液で1回、飽和食塩水で2回有機層を洗浄した。続いて、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した後、酢酸エチル:メタノール=8:2(vol)を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。無色透明液体(下記化合物C)が得られ、収量は6.29g、収率は48.8%であった。
得られた化合物Cを1H−NMRにて測定した結果は下記の通りである。
1H−NMR(300MHz、CDCl3)δ=6.52(2H、CH=CH)、5.26(2H、CHOCH)、3.69−3.60(2H+20H+2H、NCH2、CH2OCH2、CH2CH2OH)、2.87(2H、CHCHCON)。
1H−NMR(300MHz、CDCl3)δ=6.52(2H、CH=CH)、5.26(2H、CHOCH)、3.69−3.60(2H+20H+2H、NCH2、CH2OCH2、CH2CH2OH)、2.87(2H、CHCHCON)。
次に、300mLの3つ口フラスコに、化合物C6.01g(14mmol)、トリエチルアミン2.83g(28mmol)およびクロロホルム100mLを加えた。続いて、得られた混合物に、メタクリル酸クロリド1.76g(16.8mmol)およびクロロホルム50mLの混合物を0℃、窒素雰囲気下で滴下し、その後室温で1時間攪拌した。続いて、得られた反応混合物を500mL分液ロートに移し、1N塩酸水溶液で1回、飽和食塩水で2回有機層を洗浄した。続いて、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した後、酢酸エチル:メタノール=9:1(vol)を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。無色透明液体(下記化合物D)が得られ、収量は4.86g収率は69.8%であった。
得られた化合物Dを1H−NMRにて測定した結果は下記の通りである。
1H−NMR(300MHz、CDCl3)δ=6.51(2H、CH=CH)、6.13(1H、C(CH3)CH2)、5.58(1H、C(CH3)CH2)、5.26(2H、CHOCH)、4.30(2H、COOCH2)、3.76−3.60(20H+2H、CH2OCH2、CH2N)、2.86(2H、NCOCHCH)、1.95(3H、CCH3)。
1H−NMR(300MHz、CDCl3)δ=6.51(2H、CH=CH)、6.13(1H、C(CH3)CH2)、5.58(1H、C(CH3)CH2)、5.26(2H、CHOCH)、4.30(2H、COOCH2)、3.76−3.60(20H+2H、CH2OCH2、CH2N)、2.86(2H、NCOCHCH)、1.95(3H、CCH3)。
(2)疎水性基を有する単位と固定化基を有する単位とを有する重合体の調製
100mLの3つ口フラスコに、メチルメタクリレート1.80g(18mmol)、D0.995g(2mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)28.0mg(0.113mmol)、およびトルエン11.2gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Eを得た。収量は1.47g、収率は52.5%であった。
100mLの3つ口フラスコに、メチルメタクリレート1.80g(18mmol)、D0.995g(2mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)28.0mg(0.113mmol)、およびトルエン11.2gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Eを得た。収量は1.47g、収率は52.5%であった。
次に、マレイミド基の保護基であるフランを脱離するために、100mLのフラスコに、重合体E1.0g、ジブチルヒドロキシトルエン1mg(4.5μmol)、およびトルエン20gを加えた。続いて、得られた混合物を3時間還流撹拌し、氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Fを0.76g得た。
[製造例2]
(1)疎水性基を有する単位と生体親和性基を有する単位とを有する重合体の調製
100mL3つ口フラスコに、トリエチレングリコールモノエチルエーテルモノメタクリレート4.93g(20mmol)、メチルメタクリレート2.00g(20mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)69.3mg(0.279mmol)、およびトルエン27.7gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Gを得た。
(1)疎水性基を有する単位と生体親和性基を有する単位とを有する重合体の調製
100mL3つ口フラスコに、トリエチレングリコールモノエチルエーテルモノメタクリレート4.93g(20mmol)、メチルメタクリレート2.00g(20mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)69.3mg(0.279mmol)、およびトルエン27.7gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Gを得た。
[製造例3]
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
ヘキサエチレングリコールの代わりに1,3−プロパンジオールを用いた以外は製造例1と同様の方法で、固定化基を有する単位の由来元となるモノマーを調製し、化合物Hを得た。
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
ヘキサエチレングリコールの代わりに1,3−プロパンジオールを用いた以外は製造例1と同様の方法で、固定化基を有する単位の由来元となるモノマーを調製し、化合物Hを得た。
(2)疎水性基を有する単位と固定化基を有する単位とを有する重合体の調製
100mLの3つ口フラスコに、メチルメタクリレート2.70g(27mmol)、化合物H0.87g(3mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)35.7mg(0.144mmol)、およびトルエン14.3gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Iを得た。収量は1.53g、収率は42.9%であった。
100mLの3つ口フラスコに、メチルメタクリレート2.70g(27mmol)、化合物H0.87g(3mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)35.7mg(0.144mmol)、およびトルエン14.3gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Iを得た。収量は1.53g、収率は42.9%であった。
次に、マレイミド基の保護基であるフランを脱離するために、100mLのフラスコに、重合体Iの1.0g、ジブチルヒドロキシトルエン1mg(4.5μmol)、およびトルエン20gを加えた。続いて、得られた混合物を3時間還流撹拌し、氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Jを0.82g得た。
[製造例4]
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
ヘキサエチレングリコールの代わりに1,6−ヘキサンジオールを用いた以外は製造例1と同様の方法で、固定化基を有する単位の由来元となるモノマーを調製し、化合物Kを得た。
(1)固定化基を有する単位の由来元となるモノマーの調製
ヘキサエチレングリコールの代わりに1,6−ヘキサンジオールを用いた以外は製造例1と同様の方法で、固定化基を有する単位の由来元となるモノマーを調製し、化合物Kを得た。
(2)疎水性基を有する単位と固定化基を有する単位とを有する重合体の調製
100mL3つ口フラスコに、メチルメタクリレート3.60g(36mmol)、化合物K1.33g(4mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)49.3mg(0.198mmol)、およびトルエン19.7gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Lを得た。収量は0.68g、収率は13.8%であった。
100mL3つ口フラスコに、メチルメタクリレート3.60g(36mmol)、化合物K1.33g(4mmol)、2,2'-アゾビス(2,4‐ジメチルバレロニトリル)49.3mg(0.198mmol)、およびトルエン19.7gを加えた。続いて、反応液中の単量体の濃度を20質量%、開始剤濃度を1質量%とした。続いて、得られた混合物を58℃、窒素雰囲気下で16時間撹拌し、反応液を氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Lを得た。収量は0.68g、収率は13.8%であった。
次に、マレイミド基の保護基であるフランを脱離するために、100mLフラスコに、重合体L0.5g、ジブチルヒドロキシトルエン1mg(4.5μmol)、およびトルエン10gを加えた。続いて、得られた混合物を3時間還流撹拌し、氷冷した後、ヘキサンに滴下することにより重合体を沈殿させた。続いて、得られた重合体を充分にヘキサンで洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の重合体Mを0.37g得た。
[例1]
製造例1で得られた重合体Fと、製造例2で得られた重合体Gとをその重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0、50:50および0:100になるように秤量し、その濃度が0.1質量%となるようにAK−225(旭硝子社製)に溶解させ、塗布液を調製した。続いて、該塗布液を24ウェルのマイクロプレート(ATG社製)に2.2mLずつ各3ウェルに分注し、1日間放置して溶媒を揮発させ、ウェル表面に被覆層を形成した。
製造例1で得られた重合体Fと、製造例2で得られた重合体Gとをその重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0、50:50および0:100になるように秤量し、その濃度が0.1質量%となるようにAK−225(旭硝子社製)に溶解させ、塗布液を調製した。続いて、該塗布液を24ウェルのマイクロプレート(ATG社製)に2.2mLずつ各3ウェルに分注し、1日間放置して溶媒を揮発させ、ウェル表面に被覆層を形成した。
[例2]
重合体(F)の代わりに製造例3で得られた重合体Jを用いて、製造例2で得られた重合体Gとの重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0および50:50になるように秤量した以外は、例1と同様の方法により塗布液を調製した。続いて、該塗布液を用いて、例1と同様に方法により、24ウェルのマイクロプレートのウェル表面に被覆層を形成した。
重合体(F)の代わりに製造例3で得られた重合体Jを用いて、製造例2で得られた重合体Gとの重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0および50:50になるように秤量した以外は、例1と同様の方法により塗布液を調製した。続いて、該塗布液を用いて、例1と同様に方法により、24ウェルのマイクロプレートのウェル表面に被覆層を形成した。
[例3]
重合体(F)の代わりに製造例4で得られた重合体Mを用いて、製造例2で得られた重合体Gとの重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0および50:50になるように秤量した以外は、例1と同様の方法により塗布液を調製した。続いて、該塗布液を用いて、例1と同様に方法により、24ウェルのマイクロプレートのウェル表面に被覆層を形成した。
重合体(F)の代わりに製造例4で得られた重合体Mを用いて、製造例2で得られた重合体Gとの重量比を表2に示すように、100:0、99.5:0.5、99.0:1.0、95.0:5.0,90.0:10.0および50:50になるように秤量した以外は、例1と同様の方法により塗布液を調製した。続いて、該塗布液を用いて、例1と同様に方法により、24ウェルのマイクロプレートのウェル表面に被覆層を形成した。
[試験例1]重合体の耐水溶性試験
製造例1、3、4で得られた重合体F、J、Mのそれぞれ10mgと、水1gとをサンプル管に秤取し、室温で1時間撹拌した後に目視にて耐水溶性を確認した。評価は以下の基準で行った。結果を表1に示す。
<評価基準>
○(良好):含フッ素重合体が残存していた。
×(不良):含フッ素重合体が完全に溶解し、残存していなかった。
製造例1、3、4で得られた重合体F、J、Mのそれぞれ10mgと、水1gとをサンプル管に秤取し、室温で1時間撹拌した後に目視にて耐水溶性を確認した。評価は以下の基準で行った。結果を表1に示す。
<評価基準>
○(良好):含フッ素重合体が残存していた。
×(不良):含フッ素重合体が完全に溶解し、残存していなかった。
表1より、各重合体は充分に耐水溶性を有することが確認できた。
[試験例2]マイクロプレートの蛋白質非吸着性確認試験
(1)発色液、蛋白質溶液の調製
発色液は、ペルオキシダーゼ発色液(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMBZ)、KPL社製)50mLとTMB Peroxidase Substrate(KPL社製)50mLとを混合したものを使用した。また、蛋白質溶液として、蛋白質(POD−goat anti mouse IgG、Biorad社)をリン酸緩衝溶液(D−PBS、Sigma社製)で16,000倍に希釈したものを使用した。
(1)発色液、蛋白質溶液の調製
発色液は、ペルオキシダーゼ発色液(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMBZ)、KPL社製)50mLとTMB Peroxidase Substrate(KPL社製)50mLとを混合したものを使用した。また、蛋白質溶液として、蛋白質(POD−goat anti mouse IgG、Biorad社)をリン酸緩衝溶液(D−PBS、Sigma社製)で16,000倍に希釈したものを使用した。
(2)蛋白質の吸着
例1〜3で得られた被覆層を形成した24ウェルマイクロプレートにおいて、それぞれ被覆層を形成したウェルに蛋白質溶液の2mLを分注し(1ウェル毎に2mL分注)、室温で1時間放置した。ブランクとして、何も被覆されていない96ウェルマイクロプレートにおいて、3ウェルに蛋白質溶液の2μLを分注(1ウェル毎に2μL分注)した。
例1〜3で得られた被覆層を形成した24ウェルマイクロプレートにおいて、それぞれ被覆層を形成したウェルに蛋白質溶液の2mLを分注し(1ウェル毎に2mL分注)、室温で1時間放置した。ブランクとして、何も被覆されていない96ウェルマイクロプレートにおいて、3ウェルに蛋白質溶液の2μLを分注(1ウェル毎に2μL分注)した。
(3)ウェルの洗浄
次いで、24ウェルマイクロプレートを、界面活性剤(Tween20、和光純薬社製)を0.05質量%含ませたリン酸緩衝溶液(D−PBS、Sigma社製)の4mLで4回洗浄した(1ウェル毎に4mLを使用)。
次いで、24ウェルマイクロプレートを、界面活性剤(Tween20、和光純薬社製)を0.05質量%含ませたリン酸緩衝溶液(D−PBS、Sigma社製)の4mLで4回洗浄した(1ウェル毎に4mLを使用)。
(4)発色液の分注
次いで、洗浄を終えた24ウェルマイクロプレートに、発色液の2mLを分注し(1ウェル毎に2mLを使用)、7分間発色反応を行った。2N硫酸の1mLを加えることで(1ウェル毎に1mLを使用)発色反応を停止させた。ブランクは、96ウェルマイクロプレートに、発色液の100μLを分注し(1ウェル毎に100μLを使用)、7分間発色反応を行い、2N硫酸の50μLを加えることで(1ウェル毎に50μLを使用)発色反応を停止させた。
次いで、洗浄を終えた24ウェルマイクロプレートに、発色液の2mLを分注し(1ウェル毎に2mLを使用)、7分間発色反応を行った。2N硫酸の1mLを加えることで(1ウェル毎に1mLを使用)発色反応を停止させた。ブランクは、96ウェルマイクロプレートに、発色液の100μLを分注し(1ウェル毎に100μLを使用)、7分間発色反応を行い、2N硫酸の50μLを加えることで(1ウェル毎に50μLを使用)発色反応を停止させた。
(5)吸光度測定および蛋白質吸着率Qの計算
次いで、24ウェルマイクロプレートの各ウェルから150μLの液を取り、96ウェルマイクロプレートに移した。吸光度は、MTP−810Lab(コロナ電気社製)により450nmの吸光度を測定した。ここで、ブランクの吸光度(N=3)の平均値をA0とした。24ウェルマイクロプレートから96ウェルマイクロプレートに移動させた液の吸光度をA1とした。蛋白質吸着率Q1を下式により求め、蛋白質吸着率Qはその平均値とした。結果を表2に示す。Qは0.2%以下が好ましく、0.1%以下がより好ましい。
Q1=A1/{A0×(100/ブランクの蛋白質溶液の分注量)}×100
=A1/{A0×(100/2μL)}×100 [%]
次いで、24ウェルマイクロプレートの各ウェルから150μLの液を取り、96ウェルマイクロプレートに移した。吸光度は、MTP−810Lab(コロナ電気社製)により450nmの吸光度を測定した。ここで、ブランクの吸光度(N=3)の平均値をA0とした。24ウェルマイクロプレートから96ウェルマイクロプレートに移動させた液の吸光度をA1とした。蛋白質吸着率Q1を下式により求め、蛋白質吸着率Qはその平均値とした。結果を表2に示す。Qは0.2%以下が好ましく、0.1%以下がより好ましい。
Q1=A1/{A0×(100/ブランクの蛋白質溶液の分注量)}×100
=A1/{A0×(100/2μL)}×100 [%]
(6)結果
表2において、例1−1、1−7、2−6、及び3−6は比較例である。例1−2〜1−6、例2−1〜2−5、及び例3−1〜3−5は実施例である。
表2より、例1〜3において、生体親和性を有する基を有する単位を有することにより、蛋白質の非特異的な吸着が抑制されていることが確かめられた。例1−7、2−6及び3−6は蛋白質吸着率が0.2%超であり非特異的吸着がおきていることがわかる。また、例1−7の結果より、例1の重合体については、重合体Fのリンカーがポリエチレングリコール基であるため、蛋白質の非特異的な吸着が抑制される傾向ではあるが、他の実施例と比較すると抑制は充分ではない。
表2において、例1−1、1−7、2−6、及び3−6は比較例である。例1−2〜1−6、例2−1〜2−5、及び例3−1〜3−5は実施例である。
表2より、例1〜3において、生体親和性を有する基を有する単位を有することにより、蛋白質の非特異的な吸着が抑制されていることが確かめられた。例1−7、2−6及び3−6は蛋白質吸着率が0.2%超であり非特異的吸着がおきていることがわかる。また、例1−7の結果より、例1の重合体については、重合体Fのリンカーがポリエチレングリコール基であるため、蛋白質の非特異的な吸着が抑制される傾向ではあるが、他の実施例と比較すると抑制は充分ではない。
[試験例3]プレートのペプチドの選択的固定化確認試験
(1)重合体を被覆したプレートの調製
例1〜3で得られた被覆層を形成した24ウェルマイクロプレートにおいて、表2の例1−5、例2−4、例3−4の割合の重合体が被覆されたウェルを用いた。
(1)重合体を被覆したプレートの調製
例1〜3で得られた被覆層を形成した24ウェルマイクロプレートにおいて、表2の例1−5、例2−4、例3−4の割合の重合体が被覆されたウェルを用いた。
(2)ペプチドの固定化
次に、細胞接着活性のあるRGDペプチド (システイン含有)が1ウェルにつき0.1μmolとなるように分注し、ウェル内のマレイミドと反応させ、共有結合による容器への固定化を行った。
次に、細胞接着活性のあるRGDペプチド (システイン含有)が1ウェルにつき0.1μmolとなるように分注し、ウェル内のマレイミドと反応させ、共有結合による容器への固定化を行った。
(3)Ellman試薬を用いた未反応のペプチドの定量
次に、2−ニトロ−5−メルカプト安息香酸(TNB)溶液を10μLずつ分注した。TNB溶液は、遊離のチオール基と反応して黄色に呈色する。経時的に未反応のRGDペプチド (システイン含有)を呈色し、吸光度を測定することにより定量化し、反応前のペプチドに対する残存するペプチドの割合を計算した。結果を図1に示す。
次に、2−ニトロ−5−メルカプト安息香酸(TNB)溶液を10μLずつ分注した。TNB溶液は、遊離のチオール基と反応して黄色に呈色する。経時的に未反応のRGDペプチド (システイン含有)を呈色し、吸光度を測定することにより定量化し、反応前のペプチドに対する残存するペプチドの割合を計算した。結果を図1に示す。
(4)結果
図1から、例1〜3の全てにおいて、残存するペプチドの割合が経時的に減っていた。さらに、例2および3については、ペプチドとマレイミド基との反応効率がより優れていることが明らかとなった。
図1から、例1〜3の全てにおいて、残存するペプチドの割合が経時的に減っていた。さらに、例2および3については、ペプチドとマレイミド基との反応効率がより優れていることが明らかとなった。
[試験例4]プレートの細胞接着確認試験
(1)重合体を被覆したプレートの調製
製造例1で得られた化合物Dとメチルメタクリレートとの反応させるモル比を調節して、5種類の重合体Fを調製した。続いて、5種類の重合体Fと重合体Gとをそれぞれ10:90の重量比で混合して、5種類のプレートに被覆する重合体を得た。得られた重合体中に含まれるマレイミド基を有する単位の量は、それぞれ0、0.02、0.19、0.95、1.85μmolであった。
(1)重合体を被覆したプレートの調製
製造例1で得られた化合物Dとメチルメタクリレートとの反応させるモル比を調節して、5種類の重合体Fを調製した。続いて、5種類の重合体Fと重合体Gとをそれぞれ10:90の重量比で混合して、5種類のプレートに被覆する重合体を得た。得られた重合体中に含まれるマレイミド基を有する単位の量は、それぞれ0、0.02、0.19、0.95、1.85μmolであった。
次いで、各得られた重合体について、その濃度が0.1質量%となるようにAK−225(旭硝子社製)に溶解させ、塗布液を調製した。続いて、調製した塗布液を24ウェルのマイクロプレート(ATG社製)に2.2mLずつ各縦4ウェルに分注し、1日間放置して溶媒を揮発させ、ウェル表面に被覆層を形成した。コントロールとして、一番左側の縦4ウェルについては、未処理のままとした。
(2)マレイミド基の不活性化処理
重合体中に含まれるマレイミド基が蛋白質を特異的に固定化することを確認するために、ネガティブコントロールとして、24ウェルマイクロプレートの一番下の1行(6ウェル)に対して、以下の方法により、マレイミド基の不活性化処理を施した。
まず、粉末のシステインを10mg/mLとなるよう、PBSで溶解し、システイン溶液を調製した。続いて、該システイン溶液に、終濃度100mMとなるようにジチオトレイトール (dithiothreitol;DTT)(和光純薬)を溶解した。続いて、該DTT含有システイン溶液を24ウェルマイクロプレートの一番下の1行(6ウェル)に300μLずつ分注し、室温で3時間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄した。
重合体中に含まれるマレイミド基が蛋白質を特異的に固定化することを確認するために、ネガティブコントロールとして、24ウェルマイクロプレートの一番下の1行(6ウェル)に対して、以下の方法により、マレイミド基の不活性化処理を施した。
まず、粉末のシステインを10mg/mLとなるよう、PBSで溶解し、システイン溶液を調製した。続いて、該システイン溶液に、終濃度100mMとなるようにジチオトレイトール (dithiothreitol;DTT)(和光純薬)を溶解した。続いて、該DTT含有システイン溶液を24ウェルマイクロプレートの一番下の1行(6ウェル)に300μLずつ分注し、室温で3時間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄した。
(3)ペプチドの固定化
次に、細胞接着活性のあるRGDペプチド (システイン含有)を低濃度(0.02μmol)と高濃度(0.2μmol)でウェル内のマレイミドと反応させ、共有結合による容器への固定化を行った。
まず、粉末のRGDペプチド (システイン含有)5mgをPBSの724μLに溶解して、10mMのペプチド溶液を調製した。続いて、PBSで20倍に希釈して高濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液と、PBSで200倍に希釈して低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液とを調製した。続いて、低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を上から2番目の1行(6ウェル)に、高濃度のRGDペプチド(システイン含有)溶液を上から3番目および4番目の2行(12ウェル)に、それぞれ400μLずつ分注し、4℃で一晩反応させた。このとき、低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を分注した1ウェル中に含まれるペプチドの量は、0.02μmolであり、高濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を分注した1ウェル中に含まれるペプチドの量は、0.2μmolであった。続いて、上清を除き、PBSで3回洗浄した。
次に、細胞接着活性のあるRGDペプチド (システイン含有)を低濃度(0.02μmol)と高濃度(0.2μmol)でウェル内のマレイミドと反応させ、共有結合による容器への固定化を行った。
まず、粉末のRGDペプチド (システイン含有)5mgをPBSの724μLに溶解して、10mMのペプチド溶液を調製した。続いて、PBSで20倍に希釈して高濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液と、PBSで200倍に希釈して低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液とを調製した。続いて、低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を上から2番目の1行(6ウェル)に、高濃度のRGDペプチド(システイン含有)溶液を上から3番目および4番目の2行(12ウェル)に、それぞれ400μLずつ分注し、4℃で一晩反応させた。このとき、低濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を分注した1ウェル中に含まれるペプチドの量は、0.02μmolであり、高濃度のRGDペプチド (システイン含有)溶液を分注した1ウェル中に含まれるペプチドの量は、0.2μmolであった。続いて、上清を除き、PBSで3回洗浄した。
(4)未反応のマレイミド基の不活性化処理
RGDペプチド (システイン含有)が固定化されていないマレイミド基と、細胞分泌因子または細胞自身が結合することを防ぐために、細胞を播種する前に、重合体中に残存する未反応のマレイミド基の不活性化処理を行った。
まず、24ウェル全てに(1)で調製したDTT含有システイン溶液を400μLずつ分注し、室温で3時間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄した。
RGDペプチド (システイン含有)が固定化されていないマレイミド基と、細胞分泌因子または細胞自身が結合することを防ぐために、細胞を播種する前に、重合体中に残存する未反応のマレイミド基の不活性化処理を行った。
まず、24ウェル全てに(1)で調製したDTT含有システイン溶液を400μLずつ分注し、室温で3時間反応させた。続いて、PBSで3回洗浄した。
(5)細胞播種
細胞接着性を確認するために、TIG−3細胞を用いた細胞接着アッセイを実施した。TIG−3細胞とは、日本人の男性10週胎児肺の組織片より、トリプシン法でとられた線維芽細胞である。TIG−3細胞は、10%ウシ胎児血清(Thermo Fisher Scientific社)を含むMEM培地(Thermo Fisher Scientific社)(以下、維持培地と記載)を用いて、5%二酸化炭素を通気したCO2インキュベーター中、37℃で継代培養を行ったものを用いた。
まず、100mmディッシュで培養したTIG−3細胞を5mLPBSで洗浄した。続いて、細胞剥離溶液としてTrypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific社)を1mL加え、37℃で3分間反応させた。続いて、維持培地9mLを加え、剥離溶液を希釈して反応を停止した。続いて、15mL遠沈管へ移し、遠心を行った(160×g,5min)。続いて、上清を除き、血清を含まないMEM培地5mLに懸濁し、再度遠心を行った(160×g,5min)。血清成分を除くため、上記の血清を含まないMEM培地を用いた洗浄を2回行った。続いて、MEM培地に懸濁し、細胞数を計測し、5×105 cell/mLとなるように調整した。続いて、24ウェルマイクロプレートの各ウェルに300μLずつ細胞懸濁液を播種し、37℃で1時間、CO2インキュベーター内で静置した。続いて、培養上清を除き、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所)を全体の1/10量含むMEM培地を各ウェルに300μLずつ分注した。1時間後、培養上清を回収し、そのうちの100μLを用いて450nmの吸光度を計測した。得られた吸光度を用いて、接着した細胞数を定量化した。結果を図2および図3に示す。
細胞接着性を確認するために、TIG−3細胞を用いた細胞接着アッセイを実施した。TIG−3細胞とは、日本人の男性10週胎児肺の組織片より、トリプシン法でとられた線維芽細胞である。TIG−3細胞は、10%ウシ胎児血清(Thermo Fisher Scientific社)を含むMEM培地(Thermo Fisher Scientific社)(以下、維持培地と記載)を用いて、5%二酸化炭素を通気したCO2インキュベーター中、37℃で継代培養を行ったものを用いた。
まず、100mmディッシュで培養したTIG−3細胞を5mLPBSで洗浄した。続いて、細胞剥離溶液としてTrypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific社)を1mL加え、37℃で3分間反応させた。続いて、維持培地9mLを加え、剥離溶液を希釈して反応を停止した。続いて、15mL遠沈管へ移し、遠心を行った(160×g,5min)。続いて、上清を除き、血清を含まないMEM培地5mLに懸濁し、再度遠心を行った(160×g,5min)。血清成分を除くため、上記の血清を含まないMEM培地を用いた洗浄を2回行った。続いて、MEM培地に懸濁し、細胞数を計測し、5×105 cell/mLとなるように調整した。続いて、24ウェルマイクロプレートの各ウェルに300μLずつ細胞懸濁液を播種し、37℃で1時間、CO2インキュベーター内で静置した。続いて、培養上清を除き、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所)を全体の1/10量含むMEM培地を各ウェルに300μLずつ分注した。1時間後、培養上清を回収し、そのうちの100μLを用いて450nmの吸光度を計測した。得られた吸光度を用いて、接着した細胞数を定量化した。結果を図2および図3に示す。
(6)結果
図2より、プレート内の未処理のウェルに関しては、RGDペプチド (システイン含有)の有無にかかわらず、多くの細胞が接着する傾向が観察された (図2中の「未処理」の列参照。)。一方、マレイミド基を含まない重合体では (図2中の重合中に含まれるマレイミド基の量「0」の列参照。)、細胞接着がほとんど見られなかったことから、重合体の基本的性質である細胞接着抑制効果を確認することができた。
また、図3よりRGDペプチド (システイン含有)を固定化したウェルでは、重合体中に含まれるマレイミド基の量と相関して、接着細胞数が増加する傾向が確認された (図3中のRGD(低濃度)およびRGD(高濃度)参照。)。この傾向は、マレイミド基をシステイン溶液で不活性化処理したウェルでは、見られず (図3中のRGD(マレイミド不活性化)参照。)、細胞がペプチドに接着していること、そのペプチドが重合体に含まれるマレイミド基を介して固定化されていることが示された。
図2より、プレート内の未処理のウェルに関しては、RGDペプチド (システイン含有)の有無にかかわらず、多くの細胞が接着する傾向が観察された (図2中の「未処理」の列参照。)。一方、マレイミド基を含まない重合体では (図2中の重合中に含まれるマレイミド基の量「0」の列参照。)、細胞接着がほとんど見られなかったことから、重合体の基本的性質である細胞接着抑制効果を確認することができた。
また、図3よりRGDペプチド (システイン含有)を固定化したウェルでは、重合体中に含まれるマレイミド基の量と相関して、接着細胞数が増加する傾向が確認された (図3中のRGD(低濃度)およびRGD(高濃度)参照。)。この傾向は、マレイミド基をシステイン溶液で不活性化処理したウェルでは、見られず (図3中のRGD(マレイミド不活性化)参照。)、細胞がペプチドに接着していること、そのペプチドが重合体に含まれるマレイミド基を介して固定化されていることが示された。
また、図3から、マレイミド基の量が0.02μmolであるとき、ペプチドの濃度依存性が見られなかった。これは、マレイミド基へのペプチドの結合が飽和しているであると推察される。
また、マレイミド基の量が0.19μmolであるとき、ペプチドの濃度依存的な細胞接着活性が検出された。これはマレイミド基が充分量存在するためであると推察される。
また、マレイミド基が0.95または1.85μmolであるとき、未処理のウェルおよびマレイミド基を不活性化させたウェルにおいて、吸光度が上昇していた。これは、マレイミド基が多く、生体親和性を有する基(本試験例においては、ポリエチレングリコール基)の割合が相対的に減少するため、細胞由来の蛋白質が非特異的に吸着したためであると推察される。
よって、RGDペプチド(システイン含有)の量が0.2μmolであって、マレイミド基の量が0.19μmolで結合させることが最適であり、目的の蛋白質と固定化基の量は、同程度であることが望ましいことが示唆された。
また、マレイミド基の量が0.19μmolであるとき、ペプチドの濃度依存的な細胞接着活性が検出された。これはマレイミド基が充分量存在するためであると推察される。
また、マレイミド基が0.95または1.85μmolであるとき、未処理のウェルおよびマレイミド基を不活性化させたウェルにおいて、吸光度が上昇していた。これは、マレイミド基が多く、生体親和性を有する基(本試験例においては、ポリエチレングリコール基)の割合が相対的に減少するため、細胞由来の蛋白質が非特異的に吸着したためであると推察される。
よって、RGDペプチド(システイン含有)の量が0.2μmolであって、マレイミド基の量が0.19μmolで結合させることが最適であり、目的の蛋白質と固定化基の量は、同程度であることが望ましいことが示唆された。
図4は、高濃度のRGDペプチド(システイン含有)を固定化したウェルおよび未処理のウェルでのTIG−3細胞の形体を比較した画像である。図4より、高濃度のRGDペプチド(システイン含有)を固定化したウェルでは、TIG−3細胞は丸い細胞形体を示し、浮き上がっていた。一方、未処理のウェルでは、TIG−3細胞は扁平な形体をとっており、強く伸展していた。この差異は、培養容器に対し、細胞が「点」で接着しているか、「面」で接着しているかの違いによるものであると推測される。
以上の結果から、実施例の重合体が「選択的部分接着」というコンセプト通りの機能を有していることが強く示唆された。
以上の結果から、実施例の重合体が「選択的部分接着」というコンセプト通りの機能を有していることが強く示唆された。
本発明に係る樹脂組成物は、標的物質を選択的に捕捉するための基材の被覆材として好適であり、特に、特的の細胞を選択的に捕捉して、他の蛋白質等の混入をできる限り防止した状態で培養するための細胞培養用基材の被覆材として好適である。
なお、2015年12月24日に出願された日本特許出願2015−251518号の明細書、特許請求の範囲、図面、及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (10)
- マレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基を有する単位(a)と、下記一般式(1)で表される基、一般式(2)で表される基および一般式(3)で表される基からなる群から選ばれる少なくとも1種の基を有する単位(b)と、を有する重合体、または、
前記単位(a)を有する重合体(A)と、前記単位(b)を有する重合体(B)と、を含む、樹脂組成物。
- 前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(A)中に含まれる単位(a)が組成物を構成する単位の総数に対して0.001〜5mol%である請求項1または2に記載の樹脂組成物。
- 前記単位(a)と単位(b)とを有する重合体または前記重合体(B)中に含まれる単位(b)が、組成物を構成する単位の総数に対して5〜60質量%である請求項1〜3のいずれか一項に記載の樹脂組成物。
- 前記一般式(6)で表される基を有する単位(c)が、組成物を構成する単位の総数に対して30〜90質量%含まれる請求項2〜4のいずれか一項に記載の樹脂組成物。
- さらに、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、エポキシ基、(メタ)アクリル基またはグリシジル基からなる架橋性基を有する単位(d)が含まれる請求項2〜5のいいずれか一項に記載の樹脂組成物。
- 前記単位(a)が0.002〜3質量%、前期単位(b)が10〜45質量%、前記単位(c)が50〜80質量%、および前記単位(d)が0〜2.5質量%含まれる請求項6に記載の樹脂組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の樹脂組成物によって、少なくとも表面の一部が被覆された、基材。
- 前記基材が細胞培養用である、請求項8に記載の基材。
- 請求項8に記載の基材の表面上のマレイミド基、スクシンイミド基、チオール基およびヒドラジノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種の官能基に、標的細胞の細胞表面と特異的に結合する部位を有するリガンドを結合させる工程と、
前記リガンドを結合させた基材に、標的細胞を接触させて、前記リガンドに前記標的細胞を結合させる工程と、
前記リガンドに結合した前記標的細胞を培養する工程と、を有する細胞培養方法。
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