KR20180095828A - 수지 조성물, 기재 및 세포 배양 방법 - Google Patents

수지 조성물, 기재 및 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

기재 표면을 피복함으로써, 그 기재 표면에 다종 다양한 표적 물질을 그 표적 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 개재하여 선택적으로 포착할 수 있는 수지 조성물을 제공한다. 본 발명의 수지 조성물은, 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 갖는 단위 (a) 와, 하기 식 (1) 로 나타내는 기, 하기 식 (2) 로 나타내는 기 및 하기 식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 갖는 단위 (b) 를 갖는 중합체, 또는, 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 갖는 단위 (a) 를 갖는 중합체 (A) 와, 하기 식 (1) 로 나타내는 기, 하기 식 (2) 로 나타내는 기 및 하기 식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 갖는 단위 (b) 를 갖는 중합체 (B) 를 포함한다.
Figure pct00030

Description

수지 조성물, 기재 및 세포 배양 방법
본 발명은 특히 특정한 세포를 선택적으로 포착하기 위한 기재 등의 피복재로서 적합한 수지 조성물, 기재 및 세포 배양 방법에 관한 것이다.
소수성 고분자 (폴리염화비닐, 폴리스티렌, 실리콘 수지, 폴리메타크릴산에스테르, 함불소 수지 등) 나, 친수성 고분자 (폴리비닐알코올, 폴리(메타크릴산2-하이드록시에틸), 폴리아크릴아미드 등) 등의 합성 고분자 재료는, 의료용 재료로서 널리 사용되고 있다. 예를 들어, 세포 배양 용기, 카테터, 인공 장기, 어피니티 정제용 담체 등의 의료용 디바이스가 알려져 있다.
그러나, 상기 합성 고분자 재료는 생체 적합성이 불충분한 경우가 많다. 즉, 피브리노겐, 면역 글로블린 G (IgG), 인슐린, 히스테리톤, 탄산 탈수소 효소 등의 단백질이 디바이스 표면에 흡착하기 쉽다. 상기 단백질이 디바이스 표면에 흡착하면, 그 부분에 또한 세포 (혈구, 혈소판 등) 가 접착하기 쉬워진다. 그 때문에, 혈전 형성, 염증 반응 등의 생체에 대한 악영향이나, 디바이스의 열화 등의 문제가 야기된다.
그래서, 합성 고분자 재료를 사용한 의료용 디바이스에서는, 생체막 유사 구조를 갖는 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린의 중합체나, 폴리옥시에틸렌글리콜을 포함하는 고분자 등의 합성 고분자 재료로부터 형성되는 피복층을 표면에 형성하고, 생체 적합성을 높이고 있다.
또, 최근, 다능성 줄기세포에 사용하는 세포 배양 용기로서, 마우스 육종 세포로부터 추출한 단백질을 배양 용기에 도포하는 기술이 개발되어 있다 (비특허문헌 1 참조). 그러나, 재생 의료의 분야에 있어서는, 이종 동물이나 비자기 유래의 세포나 혈청, 단백질 등의 불순물은, 인체에 대하여, 예기치 못한 악영향을 초래할 가능성이 있다. 이들 불특정 인자에 의해 초래되는 리스크를 배제하기 위해서, 이종 동물이나 비자기 유래의 성분을 포함하지 않고, 함유하는 조성이 명확하고, 다능성 줄기세포를 배양 가능한 용기가 요구되고 있다.
특허문헌 1 에는, 기재 표면에 카르복실기를 갖는 (메트)아크릴레이트 모노머 등을 중합시켜 적층하고, 카르복실기에 세포 접착성의 펩티드를 공유 결합시킨 세포 배양 기구가 개시되어 있다. 그 세포 배양 기구에서는, 줄기세포 및 미분화 줄기세포를 포함하는 진핵 세포는, 그 펩티드를 개재하여 고정화하여 배양할 수 있다.
일본 공표특허공보 2011-510655호
Xu, Chunhui., et al., Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells, Nat. Biotech., 19 (10), 971-979, 2001.
특허문헌 1 에 기재된 세포 배양 기구에서는, 기재 표면에 세포 유래의 단백질 등이 비특이적으로 흡착하여, 세포 배양에 악영향을 미칠 가능성이 있다. 또, 카르복실기와 공유 결합 가능한 관능기 (아미노기 등) 밖에 고정화할 수 없다.
본 발명은, 상기 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 기재 표면을 피복함으로써, 단백질 등의 비특이적인 흡착을 억제하면서, 그 기재 표면에, 다종 다양한 표적 물질을, 그 표적 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 개재하여 선택적으로 포착할 수 있는 수지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 양태를 포함한다.
[1] 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 갖는 단위 (a) 와, 하기 일반식 (1) 로 나타내는 기, 일반식 (2) 로 나타내는 기 및 일반식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 갖는 단위 (b) 를 갖는 중합체, 또는, 상기 단위 (a) 를 갖는 중합체 (A) 와, 상기 단위 (b) 를 갖는 중합체 (B) 를 포함하는, 수지 조성물.
[화학식 1]
Figure pct00001
[상기 식 중, 아스테리스크 (★) 는 중합체 주사슬과의 직접적 결합 부위 또는 연결기를 개재한 간접적 결합 부위를 나타낸다. 상기 식 (1) 중, n 은 1 ∼ 10 의 정수를 나타내고, R11 은 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기를 나타낸다. 상기 식 (2) 중, R21 및 R22 는 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기를 나타내고, R23 ∼ R25 는 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기를 나타낸다. 상기 식 (3) 중, R31 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, R34 는 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기를 나타내고, R32 및 R33 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기를 나타낸다. X- 는 하기 식 (4) 로 나타내는 기 또는 하기 식 (5) 로 나타내는 기를 나타낸다. 하기 식 (4) 및 (5) 중, 아스테리스크는 R34 와의 결합 부위를 나타낸다.]
[화학식 2]
Figure pct00002
[2] 또한, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는 중합체 (C) 를 포함하는, 또는, 상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체가, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는, 혹은, 상기 중합체 (A) 및 상기 중합체 (B) 중 적어도 어느 일방이, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는 [1] 에 기재된 수지 조성물.
[화학식 3]
Figure pct00003
[상기 식 (6) 중, 아스테리스크는 중합체 주사슬과의 직접적 결합 부위를 나타내고, Y61 은 단결합 또는 2 가의 유기기를 나타내고, R61 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타낸다.]
[3] 상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체 또는 상기 중합체 (A) 중에 포함되는 단위 (a) 가 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 0.001 ∼ 5 ㏖％ 인 [1] 또는 [2] 에 기재된 수지 조성물.
[4] 상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체 또는 상기 중합체 (B) 중에 포함되는 단위 (b) 가 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 5 ∼ 60 질량％ 인 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 수지 조성물.
[5] 상기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 가, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 30 ∼ 90 질량％ 포함되는 [2] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 수지 조성물.
[6] 또한, 가수 분해에 의해 실란올기를 생성하는 관능기, 에폭시기, (메트)아크릴기 또는 글리시딜기로 이루어지는 가교성기를 갖는 단위 (d) 가 포함되는 [2] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 수지 조성물.
[7] 상기 단위 (a) 가 0.002 ∼ 3 질량％, 상기 단위 (b) 가 10 ∼ 45 질량％, 상기 단위 (c) 가 50 ∼ 80 질량％, 및 상기 단위 (d) 가 0 ∼ 2.5 질량％ 포함되는 [6] 에 기재된 수지 조성물.
[8] [1] ∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 수지 조성물에 의해, 적어도 표면의 일부가 피복된 기재.
[9] 상기 기재가 세포 배양용인, [8] 에 기재된 기재.
[10] [8] 에 기재된 기재의 표면 상의 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기에, 표적 세포의 세포 표면과 특이적으로 결합하는 부위를 갖는 리간드를 결합시키는 공정과, 상기 리간드를 결합시킨 기재에, 표적 세포를 접촉시켜, 상기 리간드에 상기 표적 세포를 결합시키는 공정과, 상기 리간드에 결합한 상기 표적 세포를 배양하는 공정을 갖는, 세포 배양 방법.
본 발명에 관련된 수지 조성물로 표면을 피복한 기재는, 표적 물질 이외의 비특이적인 흡착을 억제하면서, 표적 물질을, 그 물질과 특이적으로 결합하고 또한 단위 (a) 중의 관능기와 공유 결합 가능한 관능기를 갖는 리간드를 개재하여, 그 기판 표면에 선택적으로 포착할 수 있다.
도 1 은, 시험예 3 에 있어서의 예 1 ∼ 3 에서 얻어진 24 웰 마이크로 플레이트에서의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 의 잔존하는 비율과 반응 시간의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 2 는, 시험예 4 에 있어서의 TIG-3 세포를 사용한 세포 접착 어세이 후의 플레이트의 모습을 촬영한 화상이다.
도 3 은, 시험예 4 에 있어서의 각 실험 조건에서의 접착 세포수를 정량화한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4 는, 시험예 4 에 있어서의 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 고정화시킨 웰과, 미처리의 웰에 있어서의 TIG-3 세포의 형체를 비교한 화상이다.
이하의 용어의 정의 및 표현법은, 본 명세서 및 특허 청구의 범위에 있어서 적용된다.
「일반식 (7) 로 나타내는 모노머」 는, 「모노머 (7)」 이라고도 기재한다.다른 일반식으로 나타내는 모노머도, 이에 준하여 동일하게 기재한다.
「일반식 (1) 로 나타내는 기」 는, 「기 (1)」 이라고도 기재한다. 다른 일반식 (1) 로 나타내는 기도, 이에 준하여 동일하게 기재한다.
「할로겐 원자」 란, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 또는 요오드 원자를 의미하며, 바람직하게는, 염소 원자 또는 불소 원자이다.
「단위」 란, 중합체 중에 존재하여 중합체를 구성하는, 단량체에서 유래하는 부분 (중합 단위) 을 의미한다. 탄소-탄소 불포화 이중 결합을 갖는 단량체의 부가 중합에 의해 발생하는, 그 단량체에서 유래하는 단위는, 그 불포화 이중 결합이 개열하여 생긴 2 가의 단위이다. 또, 어느 단위의 구조를 중합체 형성 후에 화학적으로 변환한 것도 단위라고 한다. 또한, 이하, 경우에 따라, 개개의 단량체에서 유래하는 단위를 그 단량체명에 「단위」 를 붙인 명칭으로 부른다.
「(메트)아크릴레이트」 란, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트의 총칭이다.
「생체 친화성기」 란, 단백질이 중합체에 흡착하는 것 또는 세포가 중합체에 접착하여 움직이지 않게 되는 것을 억제하는 성질을 갖는 기를 의미한다.
「생체 적합성」 이란, 단백질 등의 생체 시료가 흡착하지 않는, 또는 세포가 접착하지 않는 성질을 의미한다.
「단백질」 이란, 올리고 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질, 또는 이들을 단편화한 상태의 것을 포함한다. 천연물 유래의 단백질이어도 되고, 인공적으로 화학 합성하여 얻어진 것이어도 되고, 한정되지는 않으며, 그 중에서도, 천연물 유래의 단백질은, 세포 독성 등의 악영향이 없는 경우가 많기 때문에, 바람직하다.
「세포」 란, 생체를 구성하는 가장 기본적인 단위이며, 세포막의 내부에 세포질과 각종 세포 소기관을 갖는 것을 의미한다. DNA 를 내포하는 핵은, 세포 내부에 포함되어도 되고 포함되지 않아도 된다.
동물 유래의 세포에는, 생식 세포 (정자, 난자 등), 생체를 구성하는 체세포, 줄기세포, 전구 세포, 생체로부터 분리된 암 세포, 생체로부터 분리되고 불사화능을 획득하여 체외에서 안정되게 유지되는 세포 (세포주), 생체로부터 분리되고 인위적으로 유전자 개변된 세포, 생체로부터 분리되고 인위적으로 핵이 교환된 세포 등이 포함된다.
생체를 구성하는 체세포에는, 선유아 세포, 골수 세포, B 임파구, T 임파구, 호중구, 적혈구, 혈소판, 매크로파지, 단구, 골세포, 골수 세포, 주피 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트, 지방 세포, 간엽 세포, 상피 세포, 표피 세포, 내피 세포, 혈관 내피 세포, 간 실질세포, 연골 세포, 난구 세포, 신경계 세포, 글리아 세포, 뉴런, 올리고덴드로사이트, 마이크로글리아, 성상교세포, 심장 세포, 식도 세포, 근육 세포 (예를 들어, 평활근 세포, 골격근 세포), 췌장 베타 세포, 멜라닌 세포, 조혈 전구 세포, 단핵 세포 등이 포함된다.
「체세포」 에는, 피부, 신장, 비장, 부신, 간장, 폐, 난소, 췌장, 자궁, 위, 결장, 소장, 대장, 방광, 전립선, 정소, 흉선, 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 조직, 혈액, 심장, 눈, 뇌, 신경 조직 등의 임의의 조직으로부터 채취되는 세포 등이 포함된다.
줄기세포란, 자기 자신을 복제하는 능력과 다른 복수 계통의 세포로 분화하는 능력을 겸비한 세포이며, 배성 줄기세포 (ES 세포), 배성 종양 세포, 배성 생식 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 (iPS 세포), 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 근 줄기세포, 생식 줄기세포, 장 줄기세포, 암 줄기세포, 모낭 줄기세포 등이 포함된다.
「전구 세포」 란, 상기 줄기세포로부터 특정한 체세포 또는 생식 세포로 분화하는 도중의 단계에 있는 세포이다.
「암 세포」 란, 체세포로부터 파생하여 무한한 증식능을 획득한 세포이다.
「세포주」 란, 생체외에서의 인위적인 조작에 의해 무한의 증식능을 획득한 세포이며, HCT116, Huh7, HEK293 (인간 태아 신 (腎) 세포), HeLa (인간 자궁경암 세포주), HepG2 (인간 간암 세포주), UT7/TPO (인간 백혈병 세포주), CHO (차이니즈 햄스터 난소 세포주), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five, Vero 등이 포함된다.
「리간드」 란, 표적 물질과 특이적으로 결합 가능한 물질을 의미한다. 리간드로는, 예를 들어, 단백질, 당 사슬, 지질 복합체, 저분자 화합물 등을 들 수 있다.
＜수지 조성물＞
본 발명은, 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 갖는 단위 (a) 와, 상기한 일반식 (1) 로 나타내는 기, 일반식 (2) 로 나타내는 기 및 일반식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 갖는 단위 (b) 를 갖는 중합체, 또는, 상기 단위 (a) 를 갖는 중합체 (A) 와, 상기 단위 (b) 를 갖는 중합체 (B) 를 포함하는, 수지 조성물을 제공한다.
본 발명의 수지 조성물 (이하, 특정 수지 조성물이라고도 한다.) 은, 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 공중합체를 포함하는 수지 조성물이어도 되고, 중합체 (A) 와 중합체 (B) 를 포함하는 수지 조성물이어도 된다. 또, 특정 수지 조성물은 단위 (a) 또는 단위 (b) 이외의 단위 (c) 및 단위 (d) 를 포함하고 있어도 된다.
특정 수지 조성물에 있어서 각 단위의 비율을 조절하기 쉬운 점에서, 특정 수지 조성물은 중합체 (A) 와 중합체 (B) 를 포함하는 수지 조성물인 것이 바람직하다. 중합체 (A) 는 단위 (a) 로만 이루어져 있어도 되고, 다른 단위 (c) 나 단위 (d) 를 갖고 있어도 된다. 특정 수지 조성물의 내수용성이 향상되기 쉬운 점에서 중합체 (A) 는 단위 (a) 및 단위 (c) 를 갖는 것이 바람직하다. 또 중합체 (B) 는 단위 (b) 로만 이루어져 있어도 되고, 다른 단위 (c) 나 단위 (d) 를 갖고 있어도 된다. 특정 수지 조성물의 내수용성이 향상되기 쉬운 점에서 중합체 (B) 는 단위 (b) 및 단위 (c) 를 갖는 것이 바람직하다. 즉 특정 수지 조성물은, 단위 (a) 와 단위 (c) 를 갖는 중합체 (A) 및 단위 (b) 와 단위 (c) 를 갖는 중합체 (B) 의 혼합물인 것이 바람직하다.
상기 일반식 (1) ∼ (3) 중의 각 기호의 정의는, 각각, 상기한 바와 같다. 그 중에서도, n 은 1 ∼ 5 가 바람직하다. R11 은 메틸기 또는 에틸기가 바람직하다. R21 및 R22 는 에틸렌기가 바람직하다. R23 ∼ R25 는 메틸기가 바람직하다. R31 및 R34 는 에틸렌기가 바람직하다. R32 및 R33 은 메틸기가 바람직하다. X- 는 -SO3 - 가 바람직하다.
본 발명에 있어서 고정화기란, 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 의미한다.
단위 (a) 중의 고정화기는, 생물 유래가 많은 분자가 갖고 있는, 다른 분자와의 결합성을 담당하는 기, 구체적으로는, 아미노기, 티올기, 카르복실기, 및 알데히드기와 공유 결합 가능한 기이다. 특정 수지 조성물은, 구성 (a) 중의 고정화기에 의해, 다종 다양한 물질과 비가역적으로 결합할 수 있다.
또, 특정 수지 조성물은, 생체 친화성기를 갖는 단위 (b) 를 포함하기 때문에, 그 고정화기와 특이적으로 결합하는 물질 이외의 물질, 특히 단백질 등의 생물 유래의 분자의 비특이적인 흡착이 억제되어 있다.
생물로부터 채취된 생체 시료와 같이 복수의 세포나 다양한 생체 분자를 포함하는 시료로부터, 목적으로 하는 세포 (표적 세포) 만을 선택적으로 배양하기 위해서는, 세포 배양 용기에, 표적 세포만을 선택적으로 포착하고, 또한 그 밖의 생체 분자의 그 세포 배양 용기에 대한 비특이적 흡착을 억제할 필요가 있다. 특정 수지 조성물은, 표적 물질과 특이적으로 결합하는 리간드와 고정화기로 비가역적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 친화성기에 의해 단백질의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있다. 이 때문에, 특정 수지 조성물로 표면을 피복한 후, 표면 상의 고정화기에, 선택적으로 포착하고자 하는 목적으로 하는 표적 물질에 대한 리간드를 공유 결합시킨 기재에 생체 시료를 접촉시킴으로써, 생체 시료로부터 표적 물질을, 단백질 등의 다른 생체 분자로부터 분리하여 선택적으로 포착할 수 있다.
특정 수지 조성물로 표면을 피복한 세포 배양용 기재는, 생체 시료에서 유래하는 단백질 등의 다른 생체 분자로부터 분리한 상태에서 특정한 표적 세포만을 배양하기 위한 세포 배양 용기로서 적합하다.
특정 수지 조성물은, 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 유래의 단위를 기본 구조로서 갖는 것이 바람직하다. 에틸렌계 불포화 중합성 모노머로는, 예를 들어, (메트)아크릴계 수지, 올레핀계 수지 (예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등), 스티렌계 수지 (예를 들어, 폴리스티렌, 아크릴로니트릴-스티렌 공중합체, 메타크릴산메틸-스티렌 공중합체 등), 염소 함유 수지 (예를 들어, 폴리염화비닐, 폴리염화비닐리덴 등), 불소 함유 수지 등의 수지를 구성 가능한 모노머 단위를 들 수 있다.
특정 수지 조성물에 있어서, 단위 (a) 를 갖는 중합체는, 상기 에틸렌계 불포화 중합성 모노머 유래의 단위에서 선택되는 1 종을 기본 구조로 하는 중합체여도 되고, 복수 종의 모노머 단위를 조합한 중합체여도 된다. 그 외 단위 (b), 단위 (c) 또는 단위 (d) 를 갖는 중합체에 있어서도, 동일하다.
≪단위 (a)≫
특정 수지 조성물에 있어서, 단위 (a) 는 고정화기로서, 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 갖는다. 단위 (a) 중의 고정화기는, 생물 유래가 많은 분자가 갖고 있는, 다른 분자와의 결합성을 담당하는 기, 구체적으로는, 아미노기, 티올기, 카르복실기, 및 알데히드기와 공유 결합 가능한 기이다. 그 수지 조성물은, 구성 (a) 중의 고정화기에 의해, 다종 다양한 표적 물질에 대한 리간드와 비가역적으로 결합할 수 있다.
특정 수지 조성물 중의 단위 (a) 중의 고정화기는, 1 종류만이어도 되고, 2 종류 이상을 적절히 조합하여 갖고 있어도 된다. 예를 들어, 표적 물질이 2 종류 이상인 경우, 2 종류의 리간드를 결합하게 되도록, 특정 수지 조성물은, 2 종류의 단위 (a) (예를 들어, 말레이미드기를 갖는 단위 (a) 와 숙신이미드기를 갖는 단위 (a)) 를 구비하고 있어도 된다.
고정화기가 말레이미드기인 경우, 시스테인 잔기를 갖는 리간드를 고정화할 수 있다. 고정화기가 숙신이미드기인 경우, 아미노기를 갖는 리간드를 고정화할 수 있다. 고정화기가 티올기인 경우, 카르복실기를 갖는 리간드를 고정화할 수 있다. 고정화기가 하이드라지노기인 경우, 알데히드기를 갖는 리간드를 고정화할 수 있다. 그 중에서도, 고정화할 수 있는 리간드에 대해 범용성이 높다는 점에서, 고정화기는 숙신이미드기 또는 티올기가 바람직하다.
상기 고정화기를 갖는 단위 (a) 의 유래원이 되는 모노머로는, 예를 들어, 하기 일반식 (7) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
[화학식 4]
Figure pct00004
상기 모노머 (7) 중, R71 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 메틸기를 나타낸다. Y71 은 단결합, -O-, -S-, -NH-, -CO-, -COO-, -CONH-, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기 또는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜기를 나타내고, p 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다. 1 분자의 모노머 (7) 중에 복수 있는 Y71 은 (p 가 2 이상일 때) 동일해도 되고 상이해도 된다. W 는 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 또는 하이드라지노기를 나타낸다.
상기 모노머 (7) 에 있어서, R71 은 수소 원자 또는 메틸기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다.
Y71 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기로는, 메틸렌기, 에틸렌기, n-프로필렌기, n-부틸렌기, n-펜틸렌기, n-헥실렌기, n-헵틸렌기, n-옥틸렌기, n-노닐렌기, n-데실렌기 등의 직사슬형의 알킬렌기, 2-메틸프로필렌기, 2-메틸헥실렌기, 테트라메틸에틸렌기 등의 분기 사슬형의 알킬렌기 등을 들 수 있다. 또, 알킬렌기는, 1 또는 수 개의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환되어 있어도 된다. 그 중에서도, 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 또는 헥실렌기가 보다 바람직하다.
상기 알킬렌글리콜 잔기란, 알킬렌글리콜 (HO-R-OH, 여기서 R 은 알킬렌기) 의 편측 말단 또는 양쪽 말단의 수산기가 다른 화합물과 축합 반응한 후에 남는, 알킬렌옥시기 (-R-O-, 여기서 R 은 알킬렌기) 를 말한다. 예를 들어, 메틸렌글리콜 (HO-CH2-OH) 의 경우의 알킬렌글리콜 잔기는 메틸렌옥시기 (-CH2-O-) 이며, 에틸렌글리콜 (HO-CH2CH2-OH) 의 경우의 알킬렌글리콜 잔기는 에틸렌옥시기 (-CH2CH2-O-) 이다. 또, 알킬렌글리콜 잔기는, 1 또는 수 개의 수소 원자가 할로겐 원자로 치환되어 있어도 된다.
Y71 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜 잔기로는, 메틸렌옥시기, 에틸렌옥시기, n-프로필렌옥시기, n-부틸렌옥시기, n-펜틸렌옥시기, n-헥실렌옥시기, n-헵틸렌옥시기, n-옥틸렌옥시기, n-노닐렌옥시기, n-데실렌옥시기 등의 직사슬형의 알킬렌옥시기, 2-메틸프로필렌옥시기, 2-메틸헥실렌옥시기, 테트라메틸에틸렌옥시기 등의 분기 사슬형의 알킬렌옥시기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌옥시기가 바람직하고, 메틸렌옥시기, 에틸렌옥시기, 프로필렌옥시기, 부틸렌옥시기, 펜틸렌옥시기, 또는 헥실렌옥시기가 보다 바람직하고, 메틸렌옥시기, 에틸렌옥시기, 프로필렌옥시기, 또는 부틸렌옥시기가 더욱 바람직하다.
알킬렌글리콜 잔기는, 그 자체가 단백질의 비특이 흡착을 억제하는 성질을 갖는다. 그 때문에, 상기 모노머 (7) 에 있어서, 링커 Y71 이 알킬렌글리콜 잔기인 경우, 모노머 (7) 로부터 유도되는 단위 (a) 는, 리간드를 고정화하는 성질과, 세포 유래의 단백질 등의 비특이 흡착을 억제하는 성질을 겸비한다.
p 는, 1 ∼ 10 의 정수여도 된다. Y71 이 알킬렌글리콜 잔기인 경우, p 는, 1 ∼ 8 이 바람직하고, 1 ∼ 7 이 보다 바람직하고, 1 ∼ 6 이 더욱 바람직하다.
특정 수지 조성물에 있어서, 중합체에 포함되는 단위 (a) 가, p 의 수가 상이한 복수 종의 단위에 의해 구성되어 있는 경우에는, p 는, 그 수지 조성물 전체에 있어서의 평균값으로서 특정된다. p 가 2 이상인 경우에는, Y71 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
상기 모노머 (7) 에 있어서, 링커 Y71 이 알킬렌기인 경우, p 개분의 알킬렌기 ((Y71)p) 의 탄소수의 합계가 1 ∼ 100 이 바람직하고, 1 ∼ 20 이 보다 바람직하다. p 가 2 이상인 경우에는, Y71 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
고정화기 W 로는, 상기 서술한 바와 같이, 고정화할 수 있는 리간드에 대해 범용성이 높다는 점에서, 숙신이미드기 또는 티올기가 바람직하다.
상기 모노머 (7) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 일반식 (8) 로 나타내는 모노머, 하기 일반식 (9) 로 나타내는 모노머, 하기 일반식 (10) 으로 나타내는 모노머, 하기 일반식 (11) 로 나타내는 모노머, 하기 일반식 (17) 로 나타내는 모노머 또는, 하기 일반식 (18) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
[화학식 5]
Figure pct00005
각 모노머 중, Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 은 단결합, -O-, -S-, -NH-, -CO-, -COO-, -CONH-, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기 또는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜기를 나타낸다. q, r, s, t, u 및 v 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다. 1 분자의 모노머 중에 복수 있는 Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 또는 Y181 은 (q, r, s, t, u 또는 v 가 2 이상일 때), 동일해도 되고 상이해도 된다.
Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기 및 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜 잔기로는, 상기 서술한 Y71 과 동일한 것을 들 수 있다.
각 모노머에 있어서, 링커 Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 은, 링커의 가동성이 좋은 점에서, 단결합, 메틸렌기, 에틸렌기 또는 에틸렌옥시기가 바람직하고, 단결합, 메틸렌기 또는 에틸렌옥시기가 더욱 바람직하다.
반복수 q, r, s, t, u 및 v 는, 각각, 1 ∼ 10 의 정수여도 된다.
Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 이 알킬렌글리콜 잔기인 경우, 상기 Y71 의 p 와 마찬가지로, q, r, s, t, u 및 v 는, 1 ∼ 8 의 정수가 바람직하고, 1 ∼ 7 이 보다 바람직하고, 1 ∼ 6 이 더욱 바람직하다. 수지 조성물에 있어서, q, r, s, t, u 및 v 의 수가 상이한 복수 종의 단위에 의해 구성되어 있는 경우에는, q, r, s, t, u 및 v 는, 각각 당해 수지 조성물 전체에 있어서의 평균값으로서 특정된다. q, r, s, t, u 및 v 가 2 이상인 경우에는, Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 은 각각 동일해도 되고, 상이해도 된다.
링커 Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 이 알킬렌기인 경우, 링커 Y71 과 마찬가지로, q, r, s, t, u 또는 v 개분의 알킬렌기의 탄소수의 합계가 1 ∼ 100 이 바람직하고, 1 ∼ 20 이 보다 바람직하다. q, r, s, t, u 및 v 가 2 이상인 경우에는, Y81, Y91, Y101, Y111, Y171 및 Y181 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
상기 모노머 (8) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (8-1) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (8-2) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
상기 모노머 (9) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (9-1) 로 나타내는 모노머, 하기 식 (9-2) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (9-3) 으로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
상기 모노머 (10) 으로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (10-1) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (10-2) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
상기 모노머 (11) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (11-1) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (11-2) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
상기 모노머 (17) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (17-1) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (17-2) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
상기 모노머 (18) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (18-1) 로 나타내는 모노머, 하기 식 (18-2) 로 나타내는 모노머 또는 하기 식 (18-3) 으로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
하기 모노머 (8-1), (8-2), (9-2), (9-3), (10-1) ∼ (11-2), (17-1), (17-2), (18-2), (18-3) 중, a 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타내고, b 는 1 ∼ 6 의 정수를 나타낸다.
[화학식 6]
Figure pct00006
고정화기를 갖는 모노머를 중합하여 조성물을 얻는 것이 곤란한 경우, 고정화기가 미리 보호기로 보호된 모노머를 사용하여 중합을 실시하고, 중합체를 얻은 후에 보호기를 떼어내도 된다.
고정화기가 말레이미드기 또는 숙신이미드기인 경우, 보호기로는, 예를 들어 푸란 등을 들 수 있다. 보호기가 푸란인 경우, 가열에 의해 용이하게 탈리시킬 수 있다.
고정화기가 티올인 경우, 보호기로는, 예를 들어 트리메틸실릴기, 트리에틸실릴기, tert-부틸디메틸실릴기 등을 들 수 있다. 이들 기가 보호기인 경우, 수용액 중에 있어서 산 또는 염기에 의해 용이하게 탈리시킬 수 있다.
고정화기가 하이드라지노기인 경우, 보호기로는, 아미노기를 보호할 수 있는 것이면, 특별한 제한은 없고, 예를 들어, t-부톡시카르보닐기 (Boc 기) 나 벤질옥시카르보닐기 (Z 기, Cbz 기), 9-플루오레닐메톡시카르보닐기 (Fmoc 기) 등을 들 수 있다. 보호기가 Boc 기인 경우, 수용액 중에 있어서 트리플루오로아세트산 등의 강산에 의해 용이하게 탈리시킬 수 있다. 또, 보호기가 Z 기인 경우, 활성탄에 담지시킨 팔라듐 등을 촉매로 하여 수소 가스를 불어넣음으로써 용이하게 탈리시킬 수 있다. 또, 보호기가 Fmoc 기인 경우, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 등의 2 급 아민에 의해 용이하게 탈리시킬 수 있다.
고정화기를 갖는 단위 (a) 의 비율은, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여, 0.001 ∼ 5 ㏖％ 가 바람직하고, 0.005 ∼ 0.5 ㏖％ 가 보다 바람직하고, 0.01 ∼ 0.1 ㏖％ 가 더욱 바람직하다. 단 「조성물을 구성하는 단위의 총수」 란, 특정 수지 조성물에 포함되는 중합체 (단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체, 중합체 (A), 및 중합체 (B)) 가 갖는 모든 단위의 총수를 의미한다.
고정화기를 갖는 단위 (a) 의 비율은, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여, 0.0004 ∼ 3 질량이 바람직하고 0.002 ∼ 0.6 질량％ 가 보다 바람직하고, 0.004 ∼ 0.3 질량％ 가 더욱 바람직하다.
≪단위 (b)≫
특정 수지 조성물에 있어서, 단위 (b) 는 생체 친화성기를 갖는다. 특정 수지 조성물은 생체 친화성을 갖는 기를 가짐으로써, 단백질 등의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있다.
생체 친화성기는, 단백질의 비특이적인 흡착 방지 효과가 높은 피복층을 형성하기 쉬운 점에서, 상기한 일반식 (1) 로 나타내는 기, 일반식 (2) 로 나타내는 기 및 일반식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이 바람직하다. 생체 친화성기로는, 단백질의 비특이적인 흡착 방지 효과가 얻어지기 쉬운 점에서, 기 (1) 만, 또는, 기 (2) 및 기 (3) 중 어느 일방 혹은 양방이 바람직하고, 기 (1), 기 (2) 또는 기 (3) 중 어느 1 개가 특히 바람직하다. 생체 친화성기로는, 입수 용이성의 점에서 기 (1) 이 특히 바람직하다.
상기 일반식 (1) ∼ (3) 중의 각 기호의 각각의 정의, 및 각각의 바람직한 양태는, 상기한 바와 동일하다.
[기 (1)]
기 (1) 은, 특정 수지 조성물로 이루어지는 피복층의 표면에 결합하고자 하는 세포 유래의 단백질 등의 비특이적 흡착을 억제할 수 있다. 기 (1) 은, 단위 (b) 의 주사슬에 포함되어 있어도 되고, 측사슬에 포함되어 있어도 된다.
기 (1) 은, 직사슬형이어도 되고, 분기 사슬형이어도 된다. 세포 유래의 단백질 등의 비특이적인 흡착을 억제하는 효과가 보다 높은 점에서, 기 (1) 은 직사슬형인 것이 바람직하다. 기 (1) 에 있어서의 R11 은, 내수성이 우수한 점에서, 메틸기 또는 에틸기가 바람직하다.
기 (1) 에 있어서의 n 은, 기 (1) 이 단위 (b) 의 측사슬에 포함되는 경우, 내수성이 우수한 점에서, 1 ∼ 10 이 바람직하고, 1 ∼ 5 가 특히 바람직하다.
기 (1) 에 있어서의 n 은, 기 (1) 이 단위 (b) 의 주사슬에 포함되는 경우, 내수성이 우수한 점에서, 2 ∼ 10 이 바람직하고, 4 ∼ 10 이 특히 바람직하다.
[기 (2)]
기 (2) 는, 혈액 중 등에 포함되는 인지질에 대하여 강한 친화성을 갖는 한편, 혈장 단백질에 대한 상호 작용력은 약하다. 그 때문에, 단위 (b) 가 기 (2) 를 가짐으로써, 예를 들어 특정 수지 조성물로 이루어지는 피복층 상에 인지질이 우선하여 흡착되고, 그 인지질이 자기 조직화하여 흡착층이 형성되는 것으로 생각된다. 그 결과, 표면이 혈관 내피 표면에 유사한 구조가 되기 때문에, 피브리노겐 등의 단백질의 비특이적인 흡착이 억제된다.
기 (2) 는, 특정 수지 조성물의 측사슬에 포함되는 것이 바람직하다.
R21 은, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기이며, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, n-프로필렌기, n-부틸렌기, n-펜틸렌기 등의 직사슬형의 알킬렌기, 2-메틸프로필렌기, 트리메틸에틸렌기 등의 분기 사슬형의 알킬렌기를 들 수 있다. 그 중에서도, 원료의 입수 용이성의 점에서, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 또는 펜틸렌기가 보다 바람직하고, 에틸렌기가 더욱 바람직하다.
R22 는, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기이며, 예를 들어, 상기 R21 과 동일한 것을 들 수 있다. 그 중에서도, 단백질의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 점에서, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 또는 부틸렌기가 보다 바람직하고, 에틸렌기가 더욱 바람직하다.
R23 ∼ R25 는, 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기이며, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기 등의 직사슬형의 알킬기, 2-메틸프로필기, 트리메틸에틸기 등의 분기 사슬형의 알킬기를 들 수 있다. 그 중에서도, 원료의 입수 용이성의 점에서, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형의 알킬기가 바람직하고, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 또는 부틸기가 보다 바람직하고, 메틸기가 더욱 바람직하다.
단위 (b) 가 기 (2) 를 갖는 경우, 기 (2) 는, 1 종이어도 되고, 2 종 이상이어도 된다.
[기 (3)]
단위 (b) 가 기 (3) 을 가짐으로써, 단위 (b) 가 기 (2) 를 갖는 경우와 동일한 이유로부터 세포 유래의 단백질 등의 비특이적인 흡착이 억제된다.
기 (3) 은, 단위 (b) 의 측사슬에 포함되는 것이 바람직하다.
R31 은, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기이며, 예를 들어, 메틸렌기, 에틸렌기, n-프로필렌기, n-부틸렌기, n-펜틸렌기, n-헥실렌기, n-헵틸렌기, n-옥틸렌기, n-노닐렌기, n-데실렌기, n-드데실렌기 등의 직사슬형의 알킬렌기, 2-메틸프로필렌기, 2-메틸헥실렌기, 테트라메틸에틸렌기 등의 분기 사슬형의 알킬렌기 등을 들 수 있다. 특정 수지 조성물이 유연성이 우수한 점에서, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 헥실렌기, 헵틸렌기, 옥틸렌기, 노닐렌기, 데실렌기, 도데실렌기, 트리데실렌기, 테트라데실렌기, 또는 펜타데실렌기가 보다 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 헥실렌기, 헵틸렌기, 옥틸렌기, 노닐렌기, 또는 데실렌기가 더욱 바람직하고, 에틸렌기가 특히 바람직하다.
R34 는, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기이며, 예를 들어, 상기 R21 과 동일한 것을 들 수 있다. 그 중에서도, 단백질의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 점에서, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기 또는 부틸렌기가 보다 바람직하고, 에틸렌기가 더욱 바람직하다.
R32 및 R33 은, 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기이며, 예를 들어, 상기 R23 ∼ R25 와 동일한 것을 들 수 있다. 그 중에서도, 단백질의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 점에서, 탄소수 1 ∼ 5 의 직사슬형의 알킬기가 바람직하고, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 또는 부틸기가 보다 바람직하고, 메틸기가 더욱 바람직하다.
단위 (b) 가 기 (3) 을 갖는 경우, 기 (3) 은, 1 종이어도 되고, 2 종 이상이어도 된다.
또, 단위 (b) 가 기 (3) 을 갖는 경우, 단백질의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있는 점에서, 단위 (b) 는, X- 가 기 (4) 인 기 (3) 을 갖거나, 또는 X- 가 기 (5) 인 기 (3) 을 갖거나 중 어느 것인 것이 바람직하다.
상기 생체 친화성기를 갖는 단위 (b) 의 유래원이 되는 모노머로는, 예를 들어, 하기 일반식 (12) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
[화학식 7]
Figure pct00007
상기 모노머 (12) 중, R121 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 메틸기를 나타낸다. Y121 은 단결합, -O-, -S-, -NH-, -CO-, -COO-, -CONH-, 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기 또는 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜기를 나타낸다. c 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다. 1 분자의 모노머 (12) 중에 복수 있는 Y121 은 (c 가 2 이상일 때) 동일해도 되고 상이해도 된다. Z 는 상기 기 (1), 상기 기 (2) 및 상기 기 (3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 나타낸다.
상기 모노머 (12) 에 있어서, R121 은 수소 원자 또는 메틸기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다.
Y121 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기로는, 예를 들어, 상기 Y71 과 동일한 것 등을 들 수 있다. 또, 알킬렌기는, 수소 원자가 할로겐 원자로 치환되어 있어도 된다. 그 중에서도, 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌기가 바람직하고, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 부틸렌기, 펜틸렌기, 또는 헥실렌기가 보다 바람직하다.
Y121 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜 잔기로는, 예를 들어, 상기 Y71 과 동일한 것 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 탄소수 1 ∼ 10 의 직사슬형의 알킬렌옥시기가 바람직하고, 메틸렌옥시기, 에틸렌옥시기, 프로필렌옥시기, 부틸렌옥시기, 펜틸렌옥시기, 또는 헥실렌옥시기가 보다 바람직하고, 메틸렌옥시기, 에틸렌옥시기, 프로필렌옥시기, 또는 부틸렌옥시기가 더욱 바람직하고, 에틸렌옥시기가 특히 바람직하다.
Y121 의 반복수 c 는, 1 ∼ 10 의 정수여도 된다.
Y121 이 알킬렌글리콜 잔기인 경우, 1 ∼ 8 의 정수가 바람직하고, 1 ∼ 7 이 보다 바람직하고, 1 ∼ 6 이 더욱 바람직하다. 수지 조성물에 있어서, c 의 수가 상이한 복수 종의 단위에 의해 구성되어 있는 경우에는, c 는, 그 수지 조성물 전체에 있어서의 평균값으로서 특정된다. c 가 2 이상인 경우에는, Y121 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
상기 모노머 (12) 에 있어서, 링커 Y121 이 알킬렌기인 경우, c 개분의 알킬렌기 ((Y121)c) 의 탄소수의 합계가 1 ∼ 100 이 바람직하고, 1 ∼ 20 이 보다 바람직하다. c 가 2 이상인 경우에는, Y121 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
생체 친화성기 Z 로는, 상기 서술한 바와 같이, 단백질의 비특이적인 흡착을 억제하는 효과가 얻어지기 쉬운 점에서, 기 (1) 만, 또는, 기 (2) 및 기 (3) 중 어느 일방 혹은 양방이 바람직하고, 기 (1), 기 (2) 또는 기 (3) 중 어느 1 개가 특히 바람직하다.
상기 모노머 (12) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 일반식 (13) 으로 나타내는 모노머, 하기 일반식 (14) 로 나타내는 모노머 또는 하기 일반식 (15) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
[화학식 8]
Figure pct00008
상기 모노머 중, Y131, Y141 및 Y151 은 상기 Y101 과 동일한 것을 나타낸다. d, e 및 f 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다. 1 분자의 모노머 중에 복수 있는 Y131, Y141 또는 Y151 은 (d, e 또는 f 가 2 이상일 때), 동일해도 되고 상이해도 된다. m 은 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다. R141, R142 및 R152 는 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기를 나타낸다. R151 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타낸다.
Y131, Y141 및 Y151 에 있어서의 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌기 및 탄소수 1 ∼ 10 의 알킬렌글리콜 잔기로는, 예를 들어, 상기 Y71 과 동일한 것을 들 수 있다.
각 모노머에 있어서, 링커 Y131, Y141 및 Y151 은, 내수성이 우수하고, 모노머를 합성하기 쉬운 점에서, 단결합, -O-, -CO-, -COO-, -CONH-, 메틸렌기, 에틸렌기, 또는 에틸렌옥시기가 바람직하고, 단결합, 메틸렌기 또는 에틸렌옥시기가 더욱 바람직하다.
d, e 및 f 는, 각각 1 ∼ 10 의 정수여도 된다.
상기 Y121 의 c 와 마찬가지로, Y131, Y141 및 Y151 이 알킬렌글리콜 잔기인 경우, d, e 및 f 는, 1 ∼ 8 이 바람직하고, 1 ∼ 7 이 보다 바람직하고, 1 ∼ 6 이 더욱 바람직하다. 특정 수지 조성물에 있어서, d, e 및 f 의 수가 상이한 복수 종의 단위에 의해 구성되어 있는 경우에는, d, e 및 f 는, 각각 그 수지 조성물 전체에 있어서의 평균값으로서 특정된다. d, e 및 f 가 2 이상인 경우에는, Y131, Y141 및 Y151 은 각각 동일해도 되고, 상이해도 된다.
링커 Y131, Y141 및 Y151 이 알킬렌기인 경우, 링커 Y71 과 마찬가지로, d, e 및 f 개분의 알킬렌기의 탄소수의 합계가 1 ∼ 100 이 바람직하고, 1 ∼ 20 이 보다 바람직하다. d, e 및 f 가 2 이상인 경우에는, Y131, Y141 및 Y151 은 동일해도 되고, 상이해도 된다.
상기 모노머 (13), 상기 모노머 (14) 및 상기 모노머 (15) 로서, 보다 구체적으로는, 하기 식 (13-1) 로 나타내는 모노머, 하기 식 (14-1) 로 나타내는 모노머 및 하기 식 (15-1) 로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다. 모노머 (13-1) 중, k 는 1 ∼ 10 의 정수를 나타낸다.
[화학식 9]
Figure pct00009
생체 친화성기를 갖는 단위 (b) 의 비율은, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여, 5 ∼ 60 질량％ 가 바람직하고 10 ∼ 50 질량％ 가 보다 바람직하고, 10 ∼ 45 질량％ 가 더욱 바람직하다.
≪단위 (c)≫
또, 특정 수지 조성물에 있어서, 소수성기를 갖는 단위 (c) 를 구비하고 있어도 된다. 특정 수지 조성물은, 단위 (c) 를 가짐으로써, 친수성의 물질과의 비특이적인 결합이 억제된다. 또한, 내수성이 향상된다.
[기 6]
소수성기로는, 예를 들어, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기 등을 들 수 있다.
[화학식 10]
Figure pct00010
기 (6) 중, 아스테리스크는 결합 부위를 나타낸다. Y61 은 단결합 또는 2 가의 유기기를 나타낸다. R61 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타낸다.
기 (6) 은, 단위 (c) 의 주사슬에 포함되어 있어도 되고, 측사슬에 포함되어 있어도 된다. 기 (6) 은, 직사슬형이어도 되고, 분기 사슬형이어도 된다.
기 (6) 에 있어서의 Y61 은, 합성의 용이함의 점에서, 이하의 기를 들 수 있다.
-O-, -S-, -NH-, -SO2-, -PO2-, -CH=CH-, -CH=N-, -N=N-, -N(O)=N-, -OCO-, -COO-, -COS-, -CONH-, -COCH2-, -CH2CH2-, -CH2-, -CH2NH-, -CO-, -CH=CH-COO-, -CH=CH-CO-, 직사슬형 또는 분기 사슬형의 알킬렌기, 알케닐렌기, 알킬렌옥시기, 2 가의 4 ∼ 7 원 고리의 치환기, 2 가의 6 원 고리의 방향족 탄화수소기, 2 가의 4 ∼ 6 원 고리의 지환식 탄화수소기, 2 가의 5 또는 6 원 고리의 복소 고리기, 이들의 축합 고리, 2 가의 연결기의 조합으로 구성되는 기 등.
2 가의 유기기는, 치환기를 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 수산기, 할로겐 원자, 시아노기, 알콕시기 (메톡시기, 에톡시기, 부톡시키기, 옥틸옥시기, 메톡시에톡시기 등), 아릴옥시기 (페녹시기 등), 알킬티오기 (메틸티오기, 에틸티오기 등), 아실기 (아세틸기, 프로피오닐기, 벤조일기 등), 술포닐기 (메탄술포닐기, 벤젠술포닐기 등), 아실옥시기 (아세톡시기, 벤조일옥시기 등), 술포닐옥시기 (메탄술포닐옥시기, 톨루엔술포닐옥시기 등), 포스포닐기 (디에틸포스포닐기 등), 아미드기 (아세틸아미노기, 벤조일아미노기 등), 카르바모일기 (N,N-디메틸카르바모일기, N-페닐카르바모일기 등), 알킬기 (메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 시클로프로필기, 부틸기, 2-카르복시에틸기, 벤질 등), 아릴기 (페닐기, 톨루일기 등), 복소 고리기 (피리딜기, 이미다졸릴기, 푸라닐기 등), 알케닐기 (비닐기, 1-프로페닐기 등), 알콕시아실옥시기 (아세틸옥시기, 벤조일옥시기 등), 알코시키카르보닐기 (메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등), 중합성기 (비닐기, 아크릴로일기, 메타크릴로일기, 스리릴기, 계피산 잔기 등) 를 들 수 있다.
기 (6) 에 있어서의 Y61 로는, 단결합, -O-, -(CH2CH2O)γ- (단, γ 는 1 ∼ 10 의 정수이다.), -COO-, 6 원 고리 방향족 탄화수소기, 직사슬형 또는 분기형의 알킬렌기, 수소 원자의 일부가 수산기로 치환된 직사슬형 또는 분기형의 알킬렌기, 이들 2 가의 연결기의 조합으로 구성되는 기가 바람직하고, 단결합, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기, -COO-, -COOA1- 가 특히 바람직하다.
A1 로는, -(CH2)δ-, -(CH2)δ-CH(OH)-(CH2)ε-, -(CH2)δ-NA2-SO2- 를 들 수 있으며, -(CH2)δ- 가 특히 바람직하다. 단, δ 는 1 ∼ 5 의 정수이고, ε 은 1 ∼ 5 의 정수이고, A2 는 수소 원자 또는 탄소수 1 ∼ 3 의 알킬기이다.
기 (6) 에 있어서의 R61 로는, 합성하기 쉬운 점에서, 탄소수 1 ∼ 15 의 알킬기로 바람직하고, 탄소수 1 ∼ 12 의 알킬기가 보다 바람직하고, 탄소수 2 ∼ 10 의 알킬기가 더욱 바람직하다.
상기 소수성기를 갖는 단위 (c) 의 유래원이 되는 모노머로는, 예를 들어, 하기 일반식 (16) 으로 나타내는 모노머 등을 들 수 있다.
[화학식 11]
Figure pct00011
모노머 (16) 중, Y161 은 상기 Y61 과 동일한 것을 나타내고, R161 은 수소 원자, 할로겐 원자 또는 메틸기를 나타내고, R162 는 상기 R61 과 동일한 것을 나타낸다.
Y161 은 단결합, -O-, -(CH2CH2O)γ- (단, γ 는 1 ∼ 10 의 정수이다.), -COO-, 6 원 고리 방향족 탄화수소기, 직사슬형 또는 분기형의 알킬렌기, 수소 원자의 일부가 수산기로 치환된 직사슬형 또는 분기형의 알킬렌기, 이들 2 가의 연결기의 조합으로 구성되는 기가 바람직하고, 단결합, 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기, -COO-, -COOA1- 가 특히 바람직하다.
A1 로는, -(CH2)δ-, -(CH2)δ-CH(OH)-(CH2)ε-, -(CH2)δ-NA2-SO2- 를 들 수 있으며, -(CH2)δ- 가 특히 바람직하다. 단, δ 는 1 ∼ 5 의 정수이고, ε 은 1 ∼ 5 의 정수이고, A2 는 수소 원자 또는 탄소수 1 ∼ 3 의 알킬기이다.
R161 은, 할로겐 원자 또는 메틸기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다.
상기 모노머 (16) 으로서, 보다 구체적으로는, 이하의 모노머를 들 수 있다.
n-부틸(메트)아크릴레이트, iso-부틸(메트)아크릴레이트, sec-부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트, n-네오펜틸(메트)아크릴레이트, iso-네오펜틸(메트)아크릴레이트, iso-네오펜틸(메트)아크릴레이트, 네오펜틸(메트)아크릴레이트, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, n-헥실(메트)아크릴레이트, iso-헥실(메트)아크릴레이트, 헵틸(메트)아크릴레이트, n-옥틸(메트)아크릴레이트, iso-옥틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, n-노닐(메트)아크릴레이트, iso-노닐(메트)아크릴레이트, n-데실(메트)아크릴레이트, iso-데실(메트)아크릴레이트, n-도데실(메트)아크릴레이트, iso-도데실(메트)아크릴레이트, n-트리데실(메트)아크릴레이트, iso-트리데실(메트)아크릴레이트, n-테트라데실(메트)아크릴레이트, iso-테트라데실(메트)아크릴레이트, n-펜타데실(메트)아크릴레이트, iso-펜타데실(메트)아크릴레이트, n-헥사데실(메트)아크릴레이트, iso-헥사데실(메트)아크릴레이트, n-옥타데실(메트)아크릴레이트, iso-옥타데실(메트)아크릴레이트, 이소보닐(메트)아크릴레이트, CH2=C(CH3)COO(CH2)2(CF2)5CF3, CH2=CHCOO(CH2)2(CF2)5CF3, CH2=C(CH3)COOCH2CF3, CH2=CHCOOCH2CF3, CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF2CF3, CH2=CR6COO(CH2)eCF2CF(CF3)2, CH2=CR6COOCH(CF3)2, CH2=CR6COOC(CF3)3 등.
소수성기를 갖는 단위 (c) 의 비율은, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여, 0 ∼ 90 질량％ 가 바람직하고, 30 ∼ 80 질량％ 가 보다 바람직하고, 50 ∼ 80 질량％ 가 더욱 바람직하다.
≪단위 (d)≫
또, 특정 수지 조성물은, 가교기를 갖는 단위 (d) 를 갖고 있어도 된다. 가교기는, 예를 들어 각 단위의 주사슬을 가교시킴으로써, 조성물에 불용성을 부여할 수 있다. 또, 기재 등의 고상 (固相) 표면에 가교함으로써, 그 수지 조성물과 기재 표면을 보다 강고하게 접착시킬 수 있다.
가교기는, 단위끼리를 가교하는 기, 또는 단위와 고상 표면을 가교하는 기이면 특별히 한정되지 않는다.
이와 같은 가교기는, 가교 가능한 관능기를 갖는 모노머를 중합시킨 후, 가교 가능한 관능기를 반응시켜, 각 단위끼리를 가교함으로써 발생시킬 수 있다.
가교 가능한 관능기로는, 모노머의 중합 반응 중에는 반응하지 않는 가교성기이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 가수 분해에 의해 실란올기를 생성하는 관능기나 에폭시기, (메트)아크릴기, 글리시딜기 등을 들 수 있다.
단위 (d) 의 비율은, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여, 0 ∼ 10 질량％ 가 바람직하고, 0 ∼ 5 질량％ 가 보다 바람직하고, 0 ∼ 2.5 질량％ 가 더욱 바람직하다.
본 발명의 수지 조성물은, 단위 (a) 를 0.002 ∼ 3 질량％, 단위 (b) 를 10 ∼ 45 질량％, 단위 (c) 를 50 ∼ 80 질량％, 및 단위 (d) 를 0 ∼ 2.5 질량％ 포함하는 것이 바람직하다.
≪제조 방법≫
특정 수지 조성물은, 예를 들어, 원료가 되는 모노머를 유기 용매에 용해하고, 중합시킴으로써, 중합체를 얻는 방법에 의해 제조해도 된다. 중합체의 각 모노머의 결합 방식은, 랜덤, 블록, 그래프트 등 어느 형태여도 된다.
유기 용매로는, 예를 들어, 2-부타논, 에탄올, 메탄올, t-부틸알코올, 벤젠, 톨루엔, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세톤, 메틸에틸케톤 등을 들 수 있다.
특정 수지 조성물은, 각각 단일의 모노머를 유기 용매에 용해하고, 중합하여 단독 중합체를 제조한 후에, 혼합하여 제조해도 되고, 2 종 이상의 모노머를 공중합시킨 공중합체를 2 종류 이상 제조한 후에, 얻어진 2 종류 이상의 공중합체를 혼합하여 제조해도 되고, 모든 원료 모노머를 공중합시킨 공중합체로서 제조해도 된다.
즉, 특정 수지 조성물은, 단위 (a) 의 유래원이 되는 모노머를 중합시켜 얻어진 중합체 (A) 와, 단위 (b) 의 유래원이 되는 모노머를 중합시켜 얻어진 중합체 (B) 를 혼합하여 제조해도 되고, 또 단위 (a) 의 유래원이 되는 모노머와, 단위 (b) 의 유래원이 되는 모노머의 공중합체를 제조해도 된다.
또, 특정 수지 조성물은, 단위 (b) 의 유래원이 되는 모노머를 중합시켜 얻어진 중합체 (B) 에 고정화기를 도입하여, 고정화기와 생체 친화성기를 갖는 공중합체를 제조해도 된다. 또한 특정 수지 조성물이 단위 (c) 를 갖는 경우, 단위 (b) 의 유래원이 되는 모노머 또는 소수성기를 갖는 단위 (c) 의 유래원이 되는 모노머를 중합시켜 단위 (b) 와 단위 (c) 를 갖는 공중합체를 제조한 후에, 그 공중합체 중의 생체 친화성기 또는 소수성기의 일부에 이미 알려진 화학 반응을 이용하여 고정화기를 수식함으로써, 고정화기를 갖는 단위 (a) 도 갖는 공중합체를 제조해도 된다.
각각의 단위의 비율이 조절하기 쉬운 점에서, 중합체에 고정화기를 도입하는 방법보다, 각 단위의 원료 모노머를 중합시켜 제조하는 방법에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 2 성분 이상의 상기 모노머를 공중합시킴으로써, 공중합체를 얻는 방법, 또는, 2 성분 이상의 상기 모노머를 공중합시킨 공중합체를 2 종류 이상 제조한 후에, 얻어진 2 종류 이상의 공중합체를 혼합하는 방법에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 또한 특정 수지 조성물이 단위 (c) 를 갖는 경우, 특히 단위 (a) 와 단위 (c) 를 갖는 공중합체, 및, 단위 (b) 와 단위 (c) 를 갖는 공중합체를 혼합하여 수지 조성물을 얻는 것이 바람직하다.
특정 수지 조성물은, 그 밖의 수지 조성물과 마찬가지로, 기재 표면을 피복하여 박막을 형성하거나, 성형체를 형성할 수 있다.
＜기재＞
본 발명은, 실시형태로서, 특정 수지 조성물로 적어도 표면의 일부가 피복된, 기재를 제공한다.
본 발명의 기재에 의하면, 보다 다종 다양한 리간드를 기재 표면 상에 고정화할 수 있다. 또한, 리간드가 고정화된 기재를 사용함으로써, 리간드와 특이적으로 결합하는 표적 물질을 선택적으로 포착하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들어, 리간드를 결합시킨 그 기재는, 표적 물질을 선택적으로 포착하기 위한 어피니티 크로마토그래피의 칼럼 충전재로서도 이용할 수 있다.
기재의 형상으로는, 특별한 한정은 없고, 예를 들어, 평판상, 구상 (球狀) 등을 들 수 있다. 기재의 재질로는, 예를 들어 무기 물질로서 실리카, 알루미나, 유리, 금속 등을 들 수 있다. 또, 유기 고분자 물질로서 열가소성 수지 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 직사슬형 폴리올레핀 수지：고리형 폴리올레핀 수지：함불소 수지 등을 들 수 있다.
포화 고리형 폴리올레핀 수지로는, 고리형 올레핀 구조를 갖는 단독 중합체 또는 고리형 올레핀과 α-올레핀의 공중합체에 수소 첨가한 포화 중합체를 들 수 있다.
또, 기재가 세포 배양용인 경우, 재질은, 세포를 배양하는 데에 적합한 임의의 재료이면 특별한 한정은 없고, 예를 들어, 소다 석회 유리, 파이렉스 (상품명) 유리, 바이콜 (상품명) 유리, 석영 유리 등의 유리 재료；실리콘；폴리(염화비닐), 폴리(비닐알코올), 폴리(메타크릴산메틸), 폴리(아세트산비닐-공(共)-무수 말레산), 폴리(디메틸실록산)모노메타크릴레이트, 고리형 올레핀 폴리머, 플루오로카본 폴리머, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌이민 등의 수상 (樹狀) 폴리머를 포함하는 플라스틱 또는 폴리머；폴리(아세트산비닐-공-무수 말레산), 폴리(스티렌-공-무수 말레산), 폴리(에틸렌-공-아크릴산) 또는 이들의 유도체 등의 코폴리머 등을 들 수 있다.
기재로서, 보다 구체적으로는, 담체 (예를 들어, 자기 담체, 어피니티 칼럼 정제용 담체 등), 세포 배양용 기재, 프레파라트, 마이크로 디바이스, 막 등을 들 수 있다. 세포 배양용 기재로는, 임의의 수의 웰이 배치된 멀티 웰 플레이트, 샬레 등을 들 수 있다. 웰 수로는, 플레이트 1 매당, 예를 들어, 6, 12, 24, 96, 384, 1,536 개 등을 들 수 있다.
또, 기재가 구상의 입자인 경우, 입자의 평균 입경 0.1 ∼ 500 ㎛ 의 폴리머 입자가 보다 바람직하다. 상기 범위의 입경을 갖는 담체의 입자는, 원심 분리, 필터 등에 의한 회수가 용이하고, 또한, 충분한 표면적을 갖고 있기 때문에 표적 물질과의 반응 효율도 높은 것으로 생각된다. 평균 입경이 500 ㎛ 이하인 경우, 표면적이 지나치게 작지 않고, 단백질과의 반응 효율이 높다. 평균 입경 0.1 ㎛ 이상인 경우, 필터에 의한 입자의 회수를 효율적으로 실시할 수 있으며, 입자를 칼럼에 충전하여 사용하는 경우에, 통액시의 압력 손실이 커질 우려가 없다.
≪피복 방법≫
기재 표면에 특정 수지 조성물을 피복하는 방법으로는, 예를 들어 유기 용매에 용해한 상기 고분자 화합물을, 상기 기재 상에, 침지, 스프레이, 스핀 코팅 등에 의해 도포한 후, 10 ∼ 120 ℃ 정도의 환경하에서 건조시킴으로써 실시할 수 있다. 상기 유기 용매로는, 예를 들어, 상기 서술한 ≪제조 방법≫ 에 있어서, 예시한 것과 동일한 것 등을 들 수 있다.
피복층의 두께는, 1 ㎚ ∼ 1 ㎜ 가 바람직하고, 5 ㎚ ∼ 800 ㎛ 가 특히 바람직하다. 두께가 상기 하한값 이상이면, 세포 유래 등의 불필요한 단백질 등의 비특이적인 흡착을 억제할 수 있다. 두께가 상기 상한값 이하이면, 피복층이 기재 표면에 밀착하기 쉽다.
≪리간드의 고정화 방법≫
특정 수지 조성물로 표면을 피복한 기재에 리간드를 고정화함으로써, 표적 물질을 선택적으로 포착 가능한 기재를 제조할 수 있다. 리간드를 고정화하는 방법에 대해서는, 공유 결합에 의해, 기재 상의 피복층이 갖는 고정화기에 따라, 공지된 방법에 따라서 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 리간드를 함유하는 용액을, 리간드와 공유 결합하는 고정화기를 구비한 피복층을 갖는 기재에 접촉시키는 방법 등을 들 수 있다.
기재 표면 상의 고정화기가 숙신이미드기이고, 아미노기를 갖는 리간드를 고정화하는 경우에는, 예를 들어, 기재 표면이, 리간드를 pH 7.0 ∼ 10.0 의 일반적인 완충액에 혼합한 용액에 접촉하는 상태에서 소정 시간 인큐베이트함으로써, 리간드를 고정화기에 결합하게 된다. 그 완충액으로는, 예를 들어, 인산 완충액, 트리스 완충액 등을 들 수 있다.
기재가 세포 배양용인 경우, 고정화하는 리간드로는, 표적 세포의 세포 표면에 특이적으로 결합하는 물질이면 특별한 한정은 없고, 예를 들어, 항체, 항체 단편, 앱타머, 세포 접착성 인자 등을 들 수 있다.
항체는, 예를 들어, 마우스 등 설치류의 동물에 표지 펩티드를 항원으로서 면역함으로써 제조할 수 있다. 또, 예를 들어, 파지 라이브러리의 스크리닝에 의해 제조할 수 있다. 항체 단편으로는, Fv, Fab, scFv 등을 들 수 있다.
앱타머란, 목적 물질에 대한 특이적 결합능을 갖는 물질이다. 앱타머로는, 펩티드 앱타머 등을 들 수 있다. 목적 물질에 특이적 결합능을 갖는 펩티드 앱타머는, 예를 들어 효모를 사용한 Two-hybrid 법 등에 의해 선별할 수 있다.
세포 접착성 인자는, 세포의 접착을 담당하는 분자의 총칭이다. 세포 접착성 인자로는, 예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 피브리노겐, 트롬보스폰딘 등을 들 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다. 세포 접착성 인자는, 배양하는 세포에 의해 적절히 선택할 수 있다.
천연물 유래의 세포 접착성 인자는, 천연물로부터 공지된 회수법 및 정제법에 의해 직접 얻어도 되고, 또는, 공지된 유전자 재조합 기술에 의해, 당해 단백질을 코드하는 유전자를 각종 발현 벡터 등에 삽입하여 세포에 도입하고, 발현시킨 후, 공지된 회수법 및 정제법에 의해 얻어도 된다. 혹은, 시판되는 키트, 예를 들어, 시약 키트 PROTEIOSTM (토요보), TNTTM System (프로메가), 합성 장치의 PG-Mate TM (토요보) 및 RTS (로슈·다이어그노스틱스) 등을 사용한 무세포 단백질 합성계에 의해 당해 단백질을 산생하고, 공지된 회수법 및 정제법에 의해 얻어도 되고 한정되지 않는다.
또, 화학 합성한 세포 접착성 인자는, 공지된 단백질 합성 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 합성 방법으로는, 예를 들어, 아지드법, 산 클로라이드법, 산 무수물법, 혼합 산 무수물법, DCC 법, 활성 에스테르법, 카르보이미다졸법 및 산화 환원법 등을 들 수 있다. 또, 그 합성은, 고상 합성법 및 액상 합성법 중 어느 것도 적용할 수 있다. 시판되는 단백질 합성 장치를 사용해도 된다. 합성 반응 후에는, 크로마토그래피 등의 공지된 정제법을 조합하여 세포 접착성 인자를 정제할 수 있다.
리간드와 결합하는 표적 물질로는, 특별한 한정은 없고, 예를 들어, 항원, 항체, 약제 (합성 화합물 또는 천연 유래의 화합물), 핵산, 세포 등을 들 수 있다.
기재는, 리간드와 고정화기가 공유 결합하고 있기 때문에, 표적 물질과 결합시키는 경우에도, 리간드는 기재에 안정적으로 고정되어 있어, 부주의하게 유리하는 경우는 없다.
≪고정화기의 불활성화 처리≫
리간드 고정 후에는, 리간드와 고정화기의 반응을 위한 용액을 제거 후, 리간드의 고정화에 관여하지 않은 고정화기를 불활성화 처리하는 것이 바람직하다. 불활성화 처리는, 고정화기의 종류에 따라, 단백질과의 결합성을 갖지 않는 다른 기로 변경시킴으로써 실시할 수 있다. 예를 들어, 고정화기가 말레이미드기 또는 숙신이미드기인 경우는, 메르캅토에탄올 등의 환원제로 불활성화 처리할 수 있다. 고정화기가 티올기인 경우는, 요오드아세트산, N-에틸말레이미드 등으로 불활성화 처리할 수 있다. 고정화기가 하이드라지노기인 경우는, 무수 아세트산, 무수 숙신산 등의 산 무수물로 불활성화 처리할 수 있다.
＜세포 배양 방법＞
일 실시형태로서, 본 발명은, 기재의 표면 상의 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기에, 표적 세포의 세포 표면과 특이적으로 결합하는 부위를 갖는 리간드를 결합시키는 공정과, 상기 리간드를 결합시킨 기재에, 표적 세포를 접촉시켜, 상기 리간드에 상기 표적 세포를 결합시키는 공정과, 상기 리간드에 결합한 상기 표적 세포를 배양하는 공정을 갖는, 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 배양 방법에 의하면, 고정화된 리간드와 특이적으로 결합하는 표적 세포를 포함하는 생체 시료를 기재 표면 상에 접촉시킴으로써, 표적 세포만을 선택적으로 포착하여 순화 배양할 수 있다. 또, 고정화하는 리간드의 종류를 적절히 선택함으로써, 다종 다양한 세포를 배양할 수 있다.
≪리간드의 결합 공정≫
상기 서술한 ≪리간드의 고정화 방법≫ 과 동일한 방법에 의해, 리간드를 기재 표면 상에 고정화할 수 있다. 또, 리간드로는, 상기와 동일한 것을 사용할 수 있다.
≪표적 세포의 결합 공정≫
계속해서, 리간드가 고정화된 기판에, 표적 세포를 포함하는 생체 시료를 접촉시켜, 표적 세포를 기재 표면 상의 리간드와 결합시킴으로써 선택적으로 포착한다. 리간드와 표적 세포의 결합은, 가역적이어도 되고, 비가역적이어도 된다.
생체 시료로는, 특별한 한정은 없고, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 누액 (淚液), 요 (尿), 땀 등의 체액, 조직편으로부터 조제된 세포의 현탁액 등을 들 수 있다. 그 기판에 접촉시키는 생체 시료로는, 생물로부터 채취된 것을 완충액 등으로 희석하는 등의 전처리를 실시한 것이어도 된다.
표적 세포와 기재를 접촉시키는 시간은, 1 ∼ 24 시간이면 된다.
≪배양 공정≫
계속해서, 충분량의 배지를 첨가하여, 표적 세포를 배양한다. 배양하는 시간은, 세포의 종류에 따라 적절히 설정할 수 있다. 배양 전에, 배지를 사용하여, 표적 세포 이외의 물질, 예를 들어, 생체 시료에 포함되어 있던 단백질, 사세포 (死細胞), 표적 세포 이외의 세포 등을 세정해도 된다.
사용하는 배지는, 세포의 생존 증식에 필요한 성분 (무기 염, 탄수화물, 호르몬, 필수 아미노산, 비필수 아미노산, 비타민) 등을 포함하는 기본 배지이면 되고, 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, DMEM, Minimum Essential Medium (MEM), RPMI-1640, Basal Medium Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle's Medium：Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), Glasgow Minimum Essential Medium (Glasgow MEM) 등을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 한정하여 해석되는 것은 아니다.
[제조예 1]
(1) 고정화기를 갖는 단위의 유래원이 되는 모노머의 조제
1 ℓ (리터) 의 3 구 플라스크에, 헥사에틸렌글리콜 45.2 g (160 m㏖), 파라톨루엔술폰산클로라이드 7.63 g (40 m㏖) 및 클로로포름 400 ㎖ 를 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물에 트리에틸아민 5.70 g (56 m㏖), 클로로포름 100 ㎖ 의 혼합물을 0 ℃, 질소 분위기하에서 적하하고, 그 후 실온에서 16 시간 교반하였다. 계속해서, 얻어진 반응 혼합물을 1 ℓ 분액 깔때기로 옮기고, 1N 염산 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 유기층을 세정하였다. 계속해서, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후, 아세트산에틸：메탄올 = 9：1 (vol) 을 전개 용매로 한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 무색 투명 액체 (하기 화합물 A) 가 얻어지고, 수량은 13.0 g, 수율은 74.7 ％ 였다.
[화학식 12]
Figure pct00012
다음으로, 1 ℓ 2 구 플라스크에, 말레이미드 29.1 g (300 m㏖), 푸란 61.3 g (900 m㏖), 디부틸하이드록시톨루엔 22 ㎎ (0.1 m㏖) 및 톨루엔 600 ㎖ 를 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 60 ℃, 질소 분위기하에서 24 시간 교반하고, 반응액을 빙랭한 후, 석출한 결정을 여과하고, 냉 (冷) 톨루엔으로 세정하였다. 백색 분말 (하기 화합물 B) 이 얻어지고, 수량은 43.5 g, 수율은 87.8 ％ 였다.
[화학식 13]
Figure pct00013
다음으로, 500 ㎖ 2 구 플라스크에, 화합물 A 13.0 g (30 m㏖), 화합물 B 7.43 g (45 m㏖), 탄산칼륨 20.7 g (150 m㏖) 및 아세토니트릴 300 ㎖ 를 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 질소 분위기하에서 2 시간 환류 교반하였다. 계속해서, 얻어진 반응 혼합물을 1 ℓ 분액 깔때기로 옮기고, 클로로포름 500 ㎖ 를 첨가하고, 1N 염산 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 유기층을 세정하였다. 계속해서, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후, 아세트산에틸：메탄올 = 8：2 (vol) 를 전개 용매로 한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 무색 투명 액체 (하기 화합물 C) 가 얻어지고, 수량은 6.29 g, 수율은 48.8 ％ 였다.
[화학식 14]
Figure pct00014
얻어진 화합물 C 를 1H-NMR 로 측정한 결과는 하기와 같다.
Figure pct00015
다음으로, 300 ㎖ 의 3 구 플라스크에, 화합물 C 6.01 g (14 m㏖), 트리에틸아민 2.83 g (28 m㏖) 및 클로로포름 100 ㎖ 를 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물에, 메타크릴산 클로라이드 1.76 g (16.8 m㏖) 및 클로로포름 50 ㎖ 의 혼합물을 0 ℃, 질소 분위기하에서 적하하고, 그 후 실온에서 1 시간 교반하였다. 계속해서, 얻어진 반응 혼합물을 500 ㎖ 분액 깔때기로 옮기고, 1 N 염산 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 유기층을 세정하였다. 계속해서, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후, 아세트산에틸：메탄올 = 9：1 (vol) 을 전개 용매로 한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 무색 투명 액체 (하기 화합물 D) 가 얻어지고, 수량은 4.86 g, 수율은 69.8 ％ 였다.
[화학식 15]
Figure pct00016
얻어진 화합물 D 를 1H-NMR 로 측정한 결과는 하기와 같다.
Figure pct00017
(2) 소수성기를 갖는 단위와 고정화기를 갖는 단위를 갖는 중합체의 조제
100 ㎖ 의 3 구 플라스크에, 메틸메타크릴레이트 1.80 g (18 m㏖), 화합물 D 0.995 g (2 m㏖), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) 28.0 ㎎ (0.113 m㏖), 및 톨루엔 11.2 g 을 첨가하였다. 계속해서, 반응액 중의 단량체의 농도를 20 질량％, 개시제 농도를 1 질량％ 로 하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 58 ℃, 질소 분위기하에서 16 시간 교반하고, 반응액을 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 계속해서, 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 E 를 얻었다. 수량은 1.47 g, 수율은 52.5 ％ 였다.
[화학식 16]
Figure pct00018
다음으로, 말레이미드기의 보호기인 푸란을 탈리하기 위해서, 100 ㎖ 의 플라스크에, 중합체 E 1.0 g, 디부틸하이드록시톨루엔 1 ㎎ (4.5 μ㏖), 및 톨루엔 20 g 을 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 3 시간 환류 교반하고, 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 F 를 0.76 g 얻었다.
[화학식 17]
Figure pct00019
[제조예 2]
(1) 소수성기를 갖는 단위와 생체 친화성기를 갖는 단위를 갖는 중합체의 조제
100 ㎖ 3 구 플라스크에, 트리에틸렌글리콜모노에틸에테르모노메타크릴레이트 4.93 g (20 m㏖), 메틸메타크릴레이트 2.00 g (20 m㏖), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) 69.3 ㎎ (0.279 m㏖), 및 톨루엔 27.7 g 을 첨가하였다. 계속해서, 반응액 중의 단량체의 농도를 20 질량％, 개시제 농도를 1 질량％ 로 하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 58 ℃, 질소 분위기하에서 16 시간 교반하고, 반응액을 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 계속해서, 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 G 를 얻었다.
[화학식 18]
Figure pct00020
[제조예 3]
(1) 고정화기를 갖는 단위의 유래원이 되는 모노머의 조제
헥사에틸렌글리콜 대신에 1,3-프로판디올을 사용한 것 이외에는 제조예 1 과 동일한 방법으로, 고정화기를 갖는 단위의 유래원이 되는 모노머를 조제하고, 화합물 H 를 얻었다.
(2) 소수성기를 갖는 단위와 고정화기를 갖는 단위를 갖는 중합체의 조제
100 ㎖ 의 3 구 플라스크에, 메틸메타크릴레이트 2.70 g (27 m㏖), 화합물 H 0.87 g (3 m㏖), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) 35.7 ㎎ (0.144 m㏖), 및 톨루엔 14.3 g 을 첨가하였다. 계속해서, 반응액 중의 단량체의 농도를 20 질량％, 개시제 농도를 1 질량％ 로 하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 58 ℃, 질소 분위기하에서 16 시간 교반하고, 반응액을 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 I 를 얻었다. 수량은 1.53 g, 수율은 42.9 ％ 였다.
[화학식 19]
Figure pct00021
다음으로, 말레이미드기의 보호기인 푸란을 탈리하기 위해서, 100 ㎖ 의 플라스크에, 중합체 I 의 1.0 g, 디부틸하이드록시톨루엔 1 ㎎ (4.5 μ㏖), 및 톨루엔 20 g 을 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 3 시간 환류 교반하고, 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 계속해서, 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 J 를 0.82 g 얻었다.
[화학식 20]
Figure pct00022
[제조예 4]
(1) 고정화기를 갖는 단위의 유래원이 되는 모노머의 조제
헥사에틸렌글리콜 대신에 1,6-헥산디올을 사용한 것 이외에는 제조예 1 과 동일한 방법으로, 고정화기를 갖는 단위의 유래원이 되는 모노머를 조제하고, 화합물 K 를 얻었다.
(2) 소수성기를 갖는 단위와 고정화기를 갖는 단위를 갖는 중합체의 조제
100 ㎖ 3 구 플라스크에, 메틸메타크릴레이트 3.60 g (36 m㏖), 화합물 K 1.33 g (4 m㏖), 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴) 49.3 ㎎ (0.198 m㏖), 및 톨루엔 19.7 g 을 첨가하였다. 계속해서, 반응액 중의 단량체의 농도를 20 질량％, 개시제 농도를 1 질량％ 로 하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 58 ℃, 질소 분위기하에서 16 시간 교반하고, 반응액을 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 계속해서, 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 L 을 얻었다. 수량은 0.68 g, 수율은 13.8 ％ 였다.
[화학식 21]
Figure pct00023
다음으로, 말레이미드기의 보호기인 푸란을 탈리하기 위해서, 100 ㎖ 플라스크에, 중합체 L 0.5 g, 디부틸하이드록시톨루엔 1 ㎎ (4.5 μ㏖), 및 톨루엔 10 g 을 첨가하였다. 계속해서, 얻어진 혼합물을 3 시간 환류 교반하고, 빙랭한 후, 헥산에 적하함으로써 중합체를 침전시켰다. 계속해서, 얻어진 중합체를 충분히 헥산으로 세정한 후, 감압 건조시켜 백색 분말상의 중합체 M 을 0.37 g 얻었다.
[화학식 22]
Figure pct00024
[예 1]
제조예 1 에서 얻어진 중합체 F 와, 제조예 2 에서 얻어진 중합체 G 를 그 중량비를 표 2 에 나타내는 바와 같이, 100：0, 99.5：0.5, 99.0：1.0, 95.0：5.0, 90.0：10.0, 50：50 및 0：100 이 되도록 칭량하고, 그 농도가 0.1 질량％ 가 되도록 AK-225 (아사히 가라스 제조) 에 용해시켜, 도포액을 조제하였다. 계속해서, 그 도포액을 24 웰의 마이크로 플레이트 (ATG 사 제조) 에 2.2 ㎖ 씩 각 3 웰에 분주 (分注) 하고, 1 일간 방치하여 용매를 휘발시키고, 웰 표면에 피복층을 형성하였다.
[예 2]
중합체 (F) 대신에 제조예 3 에서 얻어진 중합체 J 를 사용하여, 제조예 2 에서 얻어진 중합체 G 와의 중량비를 표 2 에 나타내는 바와 같이, 100：0, 99.5：0.5, 99.0：1.0, 95.0：5.0, 90.0：10.0 및 50：50 이 되도록 칭량한 것 이외에는, 예 1 과 동일한 방법에 의해 도포액을 조제하였다. 계속해서, 그 도포액을 사용하여, 예 1 과 동일한 방법에 의해, 24 웰의 마이크로 플레이트의 웰 표면에 피복층을 형성하였다.
[예 3]
중합체 (F) 대신에 제조예 4 에서 얻어진 중합체 M 을 사용하여, 제조예 2 에서 얻어진 중합체 G 와의 중량비를 표 2 에 나타내는 바와 같이, 100：0, 99.5：0.5, 99.0：1.0, 95.0：5.0, 90.0：10.0 및 50：50 이 되도록 칭량한 것 이외에는, 예 1 과 동일한 방법에 의해 도포액을 조제하였다. 계속해서, 그 도포액을 사용하여, 예 1 과 동일한 방법에 의해, 24 웰의 마이크로 플레이트의 웰 표면에 피복층을 형성하였다.
[시험예 1] 중합체의 내수용성 시험
제조예 1, 3, 4 에서 얻어진 중합체 F, J, M 의 각각 10 ㎎ 과, 물 1 g 을 샘플관에 칭량하여 담고, 실온에서 1 시간 교반한 후에 육안으로 내수용성을 확인하였다. 평가는 이하의 기준으로 실시하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
＜평가 기준＞
○ (양호)：함불소 중합체가 잔존하고 있었다.
× (불량)：함불소 중합체가 완전히 용해하고, 잔존하고 있지 않았다.
Figure pct00025
표 1 로부터, 각 중합체는 충분히 내수용성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 2] 마이크로 플레이트의 단백질 비흡착성 확인 시험
(1) 발색액, 단백질 용액의 조제
발색액은, 퍼옥시다아제 발색액 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMBZ), KPL 사 제조) 50 ㎖ 와 TMB Peroxidase Substrate (KPL 사 제조) 50 ㎖ 를 혼합한 것을 사용하였다. 또, 단백질 용액으로서, 단백질 (POD-goat anti mouse IgG, Biorad 사) 을 인산 완충 용액 (D-PBS, Sigma 사 제조) 으로 16,000 배로 희석한 것을 사용하였다.
(2) 단백질의 흡착
예 1 ∼ 3 에서 얻어진 피복층을 형성한 24 웰 마이크로 플레이트에 있어서, 각각 피복층을 형성한 웰에 단백질 용액의 2 ㎖ 를 분주하고 (1 웰마다 2 ㎖ 분주), 실온에서 1 시간 방치하였다. 블랭크로서, 아무것도 피복되어 있지 않은 96 웰 마이크로 플레이트에 있어서, 3 웰에 단백질 용액의 2 ㎕ 를 분주 (1 웰마다 2 ㎕ 분주) 하였다.
(3) 웰의 세정
이어서, 24 웰 마이크로 플레이트를, 계면 활성제 (Tween20, 와코 쥰야쿠사 제조) 를 0.05 질량％ 포함시킨 인산 완충 용액 (D-PBS, Sigma 사 제조) 의 4 ㎖ 로 4 회 세정하였다 (1 웰마다 4 ㎖ 를 사용).
(4) 발색액의 분주
이어서, 세정을 끝낸 24 웰 마이크로 플레이트에, 발색액 2 ㎖ 를 분주하고 (1 웰마다 2 ㎖ 를 사용), 7 분간 발색 반응을 실시하였다. 2N 황산 1 ㎖ 를 첨가함으로써 (1 웰마다 1 ㎖ 를 사용) 발색 반응을 정지시켰다. 블랭크는, 96 웰 마이크로 플레이트에, 발색액 100 ㎕ 를 분주하고 (1 웰마다 100 ㎕ 를 사용), 7 분간 발색 반응을 실시하고, 2N 황산 50 ㎕ 를 첨가함으로써 (1 웰마다 50 ㎕ 를 사용) 발색 반응을 정지시켰다.
(5) 흡광도 측정 및 단백질 흡착률 Q 의 계산
이어서, 24 웰 마이크로 플레이트의 각 웰로부터 150 ㎕ 의 액을 취하고, 96 웰 마이크로 플레이트로 옮겼다. 흡광도는, MTP-810Lab (코로나 전기사 제조) 에 의해 450 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 여기서, 블랭크의 흡광도 (N = 3) 의 평균값을 A0 으로 하였다. 24 웰 마이크로 플레이트로부터 96 웰 마이크로 플레이트로 이동시킨 액의 흡광도를 A1 로 하였다. 단백질 흡착률 Q1 을 하기 식에 의해 구하고, 단백질 흡착률 Q 는 그 평균값으로 하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다. Q 는 0.2 ％ 이하가 바람직하고, 0.1 ％ 이하가 보다 바람직하다.
Q1 = A1 / {A0 × (100/블랭크의 단백질 용액의 분주량)} × 100 = A1 / {A0 × (100/2 ㎕)} × 100 [％]
Figure pct00026
(6) 결과
표 2 에 있어서, 예 1-1, 1-7, 2-6, 및 3-6 은 비교예이다. 예 1-2 ∼ 1-6, 예 2-1 ∼ 2-5, 및 예 3-1 ∼ 3-5 는 실시예이다.
표 2 로부터, 예 1 ∼ 3 에 있어서, 생체 친화성을 갖는 기를 갖는 단위를 가짐으로써, 단백질의 비특이적인 흡착이 억제되어 있는 것이 확인되었다. 예 1-7, 2-6 및 3-6 은 단백질 흡착률이 0.2 ％ 초과이며 비특이적 흡착이 일어나 있는 것을 알 수 있다. 또, 예 1-7 의 결과로부터, 예 1 의 중합체에 대해서는, 중합체 F 의 링커가 폴리에틸렌글리콜기이기 때문에, 단백질의 비특이적인 흡착이 억제되는 경향이기는 하지만, 다른 실시예와 비교하면, 억제는 충분하지 않다.
[시험예 3] 플레이트의 펩티드의 선택적 고정화 확인 시험
(1) 중합체를 피복한 플레이트의 조제
예 1 ∼ 3 에서 얻어진 피복층을 형성한 24 웰 마이크로 플레이트에 있어서, 표 2 의 예 1-5, 예 2-4, 예 3-4 의 비율의 중합체가 피복된 웰을 사용하였다.
(2) 펩티드의 고정화
다음으로, 세포 접착 활성이 있는 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 가 1 웰에 대해 0.1 μ㏖ 이 되도록 분주하고, 웰 내의 말레이미드와 반응시키고, 공유 결합에 의한 용기에 대한 고정화를 실시하였다.
(3) Ellman 시약을 사용한 미반응의 펩티드의 정량
다음으로, 2-니트로-5-메르캅토벤조산 (TNB) 용액을 10 ㎕ 씩 분주하였다. TNB 용액은, 유리의 티올기와 반응하여 황색으로 정색 (呈色) 한다. 시간 경과적으로 미반응의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 정색하고, 흡광도를 측정함으로써 정량화하고, 반응 전의 펩티드에 대한 잔존하는 펩티드의 비율을 계산하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다.
(4) 결과
도 1 로부터, 예 1 ∼ 3 모두에 있어서, 잔존하는 펩티드의 비율이 시간 경과적으로 줄어들었다. 또한, 예 2 및 3 에 대해서는, 펩티드와 말레이미드기의 반응 효율이 보다 우수한 것이 분명해졌다.
[시험예 4] 플레이트의 세포 접착 확인 시험
(1) 중합체를 피복한 플레이트의 조제
제조예 1 에서 얻어진 화합물 D 와 메틸메타크릴레이트를 반응시키는 몰비를 조절하여, 5 종류의 중합체 F 를 조제하였다. 계속해서, 5 종류의 중합체 F 와 중합체 G 를 각각 10：90 의 중량비로 혼합하여, 5 종류의 플레이트에 피복하는 중합체를 얻었다. 얻어진 중합체 중에 포함되는 말레이미드기를 갖는 단위의 양은, 각각 0, 0.02, 0.19, 0.95, 1.85 μ㏖ 이었다.
이어서, 각 얻어진 중합체에 대해, 그 농도가 0.1 질량％ 가 되도록 AK-225 (아사히 가라스 제조) 에 용해시켜, 도포액을 조제하였다. 계속해서, 조제한 도포액을 24 웰의 마이크로 플레이트 (ATG 사 제조) 에 2.2 ㎖ 씩 각 세로 4 웰에 분주하고, 1 일간 방치하여 용매를 휘발시키고, 웰 표면에 피복층을 형성하였다. 컨트롤로서, 가장 좌측의 세로 4 웰에 대해서는, 미처리인 상태로 하였다.
(2) 말레이미드기의 불활성화 처리
중합체 중에 포함되는 말레이미드기가 단백질을 특이적으로 고정화하는 것을 확인하기 위해서, 네거티브 컨트롤로서, 24 웰 마이크로 플레이트의 가장 아래의 1 행 (6 웰) 에 대하여, 이하의 방법에 의해, 말레이미드기의 불활성화 처리를 실시하였다.
먼저, 분말의 시스테인을 10 ㎎/㎖ 가 되도록, PBS 로 용해하고, 시스테인 용액을 조제하였다. 계속해서, 그 시스테인 용액에, 종농도 100 mM 이 되도록 디티오트레이톨 (dithiothreitol；DTT) (와코 쥰야쿠) 을 용해하였다. 계속해서, 그 DTT 함유 시스테인 용액을 24 웰 마이크로 플레이트의 가장 아래의 1 행 (6 웰) 에 300 ㎕ 씩 분주하고, 실온에서 3 시간 반응시켰다. 계속해서, PBS 로 3 회 세정하였다.
(3) 펩티드의 고정화
다음으로, 세포 접착 활성이 있는 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 저농도 (0.02 μ㏖) 와 고농도 (0.2 μ㏖) 로 웰 내의 말레이미드와 반응시키고, 공유 결합에 의한 용기에 대한 고정화를 실시하였다.
먼저, 분말의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 5 ㎎ 을 PBS 724 ㎕ 에 용해하여, 10 mM 의 펩티드 용액을 조제하였다. 계속해서, PBS 로 20 배로 희석하여 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액과, PBS 로 200 배로 희석하여 저농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액을 조제하였다. 계속해서, 저농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액을 위로부터 2 번째의 1 행 (6 웰) 에, 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액을 위로부터 3 번째 및 4 번째의 2 행 (12 웰) 에, 각각 400 ㎕ 씩 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 이 때, 저농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액을 분주한 1 웰 중에 포함되는 펩티드의 양은, 0.02 μ㏖ 이며, 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 용액을 분주한 1 웰 중에 포함되는 펩티드의 양은, 0.2 μ㏖ 이었다. 계속해서, 상청을 제거하고, PBS 로 3 회 세정하였다.
(4) 미반응의 말레이미드기의 불활성화 처리
RGD 펩티드 (시스테인 함유) 가 고정화되어 있지 않은 말레이미드기와, 세포 분비 인자 또는 세포 자신이 결합하는 것을 방지하기 위해서, 세포를 파종하기 전에, 중합체 중에 잔존하는 미반응의 말레이미드기의 불활성화 처리를 실시하였다.
먼저, 24 웰 전부에 (1) 에서 조제한 DTT 함유 시스테인 용액을 400 ㎕ 씩 분주하고, 실온에서 3 시간 반응시켰다. 계속해서, PBS 로 3 회 세정하였다.
(5) 세포 파종
세포 접착성을 확인하기 위해서, TIG-3 세포를 사용한 세포 접착 어세이를 실시하였다. TIG-3 세포란, 일본인 남성 10 주 태아 폐의 조직편으로부터, 트립신법으로 취해진 선유아 세포이다. TIG-3 세포는, 10 ％ 소 태아 혈청 (Thermo Fisher Scientific 사) 을 포함하는 MEM 배지 (Thermo Fisher Scientific 사) (이하, 유지 배지라고 기재) 를 사용하여, 5 ％ 이산화탄소를 통기시킨 CO2 인큐베이터 중, 37 ℃ 에서 계대 배양을 실시한 것을 사용하였다.
먼저, 100 ㎜ 디쉬에서 배양한 TIG-3 세포를 5 ㎖ PBS 로 세정하였다. 계속해서, 세포 박리 용액으로서 Trypsin/EDTA (Thermo Fisher Scientific 사) 를 1 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 분간 반응시켰다. 계속해서, 유지 배지 9 ㎖ 를 첨가하고, 박리 용액을 희석하여 반응을 정지하였다. 계속해서, 15 ㎖ 원심관으로 옮기고, 원심을 실시하였다 (160 × g, 5 분). 계속해서, 상청을 제거하고, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지 5 ㎖ 에 현탁하고, 재차 원심을 실시하였다 (160 × g, 5 분). 혈청 성분을 제거하기 위해서, 상기의 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지를 사용한 세정을 2 회 실시하였다. 계속해서, MEM 배지에 현탁하고, 세포수를 계측하고, 5 × 105 세포/㎖ 가 되도록 조정하였다. 계속해서, 24 웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 300 ㎕ 씩 세포 현탁액을 파종하고, 37 ℃ 에서 1 시간, CO2 인큐베이터 내에서 정치 (靜置) 하였다. 계속해서, 배양 상청을 제거하고, Cell Counting Kit-8 (도진 화학 연구소) 을 전체의 1/10 량 포함하는 MEM 배지를 각 웰에 300 ㎕ 씩 분주하였다. 1 시간 후, 배양 상청을 회수하고, 그 중의 100 ㎕ 를 사용하여 450 ㎚ 의 흡광도를 계측하였다. 얻어진 흡광도를 사용하여, 접착한 세포수를 정량화하였다. 결과를 도 2 및 도 3 에 나타낸다.
(6) 결과
도 2 로부터, 플레이트 내의 미처리의 웰에 관해서는, RGD 펩티드 (시스테인 함유) 의 유무에 상관없이, 많은 세포가 접착하는 경향이 관찰되었다 (도 2 중의 「미처리」 의 열 참조.). 한편, 말레이미드기를 포함하지 않는 중합체에서는 (도 2 중의 중합 중에 포함되는 말레이미드기의 양 「0」 의 열 참조.), 세포 접착이 거의 보이지 않았기 때문에, 중합체의 기본적 성질인 세포 접착 억제 효과를 확인할 수 있었다.
또, 도 3 으로부터 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 고정화한 웰에서는, 중합체 중에 포함되는 말레이미드기의 양과 상관하여, 접착 세포수가 증가하는 경향이 확인되었다 (도 3 중의 RGD (저농도) 및 RGD (고농도) 참조.). 이 경향은, 말레이미드기를 시스테인 용액으로 불활성화 처리한 웰에서는, 보이지 않고 (도 3 중의 RGD (말레이미드 불활성화) 참조.), 세포가 펩티드에 접착하고 있는 것, 그 펩티드가 중합체에 포함되는 말레이미드기를 개재하여 고정화되어 있는 것이 나타났다.
또, 도 3 으로부터, 말레이미드기의 양이 0.02 μ㏖ 일 때, 펩티드의 농도 의존성이 보이지 않았다. 이것은, 말레이미드기에 대한 펩티드의 결합이 포화하고 있는 것으로 추찰된다.
또, 말레이미드기의 양이 0.19 μ㏖ 일 때, 펩티드의 농도 의존적인 세포 접착 활성이 검출되었다. 이것은 말레이미드기가 충분 량 존재하기 때문인 것으로 추찰된다.
또, 말레이미드기가 0.95 또는 1.85 μ㏖ 일 때, 미처리의 웰 및 말레이미드기를 불활성화시킨 웰에 있어서, 흡광도가 상승되어 있었다. 이것은, 말레이미드기가 많고, 생체 친화성을 갖는 기 (본 시험예에 있어서는, 폴리에틸렌글리콜기) 의 비율이 상대적으로 감소하기 때문에, 세포 유래의 단백질이 비특이적으로 흡착했기 때문인 것으로 추찰된다.
따라서, RGD 펩티드 (시스테인 함유) 의 양이 0.2 μ㏖ 이고, 말레이미드기의 양이 0.19 μ㏖ 로 결합시키는 것이 최적이고, 목적으로 하는 단백질과 고정화기의 양은, 동일한 정도인 것이 바람직한 것이 시사되었다.
도 4 는, 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 고정화한 웰 및 미처리의 웰에서의 TIG-3 세포의 형체를 비교한 화상이다. 도 4 로부터, 고농도의 RGD 펩티드 (시스테인 함유) 를 고정화한 웰에서는, TIG-3 세포는 둥근 세포 형체를 나타내고, 떠올라 있었다. 한편, 미처리의 웰에서는, TIG-3 세포는 평평한 형체를 취하고 있고, 강하게 신전 (伸展) 되어 있었다. 이 차이는, 배양 용기에 대하여, 세포가 「점」 으로 접착하고 있는가, 「면」 으로 접착하고 있는가의 차이에 따른 것으로 추측된다.
이상의 결과로부터, 실시예의 중합체가 「선택적 부분 접착」 이라고 하는 컨셉 그대로의 기능을 갖고 있는 것이 강하게 시사되었다.
산업상 이용가능성
본 발명에 관련된 수지 조성물은, 표적 물질을 선택적으로 포착하기 위한 기재의 피복재로서 적합하고, 특히, 특정의 세포를 선택적으로 포착하여, 다른 단백질 등의 혼입을 할 수 있는 한 방지한 상태에서 배양하기 위한 세포 배양용 기재의 피복재로서 적합하다.
또한, 2015년 12월 24일에 출원된 일본 특허출원 2015-251518호의 명세서, 특허 청구의 범위, 도면, 및 요약서의 전체 내용을 여기에 인용하고, 본 발명의 명세서의 개시로서 받아들이는 것이다.

Claims (10)

  1. 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기를 갖는 단위 (a) 와, 하기 일반식 (1) 로 나타내는 기, 일반식 (2) 로 나타내는 기 및 일반식 (3) 으로 나타내는 기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 기를 갖는 단위 (b) 를 갖는 중합체, 또는,
    상기 단위 (a) 를 갖는 중합체 (A) 와, 상기 단위 (b) 를 갖는 중합체 (B) 를 포함하는, 수지 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pct00027

    [상기 식 중, 아스테리스크는 중합체 주사슬과의 직접적 결합 부위 또는 연결기를 개재한 간접적 결합 부위를 나타낸다. 상기 식 (1) 중, n 은 1 ∼ 10 의 정수를 나타내고, R11 은 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기를 나타낸다. 상기 식 (2) 중, R21 및 R22 는 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기를 나타내고, R23 ∼ R25 는 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기를 나타낸다. 상기 식 (3) 중, R31 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬렌기를 나타내고, R34 는 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬렌기를 나타내고, R32 및 R33 은 각각 독립적으로 탄소수 1 ∼ 5 의 알킬기를 나타낸다. X- 는 하기 식 (4) 로 나타내는 기 또는 하기 식 (5) 로 나타내는 기를 나타낸다. 하기 식 (4) 및 (5) 중, 아스테리스크는 R34 와의 결합 부위를 나타낸다.]
    [화학식 2]
    Figure pct00028
  2. 제 1 항에 있어서,
    또한, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는 중합체 (C) 를 포함하는, 또는,
    상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체가, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는, 혹은, 상기 중합체 (A) 및 상기 중합체 (B) 중 적어도 어느 일방이, 하기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 를 갖는, 수지 조성물.
    [화학식 3]
    Figure pct00029

    [상기 식 (6) 중, 아스테리스크는 중합체 주사슬과의 직접적 결합 부위를 나타내고, Y61 은 단결합 또는 2 가의 유기기를 나타내고, R61 은 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기를 나타낸다.]
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체 또는 상기 중합체 (A) 중에 포함되는 단위 (a) 가 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 0.001 ∼ 5 ㏖％ 인, 수지 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단위 (a) 와 단위 (b) 를 갖는 중합체 또는 상기 중합체 (B) 중에 포함되는 단위 (b) 가, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 5 ∼ 60 질량％ 인, 수지 조성물.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 일반식 (6) 으로 나타내는 기를 갖는 단위 (c) 가, 조성물을 구성하는 단위의 총수에 대하여 30 ∼ 90 질량％ 포함되는, 수지 조성물.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    또한, 가수 분해에 의해 실란올기를 생성하는 관능기, 에폭시기, (메트)아크릴기 또는 글리시딜기로 이루어지는 가교성기를 갖는 단위 (d) 가 포함되는, 수지 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 단위 (a) 가 0.002 ∼ 3 질량％, 상기 단위 (b) 가 10 ∼ 45 질량％, 상기 단위 (c) 가 50 ∼ 80 질량％, 및 상기 단위 (d) 가 0 ∼ 2.5 질량％ 포함되는, 수지 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 수지 조성물에 의해, 적어도 표면의 일부가 피복된, 기재.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 기재가 세포 배양용인, 기재.
  10. 제 8 항에 기재된 기재의 표면 상의 말레이미드기, 숙신이미드기, 티올기 및 하이드라지노기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기에, 표적 세포의 세포 표면과 특이적으로 결합하는 부위를 갖는 리간드를 결합시키는 공정과,
    상기 리간드를 결합시킨 기재에, 표적 세포를 접촉시켜, 상기 리간드에 상기 표적 세포를 결합시키는 공정과,
    상기 리간드에 결합한 상기 표적 세포를 배양하는 공정을 갖는 세포 배양 방법.
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