CN104548126B - 一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料技术领域,公开了一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物及其制备与应用。所述复合物的制备方法为:将螺旋链多糖直链淀粉于二甲基亚砜中与N,N’‑羰基二咪唑和乙二胺反应,得到含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物,然后在水溶液中加入单壁碳纳米管,经超声处理、离心、过滤和冷冻干燥得到直链淀粉衍生物‑单壁碳纳米管包合物;然后将包合物分散在双蒸水中,加入核酸,充分振荡后孵育,得到螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。所述复合物结合了包合物的光热转换效应和核酸的特殊功能,可用于光热‑基因联合治疗药物的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,具体涉及一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物及其制备与应用。
背景技术
近年来,通过水溶性阳离子聚合物链段修饰改性的单壁碳纳米管(SWCNTs)在光热-基因联合治疗等领域,显示出良好的应用前景(Wang L.,et al.Biomaterials,2013,34,262-274.)。一方面,SWCNTs作为一种具有高度离域化π电子共轭体系的新型碳结构一维纳米材料,具有对近红外光响应和产生光热转换的特性,可用于肿瘤的光热治疗(MoonH.K.,et al.ACS nano,2009,3,3707-3713;Liu X.W.,et al.Biomaterials,2011,32,144-151.);另一方面,用于修饰改性的水溶性阳离子聚合物不仅可改善SWCNTs的水分散性能,还可借助静电相互作用与质粒DNA或小干扰RNA进行复合而实现基因传递(Karmakar A.,etal.International Journal of Nanomedicine,2011,6,1045-1055.)。然而,目前该类研究还十分有限,主要问题包括:(1)阳离子聚合物对SWCNTs的修饰改性需借助多步化学反应,不仅操作繁琐,而且破坏SWCNTs本身化学结构,使其性能受到影响;(2)使用的阳离子聚合物通常为聚乙烯亚胺(PEI)等,生物相容性较差;(3)该类功能化单壁碳纳米管的水分散稳定性有待提高。
直链淀粉是广泛存在于天然之中的一种由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键连接而成天然多糖,在适当条件下可形成内腔疏水、腔外亲水的圆筒形螺旋链结构,是主客体化学的研究热点之一。Kim等(Kim O.K.,et al.Journal of American ChemistrySociety,2003,125,4426.)在二甲基亚砜/水的混合溶剂中制备了直链淀粉功能化的单壁碳纳米管。伏传龙等(中国发明专利CN101182394A)使用类似方法制备了螺旋形貌直链淀粉功能化碳纳米管。该制备方法操作简便、易于实施,得到的功能化单壁碳纳米管生物相容性良好,但其在水溶液中的分散稳定性有待提高,且通过阳离子化修饰使之能够结合核酸等负电性生物活性分子,在现有技术中尚未见报道。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备得到的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
本发明的再一目的在于提供上述螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,包括以下制备步骤:
(1)将直链淀粉溶解于二甲基亚砜中,在惰性气体保护下,加入N,N’-羰基二咪唑(CDI),在20~40℃温度下搅拌反应1~6小时,然后往体系中滴加乙二胺,继续搅拌反应11~66小时后用水透析,冷冻干燥后得到含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)制备的含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物溶于水配制成0.1~5mg/mL的溶液,加入单壁碳纳米管,然后在冰水浴中进行超声处理,将得到的混合体系进行离心、微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)得到的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中,配制成0.01~1mg/mL的分散液;接着加入核酸,充分振荡后置于水浴中孵育,得到螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
步骤(1)中所述的直链淀粉优选经过纯化处理的马铃薯、玉米或者小麦直链淀粉;所述纯化处理步骤为:将直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的甲醇或乙醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作2~4次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
所述二甲基亚砜在使用前通过以下方法纯化:在二甲基亚砜中加入氢化钙,室温搅拌2~7天去除水分,减压蒸馏,收集的馏出液备用。
所述惰性气体是指氮气或氩气。
所述的用水透析优选用截流分子量为1000~30000的透析袋,用去离子水或蒸馏水透析1~7天。
所述N,N’-羰基二咪唑与直链淀粉的质量比为(0.1~6):1;乙二胺与N,N’-羰基二咪唑的摩尔比为(2~20):1。
步骤(2)所述单壁碳纳米管是指长度为0.5~10μm,直径为1~5nm的单壁碳纳米管;单壁碳纳米管与直链淀粉衍生物的质量比为(0.1~2):1。
所述超声处理是指在超声频率为20~65kHz条件下处理1~6个周期;所述周期为每隔1~30min超声处理5~60min。
所述的离心是指在转速为500~3000rpm的条件下离心1~5min;所述的微孔滤膜是指孔径为100~500nm的水系或有机系微孔滤膜。
所述冷冻干燥前通过重复离心、水洗和过滤以除去未参与形成包合物的物质。
步骤(3)所述核酸优选质粒DNA(pDNA)或siRNA;所述的置于水浴中孵育优选置于35~40℃水浴中孵育10~60min。
一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物,通过以上方法制备得到。
上述螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物在制备光热-基因联合治疗药物领域中的应用。
本发明的制备原理为:首先将直链淀粉与N,N’-羰基二咪唑和乙二胺反应得到含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物;然后通过非共价物理作用在水中包合分散单壁碳纳米管,经离心、过滤、水洗得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;再利用包合物表面的直链淀粉衍生物引入的阳离子化伯氨基团对负电性的核酸进行复合,得到螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果:
(1)本发明所使用的原料之一螺旋链天然多糖直链淀粉来源十分丰富,且可生物降解,有利于提高复合载体的生物相容性;
(2)本发明所涉及的多糖衍生物合成过程、单壁碳纳米管包合物以及复合载体的制备过程所使用反应条件温和,且易于实施;
(3)本发明在不破坏单壁碳纳米管本身结构的前提下对其进行功能化修饰,有利于其独特性能的保持;
(4)本发明所制备的水溶性直链淀粉衍生物通过包合作用提高单壁碳纳米管水分散性能的同时,所得包合物还具有明显的光热转换效应;同时利用其表面阳离子伯氨基团对带负电性的核酸分子进行复合,特别是与治疗性基因药物pDNA或siRNA的复合,使其适用于制备光热-基因联合治疗药物。
附图说明
图1为实施例1中的EA-Amy-I(a)和实施例2中的EA-Amy-II(b)的核磁共振氢谱图。
图2为SWCNTs(a)、实施例1的EA-Amy-I/SWCNTs(b)、实施例2的EA-Amy-II/SWCNTs(c)、实施例1的EA-Amy-I(d)和实施例2的EA-Amy-II(e)的热失重对比图。
图3为SWCNTs(a)、实施例1的EA-Amy-I/SWCNTs(b)和实施例2的EA-Amy-II/SWCNTs(c)水分散体系(0.1mg/mL)放置不同时间的光学照片图。
图4为水(a)以及实施例1的EA-Amy-I/SWCNTs(b)、实施例2的EA-Amy-II/SWCNTs(c)的水分散体系(0.04mg/mL)在近红外光照射下温度随时间的变化图。
图5为在实施例1的EA-Amy-I/SWCNTs(a)和实施例2的EA-Amy-II/SWCNTs(b)不同浓度下293T细胞的存活率结果图。
图6为不同质量比下实施例1的EA-Amy-I/SWCNTs/pDNA(a)和实施例2的EA-Amy-II/SWCNTs/pDNA(b)与pDNA的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)称取1g马铃薯直链淀粉溶解于50mL二甲基亚砜中,在氮气保护下,加入1gCDI,在30℃温度下搅拌反应2h,然后往体系中滴加10倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应22h后转入截留分子量为14000的透析袋中用水透析2天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物(EA-Amy-I);
(2)将EA-Amy-I溶于水配制成2mg/mL的溶液,加入0.5倍于EA-Amy-I质量的单壁碳纳米管(长度1-3μm,直径1-2nm),然后在冰水浴中使用65kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔5min超声30min,共进行3个周期的处理,将得到的混合体系在1000rpm下离心3min,所得分散液以220nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物(EA-Amy-I/SWCNTs);
(3)将EA-Amy-I/SWCNTs分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的分散液,加入pDNA(pUC18DNA,2686bp,1mg/mL于pH8.0的10mM Tris-HCl溶液,购于宝生物工程有限公司)至pDNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于38℃水浴中孵育30min,得到复合比值分别为0.1、1、2、3、5和10的得到螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物(EA-Amy-I/SWCNTs/pDNA)。
本实施例所使用的马铃薯直链淀粉在使用前经过纯化处理:将马铃薯直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的甲醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作2次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
本实施例中所述的二甲基亚砜经过下述方法处理得到:在市售二甲基亚砜中加入氢化钙,室温搅拌7天去除水分,减压蒸馏,收集的馏出液为干燥的二甲基亚砜。
步骤(1)的EA-Amy-I溶于重水配成5mg/mL的溶液,利用300MHz的核磁共振氢谱仪对其进行测定,结果如图1中a所示,根据乙二胺残基亚甲基质子1以及直链淀粉异头碳质子4的信号峰积分对比计算出EA-Amy-I中侧基接枝率为0.48。
使用热失重分析仪对SWCNTs(a)、步骤(2)的EA-Amy-I/SWCNTs(b)、步骤(1)的EA-Amy-I(d)在氮气氛围下进行表征,结果如图2所示。由图可见,EA-Amy-I/SWCNTs(b)在200℃时开始明显失重,在350℃后失重趋于平缓,800℃时残留质量为64.7%。通过与SWCNTs(a)、EA-Amy-I(d)在该温度下的平衡失重残留质量百分数对比,可以算出EA-Amy-I/SWCNTs中SWCNTs的质量分数为66.4%。
取SWCNTs(a)、步骤(2)的EA-Amy-I/SWCNTs(b)分散在水中形成0.1mg/mL的分散液,超声后1分钟以及放置一个月后的光学照片如图3所示,由图中可见SWCNTs(a)极易沉降,而久置后EA-Amy-I/SWCNTs(b)分散体系仍然稳定。
取步骤(2)的EA-Amy-I/SWCNTs(b)分散在水中形成0.04mg/mL的分散液,利用808nm近红外激光在1W/cm-2的强度下对其进行照射,记录不同时间点的温度值,其变化与水(a)对比如图4所示,由图中可见EA-Amy-I/SWCNTs(b)在水分散体系中表现出明显的光热转换效应。
考察不同浓度下步骤(2)的EA-Amy-I/SWCNTs的细胞毒性:将对数生长期的人胚肾293T细胞(中山大学实验动物中心细胞实验室提供,为常用实验细胞株,可从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买得到)以1×104个/孔接种于96孔板,每孔培养基(DMEM低糖培养基,含10%胎牛血清,Gibco公司提供)终体积为200μL,在37℃、5%CO2环境中培养24小时待细胞长到80%左右。吸去培养基,加入无血清培养基,在细胞孔中加入不同浓度的EA-Amy-I/SWCNTs分散液,每个浓度组设4个复孔。24小时后,每孔加入15μL3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(0.5mg/mL),继续在培养箱内培养,4小时后将培养基及MTT吸出,加入150μL DMSO,摇床中摇匀15分钟,在酶标仪(Infinite M200,TECAN公司提供)上检测570nm波长处的OD值。同时设置调零孔(不加细胞和EA-Amy-I/SWCNTs分散液)、对照孔(不加EA-Amy-I/SWCNTs分散液),计算细胞存活率。结果如图5中a所示,由图中可以看出随着EA-Amy-I/SWCNTs浓度的增大,细胞存活率有所下降,但在高浓度下仍保持较高的存活率,说明EA-Amy-I/SWCNTs具有较好的生物相容性。
取步骤(3)中复合比值分别为0.1、1、2、3、5和10的EA-Amy-I/SWCNTs/pDNA复合物进行凝胶电泳测试,琼脂糖浓度为1%,运行电压为100V,运行时间为30min,设置pDNA作为对照组,结果如图6中a所示,可见在复合比值大于1时,EA-Amy-I/SWCNTs可完全阻滞pDNA在电场中的迁移,说明其能够有效复合pDNA。
实施例2
(1)称取1g马铃薯直链淀粉溶解于50mL二甲基亚砜中,在氮气保护下,加入3gCDI,在30℃温度下搅拌反应2h,然后往体系中滴加10倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应22h后转入截留分子量为14000的透析袋中用水透析2天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物(EA-Amy-II);
(2)将EA-Amy-II溶于水配制成2mg/mL的溶液,加入0.5倍于EA-Amy-II质量的单壁碳纳米管(长度1-3μm,直径1-2nm),然后在冰水浴中使用65kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔5min超声30min,共进行3个周期的处理,将得到的混合体系在1000rpm下离心3min,所得分散液以220nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物(EA-Amy-II/SWCNTs);
(3)将EA-Amy-II/SWCNTs分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的分散液,加入pDNA(pUC18DNA,2686bp,1mg/mL于pH8.0的10mM Tris-HCl溶液,购于宝生物工程有限公司)至pDNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于38℃水浴中孵育30min,得到复合比值分别为0.1、1、2、3、5和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物(EA-Amy-II/SWCNTs/pDNA)。
本实施例所使用的马铃薯直链淀粉在使用前经过纯化处理:将马铃薯直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的乙醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作4次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
本实施例中所述的二甲基亚砜经过下述方法处理得到:在市售二甲基亚砜中加入氢化钙,室温搅拌2天去除水分,减压蒸馏,收集的馏出液为干燥的二甲基亚砜。
步骤(1)的EA-Amy-II溶于重水配成5mg/mL的溶液,利用300MHz的核磁共振氢谱仪对其进行测定,结果如图1中b所示,根据乙二胺残基亚甲基质子1以及直链淀粉异头碳质子4的信号峰积分对比计算出EA-Amy-II中侧基接枝率为1.37。
使用热失重分析仪对步骤(2)的EA-Amy-II/SWCNTs和步骤(1)的EA-Amy-II在氮气氛围下进行表征,结果如图2中c和e所示。由图可见,EA-Amy-II/SWCNTs(c)在200℃时开始明显失重,在350℃后失重趋于平缓,800℃时残留质量为61.1%。通过与SWCNTs(a)、EA-Amy-II(e)在该温度下的平衡失重残留质量百分数对比,可以算出EA-Amy-II/SWCNTs中SWCNTs的质量分数为62.9%。
取EA-Amy-II/SWCNTs分散在水中形成0.1mg/mL的分散液,超声后1分钟以及放置一个月后的光学照片如图3中c所示,由图中可见SWCNTs(a)极易沉降,而久置后EA-Amy-II/SWCNTs(c)分散体系仍然稳定。
取步骤(2)的EA-Amy-II/SWCNTs(c)分散在水中形成0.04mg/mL的分散液,利用808nm近红外激光在1W/cm-2的强度下对其进行照射,记录不同时间点的温度值,其变化与水(a)对比如图4所示,由图中可见EA-Amy-II/SWCNTs(c)在水分散体系中表现出明显的光热转换效应,略低于EA-Amy-I/SWCNTs(b),与其SWCNTs含量低于EA-Amy-I/SWCNTs有关。
考察不同浓度下步骤(2)的EA-Amy-II/SWCNTs的细胞毒性(考察方法同实施例1),结果如图5中b所示,由图中可以看出随着EA-Amy-II/SWCNTs浓度的增大,细胞存活率有所下降,但在高浓度下仍保持较高的存活率,说明EA-Amy-II/SWCNTs具有较好的生物相容性。
取步骤(3)中复合比值分别为0.1、1、2、3、5和10的EA-Amy-II/SWCNTs/pDNA复合物进行凝胶电泳测试,琼脂糖浓度为1%,运行电压为100V,运行时间为30min,设置pDNA作为对照组,结果如图6中b所示,可见在复合比值大于1时,EA-Amy-II/SWCNTs可完全阻滞pDNA在电场中的迁移,说明其能够有效复合pDNA。
实施例3
(1)称取1g玉米直链淀粉溶解于40mL二甲基亚砜中,在氮气保护下,加入0.1gCDI,在25℃温度下搅拌反应1h,然后往体系中滴加2倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应23h后转入截留分子量为1000的透析袋中用水透析7天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)的直链淀粉衍生物溶于水配制成5mg/mL的溶液,加入0.5倍于直链淀粉衍生物质量的单壁碳纳米管(长度0.5-2μm,直径3-5nm),然后在冰水浴中使用40kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔1min超声20min,共进行4个周期的处理,将得到的混合体系在3000rpm下离心1min,所得分散液以220nm的微孔滤膜过滤,滤渣重复水洗、离心和过滤步骤两次以除去未参与形成包合物的物质,将产物冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.7mg/mL和1mg/mL的分散液,加入pDNA(pUC18DNA,2686bp,1mg/mL于pH8.0的10mM Tris-HCl溶液,购于宝生物工程有限公司)至pDNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于35℃水浴中孵育40min,得到复合比值分别为0.1、1、2、4、7和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
本实施例所使用的玉米直链淀粉在使用前经过纯化处理:将玉米直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的乙醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作4次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
实施例4
(1)称取0.4g马铃薯直链淀粉溶解于20mL二甲基亚砜中,在氩气保护下,加入2.4gCDI,在25℃温度下搅拌反应6h,然后往体系中滴加20倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应66h后转入截留分子量为30000的透析袋中用水透析1天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)的直链淀粉衍生物溶于水配制成0.1mg/mL的溶液,加入0.5倍于直链淀粉衍生物质量的单壁碳纳米管(长度1-3μm,直径1-2nm),然后在冰水浴中使用20kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔10min超声5min,共进行6个周期的处理,将得到的混合体系在2000rpm下离心2min,所得分散液以450nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的分散液,加入pDNA(pUC18DNA,2686bp,1mg/mL于pH8.0的10mM Tris-HCl溶液,购于宝生物工程有限公司)至pDNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于35℃水浴中孵育20min,得到复合比值分别为0.1、1、2、3、5和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
实施例5
(1)称取1g小麦直链淀粉溶解于50mL二甲基亚砜中,在氮气保护下,加入5g CDI,在40℃温度下搅拌反应3h,然后往体系中滴加15倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应45h后转入截留分子量为20000的透析袋中用水透析3天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)的直链淀粉衍生物溶于水配制成5mg/mL的溶液,加入2倍于直链淀粉衍生物质量的单壁碳纳米管(长度0.5-2μm,直径3-5nm),然后在冰水浴中使用50kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔10min超声30min,共进行2个周期的处理,将得到的混合体系在1000rpm下离心4min,所得分散液以220nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.7mg/mL和1mg/mL的分散液,加入siRNA(MMP-9_siRNA,1mg/mL于DEPC水,购于GenePharma公司)至siRNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于38℃水浴中孵育40min,得到复合比值分别为0.1、1、2、4、7和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
本实施例所使用的小麦直链淀粉在使用前经过纯化处理:将小麦直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的乙醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作3次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
实施例6
(1)称取0.6g玉米直链淀粉溶解于20mL二甲基亚砜中,在氮气保护下,加入1.2gCDI,在20℃温度下搅拌反应5h,然后往体系中滴加10倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应19h后转入截留分子量为5000的透析袋中用水透析4天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)的直链淀粉衍生物溶于水配制成2mg/mL的溶液,加入1.5倍于直链淀粉衍生物质量的单壁碳纳米管(长度1-2μm,直径1-2nm),然后在冰水浴中使用60kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔5min超声40min,共进行1个周期的处理,将得到的混合体系在3000rpm下离心1min,所得分散液以500nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.7mg/mL和1mg/mL的分散液,加入siRNA(MMP-9_siRNA,1mg/mL于DEPC水,购于GenePharma公司)至siRNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于35℃水浴中孵育30min,得到复合比值分别为0.1、1、2、4、7和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
实施例7
(1)称取1g玉米直链淀粉溶解于50mL二甲基亚砜中,在氩气保护下,加入5g CDI,在40℃温度下搅拌反应3h,然后往体系中滴加15倍于CDI摩尔量的乙二胺,继续搅拌反应11h后转入截留分子量为20000的透析袋中用水透析3天,冷冻干燥后得到含伯氨基团的直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)的直链淀粉衍生物溶于水配制成5mg/mL的溶液,加入0.1倍于直链淀粉衍生物质量的单壁碳纳米管(长度7-10μm,直径3-5nm),然后在冰水浴中使用50kHz的超声波进行处理,具体周期为每隔30min超声60min,共进行2个周期的处理,将得到的混合体系在500rpm下离心5min,所得分散液以100nm的微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中分别配制成0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.7mg/mL和1mg/mL的分散液,加入siRNA(MMP-9_siRNA,1mg/mL于DEPC水,购于GenePharma公司)至siRNA的终浓度为0.1mg/mL,充分振荡后置于38℃水浴中孵育40min,得到复合比值分别为0.1、1、2、4、7和10的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物。
本实施例中所述二甲基亚砜经过下述方法处理得到:在市售二甲基亚砜中加入氢化钙,室温搅拌5天去除水分,减压蒸馏,收集的馏出液为干燥的二甲基亚砜。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于包括以下制备步骤:
(1)将直链淀粉溶解于二甲基亚砜中,在惰性气体保护下,加入N,N’-羰基二咪唑,在20~40℃温度下搅拌反应1~6小时,然后往体系中滴加乙二胺,继续搅拌反应11~66小时后用水透析,冷冻干燥后得到含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物;
(2)将步骤(1)制备的含伯氨基团的水溶性直链淀粉衍生物溶于水配制成0.1~5mg/mL的溶液,加入单壁碳纳米管,然后在冰水浴中进行超声处理,将得到的混合体系进行离心、微孔滤膜过滤,滤渣经水洗后冷冻干燥,得到直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物;
(3)将步骤(2)得到的直链淀粉衍生物-单壁碳纳米管包合物分散在双蒸水中,配制成0.01~1mg/mL的分散液;接着加入核酸,充分振荡后置于水浴中孵育,得到螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物;
所述的N,N’-羰基二咪唑与直链淀粉的质量比为(0.1~6):1;乙二胺与N,N’-羰基二咪唑的摩尔比为(2~20):1;
步骤(2)中所述的单壁碳纳米管是指长度为0.5~10μm,直径为1~5nm的单壁碳纳米管;单壁碳纳米管与直链淀粉衍生物的质量比为(0.1~2):1。
2.根据权利要求1所述的一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的直链淀粉是指经过纯化处理的马铃薯、玉米或者小麦直链淀粉;所述纯化处理步骤为:将直链淀粉溶于二甲基亚砜中,所得溶液抽滤除去不溶杂质,将滤液逐滴加入到搅拌中的甲醇或乙醇进行沉淀,沉淀物重复溶解、抽滤和沉淀操作2~4次后将沉淀物真空干燥,得到纯化的直链淀粉。
3.根据权利要求1所述的一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于:所述的二甲基亚砜在使用前通过以下方法纯化:在二甲基亚砜中加入氢化钙,室温搅拌2~7天去除水分,减压蒸馏,收集的馏出液备用;所述惰性气体是指氮气或氩气。
4.根据权利要求1所述的一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于:所述的用水透析是指用截流分子量为1000~30000的透析袋,在去离子水或蒸馏水中透析1~7天。
5.根据权利要求1所述的一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于:所述的超声处理是指在频率为20~65kHz条件下超声处理1~6个周期;所述的周期是指每隔1~30min超声处理5~60min;所述的离心是指在转速为500~3000rpm的条件下离心1~5min;所述的微孔滤膜是指孔径为100~500nm的水系或有机系微孔滤膜。
6.根据权利要求1所述的一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的核酸是指pDNA或siRNA;所述的置于水浴中孵育是指置于35~40℃水浴中孵育10~60min。
7.一种螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物,其特征在于:通过权利要求1~6任一项所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的螺旋链多糖衍生物共负载单壁碳纳米管和核酸的复合物在制备光热-基因联合治疗药物领域中的应用。
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