CN106236712A - 一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法 - Google Patents

一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，包括步骤：将氧化石墨烯溶液和壳聚糖溶液混合，再与透明质酸溶液混合，再加入Hsp90抑制剂，真空干燥，即得纳米靶向缓控释系统。对成型的纳米靶向缓控释系统进行包括透射电镜、载药率、释放速率、细胞毒性等性能测试，结果显出该系统拥有优良的缓控释和靶向功能。

Description

一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释 体系构建的方法
技术领域
本发明属于纳米药物载体技术领域，特别涉及一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法。
背景技术
研究发现，氧化石墨烯(GO)作为一种三维纳米新型的纳米材料，有着很多独特而优越的性能，包括高比表面积，细胞膜穿透性，药物负载性，良好的生物相容性，容易进行表面修饰，无免疫原特性等，而这些特性都特别适合作为纳米药物靶向缓控释系统的核心部分。外来物质进入细胞膜其中一种方式就是胞吞作用，这种方式是需要耗能的，同时也需要通过细胞膜的曲率改变而发生。有研究表明，氧化石墨烯表面能较高可以为胞吞提供一定的能量，另外它的纳米尺寸和疏水性质为其穿越磷脂双分子层提供便利。
然而，尽管氧化石墨烯含有羧基、羟基等基团，可以在水中分散存在，但其在盐溶液中会由于静电屏蔽作用而发生沉降。所以在用于药物载体时，常对其进行功能化修饰，以提高其生物相容性和靶向性，还有达到缓释效果，这能改善肿瘤的化疗效果。
壳聚糖是甲壳素经过脱乙酰基得到的，其分子中含有的游离氨基，有利于在酸性水溶液中溶解，同时游离氨基有利于壳聚糖对其他分子进行修饰。另外它的pKa值为6.5左右，导致它在生理溶液和中性溶液基本不溶解，而在更酸性的条件下溶解度上升。因此，可以用壳聚糖改性氧化石墨烯，使其具有pH敏感性，能够在酸性条件释放更多的药量。
CD44是一类跨膜糖蛋白，是细胞表面重要的透明质酸受体。而侵袭性的肿瘤细胞表面透明质酸受体明显高于正常细胞，这表明透明质酸可以作为靶向配体，能够使其修饰的药物传递体系特异性作用肿瘤细胞。同时透明质酸具有强大的亲水能力，接上透明质酸后的纳米系统亲水性能够得到改善。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新型的透明质酸、壳聚糖修饰氧化石墨烯的纳米载体的构建方法，即利用壳聚糖带正电荷与带负电荷的氧化石墨烯进行物理接枝，然后利用透明质酸的羧基与壳聚糖的氨基进行酰胺化接枝，以赋予其缓控释和靶向的功能。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，包括以下步骤：
(1)、将氧化石墨烯分散于超纯水中得到浓度为1～10mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入1～10mg/ml的壳聚糖溶液，超声处理，再磁力搅拌，将混合液透析，干燥，得到壳聚糖改性氧化石墨烯；所述壳聚糖溶液与氧化石墨烯溶液的体积比为1：1～10；
(2)、将步骤(1)的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于磷酸缓冲液中得到浓度为1～10mg/ml的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入EDC活化后的浓度为1～10mg/ml的透明质酸溶液，超声处理，再磁力搅拌，将混合液透析，干燥，得到接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯；所述透明质酸溶液与壳聚糖改性氧化石墨烯溶液的体积比为1：1～10；
(3)、将接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于磷酸缓冲液中得到浓度为1～10mg/ml的接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入1～10mg/ml Hsp90抑制剂10ml，超声处理再磁力搅拌，离心，用磷酸缓冲液洗涤游离Hsp90抑制剂，真空干燥，即得纳米靶向缓控释系统。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述超声处理的频率为20KHZ～100KHZ，所述超声处理的时间为25～35min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述磁力搅拌为：20～32℃搅拌12～36小时。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述透析的分子截留量为1000～20000Da。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述干燥为20～40℃真空干燥。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述Hsp90抑制剂为新生霉素、12-丙烯胺基-12-去甲氧基格尔德霉素、或SNX-2112。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述离心的转速为1000～5000rpm。
本发明还提供了上述构建方法构建得到的纳米靶向缓控释系统。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的纳米靶向缓控释系统的构建方法温和简单，对成型的纳米靶向缓控释系统进行包括透射电镜、载药率、释放速率、细胞毒性等性能测试，结果显示该系统载药率高，在肿瘤环境下释放药物量大且能够持续一段时间，而在正常生理环境下释放药物量非常小，通过细胞毒性实验可以得出，相同浓度下使用该载药系统对肿瘤细胞的杀害作用大于单纯用药，说明本发明的纳米靶向缓控释系统拥有优良的缓控释和靶向功能。
附图说明
图1为不同材料改性的氧化石墨烯的透射电镜图，其中(A)氧化石墨烯，(B)壳聚糖改性的氧化石墨烯，(C)壳聚糖、透明质酸改性的氧化石墨烯；
图2为改性氧化石墨烯对SNX-2112的载药率；
图3改性氧化石墨烯负载SNX-2112在不同pH下的释放(A)pH＝2.4，(B)pH＝5.5；
图4各种改性氧化石墨烯对MDA-MB-231细胞的毒性图；
图5不同浓度的改性石墨烯载药体系对MDA-MB-231细胞的毒性图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的原料都来源于市售。
实施例1 一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法
该实施例的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)、将10mg氧化石墨烯分散于10ml超纯水中得到浓度为1mg/ml的氧化石墨烯溶液，将20mg壳聚糖溶于20ml醋酸缓冲溶液，得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，将两种溶液混合后以100kHZ超声处理30min，然后32℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，24小时换一次超纯水，真空干燥，得到壳聚糖改性氧化石墨烯；
(2)、将10mg步骤(1)的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于20ml pH＝2.4的磷酸缓冲液中得到浓度为0.5mg/ml的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入10mg透明质酸、10mgEDC·HCL与2mgNHS，以80kHZ超声处理20min，然后32℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，每24小时换一次超纯水，32℃干燥透析后的产物，得到接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯；
(3)、将10mg接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于20mlpH＝2.4的磷酸缓冲液中得到浓度为0.5mg/ml的接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入15mgSNX-2112，以100kHZ超声处理30min，然后32℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液以5000rpm转速进行离心10min处理，用纯水洗涤除去游离的SNX-2112，真空干燥，即得负载了SNX-2112的纳米靶向缓控释系统。
本实施例的纳米靶向缓控释系统的透射电镜图如图1所示，其中图1中A为未改性氧化石墨烯，B为壳聚糖改性氧化石墨烯，C为透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯，从图1-A可以看出，GO为片层结构，直径在180nm左右，表面平滑；图1-B为GO-CHI，接上壳聚糖后，GO直径明显变大，而且其表面变得粗糙。整个制备过程只是使用物理方法，壳聚糖可能通过静电力和疏水作用对氧化石墨烯进行接枝；图1-C为GO-CHI-HA，是GO接上壳聚糖后再通过酰胺化反应接上透明质酸的，从图可以看出，较之于图1-A、图1-B，材料表面变得更为粗糙。
对比例1 一种壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法
该实施例的构建方法，包括以下步骤：
(1)、将10mg氧化石墨烯分散于10ml超纯水中得到浓度为1mg/ml的氧化石墨烯溶液，将20mg壳聚糖溶于20ml醋酸缓冲溶液，得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，将两种溶液混合后以100kHZ超声处理30min，然后32℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，24小时换一次超纯水，真空干燥，得到壳聚糖改性氧化石墨烯；
(2)、将10mg壳聚糖改性氧化石墨烯分散于20mlpH＝2.4的磷酸缓冲液中得到浓度为0.5mg/ml的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入15mgSNX-2112，以100kHZ超声处理30min，然后32℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液以5000rpm转速进行离心10min处理，用纯水洗涤除去游离的SNX-2112，真空干燥，即得负载了SNX-2112的壳聚糖改性氧化石墨烯纳米靶向缓控释系统。
对比例2 一种透明质酸改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法
该实施例的构建方法，包括以下步骤：
(1)、将10mg氧化石墨烯分散于10ml超纯水中得到浓度为1mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入10mg透明质酸、10mgEDC·HCL与2mgNHS，以80kHZ超声处理20min，然后32℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，每24小时换一次超纯水，32℃干燥透析后的产物，得到透明质酸改性氧化石墨烯；
(2)、将10mg透明质酸改性氧化石墨烯分散于20mlpH＝2.4的磷酸缓冲液中得到浓度为0.5mg/ml的透明质酸改性氧化石墨烯溶液，加入15mgSNX-2112，以100kHZ超声处理30min，然后32℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液以5000rpm转速进行离心10min处理，用纯水洗涤除去游离的SNX-2112，真空干燥，即得负载了SNX-2112的透明质酸改性氧化石墨烯纳米靶向缓控释系统。
试验例实施例1、对比例1和对比例2的纳米靶向缓控释系统对肿瘤细胞的毒性
将不同修饰的负载SNX-2112纳米靶向缓控释系统用MDA-MB-231细胞粒子(购于暨南大学)进行细胞实验，结果用以分析不同系统对肿瘤细胞的毒性，从而评价不同系统的靶向性能、控释性能、抗肿瘤性能等。
SNX-2112浓度标准曲线是用紫外-可见光分光光度仪测量。梯度SNX-2112溶液在波长为323nm处的吸光度，再通过浓度-吸光度绘制出来的。该浓度标准曲线的R2等于0.9993，表明所测吸光度与所配浓度具有非常好的相关性，这为下面实验所测的载药率以及释放速率的准确性提供保证。
(1)载药率测试
先配制多个不同浓度的SNX-2112溶液，置于紫外-可见光分光光度仪中，在波长323nm下测量不同浓度下SNX-2112的吸光度，并且绘制SNX-2112标准浓度曲线。将2.2.3中洗涤游离SNX-2112的滤液置于紫外-可见光分光光度仪中，在波长323nm下，测量GO、GO-CHI、GO-CHI-HA负载SNX-2112后洗涤液的吸光度，平行测量3次。
从图2可知GO(143.53％)、GO-CHI(139.05％)和GO-CHI-HA(116.23％)都有着较高的载药效率；SNX-2112的负载主要依靠其与氧化石墨烯分子间相互作用的范德华力。这可能是由于药物主要负载在氧化石墨烯上，而氧化石墨烯较大的比表面积使其具有较高的负载率。另外，由于GO、GO-CHI和GO-CHI-HA中氧化石墨烯含量依次减少，这使得单位质量材料容纳药物的氧化石墨烯减少，因而其负载率也依次减少。
(2)药物释放速率测试
1mg GO/SNX-2112、GO-CHI/SNX-2112、GO-CHI-HA/SNX-2112分别分散于0.5ml pH＝2.4和pH＝5.5的PBS缓冲液中，每种样品平行3个样，加入MWCO 10kDa的透析袋中，分别用30ml pH＝2.4和pH＝5.5的PBS缓冲液浸润并于32℃震荡22小时。分别于第2小时、6小时、12小时、24小时、48小时以及22小时各取3ml上清液，并迅速补充相应新的缓冲液，置于紫外-可见光分光光度仪中，测量其在波长为323nm处的吸光度，获得吸光度后根据SNX-2112标准浓度曲线计算释放量，绘制释放速度曲线。
从图3结果来看，载药系统在释放方面有着较好的缓控释功能。首先，在pH＝2.4的生理环境下，从图3-A可以看出，GO/SNX-2112、GO-CHI/SNX-2112、GO-CHI-HA/SNX-2112在32℃，60转/分钟的摇床下，22小时的释放量都小于20％，也就是说载药系统能够很好地在非肿瘤环境中结合SNX-2112，减少SNX-2112释放进入体液中对正常组织和细胞的毒性，由于三者的释放量基本相同，所以可以得出这种情况的出现主要是由于氧化石墨烯与SNX-2112通过分子间的范德华力作用达到在pH＝2.4的条件下的牢固结合。然而在pH＝5.5的肿瘤环境下，从图3-B可以看出，三者的释放较之于pH＝2.4时有了很大的提高，同样的温度与转速条件下22小时后的释放量都超过40％。而GO/SNX-2112与GO-CHI/SNX-2112的释放速率几乎是一样，可能是SNX-2112与接了壳聚糖的氧化石墨烯的作用大部分是通过与氧化石墨烯直接作用而负载上的，所以在较酸性的环境中，即使壳聚糖会因此而增大溶解度，对SNX-2112的释放量影响也不大。而对于GO-CHI-HA/SNX-2112，由于材料较之于GO-CHI多接上透明质酸，使氧化石墨烯被包裹得更加严实，而且更为粗糙，SNX-2112与氧化石墨烯复合后大部分都受壳聚糖和透明质酸的阻隔，所以当pH小于壳聚糖的pKa时，由于壳聚糖的溶解，导致载药系统局部的崩解，SNX-2112随着包裹层的溶解而释出，结果是释放速率加快。
(3)细胞毒性实验
收集对数期细胞，于细胞计数板数计算无色细胞数，得到细胞悬液浓度。调整细胞悬液浓度并种植于96孔板，5％CO2，32℃孵育，至细胞单层铺满孔底，吸掉培养液，加入浓度梯度的药物，再加入完全培养基，平行设3个孔：第一组对MDA-MB-231细胞做细胞毒性测试：用药为100μg/ml GO、GO-CHI、GO-CHI-HA、GO/SNX-2112、GO-CHI/SNX-2112、GO-CHI-HA/SNX-2112，结果用于检测材料对MDA-MB-231细胞的毒性作用。第二组对MDA-MB-231细胞做细胞毒性测试：用药为GO/SNX-2112、GO-CHI/SNX-2112、GO-CHI-HA/SNX-2112、SNX-2112分别配制20、40、60、80、100μg/ml，结果用于检测材料靶向性和不同浓度下对MDA-MB-231细胞的毒性作用。24小时后，先在酶联免疫检测仪OD450测量波长测一次每孔的背景吸光度，再加入CCK8后继续培养2小时。终止培养，置摇床上低速振荡1分钟。在酶联免疫检测仪OD450测量波长测量各孔的吸光值。
在图4中，从GO、GO-CHI、GO-CHI-HA对两种细胞的实验数据可以看出，氧化石墨烯本身对MDA-MB-231细胞的毒性很小，当被壳聚糖和透明质酸加以修饰后，其对MDA-MB-231细胞毒性明显降低，得出壳聚糖和透明质酸改善了氧化石墨烯的生物相容性，减少对细胞的伤害作用。根据MDA-MB-231细胞的实验数据显示，可以得出负载药物后的载药系统对其毒性增加。GO/SNX-2112比其他两组的细胞存活率更低可能是因为氧化石墨烯材料本身的微弱毒性所致。GO-CHI-HA/SNX-2112对MDA-MB-231细胞的毒性都比GO-C HI/SNX-2112大，可能是由于GO-CHI-HA/SNX-2112系统比GO-CHI/SNX-2112系统在肿瘤细胞环境下释放SNX-2112的量更多引起的，这点从体外释放曲线(图3)可以看出，另外也可能是因为接枝上透明质酸后，由于具有靶向载体，令到表面过表达CD44受体的MDA-MB-231细胞更多地摄取GO-CHI-HA/SNX-2112，从而引起更大的毒性作用，证明了载药系统的靶向功能。综合上述分析，由于载药系统具有缓控释功能与靶向功能，表明其对肿瘤细胞的强毒性作用，是一种理想的抗肿瘤载药系统。
从图5可看出，GO/SNX-2112、GO-CHI/SNX-2112、GO-CHI-HA/SNX-2112、SNX-2112在20～100μg/ml这个浓度范围内的最佳抗肿瘤浓度分别为80、60、80、80μg/ml。各组的最佳最佳抗肿瘤浓度相差无几，这可能与药物直接与细胞作用有关。
从氧化石墨烯、壳聚糖改性氧化石墨烯、透明质酸壳聚糖改性氧化石墨烯对MDA-MB-231细胞的实验数据可以看出，氧化石墨烯对细胞具有微弱毒性，用壳聚糖和透明质酸修饰后，对细胞的毒性均明显降低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将氧化石墨烯分散于超纯水中得到浓度为1～10mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入1～10mg/ml的壳聚糖溶液，超声处理，再磁力搅拌，将混合液透析，干燥，得到壳聚糖改性氧化石墨烯；所述壳聚糖溶液与氧化石墨烯溶液的体积比为1：1～10；
(2)、将步骤(1)的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于磷酸缓冲液中得到浓度为1～10mg/ml的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入EDC活化后的浓度为1～10mg/ml的透明质酸溶液，超声处理，再磁力搅拌，将混合液透析，干燥，得到接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯；所述透明质酸溶液与壳聚糖改性氧化石墨烯溶液的体积比为1：1～10；
(3)、将接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯分散于磷酸缓冲液中得到浓度为1～10mg/ml的接枝有透明质酸的壳聚糖改性氧化石墨烯溶液，加入1～10mg/ml Hsp90抑制剂，超声处理再磁力搅拌，离心，用磷酸缓冲液洗涤游离Hsp90抑制剂，真空干燥，即得纳米靶向缓控释系统。
2.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述超声处理的频率为20KHZ～100KHZ，所述超声处理的时间为25～35min。
3.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述磁力搅拌为：20～32℃搅拌12～36小时。
4.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述透析的分子截留量为1000～20000Da。
5.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述干燥为20～40℃真空干燥。
6.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(3)中所述Hsp90抑制剂为新生霉素、12-丙烯胺基-12-去甲氧基格尔德霉素、或SNX-2112。
7.根据权利要求1所述的透明质酸、壳聚糖改性氧化石墨烯制备纳米靶向缓控释体系构建的方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心的转速为1000～5000rpm。
8.权利要求1～2任一项所述的构建方法构建得到的纳米靶向缓控释系统。
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