CN104248764A

CN104248764A - 一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法

Info

Publication number: CN104248764A
Application number: CN201410397889.1A
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 杨卉卉; 陶磊; 公晓; 李赫宇; 胡娟
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University; National Dong Hwa University
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2014-12-31

Abstract

本发明涉及一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：(1)将氧化石墨烯和PEI在二甲基亚砜中通过活化剂EDC的作用产生化学键合，透析冻干，合成GOX-PEI；(2)将透明质酸溶解在蒸馏水中，加入活化剂EDC活化3小时；(3)将上述GOX-PEI逐滴加入活化过的透明质酸中，室温搅拌反应24小时，透析冻干，即得到合成产物GOX-PEI-HA。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作。本发明的新型材料可以用做药物的载体，有着很好的实用价值。

Description

一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料的制备领域，特别涉及一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法。

背景技术

石墨烯自2004年发现以来，其独特的片层结构一直是人们研究的热点。而其在生物医学领域的研究也在这几年兴起，在该领域应用较多的是石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，通常由石墨粉经化学氧化、超声分散而制得。由于其表面含有大量的含氧活性官能团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等亲水性基团，因而具有良好的水溶液稳定性和生物相容性。同时，由于氧化石墨烯具有单原子层结构，其比表面积很大，且两个基面都可以吸附药物，因此非常适合用作药物载体。然而尽管氧化石墨烯易溶于水，但是它在生理盐水中由于电荷屏蔽效应的存在易团聚，使其在生物医学领域的潜在应用价值的发挥受到阻碍。纳米材料的表面化学是改善纳米材料的生物相容性以及控制其在生物系统中行为的关键因素，因此不同的应用目的，就产生了不同的表面修饰方法，其中包括共价和非共价键修饰，最终官能化的石墨烯基材料有望用于可控释放及靶向控制的药物载体，在生物医药和诊断等领域有着很好的应用前景。

聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)是一种带正电荷的高分子聚电解质材料，分为直连型和超支化型两种，由于氨基的存在，使得它同时也具有很强的给电子能力，能对金属离子具有良好的分离、富集性能，因此被广泛应用于金属离子的分离吸附、环境保护等研究领域与方向。它同时也是一种高效的非病毒基因载体，它所具有的多个氨基使得PEI具有非常高的转染效率。由于氧化石墨烯具有高的电负性，因此极易与带正电的聚合物通过静电相互作用结合在一起，因此，将PEI非共价修饰在氧化石墨烯上，形成的GOX-PEI相比于氧化石墨烯生理学稳定性显著提高，同时材料的毒性明显降低，并且基因转染效率提高。

透明质酸是一种独特酸性粘多糖，又名玻脲酸，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性等。它是肌肤水嫩的重要基础物质，本身也是人体的一种成分，具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。它还具有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术，如晶体植入、角膜移植和抗青光眼手术等。另外还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。经透明质酸修饰后的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，有利于材料的生物应用，所得功能化纳米材料可以用作药物传输载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，该方法操作简单、反应条件温和。该石墨烯复合材料可装载药物，用于药物的缓慢定向释放。

本发明的一种含透明质酸的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：

(1)将氧化石墨烯分散在二甲基亚砜(DMSO)溶液中，加入EDC活化3小时；

(2)将PEI的二甲基亚砜溶液加入上述溶液中常温下反应24小时，透析除去未反应杂质，冷冻干燥合成GOX-PEI；

(3)将透明质酸溶解在蒸馏水中加入EDC活化3小时；

(4)将上述GOX-PEI溶于水中，逐滴加入活化过的透明质酸中，室温搅拌反应24小时，合成GOX-PEI-HA，透析除去未反应杂质，最后冷冻干燥合成含透明质酸的氧化石墨烯复合材料。

步骤(1)中所述的氧化石墨烯与EDC的质量比为1:0.5-1:1。

步骤(2)中所述的氧化石墨烯与PEI的质量比为1:1-1:2。

步骤(3)中所述的透明质酸与活化剂EDC的摩尔比为1:1。

步骤(4)中所述的GOX-PEI与HA的质量比为1:5-1:10。

步骤(2)、(4)中的透析工艺为采用透析袋，先在pH＝6-7的缓冲液中透析，再在水中透析。

步骤(2)、(4)中缓冲液为磷酸缓冲液。

对负载抗癌药物的多功能碳纳米管的制备、药物缓释及肿瘤靶向治疗研究，我们做了一些测试：

(1)TEM测试结果

TEM测试结果表明：氧化石墨烯经过透明质酸修饰过后依然保持其片层结构，即修饰仅发生在表面，并不改变石墨烯本身的结构。参见附图说明1。

(2)NMR测试结果

NMR测试结果表明：以氧化石墨烯为模板，PEI及HA分子成功地接合在氧化石墨烯的表面。参见附图说明2。

(3)TGA测试结果

TGA测试结果表明：选取420度为计算温度，修饰在氧化石墨烯表面的PEI约为40％，HA约为30％。参见附图说明3。

(4)Zata电位测试结果

Zata电位测试结果表明：氧化石墨烯经HA修饰后，呈电负性且电位升高，说明生物相容性提高，且体系分散性较好。参见表1。

有益效果

(1)本发明采用化学键合的方法，合成含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和；

(2)本发明的氧化石墨烯复合材料克服了氧化石墨烯在生理盐水中由于电荷屏蔽效应而存在易团聚的缺陷，通过透明质酸的修饰，降低了PEI的毒性并改善材料的生物相容性，具有应用其做后续相关实验分析的潜力；

(3)含透明质酸的氧化石墨烯复合材料可以用作药物的负载及缓释，特定组织的定向输送。

附图说明

图1为实施例1所得的含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的透射电镜照片。其中1a和1b分别为200nm与100nm两个不同放大倍数下的电镜照片。

图2为实施例2所得的GOX-PEI、HA及GOX-PEI-HA的¹H-NMR图谱。其中2a为GOX-PEI、2b为HA、2c为GOX-PEI-HA。

图3为实施例3所得的GOX、GOX-PEI及GOX-PEI-HA的TGA分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)将GOX(100mg)，溶解在20mL DMSO中，然后加入EDC(50mg)活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入10mL含PEI(100mg)的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝100,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得GOX-PEI。

(2)称取500mgHA于蒸馏水中加入28.8mgEDC活化3小时，称取100mgGOX-PEI溶于蒸馏水中，逐滴加入活化后的透明质酸水溶液，搅拌24h，得到GOX-PEI-HA。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝1,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。

(3)对最终产物的TEM表征如图1所示，可以看出氧化石墨烯经过透明质酸修饰过后依然保持其片层结构，即修饰仅发生在表面，并不改变石墨烯本身的结构。

实施例2

(1)将GOX(50mg)，溶解在10mL DMSO中，然后加入EDC(50mg)活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入8mL含PEI(100mg)的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝100,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得GOX-PEI。

(2)称取1000mgHA于蒸馏水中加入57.6mgEDC活化3小时，称取100mgGOX-PEI溶于蒸馏水中，逐滴加入活化后的透明质酸水溶液，搅拌24h，得到GOX-PEI-HA。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝1,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。

(3)对各步产物GOX-PEI、HA、GOX-PEI-HA测试的1H-NMR图谱如图2所示，图2-a中的化学位移为δ＝2.5～3.0ppm的峰为PEI上的氨基质子峰；图2-b中的化学位移均为透明质酸中葡糖醛酸及N-乙酰氨基葡糖的的质子峰；图2-c中相对于图2-b，在化学位移为2.7～2.8ppm之间出现了许多小的质子峰，即CNT-PEI分子的特征峰。这些结果表明HA与GOX-PEI成功连接在一起。

实施例3

(1)将GOX(200mg)，溶解在50mL DMSO中，然后加入EDC(150mg)活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入20mL含PEI(300mg)的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝100,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得GOX-PEI。

(2)称取1500mgHA于蒸馏水中加入86.4mgEDC活化3小时，称取200mgGOX-PEI溶于蒸馏水中，逐滴加入活化后的透明质酸水溶液，搅拌24h，得到GOX-PEI-HA。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝1,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。

(3)对各步产物GOX、GOX-PEI、GOX-PEI-HA测试的TGA图谱如图3所示，选取420度为计算温度，修饰在石墨烯表面的PEI约为40％，HA约为30％。

实施例4

(1)将GOX(100mg)，溶解在30mL DMSO中，然后加入EDC(80mg)活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入12mL含PEI(180mg)的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝100,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得GOX-PEI。

(2)称取800mgHA于蒸馏水中加入46.15mgEDC活化3小时，称取120mgGOX-PEI溶于蒸馏水中，逐滴加入活化后的透明质酸水溶液，搅拌24h，得到GOX-PEI-HA。最后将反应溶液放入透析袋(MW＝1,000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。

(3)GOX、GOX-PEI、GOX-PEI-HA的Zata电位如表1所示。氧化石墨烯呈电负性，说明其本身具有一定生物相容性，经PEI修饰后呈正电性，再经HA修饰后，呈电负性且电位升高，说明生物相容性提高，且体系分散性较好。

表1

Materials	GOX	GOX-PEI	GOX-HA
				Zeta(mv)	-11.9±0.8	36.1±3.11	-39.53±0.93

Claims

1.一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：

(1)将氧化石墨烯分散在二甲基亚砜中，加入EDC活化3小时；

(2)将PEI的二甲基亚砜溶液加入上述溶液中，于常温下反应24小时，透析除去未反应杂质，冷冻干燥合成GOX-PEI；

(3)将透明质酸溶解在蒸馏水中加入EDC活化3小时；

2.根据权利要求1所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的配制的氧化石墨烯溶液浓度为3mg/ml-5mg/ml，氧化石墨烯与EDC的质量比为1∶0.5～1∶1。

3.根据权利要求1所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的氧化石墨烯与PEI的质量比为1∶1～1∶2。

4.根据权利要求1所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的配制的透明质酸溶液浓度为3mg/ml-5mg/ml，透明质酸与活化剂EDC的摩尔比为1∶1。

5.根据权利要求1所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的GOX-PEI与HA的质量比为1∶5～1∶10。

6.根据权利要求1所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)、(4)中所述的透析工艺为采用透析袋，先在pH为6-7的缓冲液中透析，再在水中透析。

7.根据权利要求6所述的一种含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸缓冲液。