CN102408488B

CN102408488B - 季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102408488B
Application number: CN 201110254147
Authority: CN
Inventors: 李晓玺; 杜云翔; 黄晓仪; 陈玲; 李琳; 李冰; 苏健裕
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-08-31
Also published as: CN102408488A

Abstract

本发明公开了一种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料及其制备方法和应用，具体制备方法如下：将含水量为4.7-13.5％、重均分子质量为13000-64000Da的淀粉在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的固碱、水和季铵型阳离子醚化剂的混合体系，于温度25-30℃，转速为40-100转/min的条件下，干法混合反应12h-48h；反应完全后经洗涤、干燥、粉碎后即得到季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。本发明制得的载体材料作为基因治疗中非病毒载体材料的应用，实现基因药物的控制释放，提高药物的生物利用度和降低药物及载体的毒副作用。

Description

季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然高分子材料在医药领域的研究与开发领域，特别是淀粉载体材料在基因的控制释放领域中的应用。

背景技术

基因治疗过程中，基因药物必须顺利地进入病灶部位受体细胞的细胞核中参与调控或表达，才能体现基因治疗的疗效。但基因药物大多为DNA或RNA等核酸类物质，裸露的核酸类物质很容易被外界环境和人体中的核酸酶所降解，即使是能够避免接触核酸酶，也会因为核酸类物质本身在一般情况下带负电荷，与细胞膜所带电荷相同而产生同性相斥，所以很难顺利通过受体细胞的外膜进入细胞核。因此基因药物的输送需要借助一定的传递系统，目前进行研究的基因药物给药系统包括病毒载体介导的传递系统和非病毒载体介导的传递系统。

病毒载体介导的系统表达效率高，但存在着基因装载量有限、病毒危险性等局限性；非病毒载体介导的系统在无病毒性和免疫原性方面具有优势，但是其在体内的不稳定性限制了临床应用。目前认为理想的基因载体材料应具备(1)非侵袭性的给药方式；(2)作用靶点包括原发灶和转移病灶，特别是远隔部位的微小转移灶及特殊部位病灶；(3)使治疗基因作用具有特异性和时间可调控性并能持续表达。此外，还应具备容量大、生物安全性好、稳定及易于大量生产等特点。

目前，非病毒类基因载体材料的研究较多集中在脂质体、阳离子合成高分子材料、磁性材料等方面。近年来，由于“生态环境生产”和“绿色消费”意识的萌发和兴起，可生物降解的可再生天然高分子材料已成为药物给药系统设计、开发的基础。伴随着纳米技术的发展，天然多糖类材料以良好的生物相容性、低毒性，易于修饰的表面结构，可明显延长纳米粒在体内的保留时间，减少被吞噬细胞吞噬，增加药物疗效等特性，而越来越得到人们的青睐。常用于基因载体的天然生物多糖有普鲁蓝多糖、壳聚糖、葡聚糖等。淀粉是一种重要的天然多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性、易于结构改性，具有价廉、来源广泛、稳定性高、安全、无毒及易于形成凝胶等优良特性，已成为很有潜力的药物传递系统载体。目前采用淀粉作为非病毒载体的研究较少，Hiroaki等(Hiroaki S.，Tomoyoshi O.，Yasuro F.，et.al.，Adenovirus vector-mediated genetransfer using degradable starch microspheres for hepatocellular carcinoma in rats.J.Surgical Res.2006，133，193-196.)以粒径为45μm的淀粉微球与重组腺病毒AxCALacZ同时作用于肺癌细胞，结果发现半乳糖的表达要比单一的重组腺病毒AxCALacZ作用肺癌细胞的表达率要高。肖苏尧等(肖苏尧，刘选明，童春义等.多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用.中国科学B辑化学.2004，34(6)：473-477)利用反相乳液法制备淀粉纳米颗粒StNP，在StNP上通过静电吸附作用吸附上多聚赖氨酸(PLL)，制备出阳离子型PLL-StNP，利用PLL的阳离子特性提高DNA的结合量，同时降低载体的细胞毒性。但由于DNA吸附于纳米微球表面，形式上与一般的质粒载体相似，因此在转染过程中无法逃避网状内皮系统的识别和清除。因而存在DNA低转染率和易被细胞内限制性内切酶降解和被机体免疫系统俘获等缺点。刘俊等(刘俊，刘选明，肖苏尧等.基于超声波下淀粉纳米颗粒作载体的基因转导.高等学校化学学报.2005，26：634-637)基于超声波能使细胞壁、细胞膜以至细胞核膜产生瞬间通道，外源DNA可借此进入细胞并进行表达的功能，建立了一种超声波介导淀粉纳米颗粒，进行外源基因转染效率的方法，但实质上并未解决淀粉载体本身对基因转染效率低的难题。

由于淀粉分子链的长短不同，其形成的三维网络结构不同，而且淀粉分子可以经过化学改性后使分子链带有正电荷，因此，通过控制淀粉分子的分子量及所带正电荷，能够使其与DNA通过静电吸引和氢键相互作用而形成纳米粒，从而更加有效的保护DNA和调节DNA的释放。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。该载体材料对基因具有良好的装载能力、无毒副作用，带正电，材料易得、成本低廉。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种工艺简单，适用可靠，成本低廉的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料的制备方法。

本发明所要解决的技术问题之三是季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料作为基因药物载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料，是由淀粉分子与季铵型阳离子醚化试剂经干法发生高取代度阳离子化反应而得，该载体材料的季铵型阳离子取代度为0.19-0.43。具体制备方法如下：

将含水量为4.7-13.5％、重均分子质量(M_w)为13000-64000Da的淀粉在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的固碱、水和季铵型阳离子醚化剂的混合体系，于温度25-30℃，转速为40-100转/min的条件下，干法混合反应12h-48h；反应完全后经洗涤、干燥、粉碎后即得到季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

优选地，所述混合体系中的固碱为质量百分比为11.2-18.5％的氢氧化钠或氢氧化钾，水的质量百分比为11.5-20.3％，季铵型阳离子醚化剂为质量百分比为52.7％-87.0％的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵；所述碱、水和季铵型阳离子醚化剂的加入量均以淀粉干基计。

本发明得到的上述载体材料作为基因治疗中非病毒载体材料的应用，实现基因药物的控制释放，提高药物的生物利用度和降低药物及载体的毒副作用。具体按下述方法进行：将淀粉基因控释载体材料与治疗用基因(DNA或RNA)在水溶液中混合，控制N/P摩尔比为0.5～30，经过涡旋振荡1-5min，室温静置1-2h，形成季铵型阳离子淀粉载体/基因纳米控释传输系统，通过该纳米控释传输系统将外源基因转导入细胞中从而发挥治疗作用。季铵型阳离子淀粉可通过静电吸附作用吸附带负电荷的基因(DNA或RNA)形成表面带正电荷的纳米粒，能够促进传递系统与带负电的细胞膜结合，从而提高纳米颗粒的转染效率。

上述制备淀粉载体与治疗用基因的纳米传递系统中的N/P摩尔比中的N指的是阳离子淀粉中季胺基中的氮，P指的是DNA中三磷酸结构中第三个磷酸中的磷，每个N代表一个正电荷，每个P代表一个负电荷。

所述载体材料与治疗用基因的N/P摩尔比为0.5-30，zeta-电位为3.95-35.6mV，所形成的纳米传输系统的尺寸为98.53-337.1nm。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)本发明首次通过利用不同分子量的淀粉分子与季铵型阳离子醚化试剂经干法发生高取代度阳离子化反应而得的淀粉载体与基因治疗药物DNA的静电吸附反应，将季铵型阳离子化淀粉载体与基因药物DNA共混，成功地制备出适合基因药物DNA控制释放的淀粉类基因治疗纳米控释系统，作为该控释系统的淀粉载体材料具有价廉易得，生物相容性好、本身安全无毒等特点。

(2)通过zeta-电位的测定得出这种淀粉载体与DNA形成的纳米粒表面带有一定量的正电荷，这有助于纳米粒在转染过程中与表面带负电的细胞膜快速结合，能够有效的促进细胞对复合物的内吞作用。

附图说明

图1为Mw为64000，DS为0.19(a)、Mw为17000，DS为0.27(b)和Mw为13000，DS为0.43(c)的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料分别在不同N/P比的条件下(泳道从左至右依次为裸DNA、N/P＝0.5、1、2、5、10、30、季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料的溶液)与DNA形成的纳米传递系统对DNA的保护与泄漏情况的电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明实施方式并不仅限于此。

实施例1

将含水量为4.7％、重均分子质量(M_w)为13000Da的淀粉100g(干基)在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5％的NaOH(18.5g)，20.3％的水(20.3g)和87.0％的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)的混合体系，于温度25℃，转速为100转/min的条件下，干法混合反应48h；反应完全后经无水乙醇沉淀样品，抽滤后，用无水乙醇洗涤直到用AgNO₃检验无Cl^-为止，60℃烘干，粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.43的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(表1)。其他条件不变，改变淀粉的重均分子量和NaOH与3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表1)，所得不同取代度的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

表1

实施例2

将含水量为13.5％、重均分子质量(M_w)为64000Da的淀粉100g(干基)在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5％的KOH(18.5g)，11.5％的水(11.5g)和87.0％的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体系，于温度30℃，转速为40转/min的条件下，干法混合反应48h；反应完全后经无水乙醇沉淀样品，抽滤后，用无水乙醇洗涤直到用AgNO₃检验无Cl^-为止，60℃烘干，粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.19的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(表2)。其他条件不变，改变淀粉的重均分子量和NaOH与3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表9)，所得不同取代度的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

表2

实施例3

将含水量为4.7％、重均分子质量(M_w)为17000Da的淀粉100g(干基)在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5％的NaOH(18.5g)，20.3％的水(20.3g)和87.0％的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体系，于温度30℃，转速为75转/min的条件下，干法混合反应48h；反应完全后经无水乙醇沉淀样品，抽滤后，用无水乙醇洗涤直到用AgNO₃检验无Cl^-为止，60℃烘干，粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.35的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(表3)。其他条件不变，改变淀粉的重均分子量和NaOH与3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量(表3)，所得不同取代度的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

表3

实施例4

将含水量为4.7％、重均分子质量(M_w)为13000Da的淀粉100g(干基)在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的质量百分比为18.5％的NaOH(18.5g)，20.3％的水(20.3g)和87.0％的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵(87.0g)混合体系，于温度25℃，转速为75转/min的条件下，干法混合反应36h；反应完全后经无水乙醇沉淀样品，抽滤后，用无水乙醇洗涤直到用AgNO₃检验无Cl^-为止，60℃烘干，粉碎过80目筛后得到取代度(DS)为0.37的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(表4)。其他条件不变，改变淀粉的重均分子量、NaOH、3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵的用量和反应时间(表4)，所得不同取代度的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

表4

实施例5

(1)利用实施例2中样品10制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(M_w＝64000，DS＝0.19)配成浓度为2.33mg/ml的水溶液。

(2)提取pAcGFP1-C1质粒(4.7kb，购自美国科隆泰科实验有限公司，ClontechLaboratory，Inc.USA)，浓度为255ng/μl。

(3)按照N/P＝0.5、1、2、5、10、30的比例将步骤(1)和步骤(2)中的溶液按体积混合，控制每种N/P下DNA浓度均为100ng/μl，加入适量超纯水使终体积为50μl，涡旋震荡1min，室温静置2h。

(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合后用微量移液器转移到1％的琼脂糖加样孔中，用裸DNA和季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料水溶液做对照，在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min，转移至干净蒸馏水中清洗干净，用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1a)。

实施例6

(1)利用实施例3中样品19制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(M_w＝17000，DS＝0.27)配成浓度为1.82mg/ml的水溶液。

(2)提取pAcGFP1-C1质粒，浓度为255ng/μl。

(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合后用微量移液器转移到1％的琼脂糖加样孔中，用裸DNA和季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料水溶液做对照，在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min，转移至干净蒸馏水中清洗干净，用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1b)。

实施例7

(1)利用实施例1中样品3制备出的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料(M_w＝13000，DS＝0.43)配成浓度为1.28mg/ml的水溶液。

(2)提取pAcGFP1-C1质粒，浓度为255ng/μl。

(4)取不同N/P的样品5μl与2μl的6×上样缓冲液(loading buffer)混合后用微量移液器转移到1％的琼脂糖加样孔中，用裸DNA和季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料水溶液做对照，在TAE缓冲溶液(0.5×)中100V电压下电泳20min。电泳结束将琼脂糖在EB(溴化锭)溶液中浸泡10min，转移至干净的蒸馏水中清洗干净，用凝胶成像仪拍摄出紫外光照片(图1c)。

实施例8

利用马尔文激光粒度分布仪测定实施例5、6、7中制备的不同N/P下的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料与DNA形成的纳米复合物的zeta-电位进行测定。结果显示(表5)，不论季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料取代度高低，与DNA形成的纳米复合物表面均带正电；随着N/P增加，电荷呈现逐渐增加的趋势，zeta-电位为3.95-35.6mV。纳米复合物带正电表明它能与带负电荷的质粒DNA络合更紧密，且在转染过程中能与表面带负电的细胞膜快速结合促进细胞对复合物的内吞作用。

表5

实施例9

利用马尔文激光粒度分布仪测定实施例5、6、7中制备的不同N/P季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料与DNA形成的纳米复合物的粒度进行测定(表6)，所形成的纳米传输系统的尺寸为98.53-337.1nm。

表6

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料作为基因治疗中非病毒载体材料的应用，其特征在于，

将含水量为4.7-13.5%、重均分子质量为13000-64000Da的淀粉在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的固碱、水和季铵型阳离子醚化剂的混合体系，于温度25-30°C，转速为40-100转/min的条件下，干法混合反应12h-48h；反应完全后经洗涤、干燥、粉碎后即得到季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料；所述载体材料的季铵型阳离子取代度为0.19-0.43；

将季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料与治疗用基因在水溶液中混合，控制N/P摩尔比为0.5～30，经过涡旋振荡1-5min，室温静置1-2h，形成纳米控释传输系统，通过该纳米控释传输系统将外源基因转导入细胞中从而发挥治疗作用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述载体材料制备方法的混合体系中的固碱为质量百分比为11.2-18.5%的氢氧化钠或氢氧化钾，水的质量百分比为11.5-20.3%，季铵型阳离子醚化剂为质量百分比为52.7%-87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵；所述碱、水和季铵型阳离子醚化剂的加入量均以淀粉干基计。

3.权利要求1作为基因治疗中非病毒载体材料应用的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

将含水量为4.7-13.5%、重均分子质量为13000-64000Da的淀粉在捏合机中与经冰水浴搅拌混匀的固碱、水和季铵型阳离子醚化剂的混合体系，于温度25-30°C，转速为40-100转/min的条件下，干法混合反应12h-48h；反应完全后经洗涤、干燥、粉碎后即得到季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合体系中的固碱为质量百分比为11.2-18.5%的氢氧化钠或氢氧化钾，水的质量百分比为11.5-20.3%，季铵型阳离子醚化剂为质量百分比为52.7%-87.0%的3-氯-二羟丙基三甲基氯化铵；所述碱、水和季铵型阳离子醚化剂的加入量均以淀粉干基计。

5.一种如权利要求3或4所述方法制备的季铵型阳离子淀粉基因控释载体材料。