CN102552934B - 阿霉素纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阿霉素纳米粒，由阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物通过静电作用复合而成。所述阿霉素纳米粒的制备方法为阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素纳米粒。在水性介质中，由于所述嵌段共聚物含有的聚(γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-g-巯基丁二酸)段和聚乙二醇段将阿霉素包裹于纳米粒内核，因此阿霉素复合物粒子的稳定性好。该纳米粒有望在血液循环中通过“增强的渗透和滞留效应”在肿瘤部位聚集，提高阿霉素对肿瘤部位的靶向作用。同时，所述嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基之间的静电作用在细胞内低pH值条件下容易解除，可加快胞内释放，并提高药效。

Description

阿霉素纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及高分子药物领域，特别涉及阿霉素纳米粒及其制备方法。

背景技术

阿霉素(DOX)属于蒽环类抗生素，其作用机制是阿霉素分子嵌入DNA的双螺旋结构，改变DNA的模板性质，抑制核酸合成，起到抗肿瘤作用。自上世纪60年代以来，阿霉素就被广泛用于临床化疗，目前主要用于治疗急性白血病、乳腺癌、小细胞型肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤。阿霉素的临床使用方法多为以静脉滴注的方式给药。静脉滴注后阿霉素会迅速分布全身，毒副作用大，如会引起骨髓抑制、脱发、心脏毒性等。同时，阿霉素在血液中半衰期短，达到病灶部位的比例很低，药效较差。

为了提高药效，近年来国内外开发了一系列基于高分子载体材料的阿霉素新剂型，如：阿霉素脂质体、阿霉素微球、阿霉素毫微粒和阿霉素乳剂等。这类高分子载体材料可有效的将药物分子分散到其中，利用载体的各种响应方式，实现药物的输送和控制释放，为肿瘤的治疗提供了新的给药途径。肿瘤部位血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有高通透性和滞留性。因而，纳米至微米尺寸的药物担载体系具有显著的“增强的渗透和滞留效应”，即EPR效应。利用EPR效应这种被动靶向方式，可使药物在肿瘤部位有效聚集，同时减小非病灶部位的毒副作用。

然而，常见的载药体系不仅载药量低，且难以克服初期暴释。为克服这一问题，有研究者改用“化学担载”的方法将药物键合到高分子载体上，这种方法能够有效改善药物的溶解性，提高原药疗效的同时降低了药物的毒副作用。如专利号为200810050407.X的中国专利公开了一种高分子键合阿霉素药、其纳米胶囊及其制备方法，其中，制备的聚乙二醇-聚乳酸-阿霉素键合药是利用聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基缩合形成共价键实现阿霉素担载的。但是采用“化学担载”的方法制备键合药，无法确知键合药物在何时、何处、以何种方式断裂，也无法确知其有效成分，不利于键合药的使用。

与化学担载相比，物理担载具有药物担载过程简单、药物释放机制明确的优点而获得广泛应用。“物理担载”主要利用静电作用、疏水作用和电子堆积作用等物理方式将药物担载于载体材料上。

目前，已有多种利用聚合物载体物理担载抗癌药物的方式进入临床研究，少数已经上市，如利用脂质体担载阿霉素的Doxil和利用蛋白包裹紫杉醇的Abraxane。但是在现有抗癌药物中，只有少数如Doxil是以物理担载方式制备的阿霉素药物，并且利用其他载体以物理担载方式担载阿霉素的方式研究较少，远远不能满足市场的需要。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种阿霉素纳米粒，该纳米粒以静电复合方式担载阿霉素，在生理条件下可稳定存在并且阿霉素的释放速度具有pH敏感性。

本发明提供了一种阿霉素纳米粒，由阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物通过静电作用复合而成；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，40≤m≤250；n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100。

优选的，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

优选的，所述R₁独立地选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽或叶酸取代的烷基。

优选的，所述R₃独立地选自C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基或胆酸基。

优选的，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢。

本发明还提供了一种阿霉素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合得到阿霉素纳米粒；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，40≤m≤250；n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100。

优选的，所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

优选的，所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物按照以下方法制备：

具有式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物在紫外光照射下经引发剂引发，在有机溶剂中与巯基丁二酸发生接枝反应，得到具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物；

式(III)和式(IV)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，40≤m≤250；x为聚合度，1≤x≤300。

优选的，所述紫外光的波长为245nm～365nm。

优选的，所述引发剂为安息香双甲醚或2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。

与现有技术相比，本发明提供的复合物是以式(I)或式(II)结构所示的嵌段共聚物为载体通过静电作用结合阿霉素形成的纳米粒。本发明使用的载体具有良好的生物相容性和生物降解性。本发明的阿霉素纳米粒含有聚(γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-g-巯基丁二酸)段和聚乙二醇段，结合有阿霉素的聚(γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-g-巯基丁二酸)段具有疏水性，聚乙二醇段具有亲水性。当溶于水性介质中时，聚乙二醇段处于外部，聚(γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-g-巯基丁二酸)段处于内部，阿霉素受到这两部分的保护，可以有效避免由于静脉注射后血液循环系统的影响而发生的阿霉素突然释放，因此本发明提供的阿霉素纳米粒的稳定性好。此外，具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物包括含有羧基的聚(γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-g-巯基丁二酸)链段，所述羧基与阿霉素的氨基通过静电作用结合。由于所述羧基在水性介质中对pH值具有敏感性，因此，在较低的pH值环境中，本发明提供的复合物粒子容易解除所述嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基之间的静电作用，从而释放阿霉素并提高药物的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例6制备的嵌段共聚物和实施例6提供的mPEG₄₅-b-PPLG₂₅的红外光谱图；

图2为本发明实施例6制备的嵌段共聚物和实施例6提供的mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅以三氟乙酸作为溶剂时的¹H NMR结果图；

图3为本发明实施例23～25制备的阿霉素纳米粒的包封量和包封效率变化趋势图；

图4为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒的流体力学半径分布图；

图5为本发明实施例6制备的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K对A549细胞的毒性考察结果图；

图6为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药对A549细胞的毒性考察结果图；

图7为本发明实施例6制备嵌段共聚物的溶血实验结果图；

图8为本发明实施例24制备的是阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的溶血实验结果图；

图9为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的细胞内化荧光图；

图10为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的细胞内化荧光统计分析结果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种阿霉素纳米粒，由阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物通过静电作用复合而成；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，40≤m≤250；n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100。

本发明中，所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物为担载阿霉素的载体，阿霉素的氨基与所述嵌段共聚物中的羧基发生静电复合作用，形成阿霉素复合物。优选的，全部阿霉素分子通过静电复合作用担载于所述嵌段共聚物上形成复合物，但不限于全部的阿霉素分子均通过静电复合作用担载于所述嵌段共聚物上，也可以包含部分阿霉素分子之间以疏水作用、π-π堆积作用或其他任何的物理方式担载于所述嵌段共聚物上。所述的复合物中担载的阿霉素越多越有利于提高药效，嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10。

在本发明中，所述嵌段共聚物具有式(I)或式(II)结构，式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基，优选的，独立选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽或叶酸取代的烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，优选为-NH-；其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团，优选为C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基或胆酸基；

n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100。

在本发明中，所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物优选R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢；此时，具有式(I-a)或式(II-a)结构；

式(I-a)或式(II-a)中，m为聚合度，40≤m≤250，优选为60≤m≤150；n为聚合度，1≤n≤200，优选为10≤n≤100；y为聚合度，0≤y≤100，优选为0≤y≤50。

本发明提供了一种阿霉素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素纳米粒。

按照本发明阿霉素纳米粒的制备方法，得到的所述阿霉素纳米粒以胶束的形式存在于水性介质中，所述胶束的流体半径优选为10nm～2000nm，更优选为10nm～600nm。

由于以胶束形式存在的阿霉素纳米粒不利于保存，优选经过后处理得到阿霉素纳米粒的冻干粉，所述后处理优选包括以下步骤：

得到阿霉素纳米粒胶束后透析24h～72h，换水6～10次，冷冻干燥得到阿霉素纳米粒冻干粉。所述阿霉素纳米粒冻干粉可以复溶，经电位测试，测得其Zeta电位均为负值。

所述透析时间优选为48h～72h；所述冻干过程中可加入少量冻干保护剂，如小分子氨基酸、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇中的一种或几种，保护剂的加入可有效避免载药复合物的聚集。由于本发明涉及的大部分复合物具有良好水溶性，无需加入上述保护剂。

在本发明阿霉素纳米粒的制备方法中，所述静电复合优选在避光条件下进行。所述静电复合的时间优选2h～72h，更优选12h～48h。在所述静电复合过程中，所述嵌段共聚物的羧基浓度优选为0.1mM～100mM，更优选为1mM～60mM，最优选为2mM～20mM。

所述水性介质优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，更优选为水或缓冲溶液，所述水或缓冲溶液的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0～7.6。

本发明在制备阿霉素纳米粒时，以具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物为原料，在水性介质中与阿霉素发生静电复合作用；所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10；本发明对所述嵌段共聚物的形态没有特殊限制，优选为冻干粉；本发明所述嵌段共聚物优选按照以下方法制备：

具有式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物在紫外光照射下经光引发剂引发，在有机溶剂中与巯基丁二酸发生接枝反应，得到具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物；

式(III)和式(IV)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₄(CH₂)_rNH-，其中，R₄为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤8；

R₃独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，40≤m≤250；x为聚合度，1≤x≤300。

所述式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物优选R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢；此时，具有式(III-a)或式(IV-a)结构；

m为聚合度，40≤m≤250；x为聚合度，1≤x≤300。

本发明在制备具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物时，以巯基丁二酸和具有式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物为原料，巯基丁二酸与具有式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物的炔基比值优选为2～50，更优选为2～10；本发明对具有式(III)或式(IV)结构的嵌段共聚物的来源没有特殊限制，可以参考中国专利CN10267818A公开的方法制备。

本发明制备具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物的反应优选在无氧条件下进行，所述引发剂优选为安息香双甲醚或2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；所述紫外光的波长优选为245nm～365nm，更优选为300nm～365nm；所述反应时间优选为0.2h～5h；所述有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或三氯甲烷，更优选为N，N-二甲基甲酰胺；得到所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物后优选经透析72h、冷冻干燥得到具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物的冻干粉。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的阿霉素纳米粒及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

将具有式(III-a)结构、m＝45并且x＝10的嵌段共聚物，记为mPEG₄₅-b-PPLG₁₀。

向干燥的反应瓶内加入0.2009g mPEG₄₅-b-PPLG₁₀，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入13.9mg安息香双甲醚和0.1636g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为40.1％，反应转化率为68.5％。

实施例2

将具有式(III-a)结构、m＝45并且x＝10的嵌段共聚物，记为mPEG₄₅-b-PPLG₁₀。

向干燥的反应瓶内加入0.2003g mPEG₄₅-b-PPLG₁₀，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.0mg安息香双甲醚和0.6543g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为61.8％，反应转化率为30.2％。

实施例3

将具有式(III-a)结构、m＝45并且x＝10的嵌段共聚物，记为mPEG₄₅-b-PPLG₁₀。

向干燥的反应瓶内加入0.2010g mPEG₄₅-b-PPLG₁₀，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.0mg安息香双甲醚和1.3100g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为83.2％，反应转化率为18.4％。

实施例4

将具有式(III-a)结、m＝113并且x＝25的嵌段共聚物，记为mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2005g mPEG₄₅-b-PPLG₁₀，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.0mg安息香双甲醚和0.1633g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为45.9％，反应转化率为69.1％。

实施例5

将具有式(III-a)结、m＝113并且x＝25的嵌段共聚物，记为mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2005g mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.1mg安息香双甲醚和0.6582g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为53.6％，反应转化率为29.0％。

实施例6

将具有式(III-a)结、m＝113并且x＝25的嵌段共聚物，记为mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2008g mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.0mg安息香双甲醚和1.3201g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为60.0％，反应转化率为16.1％。

利用红外光谱图对得到的嵌段共聚物和mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅的结构进行分析，结果参见图1。图1为实施例6制备的嵌段共聚物和实施例6提供的mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅的红外光谱图，结果表明，得到的嵌段共聚物具有式(I-a)结构。

图2为本发明实施例6制备的嵌段共聚物和实施例6提供的mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅以三氟乙酸作为溶剂时的¹H NMR结果图，结果表明，实施例6制备的嵌段共聚物具有式(I-a)结构。

实施例7

将具有式(III-a)结、m＝113并且x＝25的嵌段共聚物，记为mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2003g mPEG₁₁₃-b-PPLG₂₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入14.2mg安息香双甲醚和2.5893g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为75.3％，反应转化率为8.5％。

实施例8

将具有式(III-a)结构、m＝227并且x＝81的嵌段共聚物，记为mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁。

向干燥的反应瓶内加入0.2010g mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.3mg安息香双甲醚和0.2065g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为47.2％，反应转化率为66.9％。

实施例9

将具有式(III-a)结构、m＝227并且x＝81的嵌段共聚物，记为mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁。

向干燥的反应瓶内加入0.2006g mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.5mg安息香双甲醚和0.8273g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为56.9％，反应转化率为26.1％。

实施例10

将具有式(III-a)结构、m＝227并且x＝81的嵌段共聚物，记为mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁。

向干燥的反应瓶内加入0.2006g mPEG₂₂₇-b-PPLG₈₁，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.8mg安息香双甲醚和1.6539g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(I-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为61.4％，反应转化率为13.7％。

实施例11

将具有式(IV-a)结构、m＝45并且x＝8的嵌段共聚物，记为PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈。

向干燥的反应瓶内加入0.2004g PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.3mg安息香双甲醚和0.2055g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为59.2％，反应转化率为70.4％。

实施例12

将具有式(IV-a)结构、m＝45并且x＝8的嵌段共聚物，记为PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈。

向干燥的反应瓶内加入0.2012g PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.8mg安息香双甲醚和0.8233g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为65.8％，反应转化率为28.6％。

实施例13

将具有式(IV-a)结构、m＝45并且x＝8的嵌段共聚物，记为PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈。

向干燥的反应瓶内加入0.2006g PPLG₈-b-PEG₄₅-b-PPLG₈，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.4mg安息香双甲醚和1.6449g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为85.1％，反应转化率为15.1％。

实施例14

将具有式(IV-a)结构、m＝90并且x＝15的嵌段共聚物，记为PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2002g PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入16.9mg安息香双甲醚和0.2001g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为51.3％，反应转化率为69.4％。

实施例15

将具有式(IV-a)结构、m＝90并且x＝15的嵌段共聚物，记为PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2007g PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.1mg安息香双甲醚和0.7992g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为58.2％，反应转化率为26.8％。

实施例16

将具有式(IV-a)结构、m＝90并且x＝15的嵌段共聚物，记为PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2009g PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.0mg安息香双甲醚和1.5990g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为63.4％，反应转化率为15.3％。

实施例17

将具有式(IV-a)结构、m＝90并且x＝15的嵌段共聚物，记为PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅。

向干燥的反应瓶内加入0.2006g PPLG₁₅-b-PEG₉₀-b-PPLG₁₅，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入17.0mg安息香双甲醚和3.2001g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为71.6％，反应转化率为8.2％。

实施例18

将具有式(IV-a)结构、m＝227并且x＝34的嵌段共聚物，记为PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄。

向干燥的反应瓶内加入0.2006g PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入16.3mg安息香双甲醚和0.1916g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为52.0％，反应转化率为66.4％。

实施例19

将具有式(IV-a)结构、m＝227并且x＝34的嵌段共聚物，记为PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄。

向干燥的反应瓶内加入0.2005g PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入16.2mg安息香双甲醚和0.7645g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为58.3％，反应转化率为26.1％。

实施例20

将具有式(IV-a)结构、m＝227并且x＝34的嵌段共聚物，记为PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄。

向干燥的反应瓶内加入0.2007g PPLG₃₄-b-PEG₂₂₇-b-PPLG₃₄，用5mL N，N-二甲基甲酰胺搅拌溶解后，通氮气0.5小时后，在室温、氮气保护条件下加入16.5mg安息香双甲醚和1.5296g巯基丁二酸，365nm紫外光照射反应2h，得到产物；将产物透析72小时，换水12次，冷冻干燥得具有式(II-a)结构的嵌段共聚物冻干粉。

对所述嵌段共聚物进行核磁共振测试，计算得到接枝率为63.7％，反应转化率为15.1％。

实施例21

将30mg实施例2制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于13mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为97％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例21得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过以下公式计算阿霉素在纳米粒中的包封效率(DLE)和包封量(DLC)；

得到的阿霉素纳米粒的包封效率为97.02％，包封量为8.8％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-38.5±6.2mV。

实施例22

将20mg实施例2制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于9mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为97.2％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例22得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为95.4％，包封量为15.9％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-29.6±4.0mV。

实施例23

将30mg实施例6制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于13mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为98.3％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例23得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为97.6％，包封量为8.9％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-48.4±7.6mV。

实施例24

将20mg实施例6制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于9mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为96.7％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例24得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为99.0％，包封量为16.5％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-52.2±3.2mV。

对得到的阿霉素纳米粒复溶，将阿霉素纳米粒胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图4，图4为实施例24制备的阿霉素纳米粒的流体力学半径分布图，结果表明，阿霉素纳米粒的流体力学半径在40nm～150nm之间

实施例25

将30mg实施例6制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于13mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入15mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为2∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为96.3％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例25得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为98.4％，包封量为32.8％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-43.9±5.7mV。

比较实施例23～25制备的阿霉素纳米粒的包封效率和包封量，结果参见图3，图3为发明实施例23～25制备的阿霉素纳米粒的包封量和包封效率变化趋势图，其中，曲线A为包封效率趋势，曲线B为包封量变化趋势，结果表明，由图3可知，在实施例6制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值在2～10的范围时，包埋效率几乎都接近100％，包埋量为8.9％～32.2％，由此可见，实施例6制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物对阿霉素具有良好的担载能力。

实施例26

将30mg实施例10制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于15mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为96.9％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例26得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为96.8％，包封量为8.8％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-63.3±8.4mV。

实施例27

将20mg实施例10制备的具有式(I-a)结构的嵌段共聚物溶于10mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为97.6％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例27得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为97.2％，包封量为16.2％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-57.6±4.5mV。

实施例28

将30mg实施例11制备的具有式(II-a)结构的嵌段共聚物溶于11mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为97.3％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例28得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为97.9％，包封量为8.9％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-36.2±3.8mV。

实施例29

将20mg实施例11制备的具有式(II-a)结构的嵌段共聚物溶于7mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为95.7％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例29得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为96.2％，包封量为16.04％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-27.9±4.1mV。

实施例30

将30mg实施例15制备的具有式(II-a)结构的嵌段共聚物溶于11mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为95.0％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例30得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为98.2％，包封量为8.93％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-53.7±6.7mV。

实施例31

将20mg实施例15制备的具有式(II-a)结构的嵌段共聚物溶于7mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素纳米粒胶束；将所述纳米粒胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素纳米粒冻干粉，其产率为96.6％。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例31得到的阿霉素纳米粒中阿霉素的浓度，通过实施例21中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包封效率为96.4％，包封量为16.06％。

将得到的阿霉素纳米粒冻干粉复溶，对形成的纳米粒胶束进行电位测试，其Zeta电位为-48.0±7.3mV。

实施例32

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(约10⁴个)细胞；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将实施例6制备的嵌段共聚物稀释为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL 7个浓度的溶液样品；

将各溶液样品加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K的细胞存活率，结果参见图5，图5为实施例6制备的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K对A549细胞的毒性考察结果图，结果表明，各浓度的嵌段共聚物下细胞存活率基本一致，且接近100％，由此可知，本发明使用的嵌段共聚物具有良好的生物相容性，对细胞基本没有毒性。

实施例33

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(约10⁴个)细胞；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将阿霉素裸药稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL 6个浓度的样品，用培养基将实施例24制备的阿霉素纳米粒分别按照阿霉素浓度稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL 6个浓度的样品；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素及阿霉素纳米粒的细胞存活率。

比较阿霉素纳米粒以及阿霉素裸药作用的效果参见图6，图6为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒以及纯阿霉素对A549细胞的毒性考察结果图，其中，曲线A为阿霉素裸药对细胞的毒性效果，曲线B为实施例24制备的阿霉素纳米粒对细胞的毒性效果，由图6可知，阿霉素复合物担载的阿霉素浓度与阿霉素裸药的浓度相同时，细胞的存活率相似，并且随着阿霉素浓度的增大，细胞的存活率降低，由此可见，阿霉素复合物较好的保持了阿霉素的毒性，与纯阿霉素有相近的杀伤能力，并呈现明显的剂量与药效关系。

实施例34

取含5g/L EDTA的兔血5mL，加入40mL 0.9％生理盐水，1200rpm，离心10分钟，弃上清；将沉淀用0.9％生理盐水反复离心清洗，弃上清，至上清透明，弃上清得到血细胞；取3mL的血细胞，加入27mL 0.9％生理盐水，使血细胞浓度稀释十倍；

用pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解实施例6制备的嵌段共聚物，按照羧基浓度稀释为0.078mg/mL、0.156mg/mL、0.3215mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL 8个浓度的样品，分别取上述浓度的样品0.4mL，再加入等体积的血细胞溶液，得到混合液，将混合液在37℃电热水浴振荡器中孵育2小时；

将混合液离心，取100μL上清于96孔板中，测试其在540nm的吸光度。以0.1％曲拉通-100为阳性对照，磷酸盐缓冲液为阴性对照，按照下式计算溶血百分数。

图7为本发明实施例6制备的嵌段共聚物的溶血结果图，结果表明，实施例6制备的嵌段共聚物不会产生溶血。

实施例35

取含5g/LEDTA的兔血5mL，加入40mL 0.9％生理盐水，1200rpm，离心10分钟，弃上清；将沉淀用0.9％生理盐水反复离心清洗，弃上清，至上清透明，弃上清得到血细胞；取3mL的血细胞，加入27mL 0.9％生理盐水，使血细胞浓度稀释十倍；

用pH 7.4的磷酸盐缓冲液溶解实施例24制备的阿霉素纳米粒，按照阿霉素浓度稀释为0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.0062mg/mL、0.0031mg/mL 8个浓度的样品，分别取上述浓度的样品0.4mL，再加入等体积的血细胞溶液，得到混合液，将混合液在37℃电热水浴振荡器中孵育2小时；

将混合液离心，取100μL上清于96孔板中，测试其在540nm的吸光度。以0.1％曲拉通-100为阳性对照，磷酸盐缓冲液为阴性对照，按照实施例34中提供的公式计算溶血百分数。

图8为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的溶血实验结果图，其中，曲线A为阿霉素裸药的溶血结果，曲线B为实施例24制备的阿霉素纳米粒的溶血结果，结果表明，阿霉素纳米粒可有效改善阿霉素的血液相容性。

实施例36

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入6孔板内，每孔2mL(约2×10⁵个)细胞，37℃培养24h后弃培养液；

按照阿霉素终浓度为5μg/mL稀释阿霉素裸药和实施例24制备的阿霉素纳米粒，分别取稀释后的样品2mL加入6孔板内；

将6孔板在37℃，饱和湿度，5％CO₂的细胞培养箱中培养3h；然后弃培

养液液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞3～5次；

弃去磷酸盐缓冲液，每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定10分钟；

弃甲醛，磷酸盐缓冲液洗3～5次后，每孔加入1.5μL的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，于1mL磷酸盐缓冲液中避光标记10分钟，弃标记液，磷酸盐缓冲液洗5次；

加入0.1％的TritonX-100通透5分钟，弃通透液，磷酸盐缓冲液洗3次；

加入5μL的Alexa Fluor

鬼笔环肽染色20分钟，磷酸盐缓冲液洗5次；加2μL甘油封片，激光共聚焦显微镜观察，结果参见图9，图9为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的细胞内化荧光图，其中，A～D为阿霉素裸药的激光共聚焦显微镜结果，E～H为阿霉素纳米粒的激光共聚焦显微镜结果，A和E为DAPI核染色，B和F为阿霉素荧光，C和G为Alexa Fluor 488的细胞骨架染色，D为A、B和C的叠加效果图，H为E、F和G的叠加效果图；结果表明，裸药阿霉素能快速进入细胞并作用于细胞核；而纳米粒子担载阿霉素以后需要经过内吞作用进入细胞，因此进细胞过程较慢，并且部分阿霉素分布于细胞质，显示了其缓慢释放的特性。

实施例37

收集对数期A549细胞，调整细胞浓度，接种入6孔板内，每孔2mL(约2×10⁵个)细胞，37℃培养24h后弃培养液；

按照阿霉素终浓度为5μg/mL稀释阿霉素裸药和实施例24制备的阿霉素纳米粒，分别取稀释后的样品2mL加入6孔板内；

将6孔板在37℃，饱和湿度，5％CO₂的细胞培养箱中培养3h；

然后弃培养液液，磷酸缓冲液清洗细胞3～5次，胰蛋白酶消化，收集细胞；1000rpm，离心5分钟，弃上清，每管加入1mL磷酸缓冲液重旋清洗细胞，重复两次；

弃磷酸缓冲液，每管加入500μL的磷酸缓冲液重旋细胞，流式细胞仪检测，结果参见图10，图10为本发明实施例24制备的阿霉素纳米粒及阿霉素裸药的细胞内化荧光分析结果图，其中，A图为作为对照的空白细胞的荧光分析结果，B图为阿霉素裸药的细胞内化荧光分析结果，C图为载药纳米粒子的细胞内化荧光分析结果，结果表明，担载阿霉素的纳米颗粒与阿霉素具有相近的细胞内化能力。

Claims (5)

1.一种阿霉素纳米粒，由阿霉素与具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物通过静电作用复合而成；

式（I）中和式（II）中，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢；

m为聚合度，40≤m≤250；n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100；

所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

2.一种阿霉素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

阿霉素与具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合得到阿霉素纳米粒；

式（I）中和式（II）中，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢；

m为聚合度，40≤m≤250；n为聚合度，1≤n≤200；y为聚合度，0≤y≤100；

所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20；

所述水性介质为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物按照以下方法制备：

具有式（III）或式（IV）结构的嵌段共聚物在紫外光照射下经引发剂引发，在有机溶剂中与巯基丁二酸发生接枝反应，得到具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物；

式（III）和式（IV）中，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢；

m为聚合度，40≤m≤250；x为聚合度，1≤x≤300。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述紫外光的波长为245nm～365nm。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为安息香双甲醚或2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。

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