CN102526756A - 阿霉素复合物、胶束及胶束的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阿霉素复合物、胶束及胶束的制备方法。所述阿霉素复合物，由阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合而成，所述嵌段共聚物具有式(i)或式(ii)结构。阿霉素复合物胶束包括所述阿霉素复合物和水性介质。所述阿霉素复合物胶束的制备方法为阿霉素与具有式(i)或式(ii)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素复合物胶束。在水性介质中，由于所述嵌段共聚物含有的聚谷氨酸段和聚乙二醇段将阿霉素包裹于胶束内核，因此阿霉素复合物胶束稳定性好；同时，所述嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基之间的静电作用容易解除，在较低的ph值环境中，羧基趋于质子化，阿霉素的释放速率明显增快，可提高药物的疗效。

Description

阿霉素复合物、胶束及胶束的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子药物领域，特别涉及阿霉素复合物、胶束及胶束的制备方法。

背景技术

阿霉素(DOX)是一种抗肿瘤抗生素，其作用机制是阿霉素分子嵌入DNA的双螺旋结构，改变DNA的模板性质，抑制核酸合成。阿霉素抗肿瘤谱广，疗效明确，自上世纪60年代以来，就被广泛用于临床化疗，目前主要用于治疗急性白血病、乳腺癌、小细胞型肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤。阿霉素的临床使用方法多为以静脉滴注的方式给药。静脉滴注后阿霉素会迅速分布全身，毒副作用大，如会引起骨髓抑制、脱发、心脏毒性等。同时，阿霉素在血液中半衰期短，达到病灶部位的比例很低，药效较差。

为了提高药效，高分子材料经常用来作为药物输送的载体。近期迅速发展起来的是微米和纳米尺度的高分子载体，如：胶束、囊泡和纳米颗粒等，这类高分子载体可有效的将药物分子分散到其中，利用载体的各种响应方式，实现药物的输送和控制释放。肿瘤部位血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和脂质颗粒具有高通透性和滞留性。因而，纳米至微米尺寸的药物担载体系具有显著的“增强的渗透和滞留效应”，即EPR效应。利用EPR效应这种被动靶向方式，可使药物在肿瘤部位有效聚集，同时减小非病灶部位的毒副作用。

然而，常见的囊泡载药体系不仅载药量低，且难以克服初期暴释。为克服这一问题，有研究者改用“化学担载”的方法将药物键合到高分子载体上，这种方法能够有效改善药物的溶解性，提高原药疗效的同时降低了药物的毒副作用。如专利号为200810050407.X的中国专利公开了一种高分子键合阿霉素药、其纳米胶囊及其制备方法，其中，制备的聚乙二醇-聚乳酸-阿霉素键合药是利用聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基缩合形成共价键实现阿霉素担载的。但是采用“化学担载”的方法制备键合药，无法确知键合药物在何时、何处、以何种方式断裂，不利于键合药的使用。

与化学担载相比，物理担载具有药物担载过程简单、药物释放机制明确的优点而获得广泛应用。“物理担载”主要利用静电作用、疏水作用和电子堆积作用等物理方式将药物担载于载体材料上。在物理担载中，载体表面的电位可以影响药物在肿瘤部位的聚集情况，如：Biomaterials(32(13)：3435-3446，2011)研究了不同表面电荷的载体在荷瘤小鼠的组织分布情况，结果表明，当载体表面具有较低的负电位时，可有效降低其在肝组织的滞留，并同时增加其在肿瘤部位的聚集。

近年来，抗癌药载体的设计和研究已经取得很大进展，但多数载体可控性差，限制了其进一步应用。肿瘤细胞内环境主要表现为“三低一高”，即：低氧、低糖、低pH值和高谷胱甘肽浓度，其中尤为显著的是低pH值，晚期内涵体和溶酶体的pH值可低至5.0(Advanced Functional Materials 19(22)：3580-3589)。针对肿瘤细胞内环境的特点，以不同方式在载体中埋设刺激响应型的“开关”，可降低药物对正常组织的毒性，促进药物在靶点位置的释放，从而提高药物疗效。目前，已有多种利用聚合物载体物理担载抗癌药物的方式进入临床研究，少数已经上市，如利用脂质体担载阿霉素的Doxil和利用蛋白包裹紫杉醇的Abraxane。但是在现有抗癌药物中，只有少数如Doxil是以物理担载方式制备的阿霉素药物，并且利用其他载体以静电相互作用的方式担载阿霉素的研究较少，远远不能满足市场的需要。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种阿霉素复合物，该复合物以静电复合方式担载阿霉素，在生理条件下可稳定存在并且阿霉素的释放速度具有pH敏感性。

本发明提供了一种阿霉素复合物，由阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合而成，所述嵌段共聚物具有式(I)或式(II)结构；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

优选的，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

优选的，所述保护基为C1～C6的烷基或苯甲基。

优选的，所述R₁独立地选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽或叶酸取代的烷基。

优选的，所述R₄独立地选自C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基或胆酸基。

优选的，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60％以上；R₄是氢。

本发明提供了一种阿霉素复合物胶束，包括上述技术方案所述的阿霉素复合物和水性介质。

优选的，所述水性介质包括水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

本发明还提供了一种阿霉素复合物胶束的制备方法，包括以下步骤：阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素复合物胶束；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，r为聚合度，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

优选的，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

与现有技术相比，本发明提供的复合物是以式(I)或式(II)结构所示的嵌段共聚物为载体通过静电作用结合阿霉素形成的一种复合物。本发明所述的阿霉素复合物含有聚谷氨酸段和聚乙二醇段，结合有阿霉素的聚谷氨酸段具有疏水性，聚乙二醇段具有亲水性。在水性介质中，所述复合物形成胶束，聚乙二醇段处于胶束外核，聚(L-谷氨酸)段处于胶束的内核，阿霉素受到这两部分的保护，可以有效避免由于静脉注射后血液循环系统的影响而发生的阿霉素突然释放，因此本发明提供的复合物胶束稳定性好。此外，具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物包括含有羧基的聚(L-谷氨酸)链段，所述羧基与阿霉素的氨基通过静电作用结合。由于所述羧基在水性介质中对pH值具有敏感性，因此，在肿瘤组织部位及其肿瘤细胞内较低的pH值环境中，本发明提供的复合物胶束容易解除所述嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基之间的静电作用，从而释放阿霉素并提高药物的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图；

图3为本发明实施例19～21制备的阿霉素复合物胶束的载药量和包封率变化趋势图；

图4为本发明实施例19、20和21制备的阿霉素复合物的Zeta表面电位结果图；

图5为本发明实施例10制备的阿霉素复合物在pH值5.5和7.4的释放结果图；

图6为本发明实施例10和实施例20制备的阿霉素复合物及阿霉素裸药的溶血实验结果图；

图7为本发明实施例1、实施例5、实施例6制备的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K对Hela细胞的毒性考察结果图；

图8为本发明实施例10、实施例20制备的阿霉素复合物以及阿霉素裸药对Hela细胞的毒性考察结果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种阿霉素复合物，由阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合而成，所述嵌段共聚物具有式(I)或式(II)结构；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

本发明中，所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物为担载阿霉素的载体，阿霉素的氨基与所述嵌段共聚物中的羧基发生静电复合作用，形成阿霉素复合物。优选的，全部阿霉素分子通过静电复合作用担载于所述嵌段共聚物上形成复合物，但不限于全部的阿霉素分子均通过静电复合作用担载于所述嵌段共聚物上，也可以包含部分阿霉素分子之间以疏水作用、π-π堆积作用或其他任何的物理方式担载于所述嵌段共聚物上。所述的复合物中担载的阿霉素越多越有利于提高药效，嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10。

在本发明中，所述嵌段共聚物具有式(I)或式(II)结构，式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基，优选的，独立选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽或叶酸取代的烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，优选为-NH-；其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；由于所述嵌段共聚物是通过羧基与阿霉素的氨基结合的，并且羧基比较活泼，因此在制备所述嵌段共聚物时首先用保护基对羧基进行了保护，制备完成后再脱保护，得到完整的羧基，在这个过程中，可以通过控制反应时间和物料的投料比来调控脱保护的程度，部分R₃可以为所述保护基，所述保护基优选为C1～C6的烷基或苯甲基。

R₄独立地选自氢或疏水基团，优选为C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基或胆酸基。

在本发明中，所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物优选R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60％以上；R₄是氢；此时，具有式(I-a)或式(II-a)结构；

在式(I-a)或式(II-a)中，m为聚合度，20≤m≤250，优选为40≤m≤150；n为聚合度，5≤n≤200，优选为10≤n≤100。

本发明提供了一种阿霉素复合物胶束，包括上述技术方案中所述的阿霉素复合物和水性介质。

在本发明中，上述技术方案中所述的阿霉素复合物具有聚谷氨酸段和聚乙二醇段，聚(L-谷氨酸)段为疏水链段，聚乙二醇段为亲水链段，因此在水性介质中，所述复合物能够自组装为胶束形式，聚乙二醇段处于胶束外核，聚(L-谷氨酸)段处于胶束的内核。

所述的复合胶束在水性介质中的流体动力学半径优选为10nm～2000nm，更优选为10nm～600nm。

所述水性介质优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，更优选为水或缓冲溶液，水或缓冲溶液的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0～7.6。

本发明还提供了一种阿霉素复合物胶束的制备方法，包括以下步骤：

阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素复合物胶束。

在本发明中，所述静电复合优选在避光条件下进行。所述静电复合的时间优选2h～72h，更优选12h～48h。在所述静电复合过程中，所述嵌段共聚物的羧基浓度优选为0.1mM～100mM，更优选为1mM～60mM，最优选为2mM～20mM。

所述水性介质优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，更优选为水或缓冲溶液，所述水或缓冲溶液的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0～7.6。

本发明在制备阿霉素复合物胶束时，以具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物为原料，在水性介质中与阿霉素发生静电复合作用；所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值优选大于0.3且小于20，更优选为大于0.5且小于10；本发明对所述嵌段共聚物的形态没有特殊限制，优选为冻干粉；本发明对所述嵌段共聚物的来源也没有特殊限制，优选按照以下方法制备：

无水无氧条件下，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与具有式(III)或式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式(V)或式(VI)的聚乙二醇在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物；

在式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)中，m为聚合度，20≤m≤250，优选为40≤m≤150；

在式(IV)或式(VI)中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10。

在本发明制备所述具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物过程中，所述有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或三氯甲烷，所述反应优选在无水条件下进行。

所述具有式(III)或式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式(V)或式(VI)结构的聚乙二醇含有伯胺基，因此可以引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐发生聚合，可以按照本领域技术人员熟知的常规方法制备。

所述具有式(III)或式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式(V)或式(VI)结构的聚乙二醇与所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比优选为1∶5～200，更优选为1∶10～100。所述搅拌反应的温度优选为20℃～30℃。所述搅拌反应的时间优选为60h～80h。

本发明对所述带有保护基的化合物脱保护的方法没有特殊限制，一般为溴化氢/乙酸溶液法。

所述溴化氢/乙酸溶液法包括以下步骤：

25℃下，将带有保护基的化合物溶解于二氯乙酸中，搅拌条件下向得到的溶液中加入溴化氢质量含量为33％的溴化氢/乙酸溶液，搅拌反应1h，将反应产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，在纯水中透析至少72h，透析过程中换水10～15次，冷冻干燥，得到具有式(I)或式(II)结构嵌段共聚物的冻干粉。

本发明在制备具有式(I)或式(II)结构嵌段共聚物过程中，以γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐为原料，对γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐的来源没有特殊限制，可以按照以下方法制备：

L-谷氨酸和苯甲醇在浓硫酸的作用下发生反应，经后处理得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯；

所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯反应，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐。

本发明中，所述的阿霉素复合物胶束还可以以冻干粉的形式存在，优选按照以下方法进行处理：

将所述阿霉素复合物胶束避光透析、冻干得到所需的阿霉素复合物冻干粉。

所述透析时间优选为24h～72h，更优选48h～72h，换水次数优选6～10次。

所述冻干为液氮速冻，其中可加入少量冻干保护剂，如小分子氨基酸、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇中的一种或几种，所述保护剂的加入可有效避免载药复合物的聚集。由于本发明涉及的大部分阿霉素复合物具有良好水溶性，可以不加入所述保护剂。所述阿霉素复合物冻干粉复溶后，测定溶液中阿霉素的浓度为0.01～5mg/mL。

与现有技术相比，本发明提供的复合物是以式(I)或式(II)结构所示的嵌段共聚物为载体通过静电作用结合阿霉素形成的一种复合物。本发明所述的阿霉素复合物含有聚谷氨酸段和聚乙二醇段，结合有阿霉素的聚谷氨酸段具有疏水性，聚乙二醇段具有亲水性。在水性介质中，所述复合物形成胶束，聚乙二醇段处于胶束外核，聚(L-谷氨酸)段处于胶束的内核，阿霉素受到这两部分的保护，可以有效避免由于静脉注射后血液循环系统的影响而发生的阿霉素突然释放，因此本发明提供的复合物胶束稳定性好。此外，具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物包括含有羧基的聚(L-谷氨酸)链段，所述羧基与阿霉素的氨基通过静电作用结合。由于所述羧基在水性介质中对pH值具有敏感性，因此，在肿瘤细胞内较低的pH值环境中，本发明提供的复合物胶束容易解除所述嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基之间的静电作用，从而释放阿霉素并提高药物的疗效。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的阿霉素复合物、胶束及胶束的制备方法进行详细描述，但是本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

向干燥的反应瓶内加入2.4454g数均分子量为5000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将6.4460gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取6.6330g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于60mL二氯乙酸中，加入18mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图1，图1为实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中100％为氢；所述嵌段共聚物的产率为73％，其中，n＝45，m＝113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅。

实施例2

向干燥的反应瓶内加入1.6251g数均分子量为4000的具有式(V)结构的聚乙二醇，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.2790gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物4.4241g在25℃下溶解于40mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入9mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应45min，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(II-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式(II-a)结构，其中，R3中92％为氢；所述嵌段共聚物的产率为77％，其中，n＝16，m＝90，记为PLG₁₆-b-PEG₉₀-b-PLG₁₆。

实施例3

向干燥的反应瓶内加入1.4868g数均分子量为2000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.9367gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取2.5526g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于25mL二氯乙酸中，加入7mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应45min，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中96％为氢；产率为69％，n＝10，m＝45，记为MPEG₄₅-b-PLG₁₀。

实施例4

向干燥的反应瓶内加入1.2607g数均分子量为2000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.3149gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.4685g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入10mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中100％为氢，产率为70％，n＝20，m＝45，记为MPEG₄₅-b-PLG₂₀。

实施例5

向干燥的反应瓶内加入3.0030g数均分子量为5000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与70mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.3800gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于16mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.5800g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入9mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中100％为氢，产率为67％，n＝11，m＝113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁。

实施例6

向干燥的反应瓶内加入2.5020g数均分子量为5000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.9740gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取3.5140g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于35mL二氯乙酸中，加入9mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中100％为氢，产率为71％，n＝20，m＝113，记为MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀。

实施例7

向干燥的反应瓶内加入2.1249g数均分子量为10000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与70mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.6362gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于25mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。

取4.1340g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于40mL二氯乙酸中，加入12mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应50min，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(I-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结构表明，所述嵌段共聚物具有式(I-a)结构，其中，R₃中98％为氢，产率为73％，n＝53，m＝227，记为MPEG₂₂₇-b-PLG₅₃。

实施例8

向干燥的反应瓶内加入1.0538g数均分子量为2000的具有式(V)结构的聚乙二醇，与50mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.1630gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物3.3529g在25℃下溶解于30mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入10mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(II-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式(II-a)结构，其中，R₃中100％为氢，产率为75％，n＝10，m＝45，记为PLG₁₀-b-PEG₄₅-b-PLG₁₀。

实施例9

向干燥的反应瓶内加入1.5289g数均分子量为10000的具有式(V)结构的聚乙二醇，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.8175gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N，N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到中间产物。

取制备的中间产物3.1624g在25℃下溶解于30mL二氯乙酸中，搅拌条件下加入10mL溴化氢质量浓度为33％的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水12次，然后冷冻干燥得到具有式(II-a)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，所述嵌段共聚物具有式(II-a)结构，其中，R₃中100％为氢，产率为70％，n＝27，m＝227，记为PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇。

实施例10

将60mg实施例1得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入12mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，复合胶束的表面电位均为负值。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图2，图2为实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图，实施例10制备的复合物胶束流体力学半径在70nm～400nm之间。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例10得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过以下公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率(DLE)和包埋量(DLC)；

实施例10得到的阿霉素复合物的包埋效率为99.3％，包埋量为16.6％。

实施例11

将30mg实施例1得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅溶解于12mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入1.5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为20∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-49.67±7.13mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在50nm～250nm之间。

实施例12

将30mg实施例1得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅溶解于12mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-35.30±9.69mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图2，图2为实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图，其中曲线A为实施例12制备的复合物胶束，曲线B为实施例10制备的复合物胶束，由图2可知，实施例10制备的复合物胶束流体力学半径在70nm～400nm之间，实施例12制备的复合物胶束流体力学半径在80nm～250nm之间，由此可见，随着载药量增加，胶束的粒径略有增加。

实施例13

将30mg实施例1得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅溶解于12mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入15mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为2∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-57.07±1.74mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在50nm～1000nm之间。

实施例14

将20mg实施例2得到的PLG₁₆-b-PEG₉₀-b-PLG₁₆溶解于7.5mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例14得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为97.1％，包埋量为16.2％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-45.74±5.39mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在50nm～500nm之间。

实施例15

将20mg实施例3得到的MPEG₄₅-b-PLG₁₀溶解于6mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例15得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为64.7％，包埋量为10.8％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-39.98±2.69mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在10nm～300nm之间。

实施例16

将20mg实施例4得到的MPEG₄₅-b-PLG₂₀溶解于8.2mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-42.38±4.95mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在10nm～600nm之间。

实施例17

将20mg实施例5得到MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于5mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在60nm～400nm之间。

实施例18

将20mg实施例5得到MPEG₁₁₃-b-PLG₁₁溶解于5mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入2mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素复合物。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-35.85±7.90mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在60nm～300nm之间。

实施例19

将30mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于7mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入3mg阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为10∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例19得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率(DLE)和包埋量(DLC)，得到嵌段共聚物与阿霉素的质量比为10∶1时的药物担载情况。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-33.25±3.10mV。

实施例20

将60mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于14mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入12mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例20得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为96.6％，包埋量16.1％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-49.30±3.99mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在70nm～200nm之间。

实施例21

将30mg实施例6得到的MPEG₁₁₃-b-PLG₂₀溶解于10mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入15mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为2∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例21得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率(DLE)和包埋量(DLC)，得到嵌段共聚物与阿霉素的比例为2∶1时的药物担载情况。

对实施例19～21制备的复合物胶束的包埋效率和包埋量进行比较，结果参见图3，图3为实施例19～21制备的复合物的包埋效率和包埋量变化趋势，其中，曲线A为包埋效率变换趋势，曲线B为包埋量变化趋势，由图3可知，在嵌段共聚物MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅与阿霉素的质量比的比值在2～10的范围时，包埋效率几乎都接近100％，包埋量为8.9％～32.2％，由此可见，嵌段共聚物MPEG₁₁₃-b-PLG₄₅对阿霉素具有良好的担载能力。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-43.03±2.50mV。

对实施例19～21制备的复合物胶束的Zeta表面电位进行分析，结果参见图4，图4为本发明实施例19～21制备的阿霉素复合物的Zeta表面电位结果，其中，样品A、B、C分别为实施例19、20、21制备的复合物胶束，由图4可知，实施例19～21制备的阿霉素复合物胶束表面均带有负电荷。

实施例22

将20mg实施例7得到的MPEG₂₂₇-b-PLG₅₃溶解于6mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例22得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为95.3％，包埋量15.9％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-53.23±6.22mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在60nm～800nm之间。

实施例23

将20mg实施例8得到的PLG₁₀-b-PEG₄₅-b-PLG₁₀溶解于8mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例23得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率95.9％，包埋量为16.0％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-37.61±2.58mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在80nm～600nm之间。

实施例24

将20mg实施例9得到的PLG₂₇-b-PEG₂₂₇-b-PLG₂₇溶解于7mL去离子水中，调节pH值7.0～7.6，加入4mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将所述阿霉素复合物胶束在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为5∶1的阿霉素复合物。

利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例24得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率98.3％，包埋量为16.4％。

将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-51.16±7.01mV。

复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在50nm～700nm之间。

实施例25

在37℃，取5mg的实施例10制备的阿霉素复合物溶解在5mL 0.01M的pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至透析袋，透析袋的截留分子量为3500，用40mL相应pH值的缓冲液进行透析，在特定时间取样3mL，并加入相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定释放液的浓度，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图5所示。

实施例26

在37℃，取5mg的实施例10制备的阿霉素复合物溶解在5mL 0.01M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至透析袋，透析袋的截留分子量为3500，用40mL相应pH值的缓冲液进行透析，在特定时间取样3mL，并加入相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定释放液的浓度，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图5所示，结果表明，阿霉素胶束具有缓释能力，且其释放受pH影响，在pH5.5环境下比pH7.4环境下，更有利于加速药物释放。

实施例27

取加入5g/L的EDTA的兔血5mL，加入40mL 0.9％生理盐水，1200rpm，离心10分钟，弃上清；将沉淀用0.9％生理盐水反复离心清洗，弃上清，至上清透明，弃上清得到血细胞；取3mL的血细胞，加入27mL 0.9％生理盐水，使血细胞浓度稀释十倍；

用pH 7.4的磷酸盐缓冲液分别溶解实施例10和实施例20制备的阿霉素复合物，分别按照阿霉素浓度稀释为0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.0062mg/mL、0.0031mg/mL 8个浓度的样品，分别取上述浓度的样品0.4mL，再加入等体积的血细胞溶液，得到混合液，将混合液在37℃电热水浴振荡器中孵育2小时；

将混合液离心，取100μL上清于96孔板中，测试其在540nm的吸光度。以0.1％曲拉通-100为阳性对照，磷酸盐缓冲液为阴性对照，按照下式计算溶血百分数。

图6为本发明实施例10和实施例20制备的阿霉素复合物及阿霉素裸药的溶血实验结果图，其中，曲线A为阿霉素裸药的溶血结果，曲线B为实施例20制备的阿霉素复合物的溶血结果，曲线C为实施例10制备的阿霉素复合物的溶血结果，结果表明，阿霉素复合物可以改善阿霉素的血液相容性。

实施例28

收集对数期Hela细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～10⁴个)细胞；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将实施例1制备的嵌段共聚物稀释为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL7个浓度，将实施例5和实施例6制备的嵌段共聚物及PEI25K以相同的方法制备成7个浓度的溶液样品；

将各溶液样品加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K的细胞存活率，结果参见图7，图7为实施例1、实施例5、实施例6制备的嵌段共聚物及阳性对照PEI25K对Hela细胞的毒性考察结果图，结果表明，各浓度的嵌段共聚物下细胞存活率基本一致，由此可知，本发明使用的嵌段共聚物具有良好的生物相容性，对细胞基本没有毒性。

实施例29

收集对数期Hela细胞，调整细胞浓度，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～10⁴个)细胞；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h，弃培养液；

用培养基将阿霉素裸药稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度的样品，用培养基将实施例10和实施例20制备的阿霉素复合物分别按照阿霉素浓度稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度的样品；

将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；

在37℃，饱和湿度，5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

24h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；

终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素及阿霉素复合物的细胞存活率。

比较阿霉素复合物以及阿霉素裸药作用的效果参见图8，图8为本发明实施例10、实施例20制备的阿霉素复合物以及纯阿霉素对Hela细胞的毒性考察结果图，其中，曲线A为阿霉素裸药对细胞的毒性效果，曲线B为实施例20制备的阿霉素复合物对细胞的毒性效果，曲线C为实施例10制备的阿霉素复合物对细胞的毒性效果，由图8可知，阿霉素复合物担载的阿霉素浓度与阿霉素裸药的浓度相同时，细胞的存活率相似，并且随着阿霉素浓度的增大，细胞的存活率降低，由此可见，阿霉素复合物较好的保持了阿霉素的毒性，与纯阿霉素有相近的杀伤能力，并呈现明显的计量与药效关系。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种阿霉素复合物，由阿霉素与嵌段共聚物通过静电作用复合而成，所述嵌段共聚物具有式(I)或式(II)结构；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH--或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述保护基为C1～C6的烷基或苯甲基。

4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述R₁独立地选自C1～C40烷基或由氨基、巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD短肽或叶酸取代的烷基。

5.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述R₄独立地选自C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基或胆酸基。

6.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，R₁是甲基；R₂为-NH-；R₃是氢和苯甲基，且氢占全部R₃基团的60％以上；R₄是氢。

7.一种阿霉素复合物胶束，包括权利要求1～6任意一项所述的阿霉素复合物和水性介质。

8.根据权利要求7所述的复合物胶束，其特征在于，所述水性介质包括水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。

9.一种阿霉素复合物胶束的制备方法，包括以下步骤：阿霉素与具有式(I)或式(II)结构的嵌段共聚物在水性介质中静电复合，得到阿霉素复合物胶束；

式(I)中和式(II)中，R₁独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R₂独立地选自-NH-或-R₅(CH₂)_rNH-，其中，R₅为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R₃独立地选自氢和保护基，所述保护基为烷基或芳烷基，其中，氢占全部R₃基团的60％以上；

R₄独立地选自氢或疏水基团；

m为聚合度，20≤m≤250；n为聚合度，5≤n≤200。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述嵌段共聚物与阿霉素的质量比的比值小于20。

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