JPH0564739A

JPH0564739A - 巨大リポソームの調製方法

Info

Publication number: JPH0564739A
Application number: JP22616891A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Tomita; 康子富田; Takeshi Nomoto; 毅野本; Junji Oyama; 淳史大山; Masahiro Kawaguchi; 正浩川口; Nobuko Yamamoto; 伸子山本
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-09-05
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1993-03-19

Abstract

(57)【要約】【目的】数十μｍ以上、なかでも数百μｍの直径を有
する巨大リポソームを、簡便な工程、かつ緩和な条件下
で多量に調製できる方法を提供する。【構成】リポソームを分散したアルカリ金属塩水溶液
を凍結、融解し、該アルカリ金属塩水溶液よりも低い塩
濃度の水溶液または緩衝液に対して透析して得た巨大リ
ポソームを更に０〜４０℃の範囲の一定温度条件下に保
持して、その複数を融合させてより大きな直径の巨大リ
ポソームを得る。膜蛋白質を脂質膜に含有させたプロテ
オリポソームの場合は、膜蛋白質の共存によってリポソ
ームの融合が促進される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、数十μｍ以上の、なか
でも数百μｍの直径を有する巨大リポソームを、簡便な
工程、かつ緩和な条件下で多量に調製できる方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】脂質膜による閉鎖小胞であるリポソーム
は、その内腔中あるいは膜中に種々の物質を包含するこ
とができる。そこで、この特性を利用してリポソームを
薬物の生体内運搬体として用いるための数多くの研究が
行なわれている。また、リポソームは生体膜のモデルと
しても有用であり、リポソーム単独で、あるいは様々な
膜蛋白質を脂質膜に固定したプロテオリポソームとし
て、生体膜の生物物理的諸性質の研究に広く利用されて
いる。更に最近では、化粧品や食品分野においてもその
応用が進められている。

【０００３】リポソームの製法としては、種々の方法が
知られている。例えば、有機溶媒に脂質を溶かしナス形
フラスコなどのガラス容器中で有機溶媒を除去し容器内
面に脂質薄膜を形成した後、水溶液を加えてボルテック
ス処理を行うボルテックス法［K. Inoue; Biochim. Bio
phys. Acta., 339, 390 (1974)］、脂質薄膜に水溶液を
加えて超音波処理を行う超音波処理法［L. Saunders,
J. Perrin, D. B. Gammack; J. Pharm. Pharmacol., 1
4, 567 (1962) ］、脂質を溶解している有機溶媒中に水
溶液を加えエマルジョンを作成し、次いで有機溶媒を留
去する逆相蒸発法［F. Szoka, F.Olson, T. Heath, W,
Vail, E. Mayhew, D. Papahadjopoulos; Biochim. Biop
hys. Acta., 601, 559 (1980) ］、脂質と界面活性剤の
混合ミセルから透析により界面活性剤を除去する界面活
性剤除去法［L. T. Mimms, G. Zampighi, Y. Nozaki,
C. Tanford, J. A. Reynolds; Biochemistry, 20,833
(1981) ］、超音波処理法を行った後に凍結融解を行う
凍結融解法［U. Pick; Arch. Biochem. Biophys., 212,
186 (1981) ］及び超音波処理法の後、ＣａＣｌ₂ を添
加しＥＤＴＡで処理するカルシウム融合法［D.Papahadj
opoulos, W. J. Vail,K. Jacobson, G. Poste; Biochi
m. Biophys. Acta., 394, 483 (1975) ］等が知られて
おり、これらの方法により多重層リポソーム、小さな一
枚膜リポソーム及び比較的大きな一枚膜リポソームなど
が作製できる。

【０００４】又、巨大リポソームの製法としては、脂質
薄膜を長時間かけて水和する静置水和法［A. Darszon,
C. A. Vandenberg, M. Schoufeld, M. H. Ellismau, N.
C.Spitzer, M. Montal; Proc. Natl. Acad. Sci., U.
S.A., 77, 239 (1980)］、高塩濃度存在下で凍結融解を
行った後、緩衝液に対して透析する凍結融解透析法［N.
Oku, R. C. MacDonald; Biochemistry, 22, 855 (198
3) ］等が挙げられ、これらの方法により一枚膜もしく
は一枚〜数枚膜の巨大リポソームを得ることができる。

【０００５】

【発明が解決しようとしている課題】近年、膜を介した
物質移動の研究、生体膜モデルの形成、機能膜の開発な
どにおいてリポソームを人工的に形成する技術の有用性
が高まっている。特に、数μｍ超える直径の巨大リポソ
ームは、大きな保持容積が確保できる、高分子物質の保
持が可能である、光学顕微鏡での観察、マニピュレーシ
ョンが可能である等の利点を有し、極めて有用性が高
い。ところが、直径が数十ｎｍから数百ｎｍまでのリポ
ソームにおいては、上述の超音波処理法や界面活性剤除
去法など数々の調製法が提供されているのに対し、直径
が数十μｍを超える、特に数百μｍに達する巨大リポソ
ームに関しては、ごくわずかな調製法が知られているに
すぎない。

【０００６】前述の静置水和法によれば直径が数百μｍ
の巨大リポソームを調製することができるが、この方法
では調製溶液のイオン濃度が１０^-4Ｍ以下に制限されて
しまうこと、さらには、蛋白質やビタミン等の存在下で
はリポソームの形成が阻害される場合があるなどの問題
を有する。従って、蛋白質やビタミン等の種々の物質を
膜内や膜中に存在させたリポソームを形成することが困
難となる場合もあり、そのような用途に十分対応できる
ものとは言えない。

【０００７】また、前述の凍結融解透析法は調製時のｐ
Ｈにより生成するリポソームの大きさが異なり、生体内
や生化学的反応において多く利用されるｐＨ領域（中性
及びその付近）では最大５０μｍ程度のものしか調製で
きない。この凍結融解透析法においては調製時のｐＨを
２以下にすれば、直径が数百μｍの巨大リポソームも調
製可能であるが、この場合は調製溶液が強酸性であるた
め脂質の劣化やタンパク質の変性といった問題が生じ
る。

【０００８】本発明の目的は、直径が数十μｍから数百
μｍの巨大プロテオリポソームを簡便な工程かつ緩和な
条件下で調製できる方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の巨大リポソーム
の調製方法は、（ａ）アルカリ金属塩水溶液を主体と
し、脂質を含むリポソーム形成用混合液の凍結、融解を
行なう凍結融解工程と、（ｂ）該凍結融解工程により得
られた融解液を前記リポソーム形成用混合液よりも低い
塩濃度の水溶液または緩衝液からなる透析用溶媒に対し
て透析する透析工程と、（ｃ）該透析工程後の混合液を
０℃〜４０℃の範囲の一定温度条件下に保持する成熟工
程とを有することを特徴とする。

【００１０】本発明の方法は、凍結融解透析法を応用し
たものであり、具体的には凍結融解透析法で調製したリ
ポソームを、所望の直径がリポソームに得られるまでの
一定期間、定温においてそのまま保持すること、すなわ
ち熟成させることにより、直径数十μｍ〜数百μｍへと
巨大化させるものである。このように、リポソームが直
径数十μｍ〜数百μｍへと巨大化するのは、熟成工程中
にリポソームどうしが融合してより巨大なリポソームを
形成するためと推定される。

【００１１】なお、一般に、リポソームを形成している
脂質の相転移温度以下におかれたリポソーム、特に直径
が数十ｎｍ程度の小さい一枚膜リポソーム（ＳＵＶと略
す）は、その複数が融合して大きなマルチラメラリポソ
ーム（ＭＬＶと略す）に成長し易いことが知られてい
る。これは、ＳＵＶでは曲率が大きく、その歪が過剰の
膜表面エネルギーとなり、この過剰エネルギー解消のた
めにリポソームの融合が進行すると考えられている。

【００１２】ところが、このようなＳＵＶを融合させて
ＭＬＶを得る方法を利用して巨大リポソームを調製した
場合、所望の特性を維持させつつ巨大化させることが難
しいという問題がある。例えば、所定の水溶性物質を内
包するリポソームでは、ＭＬＶ化することで該水溶性物
質の保持効率が低下してしまう場合がある。また、所望
の機能を発現させるために膜蛋白質を膜中に含有させた
プロテオリポソームでは、ＭＬＶ化させることで膜蛋白
質の所望の機能が損なわれる場合がある。これに対し
て、本発明の方法によれば、例えば凍結融解透析法で調
製した巨大一枚膜リポソーム（ＧＵＶ）から成熟工程で
更に巨大化されたＧＵＶを得ることができ、その際所望
の機能を損なうことがない。この場合、ＭＬＶ化する割
合は実質的に無視できるほど小さく、ほとんどのＧＵＶ
が更に巨大化されたＧＵＶとなる。従って、本発明の方
法を用いることで、例えば所定の水溶性物質を内包する
リポソームにおいては、該水溶性物質の保持効率を低下
させることなく巨大リポソームの調製が可能であり、ま
たプロテオリポソームにおいても目的とする機能を低下
させることなく巨大プロテオリポソームの調製が可能と
なる。

【００１３】なお、リポソームを巨大化することで、リ
ポソーム１つ当りの内容積の増加に伴って１つのリポソ
ームへの物質の取り込み効率を向上させて所望の機能を
高めるという効果も期待できる。この効果は特にプロテ
オリポソームのような膜蛋白質等の機能性物質を付加し
た場合に特に有用である。例えば、高度好塩菌の紫膜中
に存在し、光によりプロトンを輸送する蛋白質として知
られるバクテリオロドプシンを含むプロテオリポソーム
では、巨大化による内容積の増加に伴ってリポソーム内
へのプロトンの取り込み効率が増大する。

【００１４】一方、リポソームの融合は、前記のＳＵＶ
の相転移温度以下における融合のほかに、セルダウイル
スやポリエチレングリコールなどの仲介物質の存在下に
おいても起こることが知られている。また、酸性脂質を
用いて調製したリポソームでは、カルシウムイオンＣａ
²⁺によって融合が引き起こされることも報告されてい
る。しかしながら、これらの融合方法では、仲介物質も
形成されるリポソームに一緒に取り込まれるので、これ
らの方法で融合させたリポソームをこれらの仲介物質の
存在が好ましくない用途に利用するとができず、その利
用範囲が制限されるという問題がある。また、酸性脂質
を用いる方法では、利用できる脂質の種類が限定されて
しまう。これに対して、本発明においては、上記の仲介
物質を利用することなくリポソームの融合が可能とな
り、上記のような制限を緩和できる。更に、蛋白質を脂
質とともに用いるプロテオリポソームの調製の場合、蛋
白質の存在自体がリポソームの融合を助長し融合速度を
高めるという効果を得ることができる。

【００１５】本発明の方法における凍結融解工程（ａ）
及び透析工程は（ｂ）は、公知の凍結融解透析法に従っ
て行なうことができる。凍結融解工程（ａ）に用いるリ
ポソーム形成用混合液は、リポソーム形成用材料として
の脂質をアルカリ金属塩水溶液に加えて得ることができ
る。リポソーム形成用材料としての脂質には、リポソー
ムを形成できる脂質であれば制限なく利用できるが、例
えば以下のような公知の両親媒性をもつリン脂質、糖脂
質及び４級アンモニウム塩からなる脂質などが利用でき
る。

【００１６】これらの膜形成能を持つ脂質分子は炭素が
８個以上の長鎖アルキル基と親水基とを有して構成さ
れ、親水基が

【００１７】

【化１】これらの脂質材料のうち、ホスファチジルコリン（レシ
チン）やホスファチジルエタノールアミン、ジホスファ
チジルグリセロールなどのグリセロリン脂質：スフィン
ゴミエリンやセラミドシリアチン等のスフィンゴリン脂
質：セレブロシド、スルファチド、セラミドオリゴヘキ
ソシド等のスフィンゴ糖脂質：および親水基として炭水
化物を含むグリコシルジアシルグリセロール等のグリセ
ロ糖脂質は好ましい脂質材料であり、中でもグリセロリ
ン脂質、スフィンゴリン脂質等のリン脂質は特に好まし
いものである。該脂質のリポソーム形成用混合液での濃
度は、特に限定されるものではないが、好ましくは３〜
１００ｍＭ、より好ましくは１０〜３０ｍＭとすること
が望ましい。

【００１８】アルカリ金属塩水溶液に用いるアルカリ金
属塩には、カリウム、ルビジウム及びナトリウムの塩が
好ましく用いられ、リチウム塩は好ましくない。アルカ
リ金属塩の濃度は、塩の種類により異なるが、リポソー
ムの形成に必要な十分なアルカリ金属イオン濃度が得ら
れるように設定され、用いるアルカリ金属塩の種類に応
じて適宜調節される。例えば、塩化カリウムを用いた場
合には、２Ｍ以上、４Ｍ以下が好ましい。また、塩化ル
ビジウムの場合は２Ｍ以上６Ｍ以下、塩化ナトリウムの
場合は２Ｍ以上４Ｍ以下が好ましい。

【００１９】なお、リポソーム形成用混合液には、所望
に応じて種々の物質をリポソームの形成を損なわない範
囲内で添加することができる。例えば、リポソームの膜
中または内腔中に含有させてその機能を利用する物質；
各種金属イオン；コレステロール、コレスタノールなど
のステロール類等の膜安定化剤；ステアリルアミン、ホ
スファチジン酸、ジセチルホスフェート等の荷電物質；
トコフェロール等の酸化防止剤等を挙げることができ
る。リポソームの脂質膜中にまたはその内腔中に含有さ
せてその機能を利用する物質としては、抗細菌性化合物
類、抗ウイルス性化合物類、抗真菌性化合物類、抗寄生
体化合物類、抗腫瘍性化合物類、ビタミン類、膜蛋白
質、酵素等の各種蛋白質、ホルモン類、放射線標識物
質、蛍光化合物類、多糖類、核酸類等を挙げることがで
きる。これらの添加物の含有量は、その使用目的に応じ
て決定される。膜安定化剤、荷電物質、酸化防止剤につ
いては、例えばリポソーム形成用材料１重量部に対し、
ステロール類を０〜２重量部、荷電物質を０〜０．５重
量部、酸化防止剤を０〜０．２重量部とするのが好まし
い。

【００２０】これらの中で、プロテオリポソームを形成
し得る蛋白質はリポソームの融合を促進する作用があ
り、その機能を利用しない場合でも、リポソーム融合促
進剤として使用することができる。このプロテオリポソ
ームを形成し得る蛋白質としては、紫膜、膜結合型ＡＴ
Ｐ分解酵素等の「膜蛋白質」と呼ばれている蛋白質や、
膜蛋白質以外でも、表面の一部に疎水性部分を有し脂質
膜と結合し得る蛋白質等が利用できる。蛋白質をリポソ
ーム融合促進剤として使用する場合の添加量は、０．５
〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭとするのがよい。
なお、膜蛋白質を利用する場合、これは純粋な形に精製
されている必要はなく、例えば脂質膜断片が付着した状
態のものなどでも利用可能である。

【００２１】一方、リポソーム形成用混合液のｐＨは、
リポソームの形成に悪影響を及ぼさない範囲内でリポソ
ームの組成及びその用途などに応じて選択されるが、例
えば、好ましくは３以上、より好ましくは４以上とされ
る。また、機能性物質を添加する場合には機能性物質の
変成や破壊を生じないｐＨが選択される。蛋白質を添加
する場合にも、ｐＨは、例えば、好ましくは３以上、よ
り好ましくは４以上とされる。なお、本発明の方法によ
れば、中性及びその付近においても巨大リポソームの良
好な形成が可能であり、中性付近で行なわれる生体内や
生体外での各種生化学的反応に用いる種々の物質のリポ
ソームを介した利用が可能となる。

【００２２】凍結融解工程（ａ）における凍結工程は、
例えば液体窒素やアセトン−ドライアイスを用いて行う
ことができる。また、融解工程は、例えば５〜４０℃の
範囲、通常は室温に静置しながら、あるいは振盪しなが
ら行うことができる。なお、凍結融解工程は、凍結工程
と融解工程をこの順に１回行なって、あるいは２回以上
繰り返して実施することができるが、通常は３回以上繰
り返すのが好ましく、６回程度まで行なえば十分であ
る。更に、凍結融解のあとに、融解液をボルテックスミ
キサー等を用いた攪拌処理を行っても良い。

【００２３】凍結融解工程（ａ）において凍結物の融解
によって得られた融解液は、つぎに透析工程（ｂ）にお
いて、透析溶媒に対して透析処理される。この透析によ
って例えば直径数十μｍのＧＵＶを得ることができる。
透析溶媒としては、リポソーム形成用混合液よりも低い
塩濃度の水溶液や緩衝液が用いられる。この透析用溶媒
の塩濃度は、例えば８０ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ
以下、より好ましくは１０ｍＭ以下とされる。この透析
用溶媒のｐＨは、リポソーム形成用混合液と同様に、リ
ポソームの形成に悪影響を及ぼさない範囲内でリポソー
ムの組成及びその用途などに応じて選択されるが、例え
ば、好ましくは３以上、より好ましくは４以上とされ
る。なお、透析はリポソーム形成用混合液の塩濃度が透
析用溶媒の塩濃度と同程度になった時に終了する。通常
は、リポソーム形成用混合液に対し２０００〜６０００
倍の透析用溶媒量を用いて２日間行う。

【００２４】最後に、成熟工程（ｃ）において、透析終
了後の液を０〜４０℃、好ましくは５〜２０℃の範囲内
の一定温度に保持し、該液に含まれているリポソームを
融合させて巨大リポソームを得る。なお、この温度範囲
とすることによってリポソームが分散している液媒体の
主成分である水を凝固させることなく、また脂質膜の形
態を破壊することなく良好なリポソームの融合を行なわ
せることができる。また、この成熟工程は、静置状態で
も、振盪状態でも行なうことができる。この成熟工程は
所望の径がリポソームに得られたところで終了し、所望
の用途に用いる。

【００２５】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。実施例１２０ｍＭのアゾレクチン（大豆フォスファチジルコリ
ン、type IV-S: Sigma社）のクロロホルム溶液０．５ｍ
ｌをナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータを
用いて溶媒を留去した後、デシケータに入れ真空ポンプ
を用いて溶媒を完全に除いて脂質薄膜を作製した。次い
で、３Ｍの塩化カリウム水溶液（ｐＨ５．６）１ミリリ
ットルを加えボルテックスミキサーにて２分間処理して
脂質薄膜を分散させた後、水浴型超音波発振装置（ソニ
ファイアーＢ−１５型、ホップホーン使用：Branson 社
製）で３０分処理してリポソーム分散液を得た。このリ
ポソーム分散液を、液体窒素で凍結、２０℃にて融解、
ボルテックスミキサー処理３０秒という操作を３回繰り
返した。この後、前記処理液を透析チューブに移し、１
０ｍＭ塩化カリウム水溶液４リットルに対して２日間透
析を行ない、ＧＵＶを調製した。透析処理後の液体（透
析チューブ内液）からサンプリングしたＧＵＶの位相差
光学顕微鏡観察による最大粒径は３３μｍ、平均粒径は
１３．９μｍ、標準偏差５．７４μｍ（サンプル数２５
０）であった。

【００２６】一方、透析チューブ内液を容器に移し、５
℃に２０日間保持してＧＵＶを熟成させた。成熟したＧ
ＵＶの位相差光学顕微鏡観察による最大粒径は４８μ
ｍ、平均粒径は１５．１μｍ、標準偏差６．８７μｍ
（サンプル数２５０）となった。これらの結果の比較か
ら明らかなように、ＧＵＶの粒径は時間経過とともに増
大し、直径数十μｍの巨大リポソームを多量に調製する
ことができた。

【００２７】実施例２実施例１と同様にして凍結融解透析法により、位相差光
学顕微鏡観察による最大粒径が３３μｍ、平均粒径が１
３．９μｍ、標準偏差５．７４μｍ（サンプル数２５
０）のＧＵＶの分散液（透析チューブ内液）を調製し
た。次に、この分散液を１５℃に３０日間保持しＧＵＶ
を熟成させた。成熟したＧＵＶの位相差光学顕微鏡観察
による最大粒径は１１８μｍ、平均粒径は３１．２μ
ｍ、標準偏差９．２７μｍ（サンプル数２５０）であっ
た。

【００２８】実施例３２０ｍＭのアゾレクチン（大豆フォスファチジルコリ
ン、type IV-S: Sigma社）のクロロホルム溶液０．５ｍ
ｌをナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータを
用いて溶媒を留去した後、デシケータに入れ真空ポンプ
を用いて溶媒を完全に除いて脂質薄膜を作製した。次い
で、３Ｍの塩化カリウム水溶液（ｐＨ５．６）１ミリリ
ットルを加えボルテックスミキサーにて２分間処理して
脂質薄膜を分散させた後、水浴型超音波発振装置（ソニ
ファイアーＢ−１５型、ホップホーン使用：Branson 社
製）で３０分処理してリポソーム分散液を得た。

【００２９】次に、P. Oesterhelt および W. Stoecken
ius の方法（Method. Enzymol., 31, (1974), 667-678
）によって、高度好塩菌 Halobacterium halobium RJ
株から抽出した紫膜を、K. Huang の方法（Proc. Na
tl. Acad.Sci., USA, 77, (1980) , 323 ）にしたがっ
て界面活性剤Triton X-100（和光純薬工業社製）で処理
し、紫膜を脱脂した状態の膜蛋白質バクテリロドプシン
（ｂＲと略す）を得た。このｂＲの１２０μｇを先に得
たリポソーム分散液に加えて、これに液体窒素で凍結、
２０℃にて融解、ボルテックスミキサー処理３０秒とい
う操作を３回繰り返した。この後、前記処理液を透析チ
ューブに移し、１０ｍＭ塩化カリウム水溶液４リットル
に対して２日間透析を行ない、バクテリオロドプシン巨
大プロテオリポソーム（ｂＲ−ＧＵＶと略す）を調製し
た。透析後の透析チューブ内からサンプリングしたｂＲ
−ＧＵＶの位相差光学顕微鏡観察による最大粒径は３０
μｍ、平均粒径は１４．４μｍ、標準偏差５．４９μｍ
（サンプル数２５０）であり、その粒径分布は図１に示
すとおりであった。

【００３０】透析チューブ内液を容器に移し、これを５
℃に１５日間保持し、ｂＲ−ＧＵＶを熟成させた。成熟
したｂＲ−ＧＵＶの位相差光学顕微鏡観察による最大粒
径は７０μｍ、平均粒径は２４．０μｍ、標準偏差１
２．９６μｍ（サンプル数２５０）となり、その粒径分
布は図１に示すとおりであった。以上の結果の比較から
明らかなように、ｂＲ−ＧＵＶの粒径は時間経過ととも
に増大し、上記の条件で直径が２倍以上となっ巨大なプ
ロテオリポソームを多量に調製することができた。

【００３１】次に、凍結融解透析法により調製した直後
のｂＲ−ＧＵＶ（平均粒径１４．４μｍ）と、５℃にて
１５日間熟成させた後のｂＲ−ＧＵＶ（平均粒径２４．
０μｍ）とを、光照射によるプロトンポンプ能について
比較した。ｂＲは光が照射されることによって、膜を横
切ってプロトンを輸送する働きを持つことが知られてい
る。そこで、上述の透析処理直後と成熟させた後の２種
のＲ−ＧＵＶ分散液をそれぞれ同量とり、１０ｍＭ塩化
カリウム水溶液で１００倍希釈した後、これらにバンド
パスフィルター（多層膜フィルター、朝日分光社製、中
心波長５５５ｎｍ、半値幅３０ｎｍ）を通したハロゲン
光源（TECHNO LIGHT, KLS-2150: kenko社製）を照射
し、ｂＲ−ＧＵＶ分散液の外液ｐＨを変化測定によるプ
ロトンポンプ能を測定した。その測定結果を図２、図３
に示す。図示した結果の比較から明らかなように、ｂＲ
−ＧＵＶを熟成して巨大化したことにより、ｂＲ−ＧＵ
Ｖのプロトンポンプ能が増大した。

【００３２】実施例４実施例３と同様にして凍結融解透析法により、位相差光
学顕微鏡観察による最大粒径が３０μｍ、平均粒径が１
４．４μｍ、標準偏差５．４９μｍ（サンプル数２５
０）のｂＲ−ＧＵＶの分散液（透析チューブ内液）を調
製した。次に、このｂＲ−ＧＵＶ分散液を１０℃に２０
日間保持しｂＲ−ＧＵＶを熟成させたところ、位相差光
学顕微鏡観察による最大粒径が１８５μｍ、平均粒径が
５３．０μｍ、標準偏差１４．２９μｍ（サンプル数２
５０）のｂＲ−ＧＵＶが得られた。実施例５実施例３と同様にして脂質薄膜を形成した後、３Ｍの塩
化ルビジウム（ｐＨ５．７）を加え、実施例１と同様に
超音波処理してリポソーム分散液を得た。次ぎに、The
Journal of BIOLOGICALCH EMISTRY Vol. 250, No.19, p
7910-7916 、および p7917-7923 (1975)に準じて好熱性
細菌であるＰＳ３の培養ならびにＡＴＰ分解酵素の抽
出、精製を行ない、ＡＴＰ分解酵素ＴＦ₀Ｆ₁ を調製し
た。前記リポソーム分散液に、ＴＦ₀ Ｆ₁ １５０μｇを
加えて液体窒素で凍結、２０℃にて融解、ボルテックス
ミキサー処理３０秒という操作を３回繰り返した。この
後、前記処理液を透析チューブに移し、５０ｍＭ塩化ル
ビジウム水溶液４リットルに対して２日間透析を行な
い、ＴＦ₀ Ｆ₁ 巨大プロテオリポソーム（ＴＦ₀ Ｆ₁ −
ＧＵＶと略す）を調製した。透析処理後の透析チューブ
内液からサンプリングしたＴＦ₀ Ｆ₁ −ＧＵＶの位相差
光学顕微鏡観察による最大粒径は１７μｍ、平均粒径は
８．４μｍ、標準偏差３．４８μｍ（サンプル数２５
０）であった。上記の透析チューブ内液を容器に移し、
更に１５℃に１５日間保持し、ＴＦ₀ Ｆ₁ −ＧＵＶを熟
成させたところ、ＴＦ₀ Ｆ₁ −ＧＵＶの位相差光学顕微
鏡観察による最大粒径は４７μｍ、平均粒径は１３．２
μｍ、標準偏差５．４３μｍ（サンプル数２５０）とな
った。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、直径数十μｍから数百μ
ｍの巨大リポソームを、簡便な工程、かつ緩和な条件下
で多量に調製することができる。また、本発明によれ
ば、所望の機能を損なうことなく巨大リポソームの調製
が可能であり、更に、中性あるいはその付近のｐＨでも
良好な巨大リポソームの調製が可能となり、生体内反応
や生化学反応のための各種物質の巨大リポソームを介し
た利用や研究を効率良く、また効果的に行なうことがで
き、リポソームの用途の拡大が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で透析処理直後に得たバクテリオロト
゛プシン−プロテオリポソーム（平均粒径１４．４μ
ｍ）と、成熟させたバクテリオロト゛プシン−プロテオ
リポソーム（平均粒径２４．０μｍ）の粒径分布を比較
した図である。

【図２】実施例３で透析処理直後に得たバクテリオロト
゛プシン−プロテオリポソーム（平均粒径１４．４μ
ｍ）の分散液の光照射を行なった場合の経時的なｐＨの
変化を示す図である。

【図３】実施例３で成熟させたバクテリオロト゛プシン
−プロテオリポソーム（平均粒径２４．０μｍ）の分散
液の光照射を行なった場合の経時的なｐＨの変化を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者川口正浩東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者山本伸子東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリ金属塩水溶液を主体とし、脂質
を含むリポソーム形成用混合液の凍結、融解を行なう凍
結融解工程と、該凍結融解工程により得られた融解液を
前記リポソーム形成用混合液よりも低い塩濃度の水溶液
または緩衝液からなる透析用溶媒に対して透析する透析
工程と、該透析工程後の混合液を０℃〜４０℃の範囲の
一定温度条件下に保持する成熟工程とを有することを特
徴とする巨大リポソームの調製方法。
【請求項２】前記該透析工程後の混合液の保持温度
が、５℃から２０℃の範囲である請求項１に記載の巨大
リポソームの調製方法。
【請求項３】前記透析用溶媒の塩濃度が８０ｍＭ以下
である請求項１に記載の巨大リポソームの調製方法。
【請求項４】前記透析用溶媒の塩濃度が５０ｍＭ以下
である請求項１に記載の巨大リポソームの調製方法。
【請求項５】前記透析用溶媒の塩濃度が１０ｍＭ以下
である請求項１に記載の巨大リポソームの調製方法。
【請求項６】前記リポソーム形成用混合液のｐＨが３
以上である請求項１に記載の巨大リポソームの調製方
法。
【請求項７】前記リポソーム形成用混合液のｐＨが４
以上である請求項１に記載の巨大リポソームの調製方
法。
【請求項８】リポソーム形成用混合液が更にプロテオ
リポソームを形成し得る蛋白質を含む請求項１〜７のい
ずれかに記載のの巨大リポソームの調製方法。