ES2374243A1 - Vectores no virales para terapia génica. - Google Patents
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Abstract
Vectores no virales para terapia génica.La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden nanoestructuras de carbono que comprenden en su superficie dendrones y/o dendrimeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales.
Description
Vectores no virales para terapia génica.
El uso de vectores no virales en terapia génica
es especialmente relevante, ya que la FDA ha suspendido, sine
die, los ensayos clínicos usando virus (adenovirus,
adenoasociados, etc) debido a que generan reacciones inmunes que han
causado la muerte de algunos pacientes que participaban en dichos
ensayos. Los vectores víricos poseen varios inconvenientes, tales
como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una
respuesta inmune que disminuye su efectividad o falta de
especificidad celular. Junto a ello, estos sistemas son rápidamente
eliminados de la circulación, limitando el proceso de transfección a
órganos de primer paso (pulmones, hígado y bazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de
recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro
es remoto. No obstante, los problemas que plantean los virus como
vectores en terapia génica son serios y los ensayos clínicos de
terapia génica en, por ejemplo, Estados Unidos, han sido
interrumpidos recientemente por la FDA (Food and Drug
Administration) debido a la muerte de varios pacientes por fallo
multiorgánico. Este tipo de graves problemas han llevado a la
búsqueda y desarrollo de alternativas al uso de los virus como
vectores de material génico.
Los vectores no virales poseen una serie de
ventajas con respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la
preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor
flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a
transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no
provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser
administrados repetidamente.
La introducción de nanotubos acoplados a
dendrímeros polares como vehículos para la transfección génica se
basa en tres factores distintos: (i) el distinto mecanismo que estos
aductos poseen para atravesar la membrana celular si lo comparamos
con macromoléculas orgánicas como pueden ser los dendrímeros
(Podesta, J. E.; Al-Jamal, K. T.; Herrero, M. A;
Tian, B.; Ali-Boucetta, H.; Hegde, V.; Bianco, A.;
Prato, M.; Kostarelos, K., Antitumor Activity and Prolonged Survival
by Carbon-Nanotube-Mediated
Therapeutic siRNA Silencing in a Human Lung Xenograft Model
Small 2009, 5, 1176-1185); (ii)
los dendrímeros de PAMAM (Poli(amido amina)),
especialmente los de generaciones altas, han demostrado ser tóxicos
debido fundamentalmente a procesos de hemolisis y (iii) los
nanotubos son inertes químicamente lo que les confiere una alta
estabilidad.
Dentro de los vectores no virales, los
dendrímeros representan una de estas alternativas, ya que presentan
un tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja
polidispersidad y una alta densidad funcional en la superficie con
un pequeño volumen molecular.
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La presente invención se refiere a nuevos
vectores no virales para su uso en terapia génica que solventan
todos los problemas que se plantean en las otras vías de actuación
en terapia génica. Estas ventajas son las siguientes:
- a)
- Facilidad en la preparación y reproducibilidad del método sintético (incluso a escala multigramo).
- b)
- Posibilidad de modificación de la superficie del nanotubo pudiendo optimizar sus propiedades de acuerdo a la metodología sintética.
- c)
- Distinto mecanismo que estos aductos poseen para atravesar la membrana celular si lo comparamos con macromoléculas orgánicas como pueden ser los dendrímeros.
- d)
- Son generalmente seguros in vivo y poco tóxicos.
- e)
- No provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto la presente invención se refiere al
uso de un vector no viral, donde dicho vector no viral
comprende:
- i)
- una nanoestructura de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros;
- ii)
- donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, se entiende por
nanoestructura de carbono a: estructuras de carbono que poseen al
menos en una de sus dimensiones medidas en el orden del nanómetro
(10^{-9} m) y que exhiben algún tipo de propiedad única
electromagnética, óptica o estructural que es directamente una
consecuencia de su tamaño nanométrico.
Según una realización preferida, las
nanoestructuras de carbono son nanotubos de carbono.
En la presente invención se entiende por
nanotubo de carbono a nanoestructuras que están constituidas por
redes hexagonales de carbono curvadas y cerradas, formando tubos de
carbono nanométricos. Son sistemas ligeros, huecos y porosos que
tienen alta resistencia mecánica, y por tanto, interesantes para el
reforzamiento estructural de materiales y formación de composites de
bajo peso, alta resistencia a la tracción y enorme elasticidad.
Según otra realización preferida, los nanotubos
de carbono son de tipo mono (solo un tubo), bi (dos tubos metidos
uno dentro del otro) o multicapas (varios tubos metidos uno dentro
de otro).
Según otra realización preferida, los nanotubos
de carbono tienen un diámetro que dependerá del número de capas:
- a)
- Los nanotubos monocapa están comprendidos entre 0,6 y 3 nm.
- b)
- Los nanotubos de doble capa son dos láminas las que se pliegan en torno a un eje con espacios de 0,3-0,4 nm entre las capas por lo que su diámetro puede estar entre 1 y 4 nm.
- c)
- Los nanotubos multicapas constan de numerosas capas y en cuanto a su diámetro no existe un máximo, actualmente es común llegar hasta unos 80 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida, los nanotubos
de carbono tienen una longitud inferior a 10^{5} nm.
Según otra realización preferida, los nanotubos
de carbono están cortados en las puntas y/o en su capa exterior.
Se entiende por nanotubos cortados a aquellos
cuya longitud es menor de la inicial ya que se tratan mediante el
uso de medio ácido fuerte y calefacción originando grupos
carboxílicos y un corte indiscriminado de los nanotubos. El corte da
lugar a que los nanotubos se funcionalicen preferentemente en las
puntas (es decir, los extremos) de los nanotubos pero también en la
capa exterior de los nanotubos. (Liu J.; Rinzler A. G.; Dai H.;
Hafner J. H.; Bradley R. K.; Boul P. J.; Lu A; Iverson T.; Shelimov
K.;. Huffman C. B; Rodríguez-Macias F.; Shon
Y-S; Lee T. R.; Colbert D. T.; Smalley R. E.
Science 1998, 280, 1253-1256; Ziegler
K J; Gu Z; Peng H; Flor E L; Hauge R H; Smalley R E J. Am. Chem.
Soc, 2005, 127, 1541).
Según otra realización preferida, las
nanoestructuras de carbono y los dendrímeros están enlazados
químicamente mediante enlaces covalentes.
En la presente invención se entiende por
dendrímero a una macromolécula tridimensional de construcción
arborescente. Los dendrímeros forman parte de los polímeros, pero su
diferencia radica en que la distribución de las moléculas que
constituyen los polímeros lineales es probabilística, en tanto que
en el caso de los dendrímeros, se tiene una estructura química
precisa, donde los enlaces químicos entre los átomos pueden ser
descritos con exactitud. Las macromoléculas dendriméricas presentan
una forma de crecimiento generacional, G0, G1, G2.
En la presente invención se entiende por dendrón
una macromolécula con estructura dendrítica y cuyos posteriores
acoplamientos a otros dendrones o núcleos constituirán el dendrímero
en su totalidad.
Según otra realización preferida, el enlace
covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster
presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono,
preferiblemente mediante un enlace de tipo amida.
Según otra realización preferida, el enlace
amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los
dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie de la
nanoestructura de carbono.
Según otra realización preferida los dendrímeros
comprenden desde 0 a 8 generaciones, preferiblemente de 2 a 6
generaciones. Cuando el dendrímero es de generación 0 (G0) se le
denomina dendrón.
En la presente invención se entiende por
generación a las etapas del crecimiento de un dendrímero.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tienen un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000
g/mol, preferiblemente entre 1.000 y 10.000 g/mol.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tienen un diámetro comprendido entre 5 a 140 \ring{A},
preferiblemente tienen un diámetro comprendido entre 10 y 70
\ring{A}.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros comprenden entre 2 y 1.024 grupos de superficie,
preferiblemente entre 4 y 260 grupos de superficie.
En la presente invención se entiende por grupo
de superficie a: grupos amino, grupos ácido carboxílico, grupos
éster, grupos hidroxilo, grupos alquílicos, grupos amino
cuaternizados u otras estructuras como pudieran ser aminoácidos o
polietilenglicol.
Según otra realización preferida, los grupos de
superficie de los dendrímeros son grupos amino, preferiblemente
aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas
terciarias y/o primarias estás protonadas a un pH inferior a 6.
Según otra realización preferida, la relación
carga/masa de los dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0,1 a 10
mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes
como después de la unión del dendrímeros a la nanoestructura de
carbono.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto
antes como después de la unión del dendrímeros a la nanoestructura
de carbono.
Según otra realización preferida, el núcleo de
los dendrímeros se selecciona entre
\vskip1.000000\baselineskip
donde n es un número entero desde 1
a
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida, los
dendrímeros se seleccionan entre:
y/o los dendrímeros tipo
PAMAM de cuarta o sexta
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención se entiende por
dendrímero tipo PAMAM a aquellos dendrímeros que tienen un
alto grado de uniformidad molecular, estrecha distribución del peso
molecular, tamaño y características específicas de la forma, y una
superficie terminal altamente funcionalizada. El proceso de
fabricación es mediante una serie de pasos repetitivos a partir de
un núcleo iniciador central. Cada paso representa un crecimiento
posterior de la nueva "generación" de polímero con un diámetro
molecular más grande, el doble del número grupos de superficie, y
aproximadamente el doble del peso molecular de la generación
precedente. Esto es común a cualquier dendrímeros, no sólo a los de
PAMAM. Los dendrímeros de PAMAM son dendrímeros de
polidoamidoamina comerciales (por Dendritech, Inc.) y que se
sintetizan mediante una serie de pasos repetitivos siendo estos
aminolisis y reacciones de adición de Michael, 1,4.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen
partículas de oro. Las nanopartículas de oro no están unidas al
dendrímero sino que se encuentran encapsuladas dentro del mismo
mediante un efecto estérico, es decir, el dendrímero "enjaula"
las nanopartículas de oro. La presencia de la nanopartículas de oro
da lugar a que el dendrímero adopte una conformación más rígida.
Además la presencia de oro puede favorecer la aplicación de estos
compuestos en resonancia de imagen o en tratamientos de
hipertermia.
Según otra realización preferida los dendrímeros
tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino
cuaternarios.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipos PAMAM tienen unidos a través de sus grupos
amino cuaternarios un grupo:
-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}
.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación se
seleccionan entre:
donde R es
- - -CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Según otra realización preferida, la molécula
biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una
cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
En la presente invención se entiende por
oligonucleótido a una secuencia lineal de nucleótidos unidos por
enlaces fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50
nucleótidos.
En la presente invención se entiende por cadena
de aminoácidos a la unión de un número determinado de aminoácidos
para la formación de una proteína con o sin actividad
enzimática.
En la presente invención se entiende por
molécula farmacéuticamente activa a cualquier fármaco en forma de
sal farmacéuticamente aceptable para la prevención y/o tratamiento
de cualquiera de las enfermedades a las que va dirigido el vector no
viral descrito en la presente invención.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos
y/o de aminoácidos y/o molécula farmacéuticamente activa mediante
interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes,
preferiblemente amida y/o éster.
Según otra realización preferida la interacción
electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las
posiciones terminales finales las cadenas de oligonucleótidos y/o de
aminoácidos y/o de la molécula farmacéuticamente activa y la
superficie de los dendrones y/o dendrímeros.
En la presente invención se entiende por
interacción electrostática a la atracción o repulsión de cargas
eléctricas, en concreto de los grupos amino de los dendrímeros y de
los grupos carboxilo de las cadenas de oligonucleótidos y/o de
aminoácidos y/o de las moléculas farmacéuticamente activas.
Según otra realización preferida, los
dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro
ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de
los mismos.
En la presente invención se entiende por
antagomir a una nueva clase de oligonucleótidos modificados
químicamente que se utilizan para silenciar micro ARN endógeno.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de los vectores no virales tal cual han sido descritos
anteriormente para la elaboración de un medicamento en terapia
génica.
En la presente invención se entiende por terapia
génica a la introducción de cualquier tipo de material genético
(DNA, RNA, RNAi, siRNA) en el interior de una célula con el objetivo
de reponer la función de un gen defectuoso o de eliminar una
proteína de forma selectiva para poder interferir con una vía de
señalización activada durante la génesis de una enfermedad.
Una realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para enfermedades del sistema nervioso,
enfermedades neurodegenerativas y los accidentes
cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o prevención de una
infección.
Según una realización preferida la infección es
bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es
causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano
(SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Otra realización preferida se refiere al uso de
los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación
de un medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la
diabetes y la artritis reumatoide.
Otra realización preferida se refiere al uso de
de los vectores no virales descritos anteriormente para la
preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprenda
dicho vector no viral y un compuesto de mareaje radiológico pueda
ser utilizado para la observación y diagnóstico mediante las
técnicas radiológicas habitualmente utilizadas en clínica. Ejemplos
no limitantes de dichos compuestos de mareaje son gadolinio o yodo,
aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la
materia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector no viral como se ha descrito anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende el vector no viral como
se definió anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
Según una realización preferida, la composición
farmacéutica además comprende al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de la composición farmacéutica para la elaboración de un
medicamento.
Una realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para enfermedades del sistema nervioso, enfermedades
neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es
bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es
causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano
(SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento como anticancerígeno.
\newpage
Otra realización preferida se refiere al uso de
la composición descrita anteriormente para la preparación de un
medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes
y la artritis reumatoide.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit de transfección de ARN de silenciamiento que comprende el
vector no viral tal cual ha sido definido anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del kit de transfección de ARN de silenciamiento en cultivos
primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células
primarias.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para la síntesis de los vectores no virales tal
cual se definieron anteriormente, que comprende las siguientes
etapas:
- a.
- mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
- b.
- añadir la mezcla anterior a una disolución de nanoestructuras previamente dispersadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Según una realización preferida las
nanoestructuras están previamente cortadas.
Según otra realización preferida las
nanoestructuras se dispersan en al menos una disolución de DMF
(N,N-Dimetilformamida).
Según otra realización preferida, la disolución
del dendrón o dendrímero es añadida a una disolución acuosa de
HAuCl_{4} y posteriormente se reduce mediante NaBH_{4}.
Según otra realización preferida, las
nanoestructuras de carbono han sido previamente funcionalizadas
mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante
reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación
directa de las nanoestructuras para obtener en su superficie grupos
carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
El término "sales, solvatos, prodroga
farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster,
solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que,
cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar
(directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el
presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales
farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de
la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de
sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales,
prodrogas y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos
conocidos en la técnica.
Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables
de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan
mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto
original que contiene un resto básico ó acido. Generalmente, tales
sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de
ácido o base libre de los compuestos con una cantidad
estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un
disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se
prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol,
isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos
incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo,
clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y
sales de adición de acido orgánico tales como, por ejemplo, acetato,
maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato,
mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas
tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio,
magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como,
por ejemplo, etilendiamina, etanolamina,
N,N-dialquilenetanolamina, glucamina y sales de
aminoácidos básicos.
Los derivados o prodrogas particularmente
favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los
compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos
a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado
por vía oral se absorba mas fácilmente por la sangre), o que
potencia la liberación del compuesto original en un compartimento
biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con
relación a la especie original.
El termino "prodroga" o "profármaco"
se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se
convierten en vivo en los compuestos de la invención. Tales
derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e
incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la
molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los
compuestos presentes ésteres, ésteres de aminoácido, ésteres de
fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, y
amidas.
Los compuestos de la presente invención pueden
estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y
se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente
invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro
de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente
aceptables. En una realización particular, el solvato es un
hidrato.
\newpage
Los compuestos descritos en la presente
invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o
solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen
pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para
proporcionar una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte
de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser
proporcionados en forma de una composición separada para su
administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica
que comprende los compuestos de la presente invención o un
profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable
de los mismos.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción
terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas,
calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá
determinada, entre otras causas, por las características propias de
los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la
severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de
administración.
En otra realización particular, dicha
composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o
suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser
administrada por cualquier vía de administración apropiada.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC17. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC17 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC17 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 0,5 \mug/ml, (3) 1 \mug/ml, (4) 5 \mug/ml, (5) 10
\mug/ml, (6) 20 \mug/ml y (7) 40 \mug/ml. El análisis
densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel
se muestran en (B).
Fig. 2.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC23. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC23 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC23 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 5 \mug/ml, (3) 10 \mug/ml, (4) 30 \mug/ml, (5) 40
\mug/ml y (6) 50 \mug/ml. El análisis densitométrico de los
resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 3.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC24. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC24 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC24 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 5 \mug/ml, (3) 10 \mug/ml, (4) 20 \mug/ml, (5) 40
\mug/ml y (6) 60 \mug/ml. El análisis densitométrico de los
resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 4.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC28. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC28 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC28 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 1 \mug/ml, (3) 2 \mug/ml, (4) 5 \mug/ml, (5) 10
\mug/ml, (6) 15 \mug/ml, (7) 20 \mug/ml y (8) 25 \mug/ml. El
análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo
en gel se muestran en (B).
Fig. 5.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC29. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC29 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC29 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 1 \mug/ml, (3) 2 \mug/ml, (4) 5 \mug/ml, (5) 10
\mug/ml, (6) 15 \mug/ml, (7) 20 \mug/ml y (8) 25 \mug/ml. El
análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo
en gel se muestran en (B).
Fig. 6.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC32. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC32 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC32 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 2 \mug/ml, (3) 10 \mug/ml, (4) 20 \mug/ml, (5) 30
\mug/ml y (6) 50 \mug/ml. El análisis densitométrico de los
resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Fig. 7.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC33. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC33 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC33 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 2 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 40 \mug/ml y (5) 50
\mug/ml. El análisis densitométrico de los resultados del
experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 8.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a MAHC34. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de MAHC34 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de MAHC34 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 2 \mug/ml, (3) 20 \mug/ml, (4) 40 \mug/ml y (5) 50
\mug/ml. El análisis densitométrico de los resultados del
experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 9.- Análisis de retardo electroforético
de siRNA por el acoplamiento a CNH35. Los números en (A)
corresponden a diferentes volúmenes de CNH35 1 mg/ml incubadas con
25 \mul de siRNA 1,6 \muM y llevadas a un volumen final de 50
\mul con H_{2}O libre de RNAsas. Para 100 nM de siRNA
corresponde una concentración de CNH31 de: (1) 0 \mug/ml (siRNA
sólo), (2) 0,5 \mug/ml, (3) 1 \mug/ml, (4) 2 \mug/ml, (5) 3
\mug/ml y (6) 4 \mug/ml. El análisis densitométrico de los
resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
Fig. 10.- Estudio de la toxicidad de MAHC17
en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes
concentraciones de MAHC17 (1 a 30 \mug/ml) durante 48 horas. La
viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH
liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (%
control) \pm SEM (desviación estándar de la media), n=12. * p
<0,05, comparados con el control.
Fig. 11.- Estudio de la toxicidad de MAHC28
en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes
concentraciones de MAHC28 (1 a 30 \mug/ml) durante 48 horas. La
viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH
liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (%
control) \pm SEM, n=12. * p <0,05, comparados con el
control.
Fig. 12.- Estudio de la toxicidad de CNH35 en
neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes
concentraciones de CNH35 (1 a 30 \mug/ml) durante 48 horas. La
viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH
(lactato deshidrogenasa) liberada al medio de cultivo. Los datos se
expresan como media (% control) \pm SEM, n=12. * p <0,05,
comparados con el control.
Fig. 13.- Cuantificación de la transfección
del complejo MAHC28-SiRNA fluorescente en
neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo
(porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este
mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo.
Los complejos se formaron con distintas concentraciones de MAHC28 y
100 nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los
datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un mínimo de
3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
Fig. 14.- Cuantificación de la transfección
del complejo MAHC29-SiRNA fluorescente en
neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo
(porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este
mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo.
Los complejos se formaron con distintas concentraciones de MAHC29 y
100 nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los
datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un mínimo de
3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
Fig. 15.- Cuantificación de la transfección
del complejo CNH35-SiRNA fluorescente en neuronas
corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo
(porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este
mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo.
Los complejos se formaron con distintas concentraciones de CNH35 y
100 nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los
datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un mínimo de
3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
Fig. 16.- Cuantificación de la transfección
del complejo CNH35-SiRNA fluorescente en neuronas
granulares de cerebelo de rata (A) y de la toxicidad producida
por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de
propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por
citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas
concentraciones de CNH35 y 100 nM de siRNA fluorescente. Los
tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (%
control) \pm SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p
<0,05, comparados con el control.
Figura 17.- Estudio del efecto del complejo
CNH35-SiRNA o Control contra p42MAPK sobre la
expresión génica de p42MAPK en neuronas corticales mediante
real-time PCR. La cuantificación del RNAm de
p42MAPK se realizó en células transfectadas durante 48 horas con
CNH35. Los datos se expresan como media (% control) \pm SEM, de un
mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos. Tienen
carácter informativo y en ningún caso limitante de las metodologías
empleadas, las cuales pueden ser alteradas con el fin de alcanzar
unos resultados similares.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En esta memoria descriptiva los símbolos y
convenciones usadas en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son
consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la
bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of
Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los
materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se
usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar
las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la
memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); Kg (kilogramos);
ml (mililitros); \mul (microlitros); mmol (milimoles); P.f. (punto
de fusión); Hz (hertzio); MHz (megahertzio); \delta
(desplazamiento químico); ppm (partes por millón); s (singlete); d
(doblete); t (triplete); q (cuartete); c (quintuplete); m
(multiplete); J (constante de acoplamiento); RMN (resonancia
magnética nuclear); EM (espectrometría de masas); ES
(electrospray); m/z (Relación masa/carga); Anal. (Análisis
Elemental); Rto (Rendimiento); TEA (trietilamina); CH_{2}Cl_{2}
(diclorometano); CDCl_{3} (cloroformo deuterado); CD_{3}OD
(metanol deuterado) DMSO (dimetilsulfóxido); i.p. (administración
parenteral). Todas las temperaturas se expresan en ºC (grados
Celsius).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 3
(MAHC34)
20 mg de nanotubos cortados 1 (Liu J.;
Rinzler A. G. et al. Science 1998, 280, 1253-1256;
Ziegler K J; et al., J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 1541) se
dispersan en 10 ml de DMF (dimetil formamida) y seguidamente se
adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)
y 20 mg de HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y se agita
durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del
compuesto 2 (precursor de FJGC 57, 42 mg, 0,1 mmol) en 5 ml de
metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas.
Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción
se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE
(Politetrafluoroetileno), 0,2 \mum). El sólido negro que se recoge
tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina
sonicación y filtración con metanol, agua y diclorometano hasta que
el filtrado sea transparente, finalmente se secan y se obtienen 20
mg del compuesto 3.
Compuesto 5
(MAHC32)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10
ml de DMF y seguidamente se adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)
y 20 mg de HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y se agita
durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del
compuesto 4 (70 mg, 0,1 mmol) en 5 ml de metanol. La mezcla de
reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla
a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un
sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro
que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los
que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y
diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se
secan y se obtienen 18 mg del compuesto 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 7
(MAHC33)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10
ml de DMF y seguidamente se adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)
y 20 mg de HOBt (1-hidroxibenzotriazol) y se agita
durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del
compuesto 6 (140 mg, 0,1 mmol) en 5 ml de metanol. La mezcla de
reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla
a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un
sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro
que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los
que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y
diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se
secan y se obtienen 19 mg del compuesto 7.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Compuesto 9
(MAHC35)
15 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10
ml de DMF y seguidamente se adiciona 15 mg de EDC y 15 mg de HOBt y
se agita durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del
compuesto 8 (IR 8, 65 mg, 0,04 mmol) en 5 ml de metanol. La mezcla
de reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas. Tras enfriar la
mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra
empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El
sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando
ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol,
agua y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente,
finalmente se secan y se obtienen 14 mg del compuesto 9.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Compuesto 11
(MAHC23)
20 mg de nanotubos cortados 1 se
dispersan en 5 ml de DMF y se adiciona gota a gota una disolución
acuosa 1,6 \muM del dendrímero (10) (2 x 25 ml, pH 7,5). La mezcla
de reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas. Tras enfriar la
mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra
empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El
sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando
ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol,
acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y
finalmente se secan y se obtienen 20 mg del compuesto 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 12
(MAHC24)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 5
ml de DMF y seguidamente se adiciona 20 mg de EDC y 20 mg de HOBt y
se agita durante 30 minutos. Posteriormente se añade gota a gota una
disolución acuosa 1,6 \muM del dendrímero (10) (2 x 25 ml, pH
7,5). La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas.
Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción
se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2
\mum). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava
empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con
metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea
transparente y finalmente se secan y se obtienen 19 mg del compuesto
12.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del dendrímero 10
(G6-NH_{2}(Au_{200})). 50,0 ml (2x25
ml) de una disolución 1,6 \muM
G6-NH_{2}(Au_{200}) se preparó de acuerdo
al procedimiento descrito en la literatura (Kim, Y. G.; et al.,
Chem. Mater., 2004, 16, 167-172). Brevemente,
0,8 ml de una disolución acuosa recién preparada de HAuCl_{4} 10,0
mM se añade a una disolución acuosa 1,6 \muM (concentración final)
de PAMAM G6-NH_{2} (24,16 ml). El complejo
dendrímero-ión metálico se agita durante 1 min. Tras
este tiempo, se reduce rápidamente mediante una disolución acuosa
recién preparada de NaBH_{4} 1M (0,04 ml) disuelto en una
disolución de hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La
reducción ocurre inmediatamente y va acompañada de un cambio de
color de amarillo a rosado. Se agita durante 1 h antes de ser
utilizado.
Estudios de alta resolución de microscopía
electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro
de
2,0 \pm 0,3 nm.
2,0 \pm 0,3 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 13
(MAHC17)
10 mg de nanotubo cortado 12 se dispersan en 10
ml de MeOH (metanol) y se adiciona el epóxido a la mezcla (1,4
\mumol, 0,2 mg). La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante
24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de
reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE,
0,2 \mum). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se
lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración
con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea
transparente y finalmente se secan y se obtienen 9 mg del compuesto
13 (MAHC17).
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 15
(MAHC28)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 5
ml de DMF y se adiciona gota a gota una disolución acuosa del
dendrímero comercial en metanol, PAMAM de cuarta generación (14)
(0,09 mmol). La mezcla de reacción se calienta a 40ºC durante 24
horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de
reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE,
0,2 \mum). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se
lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración
con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea
transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg del compuesto
15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto 16
(MAHC29)
20 mg de nanotubos de carbono 1 se dispersan en
5 ml de DMF y seguidamente se adiciona 20 mg de EDC y 20 mg de HOBt
y se agita durante 30 minutos. Posteriormente se adiciona gota a
gota una disolución acuosa del dendrímero comercial en metanol,
PAMAM de cuarta generación (14) (0,09 mmol). La mezcla de
reacción se calienta a 40ºC durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla
a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un
sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 \mum). El sólido negro
que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los
que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y
diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se
secan y se obtienen 17 mg del compuesto 16.
\vskip1.000000\baselineskip
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Se ha investigado la capacidad de un nanotubo de
carbono unido a diferentes dendrímeros con aminas nitrogenadas en su
periferia de interaccionar y formar complejos con un RNA de
interferencia corto (siRNA), y de vehiculizarlo al interior celular
sin producir ningún tipo de citotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de neuronas granulares del cerebelo
se obtuvieron conforme a protocolos descritos previamente (Hansen
RK J Neurochem. 2007; 103(4):1396-407 Peng
LA Brain Res Dev Brain Res. 1991;
63(1-2):1-12), con
pequeñas modificaciones. Brevemente, crías de 7 días de edad de la
cepa Spragle-Dawley fueron decapitadas
rápidamente y se extrajeron los cerebros cuidadosamente. Separamos
el cerebelo asépticamente, quitamos las meninges y se cortó el
cerebelo en trozos de unos 0,4 mm. A continuación, se expuso el
tejido a tripsina y DNAsa en un medio de cultivo libre de calcio y
magnesio y se sembraron en placas de cultivo pretratadas con
poli-lisina. Las células se cultivaron en medio BME
(medio basal "eagle"), suplementado con 24,5 mM de potasio, 2
mM de glutamina, 10% de FBS (suero fetal bovino) y 50 \mug/ml de
gentamicina. A las 24 horas, Ara-C (arabinosido de
citosina) se añadió al medio para obtener una concentración final de
10 \muM para reducir el crecimiento de astrocitos. Las células se
utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que
necesitan para terminar de diferenciarse.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo primario de neuronas corticales se
realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (V.
Bruno et al., Eur. J. Neurosci., 2001
13:1469-1478). Los lóbulos corticales
frontolaterales se disecaron en fetos de 17 días de ratas hembra de
la cepa Spragle-Dawley y se disociaron
mecánicamente en HBSS ("Hank's Buffered Salt Solution"). Los
lóbulos corticales se trituraron pipeteando unas diez veces con una
pipeta Pasteur. Después de centrifugar 5 minutos a 800 \timesg,
las células se resuspendieron en medio de cultivo Neurobasal
suplementado con suero B27, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células se
sembraron en placas de cultivo pretratadas con
poli-lisina y se utilizaron no antes de 7 días tras
el cultivo, que es el tiempo que necesitan para terminar de
diferenciarse y que aparezcan receptores de glutamato.
\vskip1.000000\baselineskip
Los complejos nanotubo siRNA se formaron
mezclando cantidades iguales de volumen de la solución que contenía
el nanotubo elegido y de la que contenía el siRNA (Chonco L, et
al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21;
5(12):1886-93. Posadas I, et al., Pharm Res.
2009 May; 26(5):1181-91), e incubando la
mezcla en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ambas
moléculas se disolvieron en agua DEPC (dietil pirocarbonato) (libre
de RNAsas).
\vskip1.000000\baselineskip
El retardo en gel de agarosa se utilizó para
averiguar la concentración adecuada para obtener la mayor
efectividad de unión posible entre ambas moléculas (Haberland A
Mol Biol Rep. 2009; 36:1083-93; Zou K et al Am J Med
Genet B Neuropsychiatr Genet. 2008;
147B(6):769-77). Se testó la mezcla de
distintas concentraciones de nanotubo y de 250 ng de siRNA. La
mezcla se corrió durante 15 minutos a 60 V en un gel de agarosa al
1,2% con 0,017% de bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron y
las bandas se cuantificaron con un sistema de análisis de imagen
apropiado (Quantity One). Los resultados se pueden observar
en las figuras 1 a 9 para MAHC 17, MAHC23, MAHC24, MAHC28, MAHC29,
MAHC32, MAHC33 y MAHC34 y CNH35 respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Pruebas para evaluar la toxicidad del nanotubo
se realizaron en distintos tipos celulares, determinando la
actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) (Posadas I,
et al., Pharm Res. 2009 May; 26(5):1181). Para ello, las
células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se expusieron a
soluciones con diferentes concentraciones de nanotubo para realizar
curvas de toxicidad concentración-dependiente
durante 24, 48 o 74 horas. Los efectos tóxicos se evaluaron midiendo
la ruptura de la membrana celular y la consiguiente liberación de la
LDH al sobrenadante a través del kit CytoTox96® (Promega). Las
células se despegaron mecánicamente, se lavaron con PBS
(Phosphate buffered saline) y fueron centrifugadas a 10.000
rpm durante 10 minutos. La absorbancia del lisado y del sobrenadante
celular se midió utilizando un espectofotómetro de microplacas a una
longitud de onda de 490 nm.
La toxicidad de los tratamientos con los
complejos nanotubo-siRNA, utilizando distintas
concentraciones de nanotubo (1-8 \muM) en
combinación con 100 nM de siRNA, se estudió por citometría de flujo.
Para ello, después de los tratamientos, las células se incubaron con
yoduro de propidio 0,5 mg/ml al menos durante 1 hora a 37ºC en
oscuridad. Seguidamente, las células se tripsinizaron y se
analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur,
Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A
partir de la evaluación de 10.000 células por condición
experimental, se calculó el porcentaje de células con la membrana
citoplasmática dañada (yoduro de propidio positivas) (Weber J
Control Release. 2008 Nov 24; 132(1):55-64.
Perumal Biomaterials. 2008 Aug-Sep;
29(24-25):3469-76). Los
resultados de la citotoxicidad para neuronas corticales se pueden
observar en la figura 10 para MAHC17 y en la figura 11 para
MAHC28.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 24-72 horas con las
células en presencia de los complejos
nanotubo-siRNA, utilizando 100 nM de siRNA
fluorescente para realizarlos, se recogieron los medios
condicionados y las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS.
Las células totales -vivas y muertas- presentes en la suspensión
resultante al juntar el tripsinizado celular y el medio condicionado
se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur,
Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A
partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental
se calculó el porcentaje de células transfectadas con siRNA
fluorescente (Weber J Control Release. 2008 Nov 24;
132(1):55-64. Perumal Biomaterials. 2008
Aug-Sep;
29(24-25):3469-76).
La translocación del complejo
nanotubo-siRNA también se estudió por microscopía
confocal. Para esto, las células se sembraron en cubreobjetos y se
trataron del mismo modo que las muestras anteriores. Las células
tratadas con siRNA fluorescente, sólo o formando complejos
nanotubo-siRNA, se visualizaron y fotografiaron en
un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE200) utilizando la longitud
de onda adecuada para la excitación del fluoróforo con el que el
siRNA esta marcado (Gras R Pharm Res. 2009 Mar;
26(3):577-86). Los resultados sirvieron
para determinar el porcentaje de células positivas para la
transfección intracelular de siRNA, y se muestran en las figuras 13
a 15 para los complejos MAHC28-SiRNA,
MAHC29-SiRNA y CNH35-SiRNA en
neuronas corticales y en la figura 16 para
CNH35-siRNA en neuronas granulares de cerebelo.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN total celular se aisló mediante un método
estándar con tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo
(TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Sciences,
Indianapolis, IN). El ARN se transformó en cDNA y éste se utilizó
para realizar la real-time PCR. Utilizamos la
real-time PCR para estudiar el silenciamiento de
distintos genes por medio de 100 nM de siRNA vehiculizado con
distintas concentraciones de IR8. El gen beta-actina
se utilizó como gen de referencia para todos los experimentos de
real-time PCR. La reacción se realizó utilizando
procedimientos estándar para la "StepOnePlus
Real-Time PCR System" (Applied Biosystems).
En cada experimento, se calculó la media del ciclo umbral [cycle
threshold (C_{T})] de los triplicados de cada uno de los genes
estudiados y del gen utilizado como referencia, pudiendo así
comparar la expresión génica tras los diferentes tratamientos. Los
resultados se muestran en la figura 17.
Claims (49)
1. Uso de un vector no viral, donde el vector no
viral comprende:
- i)
- una nanoestructura de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros;
- ii)
- donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa;
para la elaboración de un medicamento para
terapia génica.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso según la reivindicación anterior,
donde la nanoestructura de carbono es un nanotubo de carbono.
3. El uso según la reivindicación anterior,
donde el nanotubo de carbono es de tipo mono, bi o multicapas.
4. El uso según la reivindicación anterior,
donde el nanotubo de carbono tiene un diámetro de entre 0,6 y 3 nm
cuando es monocapa, de entre 1 y 4 nm en los bicapa y de hasta 80 nm
si son multicapa.
5. El uso según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, donde el nanotubo de carbono tiene una
longitud inferior a 105 nm.
6. El uso según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde el nanotubo de carbono está
cortado en las puntas y/o en su capa exterior.
7. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de carbono y
los dendrones y/o dendrímeros están enlazados químicamente mediante
enlaces covalentes.
8. El uso según la reivindicación anterior,
donde el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino,
carboxilo y/o éster presentes en la superficie de la nanoestructura
de carbono.
9. El uso según la cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de carbono y
los dendrones y/o dendrímeros están enlazados mediante un enlace de
tipo amida.
10. El uso según la reivindicación anterior,
donde el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino
presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo
presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono.
11. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros
comprenden desde 0 a 8 generaciones.
12. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden de 2 a 6
generaciones.
13. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene
un peso molecular comprendido entre 300 y 100000 g/mol,
preferiblemente entre 1000 y 10000 g/mol.
14. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene
un diámetro comprendido entre 5 y 140 \ring{A}.
15. El uso según la reivindicación anterior,
donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre
10 y 70 \ring{A}.
16. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero
comprende entre 2 y 1024 grupos funcionales de superficie.
17. El uso según la reivindicación anterior,
donde el dendrón y/o dendrímero comprende de 4 a 260 grupos de
superficie.
18. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17, donde los grupos de superficie son grupos
amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más
preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están
protonadas a un pH inferior a 6.
19. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la relación carga/masa de los
dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0,1 a 10
mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
20. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros son
solubles en agua a pH inferior a 6 tanto antes como después de la
unión del dendrímero a la nanoestructura de carbono.
21. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, donde los dendrones y/o dendrímeros en sus
formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de
la unión del dendrímero a la nanoestructura de carbono.
22. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de los dendrones o
dendrímeros se selecciona entre:
donde n es un número entero desde 1
a
4.
\vskip1.000000\baselineskip
23. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, donde los dendrones y/o dendrímeros se
seleccionan entre:
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de
cuarta o sexta
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
24. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación
contienen partículas de oro.
25. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 23 ó 24, donde los dendrímeros tipo PAMAM
comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
26. El uso según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros tipos PAMAM
tienen unido a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo:
-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
27. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, donde el dendrímero PAMAM de cuarta o
sexta generación se selecciona entre:
donde R es
- - -CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-N^{+}(CH_{3})_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
28. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde la molécula biológicamente activa
es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o
una molécula farmacéuticamente activa.
29. El uso según la reivindicación anterior,
donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una
cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o a la cadena
farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o
enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o éster.
30. El uso según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde la interacción electrostática y/o
la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones
terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de
aminoácidos y/o de la sustancia farmacéuticamente activa y la
superficie de los dendrones y/o dendrímeros.
31. El uso según cualquiera de las tres
reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros están unidos a
ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos,
proteínas o cualquier combinación de los mismos.
32. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso,
enfermedades neurodegenerativas y los accidentes
cerebrovasculares.
33. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento o prevención de una infección.
34. El uso según la reivindicación anterior
donde la infección es bacteriana o viral.
35. El uso según la reivindicación anterior
donde la infección es causada por el virus del síndrome de
inmunodeficiencia humano (SIDA).
36. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento del cáncer.
37. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de una enfermedad crónica, preferiblemente la
diabetes y la artritis reumatoide.
38. El uso de los vectores descritos en las
reivindicaciones 1 a 31, para la preparación de un medio de
contraste o sonda de imagen que comprenda el vector no viral y una
molécula de mareaje radiológico.
39. Vector no viral como se define en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 31.
40. Composición farmacéutica que comprende el
vector no viral según la reivindicación 39 y al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
41. Composición farmacéutica según la
reivindicación anterior, donde además comprende al menos otro
principio activo.
42. Uso de la composición según cualquiera de
las dos reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un
medicamento.
43. Kit de transfección de ARN de silenciamiento
que comprende el vector no viral según la reivindicación 39.
44. Uso del kit de transfección de ARN de
silenciamiento según la reivindicación anterior en cultivos
primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células
primarias.
45. Procedimiento para la síntesis de los
vectores no virales según la reivindicación 39, que comprende las
siguientes etapas:
- a.
- mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
- b.
- añadir la mezcla anterior a una disolución de nanoestructuras previamente dispersadas.
\vskip1.000000\baselineskip
46. El procedimiento según la reivindicación
anterior, donde las nanoestructuras están previamente cortadas.
47. El procedimiento según cualquiera de las dos
reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras se dispersan
en al menos una disolución de DMF.
48. El procedimiento según cualquiera de las
tres reivindicaciones anteriores, donde a la disolución del dendrón
y/o dendrímero es añadida una disolución acuosa de HAuCl_{4} y
posteriormente se reduce mediante NaBH_{4}.
49. El procedimiento según cualquiera de las
cuatro reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de
carbono han sido previamente funcionalizadas mediante una
cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción
radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de
las nanoestructuras para obtener en su superficie grupos carboxilo y
anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
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