CN101228212A - 新的碳硅烷树状聚体、它们的制备和它们的用途 - Google Patents

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保拉·奥尔特加洛佩斯
马安赫莱斯·穆诺兹
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马耶苏·塞拉米亚洛贝拉
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路易斯·肖科西门尼斯
玛丽亚伊莎贝尔·克莱门特马约拉尔
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Abstract

新的碳硅烷树状聚体、它们的制备和它们的用途。本发明的树状聚体在它们的分支末端具有仲、叔和季氨基。它们的可能的用途包括载体，其用于在血液中运送带阴离子电荷的分子，诸如核酸，在它们之中有ODN和RNAi，及其它具有与它们相互作用能力的阴离子药物，防止它们与血浆蛋白质相互作用和/或增加它们在靶细胞中的渗透速率。在结合是持久的情况下，本发明的树状聚体可用于将阴离子分子固定到表面。它们的用途也包括它们作为有效成分施用以预防或治疗由微生物所引起的疾病，它们干扰所述微生物的结构和/或生活周期。

Description

新的碳硅烷树状聚体、它们的制备和它们的用途
发明领域
本发明涉及称为树状聚体的三维分子，具体而言涉及末端部分含有伯、仲、叔或季氨基的碳硅烷(carbosilane)类型的那些，涉及它们的制备方法并且涉及它们的用途。在可以使用它们的领域之中，它们作为带有负电荷的具有药理学活性的核酸及其它分子的载体的用途是突出的，因为它可以增加所述药物的半衰期和它们的生物利用度并且减少为实现所需的生物效应所必需的剂量。预防或治疗由微生物产生的疾病是本发明的树状聚体的另一种应用，所述微生物的结构和/或生活周期被它们干扰。
背景
近年来树状聚体已经得到重大的关注，原因在于它们在应用中的可能用途随着纳米规模上的催化、化学传感器、单分子胶束、酶功能的模仿、分子胶囊化、分子识别、诊断剂以及作为携带基因和药物的载体而多样化。包括全部这些应用的优秀的评论发表在参考书目中。[1，31-38]
其中树状聚体研究最多的领域之一是基因治疗(以治疗目的在细胞中引入基因材料)。直到现在，最广泛使用的携带核酸的载体是病毒类。然而，已经将病毒载体的用途联系到一些问题的出现，诸如不利的免疫作用，涉及人基因组中癌基因失调的淋巴组织增生作用[2]，等。为了试图解决这些问题，已经开发了其它类型的非病毒载体，诸如阳离子脂质体、聚合物，以及还有，如已经提到，树状聚体。这些阳离子体系的每一种与核酸形成静电络合物，所述静电络合物分别被称作脂合物(lipoplexes)、多合物(polyplexes)或树状合物(dendriplexes)。
脂质体作为转染剂的用途最初描述在1987年。[3]对于基因分布使用最多的方法是阳离子脂质中的胶囊化，到一些衍生物诸如CytofectinTM或LypofectinTM是商售的程度。然而，这些衍生物也已经显示诸如肺的炎症反应的副作用和诸如在血清存在下缺乏转染的问题。[4]
关于常规的可降解聚合物，它们作为载体的用途具有它们的热力学不稳定性的主要缺点，这使所述活性物质具有非常短的体内半衰期。[5]
非病毒载体的部分上的树状聚体的最大优点在于均匀结构和以多种方式修改骨架及其表面的可能性，这可以精确表征所述络合物(核酸/载体)并系统研究转染过程。描述树状分子作为转染剂的用途的首次公布出现在1993年，描述了称为PAMAM[6](聚酰氨基胺)的树状聚体，并且从那以后已经进行了大量研究。[7，39，40]这些树状聚体作为载体的用途是基于下列事实，在生理pH，一些端基是质子化的，为PAMAM树状聚体提供净正电荷，即使一些氨基也保持未质子化的。用这些树状聚体特别是用第六和第七代的树状聚体也已经实现了好的转染结果，然而，当使用由热处理活化的PAMAM树状聚体时，该方法的功效可以增加两三个数量级，SuperfectTM或PolyfectTM通常就是这样。
另一个类别的潜在转染剂是含有磷原子的树状聚体[8]，由Majoral等合成直到第十二代。在该情况下，已经将所述树状聚体的表面用质子化的或甲基化的叔胺官能化，并且已经作为3T3细胞的荧光素酶基因的转染剂测试。所述功效随着增加树状聚体代而增加，直到在第三代和第五代之间实现恒定值。而且，本发明人应当强调，这些树状聚体在血清存在下具有更好的转染功效。
最终，其它大分子已经是这样的，诸如聚(丙烯亚胺)(PPI)[9]或聚(赖氨酸)树状聚体[10，41]作为转运DNA或寡脱氧核苷酸(ODN)的体系。例如，来自低代PPI的树状聚体已经显示某种以低毒性体外转染的能力，虽然还不可能使用更高代，原因在于它们的毒性增加。
对于它们的部分，在不同领域的医疗应用中研究了寡核苷酸(ODN)。因而，例如，反义ODNs是DNA或类似物的短合成序列(15-30碱基长度)，所述DNA或类似物对于靶序列(RNA序列或互补于RNA可以从其转录的DNA序列)是互补的(或反义的)；设计成能干扰生物学作用，诸如转录、翻译或切割和剪接现象[11]。通过由RNase的活性降解mRNA或通过干扰核糖体阅读，将这些分子设计成作为靶mRNA的互补序列相互作用，防止翻译成蛋白质。这被称作“反义治疗”。自从1978年，反义ODNs已经用于多种领域(尤其是抗肿瘤治疗和传染病)，直到现在当一段时期的怀疑以后，反义ODNs已经恢复了它们作为分子生物学中有力工具的作用，特别是来自美国FDA对福米韦生(Formivirsen)的批准[12]，所述福米韦生是一种在由HIV感染范围内的CMV的视觉感染中指示的反义ODN。另一个反义ODN，GEM231，假定为具有针对不同的瘤形成[13]的潜在应用的分子。利用正电子发射断层显像(Positron Emission Tomography)，也对该方法研究了它在肿瘤的同位素标记中的可能用途[14]。而且，存在一种类型的反义ODN，将其假定为可以在细胞DNA水平起作用：它们是形成ODNs的三螺旋，它们中的一些为它们在HIV领域之内的应用所设计[15]。
另一个完全不同的领域是富有非甲基化的CpG序列的ODN作为免疫调节药的应用。这些序列引导免疫反应至Th1分布，其特征在于干扰素、肿瘤坏死因子、白介素-2、及其它因子的分泌增加，其增强免疫系统除去病原体诸如病毒和细菌的能力。这些ODN与淋巴细胞表面的受体相互作用，所述受体诸如Toll样受体种类的那些。正在研究它们以提高免疫缺陷患者中以及过敏性疾病范围中的免疫反应，其特征在于Th2平衡，为了传送该分布至Th1的目的[16]。
用ODN治疗的主要问题之一是实现获得治疗效果的足够水平。必需施用大量的ODN以实现所述生物效应，因为它们对于结合到血浆蛋白质诸如清蛋白具有大的亲和性[17]。还认为结合到血浆蛋白质及其它细胞表面蛋白对体内的ODN的一些毒性作用负责(补体、溶血作用、血小板减少症(thrombocytopaenia)等的级联激活)[18]。因此相信，防止所述结合到蛋白质的载体的使用可以在更大水平的活性ODN的生产中转化，而且延长其半衰期并减少它的毒性。
与蛋白质相互作用以及它们结合到所述蛋白质的问题还存在于许多其它用作药物的物质中，因为蛋白质通常(并且特别是血浆蛋白质：清蛋白、糖蛋白、脂蛋白)显示潜在能与存在于介质中的物质包括施用的药物相互作用的官能团。该结合是所述药物分布的决定因素，只要所述药物的结合部分(因为它没有被传递的能力)不形成脉管组织平衡的部分(“储器”)，不是代谢的，不是分泌的并且没有效果(除非它由所述结合决定)。
血浆蛋白结合(PPB)是到目前为止药物分布的最重要的和决定性的因素，因为结合到组织蛋白一般是被特别减少的。其中，这是由于下列事实，蛋白质的血浆浓度远大于组织的隙间浓度，而且，其蛋白质具有极小的迁移率和较小的结合物质的能力，其后者的性质在清蛋白情况下是特别显著的，所述清蛋白是正常状态血浆中主要的并且是酸性药物(虽然一些还是碱性的)主要结合到的蛋白质，而酸性糖蛋白结合那些碱性药物。
Figure A20068002687100231
根据药物结合的观点，因为清蛋白结构是相当复杂的，所以可以限定两个主要的结合点或位置：
Figure A20068002687100232
因此，结合到血浆蛋白质的问题不仅影响ODNs，而且影响几乎所有普遍使用的药物。许多这些问题还可以通过利用载体而避免。看起来明显的是，为此目的开发的载体必须具有一系列特征，诸如：
-无毒的
-非免疫原性的(除非用于疫苗接种中)
-生物相容的
-具有适于容许化学固定的官能团。
-有限的身体积累
-保持药物/ODN的活性直到达到作用位点
而且，似乎明显的是，开发的载体必须随时间释放输送的ODN或药物，以便这可以进行该作用。在该方面中，可以控制释放ODN或测定药物的载体的开发将是非常合意的，以便逐步实现生物体中活性物质的保持水平和所述效果的产生。对于全部这些原因，树状聚体的使用看起来是符合所需要求的可能性，因为它们可以作为活性物质的载体，所述载体将保护它们免受血浆酶类的降解以及免受与它们可以结合到的蛋白质的相互作用，增加它们的血液水平并且容许更高和/或更加延长的活性。特别是，像许多所关心的药物一样，ODNs是阴离子的分子(具有负电荷)，为此原因，作为其载体的树状聚体与促进它们的相互作用并且特别是在生理pH下具有阳离子属性的那些的基团的使用是非常适合的选择，以确保络合物在它的转运期间的稳定性。因此，本发明开发新的树状聚体，具体而言是碳硅烷类型的，并且提供它们的用途，其中，作为在血液和/或其它体液中传送ODNs及其它所关心的阴离子分子的载体的用途。这涉及新的领域，因为，即使关于1，2-亚乙基聚(氧化物)上构建的碳硅烷树状聚体的体外生物相容性已经发表了报告，但是迄今为止没有发表涉及具有碳硅烷结构、可溶于水的树状聚体作为载体应用的研究。[21]而且，迄今为止仅发表了三个阳离子碳硅烷树状聚体的合成研究[22-24]，没有一个符合由本发明提供的哪些。
在所述树状聚体可以作为载体所用的药物之中，有兴趣的基团是由为肿瘤细胞设计的细胞毒药物构成的[73，74]。当寻找这目标时，所述树状聚体可以用肿瘤细胞中过表达的叶酸定向在肿瘤细胞，为此原因，这些树状聚体相对于正常细胞将优选被所述细胞摄取。最近，在它们的表面用叶酸修饰的PAMAM树状聚体已经用作癌症中的神经元捕获治疗中的boto同位素的载体[75]。而且，与顺铂结合的PAMAM树状聚体作为高分子铂载体，一种抗肿瘤药物，其以受控的形式从树状聚体-铂络合物释放，引起其在实体瘤中更大的积累，具有比游离的顺铂更低的毒性[76]。控制释放的另一个备选方案是在树状聚体和药物之间由生理pH下的可生物降解的键建立共价键，这已经用表面上具有伯胺并且用1-溴乙酰基-5-氟尿嘧啶部分修饰的树状聚体所证明，以形成不稳定的酰胺键，所述酰胺键在生理pH下以受控的方式体外水解，释放5-氟尿嘧啶，一种有功效的抗肿瘤试剂。
其它所关心的其转运树状聚体可以使用的物质是在辐照以后变成毒性的那些，原因在于，原位形成少量的单线态氧，其具有有害的生理效应[69]。关于传送光敏药物的树状聚体，例如，在周边具有5-氨基乙酰丙酸，已经发表了论文，假定这些树状聚体试剂在治疗角质形成细胞肿瘤中是有希望的[70]。作为治疗实体瘤的候选物，基于携带原卟啉作为光敏剂的聚芳醚树状聚体，已经评价了树状聚体[71]。
可以假定树状聚体是有兴趣的载体的另外组的药物是由诸如非甾类抗炎药物构成的，其具有副作用诸如胃肠改变或中毒性肾损害，这是可以避免的，因为它们是由透皮途径而不是经过典型的口服或肠胃外途径供给的。表明结合到施用的药物的树状聚体存在引起增强渗透性的皮肤改变的数据[72]，成为在药物的透皮给药中良好的候选物。
树状聚体的表面官能团的多价意味着，它们可以转运的分子的巨大差异性，甚至包括具有不同功能的树状聚体：这些是正在研究中的tecto树状聚体，原因在于它们在可能的生物医学应用中巨大的潜力。
树状聚体用于药物转运的可能性不仅基于利用与外部多价的树状聚体表面的可能的相互作用，而且基于树状聚体的结构可用于容纳要转运的分子的事实。树状聚体结构空腔的用途的实例是所谓“树状盒”[68]，其中在所述表面上用苯丙氨酸基团修饰PPI树状聚体，其保护外部框架使它更致密。在树状聚体生长过程期间，将不同尺寸的分子密封在它的内部。所述树状聚体可以根据其尺寸携带不同数目的分子。当用甲酸处理所述树状聚体时，所述外部框架是开放的，可以释放在其中容纳的分子。
对于所述树状聚体可以假定为适合的载体的另一组分子是低分子量的分子(诸如肽)，针对其需要在受试者中产生免疫反应，但是由于它们的小尺寸，其几乎不是免疫原性的或者在注射在需要治疗的个体中以后引起弱的反应。可以通过增加它们的分子量，或者通过偶联至高分子量载体(传统上偶联至蛋白质)的聚合而解决该问题。具有完全限定的结构和许多能在它们的周围结合抗原的官能团的树状聚体提供良好的备选方案，用于制造具有完全限定的免疫原并且是高度可重现的疫苗。在这方面，已经开发了MAP(多抗原肽)树状聚体[57，58]，其是楔-形的结构，由赖氨酸残基的依次代而形成。这些树状聚体具有许多可以连接至低分子量抗原的伯胺，目的在于增加它们的免疫原性，避免使用载体蛋白质的需要。含有T和B细胞刺激的恶性疟原虫肽的MAP结构已经用于针对该寄生虫产生免疫反应[59]。而且，已经表明MAP结构是经过抗原呈递细胞用和细胞内结构(例如例如，病毒)的抗原衍生物一样的方法处理的，产生有效力的免疫反应，包括细胞毒素T细胞的产生[60]。本发明的树状聚体，其在它们的分支的末端具有含有氨基的部分，还可以用于疫苗接种，或者因为利用存在于它们的分支末端部分中的胺将它们连接至低分子量抗原，或者因为含有至少一个氨基的部分自身构成低分子量抗原诸如具有肽属性的那些。
MAP结构也已经用于转运疫苗范围内的非肽抗原诸如糖类、半抗原等。特别是，糖类是一类生物学识别中的重要分子。由甘露糖-异硫氰酸酯制备的糖树状聚体，结合到PAMAM树状聚体或赖氨酸树状聚体的末端胺的唾液酸或乳糖，已经用作疫苗的抗原[64，65]。在具有T-缔合的βGal1-3αGalNac二糖抗原的糖树状聚体中，也已经测试了它对于凝集素的特异于半乳糖的结合能力(将蛋白质结合至糖类)[66]，目的是利用它们检测表达T抗原受体的肿瘤并且向其传送药物。而且，可以使用糖树状聚体以增加对于要结合到它们已经结合的糖类的凝集素的亲和性，其可以是所关心的，用于利用那些糖基化的(glycosilated)树状聚体作为微生物的抗粘附素、毒素拮抗药，或者作为抗炎的、抗病毒的和抗癌的药物，因为碳的凝集素-糖类相互作用已经描述在免疫系统的许多情况(在引起细胞激活的情况中)、病毒和细菌感染中，涉及癌症和细胞生长，等。简言之，糖基化的树状聚体可以模仿天然的复合糖并且有效地与糖类的天然受体相互作用，于是产生相互作用的特征效果。
除了可以利用它的性质而将它们用作载体，目前正在给予许多关注的涉及核酸的另一个领域是制造含有有序组的DNA或RNA序列的微芯片。当制造这些微芯片时，树状聚体正在呈现为涂布玻璃表面的一个备选方案并且利用它们与核酸相互作用的能力而将所述分子固定至所述微芯片的表面[63]。核苷酸序列和本发明的树状聚体之间的键的耐久性使它们适合于利用它们的固定核酸的能力，以便用作制造这些DNA或RNA微芯片的基底。
最终，这些也需要寻找备选方法以对抗不同的病原体，干扰它们的生活周期，一个树状聚体显示自身是有兴趣的备选方案的领域。一些在前描述的树状聚体已经显示它们自身能够抑制由不同的病毒所引起的感染，干扰病毒进入细胞以及随后的病毒复制步骤。例如，那是单纯性疱疹的实例，其感染在体外被修饰的聚赖氨酸树状聚体的作用所抑制[50，51]。在细胞摄取水平和随后的步骤中也已经实现了HIV的复制，在该情况下通过利用共价修饰的PAMAM树状聚体，这表明它们能够干涉所述病毒的反转录酶和整合酶[19，52]。利用这些性质，已经开发了阴道凝胶剂用于用树状聚体-基的剂型预防性传播疾病，这就是长生胶(VivaGelTM)(星法马(Starpharma))的情况，其活性成分是用萘二磺酸酯部分官能化的聚赖氨酸树状聚体，由于结合病毒表面的糖蛋白gp120的能力，所述部分似乎在预防HIV中是有效的。即使在抗病毒树状聚体的设计中，优选在它们的表面具有基团的那些，所述基团模仿存在于细胞表面上的那些，因此，并且能够与结合到所述病毒的细胞竞争，也已经设计了具有表面酰胺基的树状聚体，其作为呼吸道合胞病毒抑制剂起作用，认为是由于具有病毒融合蛋白质的树状聚体的周边基团之间的氢桥的形成，据此理由，将可以预期用其它基团官能化的树状聚体，所述树状聚体能够与参与细胞表面相互作用的病毒蛋白质形成氢桥，也能够干扰不同的病毒，抑制由它们所引起的感染。
在其它情况下，树状聚体已经用作抗菌剂或用于破坏一些真菌的细胞膜。当它们为此目的设计时，优选在它们的表面上具有阳离子基团的树状聚体，诸如胺或四烷基铵基团，其促进树状聚体粘附至细菌的膜，引起细菌溶胞。这是它们的表面上具有叔烷基铵基团的聚(丙烯亚胺)(PPI)树状聚体的情况，其已经表明针对革兰氏阳性和革兰氏阴性的细菌都有广泛的细菌活性[53，54]。这些树状聚体具有比其它的超支化聚合物更大的杀菌剂能力。也用含有氨基的部分官能化的本发明的树状聚体表示还用于破坏细菌或真菌的细胞膜的选择。
也已经显示了，树状聚体具有使它们作为蛋白质变性剂的性质。某种类型的树状聚体通过减少水的介电常数和粘度和通过由树状聚体表面上的水分子的重构使它的规则结构无序化而起作用。这导致破坏性的疏水性(hydrophonic)相互作用，这对于大多数的三级蛋白质结构是不稳定的，引起它的变性：这是所谓的具有变性剂诸如脲或氯化胍的“细胞裂解的”作用。意欲应用该蛋白质变性能力的非常有趣的领域是溶解朊病毒蛋白质诸如PrPSc的用途[20]。朊病毒蛋白质能够采用病原体结构-形成，其导致称为海绵状脑病(克-雅综合征，疯牛病”，羊痒病等)的致命神经病。这些蛋白质形成聚集体，所述聚集体位于所感染的个体的脑中并且仅可溶于含有清洁剂作为细胞裂解剂(一般是6M的氯化胍)的溶剂。然而，这些聚集体可以用阳离子树状聚体溶解，所述阳离子树状聚体诸如PPI和PAMAM的那些：在表面上具有更大数量的胺的更大的代的那些是最有效的。因此，本发明的新的树状聚体，也用含有氨基的部分官能化，提供要使用的新的化合物，以用于溶解朊病毒聚集体并且用于治疗其它疾病，所述其它疾病的发展中也发生病原性蛋白质聚集体的形成，以及，例如，出现在阿尔茨海默病中的淀粉状蛋白质聚集体[55，56]。
简言之，树状聚体是在生物学应用中使用的具有良好性质的合成聚合物：它们可以预见地在溶液中响应，它们可以大量修饰成传送具有生物活性的多种配体，它们可以跨越生物障碍并且以很少的结构缺陷制造。因此，它们在预防和治疗策略中的应用正在研究中，包括它们的传送不同药物的用途，寡核苷酸的或多核苷酸的分子的转染，疫苗的设计，作为抗菌的、抗真菌的、抗病毒的药物的给药，乃至减轻不同病原学的病症，在所述病原学的发展中涉及蛋白质聚集体诸如由朊病毒来源的那些的形成或者阿尔茨海默病特有的淀粉状蛋白质的沉积。本发明的树状聚体涉及这些生物医学领域的有趣的备选方案。
发明概述
本发明描述在其分支末端具有末端部分的新的支化碳硅烷树状聚体，所述分支末端含有符合下式任何一项的伯、仲、叔或季氨基：
Figure A20068002687100291
如果它们是第一代；
Figure A20068002687100292
如果它们是第二代；
Figure A20068002687100293
如果它们是第三代；
或符合更后代情况下的相应类似式，其中对应于每个第i代的式将通过用下列类型的新嵌段取代对应于上代的式中的Xp而产生：
Figure A20068002687100294
将与硅原子结合的基团从被(R1-1)3-p所表示变化为被(R1-1)3-z所表示，所述硅原子为该取代嵌段结合的相同硅原子，
式中：
Alq1，Alq2，Alq3，........Alqi表示根据每代中的分支长度相互独立选择的2至4个碳的亚烷基部分；
R1，R2，R3，..........Ri-1，Ri表示在甲基和苯基中相互独立选择的部分；
X表示含有至少一个伯、仲、叔或季氨基的部分；
p是在1和3之间变化的整数；
m，n，....z是独立地在1和3之间变化的整数。
在本发明的优选实施方案中，部分R1，R2，R3，.........Ri-1，Ri是全部相同的并且对应于甲基部分。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述部分Alq1，Alq2，Alq3，......Alqi选自1，2-亚乙基和1，2-亚丙基。在本发明的另一个更优选实施方案中，所述部分全部相同并且对应于1，2-亚丙基部分。
在本发明另一个优选实施方案中，整数m，n，...z是相互相同的并且具有数值2。
在本发明最优选的实施方案中，部分R1，R2，R3，.........Ri-1，Ri全部相同，并且对应于甲基部分；部分Alq1，Alq2，Alq3，...Alqi相互相同并且对应于1，2-亚丙基部分，并且整数m，n，...j相互相同并且具有数值2。
X表示含有伯、仲、叔或季胺的任何部分。从它们中，优选的那些部分是其中X表示-OCH2CH2N(CH3)2，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N((CH3)2)2，或-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2，或-CH2CH2(CH2)eNH2基团，其中“e”是0和2之间的整数，在所述情况下，优选它取数值1。本发明优选的实施方案也是其中X表示上述的-OCH2CH2N+(CH3)3I-，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2，-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-或-CH2CH2CH2-N+H3Cl-的季铵化形式的那些。
当X表示-OCH2CH2N(CH3)2，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N(CH3)2)2，或-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2，或者它们的季铵化形式-OCH2CH2N+(CH3)3I-，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2，-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-时，特别优选的是全部分支具有含有氨基的末端部分并且所述“p”下标取数值1或2，以致每个分支将分别以单独的末端部分或两个末端部分终止。当X表示-CH2CH2CH2NH2或它的季铵化形式-CH2CH2CH2-N+H3Cl-时，特别优选的是，全部分支具有含有氨基的末端部分并且所述“p”取数值1，以致每个分支将以单独的胺部分终止。
本发明的范围还包括其中X表示含有至少一个氨基的抗原部分的情况。上述的一个特定情况将是其中所述抗原部分是肽。
本发明还涉及所述碳硅烷树状聚体的制备方法，所述方法包括下列阶段：
a)按照下列步骤生产碳硅烷树状聚体骨架：
a1)产生下式的基础起始碳硅烷树状聚体：
Si[(CH2)aCH＝CH2]4
其中根据所述分支所需的长度，a在0和2之间变化，
使SiCl4与BrMg(CH2)aCH＝CH2反应；
a2)产生后一代树状聚体的第一代碳硅烷树状聚体前体，使a1)的基础起始碳硅烷树状聚体与HSi(R1)3-mClm反应，以便生产下式的树状聚体：
Figure A20068002687100311
其中
m在1和3之间变化并且等于可以在下一代中实现的分支的数目或者等于可以将Cl基团取代的末端官能团的数目；
R1表示苯基或甲基部分；
a3)任选地，产生后一代树状聚体的第二代碳硅烷树状聚体前体，将具有在阶段a2)中产生的Si-Cl端键的衍生物进行阶段a1)和
a2)的循环，即，
i)产生新的分支，使具有Si-Cl端键的相应的衍生物与BrMg(CH2)bCH＝CH2反应，其中根据那些分支所需的长度，“b”在0和2之间变化，并且可以与“a”下标相同或不同；
ii)使i)中产生的新一代的碳硅烷树状聚体骨架与HSi(R2)3-nCln反应，其中“n”在1和3之间变化并且可以与前一代的“m”下标相同或不同并且R2表示苯基或甲基部分；
a4)任选地，产生较后代的树状聚体的相继代前体的碳硅烷树状聚体，使相应于前一代的含有Si-Cl端键的衍生物进行对利用BrMg(CH2)cCH＝CH2试剂的阶段a3)i)的重复和利用HSi(R3)3-zClz试剂的阶段a3)ii)的重复的探寻，所述试剂其中“c”在0和2之间变化并且“z”在1和3之间变化；
a5)产生最终的碳硅烷树状聚体骨架，在阶段b)中向所述骨架加入含有至少一个氨基的部分，其中最在阶段a2)、a3)中或阶段a4)的重复i-1中，取决于所述树状聚体是否分别是第一、第二或第i代，使用HSi(Ri)3-pClp试剂，其中“p”在1和3之间变化并且Ri表示苯基或甲基部分；
b)按照下列路线之一，产生含有具有伯、仲或叔氨基的末端部分的碳硅烷树状聚体：
b1)引起阶段a5)中产生的碳硅烷树状聚体的Si-Cl端键的醇解，在过量碱存在下将它与伯、仲或叔醇-胺反应；
b2)预先产生含有Si-H端键的碳硅烷树状聚体，含有至少一个伯、仲或叔氨基的部分将随后结合到所述碳硅烷树状聚体，使它经过下列阶段：
i)产生任何代的碳硅烷树状聚体的含有Si-H端键的衍生物，使相应的碳硅烷树状聚体与Si-Cl键与能够放弃氢化物基团的试剂反应，以便Cl原子的部分或全部由H原子取代；
ii)使含有Si-H键的碳硅烷树状聚体在氢化硅烷化催化剂存在下与含有伯、仲或叔氨基并且在一端具有碳-碳双键的化合物反应，以便所述化合物通过其中存在双键的末端结合到所述树状聚体；
c)任选地，通过将阶段b)中产生的树状聚体与A-Hal试剂的反应，产生含有具有季铵化氨基的末端部分的碳硅烷树状聚体，其中A表示氢、1至10个碳的烷基或芳基原子并且Hal表示Cl，Br，I。
在本发明方法的优选实施方案中，对应于试剂BrMg(CH2)aCH＝CH2，BrMg(CH2)bCH＝CH2，.........BrMg(CH2)kCH＝CH2的下标a，b，...k相互相同并且具有数值0，为此目的，使用的试剂是乙烯衍生物BrMg-CH＝CH2并且所述分支具有2个碳的长度。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，对应于试剂BrMg(CH2)aCH＝CH2，BrMg(CH2)bCH＝CH2，.........BrMg(CH2)kCH＝CH2的下标a，b，...k相互相同并且具有数值1，为此目的，使用的试剂是烯丙基衍生物BrMg-CH2-CH＝CH2并且所述分支具有3个碳的长度。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，部分R1，R2，...Ri全部相同并且对应于甲基部分。
在本发明的另一个优选实施方案中，对应于通式HSi(R2)3-nCln的试剂的下标n，m，...j优选选自1和2。在上述的特定实施方案中，在每一代中形成的分支数目总是相同的并且等于2，为此原因，试剂HSi(R2)3-nCln，，当其用于制造产生新一代树状聚体的前体时，将在全部情况下是HSi(R2)2Cl，优选地，HSi(CH3)2Cl，其对应于“n”的数值为1。
在本发明最优选的实施方案中，部分R1，R2，...Ri全部相同并且对应于甲基部分，而对应于试剂BrMg(CH2)aCH＝CH2，BrMg(CH2)bCH＝CH2，..........BrMg(CH2)kCH＝CH2的下标a，b，...k相互相同并且具有数值1，为此目的，所述碳硅烷树状聚体的分支将具有3个碳的长度，并且在每一新代中产生的分支将是2，为此目的，HSi(CH3)2Cl将总是用于产生新一代的前体。相反，当试剂HSi(R2)3-nCln用于产生具有Si-Cl端键的碳硅烷树状聚体时，从所述Si-Cl端键产生本发明的在所述分支具有氨基的碳硅烷树状聚体，优选数值“n”选自1和2，因此，可以使用HSi(CH3)2Cl作为Si(CH3)Cl2，取决于每一分支存在的末端基团的数目分别是1或2是否是所需要的。
在本发明的实施方案中，用于从相应的含有Si-Cl端键的衍生物产生本发明的碳硅烷树状聚体的醇-胺选自N，N-二甲基乙醇胺(CH2OH-CH2-N(CH3)2)，2-[(2-二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)或3，5-双(二甲基氨基乙氧基)苯甲醇(CH2OH-(C6H3)-(O-CH2-CH2-N(CH3)2)2)。在上述的优选实施方案中，将含有Si-Cl键的碳硅烷树状聚体用相应化学计量的量的所选择的醇-胺在二亚乙基醚中在过量三乙胺存在下处理，以致每一个Si-Cl键转成Si-O键，由此将它结合到对应于所使用的醇-胺的部分。在本发明的另一个实施方案中，随后将从上述醇-胺的任何一种产生的碳硅烷树状聚体用二亚乙基醚中的CH3I处理而季铵化。
在本发明的另一个实施方案中，含有伯、仲或叔氨基的化合物是其中“e”下标在0和2之间变化的式CH2＝CH-(CH2)e-NH2的伯亚烷基胺，所述化合物在一端具有碳-碳双键并且与具有Si-H键的碳硅烷树状聚体进行反应。在上述的优选实施方案中，所述伯亚烷基胺是其中“e”具有数值为1的，即，烯丙胺，CH2＝CH-CH2-NH2。在本发明的另一个实施方案中，将通过与所述烯丙胺反应而产生的具有末端部分-CH2-CH2-CH2-NH2的碳硅烷树状聚体通过加入二亚乙基醚中的HCl而季铵化。
在本发明的另一个实施方案中，含有伯、仲或叔氨基的化合物，所述化合物在一端具有碳-碳双键并且与具有Si-H键的碳硅烷树状聚体进行反应，是在一端(CH2＝CH-(CH2)e-包含链烯基部分并且在另一个不同末端包含氨基(伯、仲或叔)的化合物，其中“e”在0和2之间变化)，所述化合物另外在链烯基部分CH2＝CH-(CH2)e和氨基部分之间包含-Ra-部分。在其优选实施方案中，使用的化合物是4-烯丙基-2-甲氧基-1-(N，N-二甲基氨基乙氧基)苯，(CH2＝CH-CH2)C6H3(OMe){O(CH2)2NMe2}。
在本发明方法的优选实施方案中，在它们的末端具有Si-H键的碳硅烷树状聚体是在阶段b2)i)中利用LiAlH4作为能放弃氢化物基团的试剂产生的，所述末端将化合物进行反应，其含有至少一个伯、仲或叔氨基并且在一个末端具有碳-碳双键，其容许Si-Cl键部分或全部转化成Si-H键，虽然类似试剂的应用包括在本发明方法的范围内，在其中本发明人可以引证NaH或NaBH4。在所述优选实施方案中，在末端含有至少一个伯、仲或叔氨基的其中具有碳-碳双键的化合物的结合，是利用Karstedt催化剂[28]催化所述反应而进行的，虽然其它氢化硅烷化催化剂诸如Spiers催化剂的应用包括在本发明方法的范围内，其容许进行所需的结合[61，62]。
在另一个附加方面中，本发明涉及含有本发明的碳硅烷树状聚体的药物组合物。在本发明的一个实施方案中，所述组合物含有至少一个本发明的碳硅烷树状聚体连同至少一种另外分子，阴离子的或聚阴离子的。在上述的特定实施方案中，聚阴离子的分子是寡脱氧核糖核苷酸(ODN)或双链DNA分子。在上述的另一个特定实施方案中，聚阴离子分子是RNA分子，单链或双链的，其优选含有相互缔合的互补区域，其容许所述RNA可以用作干扰RNA(RNAi)。在另外的实施方案中，所述阴离子分子是趋于缔合到血浆蛋白质或细胞膜的药物，所述细胞膜与它接触或易于被任何这些蛋白质所降解。
在不同于上述的实施方案中，在本发明中存在碳硅烷树状聚体作为活性物质，所述活性物质具有干涉病原性微生物的生活周期的能力。在其特别的实施方案中，所述病原体是病毒，其可以是HIV。在另一个特别的实施方案中，病原性微生物是细胞壁或膜易于被所述树状聚体改变的细菌或真菌。
在另一个附加实施方案中，在本发明中存在碳硅烷树状聚体作为活性物质，所述活性物质具有干扰蛋白质聚集体的形成或促进蛋白质聚集体的溶解的能力，所述蛋白质聚集体参与诸如由朊病毒所引起的脑病或诸如阿尔茨海默病的退化过程的病理过程的发展。
在另外的实施方案中，不同于上述的实施方案，存在于药物组合物中的本发明的碳硅烷树状聚体已将肽或任何抗原部分结合到它并且设计成能发动免疫反应，其防止或保护它所供给的个体免于由其中存在所述肽或抗原部分的生物所引起的疾病。
本发明的树状聚体和含有它们的组合物可以通过普遍的给药途径施用，即离子电渗疗法、经皮路线、注射或吸入。它们还适于形成膜以涂布假体结构或斯坦特固定模网状物，以便从它们产生本发明的至少一种树状聚体或存在于与所述树状聚体相同的组合物中的至少一种物质的控制释放。
在本发明的另一个方面中，所述碳硅烷树状聚体用于将阴离子或聚阴离子特征的分子固定至表面。在本发明的一个实施方案中，所述分子将是核酸的序列，并且它们要固定到的表面是将核苷酸序列固定到的微芯片所用的基底。
在另外附加的方面中，本发明涉及将本发明的碳硅烷树状聚体用作在血液中传送阴离子物质的载体，其保护所述物质免于它们与血浆蛋白质或与它接触的细胞膜相互作用并且其能够结合到所述阴离子物质或降解它们。这个的特例将是，其中在血液pH下具有阴离子特征的物质将是药物。
在另外附加的方面中，本发明涉及将本发明的碳硅烷树状聚体用作药物，以减少或除去由微生物所引起的疾病的症状，本发明的树状聚体能够干扰所述微生物的生活周期。
在另一个附加的方面中，本发明涉及将本发明的碳硅烷树状聚体用作它们所结合到的阴离子或聚阴离子特征的分子的转染载体。这个的特定情况将是，其中聚阴离子分子是寡脱氧核糖核苷酸(ODN)或RNA分子，单链的或双链的，其优选含有相互缔合的互补区域，其容许所述RNA用作干扰RNA(RNAi)。特别优选的是，要转染的细胞是神经系统细胞或来自由此衍生的细胞系。
现在将参考下列附图和发明详述部分中说明的实施例，更详细地描述本发明。
附图简述
图1显示具有未季铵化的胺部分的数个本发明的碳硅烷树状聚体的结构：图1a中是实施例7，11，2，5中合成的那些和图1b中是实施例13和14中合成的那些。
图2显示数个具有季铵化的胺部分的本发明的碳硅烷树状聚体的结构，图2a中是实施例22，26，19和27中合成的那些，和图2b中是实施例28和29中合成的那些。
图3显示ODN和IM8树状聚体之间的络合物形成的电泳凝胶(凝胶a)中的GF和凝胶b)中不同的ODN，ClNH4(c)，NN和苯丙氨酸(Phe)(d)和IM16(凝胶e，其也含有IM8样品)。
图4显示在ODN和树状聚体Phe、ClNH4(凝胶A)、NN(凝胶B)和IM8和IM16(凝胶C)之间在不同的pH值形成的电泳凝胶。
图5显示本发明的树状聚体络合物和ODN PPT在水溶液中保持0、6或24小时的演变。
图6显示树状聚体络合物和ODN TAR的样品在清蛋白和SDS存在下的电泳凝胶。左侧部分是用Paragon蓝的蛋白质染色，右侧部分是用溴化乙啶的DNA样品染色的照片。
图7显示本发明的树状聚体和ODN的样品在完全培养基存在下温育40分钟(40min)、4小时(4H)和17小时(17H)期间时的演变。
图8显示在人血清存在下树状聚体和ODN的样品的电泳凝胶。左侧部分显示用DNA样品的紫外线产生的照片，并且右侧部分显示用Paragon蓝的蛋白质凝胶的染色。
图9a显示在0小时(0H)、4小时(4H)和24小时(24H)以后用溴化乙啶染色对应于树状聚体和ODN的混合物的电泳凝胶。
图9b显示对应于4小时的凝胶的蛋白质染色，其用溴化乙啶的染色显示在图9a中。
图10显示质粒Nf-κB-luc和IM8树状聚体之间的络合物样品的电泳凝胶。
图11显示RNAi和本发明的树状聚体(IM8)之间的络合物形成测试的电泳凝胶。
图12显示在用树状聚体IM8，IM16，ClNH4，NN，Phe和SF温育细胞以后浓度1，5，10，20和100μM的线粒体活性的结果的图解，其对于放入它以上述编号占据的柱的每个浓度具有它们的相应的条。
图13显示用树状聚体IM8，IM16，NN，Phe和S在1，5，10和20μM温育红血球以后的血红蛋白释放的结果的图解。每个条对应于以对应于上述编号的顺序放置的树状聚体，并且每组的条对应于以升序排序的浓度。
图14显示用不同的树状合物和本发明的树状聚体温育并用锥虫蓝染色的细胞死亡率百分比的图解。
图15显示流式细胞术测试的结果，其中细胞的百分比可与对应于细胞程序死亡-坏死中的细胞和活细胞的大小和复杂性相比。X-轴表示大小并且Y-轴表示复杂性，黑色细胞云对应于细胞程序死亡-坏死中的细胞。部分A对应于用CBS树状聚体处理的PBMC细胞，部分B对应于用PAMAN类型的树状聚体处理的PBMC细胞。
图16显示在流式细胞术测试以后产生的活细胞和细胞程序死亡中的细胞的百分比的表述，在用CMS树状聚体(A)或用PAMAN类型的树状聚体(B)处理的PBMC细胞中产生。
图17显示对于下列各项温育的细胞用DAPI活细胞染料的染色：1：对照；2：ODN+IM8；3：ODN+IM16；4：ODN+SF；5：ODN；6：IM8；7：IM16；8：SF。
图18显示用IM8-ODN温育细胞72小时以后拍的照片，在0，30，60，90，120和150秒以后。
图19显示淋巴增生测试中的闪烁计数器中产生的结果的图解，所述测试用不同的CBS树状聚体、用PHA和用对照(C)刺激所述细胞。
图20显示ODN的细胞局部化，用其在A：1小时；B：3小时；C：24小时以后转染PBMC。
图21显示用ODN转染的细胞中存在的荧光分析。图21A纵坐标中显示在全部线的每个位置产生的荧光的值，其表示XY的平均截点，顶部的图解对应于蓝色荧光，居中的对应于绿色荧光，并且底部的对应于红色荧光。图21B显示类似的荧光分析，取核周围绘制的感兴趣区(ROI)，其中分析蓝色荧光(顶部图解)和绿色荧光(底部图解)。
图22显示在用PPT或本发明的树状合物转染以后产生的荧光图案。1：对照；2：PPT；3：PPT+IM8；4：PPT+NN；5：PPT+Phe；6：PPT+IM16。
图23显示在用ClNH4和PPT树状聚体转染以后产生的荧光图案。
图24显示用PPT+NN处理的细胞的XY的中平面中的荧光的直方图，其中顶部图解以纵坐标显示在全部平面中发现的绿色荧光的强度，中间的图解是对应于红色荧光的类似分析并且底部图解显示对应于蓝色荧光的类似分析。
图25显示以不同浓度的NN树状聚体在感染前后根据细胞数计算HIV的DNA拷贝数产生的图解。
图26a显示微摩尔浓度(μM)的NN树状聚体进行丙烯酰胺/双丙烯酰胺电泳时产生的条带的图案，其显示泳道上。
图26b显示不用药物(Ctrl)温育的NN树状聚体的样品或用甲氨蝶呤以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/8(泳道标记为“1”)，1/4(泳道标记为“2”)，1/2(泳道标记为“3”)或1/1(泳道标记为“4”)。
图26c显示不用药物(Ctrl)温育的NN树状聚体的样品或用不同单位的肝素温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：10U(泳道标记为“1”)，1U(泳道标记为“2”)，0.5U(泳道标记为“3”)或0.1U(泳道标记为“4”)。
图26d显示不用药物(Ctrl)温育的NN树状聚体的样品或用胰岛素以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/3(泳道标记为“1”)，1/1.5(泳道标记为“2”)，4/1(泳道标记为“3”)或10/1(泳道标记为“4”)。
图27a显示微摩尔浓度(μM)的NN16树状聚体进行丙烯酰胺/双丙烯酰胺电泳时产生的条带的图案，其显示泳道上。
图27b显示不用药物(Ctrl)温育的NN16树状聚体的样品或用甲氨蝶呤以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/16(泳道标记为“1”)，1/8(泳道标记为“2”)，1/4(泳道标记为“3”)或1/2(泳道标记为“4”)。
图27c显示不用药物(Ctrl)温育的NN16树状聚体的样品或用不同单位的肝素温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：10U(泳道标记为“1”)，1U(泳道标记为“2”)，0.5U(泳道标记为“3”)或0.1U(泳道标记为“4”)。
图27d显示不用药物(Ctrl)温育的NN16树状聚体的样品或用胰岛素以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/3(泳道标记为“1”)，1/1.5(泳道标记为“2”)，4/1(泳道标记为“3”)或10/1(泳道标记为“4”)。
图28a显示微摩尔浓度(μM)的IM16树状聚体进行丙烯酰胺/双丙烯酰胺电泳时产生的条带的图案，其显示泳道上。
图28b显示不用药物(Ctrl)温育的IM16树状聚体的样品或用甲氨蝶呤以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/16(泳道标记为“1”)，1/8(泳道标记为“2”)，1/4(泳道标记为“3”)或1/2(泳道标记为“4”)。
图28c显示不用药物(Ctrl)温育的IM16树状聚体的样品或用不同单位的肝素温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：10U(泳道标记为“1”)，1U(泳道标记为“2”)，0.5U(泳道标记为“3”)或0.1U(泳道标记为“4”)。
图28d显示不用药物(Ctrl)温育的IM16树状聚体的样品或用胰岛素以树状聚体/药物分子为下列比例温育所述树状聚体的样品进行电泳时产生的条带图案：1/3(泳道标记为“1”)，1/1.5(泳道标记为“2”)，4/1(泳道标记为“3”)或10/1(泳道标记为“4”)。
图29显示不用药物(泳道标记为“D”)温育的或用胰岛素(泳道标记为“C”)温育的IM16树状聚体的样品进行电泳时产生的条带的图案，其中pH取所述泳道上指示的数字值。图中出现的右边和左边的两张照片的每一个对应于不同的凝胶，在相同的电泳条件下产生。
图30显示条形图其中，在纵坐标中，它显示增殖因子的值，指的是用化合物温育U87-MG细胞(顶部图解，标记为“A”)或SK-N-MC细胞(底部图解，标记为“B”)产生的对照(“C-”)，所述化合物以所指示的浓度指示在每个条形下。C-：阴性对照，对应于仅用培养基而不用另外的化合物温育的样品。
图31显示条形图其中，在纵坐标中，它显示生存力因子的值，相对于对照(“C-”)的值计算为百分数，在用MTT进行试验时在用表示在条形下的化合物以所示浓度和体积温育的U87-MG细胞中产生，在24小时(顶部图解，标记为“A”)，3天(3D)(中间的图解，标记为“B”)或7天(7D)(底部图解，标记为“C ”)的时间期间。Dextr：葡聚糖；Spfect：Superfect。
图32显示条形图，其中，在纵坐标中，它显示细胞毒性因子的值，相对于对照(“C-”)的值表示为百分数，在U87-MG细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)的定量以后产生，在24小时(24H)期间用条形下所示的化合物以所示浓度和体积温育。Dextr：葡聚糖；Spfect：Superfect.DMEM：对应于无细胞的培养基的值。
图33显示条形图，其中，在纵坐标中，它显示相对于对照(“C”)值的百分比的值，对应于在用MTT进行试验时产生的结果(顶部图解，标记为“A”)或者对应于SK-N-MC细胞的培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的定量(底部图解，标记为“B”)，在24小时(24H)期间用条形下所示的化合物以所示浓度和体积温育所述细胞。Dextr：葡聚糖；Spfect：Superfect.DMEM：对应于无细胞的培养基的值。
图34a显示在分析U87-MG细胞时在流式细胞仪中产生的图，所述细胞用标记有荧光素的抗-rev寡核苷酸(Oligo-FITC)在没有树状聚体温育(标记为“Ctrl”的图，对照)，或者用在寡核苷酸和NN树状聚体之间形成的络合物温育，与产生-电荷/+电荷比成比例，表示在每个图中：1∶1，1∶2，1∶4和1∶8。
图34b显示在分析U87-MG细胞时在流式细胞仪中产生的图，所述细胞用标记有荧光素的抗-rev寡核苷酸(Oligo-FITC)在没有树状聚体温育(标记为“Ctrl”的图，对照)，或者用在寡核苷酸和NN16树状聚体之间形成的络合物温育，与产生-电荷/+电荷比成比例，表示在每个图中：1∶1，1∶2，1∶4和1∶8。
图35显示在分析SK-N-MC细胞时在流式细胞仪中产生的图，所述细胞用标记有荧光素的抗-rev寡核苷酸(Oligo-FITC)在没有树状聚体温育(标记为“Ctrl”的图，对照)，或者用在寡核苷酸和NN16树状聚体之间形成的络合物温育，与产生-电荷/+电荷比成比例，表示在每个图中：1∶1，1∶2，1∶4和1∶8。
发明详述
本发明描述新的支化碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体在所述分支的末端具有伯、仲、叔或季氨基，其符合下式：
Figure A20068002687100411
在第一代的那些情况下；
Figure A20068002687100412
在第二代的那些情况下；
Figure A20068002687100413
在第三代的那些情况下；
或符合在更后代情况下的相应类似式，其中对应于每第i代的式将通过用下列类型的新嵌段取代对应于上代的式中的Xp而产生：
Figure A20068002687100414
将与硅原子结合的基团从被(Ri-1)3-p所表示变化为被(Rj-1)3-z所表示，所述硅原子为该取代嵌段结合的相同硅原子，
式中：
Alq1，Alq2，Alq3，........Alqi表示根据每代中的分支长度相互独立选择的2至4个碳的亚烷基部分；
R1，R2，R3，..........Ri-1，Ri表示在甲基和苯基部分；
X表示含有至少一个伯、仲、叔或季氨基的部分；
p是在1和3之间变化的整数；
m，n，....z是独立地在1和3之间变化的整数。
在本发明最优选的实施方案中，部分R1，R2，R3，..........Ri-1，Ri全部相同并且对应于甲基部分；部分Alq1，Alq2，Alq3，...Alqi相互相同并且对应于1，2-亚丙基部分并且整数m，n，...j相互相同并且具有数值2。在那些条件下，对应于本发明所述实施方案的树状聚体还可以由通式iG-(Xp)m表示，
其中：
i：表示树状聚体的代数
X：表示位于所述树状聚体周围的官能基团的属性
p：表示每个分支中的官能基团的数目
m：表示树状聚体中末端官能基团的数目
G：根据所述代，表示树状聚体碳硅烷骨架，将符合下式：
Figure A20068002687100421
骨架其中SiMe3(Me＝CH3)最终末端将转化成所述树状聚体的通式中的SiMe2X，在所述情况下“p”等于1；并且转化成SiMeX2，在所述情况下“p”等于2。
X表示含有伯、仲、叔或季胺的部分。
如本发明中所使用，术语树状聚体涉及树状构造的三维大分子。
术语“代”涉及对于制备所述树状聚体所必需的迭代阶段的数目。
术语“碳硅烷树状聚体”涉及具有碳硅烷骨架的树状分子。
术语“氢化硅烷化”涉及将Si-H键加入到C＝C双键。
如本发明中所用，术语“抗原部分”涉及结合到分子并且能够在提供具有结合部分的分子的个体中发动免疫反应的部分。
如本发明中所用，术语“肽”指的是，通过在氨基酸的羧基和相邻的氨基酸的氨基之间形成酰胺类型的连接而结合两个或多个氨基酸的直链。
如上所示，本发明也涉及制备本发明树状聚体的方法。利用众所周知的反应，经由分支的方法以高收率制备不同代的这些有机硅烷树状聚体。[25，42，43，44，45，46，]这些树状聚体具有巨大的多功能性，赋予它们超过其它衍生物的优势：i)可以利用乙烯的或烯丙型的Grignard衍生物在复分解步骤中修饰所述分支的长度；ii)可以改变每代分支的数目，例如，由HSiCH3Cl2置换HSiCl3；iii)可以将多种多样的官能团结合至所述树状聚体周围。而且，碳硅烷树状聚体具有巨大的化学惰性，其对于本发明的另外用途是非常有用的，利用它们作为在血液中传送阴离子分子的载体(诸如ODN和不同的阴离子药物)，它防止与血浆蛋白质相互作用和它在细胞中的摄取以发挥它的作用。
如已经说明的，在本发明的优选实施方案中，不同代的分支是全部相等的，并且是利用烯丙型衍生物BrMg-CH2-CH＝CH2的结果，同时通过利用HSiCH3Cl2的每一代中产生的分支在全部情况下也是相同的并且等于2。在那些条件下，用于产生不同的碳硅烷树状聚体的分支合成方法可以是以下列方式概况，直到第二代
Figure A20068002687100431
一旦产生对应于所需代的树状聚体前体的骨架，将产生具有Si-Cl或Si-H端键的衍生物，从其产生本发明的具有末端部分的碳硅烷树状聚体，所述末端部分含有氨基。所述方法将详述如下：
具有末端氨基的碳硅烷树状聚体的生产
合成这些衍生物的第一步是制备含有Si-Cl或Si-H端键的前体树状聚体。这些树状聚体的合成已经是公布的[25，42，43，44，45，46，]并且以高收率进行。在本说明书的下述实施例中，树状聚体已经生长至第三代，但是产生后代的树状聚体的方法学是类似的，为此目的，所述后代的树状聚体和它们的制备也包括在本发明的范围中。
在本发明优选实施方案的情况下，其中每一代的分支是相同尺寸的并且对应于3-碳链并且其中在每一代中形成新的分支，留下以四价结合到Si原子的甲基，其将维持饱和，将引起不同的具有Si-Cl和Si-H端键的前体碳硅烷树状聚体产生的反应方案将由方案1所表示：
Figure A20068002687100451
方案1
第二步骤由下列所组成：利用Si-Cl和Si-H键的已知反应性将不同的氨基结合至这些树状聚体的表面。为此目的，根据碳硅烷树状聚体中存在的
端基的属性，可以遵循两个备选的合成路线。
1.Si-Cl键的醇解路线。
该方法在碱诸如三乙胺存在下使用不同的醇-胺，加入所述碱是为了除去该反应中放出的氯化氢。术语“醇-胺”指的是含有醇官能度的不同的胺，类似于由下列式所描述的实例：
Figure A20068002687100461
N，N-二甲基乙醇胺      2-[(2-(二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇
3，5-双(二甲基氨基乙氧基)苯甲醇
在本发明中，优选使用这三种胺，但是本发明的方法容许用任何其它的胺官能化树状聚体的周边，所述胺具有易于进行描述于此的醇解方法的醇官能度，用产生的胺官能官能化任何那些胺和碳硅烷树状聚体也包括在本发明的范围中。
用二亚乙基醚中的化学计量量的N，N-二甲基乙醇胺并且在过量三乙胺存在下处理碳硅烷树状聚体，导致具有末端氨基的碳硅烷树状聚体的形成。一般地说，该阶段在方案2中再生产：
Figure A20068002687100463
该反应方案的使用产生化合物1G-[Si(OCH2CH2NMe2)]4    (1)，1G-[Si(OCH2CH2NMe2)2]4    (2)，2G-[Si(OCH2CH2NMe2)]8    (3)，2G-[Si(OCH2CH2NMe2)2]8    (4)，3G-[Si(OCH2CH2NMe2)]16    (5)，3G-[Si(OCH2CH2NMe2)2]16    (6)，在描述如下的实施例1-6中更详细地解释其合成方法。
N，N-二乙基乙醇胺由其它醇胺衍生物的取代导致与上述对于制备树状聚体的反应类似的反应，所述其它醇胺衍生物诸如3，5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)CH2OH或Me2NCH2CH2N(Me)CH2CH2OH。将该反应在方案3中复制：
Figure A20068002687100471
方案3
该反应方案的使用产生化合物1G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe2)2)]4                (7)，2G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe2)2)]8                (8)，3G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe2)2)]16               (9)，1G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe2)]4                         (10)，2G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe2)]8                         (11)，3G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe2)]16(12)，在描述如下的实施例1-6中更详细地解释其合成方法。
用MeI季铵化
用化学计量量或微小过量的HCl季铵化树状聚体1-12的末端氨基进行的尝试不产生预期结果，原因在于Si-O键的逐步水解。然而，用二亚乙基醚中的过量MeI定量地处理这些树状聚体在数小时内产生氨基的季铵化作用，引起铵阳离子的碘盐作为白色吸湿性固体以高收率沉淀。该反应提供在方案4中：
Figure A20068002687100481
                                   方案4
以该方式，分离并表征了下列树状聚体：1G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)]4(16)，1G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)2]4(17)，2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)]8   (18)，2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)2]8    (19)，3G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)]16    (20)，3G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)2]16                                      (21)，1G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe3 +I-)2)]4                    (22)，2G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe3 +I-)2)]8                    (23)，3G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe3 +I-)2)]16                   (24)，1G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)]4                             (25)，2G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)]8                             (26)，3G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)]16                            (27)。
它们的合成和表征方法在下面详述在随后描述的实施例16至27中。在这里提供的细节表明二甲基氨基的季铵化对于第三代树状聚体的一些是不完全的，具体而言是21，24和27：这些络合物的仅大约90％的端基是已经季铵化的。即使在过量MeI存在下并且使所述反应保持更长的时期，也是这样的情况。
在分别为第一和第二代的树状聚体10和11的情况下，将过量MeI加入到季铵化大分子中存在的全部氮原子所需的化学计量的量，导致树状聚体35(1G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2I-)]4和36(2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2I-)]8)的形成，分别在实施例48和49中描述了其合成和表征方法。
2.Si-H端键的氢化硅烷化路线
用烯丙胺(CH2＝CH-CH2-NH2)在Karstedt催化剂[28]存在下处理含有Si-H端键的碳硅烷树状聚体，导致以实际上定量的收率形成具有末端氨基的树状聚体1G-[SiCH2CH2CH2NH2]4(13)，2G-[SiCH2CH2CH2NH2]8(14)，3G-[SiCH2CH2CH2NH2]16(15)。由此产生它们的反应表示在方案5中：
Figure A20068002687100491
方案4
这些树状聚体是热稳定的并且在有机溶剂中稳定。它们的表征和纯度已经由元素分析(H，C，N)，NMR光谱法(1H，13C和29Si)和质谱法(电雾化或MALDI-TOF MS)所检验。在下面描述的实施例13至15中详述它们的合成和表征。
该方法也可用于合成在它们的也含有氨基的分支末端具有其它不同的末端部分的碳硅烷树状聚体，在所述反应中用烯丙胺取代含有氨基并且也含有末端碳的另一个化合物，所述末端碳与相邻的碳形成双键，以便所述化合物的末端之一具有CH2＝CH-末端部分，所述末端部分产生通过-CH2-基团结合到树状聚体骨架的化合物。所述化合物可以简单地是亚烷基胺，例如式CH2＝CH-(CH2)e-NH2的伯胺，其中“e”下标在0和2之间变化(相应的其中e＝1的情况具体而言是烯丙胺)，或更复杂的化合物，所述化合物也包含一个末端的链烯基部分(CH2＝CH-(CH2)e-)和另一个不同末端的氨基(伯、仲、叔或季)，所述化合物另外在CH2＝CH-(CH2)e-链烯基部分和氨基之间包含-Ra-部分。实施例44和45详述树状聚体31(1G-[Si((CH2)2C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2))]4)和32(2G-[Si((CH2)2C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2))]8)的合成和表征，它们在它们的分支末端含有所述化合物之一的部分衍生物，具体而言是非商业产品(CH2＝CH-CH2)C6H3(OMe){O(CH2)2NMe2}，其在先的合成描述在实施例44中。
用HCl季铵化
具有-NH2端基的树状聚体的季铵化可以通过加入作为溶剂的二亚乙基醚中的HCl(Et2O中的1M溶液)(方案6)而进行。
Figure A20068002687100501
方案6
按照所述反应方案6产生离子的衍生物1G-[SiCH2CH2CH2NH3 +Cl-]4(28)，2G-[SiCH2CH2CH2NH3 +Cl-]8(29)，3G-[SiCH2CH2CH2NH3 +Cl-]16(30)。所述化合物沉淀为白色固体并且容易用真空除去溶剂和反应中使用的过量HCl而纯化。
这些树状聚体是热稳定的并且可溶于DMSO，MeOH和H2O中。如上述树状聚体一样，它们的表征和纯度用元素分析(H，C，N)，NMR光谱法(1H，13C和29Si)和质谱法(电雾化或MALDI-TOF MS)检验。
用MeI季铵化
按照方案4，用-NMe2端基进行树状聚体31和32的季铵化，其中，在树状聚体31和32的情况下，R将对应于部分-[(CH2)2C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2)]。因此，将树状聚体31和32用二亚乙基醚(Et2O)中的甲基碘(缩写为MeI)处理，如实施例46和47中所述，由此产生树状聚体33和34。
合成具有末端氨基的碳硅烷树状聚体的实施例
应当理解，下面给出的实施例仅说明本发明的目的并且不以任何方式涉及任何局限性。
描述的树状聚体的1H-NMR光谱中的信号的积分值仅提供氢原子总数的第四部分。
下面出现的实施例1至30描述具有末端氨基的碳硅烷树状聚体的合成，从按照方案1中显示的已经知道的方法预先合成的前体树状聚体(1G-Cl4，1G-Cl8，1G-H4，2G-Cl8，2G-Cl16，1G-H8，3G-Cl4，1G-Cl8，1G-H4，)开始所述合成。如已经评述的，所述前体树状聚体用作“骨架”，从那里形成本发明的具有末端氨基的碳硅烷树状聚体，通过使它们与产生配体的化合物反应，所述配体在树状聚体分支的末端转化。用于合成实施例1至30中描述的树状聚体的合成所用的化合物是：烯丙胺(CH2＝CH-CH2-NH2)(从西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)获得)，N，N-二乙基乙醇胺(CH2OH-CH2-N(CH3)2)(从西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)获得)或2-[(2-(二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)(从西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)获得)或3，5-双(二甲基氨基乙氧基)苯甲醇(CH2OH-(C6H3)-(O-CH2-CH2-N(CH3)2)2)，该后者的化合物不是从任何商业机构获得的并且需要预先合成它，如实施例7中所描述。其中这些化合物用于产生本发明的碳硅烷树状聚体的反应的细节，以及其季铵化以产生本发明的另外的树状聚体，在下面描述在实施例1至30中。
实施例1至12：
-实施例1：1G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 )] 4 (1)的合成
将稍微过量的NEt3(0.86ml，6.2mmol)和N，N-二甲基乙醇胺(0.6ml，5.97mmol)加入到乙醚(50ml)中的1G-Cl4树状聚体溶液(0.85g，1.49mmol)中。将反应混合物在持续搅拌下在环境温度保持1h，在真空除去过量NEt3和所述溶剂后产生残渣，将其用乙醚(30ml)萃取。将得到的悬浮液用硅藻土过滤以除去反应中产生的铵盐NEt3·HCl并干燥滤液而产生作为浅黄色油的化合物1。(0.98g，84％)。
1H-NMR(CDCl3)：.3.64(2H，t，CH2O)，2.40(2H，t，CH2N)，2.22(6H，s，NMe2)，1.31(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.60(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.067(6H，s，OSiMe2)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：..61.5(CH2N)，60.8(CH2O)，46.1(NMe2)，21.3(SiCH2CH2CH2SiO)，18.1，17.4(SiCH2CH2CH2SiO)，-1.7(OSiMe2).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.49(G0-Si)，17.62(G1-Si).C36H88N4O4Si5的元素分析：计算的：C，55.33；H，11.35；N，7.17.获得的：C，55.16；H，11.22；N，7.06。
-实施例2：1G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 ] 4 (2)的合成.
从1G-Cl8(0.54g，0.87mmol)，N，N-二甲基乙醇胺(0.7ml，6.94mmol)和NEt3(1.0ml，7.2mmol)开始，按照类似于对于1所描述的方法制备第一代树状聚体2。在该方法中，产生作为无色油的2。(0.75g，80％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.74(4H，t，CH2O)，2.43(4H，t，CH2N)，2.23(12H，s，NMe2)，1.31(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.63(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.52(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.09(3H，s，OSiMe)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：.61.4(CH2N)，60.7(CH2O)，46.2(NMe2)，18.7(SiCH2CH2CH2SiO)，17.7，17.2(SiCH2CH2CH2SiO)，-4.4(OSiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：.0.47(G0-Si)，-3.65(G1-Si)，C48H116N8O8Si5的元素分析：计算的：C，53.68；H，10.89；N，10.43.获得的：C，53.54；H，11.33；N，10.06.MALDI-TOFF-MS：m/z 1095.8[M+H]+(理论值，1095.8)。
-实施例3：2G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 )] 8 (3)的合成
从2G-Cl8(0.27g，0.18mmol)，N，N-二甲基乙醇胺(0.15ml，1.47mmol)和NEt3(0.25ml，1.79mmol)开始，按照类似于对于1所描述的方法制备第二代树状聚体3。在该方法中，产生作为无色油的3(0.31g，90％)。
1H-NMR(CDCl3)：.3.64(4H，t，CH2O)，2.41(4H，t，CH2N)，2.23(12H，s，NMe2)，1.30(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si重叠的)，0.65(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(8H，m，CH2Si的部分)，0.07(12H，s，OSiMe2)，-0.09(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：.61.5(CH2N)，60.8(CH2O)，46.1(NMe2)，21.1(SiCH2CH2CH2SiO)，18.6-17.9(-CH2-基团的部分)，-1.9(OSiMe2)，-4.9(SiMe)，29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.93(G1-Si)，17.6(G2-Si)，没有观察到G0-Si。C88H212N8O8Si13的元素分析。计算的：C，56.35；H，11.39；N，5.97.获得的：C，55.98；H，11.20；N，5.78。
-实施例4：2G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 ] 8 (4).的合成
从2G-Cl16(0.48g，0.30mmol)，N，N-二甲基乙醇胺(0.48ml，4.77mmol)和NEt3(0.7ml，5.02mmol)开始，按照类似于对于1所描述的方法制备第二代树状聚体4。在该方法中，产生作为无色油的3(0.66g，90％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.75(8H，t，CH2O)，2.44(8H，t，CH2N)，2.24(24H，s，NMe2)，1.34(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si重叠的)，0.64(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.51(8H，m，CH2Si的部分)，0.09(6H，s，OSiMe)，-0.10(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：.61.4(CH2N)，60.7(CH2O)，46.2(NMe2)，18.6(SiCH2CH2CH2SiO)，17.7-17.0(-CH2-基团的部分)，-4.4(OSiMe)，-4.8(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.9(G1-Si)；-3.5(G2-Si)；没有观察到G0-Si。C112H268N16O16Si13的元素分析：计算的：C，54.67；H，10.98；N，9.11.获得的：C，54.20；H 10.37；N 9.59。
-实施例5：3G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 )] 16 (5)的合成.
从3G-Cl16(0.20g，0.06mmol)，N，N-二甲基乙醇胺(0.10ml，0.99mmol)和NEt3(0.16ml，1.14mmol)开始，按照类似于对于1所描述的方法制备第三代树状聚体5。在该方法中，产生作为浅黄色油的5(0.18g，74％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.65(8H，t，CH2O)，2.42(8H，t，CH2N)，2.24(24H，s，NMe2)，1.23(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si重叠的)，0.64(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(20H，m，CH2Si的部分)，0.068(24H，s，OSiMe2)，-0.10(9H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：.61.5(CH2N)，60.8(CH2O)，46.1(NMe2)，21.1(SiCH2CH2CH2SiO)，18.6-17.9(-CH2-基团的部分)，-1.82(OSiMe2)，-4.8(SiMe)，29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.95(G2-Si)；17.95(G3-Si)没有观察到G0-Si和G1-Si。C198H460N16O16Si29的元素分析：计算的：C，56.74；H，11.41；N，5.51.实验的％：C，56.17；H，11.28；N，5.34。
-实施例6.-3G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 ] 16 (6)的合成.
从3G-Cl32(0.19g，0.05mmol)，N，N-二甲基乙醇胺(0.17ml，1.68mmol)和NEt3(0.24ml，1.79mmol)开始，按照类似于对于1所描述的方法制备第三代树状聚体6。在该方法中，产生作为浅黄色油的6(0.20g，72％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.75(16H，t，CH2O)，2.44(16H，t，CH2N)，2.24(48H，s，NMe2)，1.32(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si重叠的)，0.66(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(20H，m，SiCH2的部分)，0.07(12H，s，OSiMe)，-0.10(18H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：61.4(CH2N)，60.7(CH2O)，46.1(NMe2)，18.4-17.4(-CH2-基团的部分)，-4.7(OSiMe2)，-5.2(SiMe)。C240H572N32O32Si29的元素分析。计算的：C，55.08；H，11.02；N，8.56.获得的：C，56.11；H，11.89；N，8.13。
-实施例7.-1G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 )] 4 (7)的合成
7.1.3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 -(C 6 H 3 )-CH 2 OH的合成
为了合成树状聚体7，8和9(起始树状聚体，依次产生树状聚体22，23和24)，必需预先合成随后用作配体的化合物，3，5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2。为此，向作为溶剂的丙酮中的3，5-二羟基苯甲醇(1.47g，10.39mmol)的溶液，加入2当量的2-氯-N，N二甲基氨基乙烷盐酸盐(2.98g，20.78mmol)，4.5当量的K2CO3(6.43g，46.75mmol)，18-冠-6醚冠(0.54g，2mmol)和一勺尖的KI。将反应在回流下保持48h。在真空除去溶剂后，将它在CH2Cl2/H2O(2×50ml)中萃取。用MgSO4在1h期间干燥有机相。然后将它过滤并在真空中除去溶剂，产生浅黄色油，将其用己烷(2×10ml)洗涤以除去18-冠-6醚冠。由此产生作为浅黄色油的目的化合物(1.53g，50％)。
NMR-1H(CDCl3)
Figure A20068002687100541
6.48(2H，m，C6H3)，6.36(1H，m，C6H3)，4.57(2H，s，CH2OH)，3.99(4H，t，CH2O-C6H3)，2.65(4H，t，CH2N)，2.60(1H，s，CH2OH)，2.28(12H，s，NMe2).NMR-13C{1H}(CDCl3)：159.9(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)，143.8(C6H3，结合到CH2OH的Cipso)，105.1和100.6(C6H3)，65.8(CH2O-C6H3)，64.9(CH2OH)，58.2(CH2N)，45.8(NMe2)。C15H26N2O3的元素分析。计算的％：C，63.80；H，9.28；N，9.92.实验的％：C，63.50；H，9.17；N，9.83。
将该化合物用于合成树状聚体7，8和9，将其描述如下。
7.2.树状聚体7的合成
将稍微过量的NEt3(0.12ml，0.87mmol)和3，5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2OH(0.22g，0.378mmol)加入到乙醚(30ml)中的1G-Cl4(0.11g，0.19mmol)树状聚体的溶液。将反应混合物在持续搅拌下在环境温度保持1h，在真空除去过量NEt3和溶剂以后，产生残渣，将其用乙醚(2×20ml)萃取。将得到的悬浮液用硅藻土过滤以除去在反应中产生的铵盐NEt3·HCl并干燥滤液，产生作为浅黄色油的化合物7(0.23g，80％)。
1H-NMR(CDCl3)：.6.45(2H，m，C6H3)；6.36(1H，m，C6H3)；4.56(2H，s，CH2OSi)；3.99(4H，t，CH2O-C6H3)；2.66(4H，t，CH2N)；2.28(12H，s，NMe2)；1.33(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)；0.68(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)；0.55(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)；0.08(6H，s，SiMe2).13C{1H}-NMR(CDCl3)：159.8(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)；143.2(C6H3，结合到CH2Osi的Cipso)；104.9和100.2(C6H3)；65.9(CH2O-C6H3)；64.6(CH2OSi)；58.2(CH2N)；45.8(NMe2)，21.2(SiCH2CH2CH2SiO)；17.9，17.2(SiCH2CH2CH2SiO)；-1.89(SiMe2).C80H148N8O12Si5的元素分析。计算的：C，61.81；H，9.60；N，7.21.获得的：C，62.10；H，9.82；N，7.3。
-实施例8.-2G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 )] 8 (8)的合成
从2G-Cl8(0.27g，0.19mmol)；NEt3(0.22mL，1.62mmol)和3，5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2OH(0.43g，1.52mmol)开始，按照类似于对于7所描述的方法制备第二代树状聚体8。在该方法中，产生作为浅黄色油的8(0.54g；82％)。
1H-NMR(CDCl3)：6.45(4H，m，C6H3)；6.36(2H，m，C6H3)；4.56(4H，s，CH2OSi)；3.99(8H，t，CH2O-C6H3)；2.67(8H，t，CH2N)；2.29(24H，s，NMe2)；1.33(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO  和SiCH2CH2CH2Si)，0.69(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.55(8H，m，结合到Si的CH2)，0.09(12H，s，OSiMe2)，-0.09(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：159.0(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)；143.3(C6H3，结合到CH2Osi的Cipso)；104.8和100.1(C6H3)；65.9(CH2O-C6H3)；64.6(CH2OSi)；58.3(CH2NMe2)；45.9(NMe2)，21.2(SiCH2CH2CH2SiO)；17.9，17.2(SiCH2CH2CH2SiO  和SiCH2CH2CH2Si)的重叠信号；-1.7(OSiMe2)，-4.9(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.93(G1-Si)，18.7(G2-Si)，未观察到G0-Si。C176H332N16O24Si13的元素分析。计算的：C，61.78；H，9.78；N，6.55.获得的：C，62.51；H，9.90；N，6.75。
-实施例9.-3G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 )] 16 (9)的合成
从3G-Cl16(0.072g，0.022mmol)；NEt3(0.060ml，0.43mmol)和3，5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2OH(0.101g，0.358mmol)开始，按照类似于对于7所描述的方法制备第三代树状聚体9。在该方法中，产生作为浅黄色油的9(0.110g；69％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ6.46(8H，m，C6H3)；6.35(4H，m，C6H3)；4.56(8H，s，CH2OSi)；3.97(16H，t，CH2O-C6H3)；2.67(16H，t，CH2N)；2.28(48H，s，NMe2)；1.33(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.69(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.55(18H，m，结合到Si的CH2)，0.09(24H，s，OSiMe2)，-0.09(9H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：160.0(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2)的Cipso；143.2(C6H3，结合到CH2Osi的Cipso)；104.3和100.8(C6H3)；65.9(CH2O-C6H3)；64.6(CH2OSi)；58.3(CH2NMe2)；45.8(NMe2)，21.1(SiCH2CH2CH2SiO)；17.8，17.2(SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si的重叠信号)；-1.8(OSiMe2)，-4.9(SiMe)。C368H700N32O48Si29的元素分析。计算的：C，61.76；H，9.86；N，6.26.获得的：C，62.43；H，9.90；N，6.80。
-实施例10.-1G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 2 )] 4 (10)的合成
将稍微过量的NEt3(0.5ml，3.58mmol)和2-{(2-二甲基氨基)乙基]甲基氨基}乙醇(0.35ml，2.19mmol)加入到乙醚(30ml)中的1G-Cl4(0.31g，0.54mmol)树状聚体溶液。将反应混合物在持续搅拌下在环境温度保持12h，在真空除去过量NEt3和溶剂以后，产生残渣，将其用乙醚(2×20ml)萃取。将得到的悬浮液用硅藻土过滤以除去在反应中产生的铵盐NEt3·HCl并干燥滤液，产生作为无色油的化合物10(0.3g，57％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.64(2H，t，CH2O)，2.51(4H，m，CH2N(Me))，2.35(2H，t，CH2N(Me)2)，2.26(3H，s，NMe)，2.19(6H，s，NMe2)，1.29(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.62(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.59(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.05(6H，s，SiMe2).13C{1H}-NMR(CDCl3)：60.8(CH2O)，59.9和56.2(CH2N(Me)CH2)，57.5(CH2N(Me)2)，45.9(NMe2)，43.3(NMe)，21.2(SiCH2CH2CH2SiO)，17.8(SiCH2CH2CH2SiO)，17.2(SiCH2CH2CH2SiO)，-2.0(SiMe2).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.49(G0-Si)，17.59(G1-Si).C48H116N8O4Si5的元素分析。计算的：C，57.09；H，11.58；N，11.10.获得的：C，57.60；H，11.72；N，11.20。
-实施例11.-2G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 2 )] 8 (11)的合成
从2G-Cl8(1.12g，0.77mmol)，NEt3(1ml，7.17mmol)和2-{[2-二甲基氨基)乙基]甲基氨基}乙醇(1ml，6.16mmol)开始，按照类似于对于10所描述的方法制备第三代树状聚体11。在该方法中，产生作为浅黄色油的11(1.3g，72％)。
1H-NMR(CDCl3)：3.65(4H，t，CH2O)，2.51(8H，m，CH2N(Me))，2.30(4H，t，CH2N(Me)2)，2.26(6H，s，NMe)，2.20(12H，s，NMe2)，1.31(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.63(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.59(8H，m，SiCH2)，0.06(12H，s，SiMe2)，-0.10(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：60.8(CH2O)，59.9和56.2(CH2N(Me)CH2)，57.5(CH2N(Me)2)，45.9(NMe2)，43.3(NMe)，21.2(CH2SiO)，18.7-17.9(SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，-1.79(OSiMe2)，-4.8(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.38(G0-Si)，0.93(G1-Si)，17.58(G2-Si).C112H226N16O8Si13的元素分析。计算的：C，57.67；H，11.58；N，9.61.获得的：C，57.20；H，11.40；N，9.52
-实施例12.3G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 2 )] 16 (12)的分析
从3G-Cl16(0.49g，0.152mmol)，NEt3(0.40ml，2.86mmol)和2-{[2-二甲基氨基)乙基]甲基氨基}乙醇(0.39ml，2.43mmol)开始，按照类似于对于10所描述的方法制备第三代树状聚体12。在该方法中，产生作为浅黄色油的12(0.51g，67％)。
1H-NMR(CDCl3)：δ3.65(8H，t，CH2O)，2.51(16H，m，CH2N(Me))，2.36(8H，t，-CH2N(Me)2)，2.26(12H，s，NMe)，2.21(24H，s，NMe2)，1.30(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.63(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(18H，m，SiCH2)，0.06(24H，s，SiMe2)，-0.10(9H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：δ60.8(CH2O)，60.0和56.2(CH2N(Me)CH2)，57.4(CH2N(Me)2)，45.9(NMe2)，43.3(NMe)，21.1(CH2SiO)，18.7-17.8(SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2SiSi)，-1.9(OSiMe2)，-4.8(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：δ0.93(G1-Si和G2-Si)，17.58(G3-Si)。C240H572N32O16Si29的元素分析。计算的：C，57.91；H，11.58；N，9.0获得的：C，57.32；H，11.38；N，8.72。
以高收率产生作为清澈的棕色油质产品的这些树状聚体。它们的全部可溶于通常水不溶性的有机溶剂。
衍生物1-12的光谱的和分析的细节与显示在图1a中的预定结构一致。因而，对应于上述树状聚体的1H-NMR中的碳硅烷骨架的信号对于不同代中类似的核具有化学位移，虽然所述信号随着树状聚体代增加而变得更宽和更变性的。这些特征主要归于两个因素：这些衍生物的聚合物类型的结构，其在它们的化学环境中赋予不同代中的核非常轻微的差异，以及在增加的代上的最外层中各自质子的迁移率的限制。[26]
这些光谱显示分配到亚甲基基团的三组信号。在SiCH2CH2CH2Si分支中，在1.30ppm观察到中心的亚甲基基团，同时直接结合到硅原子的亚甲基基团定位在0.61和0.51ppm。基于在增加树状聚体代时该最后信号的积分和1D1H-TOCSY和NOESY实验的强度增加，位于中心的信号在0.61ppm分配到CH2SiO-基团，同时位于0.51ppm为中心的信号归于亚甲基基团部分。在13C NMR光谱中，内部SiCH2CH2CH2Si分支的亚甲基基团具有21.3-17.4ppm范围内的信号。这些信号的完全分配是用HMQC实验的辅助进行的。最终，在全部衍生物和代中容易区分-SiMe2-和-SiMe-碎片。29Si NMR光谱也符合预定的公式，虽然在这些光谱中，最内部的硅原子仅在第一代树状聚体中观察到。
关于这些树状聚体的端基的表征，这里，举例来说，在衍生物1-6中描述了这些基团的表征。已经以类似方式进行了化合物的部分中的表征，并且关于它们的每一个的细节反映在该工作的实验部分。
在树状聚体1-6中，对于位于3.64(对于树状聚体1，3和5)和3.74(对于树状聚体2，4和6)的外部片段-OCH2CH2NMe2观察到三重峰，其分配至-OCH2-基团，并且在全部所述情况下另一个以2.43ppm为中心的三重峰对应于-CH2N-基团。在对应于树状聚体2，4和6中的-OCH2-基团的信号中观察到的低场位移与两个氧原子的存在相一致，所述氧原子在这些衍生物中结合到硅原子，虽然对于-CH2N-基团觉察不到该效应。结合到氮的甲基出现在全部情况中，在NMR中分别对于1H和13C在2.23和46.1ppm 。
利用1，8，9-三羟基蒽酚(ditranol)作为基质用质谱法(电雾化或MALDI-TOF MS)实现这些化合物的表征。然而，对于第二和第三代不能观察到分子的峰值，对于许多其它的高分子量树状聚体已经描述了这样的事实。[27，46-49]
实施例13至15.-
实施例13.-1G-[Si(CH 2 ) 3 NH 2 ] 4 (13)的合成
将烯丙胺(1.5ml，19.99mmol)和两滴Karstedt催化剂(3-3.5％Pt)加入到最小量的THF(1ml)的1G-H4(0.54g，1.23mmol)树状聚体溶液中。将反应混合物在真空安瓿中在4h期间加热至120℃，将反应混合物干燥以除去溶剂和过量的烯丙胺，将得到的残渣溶解在CH2Cl2中并用硅藻土和活性炭过滤。将产生的溶液通过真空除去溶液而干燥，产生作为无色油的化合物13(0.90g；83％)。该树状聚体的结构表示在图1b中。
1H-NMR(CDCl3)：2.63(2H，t，CH2N)，1.34(4H，m，SiCH2CH2CH2N和SiCH2CH2CH2Si)，1.13(2H，s，NH2)，0.54-0.44(8H，m，结合到Si的CH2)，-0.06(6H，s，SiMe2)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：45.7(CH2N)，28.3(SiCH2CH2CH2N)，20.2，18.6，17.6，(SiCH2CH2CH2Si)，12.4(SiCH2CH2CH2N)，-3.3(SiMe2).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.50(G0-Si)，1.96(G1-Si).C32H80N4Si5的元素分析.计算的：C，58.14；H，12.21；N，8.48.获得的：C，57.63；H，12.27；N，8.78.电雾化MS：m/z z＝1661.25uma[M+H]+.(计算的661.52uma)。
实施例14.-2G-[Si(CH 2 ) 3 NH 2 ] 8 (14)的合成
从2G-H8(0.42g，0.36mmol)，烯丙胺(2ml，26.7mmol)，1ml的THF和两滴Karstedt催化剂开始，按照类似于对于13所描述的方法制备第二代树状聚体14。在该方法中，产生作为无色油的14(0.32g，55％)。该树状聚体的结构表示在图1b中。
1H-NMR(CDCl3)：2.63(4H，t，CH2N)，1.41-1.28(6H，m，SiCH2CH2CH2Si和SiCH2CH2CH2N)，0.54-0.44(20H，m，结合到Si的CH2)，-0.06(12H，s，SiMe2)，-0.10(3H，s，SiMe)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：45.7(CH2N)，28.4(SiCH2CH2CH2N)，20.2，18.6，17.6，(SiCH2CH2CH2Si)，12.5(SiCH2CH2CH2N)，-3.1(SiMe2)，-4.8(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.92(G1-Si)；2.00(G2-Si).C80H196N8Si13的元素分析.计算的：C，58.75；H，12.08；N，6.85.获得的：C，58.16；H，11.95；N，6.58.电雾化MS：m/z z＝1未观察到，对于z＝2(m/z+1)818.44uma[M+H]+.(计算的.Z＝2818.8uma)。
实施例15.-3G-[Si(CH 2 ) 3 NH 2 ] 16 (15)的合成
从3G-H16(0.100g，0.037mmol)，烯丙胺(2ml，26.7mmol)，1ml的THF和两滴Karstedt催化剂开始，按照类似于对于13所描述的方法制备第三代树状聚体15。在该方法中，产生作为无色油的15(0.085g，64％)。
1H-NMR  (CDCl3)：δ2.63(8H，t，CH2N)，1.41-1.28(22H，m，SiCH2CH2CH2Si和SiCH2CH2CH2N)，0.54-0.44(36H，m，结合到Si的CH2)，-0.06(24H，s，SiMe2)，-0.10(9H，s，SiMe)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：δ45.7(CH2N)，28.4(SiCH2CH2CH2N)，20.2，18.6，17.6，(Si SiCH2CH2CH2Si)，12.5(SiCH2CH2CH2N)，-3.1(SiMe2)，-4，8(SiMe).29Si{1H}-NMR(CDCl3)：δ0.92(G1-Si和G2-Si)；2.00(G3-Si).C176H428N16Si29的元素分析.计算的：C，58.98；H，12.04；N，6.25.获得的：C，58.06；H，11.84；N，6.48。
实施例16至27.-
实施例16.-1G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - )] 4 (16)的合成
将0.4ml的乙醚(0.8mmol)中的2M MeI溶液加入到乙醚(10ml)中的1(0.12g，0.15mmol)的溶液。将反应混合物在环境温度下在持续搅拌下保持48h，然后，将它干燥以除去过量MeI。将得到的残渣用Et2O(2×5ml)洗涤并真空干燥而产生作为白色固体的化合物16(0.20g，96％)。
1H-NMR(DMSO)：3.94(2H，m，CH2O)，3.43(2H，m，CH2N)，3.09(9H，s，NMe3 +)，1.29(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.66(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.56(2H，m，CH2Si)，0.11(6H，s，OSiMe2).13C{1H}-NMR(DMSO)：65.8(CH2N)，55.8(CH2O)，52.6(NMe3 +)，19.7(SiCH2CH2CH2SiO)，16.9，16.1(SiCH2CH2CH2SiO)，-2.6(OSiMe2).C40H100N4O4Si5I4的元素分析.计算的：C，35.61；H，7.47；N，4.15.获得的：C，36.67；H，7.65；N，4.42。
实施例17.-1G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 ] 4 (17)的合成
从2(0.17g，0.16mmol)和0.80ml的乙醚中的2M MeI溶液(1.6mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第一代树状聚体17。在该方法中，产生作为白色固体的17(0.29g，86％)。
1H-NMR(DMSO)：.4.12(4H，m，CH2O)，3.54(4H，m，CH2N)，3.17(18H，s，NMe3 +)，1.29(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.75(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.54(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.20(3H，s，OSiMe).13C{1H}-NMR(DMSO)：.65.8(CH2N)，56.0(CH2O)，52.7(NMe3 +)，17.3(SiCH2CH2CH2SiO)，16.5，15.9(SiCH2CH2CH2SiO)，-5.3(OSiMe).C56H140N8O8Si5I8的元素分析.计算的：C，30.44；H，6.39；N，5.07.获得的：C，31.47；H，6.47；N，5.19。
实施例18.-合成2G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - )] 8 (18)
从3(0.25g，0.13mmol)和0.6ml的乙醚中的2M MeI溶液(1.2mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第二代树状聚体18。在该方法中，产生作为白色固体的化合物18(0.35g，87％)。
1H-NMR(DMSO)：.3.96(4H，m，CH2O)，3.45(4H，m，CH2N)，3.11(18H，s，NMe3 +)，1.29(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.65(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.52(8H，m，SiCH2的部分)，0.11(12H，s，OSiMe2)，-0.10(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(DMSO)：.65.7(CH2N)，55.9(CH2O)，52.6(NMe3 +)，19.7，17.5，16.9和重叠信号(-CH2-基团的部分)，-2.5(OSiMe2)，-5.3(SiMe).C96H236N8O8Si13I8的元素分析.计算的：C，38.29；H，7.9；N，3.72.获得的：C，38.87；H，8.32；N，3.79。
实施例19.-2G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 ] 8 (19)的合成
从4(0.10g，0.04mmol)和0.5ml的乙醚中的2M MeI溶液(1.0mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第二代树状聚体19。在该方法中，产生作为白色固体的化合物19(0.17g，87％)。
1H-NMR(DMSO)：.(ppm)4.13(8H，m，CH2O)，3.56(8H，m，CH2N)，3.19(36H，s，NMe3 +)，1.28(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.72(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.55(8H，m，SiCH2的部分)，0.21(6H，s，OSiMe)，-0.08(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(DMSO)：65.7(CH2N)，56.0(CH2O)，52.7(NMe3 +)，19.2，17.2，16.4和重叠信号(-CH2-基团的部分)，-5.2(OSiMe)，-5.6(SiMe).C128H316N16O16Si13I16的元素分析.计算的：C，32.49；H，6.73；N，4.74.获得的：C，33.32；H，7.03；N，4.72。
实施例20.-3G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - )] 16 (20)的合成
从5(0.12g，0.03mmol)和0.4ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.8mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第三代树状聚体20。在该方法中，产生作为白色固体的化合物20(0.16g，83％)。
1H-NMR(DMSO)：3.96(8H，m，CH2O)，3.47(8H，m，CH2N)，3.13(36H，s，NMe3 +)，1.28(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.65(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.52(20H，m，SiCH2的部分)，0.10(24H，s，OSiMe2)，-0.08(9H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(DMSO)：.65.8(CH2N)，55.9(CH2O)，52.6(NMe3 +)，19.7，17.2，16.0和重叠信号(-CH2-基团的部分)，-2.7(OSiMe2)，-5.5(SiMe).C96H236N8O8Si13I8的元素分析.计算的：C，39.43；H，8.08；N，3.54.获得的：C，39.19；H，8.19；N，3.68。
实施例21.-3G-[Si(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 ] 16 (21)的鉴定
从6(0.060g，0.012mmol)和0.2ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.4mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第三代树状聚体21。1H-NMR光谱具有宽信号并且显示大约90％的末端氨基已经被季铵化，为此目的，化合物21不是分离纯的。
1H-NMR(DMSO)：δ4.16(16H，m，OCH2)，3.60(16H，m，CH2N)，3.22(72H，s，NMe3 +I-)，1.27(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.52(26H，m，SiCH2CH2CH2SiO和-CH2-基团的部分)，0.07(24H，s宽，SiMe2)，没有观察到对应于SiMe的信号，因为它与前一信号出现重叠。
实施例22.-1G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3.5-(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 )] 4 (22)的合 成
从7(0.1g，0.06mmol)和0.35ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.7mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第一代树状聚体22。在该方法中，产生作为白色固体的化合物22(0.14g，90％)。
1H-NMR(DMSO)：6.55(3H，m，C6H3)；4.58(2H，s，CH2OSi)；4.42(4H，t，CH2O-C6H3)；3.77(4H，t，CH2N)；3.18(18H，s，NMe3 +)；1.35(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.70(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.57(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.08(6H，s，SiMe2).13C{1H}-NMR(DMSO)：.157.8(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)；143.2(C6H3，结合到CH2OSi的Cipso)；104.9和99.6(C6H3)；63.5(CH2NMe2)；63.0(CH2OSi)；61.3(CH2O-C6H3)；52.7(+NMe3)，19.9(SiCH2CH2CH2SiO)；16.9，16.1(SiCH2CH2CH2SiO)；-2.4(SiMe2).C88H172I8N8O12Si5的元素分析.计算的：C，39.29；H，6.44；N，4.17.获得的：C，38.90；H，6.24；N，4.09。
实施例23.-2G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 )] 8 (23)的合 成
从8(0.08g，0.023mmol)和0.20ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.4mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第二代树状聚体23。在该方法中，产生作为白色固体的化合物23(0.11g，85％)。
1H-NMR(DMSO)：6.58(6H，m，C6H3)；4.58(4H，s，CH2OSi)；4.44(8H，t，CH2O-C6H3)；3.79(8H，t，CH2N)；3.20(30H，s，NMe3 +)；1.33(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.67(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.54(8H，m，结合到Si的CH2)，0.07(12H，s，OSiMe2)，-0.07(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(DMSO)：157.9(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)；143.2(C6H3，结合到CH2OSi的Cipso)；105.2和99.6(C6H3)；63.5(CH2NMe2)；63.0(CH2OSi)；61.4(CH2O-C6H3)；52.7(NMe3 +)，19.8(SiCH2CH2CH2SiO)；17.5，16.8(SiCH2CH2CH2SiO和与SiCH2CH2CH2Si的重叠信号)；-2.4(OSiMe2)；-5.5(SiMe).C192H380I16N16O24Si13的元素分析.计算的：C，40.51；H，6.73；N，3.94.获得的：C，41.20；H，7.02；N，4.10。
实施例24.-3G-[Si(OCH 2 -(C 6 H 3 )-3，5-(OCH 2 CH 2 NMe 3 + I - ) 2 )] 16 (24)的合 成
从9(0.084g，0.012mmol)和0.25ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.5mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第三代树状聚体24。在该方法中，产生作为白色固体的化合物24(0.080g，72％)。
1H-NMR(DMSO)：.6.57(12H，m，C6H3)；4.58(8H，s，CH2OSi)；4.44(16H，t，CH2O-C6H3)；3.78(16H，t，CH2N)；2.28(72H，s，NMe3 +)；1.33(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.69(8H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.55(18H，m，结合到Si的CH2)，0.08(24H，s，OSiMe2)，-0.08(9H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：158.0(C6H3，结合到OCH2CH2NMe2的Cipso)；143.2(C6H3，结合到CH2OSi的Cipso)；104.9和100.12(C6H3)；63.4(CH2O-C6H3)；63(CH2OSi)；61.4(CH2NMe2)；52.7(NMe3 + 3)，19.9(SiCH2CH2CH2SiO)；17.5，16.8(SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si的重叠信号)；-2.3(OSiMe2)，-5.5(SiMe).C384H748I16N32O48Si29的元素分析.计算的：C，48.92；H，8；N，4.75.获得的：C，47.60；H，7.02；N，4.35。
实施例25.-1G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 3 + I - )] 4 (25)的鉴定
从10(0.043g，0.047mmol)和0.094ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.188mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第一代树状聚体25。在该方法中，产生作为白色固体的化合物25。该化合物不是分离纯的，由于两个氮原子都可以参与的非选择性季铵化方法，观察到混合物，虽然化合物25是该混合物的主要组分。
1H-NMR(DMSO)：3.98(2H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.60(2H，t，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.42(2H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.11(9H，s，NMe3 +I-)，2.76(2H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，2.21(3H，s，NMe)，1.30(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.61(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.53(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.04(6H，s，SiMe2).13C{1H}-NMR(CDCl3)：64.8(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，61.0(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，59.5(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，58.3(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，52.2(NMe3 +I-)，41.3(NMe)，20.0(SiCH2CH2CH2SiO)，16.9和16.1(SiCH2CH2CH2SiO)，-2.5(SiMe2)。
实施例26.-2G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 3 + I - )] 8 (26)的鉴定
从11(0.19g，0.08mmol)和0.34ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.68mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第二代树状聚体26。在该方法中，产生作为浅黄色固体的化合物26。该化合物不是分离纯的，由于两个氮原子都可以参与的非选择性季铵化方法，观察到混合物，虽然化合物26是该混合物的主要组分。
1H-NMR(DMSO)：4.02(4H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.60(4H，t，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.42(4H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.11(18H，s，NMe3 +I-)，2.76(4H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，2.21(6H，s，NMe)，1.30(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.59(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.51(8H，m，-CH2-基团的部分)，0.03(12H，s，SiMe2)，-0.11(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(CDCl3)：64.9(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，61.0(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，59.6(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，58.3(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，52.3(NMe3 +I-)，41.3(NMe)，20.0-16.8(碳硅烷骨架的-CH2-基团)，-2，5(SiMe2)，-5，5(SiMe)。
实施例27.-3G-[Si(O(CH 2 ) 2 N(Me)(CH 2 ) 2 NMe 3 + I - )] 16 (27)的鉴定
从20(0.084g，0.017mmol)和0.13ml的乙醚中的2M MeI溶液(0.27mmol)开始，按照类似于对于16所描述的方法制备第三代树状聚体27。在该方法中，产生作为浅黄色固体的化合物27。该化合物不是分离纯的，由于两个氮原子都可以参与的非选择性季铵化方法，观察到混合物，虽然化合物27是该混合物的主要组分。
1H-NMR(DMSO)：δ3.99(8H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.60(8H，t，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.44(8H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，3.12(36H，s，NMe3 +I-)，2.76(8H，m，OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，2.22(12H，s，NMe)，1.28(14H，m，SiCH2CH2CH2SiO和SiCH2CH2CH2Si)，0.51(26H，m，SiCH2CH2CH2Si O和-CH2-基团的部分)，0.03(24H，s，SiMe2)，-0.11(9H，s，SiMe).13C{1H(-NMR(CDCl3)：δ64.9(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，61.0(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，59.6(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，58.3(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I-)，52.3(NMe3 +I-)，41.3(NMe)，20.0-16.8(碳硅烷骨架的基团-CH2-)，-2，5(SiMe2)，-5，5(SiMe)。
在第三代树状聚体21，24和27的情况下，如由1H-NMR谱所表示，甚至在过量MeI存在下并将反应保持在更长的时期内，二甲基氨基的季铵化也是不完全的，从所述谱可以近似地估计在这些络合物中约90％的末端二甲基氨基已经被季铵化。
全部这些离子的衍生物在典型的有机溶剂中是不溶的，但是溶于DMSO，MeOH和H2O。
衍生物16-27的光谱和分析的信息与显示在图2a中的假定结构一致。出现在这些衍生物的1H-NMR谱中的信号，在环境温度在作为溶剂的DMSO中作出的，比它们在普通有机溶剂中的前体的信号更宽。对于其它水溶性碳硅烷树状聚体，已经在以前描述了该事实，并且已经将它解释为偶极展宽的作用，是这些主要是疏水树状聚体的迁移率降低的结果[29]。
虽然观察到增加所述代时信号展宽的增加，树状聚体16-27的1H和13C NMR谱也具有与它们的前体1-12的那些相同的对于碳硅烷骨架的共振模式。
如同具有末端氨基的树状聚体，对于这些衍生物，这里它详细描述了仅对于衍生物16-21的外部基团的信号分配，已经以类似方式在衍生物的部分中进行了分配。
外部基团SiOCH2CH2NMe3 +I-，以可归属到-OCH2-基团的亚甲基质子的3.94(对于树状聚体16，18和20)或4.12(对于树状聚体17，19和21)为中心和可归属到片段-CH2N-的质子的3.45(对于树状聚体16，18和20)或3.56(对于树状聚体17，19和21)为中心产生宽的多重峰。所述氨基的季铵化产生-OCH2-信号中的0.3-0.4ppm的低场位移，而-CH2N-基团的亚甲基质子大约位移1ppm。直接结合到氮的甲基分别给出3.18和52.6ppm为中心的1H和13C NMR信号，关于以氨基终止的树状聚体1-6中观察到的信号，假定低场位移。这些变化与以铵基终止的树状聚体16-21中的氮原子上的正电荷的存在相一致。
实施例28至30.-
实施例28.-G 1 [Si(CH 2 ) 3 NH 3 + Cl - ] 4 (28)的合成
将1.2ml(1.2mmol)的Et2O中的1M的HCl溶液加入到40ml的Et2O中的化合物13(0.17g，0.26mmol)的溶液。将反应在环境温度并且在持续搅拌下保持2h，其后观察到白色沉淀的出现。在真空中除去溶剂和过量的HCl并且在该方法中，以定量收率产生作为白色固体的28。该树状聚体的结构表示在图2b中。
1H-NMR(D2O)：.2.74(2H，t，CH2N)，1.45(2H，m，SiCH2CH2CH2N)，1.19(2H，m，SiCH2CH2CH2Si)，0.38(6H，t，CH2Si)，-0.19(6H，s，SiMe2).13C{1H}-NMR(D2O)：42.0(CH2N)，21.3(SiCH2CH2CH2N)，18.8，18.0，16.6(SiCH2CH2CH2Si)，11.2(SiCH2CH2CH2N)，-4.4(SiMe2).C32H84N4Cl4Si5的元素分析.计算的：C，47.61；H，10.49；N，6.94.获得的：C，48.57；H，10.46；N，6.82。
实施例29.-2G-[Si(CH 2 ) 3 NH 3 + Cl - ] 8 (29)的合成
从14(0.09g，0.05mmol)和0.6ml的乙醚中的1M HCl溶液(0.06mmol)开始，按照类似于对于28所描述的方法制备第二代树状聚体29。在该方法中，产生作为浅黄色固体的化合物29(0.06g；55％)。该树状聚体的结构表示在图2b中。
1H-NMR(D2O)：.2.74(2H，t，CH2N)，1.47(2H，m，SiCH2CH2CH2N)，1.16(4H，m，SiCH2CH2CH2Si)，0.38(16H，t，CH2Si)，-0.19(6H，s，SiMe2).-0.22(3H，s，SiMe).13C{1H}-NMR(D2O)：42.0(CH2N)，21.8(SiCH2CH2CH2N)，2.5-17.0(SiCH2CH2CH2Si)，12.01(SiCH2CH2CH2N)，3.23(SiMe2)，-4.2(SiMe2).C80H204N8Cl8Si13的元素分析.计算的：C，49.86；H，10.67；N，5.81.获得的：C，49.79；H，10.18；N，5.76。
实施例30.-3G-[Si(CH 2 ) 3 NH 3 + Cl - ] 16 (30)的合成
从15(0.060g，0.018mmol)和0.30ml的乙醚中的1M HCl溶液(0.30mmol)开始，按照类似于对于28所描述的方法制备第三代树状聚体30。在该方法中，产生作为浅黄色固体的化合物30(0.054g，78％)。
1H-NMR(D2O)：δ2.74(8H，t，CH2N)，1.45(8H，m，SiCH2CH2CH2N)，1.20(14H，m，SiCH2CH2CH2Si)0.39(36H，m，结合到Si的CH2)，-0.19(24H，s，SiMe2)，-0.10(9H，s，SiMe)，13C{1H}-NMR(CDCl3)：δ42.0(CH2N)，21.3(SiCH2CH2CH2N)，18.9，17.9，16.5，(SiCH2CH2CH2Si)，11.3(SiCH2CH2CH2N)，-4.4(SiMe2)，-4.8(SiMe).C176H444N16Si29的元素分析.计算的：C，55.44；H，11.74；N，5.88.获得的：C，56.16；H，11.98；N，6.01。
新的树状聚体的生物相容性研究，结合至聚阴离子和血浆蛋白质的表征和所述树状合物的生物学行为
如上所示，本发明的方面之一是由药物组合物构成的，所述药物组合物含有至少一种本发明的树状聚体，或者连同它伴随的那个/那些的阴离子特征和药物兴趣的另一种/其它的物质作为载体，以促进在血液流动中输送至靶细胞，其中它/它们必须发挥它们的作用，保护它/它们免受与它们可以结合到的血浆蛋白质的相互作用，或者其可以影响它们的稳定性，或者作为具有与引起疾病的微生物的生活周期相互作用能力的活性物质，目的是通过本发明的一个或多个树状聚体预防、减少或除去所述疾病的作用。在本发明所述方面的优选实施方案之一中，本发明的一个或多个树状聚体用作载体的阴离子特征的分子是寡脱氧核糖核苷酸(ODN)，优选反义ODN，或更大长度的双链DNA分子或干扰RNA。本发明的树状聚体或含有它们的组合物预防或治疗由病原体或基因失效所引起的疾病的应用也是本发明的方面。
因此，决定测试新的提出的树状聚体的生物相容性，表征它们对于聚阴离子和血浆蛋白质的结合并且分析在本发明的树状聚体和选择的聚阴离子之间形成的树状聚体-类型的络合物的生物学行为。进行这些测试所选择的树状聚体是：
树状聚体：
IM8：                                IM16：
2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)]8(18)         2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)2]8(19)
分子量＝3011g/mol                    分子量＝4731.59g/mol
8个正电荷                            16个正电荷
Figure A20068002687100701
Phe：
2G-[Si(OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2NMe3 +I-)2)]8(23)
Mw＝5692.80g/mol
16个正电荷
Figure A20068002687100702
NN：                            CINH4：
2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +I-)]8(26)  2G-[Si(CH2)3NH3 +Cl-]8(29)
分子量＝3468.08g/mol            分子量＝1927.6g/mol
8个正电荷                       8个正电荷
SF(Superfect
Figure A20068002687100712
(活化的PAMAM树状聚体，恰根公司(Qiagen)，Crawley，GB)
140个末端氨基
Mw＝35.000
Figure A20068002687100713
G4：(第4代PAMAM树状聚体；奥德里奇化学品公司(AldrichChemical Co.)，密尔沃基(Milwaukee)，WI)
140个末端氨基酸
分子量＝14.215
最后两种，Superfect和G4，是商业的PAMAM树状聚体，将其作为对于本发明的碳硅烷树状聚体的比较使用。
CBS的物理化学性质：水溶性
本发明的全部碳硅烷树状聚体在对于起始溶液所使用的浓度(2mg/ml)通过温和搅拌是水溶性的，不需要加热。
为了实施所述实验，将使用的全部CBS以起始浓度(2μg/μl≡2mg/ml)悬浮。
实施例31：CBS和ODN之间的络合物形成
-使用的ODN
使用的寡核苷酸序列是针对HIV RNA的反义序列(互补的)。长度从15至28个碱基变化，具有硫代磷酸酯属性。使用的特定ODN和它们的序列在表1中显示如下。
表1.-使用的ODN
  名称   反义序列5′-3′   碱基数   分子量g/mol
  A)GF(抗-gag)   CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT(SEQ ID NO：1)   25   8112.5
  B)RF(抗-Rev)   TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCA(SEQ ID NO：2)   28   9086.0
  C)PPT(抗mRNA)   AATTTTCTTTTCCCCCCT(SEQ ID NO：3)   18   5841.0
  D)PPT-TFO(三螺旋   TTTTCTTTTGGGGGG(SEQ ID NO：4)   15   4867.5
  前体)
  E)TAR(抗-TAR)   GCTCCCGGGCTCGACC(SEQ ID NO：5)   16   5192.0
使用的部分ODN在5’端发荧光。这是通过将字母F加入到它的符号而表示的。因而，“GF”指的是在5’端发荧光的抗-gag ODN，而“RF”指的是在5’端发荧光的抗-Rev ODN。
使用的全部ODN以1μg/μl的浓度再悬浮。
-琼脂糖凝胶中的络合物显示
琼脂糖凝胶用于研究PAMAM类型的树状聚体和血浆DNA或用其同位素标记形式的ODN之间的络合物形成是已知的。基于这类方法，对凝胶进行尝试，所述凝胶容许研究该性质，如有可能，不使用放射性同位素。
将不同的琼胶糖浓度用于显示ODN和树状合物的迁移，倾向使用具有小尺寸的ODN。最终，TAE 1x中3％的琼胶糖浓度被选为最佳。非荧光的ODN的迁移可与发荧光的ODN相比，二者在相同高度迁移但是后者相当大地增加感知信号。利用它们，它因而避免ODN的同位素标记。制造双孔以制备这些凝胶，容许60μl的装载体积，其中50μl是RPMI中样品混合物的体积并且10μl是含有甘油的装载缓冲液。作为大小标记物，使用100个碱基对的序列梯(Gibco公司(Gibco)BRL)。
-络合物形成
对于凝胶和细胞上进行的全部所述试验中的络合物形成，采用所述络合物中正负电荷数量之间的比例。如由不同的作者在用PAMAM树状聚体的研究中所公布，必要的是，形成的络合物具有过量的正电荷以促进它结合到带负电荷的细胞膜糖蛋白，因而启动胞吞过程。同样地，加入过量的正电荷以确保树状聚体-DNA络合物的形成。因此，与负电荷(由ODN所提供)相比较，以过量的正电荷(由CBS提供)数量的形式形成CBS树状聚体和不同的核酸之间的络合物。然而，试验不同的电荷比，使所述计算基于树状聚体电荷数量(固定的)和ODN的负电荷数量(也是固定的)。将2/1比例的正/负电荷充分固定在全部树状聚体中以形成具有总正电荷的络合物，虽然在一些实验中提供与正电荷相等数量的负电荷的平衡或过量负电荷。
对于SF，使用由制造商提出的电荷比，并且对于G4PAMAM，有利的是使用100比1的摩尔过量的PAMAN类型的树状聚体，根据由Sato等所提出的。(临床癌症研究(Clin Cancer Res)2001年11月；7(11)：3606-12)。
在全部所述试验中，使用不含RPMI血清的酚红作为支持介质，使用60μl的络合物形成体积。
-形成的络合物的电泳
使用本发明的树状聚体IM8，ClNH4，NN，Phe和IM16测试络合物形成。
用从不同的ODN和不同的树状聚体的混合物得到的样品进行的电泳结果显示在图3中。不同的凝胶中出现的装载样品如下：
IM8：
-图3a.IM8和ODN GF之间的络合物形成。进行电泳的样品如下：
泳道1：100bp序列梯
泳道2：4μl GF+4.52μl IM8+91.48μl RPMI(+/-)＝2/1
泳道3：4μl GF+9.03μl IM8+86.97μl RPMI(+/-)＝4/1
泳道4：4μl GF+45.2μl IM8+50.8μl RPMI(+/-)＝20/1
泳道5：4μl GF+90.4μl IM8+5.6μl RPMI(+/-)＝40/1
泳道6：4μl GF+96RPMI
泳道7：4.52μl IM8+95.48μl RPMI
泳道8：9.03μl IM8+90.97μl RPMI
泳道9：45.2μl IM8+54.8μl RPMI
泳道10：90.4μl IM8+9.6μl RPMI
电泳的结果表明IM8能够保留DNA。电荷越大，络合物对于负极迁移越多，直到达到不管增加多少正电荷(树状聚体的数量)它也不再向上移动的极限(很可能全部DNA分子已经与CBS-IM8形成络合物或者因为凝胶孔隙的尺寸不容许它)。
-图3b：含有不同尺寸的IM 8和ODNs(电荷比2/1)的样品的电泳。进行电泳的样品如下：
泳道1：100bp序列梯
泳道2：RF：4.5μl+56μl RPMI
泳道3：RF：4.5μl+5.3μl IM8+50μl RPMI
泳道4：PPT 3μl+57μl RPMI
泳道5：PPT 3μl+3.4μl IM8+54μl RPMI
泳道6：PPT-TFO 2.5μl+58μl RPMI
泳道7：PPT-TFO 2.5μl+2.8μl IM8+55μl RPMI
泳道8：TAR 2.6μl+57μl RPMI
泳道9：TAR 2.6μl+3μl IM8+55μl RPMI
-电泳的结果显示IM 8能够保留全部ODN的迁移。这首次指出，ODNs的长度不是络合物形成的决定因素。
CINH4
-图3c.ClNH4和ODN RF之间的络合物形成。进行电泳的样品如下：
泳道1：RPMI对照
泳道2：RF 4.5μl+3.3μl ClNH4+52μl RPMI(+/-)＝2
泳道3：RF 4.5μl+55μl RPMI
泳道4：RF 2.25μl+3.3μl ClNH4+55μl RPMI(+/-)＝4
泳道5：RF 2.25μl+58μl RPMI
泳道6：RF 1.28μl+3.3μl ClNH4+56μl RPMI(+/-)＝7
泳道7：RF 1.28μl+58μl RPMI
泳道8：3.3μl ClNH4+57μl RPMI
泳道9：100bp序列梯
根据产生的结果，ClNH4也能够保留具有全部所评价的电荷比的DNA。
NN和Phe
-图3d.ODN RF和NN或Phe树状聚体之间的络合物形成。进行电泳的样品如下：
泳道1：4.5μl RF+6μl G2NN+50μl RPMI(+/-)＝2
泳道2：4.5μl RF+21μl G2NN+35μl RPMI(+/-)＝7
泳道3：1.3μl RF+6μl G2NN+53μl RPMI(+/-)＝7
泳道4：2.25μl RF+3μl G2NN+55μl RPMI(+/-)＝2
泳道5：2.25μl RF+10.5μl G2NN+48μl RPMI(+/-)＝7
泳道6：0.64μl RF+3μl G2NN+56μl RPMI(+/-)＝7
泳道7：2.25μl RF+57μl RPMI
泳道8：4.5μl RF+5μl G2Phe+55μl RPMI(+/-)＝2
泳道9：4.5μl RF+17.5μl G2Phe+38μl RPMI(+/-)＝7
泳道10：1.3μl RF+5μl G2Phe+54μl RPMI(+/-)＝7
泳道11：2.25μl RF+2.5μl G2Phe+55μl RPMI(+/-)＝2
泳道12：2.25μl RF+8.75μl G2Phe+50μl RPMI(+/-)＝7
泳道13：0.64μl RF+2.5μl G2Phe+57μl RPMI(+/-)＝7
该电泳的结果也表明，NN和Phe也都能够与ODN形成络合物。
IM16
-图3e.ODN PPT，IM8和IM16树状聚体和形成所述树状聚体的相应单体之间的络合物形成。进行电泳的样品如下：
泳道1：100bp序列梯
泳道2：PPT 2.57μl+3μl IM8+54μl RPMI
泳道3：PPT 2.57μl+2.35μl IM 16+55μl RPMI
泳道4：PPT 2.57μl+1.8μl单体+55μl RPMI
泳道5：PPT 2.57μl+57μl RPMI
在含有ODN和IM 16树状聚体的样品在其中运行的泳道中，后者也能够保留DNA。
因此，第二代CBS测试能够保留DNA对于正极的迁移，这是在全部情况下在CBS和ODN之间静电形成的形成的反映：试验的小代的CBS不妨碍保留DNA。不含DNA的树状聚体，对于它们的部分，发出弱的几乎觉察不到的信号。
-络合物形式的树状聚体的完整性研究
用于该工作的CBS的合成方法从普通结构的初始核开始，通过利用不同的官能团终止在周边中的官能化，其是提供正电荷到树状聚体并且确定它们之间差异的那些，所述树状聚体核是非极性属性的。因为用于树状聚体核的官能团的一些键在水溶液中可以是不稳定的，进行试验以确定DNA是否保留在琼脂糖凝胶中，并且，因此，CBS和DNA之间的络合物形成可以是由于保存的全部树状聚体结构或相反，末端官能团从树状聚体核的部分离开，造成DNA保留。对此，使用凝胶，其中在ODNs和完整的CBS和在ODNs和末端官能团之间推测形成的那些之间形成络合物，碳硅烷骨架已经官能化了所述末端官能团，在该情况下是季铵化的二甲基乙醇胺。如前已经说明，那些结合到树状聚体作为末端官能团的带正电荷的分子是给予树状聚体其电荷的那些。作为对照，比较了ODN-树状聚体的混合物，ODN-单体和单独的ODN。相应的凝胶显示在图3e中，对其已经进行了提及，其中比较并进行电泳的样品如下：
Calle1：100bp序列梯
泳道2：含有RPMI培养基而没有树状聚体或寡核苷酸的对照
泳道3：PPT 2.57μl+3μl IM8+54μl RPMI
泳道4：PPT 2.57μl+2.35μl IM 16+55μl RPMI
泳道5：PPT 2.57μl+1.8μl单体+55μl RPMI
泳道6：PPT 2.57μl+57μl RPMI
该试验的结果清楚地显示，完全的树状聚体结构是保留DNA所必需的，单体是不能的，尽管它们的保留DNA的正电荷。因此，在这些浓度，所述树状聚体结构将全部保持。
实施例32：树状合物在不同的pH的稳定性
在不同pH的络合物上进行稳定性研究，以确定pH的改变将如何影响所述络合物，因为存在不同的解剖学、组织或细胞局部化，其中pH酸化或碱化。实例是胃环境的酸，小肠的胰腺分泌的碱，或在细胞水平，核内体-lisosome行为，在那里它从生理pH(7.35-7.45)改变至4左右的酸性pH。因此，有趣的是，已知在什么pH范围，DNA络合物可以与使用的不同CBS一起保持。按照惯常方法形成所述络合物并且以的不同pH的不同溶液过量增加体积。
因此，对于树状聚体Phe、ClNH4、NN、IM8和IM16的每一个，根据实施例31，制备了7种用PPT形成的树状合物的溶液，以2/1电荷比并且以下列pH：2.8；2.7；4.7；5.7；6.4；7.4；8：
产生的结果显示在图4出现的电泳凝胶中，其中正常ODN迁移带的高度在所述凝胶的底部用箭头显示。按照增加的pH次序从左至右装载样品。无样品形成在用X表示的孔中。
依照产生的结果，虽然在树状聚体ClNH4和Phe和ODN之间形成的络合物在全部试验pH是稳定的，但是在NN和ODN之间形成的络合物在酸性pH(小于5.7)是不稳定，如孔中ODN迁移区域中的信号外观所示，在对应于图4b的凝胶中用箭头表示。在IM8和IM16的情况下，发生类似的某事：IM8-ODN络合物在pH＜4.7离解；用IM 16形成的那些在pH＜5.7离解。然而，在碱性pH，全部络合物是稳定的，因为没有信号出现在对应于pH7.4和pH8的泳道中。
这指的是，在酸性环境(胃，核内体-lisosome)中，CBS NN、CBSIM8和CBS IM16与ODN之间的络合物将逐渐释放ODN。该事实对于需要控制释放pH-依赖的ODN的那些应用将是有益的。它也指的是，如果树状聚体仍在结合到ODN的细胞内部，当它进入核内体-lisosome隔室时，它将破裂。相反，在碱性环境(小肠液)中，它将保持稳定。
实施例33：树状合物在水溶液中随时间的稳定性
在水溶液中制备不同的树状合物的样品，其根据实施例31以2/1电荷比在ODN PPT和树状聚体IM8，IM16和NN之间形成，并且在自从样品制备的不同时间以后进行电泳，具体而言是0小时、6小时和24小时。在那些时间期间，将树状合物保持在模仿生理条件的条件下：37℃，在5％CO2气氛中。结果显示在图5中，其中对应于0小时样品的图5a的凝胶，对应于6小时以后的样品的图5b和对应于24小时以后的样品的图5c。在三种情况下，a，b和c，样品按照该次序出现在泳道中：
泳道1：100bp序列梯
泳道2：IM8+PPT
泳道3：IM16+PPT
泳道4：NN+PPT
泳道5：PPT
所述凝胶显示，随着时间，存在ODN从树状聚体的逐步释放，所述树状合物用三种被评价的树状聚体形成。对于它在聚阴离子的延迟释放中的用途，这是一个良好的指标。
实施例34：树状合物在蛋白质和洗涤剂存在下的稳定性
结合到血浆蛋白质是用ODN治疗面临的障碍之一。所述结合降低ODN的生物利用度，必需更大的剂量才能发挥所需的生物效应。本节目的是分析介质中蛋白质的存在对于所述络合物稳定性的影响，并且这是否可以以任何方式防止ODN结合到血浆蛋白质。用CBS NN进行这些研究并且分析在牛血清清蛋白(BSA)和阴离子洗涤剂PBS存在下形成的树状合物的行为。
进行为树状聚体/ODN比例为2/1所必需的计算，并且制备下列样品，目的是将树状合物暴露于不同浓度的牛血清清蛋白、含有胎牛血清的完全培养基或AB完全人血清的存在下。测试产生的不同的混合物在相同的3％琼脂糖凝胶上的DNA和蛋白质迁移，溴化乙啶在所述琼脂糖凝胶的组成中。首先，对暴露于紫外线的凝胶拍照，然后将它用0.5％的Paragon蓝着色溶液(8-氨基-7-(3-硝基苯偶氮基)-2-(苯甲酰甲基)-1-萘酚-3，6-二磺酸钠盐，贝克曼(Beckman)Coulter
Figure A20068002687100791
)染色20分钟(染色以显示蛋白质的存在)，并且最终将所述凝胶用10％冰醋酸洗涤物脱色，随后用数字照相机拍照。结果显示在图6中，其中部分a对应于用Paragon蓝的染色，并且部分b对应于用紫外线拍的凝胶照片。样品以下列次序出现：
泳道：100bp序列梯
泳道1：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI
泳道2：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl PBS-BSA 2％
泳道3：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl PBS-BSA 5％
泳道4：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl PBS-BSA 10％
泳道5：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl SDS 0.5％
泳道6：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl SDS 1％
泳道7：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl SDS 2％
泳道8：2.60μl TAR+3.47μl NN+25μl RPMI+30μl完全培养基
泳道9：2.60μl TAR+27μl RPMI+30μl PBS-BSA 10％
泳道10：2.60μl TAR+27μl RPMI
首先，可以观察到，在全部孔(除了用SDS处理的)中，暗带出现在游离的ODN和所述孔之间：它们是Paragon蓝与装载缓冲液中存在的溴酚蓝的络合物。而且，在其中存在清蛋白的全部泳道中，出现对应于它的染色的斑点。
依照凝胶中显示的结果，可以得出下列结论：
A)ODN与清蛋白形成络合物，对此那里在凝胶中对应一个用溴化乙啶染色的条带，其已经围绕它标记。
B)递增的清蛋白浓度不能离解所述络合物(2，3，4)。而且，清蛋白不应该从树状聚体-DNA络合物螯合ODN，因为，否则，它将迁移到圆圈的高度。
C)所述络合物在以全部测试浓度的阴离子洗涤剂(SDS)存在下离解。
实施例35：NN-ODN树状合物在血清存在下的稳定性
为了观察树状合物在血清存在下随时间的稳定性，进行试验，其中将样品添加至含有10％胎牛血清(FCS)的完全培养基。用TAR制备下列样品作为ODN：
Figure A20068002687100801
4.TAR 2.59μL+54μL RPMI
如所示，在它的制备20分钟以后，将100μl完全培养基添加到样品1，2和3。从每个样品，在40分钟、4小时和17小时以后，取45μl等分部分，并且将它们在琼脂糖凝胶中进行电泳。按照从左至右编号的顺序，将样品装载在凝胶中，具有预先定位的100bp序列梯标记物。在最后的点(17小时)，针对不含NN的ODN仅测试2/1比例的络合物。所述结果显示在图7中，其中那里在对应于以2/1的比例含有TAR+NN的样品的每个孔上出现日期。
从预先提到的细节，可以得出下列观察：
a)在40min以后，可以看出仅2/1的电荷比能够完全保留ODN，1/1当然还有0.5/1的比例是不可能的。
b)在17h以后，NN树状聚体释放对于阳极迁移的ODN。
c)完全培养基的蛋白质不干扰所述络合物的稳定性。另一方面，释放的ODN在单独的ODN的同一平面上迁移，这表明ODN不与存在于培养基(10％胎牛血清，抗生素和L-谷氨酰胺)中的任何蛋白质形成任何络合物。
简言之，在10％FCS存在下，络合物和ODN表现如同对于仅含有RPMI的混合物所用的培养基，不与血浆蛋白质形成络合物，并且在17h以后NN释放至ODN。
然后检验络合物和ODN如何在人血清存在下表现。为此，用人血清AB进行研究。
首先，在人血清存在下检验不含树状聚体的ODN的行为。为了进行这个，将具有下列组成的样品进行电泳：
泳道0：100bp序列梯
泳道1：对照(血清AB)
泳道2.2.6μL TAR+17μL RPMI+40μL血清AB
泳道3.2.6μL TAR+37μL RPMI+20μL血清AB
泳道4.2.6μL TAR+47μL RPMI+10μL血清AB
泳道5.2.6μL TAR+57μL RPMI
在凝胶中装载样品以前，在等待20分钟用于ODN与血清蛋白质良好的相互作用以后，产生的电泳凝胶显示在图8中。在这个中，部分a显示通过用溴化乙啶染色，用紫外线产生的带的外观照片，并且部分b显示用Paragon蓝
Figure A20068002687100821
处理的相同凝胶。部分a中对应于ODN的带在与部分b中的蛋白质带的相同高度的局部化表明ODN对于人血清蛋白质的结合。
其次，证实了人血清蛋白质的存在对于ODN-NN树状合物的影响。尝试检测所述树状聚体是否将防止ODN结合至蛋白质；为了进行这个，将含有3种浓度的人血清AB的树状合物、ODN和无DNA的树状聚体温育：在进行ODN、树状聚体和不含血清的RPMI的混合以后20分钟，将100μL的RPMI添加到所述混合物，或者是纯的，或者以5％、10％或20％含有血清AB。在树状聚体和ODN混合0小时、4小时和24小时以后进行电泳，以下列方式装载样品：
0小时
...20′＝＞100μL RPMI
泳道1.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI纯的
泳道2.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 5％
泳道3.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 10％
泳道4.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 20％
泳道5.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    5％
泳道6.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    10％
泳道7.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    20％
泳道8.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    纯的
4小时：
...20′＝＞100μL RPMI
泳道1.对照(60μL RPMI)         20％
泳道2.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI纯的
泳道3.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI  5％
泳道4.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI  10％
泳道5.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI  20％
泳道6.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    5％
泳道7.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    10％
泳道8.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    20％
泳道9.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    纯的
泳道10.3.25μL NN+57μL RPMI    5％
泳道11.3.25μL NN+57μL RPMI    10％
泳道12.3.25μL NN+57μL RPMI    20％
24小时
...20′＝＞100μL RPMI
泳道1.对照(60μL RPMI)       20％
泳道2.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI纯的
泳道3.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 5％
泳道4.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 10％
泳道5.2.43μL PPT-TFO+3.25μL NN+54μL RPMI 20％
泳道6.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    5％
泳道7.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    10％
泳道8.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    20％
泳道9.2.43μL PPT-TFO+57μL RPMI    纯的
泳道10.3.25μL NN+57μL RPMI    5％
泳道11.3.25μL NN+57μL RPMI    10％
泳道12.3.25μL NN+57μL RPMI    20％
紫外光下照相所述凝胶的结果显示在图9a中。图9b，对于它的部分，显示用Paragon蓝染色对应于4小时样品的凝胶。
所述结果显示，不含血清的NN+PPT-TFO树状合物如惯常所表现，在24h以后释放ODN。在0和4h以后：在血清存在下的NN+PPT-TFO给出不同于在血清存在下的PPT-TFO的电泳图谱。后者给出延长的和发散的信号，虽然树状合物在孔中留下ODN(除了当血清是20％时，其产生ODN的轻微泄漏并且结合至蛋白质)。观察蛋白质凝胶，(其中对应于4小时样品的那些已经作为实例显示，虽然0和24小时凝胶中的结果类似)，这些跑向正极，(将它从所述孔分开的染色)；但是有趣的是，在BE凝胶中观察到，当它是单独的不含树状聚体的时候，蛋白质与ODN形成络合物。不管树状聚体的存在(其没有成功在所述孔中保留蛋白质，不与所述蛋白质形成络合物)，所述蛋白质跑在全部实验情况的相同高度。蛋白质的存在没有成功从ODN-树状聚体络合物除去ODN；在24h以后，络合物开始释放ODN，但是这不像不含血清的ODN对照那样向下迁移，而是通过所述蛋白质立即保留在它的迁移中，给出与不含NN的含有血清的ODN相同的延长的和发散的信号。
因此，似乎在4和24h存在窗口，其中所述树状聚体将防止ODN结合至蛋白质。在这时以后，它释放它。这将给予ODN时间而在从脉管内空间经过到脉管外空间时结合到所述树状聚体，确定的是，所述树状聚体将随后随着时间以受控方式释放ODN，给它机会以发挥它的作用。血清的主要蛋白质是清蛋白，其具有2个给予它总的负电荷的负域，但是它也具有正电荷，其将它结合至ODN。CBS的疏水性位点很可能不与所述清蛋白的疏水性位点相互作用。所述相互作用是实现树状聚体和蛋白质之间的稳定结合所必需的，为此原因，它们不形成络合物；然而树状聚体和ODN之间的静电结合防止后者与清蛋白的正位点结合。
实施例36：与大尺寸的DNA形成络合物的能力
用质粒与CBS IM8进行初步试验，它能够与使用的质粒Nf-κB-luc形成络合物。在类似于上述实验的形式中，用不同的样品进行电泳，将序列梯类型的标记物在它之前放在所述孔中，测量直到5000pb。样品是下列的：
泳道1：1μl p+0.58μl IM8(+/-)＝2/1+28μl RPMI
泳道2.1μl p+1.74μl IM8(+/-)＝6/1+28μl RPMI
泳道3.1μl p+2.9μl IM8(+/-)＝10/1+27μl RPMI
泳道4.1μl p+29μl IM8(+/-)＝100/1+0μl RPMI
泳道5.1μl p(0.43μg p)
泳道6.2μl p
其中p＝质粒.
电泳照片显示在图10中。它表明，电荷比A(+/-)＝6/1目前成功保持DNA迁移。
实施例37.与siRNA形成络合物的能力
还进行了初步试验以评价小的干扰RNA(siRNA)的保留能力。为此目的使用由Ambion公司(Ambion，Inc)提供的下列抗-CD4siRNA：
5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGUdGdA-3’(SEQ ID NO：6)所用的凝胶是基质凝胶，一种用加热并随后用含有溴化乙啶的样品标记后而产生的25或50％琼脂糖和直链丙烯酰胺混合物制备的凝胶。在该情况下，具体而言，使用50％基质，0.7％琼脂糖和50％TAE 2X。
进行电泳的样品如下：
泳道1：RPMI
泳道2：1μl siRNA+1.58μl IM8+48μl RPMI(+/-)＝2
泳道3：1μl siRNA+4.74μl IM8+44μl RPMI(+/-)＝6
泳道4：1μl siRNA+49μl RPMI
显示在图11中的电泳凝胶照片再次表明络合物形成是阳性的。
毒性试验
通过五个不同的但是互补的方法研究不同的树状聚体的毒性，其提供细胞功能、膜渗透性和细胞外观的细节。
为了在不同的方面评价生存力，使用不同的技术：膜完整性(用锥虫蓝染色)，细胞凋亡(用非外壁内层(anexine)-V-PE和DAPI标记)，坏死(用7-AAD标记)，MTT试剂(它评价线粒体毒性)，通过流式细胞术评价细胞的尺寸和复杂性，体内镜检以评价细胞运动性。应用这些技术用于研究ODN、树状聚体和树状合物在外周血单核细胞(PBMC)中的毒性。另外，通过溶血试验评价树状聚体对于红血球的毒性。
实施例38：关于PBMC的试验
-试验的树状聚体
试验树状聚体IM8，IM16，ClNH4，NN，Phe和商业控制的SF(Superfect)和G4的毒性。它们的每一个取不同的数量，以便用其温育细胞的终浓度是1μM，5μM，10μM，20μM和100μM。
-外周血单核细胞(PBMC)的生产
所述血液来自成年人供者或健康婴儿的脐带。将所述血液用PBS稀释1/2，并且将它在菲科尔(Ficoll)梯度中离心。在所述离心以后，回收PBMC卤素并且进行两个随后的洗涤-离心分离循环。将得到的PBMC再悬浮在含有10％FCS，抗生素和谷氨酰胺的完全培养基中。
-用所述细胞的温育
将100μl的10％胎牛血清、抗生素和谷氨酰胺的完全培养基加入到体积为60μl含有相应的试验树状聚体的RPMI。然后将160μl加入到340μl中接种的细胞，实现500μl的终体积。以这种方法将细胞温育48小时，然后通过它的外观检查和通过评价线粒体活性而评价用所述树状聚体温育的影响。
-外观检查的结果
从外观检查产生的观察在表2中显示如下。
表2：用树状聚体温育的PBMC的视觉检查结果
  1μM   5μM   10μM   20μM   100μM
  IM8   好   好   减少双倍的折射死亡率增加   细胞数减少   非常少的活细胞
  IM16   好   好   细胞聚集体+   细胞聚集体++   细胞聚集体+++
  ClNH4  好   聚集体+   许多膜部分   少数细胞具有死的外观   大的棕色细胞块
  NN   好   好   比该浓度的上述CBS更好的外观   细胞数下降但是相对于该浓度的上述CBS的外观改善   非常少的细胞，但是比该浓度的上述CBS更好的外观
  Phe   好   好   好   很少的细胞   离析的细胞
  SF   聚集体++   聚集体++++   未试验   未试验   未试验
  G4   好   聚集体+  聚集体++   聚集体+++.大量的死亡率   大的深色聚集体
从目视观察，了解到，对于淋巴细胞最低毒性的树状聚体是CBS NN和Phe，试验的两个PAMAM树状聚体是最低毒性的。
-线粒体活性：MTT
在48小时以后进行线粒体活性关于树状聚体浓度的曲线。该技术用于表明对于细胞内部的细胞内有害影响。它是基于细胞的选择性能力的比色试验，所述细胞对于还原不可溶的甲月替晶体中的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物是可行的。在用不同浓度的树状聚体在96-孔板中温育PBMC(100,000/孔)48小时以后，除去含有树状聚体的上清液并用200μl不含血清或酚红的培养基(Optimem)将它替代。为了避免在该步骤的细胞和随后的甲月替损失，已经对所述规程进行了修改，将PBMC以5-10μg/ml的浓度接种在总人血浆纤连蛋白(Sigma
Figure A20068002687100881
)中，以便在4-小时温育期间它们固定到所述孔的底部。除200μl的Optimem之外，在PBS pH7.4以5mg/ml的浓度添加20μl过滤的MTT以实现它的无菌性(噻唑基蓝，Sigma)以实现终浓度为每孔0.5mg MTT/ml。在37℃用5％CO2气氛温育4小时以后，将板在2000rpm离心并随后除去含有没有反应的过量MTT的上清液。在相差显微镜下观察甲月替晶体并随后用200μl的二甲基亚砜(DMSO)溶解。将所述板在700rpm在Eppendorf
Figure A20068002687100883
搅拌器-加热器中搅拌以确保所述晶体的正确溶解。利用板阅读器在570nm的波长用690nm的参比，通过光谱法确定甲月替的浓度([A])。利用不含细胞的Optimem将光谱测定法校准至零。基于线粒体活性，基于该式：[A]试验/[A]对照×100，计算相对于对照(未处理的细胞)的相对细胞生存力。按照ATCC的准则，将每个树状聚体浓度试验一式三份。产生的结果在表3中显示如下。
表3.在根据MTT用树状聚体温育以后的细胞生存力
  1μM   5μM   10μM  20μM   100μM
  IM8   98   60   18   12   10
  IM16   94   99   63   37   11
  ClNH4  65.5   47   40   16   14
  NN   87   68   66   32   9
  Phe   83   77   71   54   14
  SF   11   11
从用MTT的试验时，收集到的是，在用递增浓度的CBS或SF处理以后显示更大的线粒体生存力的细胞是用CBS IM16、CBS NN和CBSPhe处理的那些。然而，如果用目视观察的那些将数据作为一个整体来看，推断出，虽然IM16将引起细胞聚集体的形成，但是NN和Phe不这样做，后者对于淋巴细胞是更相容的。
实施例39.关于红血球的试验
进行目视检查以检测血凝集作用的存在/不存在，并通过光谱测定法定量血红蛋白的释放(溶血试验)。从上述实施例38的树状聚体排除ClNH4，因为所述结果对于淋巴细胞更具毒性，并且所述结果可与对于PAMAN类型第4代树状聚体产生的那些相比。
利用上述实施例中引用的相同的菲科尔(Ficoll)梯度，在与PBMC分离以后获得红血球。将它们在PBS中稀释以能够独立地察看它们。将所述细胞再悬浮在500μl的PBS中并且接种在24-孔板中(300,000/孔)。作为阳性对照，使用0.2％Triton X-100处理的细胞。阴性对照：PBS(空白)。将红血球用不同的树状聚体浓度温育。通过收集100μl上清液并且通过光谱测定法利用板阅读器在550nm的和作为参比的690nm波长测量吸光度而评价血凝集作用的存在，细胞的数目和血红蛋白随小时的释放。
-目视检查
从目视检查得到的观察在表4中显示如下。
表4.用树状聚体温育的红血球的目视检查
  1μM   5μM   10μM   20μM
  IM8   好   Ag+   Ag+   无细胞
  IM16   好   Ag++   Ag++但是比用IM8有更多的细胞   无细胞
  NN   好   好   Ag+/-   无细胞
  Phe   Ag+   Ag+++   Ag+++   有细胞但是完全凝集
  G4   Ag+   Ag++   纺锤形细胞   有细胞但是它们是纺锤形的
Ag＝凝集
-1小时以后血红蛋白释放的定量
在Triton X-100对照中100％溶血(用Triton处理的细胞全部是死的和破裂的)。在未处理的细胞的阴性对照中7％溶血。将每个孔表示为相对于被认为是100％的Triton X-100的O.D.(吸光度)的百分比，另外对所述百分比减去7％的对照。用这种方法，获得在表5中显示如下的结果：
表5.-在用树状聚体温育以后的血红蛋白释放的百分比
  IM8   IM16   NN   Phe   G4
  1μM   34.8   11.000   6.6   8.000   8.4
  5μM   28   22.000   15   12.000   0
  10μM   79   55.000   75   31.000   0
  20μM   84   82.000   83   53.000   0
在5μM的NN和Phe稍微超过10％的毒性，这被认为是红细胞毒性的截止点。发生的是，Phe诱导血凝集作用而NN不诱导血凝集作用。作为不寻常的细节，IM16诱导更少的溶血作用并且在所述孔中留下比IM8更大数目的细胞，(符合对于淋巴细胞中的MTT所观察的)，但是它诱导凝集。除NN之外全部诱导血凝集作用。PAMAM G4诱导红血球的凝集和形成改变，然而并非溶血作用。
血细胞凝集从最大到最低的顺序是：
G4＞Phe＞IM16＞IM8＞NN
总体上，其中细胞具有较好外观也具有几乎不可测量的溶血作用的孔是NN树状聚体。
如果将淋巴细胞和红血球上产生的毒性合起来，显示较好的生物相容性分布的树状聚体是NN。
实施例40.ODN+树状聚体络合物与单独的树状聚体比较的毒性。
当它们与DNA形成络合物时，改变(降低)其它树状聚体诸如PAMAM的毒性。下列实验试图公开，当结合到ODN时，关于毒性，CBS发生了什么。
关于该情形的估计时间是72小时。关于PBMC评价所述毒性，以实施例38中描述的方式产生。
在全部情况中使用下列电荷比：(+/-)＝2/1
为了实现2/1的电荷剂量(+/-)，在这些实验中使用的树状聚体浓度是：
IM8：2.96μg＝3.93μM
IM16：2.35μg＝1.99μM
ClNH4：1.92μg＝3.98μM
Phe：2.8μg＝1.96μM
NN：3.42μg＝3.94μM
SF：0.68μM
G4：100μM
以下列方式使用的ODN是PPT：
含有CBS的络合物中的[ODN PPT]：2.57(0.88μM)
含有SF的络合物中的[ODN PPT]：0.34μM
含有G4的络合物中的[ODN PPT]：1μM
-络合物形成
使用不含血清的酚红的RPMI作为支持介质，在全部所述试验中使用60μl的络合物形成体积。将ODN或树状聚体的相应数量用于达到电荷比(+/-)＝2，所述正电荷是通过树状聚体提供的并且负电荷是通过ODN提供的。基于树状聚体(固定的)的电荷数和ODN的负电荷数(也是固定的)进行计算。
一旦将ODN和CBS添加在RPMI中，等待20分钟的时间以确保络合物形成。
在SF的情况下，按照制造商的说明书形成络合物。
-用所述细胞的温育
在需要确保络合物形成的时间以后，将100μl的10％FCS完全培养基、抗生素和谷氨酰胺加入到60μl的含有ODN和树状聚体的RPMI。然后将160μl加入到340μl中接种的细胞，实现500μl的终体积。或者用所述络合物温育所述细胞，所述络合物是含有不含CBS的ODN的相等体积的混合物，所述混合物单独含有树状聚体，或用用作阴性对照的仅含有RPMI+完全培养基的混合物温育所述细胞。然后收集细胞和/或上清液而通过流式细胞术、共焦显微术或细胞DNA提取而分析。
-免疫荧光和共焦的显微术
在用含有发荧光的ODNs、树状合物、树状聚体或RPMI的混合物温育以后，处理所述细胞用于随后在常规共焦的或荧光显微镜中获得图像。将细胞通过聚-L-赖氨酸，(PLL)(Sigma
Figure A20068002687100921
)粘附于具有直径为30mm的孔的玻璃载玻片。为了进行这个，将载玻片用30μl的PLL在37℃和5％CO2的培养箱中预温育。在该温育以后，用PBS洗涤过量的PLL。将来自每个处理的将要粘附在PLL中的细胞用PBS洗涤两次，并且用0.8％锥虫蓝(Sigma
Figure A20068002687100922
)标记1分钟，然后显示活细胞。将它们再次用PBS洗涤两次。在那时将所述细胞加入到孔(100,000/孔)，在37℃和5％CO2的培养箱中在PLL上处理1小时。在该小时以后，用PBS洗涤过量的体积并且用最近制备的3％低聚甲醛(PFA)(在它使用的2周之内)处理10分钟。在这10分钟以后，用PBS洗涤过量的PFA并且用抗体标记所述细胞，所述抗体用荧光染料和DAPI注记。首先将细胞膜染色然后是细胞核。将预先滴定的抗体用于确定进行本发明试验所使用的最佳浓度。首先，使用小鼠抗人的抗-CD45IgG1，κ初级抗体(BD
Figure A20068002687100923
)；以1μg/ml的稀释度将30μl的抗体添加至每孔；将它温育30分钟然后用PBS洗涤余物。然后，使用山羊抗-小鼠IgG-IgM的次级抗体(重链和轻链)，结合在德克萨斯-红(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch))中，以贮液(贮液浓度1.4mg/ml)的1/130稀释度30μl/孔。将所述细胞温育另外30分钟并且然后将它们用PBS洗涤。最终，利用DAPI(Vysys
Figure A20068002687100925
)10μl/孔将所述细胞核染色10分钟，然后用PBS洗涤两次。用抗体和DAPI的温育是在环境温度进行的。在使用的同一天稀释抗体以避免它们随时间的推移而降解，并且在使用之前将它们在12000rpm离心以除去聚集体的存在。在封闭培养基中进行每一抗体的稀释以减少非特异性标记(含有1％牛血清清蛋白的PBS)。最终，利用对于荧光是特殊的介质(DAKO Cytomation封固介质
Figure A20068002687100926
)抗衰减地封固所述制备(设计成能防止样品免于由激光所引起的劣化)。然后观察它并且利用Leica TCS SP2共焦显微镜捕获图像，利用不同的激发线：405，488和514nm并且利用共焦的光学微分对比显微术的透镜。在捕获图像以后，利用Leica
Figure A20068002687100931
软件分析它。
体内共焦的显微术。为了检验不同的用PBMC进行的ODN、树状合物和树状聚体的处理以后的细胞生存力，并且研究因此诸如发荧光的ODN的捕获的现象或评价转染细胞的移动，使用体内共焦的显微技术。因而，用总的人血浆纤连蛋白(Sigma)以5-10μg/ml的使用浓度接种2.5cm晶体，用纤连蛋白在37℃温育1小时。在用PBS洗涤晶体上过量纤连蛋白以后，使用预先用PBS洗涤的PBMC并且将它们在37℃以5％CO2气氛温育30分钟。通过用PBS洗涤除去不粘附的过量细胞。进行所述晶体的全部工作，将这个在无菌培养皿(Petri dish)中和在层流室中配置在非-粘附的表面(灭菌的金属纸)上。最终，将晶体包括在所述容器中用于体内共焦的显微术，其中在37℃用5％气氛保持所述细胞。在启动任何体内实验以前，在30分钟期间将所述细胞在所述容器中从处理进行回收。在该时期以后，不同地处理所述细胞：
1.添加发荧光的ODN或含有发荧光的ODN的树状合物，并且评价其细胞的内化。
2.在用树状聚体、树状合物或ODN的不同攻击以后评价细胞的移动能力。
为了进行这个，随着时间(每30″，1′或2′)对包括细胞核的细胞进行顺序捕获，选择其中中平面的截止值。在获得以后，安装所述图像用于过程图像的产生。
-用锥虫蓝染色
该技术评价细胞膜对锥虫蓝(缩写TB)的渗透性。活细胞排斥该染色。
为了进行它，用0.8％锥虫蓝(西格玛(Sigma))制备溶液并且处理在离心1分钟以后产生的细胞丸，用随后的用PBS的细胞离心-洗涤进行两次。在光学显微镜下观察所述细胞并且对于锥虫蓝的存在计数阳性的细胞(蓝色细胞，死的)，关于阴性细胞(活细胞)的百分比。为了进行这个，选择具有至少100个细胞的大视野。产生的结果在表6中显示如下。
表6.-用锥虫蓝染色的细胞百分比
  TB+(％)   TB+(％)
  对照   12.2   PPT   11.9
  PPT+IM8   11.5   IM8   17.1
  PPT+IM16   14.9   IM16   18.5
  PPT+CLNH4   15.8   ClNH4   15.7
  PPT+Phe   10.7   Phe   11.3
  PPT+NN   13.6   NN   10.6
  PPT+SF   72   SF   100
  PPT+G4   80.5   G4   100
n＝100细胞/计数
更大百分比的死亡率对应于与ODN形成络合物的PAMAM和单独的PAMAM。CBS不显示TB阳性细胞相对于未处理的对照细胞增加的百分比，当用CBS-ODN或用CBS单独处理所述细胞时几乎没有观察的差异。
-流式细胞术试验
具有对应于细胞凋亡-坏死中的细胞的大小和复杂性的细胞的百分比可与活细胞相比。对此，通过流式细胞术评价尺寸(FW)和复杂性(SD)。为了进行这个，在具有FW和SD的细胞周围画出区域，对应于细胞凋亡-坏死中的细胞，和具有FW和SD的细胞周围的另一个区域，对应于活细胞。比较在每个载玻片中存在的细胞百分比。产生的图显示在图15中，其中X-轴表示尺寸(FW)并且Y-轴表示复杂性(SD)。
部分A显示用CBS树状聚体处理的PBMC-类型的细胞群体并且部分B是用PAMAN类型的树状聚体处理的群体。暗细胞云对应于细胞凋亡坏死中的细胞。活细胞以灰色表示。对应于每个细胞类型获得数字的百分比，产生表7中所示的值。
表7.-活细胞和凋亡-坏死细胞的百分比
  活细胞(％)   凋亡-坏死(％)   活细胞(％)   凋亡-坏死(％)
  对照   69   27   PPT   71   23
  PPT+IM8   71   24   IM8   59   36
  PPT+IM16   72   22   IM16   67   28
  PPT+ClNH4   78   17   ClNH4   71   26
  PPT+Phe   72   22   Phe   61   33
  PPT+NN   73   21   NN   70   24
  PPT+SF   24   70   SF   12   82
  PPT+G4   4   84   G4   4   85
这些结果图解表示在图14中，所述图以黑色表示死细胞的百分比并且以灰色表示活细胞的百分比。第一个条(C)，对应于对照。
最大百分比的死亡率对应于与ODN形成络合物的PAMAM和单独的PAMAM。另一方面，CBS不显示相对于未处理细胞的对照的细胞凋亡-坏死更大的百分比，当用CBS-ODN或用CBS单独处理所述细胞时几乎没有观察的差异。
-用DAPI染色
作为检验细胞生存力的附加试验，使用DAPI(Vysys
Figure A20068002687100951
)活体染料，在10分钟期间利用10μl/孔并且随后用PBS洗涤两次。细胞凋亡或坏死中的细胞核显示减少的核大小，染色质的凝聚和核断裂。
图17显示用下列样品产生的结果：1：对照；2：ODN+IM8；3：ODN+IM16；4：ODN+SF；5：ODN；6：IM8；7：IM16；8：SF
用CBS-ODN络合物或单独的CBS处理的细胞，显示具有均匀分配的染色质的圆细胞核，具有与未处理的对照细胞的细胞核类似的外观。具有SF(4和8)处理的孔显示标记的细胞消耗，使分析困难。
-录像
细胞是活着的最清晰的证据是它移动。活细胞显示暂时的在用纤连蛋白接种的晶体表面上移动的细胞突出。用CBS处理的细胞显示类似于未处理细胞的移动模式。
作为实施例，图18显示在用CBS IM8-ODN温育所述细胞72小时以后拍摄的照片序列。一些移动细节是用箭头突出的。
总之，树状聚体在络合物形成中使用的浓度表明，它们是相当生物相容的，当用CBS-ODN络合物处理时所述细胞显示与单独处理时类似的生存力。
抗原能力
当想要知道新分子的生物相容性分布时，非常重要的是知道它是否可以构成非特异性的抗原刺激。这将是一个缺点，因为免疫系统细胞可以将所述分子识别为外来因素，针对其它将发动对于生物或许将是有害的响应。为了进行这个，在不同的CBS存在下进行淋巴细胞增殖研究，以达到比较淋巴细胞刺激能力的目的，它们将与典型的有效刺激诸如植物凝血素(PHA)比较。
实施例41.增殖试验
为了评价CBS树状聚体的抗原能力，进行淋巴增生试验。将所述实验在96-孔平底板中制备一式三份(100,000细胞/孔，以200μl的含有抗生素、谷氨酰胺和10％AB血清的完全人AB培养基)。所述实验具有一个阴性对照增殖孔(未处理的细胞)，一个用惯常使用的剂量(2μM)的每个试验的树状聚体处理的孔，另一个用更大剂量的非常接近于细胞毒性(5μM)并且另一个用1μg/mL植物凝血素处理的增殖的阳性对照。在37℃以5％CO2的气氛温育5天以后，除去100μl的上清液，然后增加100μl的含有DNA的同位素插入剂，氚标记的胸腺嘧啶核苷(用10％AB培养基和胸腺嘧啶核苷1/100制备)。然后利用采集机(Harvester)将所述板滤光，经过滤色片经过它的内容物，使其干燥过夜(大约16小时)。在该时期以后，将一片含有闪烁介质的Methylex
Figure A20068002687100961
加热熔化，并且在γ照相机中读出它，以评价计数的数目(计数越大，增殖越多)。在表8中显示如下的结果，表示为氚标记的胸腺嘧啶核苷计数/分钟(cpm)。将每个浓度的每个结果进行一式三份，表中出现的值是3次的平均值。将PHA和对照试验12次。
表8.淋巴增生试验中计数数目的读数
Figure A20068002687100971
图19显示该信息的图示。
如从该试验可以了解，CBS树状聚体在任何试验浓度不构成PBMC的抗原刺激。
转染试验
评价ODN穿过PBMC的质膜和核膜的能力，并且所述能力可与所述ODN提供的与不同的CBS形成络合物的能力相比。利用共焦的显微术，本发明的树状聚体可与PAMAM类型的那些相比。
实施例42.转染试验
-PBMC细胞的产生和用所述样品的温育
使用上述实施例中说明的相同方法。
-细胞的预先处理
在用ODN或用树状合物处理以前两天，将PBMC用1-2μg/ml之间的剂量的植物凝集素和用100IU/ml的剂量的白介素-2(IL-2)刺激，细胞浓度在3和5百万个/ml之间。在处理当天，将细胞以300,000-500,000个细胞/340μl的浓度再悬浮。然而，并且在给定各自的顺序处理以后的终体积是500μl的情况下，在实验期间以50IU/ml的剂量添加IL-2保持细胞活化，基于构成终体积的500μl而计算。
-共焦的显微术
使用预先描述在其它实施例中的方法。
-用ODN得到的结果
用序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5的ODN的每一个进行试验。与先前发表的相反，ODN显示意外的穿过质膜以及核膜的能力。该方法是时间依赖的。因而，在3小时以后，在细胞细胞质中发现ODN，并且在24小时以后在细胞核中发现ODN。这个的实施例可以在图20中观察，其中可以观察到在用ODN RF转染开始的1，3或24小时后拍的照片。
荧光模式是发散的，不形成聚集体。
当进行细胞的XY分割并且分析荧光存在时，核定位是更清晰的。该类型的试验可以在图21中观察。当观察到通过中面中的线存在的荧光时(图21a)，顶部图解中表示的蓝色荧光(细胞核)和中部图解(ODN)中表示的绿色荧光在底部图解(膜)中表示的红色信号下共定位。当进行类似的分析时，但是取贯穿Z-轴上多个截面的细胞核周围画出的感兴趣区(ROI)(图21B)时，它显示绿色(底部图解)如何与蓝色(顶部图解)共定位，并且出现在细胞质以外直到达到所述膜。
不管试验的ODN的长度(从15至28碱基)，结果是相同的。
-用ODN+CBS树状合物产生的结果
利用ODN PPT进行转染试验以形成含有不同的本发明树状聚体的树状合物。具体而言，使用下列样品转染：1：对照；2：PPT；3：PPT+IM8；4：PPT+NN；5：PPT+Phe；PPT+IM 16。
48小时以后产生的结果表示在图22中。
除ClNH4以外的全部树状聚体实现类似于不含CBS的ODN的模式，即，发散的、核的和细胞质的。在一些进行的实验中，一些络合物在任意单位的荧光中实现比不含CBS的ODN的(含有NN和Phe的那些)更高的结果，但是这在不同的实验中不能统计显著性地重复，所述实验在络合物和单独的ODN之间具有高达7个比较系列的重复。然而，含有ClNH4的PPT的样品在显示在图23中的聚集体中产生荧光模式。
为了证明它有效地是细胞质的和核荧光的模式，进行XY中的中平面中单一细胞的直方图，类似于用不含CBS的ODN所进行的那种。例如，图23显示对于含有PPT+NN的细胞的一个分析：
从这些数据可以推断，除ClNH4之外，CBS树状聚体决不干扰ODN在细胞中的分布。
病毒或其它生物剂受所述树状聚体的抑制
由于上述实验中所示的生物相容性，本发明的树状聚体将适合于制备药物组合物(肠胃外的或口服的)或干扰装置(阴道凝胶剂，防腐剂)，用于生物剂诸如HIV病毒或其它的病毒诸如丙型肝炎或其它的生物剂诸如朊病毒的预防和/或治疗。为此目的，设计研究该能力的HIV病毒抑制试验。
实施例43：HIV抑制试验
-病毒制备
使用MT-2细胞(用人淋巴亲细胞的病毒类型I永生化的人T淋巴细胞)。将20×106个MT-2用补充有10％FCS的RPMI 1640培养基洗涤两次，并且将它们在含有10％FCS的RPMI中以2×106细胞/ml的浓度转移到25ml。然后以1粒/细胞(1MOI)的浓度加入HIVNL4.3病毒。将MT-2和病毒在37℃在至少2小时的期间培养，每15-30分钟搅拌所述培养物。最终，将培养物(细胞-病毒)洗涤两次以除去没有整合到细胞基因组中的病毒。将细胞转移并以相同培养基培养在25cm2瓶中。
每72-96小时收集一半的上清液，也要注意不收集细胞。以含有10％FCS的RPMI培养基中的相同浓度添加40×106个MT-2。将上清液等分并储存在液氮中，随后将它滴定(tittered)。
-病毒效价
将分离的病毒HIVNL4.3，实验室建立的病毒株，在MT-2细胞系中滴定。将2×104个MT-2细胞用完全培养基培养在96-孔板中，并且以不同的浓度加入40μl的病毒制备物，对于所述病毒制剂进行相应的稀释。将它们的全部一式八份放置并在37℃在CO2气氛中保持一周。在这次以后，通过细胞病变效应和多核体(syncyte)形成的显示阅读效价。通过应用Spearman-Karber公式[30]计算效价，所述公式用于在培养中量化每ml培养基的病毒颗粒数目，其中要滴定的病毒浓缩物的连续稀释已经一式八份接种。
-T淋巴细胞的体外感染
在48小时期间用2μg/ml的PHA和100IU的IL-2刺激PBMC，以引起多克隆的激活；在24小时以后将细胞用PBS洗涤。用计算的每细胞的HIVNL4.3的颗粒数在含有10％FCS的RPMI培养基中在37℃在用5％CO2加湿的气氛中温育所需浓度的细胞。在此时以后，将培养细胞收集并洗涤三次以除去粘附至细胞表面的病毒，将它们在24-孔板中再次沉积在含有10％FCS和50IU/ml的IL2的RPMI培养基中，并且将它们用不同的树状聚体处理。将培养物在37℃温育并且它们保持在用5％CO2加湿的气氛中。
-用CBS抑制HIV
在感染它们以前的情况下并且在以感染复数为0.4MOI感染它们以后的另一个情况下，将400,000PBMC/孔的24-板接种并将它们用1，3和5μM的NN处理。在24h以后收集细胞以提取DNA并且随后定量每一细胞的病毒拷贝(按照HIV DNA在受感染细胞中的检测和定量的方法，所述方法以国家专利局的专利号2401986登记)。
为了消除树状聚体的可能毒性对于细胞数和病毒拷贝数的影响，将病毒拷贝数调整成能够在不同的树状聚体浓度之间进行比较的活细胞的百分比。然而，树状聚体在使用的浓度(在流式细胞术中用FW和SD定量)不诱导显著的死亡率。
因此进行下列调整：DNA HIV拷贝数/106个细胞/活细胞，产生显示在图25中的下列图解，其中前缀前或后指的是在感染前后施用1，3或5μM的NN，并且标记为“C”的条对应于对照。
产生的结果表明，在施用至本发明之前或以后，所述树状聚体在用HIV感染PBMC中发挥明显的障碍。因此，它应当作用于整合前和整合后的步骤上。
实施例31至43的实验结论
-试验的CBS树状聚体显示在用于传送ODN的剂量对于PBMC的良好生物相容性。
-当关于淋巴细胞和红血球的毒性数据作为一个整体来看，具有较好的生物相容性分布的树状聚体是CBS-NN。
-CBS NN，IM8和IM16随时间释放ODN，在24小时以后实际上释放100％的ODN。这些树状聚体也在酸性pH(＜5)释放ODN。
-在10％FCS存在下，试验的ODN显示通过它们自身在细胞中摄取的高能力，在已经将其加入到细胞培养物17小时以后在几乎100％的活细胞中穿过质膜和核膜。
-试验的全部CBS-ODN树状合物(ClNH4之外)不干扰ODN的内化作用和它的细胞质和核的分布。
-CBS NN防止ODN结合至血浆蛋白质，该防护不干扰随后的在所述蛋白质存在下随时间在水介质中的逐渐释放。为此原因和上述的那些，本发明的树状聚体似乎适于用于抑制蛋白质合成的反义治疗中，它一般便于减少所述蛋白质合成的水平，因为它涉及一些病症，无论是肿瘤的或病毒的类型或涉及不同的人或动物疾病中的任何其它的形式。
-所述NN树状聚体显示良好防止由HIV病毒感染淋巴细胞的能力，连同所证明的良好的生物相容性，显示它可以用于预防和/或治疗由生物剂诸如HIV或其它的病毒诸如丙型肝炎产生的病症，包括其它的生物剂诸如朊病毒。
-CBS Phe和ClNH4显示有效地和长时间地固定核酸的良好能力，为此目的，而且，它们可以适于产生RNA或DNA微芯片或需要固定核酸的其它装置，原因在于DNA固定的形成(与DNA的磷酸酯基团的静电)，这里描述的CBS使核苷酸序列暴露于与其它核酸的互补序列相互作用。
新的树状骤体的合成
为了增加本发明的碳硅烷树状聚体的多功能性，对于实施例1至30中所描述的合成的那些合成附加的树状聚体，改变用于产生分支的末端部分的起始化合物(实施例44至47)和增加季铵化试剂的浓度，在上述实施例中已经描述了其合成的树状聚体的氨基的季铵化方法，以确保不仅季铵化末端部分的末端可以如此构成的氨基，而且季铵化可以包含在所述末端部分中的其它氨基(实施例48和49)。
这些树状聚体的合成描述如下：
实施例44至47.-
实施例44.-1G-[Si(CH 2 ) 2 C 6 H 3 (OMe)(O(CH 2 ) 2 NMe 2 )] 4 .(31)的合成
为了合成该树状聚体和描述在下列实施例中的树状聚体32，使用4-烯丙基-2-甲氧基-1-(N，N-二甲基氨基)苯((CH2＝CH-CH2)C6H3(OMe){O(CH2)2NMe2})，一种非商业的化合物，它需要在相应的氢化硅烷化反应之前合成。
-(CH 2 ＝CH-CH 2 )C 6 H 3 (OMe){O(CH 2 ) 2 NMe 2 }的合成
将1当量的ClCH2CH2NMe2H+Cl-(7.02g，48.7mmol)，4当量的K2CO3(26.93g，195mmol)和18-冠-6醚冠(2.57g，9.74mmol)加入到丙酮中的4-烯丙基-2-甲氧基苯酚(8.0g，48.7mmol)的溶液。将反应在回流下保持48h。在真空除去溶剂后，在CH2Cl2/H2O(2×50ml)中进行萃取。将有机相用MgSO4干燥2h。然后将其过滤，并除去溶剂，产生浅黄色油，将其用己烷洗涤(2×10ml)以除去18-冠-6醚冠。由此产生作为浅黄色油的化合物(5.49g，48％)。
NMR-1H(CDCl3)：δ6.79(d，1H，C6H3)，6.68(m，2H，C6H3)，5.92(t，1H，CH＝CH2-CH2-Ph)，5.02(m，2H，CH＝CH2-CH2-Ph)，4.07(t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，3.81(s，3H，CH3O)，2.52(m，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，2.74(t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，2.31(s，6H，NMe2).NMR-13C{1H}(CDCl3)：δ149.51(结合到-O(CH2)2NMe2的Cipso)，146.55(结合到-OMe的Cipso)，137.59(结合到-CH2的Cipso)，133.17(CH＝CH2-CH2-Ph)，120.37，113.76，112.26(C6H3)，115.58(CH＝CH2-CH2-Ph)，67.39(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，58.12(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，55.78(CH3O)，45.94(NMe2)，39.76(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)。
-树状聚体31的合成
将(CH2＝CH-CH2)C6H3(OMe){O(CH2)2NMe2}(0.9g，4.64mmol)和一滴Karstedt催化剂(3-3.5％Pt)加入到最小量的THF(3ml)的1G-H4树状聚体溶液(0.50g，1.16mmol)。将反应混合物在真空安瓿中在12h期间加热至45℃。将产生的溶液通过真空除去所述溶剂而干燥，产生作为黄色油的化合物31(1.60g，100％)。
NMR-1H(CDCl3)：δ6.80(d，1H，C6H3)，6.65(m，2H，C6H3)，4.07(t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，3.81(s，3H，CH3O)，2.74(t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，2.52(m，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，2.31(s，6H，NMe2)，1.55(m  宽，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，1.28(m  宽，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，0.53(m，6H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，-0.07(s，6H，SiMe2)，NMR-13C{1H}(CDCl3)：δ149.40(结合到-O(CH2)2NMe2的Cipso)，146.29(结合到-OMe的Cipso)，136.03(结合到-CH2的Cipso)，120.24，113.72，112.30(C6H3)，67.47(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，58.22(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，55.88(CH3O)，46.00(NMe2)，39.67(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，26.26(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，20.29，18.56，17.53(Si(CH2)3Si)，15.41(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，-3.28(SiMe2)，29Si{1H}-NMR(CDCl3)：(G0-Si)未观察到，1.60(G1-Si).
-实施例45：2G-[Si(CH 2 ) 2 C 6 H 3 (OMe)(O(CH 2 ) 2 NMe 2 )] 8 .(32)的合成
从树状聚体2G-H8(0.32g，0.27mmol)，(CH2＝CH-CH2)C6H3(OMe){O(CH2)2NMe2}](0.51g，2.17mmol)，3ml的THF和一滴Karstedt催化剂开始，按照类似于对于31所描述方法制备第二代树状聚体32。在该方法中，产生作为棕色油的32(0.38g，50％)。
NMR-1H(CDCl3)：δ6.80(d，2H，C6H3)，6.66(m，4H，C6H3)，4.08(t，4H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，3.81(s，6H，CH3O)，2.74(t，4H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，2.52(m，4H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，2.30(s，12H，NMe2)，1.55(m  宽，4H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，1.28(m  宽，6H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，0.53(m宽，16H，结合到Si的-CH2)，-0.072(s，12H，SiMe2)，-0.01(s，3H，SiMe)，NMR-13C{1H}(CDCl3)：δ149.37(结合到-O(CH2)2NMe2的Cipso)，146.29(结合到-OMe的Cipso)，135.98(结合到-CH2的Cipso)，120.24，113.69，112.30(C6H3)，67.44(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，58.19(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，55.86(CH3O)，45.98(NMe2)，39.65(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，26.23(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，20.13，18.81，18.60(Si(CH2)3Si)，15.38(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，-3.25(SiMe2)，-4.93(SiMe)，29Si{1H}-NMR(CDCl3)：0.1.00(G1-Si)；1.70(G2-Si)。
-实施例46：1G-[Si((CH 2 ) 2 C 6 H 3 (OMe)(O(CH 2 ) 2 NMe + 3 I - ))] 4 (33)的合成
将0.02ml二亚乙基醚中的2M的MeI(0.27mmol)溶液加入到乙醚(3ml)中的31树状聚体溶液(0.094g，0.068mmol)。将反应混合物在持续搅拌下在环境温度保持48h，然后，将其干燥以除去过量的MeI。将得到的残渣用己烷洗涤(2×5ml)并真空干燥以产生作为白色固体的树状聚体33(0.10g，83％)。
NMR-1H(DMSO)：δ6.94(d，1H，C6H3)，6.75(m，2H，C6H3)，4.34(t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，3.74(s，3H，CH3O和t，2H，Ph-O-CH2-CH2-NMe+ 3重叠的)，3.18(s，9H，NMe+ 3)，2.49(m，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph，与DMSO的信号重叠的)，1.51(m宽，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)1.28(m宽，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，，0.91(m，2H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，0.51(m，4H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，-0.07(s，6H，SiMe2)，NMR-13C{1H}(DMSO)：δ148.6(结合到-O(CH2)2NMe2的Cipso)，144.3(结合到-OMe的Cipso)，135.9(结合到-CH2的Cipso)，119.5，114.2，111.9(C6H3)，63.6(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，62.6(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，55.1(CH3O)，52.7(NMe+ 3)，39.0(Si-CH2-CH2-CH2-Ph，与DMSO的信号重叠的)，25.3(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，19.1，17.6，16.4(Si(CH2)3Si)，14.3(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，-3.7(SiMe2)。
-实施例47：2G-[Si((CH 2 ) 2 C 6 H 3 (OMe)(O(CH 2 )2NMe + 3 I - ))] 8 (34)的合 成
从32(0.38g，0.13mmol)和0.07ml乙醚(1.04mmol)中的2M MeI溶液开始，按照类似于对于33所描述方法制备第二代树状聚体348在该方法中，产生作为白色固体的34(0.45g，85％)。
NMR-1H(DMSO)：δ6.94(d，2H，C6H3)，6.75(m，4H，C6H3)，4.33(t，4H，Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，3.74(s，6H，CH3O和t，4H，Ph-O-CH2-CH2-NMe+3重叠的)，3.18(s，18H，NMe+ 3)，3.18(m，4H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph，与DMSO信号重叠的)，1.50(m宽，4H，Si-CH2-CH2-CH2-Ph)1.29(m宽，6H，Si-CH2-CH2-CH2-Si)，0.50(m，16H，CH2Si)，-0.09(s，12H，SiMe2)，-0.11(s，3H，SiMe)，13C{1H}-NMR(DMSO)：δ148.6(结合到-O(CH2)2NMe2的Cipso)，144.3(结合到-OMe的Cipso)，135.9(结合到-CH2的Cipso)，119.5，114.3，111.9(C6H3)，63.6(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，62.6(Ph-O-CH2-CH2-NMe2)，55.1(CH3O)，52.7(NMe+ 3)，39.0(Si-CH2-CH2-CH2-Ph，与DMSO的信号重叠的)，25.3(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，19.0，17.7，17.6(Si(CH2)3Si)，14.3(Si-CH2-CH2-CH2-Ph)，-3.8(SiMe2)，-5.4(SiMe)。
实施例48和49
-实施例48：1G-[(Si(O(CH 2 ) 2 N(Me) 2 (CH 2 ) 2 NMe 3 + 2I - )] 4 (35)的合成
树状聚体35，其具有季铵化结构的全部氮原子，是从第一代树状聚体25(0.24g，0.24mmol)和MeI(2.4mmol)在1.2ml作为溶剂的二亚乙基醚中制备的。在该方法中，产生不溶于二亚乙基醚的作为白色固体的35(0.49g，95％)。
NMR-1H(DMSO-d6)：4.00(2H，t，CH2O)，3.93(4H，m，CH2N(Me)2 +)，3.53(2H，t，CH2N(Me)3 +)，3.18(15H，s宽，N(Me)2 +和N(Me)3 +)，1.31(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.70(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.55(2H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.13(6H，s，OSiMe2).NMR-13C{1H}(DMSO-d6)：64.9(CH2O)，56.3，55.9，55.6(CH2N(Me)2 +和CH2N(Me)3 +)，52.5(NMe3 +)，50.9(NMe2 +)，21.2(SiCH2CH2CH2SiO)，17.8(SiCH2CH2CH2SiO)，17.2(SiCH2CH2CH2SiO)，-2.6(OSiMe2).C52H128N8O4Si5I8的元素分析.计算的.％：C，39.59；H，8.18；N，7.10.实验的.％：C，38.65；H，7.98；N，6.94。
-实施例49：2G-[Si(O(CH 2 ) 2 N + (Me) 2 (CH 2 ) 2 NMe 3 + 2I - )]8(36)的合成
从26(0.11g，0.04mmol)和0.06ml的MeI(0.91mmol)开始，按照类似于对于35所描述的方法制备第二代树状聚体36。在该方法中，产生作为白色固体的化合物36(0.18g，86％)。
NMR-1H(DMSO-d6)：4.00(4H，t，CH2O)，3.93(8H，m，CH2N(Me)2 +)，3.59(4H，t，CH2N(Me)3 +)，3.21(30H，sbroad，N(Me)2 +和N(Me)3 +)，1.35(6H，m，SiCH2CH2CH2SiO  和SiCH2CH2CH2Si)，0.72(4H，m，SiCH2CH2CH2SiO)，0.56(8H，m，SiCH2)，0.13(12H，s，OSiMe2)，-0.07(3H，s，SiMe).NMR-13C{1H}(DMSO-d6)：64.7(CH2O)，56.3，56.0，55.7(CH2N(Me)2 +和CH2N(Me)3 +)，52.6(NMe3 +)，50.9(NMe2 +)，21.2-17.2(碳硅烷骨架的-CH2-基团)，-2，5(OSiMe2)，-5，5(SiMe).C128H316N16O8Si13I16的元素分析.计算的.％：C，33.40；H，6.92；N，4.87.实验的.％：C，32.90；H，6.75；N，4.57。
在下列实施例中描述的试验中使用的该树状聚体接受缩写名称NN16，在下文中将称呼所述名称。在结构式中，分子量(Mw)和正电荷数是下列所示的那些：
NN16：
2G-[SiO(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2I-]8(36)
分子量＝4603.56g/mol
16个正电荷
Figure A20068002687101071
树状聚体对于药物的结合试验
为了试验本发明的树状聚体作为药物载体的应用，所述药物载体在生理pH具有负电荷，进行试验，首先，检验本发明的不同的树状聚体是否能够与多种药物形成络合物并且，然后，证实所述结合是否是可逆的，检验培养基的pH的变化是否引起树状聚体-药物络合物的离解。这意欲模仿在生理条件检验中将发生什么，在一方面，所述树状聚体能够与药物形成络合物，在它经过血液的输送期间防止它们与血浆蛋白质或细胞膜相互作用；另一方面，用具有pH改变的离解试验，尝试复制将在细胞内部找到树状聚体-药物络合物的条件，其中推测所述树状聚体-药物络合物通过核内体渗入或者可以渗入其内部，一旦在细胞质中，通过H+类型的腺苷三磷酸酶输送泵的作用酸化，其中树状聚体应当捕获部分过量质子并释放输送的分子的环境，这将可以使它发挥它的作用。
确定树状聚体-药物结合的试验
进行所述试验所选择的树状聚体是：
-NN(2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +I-)]8(26))
-NN16(2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2I-)]8(36))
-IM16(2G-[Si(OCH2CH2NMe 3 +I-)2]8(19)
进行所述试验所选择的药物，在生理pH全部具有至少一个负电荷，是：
-甲氨喋呤(钠盐)：
1个电荷(-)
供给实验室：Almirall
外观：25mg/ml溶液
赋形剂：NaCl，NaOH，HCl，双-蒸馏的H2O
-肝素(钠盐)
数个电荷(-)
供给实验室：Rovi
外观：10mg/ml溶液(1000U)
赋形剂：对-苯甲酸甲酯，对-苯甲酸丙酯，NaCl，双-蒸馏的H2O
-胰岛素(重组人胰岛素)
4个电荷(-)
供给实验室：诺和诺德(Novo Nordisk)
产品商品名：Actrapid
外观：3.5mg/ml溶液(100U)
赋形剂：ZnCl2，HCl，NaOH，双-蒸馏的H2O
树状聚体和药物之间的结合和络合物形成的测定是通过评价结合到药物的树状聚体相对于游离的树状聚体在聚丙烯酰胺凝胶中的延迟进行的：
-络合物形成：它以30μl混合物的终体积进行，这是装载在所述凝胶中的最大体积。为了进行这个，从必要量的树状聚体开始，一旦已经进行电泳，则所述树状聚体在凝胶中通过用硝酸银染色提供完美地可识别的条带：20μl的100μM溶液，其对应于1.2×1015个分子。以10μl在不同的浓度添加药物以产生选择的(+)和(-)电荷比，也确定混合物中存在的药物分子的数量。虽然对于它的形成可能需要更多的时间，但是在37℃在1小时期间进行所述混合物的温育以给予更加热力学稳定的络合物所用的时间。将每个络合物一式两份进行。
-电泳和凝胶染色：使用的凝胶是7.5％的聚丙烯酰胺/双丙烯酰胺，用1.5M的Tris pH8.8制备。在4小时期间在90伏进行每个电泳，其后用硝酸银将凝胶染色并照相。对于每个关于某一树状聚体和药物之间络合物形成的试验，特别是，在其中以不同的浓度单独装载树状聚体的凝胶中进行上述电泳，以检验它们的状态，将每个浓度放置一式两份，其后在另一个凝胶中进行另一个电泳，其中装载预先温育的树状聚体-药物络合物，也将温育对照混合物装载在一对孔中，其中已经添加树状聚体而没有所述药物，以能够证实对应于树状聚体和药物混合物的泳道中产生的条带延迟的存在。
用每一个试验的树状聚体和药物而产生的结果描述在实施例50至52中。
-实施例50：药物对于NN树状聚体的结合试验
将NN树状聚体以576μM的起始浓度溶解在蒸馏的H2O中，从它进行稀释以产生100μM、10μM和1μM的浓度。用对应于这些浓度的每一个的溶液的等分部分进行的上述电泳表明，所述树状聚体在它们的全部中情况良好。选择100μM的浓度作为容许观察染色后的凝胶中的树状聚体并检测进行电泳而产生的条带中的可能的延迟的浓度，不是游离形式，而是与药物形成络合物。
下面，以下列方式进行与不同的药物的结合试验：
a)甲氨蝶呤
如已经说明，在该试验中使用的甲氨蝶呤以25mg/ml的水溶液形式存在，分子量Mw＝476.427g/mol并且每一分子1个(-)电荷。制备树状聚体-甲氨蝶呤混合物并且温育，其对应于表9中显示如下的特征：
表9.-NN树状聚体-甲氨蝶呤混合物的特征
Figure A20068002687101101
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图26b中，标记为“NN+Met”。这里可以观察到树状聚体以全部络合比针对游离的一种而结合的延迟是如何产生的。因此可以说，形成NN-甲氨蝶呤络合物。当放置更多药物分子(1)时所述延迟不会更大，但是相反，在有较少的(4)的地方较少。这可以是由于下列事实，树状聚体的(+)电荷被甲氨蝶呤分子的易接近性不是自由的，即，全部(+)电荷不能由甲氨蝶呤分子占据，因为可以在它们之间空间地干扰，以便在培养基中高数量甲氨蝶呤分子存在下，它们在它们自己之间通过结合到(+)电荷而竞争，以致所述键不稳定并且结果是其中比理论上提供的每时间单位的那些结合较少药物分子的络合物。形成动态平衡。
b)肝素
在所述试验中使用的肝素以10mg/ml(1000U)存在于水溶液中。因为本发明人没有它的分子量，也没有负电荷的数量，虽然众所周知存在数个，所以与所述树状聚体的结合是通过肝素单位进行的。因而，制备和温育树状聚体-肝素混合物，其对应于在表10中显示如下的特征。
表10.-NN树状聚体-肝素混合物的组成
  对照(Ctrl.)   1   2   3   4
NN100μM(1.2×1015分子)   1.2  1015NN分子+肝素10U   1.2  1015NN分子+肝素1U   1.2  1015NN分子+肝素0.5U   1.2  1015NN分子+肝素0.1U
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图26c中，标记为“NN+Hep”。如可以在所述图观察到，在全部树状聚体/药物比例中，用肝素温育的树状聚体相对于对照发生延迟；实际上，当树状聚体结合到0.1U的肝素时，所述树状聚体仅移动少许。因此可以说，形成NN-肝素络合物。
c)胰岛素
在所述试验中使用的胰岛素以3.5mg/ml(100U)的浓度存在于水溶液中。不管具有它的分子量(5825g/mol)并建立4个(-)电荷的平均值，通过由胰岛素单位的计算而设计与树状聚体的结合，认为着眼于与临床实践中使用的游离胰岛素的剂量的结果比较，它可以是有用的。因而，制备和温育树状聚体-胰岛素混合物，其对应于在表11中显示如下的特征。
表11.-NN树状聚体-胰岛素混合物的特征
Figure A20068002687101121
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果显示在图26d中，标记为“NN+Ins”。在这里，可以观察到，在全部树状聚体/药物比例中，用胰岛素温育的树状聚体相对于对照发生延迟；实际上当它结合到0.1U或0.05U的胰岛素时所述树状聚体仅移动少许。因此，可以说形成NN-胰岛素络合物。
-实施例51：药物对于NN16树状聚体的结合试验
将NN16树状聚体以434μM的起始浓度溶解在蒸馏的H2O中，从它进行稀释以产生100μM、10μM和1μM的浓度。用对应于这些浓度的每一个的溶液的等分部分进行的上述电泳，图27a中显示的凝胶对应于所述电泳，表明所述树状聚体在它们的全部中情况良好。选择100μM的浓度作为容许容易地观察染色后的凝胶中的树状聚体并检测进行电泳而产生的条带中的可能的延迟的浓度，不是游离形式，而是与药物形成络合物。
下面，以下列方式进行与不同的药物的结合试验：
a)甲氨蝶呤
如已经说明，在该试验中使用的甲氨蝶呤以25mg/ml的水溶液形式存在，分子量Mw＝476.427g/mol并且每一分子1个(-)电荷。制备树状聚体-甲氨蝶呤混合物并且温育，其对应于表12中显示如下的特征：
表12.-NN16树状聚体-甲氨蝶呤混合物的特征
Figure A20068002687101131
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图27a中，标记为“NN16+Met”。在全部树状聚体/药物比例中用甲氨蝶呤温育的树状聚体相对于对照虽然不是非常明确的，但是其中可以观察到延迟发生。因此可以说，形成NN16-甲氨蝶呤络合物。
b)肝素
如上述实施例中，在所述试验中使用的肝素以10mg/ml(1000U)存在于水溶液中。因为本发明人没有它的分子量，也没有负电荷的数量，虽然众所周知存在数个，所以与所述树状聚体的结合是通过肝素单位进行的。因而，制备和温育树状聚体-肝素混合物，其对应于在表13中显示如下的特征。
表13.-NN16树状聚体-肝素混合物的组成
  对照(Ctrl.)   1   2   3   4
NN16100μM(1.2×1015分子)   1.2×1015NN16分子+肝素10U  1.2×1015NN16分子+肝素1U   1.2×1015NN16分子+肝素0.5U   1.2×1015NN16分子+肝素0.1U
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图27c中，标记为“NN16+Hep”。如可以在所述图观察到，在全部树状聚体/药物比例中，用肝素温育的树状聚体相对于对照发生延迟；实际上，在含有肝素的树状聚体的孔中没有迁移。因此可以说，形成NN16-肝素络合物。
c)胰岛素
在所述试验中使用的胰岛素以3.5mg/ml(100U)的浓度存在于水溶液中。不管具有它的分子量(5825g/mol)并建立4个(-)电荷的平均值，通过由胰岛素单位的计算而设计与树状聚体的结合，认为着眼于与临床实践中使用的游离胰岛素的剂量的结果比较，它可以是有用的。因而，制备和温育树状聚体-胰岛素混合物，其对应于在表14中显示如下的特征。
表14.-NN16树状聚体-胰岛素混合物的特征
Figure A20068002687101141
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果显示在图27d中，标记为“NN16+Ins”。在这里，可以观察到，在全部树状聚体/药物比例中，用胰岛素温育的树状聚体相对于对照发生延迟；实际上当它结合到0.1U或0.05U的胰岛素时所述树状聚体仅移动少许。因此，可以说形成NN16-胰岛素络合物。
-实施例52：药物对于IM16树状聚体的结合试验
将IM16树状聚体以442μM的起始浓度溶解在蒸馏的H2O中，从它进行稀释以产生100μM、10μM和1μM的浓度。用对应于这些浓度的每一个的溶液的等分部分进行的上述电泳，图28a中显示的凝胶对应于所述电泳，表明所述树状聚体在它们的全部中情况良好。
下面，以下列方式进行与不同的药物的结合试验：
a)甲氨蝶呤
如已经说明，在该试验中使用的甲氨蝶呤以25mg/ml的水溶液形式存在，分子量Mw＝476.427g/mol并且每一分子1个(-)电荷。制备树状聚体-甲氨蝶呤混合物并且温育，其对应于表15中显示如下的特征：
表15.-IM16树状聚体-甲氨蝶呤混合物的特征
Figure A20068002687101151
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图28b中，标记为“IM16+Met”。在全部树状聚体/药物比例中用甲氨蝶呤温育的树状聚体相对于对照，可以观察到没有延迟发生。因此可以说，没有形成IM16-甲氨蝶呤络合物。
b)肝素
如上述实施例50和51中，在所述试验中使用的肝素以10mg/ml(1000U)存在于水溶液中。因为本发明人没有它的分子量，也没有负电荷的数量，虽然众所周知存在数个，所以与所述树状聚体的结合是通过肝素单位进行的。因而，制备和温育树状聚体-肝素混合物，其对应于在表16中显示如下的特征。
表16.-IM16树状聚体-肝素混合物的组成
  对照(Ctrl.)   1   2   3   4
IM16100μM(1.2×1015分子)   1.2×1015IM16分子+肝素10U   1.2×1015IM16分子+肝素1U   1.2×1015IM16分子+肝素0.5U   1.2×1015IM16分子+肝素0.1U
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果，显示在图28c中，标记为“IM16+Hep”。如可以在所述图观察到，对应于类型4(0.1U的肝素)的出现在所述泳道中的条带比对照产生的那些更弱，这表明肝素结合到树状聚体的一小部分。在其它树状聚体/药物比例中，肝素防止树状聚体的迁移。因此可以说，形成IM16-肝素络合物。
c)胰岛素
如实施例50和51中，在所述试验中使用的胰岛素以3.5mg/ml(100U)的浓度存在于水溶液中。不管具有它的分子量(5825g/mol)并建立4个(-)电荷的平均值，通过由胰岛素单位的计算而设计与树状聚体的结合，认为着眼于与临床实践中使用的游离胰岛素的剂量的结果比较，它可以是有用的。因而，制备和温育树状聚体-胰岛素混合物，其对应于在表17中显示如下的特征。
表17.-IM16树状聚体-胰岛素混合物的特征
Figure A20068002687101171
将这些混合物以及不含药物对照的树状聚体进行电泳的结果显示在图28d中，标记为“IM16+Ins”。在这里，可以观察到，在全部树状聚体/药物比例中，用胰岛素温育的树状聚体相对于对照发生延迟，虽然在对应于含有0.05U或0.01U的胰岛素的混合物的泳道中，仅在一些树状聚体分子中发生延迟：对照中的条带迁移但是它是较弱的。实际上，当用0.5U的胰岛素发生温育时迟延是显著的，并且在对应于含有1U胰岛素的树状聚体温育混合物的泳道中，没有条带出现，这表明已经形成络合物，所述络合物没有进入凝胶。因此，可以说形成IM16-胰岛素络合物。
树状聚体-药物络合物对于pH稳定性的测定
一旦已经证实多种药物结合至树状聚体，尝试检验所述结合是否是可逆的，检验对于培养基pH的预期变化，树状聚体-药物络合物的离解是否发生，试图用它复制在生理条件下将发生的，其中假定树状聚体-药物络合物将通过核内体渗入细胞中，在通过H+泵的作用达到细胞质时，其内部将被酸化，这将在捕获该部分过量质子时产生树状聚体药物的释放。
已知，在核内体中达到的pH可以在4.5和6.5之间[77，78，79]。因而，选择进行所述试验的pH是：
5-6-7.4-9-10
虽然在电泳之前在络合物形成方法中引入pH变化的阶段，按照类似于确定树状聚体-药物结合的试验中所使用的方法，通过关于游离的树状聚体评价结合到所述药物的树状聚体的聚丙烯酰胺凝胶中的延迟，再次进行关于预先形成在多种培养基pH的树状聚体-药物络合物的行为的试验，所述方法以下列方式进行：
-络合物形成：将它在30μl的最终混合物体积中进行，这是用于凝胶中装载的最大体积。为了进行这个，本发明人从必要量的树状聚体开始，一旦已经进行电泳，则所述树状聚体在凝胶中通过用硝酸银染色提供完美地可识别的条带：20μl的100μM溶液，其对应于1.2×1015个分子。将所述药物添加在剩余的10μl中，对于它选择最小的浓度，所述浓度根据预先进行的络合物形成试验，相对于对应于游离树状聚体的条带，它能够产生明显的树状聚体-药物络合物条带的延迟；所述浓度的选择确保形成树状聚体-药物络合物。虽然对于它的形成可能需要更多的时间，但是在37℃在1小时期间进行所述混合物的温育以给予更加热力学稳定的络合物所用的时间。对于每个要试验的pH，温育2个混合物。接着，加入10μl的0.1M缓冲液，所述缓冲液能够以0.025M的终浓度保持每个样品中寻求的pH，这在它之中可以实现，然后将每个样品在37℃保持另外15分钟。
-电泳和凝胶染色：以树状聚体-药物结合确定试验中描述的相同条件进行它们。
-树状聚体：
所述试验用IM16树状聚体进行：
(2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +I-)2]8(19).
-药物：
选择胰岛素进行所述试验，向各自反应混合物加入0.5单位(0.5U)。
-缓冲溶液
选择用不同的磷酸盐制备的溶液作为缓冲溶液。为了进行这个，制备缓冲溶液的H2PO4Na，HPO4Na2和PO4Na3种类的每一种的0.2M溶液，每一种为所需的pH，全部0.1M，混合表示在表18中的溶液的体积并用H2O完成至100ml。
表18.-缓冲溶液的组成
  缓冲溶液   pH   体积H2PO4Na 0.2M(ml)   体积HPO4Na20.2M(ml)   体积PO4Na30.2M(ml)   终体积(ml)
  T5   5   49.3   0.7   -   100
  T6   6   43.9   6.1   -   100
  T7.4   7.4   11.2   38.8   -   100
  T9   9   0.4   49.6   -   100
  T10   10   -   49.8   0.2   100
试验的细节和结果描述在下列内容中。
-实施例53：IM16树状聚体-药物络合物的pH稳定性试验
对于树状聚体药物络合物形成制备10个反应混合物(“C”样品：络合物)，向它们的每一个添加20μl的100μM浓度的树状聚体溶液和10μl其含有0.5U的胰岛素溶液。对于每个所述反应混合物制备对照样品(“D”：游离的树状聚体)，其中添加树状聚体而不添加药物。在温育1小时以后，将10μl的缓冲液加入到每个样品，以便20个样品具有表19中显示如下的组成和特征：
表19.-IM16-胰岛素络合物的稳定性试验混合物
Figure A20068002687101201
在添加缓冲液以后的等待时间(15分钟)以后，样品经历电泳和凝胶的染色，产生图29中所示的条带分布，其中样品分布在不同的凝胶中。在所述图中，可以观察到，在酸性pH，游离的树状聚体保持稳定，而在含有络合物的泳道中，观察到条带的出现，为此目的，推断所述络合物的部分离解已经发生并且药物已经从树状聚体释放，使树状聚体成为游离的。在碱性pH，树状聚体是不稳定的并且不降解，这导致络合物的离解。
结论是，IM16树状聚体-胰岛素络合物在酸性pH离解，这可以想到，其它的树状聚体-药物络合物也可以显示类似的行为。
因此，实施例50至53中描述的试验支持所述树状聚体作为带负电荷的药物载体在血液中的应用，并且而且，所述结合是可逆的，在摄取核内体中达到的酸性pH下药物可以释放在细胞内部。
用树状聚体转运的寡核苷酸转染源自神经系统的细胞
因为用PBMC进行的试验表明树状聚体-ODN络合物可以渗入细胞并且在它之中离解，所以进行试验以检测所述树状聚体是否可以在细胞中用作产生低转染率的ODN或具有聚阴离子特征的其它分子诸如RNAi的转染载体，增加转染率。因此，选择由神经系统获得的两个(细胞)系，SK-N-MC(神经母细胞瘤：ATCC HTB 10)和U87-MG(星形胶质细胞瘤：ICLC HTL00013)，并且首先，证实本发明的碳硅烷树状聚体没有毒性，因此，不引起增殖，其后测试在用本发明的树状聚体渗入相同形成的络合物时，这些细胞中的ODN转染率是否可以增强。用树状聚体NN(2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +I-)]8(26))和NN16(2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2I-)]8(36))进行所述试验。用抗-rev RFODN(SEQ ID NO：2)进行转染试验。培养基是DMEM+10％胎牛血清。
-实施例54：用树状聚体温育的SK-N-MC和U-87-MG细胞的增殖
进行不同的实验，一个用SK-N-MC细胞，另一个用U-87-MG细胞，所述实验研究树状聚体对于所述(细胞)系增殖的影响。为此，将相应的7000细胞/孔涂覆在96-孔皿中。用不同的浓度(1μM，5μM和10μM)的NN树状聚体或NN16树状聚体将所述细胞温育3天。作为阳性增殖对照，将细胞用20μg/ml的LPS温育并且，作为阳性死亡诱导对照，使用用7％DMSO温育的细胞。使用未处理的细胞作为阴性对照。在温育3天以后利用来自普洛麦格(Promega)的CellTiter 96第一水溶液(Aqueous OneSolution)细胞增殖试验试剂盒测量细胞增殖，这容许从细胞还原能力的评价量化细胞增殖，所述细胞还原能力从MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羰基甲氧苯基(carboximethoxyphenyl))-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓)与电子偶联剂PES(吩嗪硫酸乙酯)组合的生物还原的比色改变而测定。在对于阴性对照的490nm获得吸光度值，将它给定为数值1并且产生的吸光度部分在那里用于参比。
图30的上部，标记为“A”，显示在U87-MG细胞中获得的结果图。观察到，对应于用树状聚体温育的样品的条形表明其中细胞增殖非常类似于阴性对照(C-)的细胞增殖，为此目的，可以说在用U87-MG细胞系将它们温育三天以后，树状聚体NN和NN16都不诱导增殖也不诱导细胞死亡。
图30的下部，标记为“B”，显示SK-N-MC细胞中产生的结果图。在那里可以观察到，在10μM的浓度，树状聚体NN和NN16对于SK-N-MC细胞系都是毒性的。相反，1μM和5μM的浓度不产生毒性也不产生细胞增殖。
实施例55：树状聚体在U-87-MG细胞中的毒性研究
-用MTT的试验
用U-87-MG细胞进行试验，其中在不同的时间研究树状聚体对于所述细胞系的生存能力的影响。为了进行这个，将每孔15000(24小时温育)、7000(3天温育)或1500(7天温育温育)个细胞涂覆在96-孔板中。用不同的浓度(1μM，5μM和10μM)的NN树状聚体或NN16树状聚体将所述细胞温育24小时、3天和7天。使用两个不同的阴性对照：未处理的细胞(C-)和另外地，用不同浓度(1μM，5μM和10μM)的葡聚糖温育的细胞，在新的生物材料试验中一般将大分子用作细胞毒性的阴性对照。也使用两个不同的阳性对照：用7％DMSO处理的细胞和用1％Triton X-100处理的细胞。
为了能够进行其它的参考研究，在24小时、3和7天以后也研究了商业的树状聚体Superfect
Figure A20068002687101221
和Polyfect
Figure A20068002687101222
(二者都来自恰根(Qiagen))。在Superfect的情况下，试验三个剂量，由制造商推荐的最佳剂量(2.5μl)，较低的剂量(1.25μl)和另一个较高的剂量(5μl)。关于Polyfect，具体而言为粘附细胞所设计的，三个试验剂量是：最佳剂量(0.6μl)，较低的剂量(0.3μl)和较高的剂量(1.2μl)。
在每个相应的温育时间以后，用MTT以类似于实施例38中所描述的进行试验。在未处理的细胞(C-)中获得的吸光度值，将它给定为数值1，并且将产生的吸光度部分用于参考它。
图31可以观察用U87-MG细胞产生的结果。上部的绘图，标记为“A”，对应于在温育24小时以后产生的值；位于中部区域的绘图，标记为“B”，对应于在温育3天以后产生的值；最后，位于下部的图，标记为“C”，对应于在温育7天以后产生的值。
在所述绘图中，可以观察到，在24小时以后和3和7天以后，用葡聚糖处理的细胞具有等于或大于0.8的生存能力值。
在温育24小时以后，在任一项浓度中，商业的树状聚体Superfect产生类似的细胞生存能力，等于0.7。在三天以后，甚至在较低的剂量(1.25μl)，该值降低，达到具有高达0.4的值。在用Superfect温育7天以后，在使用的三个剂量的任何一个中，细胞是死的。
在三个试验剂量的任何一个中，Polyfect树状聚体具有比Superfect更低的毒性。
关于本发明的树状聚体NN和NN16，相对于阴性对照，在24小时以后产生的生存能力相互类似并且发现在0.6和0.75之间的范围内。在NN树状聚体的情况下，增加浓度时，在3天以后的细胞生存能力降低，从1μM的浓度的0.95的值至10μM的0.5的值。关于NN16树状聚体，在研究的三个浓度的任何一种，它具有接近于0.8的值。在用碳硅烷树状聚体温育7天以后，U87-MG具有接近于或超过阴性对照的生存能力，不同之处在于在NN16在10μM浓度的情况下，其生存能力是0.7。
-上清液中乳酸脱氢酶浓度(LDH)的测量
评价由树状聚体诱导的细胞毒性的另一种形式是通过定量细胞培养上清液中LDH的浓度，这被认为是某一化合物或分子的细胞毒性的直接测量，并且给出细胞在膜中经历的损伤的概念。因此，类似于通过MTT测定的，在U87-MG细胞中进行生存能力试验，虽然在该情况下，在向其添加葡聚糖的培养基中温育24小时以后，所述生存能力通过测量本发明的树状聚体NN或NN16、DMSO或Triton X-100的细胞上清培养物中LDH的浓度而测量。在用MTT进行的试验中使用的这些化合物的每一种的浓度和体积是相同的。按照制造商的说明书，将来自罗氏应用科学(Roche Applied Science)的商业试剂盒细胞毒性检测试剂盒(CytotoxicityDetection KitPLUS)(LDH)用于测定乳酸脱氢酶。
为了评价所述结果，将数值1赋予阴性对照(未处理的细胞)，从它计算温育细胞的每个化合物的细胞毒性值。
产生的结果，显示在图32中，表明，如用MTT进行的试验中所观察，在任何所述浓度，Polyfect是具有最低毒性的商业树状聚体，而Superfect随着浓度增加而在膜中产生更大的损伤，直到产生比最大剂量(5μl)的阴性对照高达5倍或更大的细胞毒性。
随着它们的浓度增加，NN和NN16树状聚体具有更大的细胞毒性。相互比较，NN16比NN是更低毒性的。
实施例56：SK-N-MC细胞中树状聚体的毒性研究
在SK-N-MC细胞中进行类似于实施例55中对于U87-MG细胞所描述(通过用MTT进行的试验评价细胞生存能力和定量细胞上清液中的LDH)的那些的试验：将所述细胞用相同化合物在相同浓度温育，虽然在该情况下用单独的MTT的测量是在温育24小时以后进行的。
如实施例55中，将用MTT的试验中产生的吸光度值表示成阴性对照，产生图33(A)的上部中所示的结果。
根据这些结果，在使用的任何一项浓度，用葡聚糖温育的细胞显示等于或大于阴性对照的那些的生存能力值。
在使用的任何三个浓度，用Polyfect处理的细胞具有超过0.7的生存能力，与用Superfect处理细胞时所发生的相反，其产生大约0.5的生存能力。
关于本发明的树状聚体，观察到与U87-MG细胞系中所发生的相反，树状聚体浓度的改变产生非常剧烈的细胞生存能力的变化。在试验的本发明的两个树状聚体(NN和NN16)中，NN16是具有最低毒性的一种。
在LDH定量试验中，将数值1赋予阴性对照，从所述数值计算另一个细胞毒性值，并且产生图33(B)的下部中所示的结果。产生的结果证实关于用MTT的试验所作出的观察。
实施例57：通过树状聚体介导的U87-MG和SK-N-MC细胞的转染
将100000个相应细胞系的细胞/孔涂覆在含有500μl培养基的24-孔板中。
用树状聚体NN和NN16和发荧光的抗-rev反义寡聚核苷酸在总体积为75μl的不含血清的培养基中形成树状合物，其中以250nM的浓度和不同比例的相应的树状聚体混合抗-rev寡聚核苷酸，以便获得不同的-电荷/+电荷比例：1∶1，1∶2，1∶4和1∶8。将所述混合物在环境温度温育半小时然后将它添加到相应的孔以便用树状合物温育所述细胞。
在温育24小时以后，从所述孔除去细胞，将它们用PBS洗涤两次，将它们用酸性甘氨酸温育1分钟以除去可能的已经粘附在细胞膜上的树状合物的部分，并且用PBS进行最后的洗涤。最后，将所述细胞再悬浮在500μl的PBS中，并且通过流式细胞术定量细胞内部发荧光的寡聚核苷酸的数量。
图34a和34b显示用U87-MG细胞系产生的结果。所述图对应于用不含树状聚体的寡聚核苷酸(Ctrl)或用络合物温育细胞产生的结果，所述络合物用一种树状聚体和抗-rev寡聚核苷酸成比例地形成，其产生每个图上表示的-电荷/+电荷比：1∶1，1∶2，1∶4和1∶8。图34a对应于用NN树状聚体进行的试验，而图34b对应于用NN16树状聚体进行的试验。在两者情况下，所述图可以观察到，用更大量的树状聚体形成的络合物温育U87-MG细胞产生转染的增加，在仅用寡聚核苷酸(Ctrl)温育细胞情况下产生的19％增加至用-电荷/+电荷比例为1∶8形成的树状合物时的95％，以及在用也具有-电荷/+电荷比例为1∶8的NN16树状聚体形成的树状合物温育情况下的97.8％。因此，结果表明，相对于所述寡聚核苷酸的树状聚体增加产生转染的细胞的百分比增加，达到当-电荷/+电荷是1∶8的最大转染点。
图35显示用SK-N-MC细胞系用NN16树状聚体产生的结果。在该情况下，用-电荷/+电荷比例为1∶4形成的树状合物产生最大转染(82.3％)。
在一个细胞系和另一个中，相对于用单独的核苷酸温育时所产生的，在用树状合物温育所述细胞时，产生转染百分比的增加，特别是当-电荷/+电荷比例是1∶4或1∶8时，即，根据要转染的细胞类型和形成树状合物的特定树状聚体和寡聚核苷酸，虽然最佳-电荷/+电荷比例可以是不同的，但是当树状聚体相对于任何其它的寡聚核苷酸的比例增加时，所述寡聚核苷酸由核苷酸或由脱氧核糖核苷酸组成，产生类似的结果。在任何情况下，描述的试验支持本发明的碳硅烷树状聚体作为载体的应用，以增加聚阴离子分子诸如寡核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸(ODN)或干扰RNA(RNAi)的转染。
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序列表
<110>阿卡拉大学
<120>新的碳硅烷树状聚体、它们的制备和它们的用途
<130>PCT-281
<160>6
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>反义寡脱氧核苷酸
<223>GF
<220>
<223>反-gag
<220>
<223>核苷酸之间的硫代磷酸酯键
<220>
<223>5’的荧光素
<400>1
ctctcgcacc catctctctc cttct                      25
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>反义寡脱氧核苷酸
<223>RF
<220>
<223>反-Rev
<220>
<223>核苷酸之间的硫代磷酸酯键
<220>
<223>5’的荧光素
<400>2
tcgtcgctgt ctccgcttct tcctgcca                28
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>反义寡脱氧核苷酸
<223>PPT
<220>
<223>反-mRNA
<220>
<223>核苷酸之间的硫代磷酸酯键
<400>3
aattttcttt tcccccct                           18
<210>4
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>反义寡脱氧核苷酸
<223>PPT-TFO
<220>
<223>三螺旋前体
<220>
<223>核苷酸之间的硫代磷酸酯键
<400>4
ttttcttttg ggggg                                   15
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>反义寡脱氧核苷酸
<223>TAR
<220>
<223>反-TAR
<220>
<223>核苷酸之间的硫代磷酸酯键
<400>5
gctcccgggc tcgacc                                  16
<210>6
<211>21
<212>RNA/DNA
<213>人工序列
<220>
<221>干扰RNA
<220>
<221>DNA
<222>20-21
<223>脱氧核糖核苷酸
<223>ipRNA 抗-CD4
<400>6
gaucaagaga cuccucagug a                                       21

Claims (172)

1.支链碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体它们的分支末端的终止部分含有符合下式任何一项的伯、仲、叔或季氨基：
Figure A2006800268710002C1
如果它们是第一代；
Figure A2006800268710002C2
如果它们是第二代；
如果它们是第三代；
或符合在更后代情况下的相应类似式，其中对应于每个第i代的式将通过用下列类型的新嵌段取代对应于上代的式中的Xp而产生：
将与硅原子结合的基团从被(Ri-1)3-p所表示变化为被(Ri-1)3-z所表示，所述硅原子为该取代嵌段结合的相同硅原子，
式中：
Alq1，Alq2，Alq3，........Alqi表示根据每代中的分支长度相互独立选择的2至4个碳的亚烷基部分；
R1，R2，R3，..........Ri-1，Ri表示在甲基和苯基中相互独立选择的部分；
X表示含有至少一个伯、仲、叔或季氨基的部分；
p是在1和3之间变化的整数；
m，n，....z是独立地在1和3之间变化的整数。
2.根据权利要求1的碳硅烷树状聚体，其中所述部分Alq1，Alq2，Alq3，......Alqi在1，2-亚乙基和1，2-亚丙基之中独立地选择。
3.根据权利要求2的碳硅烷树状聚体，其中所述部分Alq1，Alq2，Alq3，...Alqi全部相同并且表示1，2-亚丙基部分。
4.根据权利要求1的碳硅烷树状聚体，其中所述整数m，n，...z是相互相同的并且具有数值2。
5.根据权利要求1的碳硅烷树状聚体，其中所述部分R1，R2，R3，.........Ri-1，Ri是全部相同的并且表示甲基部分。
6.根据权利要求1至5的碳硅烷树状聚体，其中所述部分Alq1，Alq2，Alq3，...Alqi是相互相同的并且表示1，2-亚丙基部分；整数m，n，...j相互相同并且具有数值2并且所述部分R1，R2，R3，.........Ri-1，Ri是全部相同的并且表示甲基部分。
7.根据权利要求6的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分通过由醇-胺的-OH基团形成的-O-基团结合到树状聚体。
8.根据权利要求7的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分选自部分
-OCH2CH2N(CH3)2，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N(CH3)2)2和-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2。
9.根据权利要求8的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分是部分-OCH2CH2N(CH3)2。
10.根据权利要求9的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2CH2N(CH3)2部分终止。
11.根据权利要求10的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
12.根据权利要求9的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2CH2N(CH3)2部分终止。
13.根据权利要求12的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
14.根据权利要求8的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分是部分-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N(CH3)2)。
15.根据权利要求14的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N(CH3)2)2部分终止。
16.根据权利要求15的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
17.根据权利要求14的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N(CH3)2)2部分终止。
18.根据权利要求17的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
19.根据权利要求8的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分是部分-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2。
20.根据权利要求19的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2部分终止。
21.根据权利要求20的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
22.根据权利要求19的碳硅烷树状聚体，其中“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2部分终止。
23.根据权利要求22的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
24.根据权利要求6的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的分支的末端部分通过-CH2-基团结合到树状聚体，所述-CH2-基团由化合物中作为碳-碳双键的形成部分的末端碳所形成，所述化合物含有至少一个氨基，使用所述氨基将所述树状聚体进行反应而产生分支的末端部分。
25.根据权利要求24的碳硅烷树状聚体，其中所述分支的末端部分符合式-CH2CH2(CH2)e-NH2，其中“e”是0和2之间的数。
26.根据权利要求25的碳硅烷树状聚体，其中“e”取数值1，含有至少一个氨基的分支的末端部分符合式-CH2CH2CH2-NH2。
27.根据权利要求26的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-CH2CH2CH2-NH2部分终止。
28.根据权利要求27的碳硅烷树状聚体，其中所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
29.根据权利要求6的碳硅烷树状聚体，其中存在于所述分支的末端部分中的部分或全部氨基是季铵化的。
30.根据权利要求29的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分选自部分-OCH2CH2N+(CH3)3I-，-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2和-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-。
31.根据权利要求30的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分是部分-OCH2CH2N+(CH3)3I-。
32.根据权利要求31的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2CH2N+(CH3)3I-部分终止。
33.根据权利要求32的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
34.根据权利要求31的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2CH2N+(CH3)3I-部分终止。
35.根据权利要求34的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
36.根据权利要求30的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分是部分-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2。
37.根据权利要求36的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2部分终止。
38.根据权利要求37的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
39.根据权利要求36的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2-(C6H3)-3，5-(OCH2CH2N+(CH3)3)I-)2部分终止。
40.根据权利要求39的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
41.根据权利要求30的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分是部分-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-。
42.根据权利要求41的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-部分终止。
43.根据权利要求42的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
44.根据权利要求41的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值2并且每个分支以两个-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3I-部分终止。
45.根据权利要求44的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
46.根据权利要求29的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分符合式-CH2CH2(CH2)e-N+H3Cl-，其中“e”是0和2之间的整数。
47.根据权利要求46的碳硅烷树状聚体，其中“e”取数值1，含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分符合式-CH2CH2CH2-N+H3Cl-。
48.根据权利要求47的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-CH2CH2CH2-N+H3Cl-部分终止。
49.根据权利要求48的碳硅烷树状聚体，其中所述碳硅烷树状聚体是第一、第二或第三代。
50.根据权利要求6的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个氨基的末端部分形成抗原部分的一部分。
51.根据权利要求50的碳硅烷树状聚体，其中所述胺部分形成肽的一部分。
52.碳硅烷树状聚体的制备方法，所述方法包含下列阶段：
a)按照下列步骤生产碳硅烷树状聚体骨架：
a1)产生下式的基础起始碳硅烷树状聚体：
Si[(CH2)aCH＝CH2]4
其中根据所述分支所需的长度，a在0和2之间变化，使SiCl4与BrMg(CH2)aCH＝CH2反应；
a2)产生后一代树状聚体的第一代碳硅烷树状聚体前体，使a1)的基础起始碳硅烷树状聚体与HSi(R1)3-mClm反应，以便生产下式的树状聚体：
Figure A2006800268710007C1
其中
m在1和3之间变化并且等于可以在下一代中实现的分支的数目或者等于可以将Cl基团取代的末端官能团的数目；
R1表示苯基或甲基部分；
a3)任选地，产生后一代树状聚体的第二代碳硅烷树状聚体前体，将具有在阶段a2)中产生的Si-Cl端键的所述衍生物进行阶段a1)和a2)的重复，即，
i)产生新的分支，使相应的具有Si-Cl端键的衍生物与BrMg(CH2)bCH＝CH2反应，其中根据那些分支所需的长度，“b”
在0和2之间变化，并且可以与“a”下标相同或不同；
ii)使i)中产生的新一代的碳硅烷树状聚体骨架与HSi(R2)3-nCln反应，其中“n”在1和3之间变化并且可以与前一代的“m”下标相同或不同并且R2表示苯基或甲基部分；
a4)任选地，产生较后代的树状聚体的相继代前体的碳硅烷树状聚体，使相应于前一代的含有Si-Cl端键的衍生物进行对利用BrMg(CH2)cCH＝CH2试剂的阶段a3)i)的重复和利用HSi(R3)3-zClz试剂的阶段a3)ii)的重复的探寻，所述试剂其中“c”在0和2之间变化并且“z”在1和3之间变化；
a5)产生最终的碳硅烷树状聚体骨架，在阶段b)中向所述骨架加入含有至少一个氨基的部分，其中在阶段a2)、a3)中或阶段a4)的重复i-1中，取决于所述树状聚体是否分别是第一、第二或第i代，使用HSi(Ri)3-pClp试剂，其中“p”在1和3之间变化并且Ri表示苯基或甲基部分；
b)按照下列路线之一，产生含有具有伯、仲或叔氨基的末端部分的碳硅烷树状聚体：
b1)引起阶段a5)中产生的碳硅烷树状聚体的Si-Cl端键的醇解，在过量碱存在下将它与伯、仲或叔醇-胺反应；
b2)预先产生含有Si-H端键的碳硅烷树状聚体，含有至少一个伯、仲或叔氨基的部分将随后结合到所述碳硅烷树状聚体，使它经过下列阶段：
i)产生任何代的碳硅烷树状聚体的含有Si-H端键的衍生物，使相应的碳硅烷树状聚体与Si-Cl键与能够放弃氢化物基团的试剂反应，以便Cl原子的部分或全部由H原子取代；
ii)使含有Si-H键的碳硅烷树状聚体在氢化硅烷化催化剂存在下与含有伯、仲或叔氨基并且在一端具有碳-碳双键的化合物反应，以便所述化合物通过其中存在双键的末端结合到所述树状聚体；
c)任选地，通过将阶段b)中产生的树状聚体与A-Hal试剂的反应，产生含有具有季铵化氨基的末端部分的碳硅烷树状聚体，其中A表示氢、1至10个碳的烷基或芳基原子并且Hal表示Cl，Br，I。
53.根据权利要求52的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中起始试剂的“a”下标等于1，因此是BrMgCH2CH＝CH2。
54.根据权利要求52的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中用于在任选的阶段a3)i)中产生新分支的BrMg(CH2)bCH＝CH2试剂的“b”下标和用于在每一个任选的阶段a4)的重复中产生新分支的BrMg(CH2)cCH＝CH2试剂的不同的“c”下标等于1，因此，所述试剂是BrMgCH2CH＝CH2。
55.根据权利要求53和54的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在起始阶段a1)和其中经由任选的阶段a3)i)或通过任选的阶段a4)的重复而产生新分支的全部场合中都使用BrMgCH2CH＝CH2试剂。
56.根据权利要求52至55任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段a2)的HSi(R1)3-mClm的部分R1，作为用于在任选阶段a3)ii)中产生含有Si-Cl端键的衍生物的HSi(R2)3-nCln的部分R2，和任选的阶段a4)的重复中的HSi(Ri)3-zClz试剂的相继Ri部分是相互全部相同的并且相应于甲基部分。
57.根据权利要求52至56任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段a2)的试剂HSi(R1)3-mClm试剂的“m”下标和任选阶段a3)ii)的试剂HSi(R2)3-nCln的“n”下标和任选的阶段a4)的重复的试剂HSi(Ri)3-zClz的“z”下标都相互全部相同并且等于2，在全部情况下都使用试剂HSi(Ri)1Cl2。
58.根据权利要求56和57的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中：
-阶段a2)的试剂HSi(R1)3-mClm的部分R1和任选阶段a3)ii)中用于产生含有Si-Cl端键的衍生物的试剂HSi(R2)3-nCln的部分R2和任选的阶段a4)的重复中使用的试剂HSi(Ri)3-zClz的相继Ri部分都是相互全部相同的并且相应于甲基部分；
-阶段a2)的试剂HSi(R1)3-mClm的“m”下标和任选阶段a3)ii)的试剂HSi(R2)3-nCln的“n”下标和任选的阶段a4)的重复的试剂HSi(Ri)3-zClz的“z”下标都相互全部相同并且等于2；
由此在产生Si-Cl端键的全部步骤中，意欲容许通过由新的分支取代Cl部分的每一个而产生较后代的衍生物，使用的试剂是HSiCH3Cl2。
59.根据权利要求55和58的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中：
-在起始阶段a1)和通过任选阶段a3)i)或通过任选的阶段a4)的重复获得新分支的全部那些情况中使用试剂BrMgCH2CH＝CH2；
-在产生Si-Cl端键的全部步骤中，意欲通过由新分支取代Cl部分的每一个而容许较后代的衍生物的产生，使用的试剂是HSiCH3Cl2。
60.根据权利要求59的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中用于在最终碳硅烷树状聚体骨架中产生末端Si-Cl键的试剂HSi(Ri)3-pClp是HSi(CH3)2Cl，在阶段b)中将含有氨基的部分加入到所述骨架。
61.根据权利要求60的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在与醇-胺反应的路线b1)之后，含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架在阶段
b)中结合到含有至少一个氨基的部分。
62.根据权利要求61的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在阶段b1)中用醇-胺处理含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体，所述醇-胺选自：N，N-二乙基乙醇胺(CH2OH-CH2-N(CH3)2)，2-[(2-(二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)或3，5-双(二甲基氨基乙氧基)苯甲醇(CH2OH-(C6H3)-(O-CH2-CH2-N(CH3)2)2)。
63.根据权利要求62的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中优选地，关于存在于阶段a)中产生的最终碳硅烷树状聚体骨架中的Si-Cl端键的数目使用化学计量的量的所选择的醇-胺。
64.根据权利要求62或63的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段b1)中产生的碳硅烷树状聚体的氨基的季铵化的任选阶段c)是用过量的CH3I处理它而进行的。
65.根据权利要求62至64的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a2)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第一代碳硅烷树状聚体。
66.根据权利要求62至64的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a3)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第二代碳硅烷树状聚体。
67.根据权利要求62至64的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a4)的首次实施符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第三代碳硅烷树状聚体。
68.根据权利要求59的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中用于在最终碳硅烷树状聚体骨架中产生Si-Cl端键的试剂HSi(Ri)3-pClp是HSiCH3Cl2，在阶段b)中将具有氨基的部分加入到所述骨架。
69.根据权利要求68的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在与醇-胺反应的路线b1)之后，在阶段b)中含有至少一个氨基的部分与具有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架结合。
70.根据权利要求69的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在阶段b1)中用醇-胺处理含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体，所述醇-胺选自：N，N-二乙基乙醇胺(CH2OH-CH2-N(CH3)2)，2-[(2-(二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)或3，5-双(二甲基氨基乙氧基)苯甲醇(CH2OH-(C6H3)-(O-CH2-CH2-N(CH3)2)2)。
71.根据权利要求70的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中优选地，关于存在于阶段a)中产生的最终碳硅烷树状聚体骨架中的Si-Cl端键的数目使用化学计量的量的所选择的醇-胺。
72.根据权利要求70或71的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段b1)中产生的碳硅烷树状聚体的氨基的季铵化的任选阶段c)是用过量的CH3I处理它而进行的。
73.根据权利要求70至72的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a2)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第一代碳硅烷树状聚体。
74.根据权利要求70至72的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a3)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第二代碳硅烷树状聚体。
75.根据权利要求70至72的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用醇-胺处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a4)的首次实施符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第三代碳硅烷树状聚体。
76.根据权利要求60或68的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在与一端具有碳-碳双键并且含有至少一个氨基的化合物的反应的路线b2)之后，在阶段b)将含有至少一个氨基的部分结合到含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架。
77.根据权利要求76的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中能够放弃氢化物基团而将部分或全部Si-Cl键转化成Si-H键的试剂是LiAlH4并且用于结合到含有Si-H键的碳硅烷树状聚体的氢化硅烷化催化剂是通过末端含有伯、仲或叔氨基的化合物，其中所述化合物具有碳-碳双键，是Karstedt催化剂。
78.根据权利要求77的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在一个末端具有碳-碳双键的化合物是式CH2＝CH-(CH2)e-NH2的伯亚烷基胺，其中所述“e”下标在0和2之间变化。
79.根据权利要求78的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中式CH2＝CH-(CH2)e-NH2的“e”下标具有数值1，在阶段b2)中使用的亚烷基胺是丙烯胺，CH2＝CH-CH2-NH2。
80.根据权利要求79的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中优选地，关于存在于所述碳硅烷树状聚体骨架中的Si-H键的数目使用化学计量的量的烯丙胺。
81.根据权利要求79或80的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段b2)中产生的碳硅烷树状聚体的氨基的季铵化的任选阶段c)是用HCl将其处理而进行的。
82.根据权利要求79至81的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b2)中用LiAlH4处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a2)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第一代碳硅烷树状聚体。
83.根据权利要求79至81的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b2)中用LiAlH4处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a3)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第二代碳硅烷树状聚体。
84.根据权利要求79至81的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b2)中用LiAlH4处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a4)的首次实施符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第三代碳硅烷树状聚体。
85.含有至少一种根据权利要求1至51的任一项的碳硅烷树状聚体的组合物。
86.根据权利要求85的组合物，所述组合物还含有至少一种阴离子或聚阴离子特征的分子。
87.根据权利要求86的组合物，其中聚阴离子特征的分子是核酸序列或其衍生物。
88.根据权利要求87的组合物，其中所述核酸序列或其衍生物是反义DNA。
89.根据权利要求88的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种具有用作反义DNA或其衍生物的载体以降低反义DNA与血浆蛋白质或与细胞表面的相互反应的可能性的目的。
90.根据权利要求89的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种具有促进在那里存在的至少一种反义DNA或其衍生物的控释的目的。
91.根据权利要求90的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种是选自NN、IM8和/或IM16的树状聚体。
92.根据权利要求88至91的任一项的组合物，其中所述反义DNA具有序列SEQ ID NO：1。
93.根据权利要求88至91的任一项的组合物，其中所述反义DNA具有序列SEQ ID NO：2。
94.根据权利要求88至91的任一项的组合物，其中所述反义DNA具有序列SEQ ID NO：3。
95.根据权利要求88至91的任一项的组合物，其中所述反义DNA具有序列SEQ ID NO：4。
96.根据权利要求88至91的任一项的组合物，其中所述反义DNA具有序列SEQ ID NO：5。
97.根据权利要求87的组合物，其中核酸序列或其衍生物是双链的DNA序列。
98.根据权利要求97的组合物，其中核酸序列或其衍生物是质粒或病毒的DNA衍生物。
99.根据权利要求86的组合物，其中聚阴离子特征的分子是干扰RNA或其衍生物。
100.根据权利要求99的组合物，其中所述干扰RNA的分子含有序列SEQ ID NO：6。
101.根据权利要求86的组合物，其中阴离子特征的分子是在生理pH带负电荷的药物。
102.根据权利要求101的组合物，其中所述带负电荷的药物是乙酰水杨酸、吲哚美辛、呋塞米、青霉素、苯妥英、甲苯磺丁脲、华法林、萘啶酸或氯噻嗪。
103.根据权利要求85的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种具有用作活性物质的目的，所述活性物质被设计成预防和/或治疗由病毒或由朊病毒所引起的疾病，所述活性物质能够干扰所述病毒或朊病毒的生活周期。
104.根据权利要求103的组合物，其中试图预防或治疗的疾病是由HIV病毒所引起。
105.根据权利要求104的组合物，其中至少存在NN树状聚体。
106.根据权利要求85的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种具有用作活性物质的目的，所述活性物质被设计成预防和/或治疗由细菌或由真菌所引起的疾病，所述细菌或真菌的细胞膜或壁容许被所述树状聚体所改变。
107.根据权利要求85的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体的至少一种具有用作活性物质的目的，所述活性物质被设计成干扰蛋白质聚集体的形成或促进蛋白质聚集体的溶解，所述蛋白质聚集体诸如出现在阿尔茨海默病或由朊病毒所引起的脑病中的那些。
108.一种组合物，所述组合物含有根据权利要求50和51的任何一项的碳硅烷树状聚体的至少一种，所述组合物被设计成发动免疫反应，防止或保护它所提供到的个体免于由生物体所引起的疾病，其中所述生物体含有结合到所述树状聚体的肽或抗原部分。
109.根据权利要求86至108任何一项的组合物，所述组合物被设计成通过离子电渗疗法、通过经皮途径或吸入而施用。
110.根据权利要求86至108任何一项的组合物，所述组合物被设计成被注射。
111.根据权利要求86至108任何一项的组合物，所述组合物被设计成能与它的膜形成涂敷假体结构或斯坦特固定模网状物，以便从它们产生本发明的至少一种树状聚体或存在于所述组合物中的至少一种物质的控释。
112.含有至少一种根据权利要求85的碳硅烷树状聚体的组合物，所述组合物被设计成能用于将核酸分子固定至表面，诸如核苷酸序列的微芯片的基底。
113.根据权利要求112的组合物，其中所述树状聚体是Phe和/或ClNH4。
114.根据权利要求1至51任一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85至96的任何一项的组合物在制造药物中的应用，所述药物用于预防或治疗由病毒或通过基因的改变而产生的疾病，所述疾病的症状可以通过利用反义DNA减轻或消除。
115.根据权利要求114的应用，其中试图预防或治疗的疾病的一种是由HIV病毒产生的。
116.根据权利要求1至51任一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85或97的任何一项的组合物在制造药物中的应用，所述药物用于预防或治疗病症或疾病，所述病症或疾病的症状可以通过在细胞中引入双链DNA而减轻或消除。
117.根据权利要求116的应用，其中所述双链DNA在它针对的细胞中能够表达至少一种蛋白质。
118.根据权利要求1至51任一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85、99或100的任何一项的组合物在制造药物中的应用，所述药物用于预防或治疗由病毒或通过基因的改变而产生的病症或疾病，所述病症或疾病的症状可以利用一个或多个干扰RNAs减轻或消除。
119.根据权利要求1至51的任何一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85、101或102的任何一项的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于预防或治疗病症或疾病，所述病症或疾病可以通过施用在生理pH具有负电荷的药物而减轻或消除。
120.根据权利要求1至51任何一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85、103、104或105的任何一项的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于预防或治疗由病毒或朊病毒产生的病症或疾病，所述树状聚体能够干扰所述病毒或朊病毒的生活周期。
121.根据权利要求1至51任何一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85或106的任何一项的组合物在药物制造中的应用，所述药物用于预防或治疗由细菌或由真菌产生的病症或疾病，所述细菌或真菌的细胞膜或壁容许被所述树状聚体改变。
122.根据权利要求1至51任何一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85或107任何一项的组合物在药物制造中的应用，所述药物被设计成干扰蛋白质聚集体的形成或促进蛋白质聚集体的溶解，所述蛋白质聚集体诸如阿尔茨海默病或由朊病毒所引起的脑病中出现的那些。
123.根据权利要求50或51任何一项的碳硅烷树状聚体或根据权利要求85或108任何一项的组合物在制造药物中的应用，所述药物被设计成发动免疫反应，所述免疫反应防止或保护免受由含有存在于所述树状聚体中的肽或抗原部分的生物体所引起的疾病。
124.根据权利要求24的碳硅烷树状聚体，其中所述分支的末端部分对应于式-(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N(CH3)2。
125.根据权利要求124的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N(CH3)2部分终止。
126.根据权利要求125的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一或第二代。
127.根据权利要求29的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分是部分-(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N+(CH3)3I-。
128.根据权利要求127的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N+(CH3)3I-部分终止。
129.根据权利要求128的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一或第二代。
130.根据权利要求29的碳硅烷树状聚体，其中含有至少一个季铵化氨基的分支的末端部分是部分-O(CH2)2N(CH3)2(CH2)2NMe3 +2I-。
131.根据权利要求130的碳硅烷树状聚体，其中所述“p”下标取数值1并且每个分支以单独的-O(CH2)2N(CH3)2(CH2)2NMe3 +2I-部分终止。
132.根据权利要求131的碳硅烷树状聚体，所述碳硅烷树状聚体是第一或第二代。
133.根据权利要求77的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中在一端具有碳-碳双键的化合物是(CH2＝CH-CH2)C6H3(OCH3){O(CH2)2N(CH3)2。
134.根据权利要求133的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中优选地，关于存在于所述碳硅烷树状聚体骨架中的Si-H键的数目使用化学计量的量的(CH2＝CH-CH2)C6H3(OCH3){O(CH2)2N(CH3)2。
135.根据权利要求133或134的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段b2)中产生的碳硅烷树状聚体的氨基的季铵化的任选阶段c)是用CH3I处理它而进行的。
136.根据权利要求133至135的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b2)i)中用LiAlH4处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a2)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第一代碳硅烷树状聚体。
137.根据权利要求133至135的任一项的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b2)i)中用LiAlH4处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a3)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第二代碳硅烷树状聚体。
138.根据权利要求62的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架在阶段b1)中用2-[(2-二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)处理。
139.根据权利要求138的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中优选地，关于阶段a)中产生的最终碳硅烷树状聚体骨架中的Si-Cl端键的数目使用化学计量的量的2-[(2-二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)。
140.根据权利要求139的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中阶段b1)中产生的碳硅烷树状聚体的过量MeI的季铵化任选的阶段c)是用过量CH3I处理而进行的，过量是关于实现季铵化所需的化学计量的量计算的，所述季铵化是存在于所述分支的末端氨基中的氮原子和存在于其余的内部氨基中的氮原子的季铵化，所述内部氨基也从构成所述碳硅烷树状聚体骨架的分支末端的醇-胺形成所述部分的一部分。
141.根据权利要求140的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用2-[(2-二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a2)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第一代碳硅烷树状聚体。
142.根据权利要求140的碳硅烷树状聚体的制备方法，其中已经产生了在阶段b1)中用2-[(2-二甲基氨基乙基)甲基]氨基乙醇(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2)处理的含有Si-Cl端键的最终碳硅烷树状聚体骨架，使阶段a3)符合碳硅烷树状聚体骨架的产生完成的阶段a5)，在阶段b)中产生第二代碳硅烷树状聚体。
143.根据权利要求101的组合物，其中带负电荷的药物是甲氨蝶呤、肝素或胰岛素。
144.根据权利要求143的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体选自NN、NN16或IM16。
145.根据权利要求144的组合物，其中存在的碳硅烷树状聚体是NN16并且所述药物是胰岛素。
146.根据权利要求119的应用，其中使用碳硅烷树状聚体用于制造的药物含有甲氨蝶呤、肝素或胰岛素。
147.根据权利要求146的应用，其中所述药物含有胰岛素。
148.根据权利要求146或147的应用，其中在制造所述药物中使用的碳硅烷树状聚体选自NN、NN16或IM16。
149.根据权利要求148的应用，其中在制造所述药物中使用的碳硅烷树状聚体是NN16并且所述药物含有胰岛素。
150.根据权利要求1至51的任何一项的碳硅烷树状聚体的应用，用于在生理pH增加阴离子或聚阴离子特征的分子的转染率，碳硅烷树状聚体与所述分子在所述pH形成络合物。
151.根据权利要求150的应用，其中所述阴离子或聚阴离子特征的分子是核酸或其衍生物。
152.根据权利要求151的应用，其中所述核酸是反义DNA或干扰RNA。
153.根据权利要求151或152的应用，其中转染的细胞是神经系统的细胞或从神经系统衍生的细胞系。
154.根据权利要求153的应用，其中想要增加其转染率的核酸是反义DNA。
155.根据权利要求154的应用，其中所述树状聚体与反义DNA以1∶1和1∶8之间变化的负电荷∶正电荷的比率形成络合物。
156.根据权利要求155的应用，其中所述树状聚体选自NN和NN16。
157.根据权利要求153至156的应用，其中转染的细胞是细胞系U87-MG。
158.根据权利要求157的应用，其中所述树状聚体与反义DNA以负电荷∶正电荷比率为1∶8而形成络合物。
159.根据权利要求158的应用，其中所述树状聚体是NN。
160.根据权利要求158的应用，其中所述树状聚体是NN16。
161.根据权利要求153至156的应用，其中转染的细胞是细胞系SK-N-MC。
162.根据权利要求161的应用，其中所述树状聚体与反义DNA以负电荷∶正电荷比率为1∶4而形成络合物。
163.根据权利要求162的应用，其中所述树状聚体是NN16。
164.增加阴离子或聚阴离子特征的分子在生理pH的转染率的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求1至51任何一项的碳硅烷树状聚体，阴离子或聚阴离子特征的分子与所述碳硅烷树状聚体能够在生理pH形成络合物。
165.根据权利要求164的试剂盒，其中转染的细胞是神经系统的细胞或从神经系统衍生的细胞系。
166.根据权利要求165的试剂盒，其中想要增加其在生理pH下的转染率的阴离子或聚阴离子特征的分子是核酸或其衍生物。
167.根据权利要求166的试剂盒，其中所述核酸是反义DNA或干扰RNA。
168.根据权利要求166或167任何一项的试剂盒，其中所述核酸还包括在所述试剂盒中。
169.根据权利要求168的试剂盒，其中将所述核酸以组合物形式包括在所述试剂盒中，该组合物与其中所述碳硅烷树状聚体形成部分的组合物分开。
170.根据权利要求168的试剂盒，其中将所述核酸以组合物形式包括在所述试剂盒中，其中所述碳硅烷树状聚体形成相同组合物的部分。
171.根据权利要求170的试剂盒，其中将所述核酸以组合物形式包括在所述试剂盒中，其中所述树状聚体以1∶1和1∶8之间变化的负电荷∶正电荷比率形成相同组合物的部分。
172.根据权利要求164至171任何一项的试剂盒，其中所述碳硅烷树状聚体选自NN和NN16。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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