CN102858851A - 碳硅烷树枝状化合物及其作为抗病毒剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碳硅烷树枝状化合物及其作为抗病毒剂的用途,具体而言,本发明涉及从一种多官能核,优选硅或多酚合成的高度支化的高分子化合物,具有碳硅烷结构,其外层用基团,优选阴离子基团进行了功能化,这些基团使这种高分子化合物带有净负电荷。此外,本发明涉及其合成步骤及其作为抗病毒剂、抗细菌和抗真菌剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一类高度支化的高分子化合物,这类化合物由一种名为树枝状化合物的多官能核合成,其具有碳硅烷结构,且外层用阴离子基团进行了功能化,这些基团使这类高分子化合物带有净负电荷。此外,本发明还涉及此类化合物的合成工艺及其生物医学应用。
背景技术
现有多种表面带有净负电荷且用作抗病毒剂的树枝状化合物或树枝化聚合物,因为HIV、HSV等多类病毒都可与聚阴离子化合物结合。因此,磺化多糖通常是有效的病毒抑制剂。在这类聚阴离子树枝状化合物中,一些实施例已得到描述,例如末端带羧酸酯或磺酸酯基团的聚赖氨酸树枝状化合物,此物质可有效阻断HSV感染(参照Gong,Y.等Antiviral Res,2002,55(2),319-329)。同一批作者对小鼠进行的研究表明,这些树枝状化合物可保护这些动物的阴道不被感染,磺酸酯衍生物可干扰受感染细胞中病毒复制的最后阶段。
经证实,一些相似的具有聚赖氨酸骨架和末端羧酸酯或磺酸酯基团的树枝状化合物也可在体外有效抑制HIV(参照McCarthy,TD等Mol Pharm.2005Jul-Aug;2(4):312-8)。聚阴离子树枝状化合物可抑制病毒进入细胞和两种病毒酶(逆转录酶和整合酶)的活性,这表明这些聚阴离子衍生物可能作用于HIV的不同复制周期,具体取决于它们在细胞内的整合和放置方式。最近一些研究表明,带磺酸酯基团的树枝状化合物可保护雌性猕猴的阴道不被猴免疫缺陷病毒(SIV)感染。
在本节中,我们重点介绍了配制成凝胶剂的带有负电荷的树枝状化合物,其名称为SPL7013。这种树枝状化合物由一家澳大利亚制药公司开发,体外和体内研究显示,这种化合物是进入市场的最佳候补产品,它将成为第一个商品化的具有明确生物化学应用的树枝状化合物。SPL7013是一种赖氨酸基树枝状化合物,其表面具有萘二磺酸基团,且是一种名为的阴道杀微生物凝胶剂的活性成分。它是HIV-1许多菌株的体外强效抑制剂。它可用于预防HIV和外生殖器疱疹的阴道传播。因此,由Dezutti及其同事进行的一项研究表明,这种树枝状化合物的一种盖伦制剂(5%)对上皮细胞的毒性很低,且可有效预防HIV-1感染外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞,以及HIV-1从上皮细胞转移到PBMC。后续研究表明,每日涂抹浓度为1-3%的SPL7013凝胶可良好耐受。对于此凝胶剂在直肠给药情况下,它对HIV-1感染的预防作用也获得了相似结果。此外,用SPL7013胶凝剂对猕猴进行的阴道水平的研究表明,使用5%浓度的胶凝剂时不会对阴道粘膜产生刺激征,且可以完全(100%)保护猕猴不被SIV感染。还使用PAMAM型或PPI型骨架制备了其它与SPL7013相似的树枝状化合物,这些化合物具有类似生物活性,但由于合成工艺的不同而未得到商业化利用。
其它被描述为抗病毒剂的阴离子树枝状化合物为:BRI2923,这是一种树枝状化合物样聚酰胺胺(PAMAM),它由氨核生长而成,表面用24个萘二磺酸基团进行了功能化。BRI6195,这也是一种PAMAM树枝状化合物型,它由乙二胺核生长而成,表面用32个苯基二羧酸酯基团进行了功能化。这些树枝状化合物可抑制HIV的不同菌株在MT-4细胞系中的复制(参照Jiang YH等,AIDS Res Hum.Retriviruses,2005,21,207)。
基于含磷原子骨架的树枝状化合物的合成方法已经发表,这类树枝状化合物的表面用磷酸酯阴离子基团进行了功能化(参照L.Griffe,等,Angew.Chem Int Ed,2007,46,2523)。这些树枝状化合物在自然杀伤细胞(NK)的活化和增殖方面表现出很高的活性。这些数据给我们带来了希望,因为它们为可能需要大量NK细胞的抗病毒或抗癌免疫疗法的应用提供了机会。
发明内容
本发明提供一类高度支化的高分子化合物,这类化合物由一种名为树状化合物多官能核合成,具有碳硅烷结构,其外层用羧基、磺基或磷酸基团进行了功能化,优先使用可使大分子带净负电的阴离子基团。此外,本发明还提供了其制备工艺及其在生物医学领域的应用。
本发明的第一方面涉及一种碳硅烷树枝状化合物,其包括:一种多官能核(Nu)和一个外层,其全部或部分存在于结构式(I)所代表基团的相同或不同单元中:
其中:R'为烷基(C1-C4),p为1至3内的一个整数,优选为1,X为以下结构式(II)代表的基团:
-E-N[-(CH2)z-R1]2
(II)
其中E为连接基团,其位于通式(I)的硅原子和胺基的氮原子之间。
z为1至4内的一个整数,R1选自于由-COOR2、-SO3R2以及-PO3(R2)2所组成的群组,R2为氢原子或烷基(C1-C4)。
本文所述的“碳硅烷树枝状化合物”指的是一种高度支化的球形大分子,其中,树枝状化合物的生长核具有多个官能团,生长单元、枝杈或分支具有碳硅烷骨架,树枝状化合物的外层、表面或外围包含了官能团。这种表面或外层相当于分支末端。
本文所述的“多官能核”一词是指一种与至少两个分支共价结合的多功能元素或化合物,即,至少应为二价。在一种优选实施方案中,此核为四价,更 优选地,此核为硅(即,一种硅基)。在另一优选实施方案中,此核可以为一种多酚,“多酚”一词是指一种在任意位置被至少两个羟基取代的苯分子,例如1,4-二羟基苯、1,2-二羟基苯或1,3-二羟基苯,更优选地为氢醌(1,4-二羟基苯),但可以有三、四、五或六个羟基。更优选地,多酚被三个基团取代,优选1,3,5-三羟基苯。
本文所述的“连接基团”是指任何用于连接分支的基团,分支与核心相连,其官能团位于树枝状化合物的外层。E结合基团优先从烷基(C1-C10)或基团-(CH2)x-R3(R3可为三唑或酚盐基团,x为1至6之间的一个整数)中选择。
本文所述的“烷基”一词是指直链或支链的脂肪链。对于R'和R2,这些分支具有1至4个碳原子,例如,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基或仲丁基,优选的烷基为甲基。对于结合基团(E),这些链具有1至10个碳原子,更优选地为具有1至4个碳原子的链烷基,更优选地,连接基团(E)为丙基。
在另一优选实施方案中,结合基团(E)为-(CH2)x-R3,R3为以下结构式所代表的三唑:
其中,x如上文所述,更优选地,x为4。
在另一优选实施方案中,结合基团(E)为-(CH2)x-R3,R3为以下结构式所代表的酚盐:
其中,x如上文所述,更优选地,x为1。
当R1为COOR2基团或-SO3R2基团时,R2优选为氢原子或甲基,更优选地,z为2。当R1为-PO3(R2)时,R2优选为氢原子或甲基,更优选地,z为1。
本发明的树枝状化合物也可以为阴离子,形成羧酸酯、磷酸酯或磺酸酯基团。
因此,本发明不仅包括树枝状化合物本身,还包括其任何盐类,例如,碱金属或碱土金属盐,这些盐可以从钠盐、钾盐或钙盐中选择,优选钠盐。
在另一优选实施方案中,树枝状化合物的代数可以为零,可以用以下结构式(III)表示:
其中:Nu代表一种如上文所定义的多官能核,Ra为一种烷基(C1-C6),y为2至6内的一个整数,当多官能核为硅时优选4,R为上文所述的通式(I)代表的端基。如果多官能核为硅或多酚,结构式(III)代表的树枝状化合物可以分别如结构式IIIa或IIIb所示:
其中R、Ra和y的定义如上文所述。对于IIIb,y优选为3。
“代数”一词是指制备树枝状化合物所需的分支重复数。
在另一优选实施方案中,树枝状化合物至少为第一代树枝状化合物,可以用以下通式(IV)表示:
其中:Nu代表一种如上文所定义的多官能核,Ra、Rb和RII为相同或不同基团且,代表一种烷基(C1-C6),m为1至3之间的一个整数,m优选2;y为2至6之间的一个整数,R为上文所述的通式(I)的端基。如果多官能核为硅或多酚,结构式(IV)代表的树枝状化合物可以分别如结构式IVa或IVb所示:
其中:R、Ra、Rb、RII、m和y的定义如上文所述。对于IVb,y优选为3。
在另一优选实施方案中,树枝状化合物至少为第二代树枝状化合物,可以用以下通式(V)表示:
其中:Nu代表一种如上文所定义的多官能核,Ra、Rb、Rc、RII和RIII为相同或不同基团,且代表一种烷基(C1-C6),m和n为相同或不同数字,且为1至3之间的一个整数;m和/或n优选2,y为2至6之间的一个整数,R为上文所述的通式(I)的端基。如果多官能核为硅或多酚,结构式(V)代表的树枝状化合物可以分别如结构式Va或Vb所示:
其中:R、Ra、Rb、Rc、RII、RIII、m、n和y的定义如上文所述。对于Vb,y优选3。
在另一优选实施方案中,树枝状化合物至少为第三代树枝状化合物,可以用以下通式(VI)表示:
其中:Ra、Rb、Rc、Rd、RII、RIII和RIV为相同或不同基团,且代表一种烷基(C1-C6),m、n和q为相同或不同数字,且为1至3之间的一个整数;m、n和/或q优选2;y为2至6之间的一个整数,R为上文所述的通式(I)的端基。如果中心核为硅或多酚,结构式(VI)代表的树枝状化合物可以分别如结构式VIa或VIb所示:
(VIb)
其中:R、Ra、Rb、Rc、Rd、RII、RIII、RIV、m、n、q和y已在上文中描述过。对于VIb,y优选3。
在结构式(III)、(IV)、(V)或(VI)所代表的树枝状聚合物中,自由基Ra、Rb、Rc或Rd可以为相同或不同基团,且优选代表一种烷基(C2-C4)。在另一优选实施方案中,基团RII、RIII和RIV相互独立,且代表一种烷基(C1-C4),更优选地为甲基。
本发明所述的这些有机硅烷树枝状化合物可以从一个多价核出发,通过发散合成法(从内向外生长),利用已知反应,经过不同代数,以高收率制备而成,多价核优选四烯丙基硅烷,随后的表面功能化采用不同官能团,优选阴离子。羧酸酯和磺酸酯树枝状化合物性质稳定且溶于水。树枝状化合物能够以钠盐、酸或氨基酸形式获得,具体取决于pH值,因此可提供更广泛的功能应用。它们的合成方法相对简单,更容易大量获得。此外,碳硅烷树枝状化合物具有较高化学惰性,这对任何生物医学应用的研究都非常有用。
对于合成在焦点处具有官能团的楔型树枝状分子或碳硅烷型树状体,允许将这样一些树状体偶联到一个多价核上。对于对所获得的树枝状化合物的外层进行适当功能化,允许获得具有羧酸酯、磺酸酯或磷酸酯等端基的阴离子树枝状化合物。也就是说,可按照一种含3个步骤的合成顺序来制备这些阴离子衍生物:
·合成具有一个焦点和经过适当功能化的外层的树状体或楔型树枝状分子。
·将上一节中合成的树状体或楔型树枝状分子偶联到一个核上。
·用不同性质的阴离子基团,例如羧酸酯、磺酸酯或磷酸酯,对上一节中获得的树枝状化合物的外层进行功能化。
可以使用一种发散生长策略,从卤代烷开始合成这些楔型树枝状分子,更优选地,从溴代烷开始,例如烯丙基溴或4-溴丁烯。根据在这些树状体外层中实现的功能化类型,可使用楔型树枝状分子,这使阴离子碳硅烷树枝状化合物的获取过程具有广泛的功能性。通过这种方式可制备楔型树枝状分子,这种分子的焦点处具有一种溴烷基BrCH2-Dend的,且其表面具有不同基团,例如:烯丙基、Si-H或Si-Cl、酯端基等。这些楔型树枝状分子的一种普遍外形如图16所示。
树状体的焦点处可能具有官能团-CH2Br,因此可将其固定在中心核上,使树枝状化合物的表面具有不同官能团。对于在各种衍生物(例如多酚)的焦点处具有C-Br键的楔型树枝状分子,其偶联反应通常可以在丙酮、四氢呋喃(THF)或二甲基甲酰胺(DMF)等溶剂中进行,在碱(例如碳酸钾(K2CO3)或碳酸铯(Cs2CO3))存在下将反应液加热至60至100°C反应数小时,然后加入冠醚(例如18-C-6)以促进无机盐溶解于所用的有机溶剂中。
合成上文所述的树枝状化合物后,可通过不同途径形成表面具有羧基、磷酸基或磺酸基——更优选地为它们的阴离子基团——的树枝状化合物,具体途径首先取决于起始树枝状化合物的性质,其次根据最终树枝状化合物所需的阴离子基团的性质:
因此,可使用两种方法获得羧酸酯衍生物,第一种方法是通过铂催化剂使烯丙基胺与末端为Si-H的树枝状化合物发生硅氢加成反应,接着通过Michael加成反应将丙烯酸甲酯加成到氨基,末端为-NH2的树枝状化合物上,然后进行酯基转换反应,最后用NaOH等碱处理,得到羧酸酯基。第二种方法是先通过丙烯酸甲酯的Michael型加成反应制备一种具有端胺基的烯丙基酯,然后使功能化的烯丙基胺与末端为Si-H的树枝状化合物发生硅氢加成反应。在这种情况下,最终步骤也是通过加入碱使端酯基转变为羧酸酯基。
另一方面,可以先通过烯丙基胺与末端为Si-H的树枝状化合物发生的硅氢加成反应制备具有磺酸酯基团的树枝状化合物,然后通过Michael型加成反应将乙烯基磺酸钠加成到第一步制得的末端为NH2-的树枝状化合物上。
对于磷酸酯衍生物的制备,可以先合成末端为NH2-的树枝状化合物,然后通过加入亚磷酸甲酯HPO(OMe)2引入相应基团。可以再次通过在上一步获得的树枝状化合物中加入碱,例如NaOH,来形成具有端磷酸酯基团的阴离子衍生物。
因此,本发明的另一方面涉及一种获得本发明所述树枝状化合物的方法,包括通过Michael型加成反应将一种含多价核和端NH2基团的树枝状化合物加成到一种含羧基或磺酸基的烯烃上,例如丙烯酸甲酯或乙烯基磺酸酯(用于用羧酸酯或磺酸酯基团对树枝状化合物表面进行功能化)或使这些树枝状化合物与甲醛和磷酸二甲酯发生两步反应(用于用磷酸酯基团对树枝状化合物表面进行功能化)。一种方案可以如下所示:
方案1
其中:E、z和R1已在上文中描述,n代表代数(G),X代表端基数,该数字取决于代数。
本文所述的“烯烃”是指含至少一个末端双键的直链或支链不饱和烃,其碳链具有2至4个碳原子,还包含一个羧基或磺酸酯基团。
对于获得本发明所述的树枝状化合物,在该过程的一种优选实施方案中,可以通过烯丙基胺与末端为Si-H键的不同代碳硅烷树枝状化合物发生的硅氢加成反应获得末端为NH2基团的树枝状化合物。
在另一首选实施方案中,通过以下方法获得含一个NH2基团的树枝状化合物:
a)合成在焦点处具有卤代烷基并用来自卤代烯烃的烯丙基进行了功能化的树状体;
b)将步骤(a)获得的树状体偶联到一多价核上
c)用端NH2基团对步骤(b)获得的树枝状化合物进行功能化。
本发明的另一方面涉及一种获得本发明所述树枝状化合物的方法,其包含一种含Si-H基团的树枝状化合物与用羧基、磷酸基或磺酸基进行功能化的端烯丙基胺基团发生的硅氢加成反应。
在另一优选实施方案中,通过以下方法获得含多价核的多价树枝状化合物和Si-H端基:
a)合成在焦点处具有卤代烷基并用从卤代烯烃制得的Si-H基团进行了功能化的树状体;
b)将步骤(a)获得的树状体偶联到一个多价核上,或者
a’)合成在焦点处具有卤代烷基并用从卤代烯烃制得的烯丙基进行了功能化的树状体
b’)将步骤(a’)获得的树状体偶联到一个核上,
c’)用Si-H端基对步骤(b’)获得的树枝状化合物进行功能化。
本发明所述的“卤代烯烃”是指一种被一个卤素原子(例如溴、碘或氯)取代的烯烃(C1-C6),更优选地为一种溴代烯烃(C1-C6),甚至更优选地为一种溴代烯烃(C2-C4),例如溴代4-溴丁烷。
在获得本发明所述的树枝状化合物的过程中,可使用“点击化学”方法将含有炔丙基胺的碳硅烷树枝状化合物连接到用端叠氮基进行了功能化的不同代碳硅烷树枝状化合物,以此获得末端为NH2基团的树枝状化合物。但是,如上文所述,也可以提前将羧基、磺酸基或磷酸基连接到树枝状化合物骨架的表面,对氨基末端进行功能化。
因此,本发明的另一方面涉及一种获得本发明所述的树枝状化合物的方法,包括先用羧基、磺酸基、磷酸基或它们的前体基团对有机胺进行功能化,再连接到末端具有Si-H键或用端叠氮基团进行了功能化的不同代碳硅烷树枝状化合物上。
另一方面,本发明涉及结构式(VII)代表的一种化合物:
Et3-R (VII)
其中,Et为一种乙基基团,R为上文所述的结构式(I)的末端基团,一种-Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p基团或基团-Si(R')3-p[E-NH2]p,其中R'为一种烷基基团(C1-C4),R'优选甲基,p为1至3之间的整数,优选为1,E为上文所述的一种结合基团。
因此,其它反应中间体可以为用叠氮或胺端基进行了功能化的碳硅烷树枝状化合物,其包含:
——一个如上文所定义的多官能核,优选为四烯丙基硅烷或多酚
——一个外层,其全部或部分存在于基团-Si(R')3-p[(CH2)4-N3]p或基团-Si(R')3-p[E-NH2]p的相同或不同单元中,其中:R'、p和E已在上文中描述过,E优选基团-(CH2)x-R3,R3为三唑,x的定义如权利要求6所述,x优选为4。
本发明所述的树枝状化合物可用于生物医学的不同领域,其中包括用作治疗剂、抗病毒剂、抗菌剂或抗朊病毒药物。除了抗微生物活性,它还具有抗炎活性,因此具有更好的疾病预防性质,因为在存在炎性过程的情况下,感染HIV的机率会大大增加。显然,一种良好的阴道局部用杀微生物剂应能预防HIV感染并保持阴道上皮屏障的完整性。从这个意义上说,阴道发炎过程可能通过以下方式来提高HIV感染几率:激活树突状细胞并将T细胞(HIV的靶细胞)募集到炎症部位,增大HIV感染风险并通过细胞因子激活转录过程,调节转录因子NF-kappaB,转录因子再与HIV结合并激活HIV。转录因子NF-kappaB是抗炎化合物的一个主要药物靶点。除了具有在当前技术水平下已知的其它树枝状化合物所具有的抗病毒活性、抗菌活性或抗朊病毒活性,本发明所述的树枝状化合物还具有另外的优点,即抗炎性质。
因此,本发明的另一方面涉及用作预防和/或治疗由病毒、细菌或真菌所致疾病的备选药物的树枝状化合物,更优选地,当疾病是由HIV毒株引起时。更优选地,这些树枝状化合物为阴离子。
作为一种抗病毒剂,本发明所述的纳米级尺寸的树枝状化合物可防止病毒附着于靶细胞,防止靶细胞受感染,以及防止产生新病毒颗粒。
除了疾病预防方面的应用,根据实验结果,这种纳米颗粒还可防止尚未受感染的细胞受到感染,本发明所述的树枝状化合物还具有治疗效果,因为在受感染细胞中,这种纳米颗粒可减少HIV病毒复制,但其主要对性传播疾病(STD)有治疗效果(抗病毒、抗细菌或抗真菌)。因此在一优选实施方案中,疾病是指性传播疾病,本发明所述的树枝状化合物可用作这类疾病的抗病毒、抗细菌或抗真菌系统。
本发明所述的“性传播疾病”一词是指通过与感染了此类疾病的人发生性关系而患上的传染病,这种传染病可能是由细菌、真菌、原生动物和病毒引起的,例如由HIV引起的传染病。与HIV感染者进行无保护性交是绝大多数HIV感染的发生原因。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物,其包含至少一种如上文所述的树枝状化合物以及一种药学上可接受的载体。此外,这种药物组合物可以包含另一种活性产物。
可用于此类组合物的“药学上可接受的载体”是当前技术水平下的专家已知的载体。
药物组合物的实施例包括用于口服给药、经鼻腔给药、局部给药或非消化道给药的任何固体(片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂等)或液体(凝胶、溶液、混悬剂或乳浊液),优选的给药方式为局部给药,优选剂型为胶凝剂。
本发明的另一方面涉及一种治疗或预防哺乳动物体内(优选人类)由病毒、细菌或真菌引起的疾病的方式,其包含一种至少含一种本发明所述树枝状化合物组合物的有疗效剂量的给药。该组合物的优选给药方式为口服给药、经鼻腔给药、局部给药或非消化道给药。
本文所用的“有疗效剂量”一词是指经过计算可以产生所需效果,且通常根据,尤其是组合物的性质、患者年龄、状况和病史、疾病的严重程度、及给药途径和频率来确定的组合物的用量。
本发明所述的树枝状化合物还可用作输送分子的载体,优选具有药理活性(有活性)的分子,使用带负电荷的树枝状化合物时,更优选地为带正电荷的分子。
在描述的内容和权利要求中,“包含”一词及其同义词不排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。对于现有技术水平下的专家,本发明的其他目的、优点和特征将从描述的内容和本发明的部分实施中显现。下列实施例和附图是作为实施例提供的,不对本发明构成限制。
附图说明
图1显示的是浓度为10μM的具有羧酸酯(G1COO8、G2COO16和G3COO32)和磺酸酯(G1SF8、G2SF16和G3SF32)端基的三代阴离子树枝状化合物在HEC-1A(人子宫内膜上皮细胞)中的细胞毒性。图1A,LDH检测(乳酸脱氢酶释放法)。Tx-100(triton x-100)1%表示100%毒性。图1B,溴化物MTT检测。DMSO 20%表示100%毒性。Dx(葡聚糖)被用作一种安全的对照分子。DxS(葡聚糖硫酸酯)和苏拉明是具有阴离子基团的分子,被用作抑制HIV的阳性对照分子。
图2显示的是PBMC在不同浓度的G2COO16和G2SF16中的生存力。图2A,LDH检测和图2B,MTT检测。
图3显示的是G2SF16树枝状化合物对人血红细胞的细胞毒性(血红蛋白释放到上清液中)。
图4表现的是对PBMC进行的4日淋巴细胞增生检测。用2μg/mL的PHA(纯化的植物血凝素)刺激PBMC。图4A显示,树枝状化合物G2SF16不具有促有丝分裂作用。图4B显示,树枝状化合物G2SF16抑制了PHA在PBMC中的促有丝分裂作用。
图5表现的是在不同的时间,用树枝状化合物G2COO16和G2SF16进行预处理的情况下,针对病毒颗粒对单层上皮细胞的粘附而进行的试验。通过酶免疫测定法确定培养基上清液(p24ELISA)中的Agp24的数量,以此评估HIV的数量。图5A为感染24小时后的结果,图5B为感染72小时后的结果。
图6显示的是通过细胞系HEC-1A对病毒颗粒进行的内化试验。先用树枝状化合物将细胞处理1小时,然后用X4HIV NL4.3将细胞感染3小时。感染后,用0.2%的TX-100溶解HEC-1A细胞,以确定细胞内的病毒颗粒的数量。
图7显示的是树枝状化合物和病毒颗粒间的相互作用机制。在与PBMC接触前,先用树枝状化合物对毒株X4HIV NL4.3和R5HIV Bal进行预处理。4天后收集病毒上清液。
图8显示的是在HEC-1A中对转胞吞作用的抑制。我们评估了用于刺激单层阴道粘膜的穿透小室装置的基底侧上清液中Agp24的数量。
图9显示的是对树枝状化合物G2SF16在PBMC中的疾病预防作用和治疗作用进行的评估。在用HIV感染前后的不同时间处理PBMC,以分析树枝状化合物G2SF16的活性。T-20是一种抑制病毒膜与细胞膜融合的抑制剂,它通过gp41蛋白抑制病毒进入细胞,AZT是一种逆转录酶抑制剂。概括而言,二者均为病毒复制抑制剂,均可用作抑制病毒复制的对照物。图9A为预处理,即先添加树枝状化合物再感染,图9B为后处理,即先感染再添加树枝状化合物。
图10显示的是对HIV进入树突状细胞和巨噬细胞的抑制作用。用树枝状化合物G2SF16将细胞预处理1小时。用毒株X4HIV NL4.3(黑条)和R5HIV Bal(灰条)感染细胞。
图11显示的是阴离子碳硅烷树枝状化合物的杀菌作用。该图表现的是用金黄色葡萄球菌(S.aureus)后处理24小时后,氨苄西林及树枝状化合物G2SF16和G2COO16的浓度依赖性。三角形斜坡表示抗生素(2,1,0.5,0.25,1.12,0.6,0.3,0.15μg/mL)或树枝状化合物(160,80,40,20,10,5,2.5,1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
图12显示的是阴离子碳硅烷树枝状化合物的抑菌作用。该图表现的是用金黄色葡萄球菌(S.aureus)后处理24小时后,氨苄西林及树枝状化合物G2SF16和G2COO16的浓度依赖性。三角形斜坡表示抗生素(2,1,0.5,0.25,1.12,0.6,0.3,0.15g/mL)或树枝状化合物(160,80,40,20,10,5,2.5,1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
图13显示的是对通过点击化学获得的树枝状化合物的生物兼容性及其对HIV进入的抑制作用进行的研究。图13A表现的是通过MTT检测获得的树枝状化合物在HEC-1A细胞中的毒性曲线。图13B显示的是在感染前用树枝状化合物G2CKC0016和G2CKP32预处理1小时后,对HIV进入HEC-1A细胞的抑制作用。
图14显示的是肿瘤坏死因子-α(TNF)在T淋巴细胞中的抑制作用。在G2SF16的存在下用pTNF-luc质粒转染Jurkat细胞。aTNF是抗肿瘤坏死因子-α。
图15显示的是在G2SF16的存在下用质粒pNF-kB-luc转染Jurkat细胞的结果。
图16为一种在焦点(F.p.f)和外层(FP)具有双官能团的碳硅烷楔型树枝状分子(树状体)的示意图。
图17显示的是三代树枝状化合物与MT-2细胞接触24小时后,LDH的释放情况进行的研究。
图18显示的是三代树枝状化合物与PBMC细胞接触24小时后,对LDH的释放情况进行的研究。
图19显示的是PBMC与不同浓度的树枝状化合物接触24小时后,对PBMC中的线粒体活性进行的研究。
图20表现的是在单层HEC-1A细胞中对HIV转胞吞作用的抑制作用。先用树枝状化合物对此单层细胞进行预处理,再在顶端部分用70ng Bal病毒处理1小时,48小时后收集基底侧上清液。
图21表现的是用G2O3SF24预处理1小时后对PBMC感染的抑制作用。将所有试剂加入孔板中10μM的最终浓度。
图22显示的是4天后针对巨噬细胞(M)、未成熟树突状细胞(Di)和成熟树突状细胞(Dm)中的感染抑制情况进行的试验。先将细胞预处理1小时,再用NL4.3(3ng)感染。
图23表现的是杀菌作用取决于用金黄色葡萄球菌(S.aureus)后处理24小时后氨苄西林(商品化抗生素)及树枝状化合物G2O3SF24的浓度。三角形斜坡表示抗生素(2,1,0.5,0.25,1.12,0.6,0.3,0.15μg/mL)或树枝状化合物(160,80,40,20,10,5,2.5,1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
图24表现的是抑菌作用取决于用金黄色葡萄球菌(S.aureus)后处理24小时后氨苄西林(商品化抗生素)及树枝状化合物G2O3SF24的浓度。三角形斜坡表示抗生素(2;1;0.5;0.25;1.12;0.6;0.3;0.15μg/mL)或树枝状化合物(160;80;40;20;10;5;2.5;1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
图25表现的是杀真菌作用取决于用人白色念珠菌(C.albicans.)后处理24小时后两性霉素B(商品化杀真菌剂)及树枝状化合物G2O3SF24的浓度。三角形斜坡表示两性霉素B(2;1;0.5;0.25;1.12;0.6;0.3;0.15μg/mL)或树枝状化合物(160;80;40;20;10;5;2.5;1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
图26表现的是抑制真菌作用取决于用人白色念珠菌(C.albicans.)后处理24小时后两性霉素B(商品化杀真菌剂)及树枝状化合物G2O3SF24的浓度。三角形斜坡表示两性霉素B(2;1;0.5;0.25;1.12;0.6;0.3;0.15μg/mL)或树枝状化合物(160;80;40;20;10;5;2.5;1.25μM)的浓度在下降。灰条代表浓度为10μM的树枝状化合物。
具体实施方式
以下内容通过发明人进行的试验来阐述本发明,重点描述了碳硅烷树枝状化合物的效力及其合成方法。
实施例1:合成本发明所述的从硅核生长而成的树枝状化合物。
按照下列两种方法合成:
方法1:从具有端氨基的四烯丙基硅烷合成碳硅烷树枝状化合物。
通过两种策略合成具有端氨基的碳硅烷树枝状化合物:1)使烯丙基胺与末端含Si-H键的不同代碳硅烷树枝状化合物发生硅氢加成反应,或者2)使用点击化学方法将炔丙基胺连接到含端叠氮基的不同代碳硅烷树枝状化合物上。
方法1(a):从通过烯丙基胺的硅氢加成获得的具有端胺基的碳硅烷树枝
状化合物合成阴离子树枝状化合物。
为了简化这些实施例中所述的树枝状化合物的命名方式,通常可以将其表示为Gn-(Fp)x,其中:
n,表示代(G)数。
F表示位于树枝状化合物外层的官能团的性质。
p表示每个分支中的官能团数。
x表示树枝状化合物上存在的末端单元数。
当树枝状化合物为第零代时,G0,n=0,或者当其为第一代时,G1,n=1,或者第二代,G2,即n=2,其一般结构如下所示:
相应的单核化合物为:Et3-[Fp],其中Et为乙基。
从具有氨端基的碳硅烷树枝状化合物或其三乙基硅基取代的单核对应化合物(Et3-[Si(CH2)3NH2](1)开始制备阴离子树枝状化合物,其中F为Si(CH2)3NH2基团,分子式为Gn-[Si(CH2)3NH2]x,(n=0,x=4(2);n=1,x=8(3);n=2,x=16(4))。可按照文献中描述的反应,通过发散合成法制备这些不同代的树枝状化合物(M.Angeles-Fernández等“Water-SolubleCarbosilane Dendrimers:Synthesis,Biocompatibility and Complexation withOligonucleotides;evaluation for Medical Applications”Chem.Eur.J..2007,13,483-495)。可按照下文所述的步骤从这些化合物获得具有羧酸酯基团、磺酸酯基团或磷酸酯基团的阴离子树枝状化合物:
方法1(a):羧酸酯树枝状化合物
使丙烯酸甲酯与具有端氨基-NH2的树枝状化合物发生Michael加成反应,以此来合成不同代的阴离子羧酸酯树枝状化合物,如上文所述的1-4。反应条件如方案2所述,最终得到无色的油状树枝状化合物Gn-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]x:(三乙基硅基:Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2](5);G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]4n=0,x=4(6);G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]8,n=1,x=8(7);G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2COOMe)2]16 n=2,x=16(8)),该物质易溶于常见的有机溶剂,但不溶于水。下图所示为三乙基硅基中间体(5)和树枝状化合物(6)、(7)、(8)的结构。
用NaOH处理衍生物5-8可使后者转化为相应的阴离子羧酸酯衍生物,最终得到化合物Gn-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]x:三乙基硅烷Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2](9);G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]4 n=0,x=4(10);G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]8n=1,x=8(11);G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]x n=2,x=16(12),这类化合物以白色固体形态分离出来,它们易溶于水,且收率高(方案2)。再用1M的HCl水溶液处理化合物9-12,得到阳离子衍生物Gn-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]x:三乙基硅基Et3-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2](13);G0-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]4,n=0,x=4(14);G1-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]8 n=2,x=8(15);G2-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2COOH)2]16 n=3,x=16(16))(方案2)。
方案2
用NaOH溶液处理,也可使衍生物13-16可逆地转化为阴离子树枝状化合物9-12,如果再用1M的HCl水溶液处理,则可使其恢复为衍生物13-16(方案2)。
下图为树枝状化合物13和14的一个示例:
方法1(a):磺酸酯树枝状化合物。
使乙烯基磺酸钠与具有端氨基-NH2的树枝状化合物发生Michael加成反应,以此来合成具有磺酸酯端基的阴离子树枝状化合物,1至4。此反应在乙醇-水混合溶液中进行,加热到120°C,最终以易溶于水的白色固体形态得到阴离子衍生物Gn-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]x(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2](17);G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]4 n=0,x=4(18);G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]8 n=1,x=8(19);G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]16 n=2,x=16(20)),这种衍生物的收率高,经过长期储存也不会出现分解迹象。(方案3)。
方案3
与羧酸酯衍生物类似,可以使用过量的1M HCl水溶液处理阴离子树枝状化合物17-20,以对后者进行质子化,形成阳离子树枝状化合物Gn-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3 -Na+)2]x(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3 -Na+)2](21);G0-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3 -Na+)2]4 n=0,x=4(22);G1-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3 -Na+)2]8 n=2,x=8(23);G2-[Si(CH2)3N+H(CH2CH2SO3 -Na+)2]16n=3,x=16(24)),用NaOH溶液处理这种阳离子化合物则可使其恢复为因阴离子化合物(方案3)。
方法1(a):磷酸酯树枝状化合物。
不能从通过烯丙基胺的硅氢加成制得的带NH2端基的碳硅烷树枝状化合物中获得外层带阴离子磷酸酯基团的树枝状化合物,因为这些衍生物与甲醛和亚磷酸二甲酯HPO(OMe)2的反应不能使具有磷酸酯基团的树枝状系统得到功能化。
方法1(b):通过点击化学方法将炔丙基胺基团偶联到末端为叠氮的树枝
状化合物上,由此获得具有端氨基的树枝状化合物,再从此化合物中合成阴
离子树枝状化合物。
这条合成路线最初涉及碳硅烷树枝状化合物的制备,这种化合物从一个具有端叠氮基团的四烯丙基硅烷核生长而成。通过两个步骤从末端含Si-H键的Gn-[Si-H]x型树枝状化合物制备这些叠氮衍生物(方案4)。首先使nG-[Si-H]x与4-溴丁烯发生硅氢加成反应,生成不同代的末端为CH2Br基团的碳硅烷树枝状化合物Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]x(三乙基硅基Et3-[Si-CH2CH2CH2CH2Br](25);G0-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]4 n=0,x=4(26);G1-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]8 n=1,x=8(27);G2-[Si-CH2CH2CH2CH2Br]16 n=2,x=16(28))。随后使衍生物25-28与叠氮化钠反应,生成具有端叠氮基团的碳硅烷树枝状化合物Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]x(三乙基硅基Et3-[Si-CH2CH2CH2CH2N3](29);G0-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]4 n=0且x=4(30);G1-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]8 n=1,x=8(31);G2-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]16 n=2,x=16(32))(参照方案4)
方案4
化合物25至32为在空气中稳定的油性固体,易溶于大多数常用的有机溶剂,经过长期储存也不会分解。
制得具有端叠氮基团的树枝状化合物后,通过化合物29-32与炔丙基胺化合物之间的“点击化学”反应合成表面有氨基(-NH2)的树枝状化合物,得到衍生物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]x(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2](33);ck-G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]4 n=0,x=4(34);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]8 n=2,x=8(35);ck-G3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]16 n=3,x=16(36))(参照方案5)
方案5
这些树枝状化合物可简单地表示为ck-Gn-(Fp)x,其中:ck表示这些树枝状化合物是通过一个叠氮基团与一个碳碳三键之间的点击偶联反应制得的,n、G、F、p和x的含义如上文所述,这些化合物的结构也如上文所述。
按照这条合成路线制备阴离子树枝状化合物时,先从合成具有端氨基的碳硅烷树枝状化合物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2NH2]x开始,即化合物(33)至(36)。从这些化合物开始,按照与上一节所述的通过烯丙基胺的硅氢加成反应制得具有端NH2基团的树枝状化合物相似的步骤,最终制得具有羧酸酯、磺酸酯或磷酸酯基团的阴离子树枝状化合物。因此,我们得到下文所述的化合物系列。
方法1(b)用于合成具有羧酸酯基团的阴离子树枝状化合物。
在方案5所述的反应条件下使丙烯酸甲酯与末端为NH2的树枝状化合物33-36发生Michael型加成反应,得到无色油状树枝状化合物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]x,(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2](37);ck-G0-Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]4 n=0,x=4(38);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]8 n=1,x=8(39);ck-G2-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COOMe)2]16 n=2,x=16(40)),这种化合物可溶于常见的有机溶剂但不溶于水。
用NaOH处理衍生物37-40,可使后者转化为相应的阴离子羧酸酯衍生物,得到化合物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]x,(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2](41);ck-G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]4 n=0,x=4(42);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]8 n=1,x=8(43);ck-G2-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]16 n=2,x=16(44)),这些化合物以白色固体形态分离出来,它们易溶于水,且收率高(方案6)
方案6
方法1(b)用于合成具有磺酸酯基团的阴离子树枝状化合物。
使乙烯基磺酸钠与末端为-NH2的树枝状化合物33-36在水-乙醇混合液中,在120°C下发生Michael型加成反应,得到白色固态阴离子衍生物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2SO3Na)2]x(三乙基硅基,x=1(45);n=1,x=4(46);n=2,x=8(47);n=3,x=16(48)),这种衍生物易溶于水,收率高,经过长期储存也不会出现分解迹象(方案7)。
方案7
方法1(b)用于合成具有磷酸酯基团的阴离子树枝状化合物。
具有端–NH2基团的树枝状化合物33-36与甲醛在室温下在THF中反应1小时,然后在“原位置”加入亚磷酸甲酯HPO(OMe)2,将此混合物加热到40°C,在此温度下反应3小时,得到无色油状的阴离子衍生物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]x,(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2](49);ck-G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]4 n=0,x=4(50);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8 n=1,x=8(51);ck-G2-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]16 n=2,x=16(52)),这种衍生物的收率高,经过长期储存也不会出现分解迹象(方案8)。用NaOH处理衍生物49-52,可使后者转化为具有端磷酸酯基团的阴离子碳硅烷树枝状化合物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]x(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2](53);ck-G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]4 n=0,x=4(54);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]8 n=1,x=8(55);ck-G2-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(ONa)2)2]16 n=2,x=16(56))(方案8)。这些化合物以白色固体形态分离出来,它们易溶于水,经过长期储存也不会出现分解迹象。
方案8
方法2——用阴离子基团对有机胺进行功能化,然后将其固定到碳硅烷
树枝状化合物上。
为了继续合成这些化合物,先用阴离子基团或阴离子基团的前体对一系列有机胺、脂肪胺和芳香胺进行功能化。这些胺类化合物也具有其它官能团,此官能团使它们能够通过端基与碳硅烷树枝状化合物结合。
合成的具有羧酸酯基团(A)、磺酸酯基团(B)、磷酸酯基团(C)的烯丙基衍生物可以与含端Si-H键的树枝状化合物Gn-(SiH)x(三乙基硅烷,G0,G1,G2,其x分别为1,4,8和16)发生硅氢加成反应,以此来连接到碳硅烷支架上。
合成的另一系列化合物是通过用羧酸酯基团(D)、磺酸酯基团(E)或磷酸酯基团(F)对炔丙基胺进行功能化获得的衍生物。在这种情况下,这些衍生物中存在的碳碳三键使其能够通过炔丙基衍生物和树枝状化合物的叠氮基团之间的偶联反应与具有端叠氮基团的碳硅烷树枝状化合物Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]x结合。
制得的第三类化合物是通过具有羧酸酯(G)或磷酸酯(H)基团的4-氨基苯酚衍生的-NH2基团获得的。在这种情况中,这类化合物通过酚解反应与末端含Si-Cl或SiCH2-Cl键的碳硅烷树枝状化合物结合(方案11)。
方法2(a),烯丙基胺的功能化。
使烯丙基胺分别与丙烯酸甲酯和乙烯基磺酸钠发生Michael加成反应,通过此方法合成化合物A和B。在衍生物A的合成过程中,Michael加成反应在THF中进行,在室温下反应3小时。衍生物B是通过乙烯基磺酸钠与烯丙基胺之间的Michael加成反应制得的。对于这种衍生物,此反应以H2O为溶剂,在120°C下反应48小时。衍生物C的制备从烯丙基胺开始,通过一种两步反应完成。首先,使烯丙基胺与甲醛在室温下在THF中反应1小时,然后在“原位置”加入亚磷酸二甲酯,将所得混合液加热到40°C,并在此温度下反应3小时,得到无色油状的衍生物C。
获得A-C烯丙基衍生物后,使这些衍生物与具有端Si-H键且从四烯丙基硅烷核生长而成的0至2代碳硅烷树枝状化合物Gn-(SiH)x,(三乙基硅烷、G0、G1、G2,x分别为1、4、8和16)发生硅氢加成反应,合成出用丙烯酸甲酯基团,5-8,或磺酸钠,17-20,进行了功能化的碳硅烷树枝状化合物,此化合物已在上一节中得到描述(参照方案9)。
方案9
用NaOH溶液处理衍生物5-8,使后者转化为相应的具有羧酸酯基团的阴离子树枝状化合物,9-12(参照方案2)。
方法2(b),炔丙基胺的功能化。
使炔丙基胺分别与丙烯酸甲酯和乙烯基磺酸钠发生Michael加成反应,通过此方法合成化合物D和E。在衍生物D的合成过程中,Michael加成反应在THF中进行,在室温下反应3小时。衍生物E是通过乙烯基磺酸钠与炔丙基胺之间的Michael加成反应制得的。对于这种衍生物,此反应以H2O为溶剂,在120°C下反应48小时。衍生物F是通过两个步骤从炔丙基胺合成的。首先,使炔丙基胺与甲醛在室温下在THF中反应1小时,然后在“原位置”加入亚磷酸二甲酯,将所得混合液加热到40°C,并在此温度下反应3小时,得到无色油状的衍生物F。
获得化合物D-F后,通过点击化学法将它们偶联到含有一个四烯丙基硅烷核和数个叠氮端基的0至2代树枝状化合物Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]x(三乙基硅基Et3-[Si-CH2CH2CH2CH2N3](29);G0-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]4 n=0,x=4(30);G1-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]8 n=1,x=8(31);G2-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]16 n=2,x=16(32))上,合成出用酯基,37-40,或磺酸钠,45-48,或磷酸甲酯基团功能化了的碳硅烷树枝状化合物ck-Gn-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]x(三乙基硅基Et3-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2](49);ck-G0-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]4 n=0,x=4(50);ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8 n=1,x=8(51);ck-G2-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]16 n=2,x=16(52))。(方案10)
方案10
这些具有羧酸酯基团、磺酸酯基团或磷酸酯基团的树枝状化合物已在上文中得到描述。
方法2(c)4-氨基苯酚的功能化。
使丙烯酸甲酯与4-氨基苯酚发生Michael加成反应,通过此方法合成化合物G。此衍生物如文献所述。衍生物H是通过两个步骤从4-氨基苯酚制得的。首先,使4-氨基苯酚与甲醛在室温下在THF中反应1小时,然后在“原位置”加入亚磷酸二甲酯,将所得混合液加热到40°C,并在此温度下反应3小时,得到无色油状的衍生物H。
获得衍生物G和H后,使这些衍生物与具有一个四烯丙基硅烷和数个端Si-Cl或Si-CH2Cl基团的0至2代碳硅烷树枝状化合物发生酚解反应,合成出用丙烯酸甲酯基团功能化了的碳硅烷树枝状化合物Gn-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]x(三乙基硅基Et3-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2](57);G0-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]4 n=0,x=4(58);G1-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]8 n=1,x=8(59);G2-[SiCH2-OC6H4-N(CH2CH2COOMe)2]16 n=2,x=16(60)),或用磷酸甲酯基团功能化了的碳硅烷树枝状化合物Gn-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]x(三乙基硅基Et3-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2](61);G0-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]4 n=0,x=4(62);G1-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]8 n=1,x=8(63);G2-[SiCH2-OC6H4-N(CH2PO(OMe)2)2]16 n=2,x=16(64)),方案11。获得的化合物57-64为无色油状,易溶于大多数常见的有机溶剂,但不溶于水。
方案11
例1:合成本发明所述的从四烯丙基硅烷核生长而成的树枝状化合物。
按照下列两种方法合成:
方法1:从具有端氨基的四烯丙基硅烷合成碳硅烷树枝状化合物。
通过两种策略合成具有端氨基的碳硅烷树枝状化合物:1)使烯丙基胺与含端Si-H键的不同代碳硅烷树枝状化合物发生硅氢加成反应,或者2)使用点击化学方法将炔丙基胺连接到含端叠氮基的不同代碳硅烷树枝状化合物上。
下文列出了描述这些化合物的合成方法的一些实施例。
碳硅烷树枝状化合物的合成与表征。
已使用元素分析、1H、13C、29Si、31P和15N-NMR光谱以及质谱分析法进行了树枝状化合物的结构表征。光谱数据和分析数据与已提出的衍生物结构一致。
实施例1.2:合成G
1
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COOMe)
2
]
4
(6)
方法1。
根据文献(S.W.Krska,D.Seyferth,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,3604-3612)配制G1-[(CH2)3NH2]4(0.88g,1.34mmol)的甲醇溶液,然后向此溶液中加入丙烯酸甲酯CH2=CHCOOMe(1.0ml,11.1mmol)。在室温下将反应混合物搅拌12小时,然后在真空下蒸除挥发性物质,得到化合物6(1.79g,99%)。
方法2
将CH2=CHCH2N(CH2CH2COOMe)2(0.5g,2.18mmol)和一滴Karsted催化剂(含3-3.5%Pt的聚二甲基硅氧烷溶液)加入末端为氢原子的第一代树枝状化合物G1-[Si-H]4(0.24g,0.05mmol)的甲苯溶液。在室温下将反应混合物搅拌12小时,然后在真空下蒸除挥发性物质,得到化合物6(0.58g,80%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.64(s,24H,-OMe),2.75(t,16H,-NCH2CH2COOMe),2.42(m,16H,-NCH2CH2COOMe和-SiCH2CH2CH2N-),1.32(m,16H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N-),0.54(m,24H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N-),0.37(m,8H,SiCH2CH2CH2Si-),-0.06(s,24H,-SiMe2)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ173.0(COOMe),57.5(SiCH2CH2CH2N-),51.5(-OMe),49.3(-NCH2CH2COOMe),32.4(-NCH2CH2COOMe),21.6(-SiCH2CH2CH2N-),20.3,18.5,18.0(Si(CH2)3Si-),13.0(-SiCH2CH2CH2N-),-3.3(-SiMe2)。29Si{1H}-NMR(CDCl3):δ0.8(G0-Si),1.9(G1-Si)。模拟计算C64H128N4O16Si5:%:C,56.93;H,9.56;N,4.15;Exp.%:C 57.09;H,10.06;N,4.34.GPC:PDI exp=1.04。
实施例1.2:合成G
2
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COOMe)
2
]
8
(7)
这种第二代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物6的制备方法相似,先将G2-[(CH2)3NH2]8(0.65g,0.39mmol)溶于甲醇和过量丙烯酸甲酯CH2=CHCOOMe(1ml.11.1mmol)中。分离出无色油状物质7(1.09g,92%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.64(s,48H,-OMe),2.75(m,32H,-NCH2CH2COOMe),2.42(m,48H,-NCH2CH2COOMe和–SiCH2CH2CH2N-),1.31(m,40H,SiCH2CH2CH2Si-和–SiCH2CH2CH2N-),0.53(m,48H,SiCH2CH2CH2Si-和–SiCH2CH2CH2Si-),0.38(m,16H,SiCH2CH2CH2N-),-0.06(s,48H,-SiMe2),-0.1(s,12H,-SiMe)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ173.0(-COOMe),57.5((-SiCH2CH2CH2N--),51.5OMe),49.2(-NCH2CH2COOMe),32.5(-NCH2CH2COOMe),21.5(-SiCH2CH2CH2N-),20.1-17.7(Si(CH2)3Si-),12.8(-SiCH2CH2CH2N-),-3.3(-SiMe2)-5.0(-SiMe)。29Si{1H}-NMR(CDCl3):δ(未观察到G0-Si),0.78(G1-Si),1.88(G2-Si)。模拟计算C144H292N8O32Si13:%:C,57.40;H,9.77;N,3.72;Exp.%:C 56.76;H,9.78;N,3.88。GPC:PDI exp=1.3
实施例1.3:合成G
3
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COOMe)
2
]
16
(8)
这种第三代树枝状化合物的制备方法与本文所述的第一代和第二代树枝状化合物的制备方法相似,先将G3-[(CH2)3NH2]16(0.25g,0.06mmol)溶于甲醇和过量丙烯酸甲酯CH2=CHCOOMe(1ml.11.1mmol)中。分离出无色油状物质8(0.39g,99%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.63(s,96H,-OMe),2.74(m,64H,-NCH2CH2COOMe),2.41(m,96H,-NCH2CH2COOMe和-SiCH2CH2CH2N-),1.31(m,88H,SiCH2CH2CH2Si-and-SiCH2CH2CH2N-),0.53(m,112H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2Si-),0.37(m,32H,SiCH2CH2CH2N-),-0.07(s,96H,-SiMe2),-0.1(s,36H,-SiMe)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ173.0(-COOMe),57.5(-SiCH2CH2CH2N-),51.5(-OMe),49.2(-NCH2CH2COOMe),32.5(-NCH2CH2COOMe),21.5(-SiCH2CH2CH2N-),20.1-17.9(Si(CH2)3Si-),12.8(-SiCH2CH2CH2N-),-3.3(-SiMe2)-5.0(-SiMe)。29Si{1H}-NMR(CDCl3):δ(未观察到G0-Si和G1-Si),0.8(G2-Si),1.9(G3-Si)。模拟计算C304H620N16O64Si29:%:C,57.60;H,9.86;N,3.54;Exp.%:C 58.38;H,9.86;N,3.08.GPC:PDI exp=1.3
实施例1.4:合成G
1
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COONa)
2
]
4
(10)
将NaOH(pH=10)溶液加入树枝状化合物6(1.80g,1.34mmol)的乙醇溶液。将所得溶液在室温下搅拌2小时,然后在减压条件下蒸除剩余溶剂。用Et2O洗残留物,然后真空干燥,得到易溶于水的白色固态物质10(1,86g,98%)。
1H-NMR(D2O):δ2.57(m,8H,-NCH2CH2COO-Na+),2.72(m,8H,-SiCH2CH2CH2N-),2.16(m,16H,-NCH2CH2COO-Na+),1.25(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-,SiCH2CH2CH2Si-),0.43(m,8H,SiCH2CH2CH2Si-),0.27(t,8H,SiCH2CH2CH2N),-0.20(s,24H,-SiMe2)。13C{1H}-NMR(D2O):δ179.9(-NCH2CH2COO-Na+),55.3(-SiCH2CH2CH2N-),48.6(-NCH2CH2COO-Na+),32.7(-NCH2CH2COO-Na+),19.0(-SiCH2CH2CH2N-),18.4,17.5and 15.9(Si(CH2)3Si),11.4(-SiCH2CH2CH2N-),-4.8(-SiMe2)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ1.1(G0-Si),1.8(G1-Si)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-322.6。模拟计算C56H104N4Na8O16Si5:%:C,47.57;H,7.41;N,3.96;Exp.%:C 46,15;H,7.53;N,3.62。
实施例1.5:合成G
2
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COONa)
2
]
8
(11)
这种第二代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物10的制备方法相似,先将第二代树枝状化合物7(1.05g,0.35mmol)的乙醇溶液与pH=10的NaOH溶液混合。将所得溶液在室温下搅拌2小时,然后在减压条件下蒸除剩余溶剂。用Et2O洗残留物,然后真空干燥,得到易溶于水的白色固态物质11(1.06g,97%)。
1H-NMR(D2O):δ2.61(m,32H,-NCH2CH2COO-Na+),2.31(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-),2.17(m,32H,-NCH2CH2COO-Na+),1.31(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-),1.20(m,24H,SiCH2CH2CH2Si-),0.42(m,48H,SiCH2CH2CH2Si-),0.26(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-),-0.17(宽谱,48H,-SiMe2),-0,21(宽谱,12H,-SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ180.5(-NCH2CH2COO-Na+),56.8(-SiCH2CH2CH2N-),49.7(-NCH2CH2COO-Na+),33.7(-NCH2CH2COO-Na+),19.9(-SiCH2CH2CH2N-),19.3-17.9(Si(CH2)3Si),12.7(-SiCH2CH2CH2N-),-3.4(-SiMe2),-4.4(-SiMe)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未发现G0-S),1.2(G1-Si),1.9(G2-Si)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-329。模拟计算C128H244N8Na16O32Si13:%:C,48.96;H,7.83;N,3.57;Exp.%:C,49.03;H,7.79;N,3.31。
实施例1.6:合成G
3
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
COONa)
2
]
16
(12)
这种第三代树枝状化合物的制备方法与本文所述的第一和第二代树枝状化合物的制备方法相似,先将第二代树枝状化合物8(0.39g,0.07mmol)溶于乙醇溶液和过量的NaOH溶液(pH=10)混合。将所得溶液在室温下搅拌2小时,然后在减压条件下蒸除剩余溶剂。用Et2O洗残留物,然后真空干燥,得到易溶于水的白色固态物质12(1.07g,95%)。
1H-NMR(D2O):δ2.54(m,64H,-NCH2CH2COO-Na+),2.22(m,32H,-SiCH2CH2CH2N-),2.14(m,64H,-NCH2CH2COO-Na+),1.20(m,88H,-SiCH2CH2CH2N-,SiCH2CH2CH2Si-),0.42(m,112H,SiCH2CH2CH2Si-),0.25(m,32H,-SiCH2CH2CH2N-),-0.17(宽谱,96H,-SiMe2),-0,25(宽谱,36H,-SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ181.2(-NCH2CH2COO-Na+),57.1(-SiCH2CH2CH2N-),49.6(-NCH2CH2COO-Na+),34.3(-NCH2CH2COO-Na+),20.3(-SiCH2CH2CH2N-),19.5–18.0(Si(CH2)3Si),13.0(-SiCH2CH2CH2N),-3.4(-SiMe2),-4.5(-SiMe)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si和G1-Si),1.1(G2-Si),2.0(G3-Si)。
实施例1.7:合成G
1
-[Si(CH
2
)
3
N
+
H(CH
2
CH
2
COOH)
2
]
4
4Cl
-
(14)
向树枝状化合物10(1.36g,1.01mmol)的甲醇溶液中加入过量的浓度为37%的HCl溶液(2.36mmol)。将所得溶液在室温下搅拌3小时,然后在减压和50°C的条件下蒸除剩余溶剂。用新鲜Et2O(2x25ml)洗残留物,然后真空干燥,得到白色固态物质14(1.17g,84%)。
1H-NMR(D2O):δ3.30(m,16H,-N+HCH2CH2COOH),2.99(m,8H,-SiCH2CH2CH2N+H-),2.70(m,16H,-N+HCH2CH2COOH),1.57(m,8H,-SiCH2CH2CH2N+H-),1,21(m,8H,SiCH2CH2CH2Si-),0.44(m,24H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.15(宽谱,6H,-SiMe2)。13C{1H}-NMR(D2O):δ174.0(-COOH),55.2(-SiCH2CH2CH2N+H-),49.1(-N+HCH2CH2COOH),28.4(-N+HCH2CH2COOH),19.6,18.5,18.2(Si(CH2)3Si),17.2(-SiCH2CH2CH2N+H-),11.5(-SiCH2CH2CH2N+H-),-3.6(-SiMe2)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-325(-N+H(CH2CH2COOH)2)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(G0-Si未观察到),2.2(G1-Si)。模拟计算C56H116Cl4N4O16Si5:%:C,48.61;H,8.45;N,4.05;Exp.C,48.78;H,8.41;N,4.00。
实施例1.8:合成G2-[Si(CH
2
)
3
N
+
H(CH
2
CH
2
COOH)
2
]
8
8Cl
-
(15)
这种第二代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物14的制备方法相似,先将第二代树枝状化合物11(1.0g,0.33mmol)的甲醇溶液和过量的浓度为37%的HCl溶液(2.65mmol)混合,得到易溶于水的白色固态树枝状化合物15(0.98g,96%)。
1H-NMR D2O):δ3.30(m,32H,-N+HCH2CH2COOH),3.01(m,16H,-SiCH2CH2CH2N+H-),2.74(m,32H,-N+HCH2CH2COOH),1.57(m,16H,-SiCH2CH2CH2N+H-),1.20(m,24H,SiCH2CH2CH2Si-and-SiCH2CH2CH2Si-),0.42(m,64H,SiCH2CH2CH2Si-and-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.14(宽谱,60H,-SiMe2和–SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ173.8(-COOH),55.3(-SiCH2CH2CH2N+H-),49.1(-N+HCH2CH2COOH),28.4(-N+HCH2CH2COOH),19.6-17.0(Si(CH2)3Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),11.6(-SiCH2CH2CH2N+H-),-3.5(-SiMe2和–SiMe)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(G0-Si未观察到),1.1(G1-Si).2.2(G2-Si)。模拟计算C128H268Cl8N8O32Si13:%:C,49.91;H,8.77;N,3.64;Exp.%:C,50.64;H,8.61;N,3.45。
实施例1.9:合成G3-[Si(CH
2
)
3
N
+
H(CH
2
CH
2
COOH)
2
]
16
16Cl
-
(16)
这种第三代树枝状化合物的制备方法与本文所述的第一代和第二代树枝状化合物14和15的制备方法相似,先将树枝状化合物12(1.0g,0.17mmol)的甲醇溶液和过量的浓度为37%的HCl溶液(2.52mmol)混合,得到易溶于水的白色固态树枝状化合物16(0.8g,86%)。
1H-NMR(D2O):δ3.29(m,64H,-N+HCH2CH2COOH),3.0(m,32H,-SiCH2CH2CH2N+H-),2.71(m,32H,-N+HCH2CH2COOH),1.57(m,32H,-SiCH2CH2CH2N+H-),1.19(m,56H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2Si-),0.40(m,144H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.14(宽谱,132H,-SiMe2和-SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ174.6(-COOH),55.8(-SiCH2CH2CH2N+H-),49.4(-N+HCH2CH2COOH),28.9(-N+HCH2CH2COOH),19.8-17.2(Si(CH2)3Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),11.6(-SiCH2CH2CH2N+H-),-3.5(-SiMe2),-4.4(-SiMe)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si、G1-Si和G2-Si),2.5(G3-Si)。模拟计算C272H572Cl16N16O64Si29:%:C,50.47;H,8.91;N,3.46;Exp.%:C,50.99;H,8.61;N,2.99。
实施例1.10:合成G
1
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
SO
3
Na)
2
]
4
(18)
将质量分数约为30%的乙烯基磺酸钠CH2=CHSO3Na的H2O溶液(5.16ml,14.0mmol)加入G1-[CH2CH2CH2NH2]4(1.16g,1.75mmol)的乙醇溶液中。将所得溶液在120°C下搅拌3天。然后过滤此溶液,用甲醇洗残留物,真空干燥,得到白色固态物质18(2.25g,73%).
1H-NMR(D2O):δ2.86(m,16H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.77(m,16H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.27(m,8H,-SiCH2CH2CH2N-),1.39(m,8H,-SiCH2CH2CH2N-),1.21(m,8H,SiCH2CH2CH2Si-)0.42(m,9H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N-),-0.20(s,24H,-SiMe2)。13C{1H}-NMR(D2O):δ56.5(-SiCH2CH2CH2N-),47.8(-NCH2CH2SO3 -Na+),47.0(-NCH2CH2SO3 -Na+),20.4(SiCH2CH2CH2Si-),19.4,16.9(-SiCH2CH2CH2N-和SiCH2CH2CH2Si-),18.5(-SiCH2CH2CH2N-),12.3(SiCH2CH2CH2Si-),-3.8(-SiMe2)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-339.1(-NCH2CH2SO3 -Na+)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si),1.8(G1-Si)。模拟计算C52H116N4Na8O24S8Si5:%:C,35.44;H,6.63;N,3.18;S,14.56;Exp.%:C,34.54;H,6.56;N,3.02;S,15.28。
实施例1.11:合成G
2
-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
SO
3
Na)
2
]
8
(19)
将质量分数约为30%的乙烯基磺酸钠CH2=CHSO3Na的H2O溶液(1.8ml,4.91mmol)加入G2-[CH2CH2CH2NH2]8(0.5g,0.31mmol)的乙醇溶液中。将所得溶液在120°C下搅拌3天。然后过滤此溶液,用甲醇洗残留物,真空干燥,得到白色固态物质19(0.91g,80%)。
1H-NMR(D2O):δ2.86(m,32H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.76(m,32H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.28(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-),1.21(m,40H,-SiCH2CH2CH2N-,-SiCH2CH2CH2Si-和SiCH2CH2CH2Si-),0.43(m,48H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2Si-),0.28(m,16H,-SiCH2CH2CH2N-),-0.16(s broad,48H,-SiMe2),-0.21(宽谱,12H,-SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ56.9(-SiCH2CH2CH2N-),48.0(-NCH2CH2SO3 -Na+),46.7(-NCH2CH2SO3 -Na+),20.1(-SiCH2CH2CH2N-),18.5-17.7(Si(CH2)3Si),12.4(-SiCH2CH2CH2N-),-3.5(SiMe2),-4.4(SiMe)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-348.5(-NCH2CH2SO3 -Na+)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si),1.1(G1-Si),2.1(G2-Si)。模拟计算C112H244N8Na16O48S16Si13:%:C,36.19;H,6.62;N,3.01;S,13.80;Exp.%:C,36.06;H,7.04;N,2.63;S,13.91。
实施例1.12:合成G3-[Si(CH
2
)
3
N(CH
2
CH
2
SO
3
Na)
2
]
16
(20)
将质量分数约为30%的乙烯基磺酸钠CH2=CHSO3Na的H2O溶液(1.70ml,4.64mmol)加入G3-[CH2CH2CH2NH2]16(0.52g,0.14mmol)的乙醇溶液中将所得溶液在120°C下搅拌3天。然后过滤此溶液,用甲醇洗残留物,真空干燥,得到白色固态物质20(0.79g,73%)。
1H-NMR(D2O):δ2.85(m,64H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.78(m,64H,-NCH2CH2SO3 -Na+),2.27(m,32H,-SiCH2CH2CH2N-),1.24(m,88H,-SiCH2CH2CH2N-,-SiCH2CH2CH2Si-和SiCH2CH2CH2Si-),0.44(m,144H,SiCH2CH2CH2Si-,-SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N-),-0.15(宽谱,132H,-SiMe2和–SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ57.1(-SiCH2CH2CH2N-),47.9(-NCH2CH2SO3 -Na+),47.1(-NCH2CH2SO3 -Na+),20.6(-SiCH2CH2CH2N-),20.0-18.0(Si(CH2)3Si),12.7(-SiCH2CH2CH2Si-),-3.4(-SiMe2),-4.4(-SiMe)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-349.7.29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si和G1-Si),1.2(G2-Si),2.0(G3-Si)。模拟计算C224H492N16Na32O96S32Si29:%:C,35.76;H,6.59;N,2.98;S,13.64;Exp.%:C,36.93;H,7.19;N,2.58;S,12.86。
实施例1.13:合成G
1
-[Si(CH
2
)
3
N
+
H(CH
2
CH
2
SO
3
-
Na
+
)
2
]
4
4Cl
-
(22)
将过量的浓度为1M的HCl乙醚溶液(0.5ml,0.23mmol)加入树枝状化合物18的水溶液(0.05g,0.03mmol)中。将所得溶液在室温下搅拌12小时,然后在减压条件下蒸除剩余溶剂。用乙醚(2x 25ml)洗残留物,再以水为洗脱液,用葡聚糖凝胶柱层析法提纯。得到易溶于水的白色固态树枝状化合物22(0.04g,80%)。
1H-NMR(D2O):δ3.44(m,16H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+),3.16(m,24H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+和-SiCH2CH2CH2N+H-),1.56(m,16H,-SiCH2CH2CH2N+H-和-SO3 -Na+),1.21(m,8H,SiCH2CH2CH2Si-)0.42(m,9H,SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.16(宽谱,24H,-SiMe2)。13C{1H}-NMR(D2O):δ56.5(-SiCH2CH2CH2N+H-),49.4(-N+HCH2CH2SO3 -Na+),44.8(-N+HCH2CH2SO3 -Na+),19.6(SiCH2CH2CH2Si-),18.5,18.2(-SiCH2CH2CH2N+H-and SiCH2CH2CH2Si-),17.2(-SiCH2CH2CH2N+H-),11.4(SiCH2CH2CH2Si-),-3.5(-SiMe2)。15N{1H}-NMR(D2O):δ-338.5(N+HCH2CH2SO3 -Na+)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si),2.3(G1-Si)。模拟计算C46H112Cl4N4O24S8Si5.%:C,33.60;H,6.87;N,3.41;S,15.60;Exp.%:C,32.52;H,5.87;N,3.72;S,14.58。
实施例1.14:合成G2-[Si(CH
2
)
3
N
+
H((CH
2
CH
2
SO
3
-
Na
+
)
2
]
8
8Cl
-
(23)
这种第二代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物22的制备方法相似,先将第二代树枝状化合物19(0.07g,0.02mmol)的水溶液与过量的浓度为1M的HCL乙醚溶液(0.5ml,0.3mmol)混合,得到易溶于水的白色固态树枝状化合物23(0.04g,60%)。
1H-NMR(D2O):δ3.47(m,32H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+),3.17(m,48H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+和-SiCH2CH2CH2N+H-),1.58(m,32H,-SiCH2CH2CH2N+H-和-SO3 -Na+),1.23(m,24H,-SiCH2CH2CH2Si-和SiCH2CH2CH2Si-),0.46(m,64H,SiCH2CH2CH2Si-,-SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.11(宽谱,60H,-SiMe2和–SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ55.6(-SiCH2CH2CH2N+H-),48.4(-N+HCH2CH2SO3 -Na+),43.9(-N+HCH2CH2SO3 -Na+),20.5–17.1(-SiCH2CH2CH2N+H-,和Si(CH2)3Si),10.6(-SiCH2CH2CH2N+H-),-3.3(-SiMe2和-SiMe)。29Si{1H}-NMR(D2O):δ(未观察到G0-Si),0.7(G1-Si),2.2(G2-Si)。模拟计算C112H268Cl8N8O48S16Si13.%:C,36.78;H,7.39;N,3.06;S,14.03;Exp.%:C,35.93;H,7.46;N,3.43;S,13.97。
实施例1.15:合成G3-[Si(CH
2
)
3
N
+
H(CH
2
CH
2
SO
3
-
Na
+
)
2
]
16
16Cl
-
(24)
这种第三代树枝状化合物的制备方法与本文所述的第一代和第二代树枝状化合物22和23的制备方法相似,先将树枝状化合物20(0.06g,0.008mmol)的水溶液和过量的浓度为1M的HCl乙醚溶液(0.5ml,0.3mmol)混合,得到易溶于水的白色固态树枝状化合物24(0.04g,60%)。
1H-NMR(D2O):δ3.47(m,64H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+),3.16(m,96H,-N+HCH2CH2SO3 -Na+和-SiCH2CH2CH2N+H-),1.57(m,64H,-SiCH2CH2CH2N+H-和-SO3 -Na+),1.21(m,56H,-SiCH2CH2CH2Si-和SiCH2CH2CH2Si-),0.44(m,144H,SiCH2CH2CH2Si-,-SiCH2CH2CH2Si-和-SiCH2CH2CH2N+H-),-0.11(宽谱,132H,-SiMe2和-SiMe)。13C{1H}-NMR(D2O):δ56.5(-SiCH2CH2CH2N+H-),45.1和44.9(N+HCH2CH2SO3 -Na+和-N+HCH2CH2SO3 -Na+),20.0-17.8(-SiCH2CH2CH2N+H和Si(CH2)3Si),11.6(SiCH2CH2CH2Si),-3.3(-SiMe2),-4.4(-SiMe)。模拟计算C224H540Cl16N16O96S32Si29.%:C,36.34;H,7.35;N,3.03;S,13.86;Exp.%:C,35.87;H,7.84;N,3.34;S,12.96。
实施例1.16:合成G
1
-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Br]
4
(26)
将1.61mL 4-溴-1-丁烯(15.85mmol)的正己烷溶液和五滴Karstedt催化剂加入树枝状化合物G1-[Si-H]4(3.52mmol)的正己烷溶液(5mL)中,在60°C下搅拌五天。然后,在真空下蒸除挥发性物质,加入二氯甲烷,用活性炭过滤所得溶液。在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色液态物质26(2.32g,68%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.40(8H,t,CH2Br),1.85(8H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br),1.37(16H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2Si),0.51(24H,m,与Si相连的CH2),-0.05(24H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ36.4(CH2Br),33.7(SiCH2CH2CH2CH2Br),22.5(SiCH2CH2CH2CH2Br),20.2(SiCH2),18.6(SiCH2),17.6(SiCH2),14.5(SiCH2),-3.281(SiCH3)。模拟计算C36H80Br4Si5.%:C,44.44;H,8.29;Exp.%:C,44.24;H,8.18。
实施例1.17:合成G2-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Br]
8
(27)
这种第二代树枝状化合物的制备方法和本文所述的化合物26的制备方法相似,先将含0.38g G2-[Si-H]8的正己烷溶液(10mL)、0.28mL 4-溴-1-丁烯(2.7mmol)和两滴Karstedt催化剂混合,在60°C下搅拌16小时。然后,在真空下蒸除挥发性物质,加入二氯甲烷,用活性炭过滤所得溶液。在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色液态物质27(0.61g,83%)。
1H-NMR(CDCl3):3.40(16H,t,CH2Br),1.85(16H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br),1.31(40H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2Si),0.53(64H,m,与Si相连的CH2),-0.05(48H,s,Si(CH3)2),-0.09(12H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ36.8(CH2Br),34.0(SiCH2CH2CH2CH2Br),22.93(SiCH2CH2),20.5(SiCH2CH2),19.6(SiCH2CH2),19.3(SiCH2),19.1(SiCH2),18.9(SiCH2),18.2(SiCH2),14.9(SiCH2),-2.8(SiCH3),-4.5(SiCH3)。模拟计算C88H196Br8Si13.%:C,46.79;H,8.75;Exp.%:C,46.51;H,8.75。
实施例1.18:合成G3-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Br]
16
(28)
这种第三代树枝状化合物的制备方法和本文所述的化合物26的制备方法相似,先将含0.81g G3-[Si-H]16(0.31mmol)的正己烷溶液(20mL)、0.51mL4-溴-1-丁烯(5.04mmol)和两滴Karstedt催化剂混合,在60°C下搅拌16小时。然后,在真空下蒸除挥发性物质,加入二氯甲烷,用活性炭过滤所得溶液。在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色液态物质28(1.27g,86%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.40(32H,t,CH2Br),1.85(32H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br),1.30(88H,m,SiCH2CH2CH2CH2Br y SiCH2CH2CH2Si),0.53(144H,m,与Si相连的CH2),-0.05(120H,s,Si(CH3)2y SiCH3),-0.09(12H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR (CDCl3):δ36.4(CH2Br),33.6(SiCH2CH2CH2CH2Br),22.5(SiCH2CH2),20.1(SiCH2CH2),19.0-14.5(SiCH2),-3.3(SiCH3),-4.8(SiCH3,两种信号)。模拟计算C192H428Br16Si29.%:C,47.74;H,8.93;Exp.%:C,48.62;H,9.00。
实施例119:合成G
1
-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
N
3
]
4
(30)
将0.34g叠氮化钠(5.16mmol)和少量KI加入树枝状化合物26(0.52mmol)的DMF溶液中,在90°C下将反应液搅拌五天,再在真空下将其装入封闭型安瓿瓶中,放置3天。然后在真空下蒸除挥发性物质,加入10mL二氯甲烷,用水萃取两次。用MgSO4干燥分离出的有机相。过滤溶液,并在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色油状物质30(0.35g,81%)。
1H-NMR(CDCl3):3.24(8H,t,CH2N3),1.60(8H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3),1.35(16H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3 andSiCH2CH2CH2Si),0.52(24H,m,与Si相连的CH2),-0.06(24H,s,Si(CH3)2)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ51.1(CH2N3),32.6(SiCH2CH2CH2CH2N3),21.1(SiCH2CH2),20.2(SiCH2CH2),18.6(SiCH2),17.5(SiCH2),15.0(SiCH2),-3.3(SiCH3)。
实施例1.20:合成G2-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
N
3
]
8
(31)
这种第二代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物30的制备方法相似,先将化合物27(1.00g,0.44mmol)的DMF(30mL)溶液、0.43g叠氮化钠(6.64mmol)和少量KI混合。在90°C下将反应液搅拌五天,再在真空下将其装入封闭型安瓿瓶中放置16个小时。然后在真空下蒸除挥发性物质,加入30mL二氯甲烷,用水(2x15mL)萃取两次。用MgSO4干燥分离出的有机相。过滤溶液,并在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色油状物质31(0.67g,78%)。
1H-NMR(CDCl3):3.24(16H,t,CH2N3),1.60(16H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3),1.29(40H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3y SiCH2CH2CH2Si),0.51(64H,m,与Si相连的CH2),-0.06(48H,s,Si(CH3)2),-0.10(24H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ51.1(CH2N3),32.6(SiCH2CH2CH2CH2N3),21.2(SiCH2CH2),20.5(SiCH2CH2),19.2(SiCH2CH2),18.8(SiCH2),18.6(SiCH2),18.5(SiCH2),17.7(SiCH2),15.0(SiCH2),-3.3(Si(CH3)2),-4.9(SiCH3)。模拟计算C88H196N24Si13.%:C,54.04;H,10.10;N,17.19;Exp.%:C,54.81;H,9.72;N,12.94。
实施例1.21:合成G3-[SiCH
2
CH
2
CH
2
CH
2
N
3
]
16
(32)
这种第三代树枝状化合物的制备方法与本文所述的化合物30的制备方法相似,先将化合物28(1.82g,0.38mmol)的DMF-THF(30mL/10mL)溶液、0.50g叠氮化钠(7.70mmol)和少量KI混合。在90°C下将反应液搅拌五天,再在真空下将其装入封闭型安瓿瓶中放置16个小时。然后在真空下蒸除挥发性物质,加入30mL二氯甲烷,用水(2x15mL)萃取两次。用MgSO4干燥分离出的有机相。过滤溶液,并在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色油状物质32(1.33g,82%)。
1H-NMR(CDCl3):δ3.24(32H,t,CH2N3),1.60(32H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3),1.32(88H,m,SiCH2CH2CH2CH2N3y SiCH2CH2CH2Si),0.54(144H,m,与Si相连的CH2),-0.05(120H,s,Si(CH3)2y SiCH3),-0.09(12H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ51.1(CH2N3),32.6(SiCH2CH2CH2CH2N3),21.2(SiCH2CH2),20.0(SiCH2CH2),19.0-17.5(SiCH2)15.0(SiCH2),-3.3(Si(CH3)2),-4.9(SiCH3)。模拟计算C192H428N48Si29.%:C,54.59;H,10.21;N,15.92;Exp.%:C,56.08;H,9.58;N,11.08。
实施例1.22:合成ck-G
1
-[Si(CH
2
)
4
(N
3
C
2
H)CH
2
NH
2
]
4
(34)
将含有0.31g(0.38mmol)G1-[SiCH2CH2CH2CH2N3]4的THF(10mL)溶液与0.11mL(1.66mmol)炔丙基胺混合,向此混合液中加入抗坏血酸钠(0.04g,0.11mmol)的水溶液(1.25mL)和CuSO4(0.02mg,0.07mmol)的水溶液(1.25mL)。在室温下将反应混合液搅拌16个小时。然后加入2mL氨水(15%),搅拌10分钟。用EtOAc (3x10mL)萃取所得溶液。用硫酸钠干燥合并的有机相,浓缩,在真空下蒸除溶剂,得到淡黄色油状第一代树枝状化合物34。
1H-NMR(CDCl3):7.41(4H,s,NCHCN),4.30(8H,t,CH2CH2N),3.97(8H,sb,NH2),1.88((8H,m,CH2CH2N),1.27(16H,m,SiCH2CH2),0.54(24H,m,SiCH2),0.08(24H,s,SiCH3)。
实施例1.23:合成ck-G
1
-[Si(CH
2
)
4
(N
3
C
2
H)CH
2
N(CH
2
CH
2
COOMe)
2
]
4
(38)
这种第一代树枝状化合物38的制备方法与本文所述的化合物34的制备方法相似,先将5mL含G1-[SiCH2CH2CH2CH2N3]4(0.30g,0.37mmol)的THF与用酯基(D)功能化了的炔丙基胺(0.33g,1.46mmol)、抗坏血酸钠(35mg,0.18mmol)的水溶液(0.75mL)及0.75mL CuSO4(18mg,0.073mmol)水溶液混合。在室温下将反应混合液搅拌16个小时。然后加入4mL氨水(15%),搅拌10分钟。用EtOAc (3x10mL)萃取所得溶液。用硫酸钠干燥合并的有机相,浓缩,在真空下蒸除溶剂。用凝胶渗透层析法提纯化合物38,得到淡黄色油状目标产物(0.43g,68%)。
1H-NMR(CDCl3):7.43(4H,s,NCHCN),4.3(8H,t,CH2CH2N),3.78(8H,s,CCH2N),3.64(24H,s,OCH3),2.78(16H,t,NCH2CH2C(O)),2.47(16H,t,NCH2CH2C(O)),1.90(8H,m,CH2CH2N),1.27(16H,m,SiCH2CH2),0.52(24H,m,SiCH2),-0.08(24H,s,SiCH3。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ172.8(CO2CH3),144.6(NCCCH2),122.2(NCCCH2),51.5(OCH3),49.9(CH2N),48.9(CH2N),48.7(CH2N),34.0(CH2CH2CH2CH2N),32.6(CH2CO),21.0(CH2CH2CH2Si),20.1(CH2CH2CH2),18.5(SiCH2),17.5(SiCH2),14.9(SiCH2),-3.4(SiCH3)。
实施例1.24:合成ck-G
1
-[Si(CH
2
)
4
(N
3
C
2
H)CH
2
N(CH
2
PO(OMe)
2
)
2
]
4
(50)
这种第一代树枝状化合物50的制备方法与本文所述的化合物34的制备方法相似,先将10mL含G1-[SiCH2CH2CH2CH2N3]4(0.30g,0.37mmol)的THF与用亚磷酸基团(F)功能化了的炔丙基胺(0.44g,1.46mmol)、抗坏血酸钠(35mg,0.18mmol)的水溶液(1.25mL)及1.25mL CuSO4(18mg,0.073mmol)水溶液混合。在室温下将反应混合液搅拌16个小时。然后加入2mL氨水(15%),搅拌10分钟。用EtOAc(3x10mL)萃取所得溶液。用硫酸钠干燥合并的有机相,浓缩,在真空下蒸除溶剂,得到淡黄色油状物质50(0.16g,65%)。
1H-NMR(CDCl3):7.6(4H,s,NCHCN),4.32(8H,t,CH2CH2N),4.13(8H,s,CCH2N),3.76(48H,d,OCH3),3.15(4H,d,NCH2P),1.89(8H,m,CH2CH2N),1.27(16H,m,SiCH2CH2),0.54(24H,m,SiCH2),-0.08(24H,s,SiCH3)。13C{1H}-NMR(CDCl3):δ143.1(NCCCH2),123.0(NCCCH2),52.7(d,OCH3),51.2(t,CCH2N),50.0,49.0(dd,NCH2P),34.1(CH2CH2CH2CH2N),21.0(CH2CH2CH2CH2N),20.1(CH2CH2CH2Si),18.5(SiCH2),17.5(SiCH2),14.9(SiCH2),-3.4(SiCH3)。
实施例2:从一个多酚核制得的树枝状化合物。
A——合成具有一个焦点和数个经过适当功能化的外层基团的树状体或楔型树枝状分子。
从溴代烯烃,例如4-溴丁烯,合成具有端烯丙基的1-3代楔型树枝状分子的合成步骤如方案12所述。在第一步中,烯烃的双键与HSiMeCl2发生硅氢加成反应,生成具有端SiCl2基团的第一代楔型树枝状分子,BrG1Cl2(65),该分子可通过与烯丙基溴化镁BrMg(C3H5)反应,转化为相应的具有端烯丙基基团的第一代楔型树枝状分子,我们将此分子命名为BrG1A2(66)。使化合物BrG1A2重复进行先前的两个反应,则生成第二代树状体BrG2Cl4(67)和BrG2A4(68),现在,如果使楔型BrG2A4再重复进行这两个反应,则生成第三代树状体BrG3Cl8(69)和BrG3A8(70)。
方案12
其中:i)HSiMeCl2,铂催化剂;ii)BrMg(C3H5)
上文所述的具有端Si-H键的楔型树枝状分子的功能化可通过以下两个步骤完成,先使末端为烯丙基的树状体与二甲基氯硅烷SiMe2ClH发生硅氢加成反应,然后通过氢化铝锂LiAlH4完成氯氢交换,如方案13所述。因此,以第一代树状体BrG1A2(66)为起始物,可分离出楔型树枝状分子BrG1H2(71),以第二代树状体68为起始物,可分离出楔型树枝状分子BrG2H4(72),以第三代树状体69为起始物,可获得具有8个Si-H基团的楔型树枝状分子BrG3H8(73)。
方案13
其中:i)HSiMe2Cl,铂催化剂;ii)LiAlH4。
本发明所述的第三类楔型树枝状分子具有一个焦点和一个官能团-CH2Br,其外层用酯基进行了功能化,该酯基是阴离子配体的前体基团,如本报告的第I部分所述。按照方案14所述的步骤可将这些树状体制备到第三代。其反应包括具有端Si-H键的楔型碳硅烷与含丙烯酸甲酯基团的烯丙基胺发生的硅氢加成反应,使用的是Karstedt催化剂。此合成方法所用的烯丙基胺被描述为化合物A。
因此,如果此反应以第一代楔型树枝状分子71为基础,该分子与化合物A的反应可生成用4个端甲酯基团修饰的第一代楔型树枝状分子BrG1(COOMe)4(74)。如果起始化合物为第二代楔型树枝状分子8,则获得第二代楔型树枝状分子BrG2(COOMe)8(75),该分子表面具有8个酯基团,如果反应物是第三代楔型树枝状分子9和烯丙基胺A,则获得第三代树状体BrG3(COOMe)16(76),其外层具有16个酯基团。
方案14
其中:i)C3H5N(C2H4COOMe)2,铂催化剂。
已通过碳、氢和氮元素分析、1H、13C和29Si NMR光谱和质谱分析法对本节所述的树状体或楔型树枝状分子65-76进行了表征,详见下文:
合成BrG
1
(SiCl
2
)(65)。
向冷却到0°C的4-溴-1-丁烯(4.00g,0.030mol)的正己烷溶液(4mL)中加入HSiMeCl2(5.10g,0.045mol)和Kardsted催化剂(3%mol)。使反应液在室温下搅拌过夜,然后在真空下蒸除挥发性物质。加入正己烷(15mL),用活性炭过滤此溶液。蒸除溶剂,得到无色液态化合物BrG1(SiCl2)(65)(7.03g,95%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.77(s,3H,MeSiCl2),1.11(m,2H,CH2Si),1.65(m,2H,CH2CH2Si),1.93(m,2H,BrCH2CH2),3.41(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2);13C-NMR{1H}(CDCl3):δ5.1(MeSiCl2),20.6(CH2CH2Si),21.1(CH2CH2Si),32.8(BrCH2CH2),34.9(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):δ32.3(MeSiCl2)。
合成BrG
1
A
2
(66)。
向冷却到0°C的BrG1(SiCl2)(10.00g,0.040mol)的Et2O溶液(25mL)中缓慢加入BrMg(C3H5)(0.085mol),使所得混合液在室温下搅拌过夜。然后加入冷的NH4Cl水溶液(12%,50mL)。接着用水/乙醚萃取(3次),用MgSO4干燥有机相,最后在真空下蒸除挥发性物质,得到无色液态BrG1A2(8.35g,80%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.02(s,3H,MeSi(CH2CHCH2)2),0.53(m,2H,CH2Si),1.44(m,2H,CH2CH2Si),1.54(d,J=8.5Hz,4H,SiCH2CH),1.85(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),4.84(m,4H,CH=CH2),5.74(m,2H,CH=CH2),13C-NMR{1H}(CDCl3):δ-5.9(e),12.0(d),21.2(f),22.1(c),33.5(a),36.2(b),113.3(h),134.5(g);29Si-NMR(CDCl3):δ0.99(MeSi)。模拟计算C11H21BrSi(261,27g/mol):C,50.57;H,8.10;Exp.:C,51.03;H,8.17。
合成BrG
2
(SiCl
2
)
2
(67)。
此化合物是用BrG1A(4.30g,0.016mol)、HSiMeCl2(3.41g,0.03mol)和Kardsted催化剂(3%mol)制备而成,按上文所述的BrG1(SiCl2)的合成步骤进行,得到无色油状BrG2(SiCl2)2(67)(7.60g,94%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.03(s,3H,MeSi),0.53(m,2H,SiCH2),0.66(m,4H,SiCH2),0.75(s,6H,MeSiCl2),1.19(m,4H,CH2SiCl2),1.50(m,6H,CH2),1.85(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),5.1(MeSiCl2),12.5(SiCH2),17.3(CH2),17.9(CH2),22.3(BrCH2CH2CH2),25.9(CH2SiCl2),33.7(BrCH2),36.4(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):δ2.3(MeSi),32.1(MeSiCl2)。
合成BrG
2
A
4
(68)。
此化合物是用BrG2(SiCl2)2(6.25g,0.013mol)和BrMg(C3H5)(0.055mol)制备而成,按上文所述的BrG1A2的合成步骤进行,得到无色油状BrG2A4(5.10g,78%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.08(s,3H,MeSi),-0.04(s,6H,MeSi),0.56(m,10H,SiCH2),1.25(m,6H,CH2),1.52(d,J=8.4Hz,8H,CH2CH=CH2),1.84(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),4.84(m,8H,CH=CH2),5.74(m,4H,CH=CH2);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.7(MeSi),-5.1(MeSi),12.9(SiCH2),17.9,18.2和18.6(CH2),21.4(CH2CH=CH2),22.5(BrCH2CH2CH2),33.6(BrCH2),36.3(BrCH2CH2),113.0(CH=CH2),134.8(CH=CH2);29Si-NMR(CDCl3):0.1(MeSi),1.8(MeSi)。模拟计算C25H49BrSi3(513.82g/mol):C,58.44;H,9.61;Exp.:C,58.01;H,9.53。
合成BrG
3
(SiCl
2
)
4
(69)。
此化合物是用BrG2A4(2.50g,4.86mmol)、HSiMeCl2(3.80g,0.033mol)和Kardsted催化剂(3%mol)制备而成,按上文所述的BrG1(SiCl2)的合成步骤进行,得到无色油状BrG3(SiCl2)4(4.45g,94%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.07(s,3H,MeSi),-0.04(s,6H,MeSi),0.58(m,18H,SiCH2),0.75(s,12H,MeSiCl2),0.87(m,8H,CH2),1.16(m,8H,CH2SiCl2),1.52(m,6H,CH2),1.85(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.2(MeSi),5.5(MeSiCl2),12.9(SiCH2),17.3和17.5(CH2),18.4,18.6和18.7(CH2),22.6(BrCH2CH2CH2),25.9(CH2SiCl2),33.6BrCH2),36.3(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):1.4(MeSi),1.8(MeSi),32.1(MeSiCl2)。
合成BrG
3
A
8
(70)。
这种化合物是用BrG3(SiCl2)4(3.30g,3.39mmol)和BrMg(C3H5)(0.031mol)制备而成,按上文所述的BrG1A2的合成步骤进行,得到无色油状BrG3A8(2.62g,76%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,3H,MeSi),-0.08(s,6H,MeSi),-0.04(s,12H,MeSi),055(m,26H,SiCH2),1.31(m,16H,CH2),1.52(d,J=8.4Hz,16H,CH2CH=CH2),1.84(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),4.84(m,16H,CH=CH2),5.73(m,8H,CH=CH2);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.7(MeSi),-5.1(MeSi),-4.9(MeSi),13.0(SiCH2),17.9,18.3,18.5,18.8和18.9(CH2),21.5(CH2CH=CH2),22.6(BrCH2CH2CH2),33.6(BrCH2),36.4(BrCH2CH2),113.1(CH=CH2),134.9(CH=CH2);29Si-NMR(CDCl3):0.1(MeSi),0.9(MeSi),1.8(MeSi)。模拟计算C53H105BrSi7(1018.90g/mol):C,62.48;H,10.39;Exp.:C,61.92;H,10.33。
合成BrG
1
H
2
(71)。
在0°C下将BrG1(SiCl)2(2.00g,4.44mmol)的Et2O溶液(25mL)缓慢加入LiAlH4(7.76mmol)的Et2O(25mL)溶液中。添加完毕后,使反应液在室温下搅拌过夜。然后将混合液倒入NaCl水溶液中,再用水/乙醚萃取(3次)。用MgSO4干燥有机相,最后蒸干,得到无色液态化合物71(1.20g,71%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.08(s,3H,MeSi),0.04(d,J=4.2Hz,12H,Me2SiH),0.52(m,2H,SiCH2),0.58(m,8H,SiCH2),1.38(m,6H,CH2),1.85(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),3.82(m,2H,SiH);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-4.3(Me2SiH),12.9(SiCH2),17.9(CH2),18.8和19.0(CH2),22.5(BrCH2CH2CH2),33.7(BrCH2),36.4(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):-14.6(Me2SiH),2.1(MeSi)。模拟计算C15H37BrSi3(381.61g/mol):C,47.21;H,9.77;Obt.:C,47.89;H,9.53。
合成BrG
2
H
4
(72)。
此化合物是用BrG2(SiCl2)4(3.15g,3.53mmol)和LiAlH4(10.60mmol)制备而成,按上文所述的BrG1H2的合成步骤进行,得到无色油状BrG2H4(72)(1.76g,66%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,6H,MeSi),-0.08(s,3H,MeSi),0.04(d,J=4.2Hz,12H,Me2SiH),0.54(m,26H,SiCH2),1.35(m,14H,CH2),1.85(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),3.82(m,4H,SiH);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.0(MeSi),-4.38(Me2SiH),13.0(SiCH2),18.2,18.5,18.7,18.8,19.0(CH2),22.5(BrCH2CH2CH2),33.6(BrCH2),36.4(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):-14.1(Me2SiH),1.0(MeSi),1.8(MeSi)。模拟计算C33H81BrSi7(754.50g/mol):C,52.53;H,10.82;Obt.:C,53.00;H,10.25。
合成BrG
3
H
8
(73)。
此化合物是用BrG3(SiCl)8(2.00g,1.13mmol)和LiAlH4(6.75mmol)制备而成,按上文所述的BrG1H2的合成步骤进行,得到无色油状BrG3H8,73,(1.11g,66%)。
1H-NMR(CDCl3):δ-0.10(s,21H,MeSi),0.04(d,J=4.2Hz,48H,Me2SiH),0.58(m,58H,SiCH2),1.31(m,30H,CH2),1.82(m,2H,BrCH2CH2),3.40(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),3.83(m,8H,SiH);13C-NMR{1H}(CDCl3):(MeSi),-4.3(Me2SiH),13.0(SiCH2),18.2-19.0(CH2),22.6(BrCH2CH2CH2),33.5(BrCH2),36.5(BrCH2CH2);29Si-NMR(CDCl3):-14.6(Me2SiH),1.4(MeSi)。模拟计算C69H169BrSi15(1500.27g/mol):C,55.24;H,11.35;Obt.:C,54.88;H,10.73。
合成BrG
1
(COOMe)
4
(74)。
将BrG1H2(1.00g,2.62mmol)、C3H5N(C2H4COOMe)2(1.21g,5.24mmol)和Kardsted催化剂(3%mol)加入正己烷(2mL)中,搅拌过夜。然后加入正己烷(15mL),用活性炭过滤此溶液。在真空下蒸除溶剂,得到无色油状BrG1(COOMe)4,74,(2.04g,92%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,3H,MeSi),-0.08(s,12H,Me2Si),0.33(m,4H,SiCH2),0.52(m,10H,SiCH2),1.27(m,4H,CH2),1.35(m,6H,CH2),1.83(m,2H,BrCH2CH2),2.33(m,4H,CH2N),2.41(t,J=7.3Hz,8H,CH2N),2.74(t,J=7.3Hz,8H,CH2CO),3.39(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),3.61(s,12H,OMe)。13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-3.3(Me2Si),12.8(SiCH2),12.9(SiCH2),18.4(CH2),18.6和20.1(CH2),21.5(CH2CH2N),22.5(BrCH2CH2CH2),32.5(CH2CO),33.7(BrCH2),36.4(BrCH2CH2),49.2(CH2N),51.6(OMe),57.5(CH2N),173.1(CO)。模拟计算C37H75BrN2O8Si3(840.16g/mol):C,52.89;H,9.00;Obt.:C,52.29;H,8.63。
合成BrG
2
(COOMe)
8
(75)。
此化合物是用BrG2H4(0.30g,0.40mmol)和C3H5N(C2H4CO2Me)2(0.40g,1.75mmol)制备而成的,按上文所述的BrG1(CO2Me)4的合成步骤进行,以甲苯为洗脱液进行凝胶渗透层析后,得到无色油状BrG2(CO2Me)8(0.53g,80%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,6H,MeSi),-0.08(s,3H,MeSi),-0.07(s,24H,Me2Si),0.37(m,8H,SiCH2),0.52(m,26H,SiCH2),1.33(m,22H,CH2),1.83(m,2H,BrCH2CH2),2.33(m,8H,CH2N),2.41(t,J=7.3Hz,16H,CH2N),2.74(t,J=7.3Hz,16H,CH2CO),3.39(t,J=6.6Hz,2H,BrCH2),3.61(s,24H,OMe)。
B——将上一节中合成的树状体偶联到一个多酚核上。
在上一段中描述的所有树状体的焦点中均具有一个-CH2Br官能团,通过此官能团可将树状体固定到一个多酚核上,例如氢醌或1,3,5-三羟基苯,使树枝状化合物的表面具有不同官能团。焦点处具有C-Br键的楔型树枝状分子与酚类化合物发生的偶联反应通常在碳酸钾(K2CO3)和冠醚18-C-6存在的情况下,在丙酮中进行,反应温度为80°C,如方案15所述:
方案15
其中:i)K2CO3,C18H32O6,丙酮,80°C;F为官能团;y为官能团个数。
在下文所述的这些树枝状化合物中,已使用一种GnOxFy型命名法,其中:
Gn:表示通过偶联楔型树枝状分子和多酚核获得的第几代树枝状化合物。
Ox:表示已通过酚类化合物的氧原子将楔型树枝状分子偶联到树枝状化合物的核上。数字x表示起始多酚衍生物中存在的基团数。因此,O2表示与氢醌核偶联,O3表示与具有三个酚基的1,3,5-三羟基苯核偶联。
F:代表一个或多个字母,这些字母用于说明存在于树枝状化合物表面的官能团的性质。因此A代表一个烯丙基基团,Cl代表端Si-Cl键,H代表端Si-H键,N代表端氨基,等等。
y:表示存在于树枝状化合物表面的官能团数。
合成具有端烯丙基基团的树枝状化合物
使焦点处具有C-Br键且表面具有烯丙基基团的楔型树枝状分子与一个多酚核发生偶联反应,生成末端为烯丙基的球形树枝状化合物,如方案16中的第一代树枝状化合物的结构图所示。例如,1,3,5-三羟基苯与楔型树枝状分子BrG1A2(2)反应生成表面含六个烯丙基基团的树枝状化合物G1O3A6(13)。如果使用第二代楔型树枝状分子BrG2A4(4),则得到第二代树枝状化合物G2O3A12(14),如果使用第三代楔型树枝状分子BrG3A8(6),则得到第三代树枝状化合物G3O3A24(15)。
方案16
其中:i)K2CO3,18C6(10%),丙酮,80°C
合成具有端Si-H基团的树枝状化合物
使焦点处具有C-Br键且表面具有Si-H键的楔型树枝状分子与一个多酚核发生偶联反应,生成用端Si-H基团功能化了的球形树枝状化合物(如方案17中的第一代衍生物)。通过这种方式,当起始物为BrG1H2(71)时,得到第一代树枝状化合物G1O3H6(80),当起始物为BrG2H4时,分离出第二代树枝状化合物G2O3H12(81),当起始物为BrG3H8(73)时,得到含24个Si-H分支的树枝状化合物G3O3H24(82)。
这些衍生物也可通过一种两步过程,用末端为烯丙基的树枝状化合物77-79制得,即,先使烯丙基树枝状化合物与HSiMe2Cl发生硅氢加成反应,再通过LiAlH4,用氢原子取代氯原子,从而获得上文所述的树枝状化合物80-82。
方案17
其中:i)K2CO3,18C6(10%),丙酮,80°C
合成具有端酯基CO
2
Me基团的树枝状化合物。
通过相似的方式,如上两段所述,使焦点处具有一个C-Br键且表面具有甲酯基团的楔型树枝状化合物与多酚核反应,形成用端酯基功能化的球形树枝状化合物(方法A)。方案18显示了第一代树枝状化合物的制备方法。通过这种方法,以BrG1(COOMe)4(74)为起始物则获得第一代树枝状化合物G1O3(COOMe)12(83),以BrG2(COOMe)8(75)为起始物则生成第二代树枝状化合物G2O3(COOMe)24(84),以BrG3(COOMe)16(76)为起始物则分离出含48个端酯基的树枝状化合物G3O3(COOMe)48(85)。也可通过烯丙胺A与端Si-H树枝状化合物(80-82)之间的硅氢加成反应(方法B),或通过用NH2功能化的树枝状化合物(86-88)与丙烯酸甲酯之间的Michael型加成反应(方法C)制备这些化合物。方案19显示了这些通过方法B和C制备的具有酯基的树枝状化合物的合成路线。
方案18
其中:i)K2CO3,18C6(10%),丙酮,80°C
方案19
其中:i)HSiMe2Cl,Pt催化剂;ii)LiAlH4;iii)C3H5NH2,Pt催化剂;iv)C2H3CO2Me;v)C3H5N(C2H4CO2Me)2,Pt催化剂。
已通过碳、氢和氮元素分析、1H、13C和29Si NMR光谱和质谱分析对树枝状化合物77-85进行了表征,详见下文:
合成G
1
O3A
6
(77)。
将BrG1A2(1.50g,5.74mmol)、1,3,5-(HO)3C6H3(0.24g,1.91mmol)、K2CO3(1.59g,1148mmol)、冠醚18-C-6(0.15g,0.57mmol)加入丙酮(50mL)中,然后将此混合液装入特氟隆阀安瓿瓶中,再将此瓶在80°C下加热48小时。反应完毕后用Et2O/H2O(氨水,12%)萃取,先后用MgSO4和SiO2干燥有机相30分钟。过滤溶液,并在真空下蒸除挥发性物质,得到浅黄色油状G1O3A6(1.01g,79%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.02(s,9H,MeSi),0.58(m,6H,CH2Si),1.44(m,6H,OCH2CH2CH2),1.54(d,J=8.5Hz,12H,CH2CH=CH2),1.76(m,6H,OCH2CH2),3.89(t,J=6.4Hz,6H,OCH2),4.84(m,12H,CH=CH2),5.78(m,6H,CH=CH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.9(MeSi),12.7(SiCH2),20.1(OCH2CH2CH2),21.3(CH2CH=CH2),32.9(OCH2CH2),67.4(OCH2),93.7(C6H3(CH),113.1(CH=CH2),134.7(CH=CH2),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):0.8(MeSi)。模拟计算C39H66O3Si3(667.20g/mol):C 70.21;H 9.97;Obt.:C 69.83;H 9.22。
合成G
2
O3A
12
(78)
方法A)此化合物是由BrG2A4(1.50g,2.92mmol)、1,3,5-(HO)3C6H3(0.12g,0.97mmol)、K2CO3(0.81g,5.84mmol)和冠醚18-C-6(0.077g,0.29mmol)制备而成,按本文所述的G1O3A6的合成步骤进行,得到淡黄色油状G2O3A12,78(0.98g,71%)。
方法B)以G2O3(SiCl2)6(4.20g,3.09mmol)和BrMg(C3H5)(0.044mol)为起始物,按本文所述的BrG1A2的合成步骤进行,得到淡黄色油状G2O3A1278(3.35g,76%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.08(s,9H,MeSi),-0.04(s,18H,MeSi),0.57(m,30H,SiCH2),1.30(m,12H,CH2),1.41(m,6H,OCH2CH2CH2),1.52(d,J=7.9Hz,24H,CH2CH=CH2),1.75(m,6H,OCH2CH2),3.88(t,J=6.3Hz,6H,OCH2),4.84(m,24H,CH=CH2),5.74(m,12H,CH=CH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.7(MeSi),-5.1(MeSi),13.8(SiCH2),17.9,18.2和18.6(CH2),20.6(OCH2CH2CH2),21.5(CH2CH=CH2),33.3(OCH2CH2),67.6(OCH2),93.7(C6H3(CH),113.1(CH=CH2),134.9(CH=CH2),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):0.1(MeSi),1.5(MeSi)。模拟计算C81H150O3Si9(1424.83g/mol):C 68.28;H 10.61;Obt.:C 68.01;H 10.31。
合成G
3
O3A
24
(79)
方法A)此化合物是由BrG3A8(1.50g,1.47mmol)、1,3,5-(HO)3C6H3(0.061g,0.49mmol)、K2CO3(0.41g,2.94mmol)和冠醚18-C-6(0.039g,0.14mmol)制备而成,按本文所述的G1O3A6的合成步骤进行,得到淡黄色油状G3O3A24,79(0.92g,62%)。
方法B)以G3O3(SiCl2)12(3.10g,1.10mmol)和BrMg(C3H5)(0.027mol)为起始物,按本文所述的BrG1A2的合成步骤进行,得到淡黄色油状G3O3A24(2.50g,77%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,18H,MeSi),-0.07(s,9H,MeSi),-0.04(s,36H,MeSi),0.55(m,78H,SiCH2),1.31(m,42H,CH2),1.52(d,J=7.9Hz,48H,CH2CHCH2),1.75(m,6H,OCH2CH2),3.88(t,J=6.3Hz,6H,OCH2),4.84(m,48H,CH=CH2),5.74(m,24H,CH=CH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.7(MeSi),-5.0(MeSi),13.9(CH2Si),17.9,18.2,18.5,18.8,18.9(CH2),20.6(OCH2CH2CH2),21.5(CH2CH=CH2),33.3(OCH2CH2),67.7(OCH2),93.6(C6H3(CH),113.0(CH=CH2),134.9(CH=CH2),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):0.1(MeSi),0.9(MeSi),1.7(MeSi)。模拟计算C165H318O3Si21(2940.08g/mol):C 67.41;H 10.90;Obt.:C 66.56;H 10.87。
合成G
1
O3H
6
(80)
此化合物可以通过一种两步过程,从G1O3A6,77制得。第一步为77(1.01g,1.51mmol)与HSiMe2Cl(1.46g,0.015mol)在Kardsted催化剂(3%mol)的作用下发生硅氢加成反应,得到浅黄色油状具有Si-Cl键的树枝状化合物G1O3(SiCl)6(1.77g,95%)。G1O3(SiCl)6(1.77g,1.43mmol)与LiAlH4(6.45mmol)按照本文所述的BrG1H2的合成步骤进行反应,得到无色油状化合物G1O3H6,80,(1.00g,68%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.08(s,9H,MeSi),0.04(d,J=4.2Hz,36H,Me2SiH),0.55(m,18H,SiCH2),0.63(m,12H,CH2SiH),1.25(m,18H,CH2),1.77(m,6H,OCH2CH2),3.82(m,6H,SiH),3.88(t,J=6.6Hz,6H,OCH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-4.4(Me2SiH),13.7(SiCH2),18.0,18.8和18.9(CH2),20.5(OCH2CH2CH2),33.2(OCH2CH2),67.6(OCH2),93.8(C6H3(CH),161.0(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):-14.0(Me2SiH),1.9(MeSi)。模拟计算C51H114O3Si9(1028.22g/mol):C 59.57;H 11.18;Obt.:C 59.89;H11.53。
合成G
2
O3H
12
(81)
此化合物可以通过一种两步过程,从G2O3A12,78制得。第一步为78(2.00g,1.40mmol)与HSiMe2Cl(2.71g,0.029mol)在Kardsted催化剂(3%mol)的作用下发生硅氢加成反应,得到浅黄色油状具有Si-Cl键的树枝状化合物G2O3(SiCl)12(3.41g,95%)。G2O3(SiCl)12(1.45g,0.57mmol)与LiAlH4(5.10mmol)按照本文所述的BrG1H2的合成步骤进行反应,得到无色油状化合物G2O3H12,81,(0.80g,66%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,18H,MeSi),-0.08(s,9H,MeSi),0.03(d,J=4.2Hz,72H,Me2SiH),0.55(m,54H,SiCH2),0.63(m,24H,CH2SiH),1.35(m,42H,CH2),1.77(m,6H,OCH2CH2),3.82(m,12H,SiH),3.88(t,J=6.6Hz,6H,OCH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-5.0(MeSi),-4.4(Me2SiH),13.9(SiCH2),18.2,18.5,18.8和19.0(CH2),20.5(OCH2CH2CH2),33.3(OCH2CH2),67.7(OCH2),93.7(C6H3(CH),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):-14.2(Me2SiH),0.8(MeSi),1.9(MeSi)。模拟计算C105H246O3Si21(2146.87g/mol):C 58.74;H 11.55;Obt.:C 57.89;H 11.53。
合成G
3
O3H
24
(82)
此化合物可以通过一种两步过程,从G3O3A24,82制得。第一步为79(2.50g,0.85mmol)与HSiMe2Cl(3.28g,0.034mol)在Kardsted催化剂(3%mol)的作用下发生硅氢加成反应,得到浅黄色油状具有Si-Cl键的树枝状化合物G3O3(SiCl)24(4.21g,95%)。G3O3(SiCl)24(3.00g,0.58mmol)与LiAlH4(0.010mol)按照本文所述的BrG1H2的合成步骤进行反应,得到无色油状化合物G3O3H24,82,(1.64g,65%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s.a.,54H,MeSi),0.03(d,J=4.2Hz,144H,Me2SiH),0.58(m,174H,SiCH2),1.35(m,90H,CH2),1.77(m,6H,OCH2CH2),3.82(m,30H,SiH和OCH2),6.03(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.0(MeSi),-4.3(Me2SiH),13.9(CH2Si),18.2,18.5,18.8,18.9(CH2),20.6(OCH2CH2CH2),33.2(OCH2CH2),67.7(OCH2),94.5(C6H3(CH),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):-14.2(Me2SiH),1.0,1.2(MeSi)。模拟计算C213H510O3Si45(4384.17g/mol):C 58.35;H 11.73;Obt.:C 58.85;H 10.97。
C.用不同性质的阴离子基团,例如羧酸酯、磺酸酯、磷酸酯,对上一节中获得的树枝状化合物的外层进行功能化。
分离出上一段中所述的树枝状化合物后,可通过不同方式合成阴离子树枝状化合物,具体方式首先取决于起始树枝状化合物中的官能团,其次取决于最终树枝状化合物中的目标阴离子基团的性质。
阴离子羧酸酯树枝状化合物。
对于用上文所述的方法A、B、C制得的具有端酯基的树枝状化合物,可以在甲醇和水的混合液中用碱,例如NaOH对其进行处理,使其转化为阴离子羧酸酯树枝状化合物89-91(方案20)。
按照前文所述的步骤,生成含12个阴离子端基的第一代树枝状化合物G1O3(COONa)12(89),含24个阴离子端基的树枝状化合物G2O3(COONa)24(90),以及含48个羧酸酯端基的树枝状化合物G3O3(COONa)48(91)。方案20描述了第一代树枝状化合物的合成方法。
方案20
其中:i)NaOH
阴离子磺酸酯树枝状化合物。
具有端磺酸酯基团的阴离子树枝状化合物的合成是通过乙烯基磺酸钠与NH2树枝状化合物(86-88)之间的Michael型加成反应实现的,此反应可生成具有外围磺酸酯基团的阴离子树枝状化合物。
通过这种方式,已制得分别含12、24和48个端磺酸酯基团的阴离子树枝状化合物G1O3(SO3Na)12(92)、G2O3(SO3Na)24(93)和G3O3(SO3Na)48(94)。方案21描述了第一代树枝状化合物的合成方法。
方案21
其中:i)C2H3SO3Na
合成磷酸酯阴离子树枝状化合物。
以NH2树枝状化合物(86-88)为起始物,通过两个步骤合成阴离子磷酸酯树枝状化合物。首先,在THF中与甲醛在室温下反应1小时,然后在“原位置”加入亚磷酸二甲酯,将混合液加热到40°C,并在该温度下反应3小时,得到具有端PO(OMe)2单元的树枝状化合物。最后,这些树枝状化合物与NaOH反应,其外围PO(OMe)2基团转化为阴离子-PO(ONa)2.基团
通过这种方式,已制得分别含12、24和48个端磷酸酯基团的阴离子树枝状化合物G1O3(PO(ONa)2)12(95)、G2O3(PO(ONa)2)24(96)和G3O3(PO(ONa)2)48(97)。方案22描述了第一代树枝状化合物的合成方法。
方案22
其中:i)CH2O,HP(O)(OMe)2;ii)NaOH
已通过碳、氢和氮元素分析、1H、13C、29Si和31P NMR光谱和质谱分析对树枝状化合物86-97进行了表征,详见下文:
合成G
1
O3(NH
2
)
6
(86)。
将G1O3H6(0.50g,0.49mmol)、烯丙基胺、C3H5NH2(0.37g,6.42mmol)和Kardsted催化剂(3%mol)加入THF(3mL)中,然后将此混合液装入特氟隆阀安瓿瓶中,再将此瓶在120°C下加热48小时。然后蒸除挥发性物质,加入CH2Cl2(10mL),再用活性炭过滤溶液。蒸除溶剂,得到浅黄色油状G1O3(NH2)6,86(0.59g,89%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.09(s,9H,MeSi),-0.06(s,36H,Me2SiH),0.48(m,18H,SiCH2),0.54(m,36H,SiCH2),1.29(m,18H,CH2),1.40(m,24H,CH2),1.74(m,6H,OCH2CH2),2.63(t,J=7.1Hz,12H,CH2N),3.87(t,J=6.3Hz,6H,OCH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-3.3(Me2Si),12.3(NCH2CH2CH2),13.8(SiCH2),18.4,18.6和20.0(CH2),20.5(OCH2CH2CH2),33.2(OCH2CH2),45.6(NCH2),67.6(OCH2),93.7(C6H3(CH),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):1.8(MeSi),2.1(Me2Si)。模拟计算C69H156N6O3Si9(1370.78g/mol):C 60.46,H 11.47,N 6.13;Obt.:C 61.11,H11.26,N 5.86。
合成G
2
O3(NH
2
)
12
(87)。
第二代树枝状化合物87的制备步骤与本文所述的化合物86的制备步骤相似,以G2O3H12(0.50g,0.23mmol)和C3H5NH2(0.32g,5.59mmol)为起始物,得到淡黄色油状G2O3(NH2)12(0.47g,72%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.11(s,18H,MeSi),-0.09(s,9H,MeSi),-0.07(s,72H,Me2SiH),0.43(m,26H,CH2),0.54(m,72H,CH2),1.21(s,24H,NH2),1.28(m,36H,CH2),1.38(m,30H),1.74(m,6H,OCH2CH2),2.63(t,J=7.1Hz,24H,CH2N),3.85(t,J=6.3Hz,6H,OCH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-4.9(MeSi),-4.7(MeSi),-3.3(Me2Si),12.3(SiCH2),13.8(SiCH2),18.4,18.6,18.8,20.0,20.1(CH2),20.6(OCH2CH2CH2),28.3(CH2CH2N),33.3(OCH2CH2),45.7(CH2N),67.6(OCH2),93.7(C6H3(CH),160.9(i-C6H3);29Si-NMR(CDCl3):0.9(MeSi),1.7(MeSi),1.9(Me2Si)。模拟计算C141H330N12O3Si21(2832.00g/mol):C 59.80;H 11.75;N 5.94;Obt.:C 60.92;H10.03;N 5.44.
合成G
3
O3(NH
2
)
24
(88)。
第三代树枝状化合物88的制备步骤与本文所述的化合物86的制备步骤相似,以G3O3H24(1.00g,0.23mmol)和C3H5NH2(0.62g,0.011mol)为起始物,得到淡黄色油状G3O3(NH2)24(0.48g,36%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.11(s.a.,54H,MeSi),-0.07(s,144H,Me2Si),0.52(m,222H,SiCH2),1.21-1.50(m,186H,NH2,CH2),1.74(m,6H,OCH2CH2),2.63(t,J=7.1Hz,48H,CH2N),3.85(t,J=6.3Hz,6H,OCH2),6.04(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-4.9(MeSi),-3.3(Me2Si),12.8(CH2CH2CH2N),14.1(SiCH2),17.9-20.6(CH2),27.1(CH2CH2N),33.4(OCH2CH2),45.1(CH2N),67.8(OCH2),93.7(C6H3(CH),161.0(i-C6H3)。模拟计算C285H678N24O3Si45(5754.44g/mol):C 59.49;H 11.88;N 5.84;Obt.:C 58.50;H 11.67;N 5.34。
合成G
1
O3(COOMe)
12
(83)。
方法A)此化合物是由BrG1(CO2Me)4(0.55g,0.65mmol)、1,3,5-(HO)3C6H3(0.027g,0.21mmol)、K2CO3(0.18g,1.30mmol)和冠醚18-C-6(0.017g,0.06mmol)制备而成,按本文所述的G1O3A6的合成步骤进行,得到淡黄色油状G1O3(CO2Me)12(0.36g,68%)。
方法B)以G1O3H6(0.20g,0.19mmol)和C3H5N(C2H4CO2Me)2(0.28g,1.18mmol)为起始物,按本文所述的BrG1(CO2Me)4的合成步骤进行,用正己烷(2x 10mL)洗后,得到淡黄色油状G1O3(CO2Me)12(0.42g,89%)。
方法C)在室温下将G1O3(NH2)6(0.25g,0.18mmol)、丙烯酸甲酯C2H3CO2Me(0.28g,3.28mmol)和CH3OH(5mL)组成的混合溶液搅拌16个小时。然后过滤溶液,蒸除挥发性物质,用正己烷(2x 10mL)洗残留的油状物,得到淡黄色油状G1O3(CO2Me)12,83(0.39g,90%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.09(s,9H,MeSi),-0.07(s,36H,Me2Si),0.40(m,12H,SiCH2),0.53(m,30H,SiCH2),1.27(m,12H,CH2),1.36(m,18H,CH2),1.75(m,6H,OCH2CH2),2.39(m,12H,CH2N),2.41(t,J=7.3Hz,24H,CH2N),2.74(t,J=7.3Hz,24H,CH2CO),3.64(s,36H,OMe),3.87(t,J=6.6Hz,6H,OCH2),6.03(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-3.3(Me2Si),12.8(SiCH2),13.9(SiCH2),18.4,18.6和20.1(CH2),20.5(OCH2CH2CH2),21.5(CH2CH2N,32.5(CH2CO),33.7(OCH2CH2),49.2(CH2N),51.6(OMe),57.5(CH2N),67.7(OCH2),93.6(C6H3(CH),160.9(i-C6H3),173.1(CO);29Si-NMR(CDCl3):1.6(MeSi),1.9(Me2Si)。模拟计算C117H228N6O27Si9(2403.86g/mol):C 58.46,H 9.56,N 3.50;Obt.:C 58.09,H 9.13,N 3.02。
合成G
2
O3(COOMe)
24
(84)。
化合物84的合成步骤与本文所述的衍生物83的合成步骤相似。例如,以G2O3H12(0.35g,0.16mmol)和C3H5N(C2H4CO2Me)2(0.46g,2.00mmol)为起始物,按本文所述的BrG1(CO2Me)4的合成步骤进行,得到淡黄色油状G2O3(CO2Me)24(0.70g,88%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.10(s,27H,MeSi),-0.07(s,72H,Me2Si),0.39(m,24H,SiCH2),0.53(m,78H,SiCH2),1.30(m,66H,CH2),1.75(m,6H,OCH2CH2),2.39(m,24H,CH2N),2.41(t,J=7.3Hz,48H,CH2N),2.74(t,J=7.3Hz,48H,CH2CO),3.64(s,72H,OMe),3.87(t,J=6.6Hz,6H,OCH2),6.03(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):-5.1(MeSi),-3.3(Me2Si),12.8(SiCH2),13.9(SiCH2),18.4,18.8,19.0和20.1,20.5,21.5(CH2),32.5(NCH2),33.7(OCH2CH2),49.2(CH2CO),51.2(OMe),57.5(CH2N),67.7(OCH2),93.6(C6H3(CH),160.9(i-C6H3),173.1(CO);29Si-NMR(CDCl3):0.9(MeSi),1.7(MeSi),1.9(Me2Si)。
合成G
3
O3(COOMe)
48
(85)。
化合物85的合成步骤与本文所述的衍生物83的合成步骤相似。例如,以G3O3H24(0.32g,0.075mmol)和C3H5N(C2H4CO2Me)2(0.41g,1.80mmol)为起始物,按本文所述的BrG1(CO2Me)4的合成步骤进行,得到淡黄色油状G3O3(CO2Me)48(0.63g,88%)。
1H-NMR(CDCl3):-0.12(s.a.,54H,MeSi),-0.07(s,144H,Me2Si),0.38(m,48H,SiCH2),0.52(m,174H,SiCH2),1.26(m,84H,CH2),1.38(m,54H,CH2),1.75(m,6H,OCH2CH2),2.45(m,144H,CH2N),2.74(s.a.,98H,CH2CO),3.63(s,144H,OMe),3.87(s.a.,6H,OCH2),6.00(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(CDCl3):δ-4.8(MeSi),-3.3(Me2Si),12.8(SiCH2),14.1(SiCH2),18.4-20.5(CH2),32.3(NCH2),33.6(OCH2CH2),49.2(CH2CO),51.6(OMe),57.4(CH2N),67.8(OCH2),93.6(C6H3(CH),160.9(i-C6H3),172.8(CO);29Si-NMR(CDCl3):-0.9,1.8(MeSi),1.9(Me2Si)。模拟计算C477H966N24O99Si45(9886.72g/mol):C 57.95;H 9.85;N 3.40;Obt.:C 57.09;H 10.10;N 3.63。
合成G
1
O3(COONa)
12
(89)。
将NaOH(0.048g,1.19mmol)的水溶液(1mL)加入G1O3(COOMe)12(0.20g,0.083mmol)的甲醇溶液(3mL),搅拌反应24小时。蒸干溶剂,用MeOH(2x 10mL)和Et2O(2x10mL)洗残留物,得到白色固态G1O3(COONa)12,89(0.17g,82%)。
1H-NMR(D2O):-0.26(s,45H,MeSi),0.19(m,18H,SiCH2),0.32(m,24H,SiCH2),1.19(m,30H,CH2),1.45(m,6H,OCH2CH2),2.07(m,36H,CH2N),2.47(m,24H,CH2CO),3.50(s,6H,OCH2),5.70(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(D2O):-4.8(MeSi),-3.5(Me2Si),12.8(SiCH2),13.7(SiCH2),18.4-20.2(CH2),32.9(OCH2CH2),34.2(CH2N),49.4(CH2CO),57.0(CH2N),67.1(OCH2),93.7(C6H3(CH),160.5(i-C6H3),181.1(CO);29Si-NMR(D2O):1.6(MeSi)。
合成G
2
O3(COONa)
24
(90)。
以G2O3(COOMe)24(0.35g,0.071mmol)和NaOH(0.046g,1.16mmol)为起始物,按本文所述的89的合成步骤进行,得到白色固态G2O3(COONa)24(90)(0.29g,82%)。
1H-NMR(D2O):-0.21(s,99H,MeSi和Me2Si),0.22(m,30H,SiCH2),0.38(m,72H,SiCH2),1.17(m,66H,CH2),1.58(m,6H,OCH2CH2),2.10(m,48H,CH2N),2.19(m,24H,CH2N),2.51(m,48H,CH2CO),3.42(s,6H,OCH2),5.64(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(D2O):-4.5(MeSi),-3.4(Me2Si),13.0(SiCH2),13.7(SiCH2),18.4-20.3(CH2),32.9(OCH2CH2),34.3(NCH2),49.6(CH2CO),57.2(NCH2),67.2(OCH2),93.8(C6H3(CH),168.4(i-C6H3),181.2(CO);29Si-NMR(D2O):1.7(MeSi和Me2Si)。
合成G
3
O3(COONa)
48
(91)。
以G3O3(COOMe)48(0.30g,0.030mmol)和NaOH(0.069g,1.74mmol)为起始物,按本文所述的89的合成步骤进行,得到白色固态G3O3(COONa)48(91)(0.24g,79%)。
1H-NMR(D2O):-0.21(s.a.,207H,MeSi和Me2Si),0.20-0.40(m,222H,SiCH2),1.16(m,138H,CH2),1.58(m,6H,OCHC2H2),2.09(m,144H,CH2N),2.49(m,96H,CH2CO),3.42(s,6H,OCH2),5.64(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(D2O):-4.5(MeSi),-3.4(Me2Si),12.9(SiCH2),18.0-21.0(CH2),34.2(NCH2),49.4(CH2CO),57.2(NCH2),181.1(CO),未观察到OCH2CH2CH2CH2或C6H3的碳原子。
合成G
1
O3(SO
3
Na)
12
(92).
将G1O3(NH2)6(0.25g,0.18mmol)和C2H3SO3Na(0.28g,2.18mmol)加入H2O/EtOH混合液(5mL/10mL)中,然后将所得混合液加入特氟隆阀安瓿瓶中,再将此瓶在120°C下加热48小时。然后蒸干溶剂,用MeOH(2x10mL)和Et2O(2x 10mL)洗残留物,得到白色固态G1O3(SO3Na)12,92(0.30g,57%)。
1H-NMR(D2O):-0.18(s,45H,MeSi),0.26(m,18H,SiCH2),0.39(m,24H,SiCH2),1.19(m,18H,CH2),1.29(m,12H,CH2),1.47(m,6H,OCH2CH2),2.26(m,12H,CH2N),2.77(m,24H,CH2N),2.86(m,24H,CH2S),3.59(s,6H,OCH2),5.78(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(D2O):-4.8(MeSi),-3.5(Me2Si),12.7(SiCH2),13.7(SiCH2),18.4,19.9和20.2(CH2),32.7(OCH2CH2),47.1(CH2S),47.8(CH2N),57.1(CH2N),67.2(OCH2),93.7(C6H3(CH),160.6(i-C6H3);29Si-NMR(D2O):1.9(MeSi)。
合成G
2
O3(SO
3
Na)
24
(93).
以G2O3(NH2)12(0.20g,0.071mmol)和C2H3SO3Na(0.13g,0.97mmol)为起始物,按本文所述的92的合成步骤进行,得到白色固态G2O3(SO3Na)24,93(0.25g,60%)。
1H-NMR(D2O):-0.18(s,99H,MeSi和Me2Si),0.26(m,30H,SiCH2),0.41(m,72H,SiCH2),1.25(m,66H,CH2),1.60(m,6H,OCH2CH2),2.27(m,24H,CH2N),2.75(m,48H,CH2N),2.86(m,48H,CH2S),3.45(s,6H,OCH2),5.78(s,3H,C6H3);13C-NMR{1H}(D2O):-4.6(MeSi),-3.4(Me2Si),12.7(SiCH2),13.7(SiCH2),18.5-20.5(CH2),33.0(OCH2CH2),47.0(NCH2),47.9(CH2S),57.2(NCH2),66.8(OCH2),93.6(C6H3(CH),160.6(i-C6H3);29Si-NMR(D2O):1.9(MeSi和Me2Si)。
合成G
3
O3(SO
3
Na)
48
(94)。
以G3O3(NH2)24(0.20g,0.035mmol)和C2H3SO3Na(0.12g,0.92mmol)为起始物,按本文所述的92的合成步骤进行,得到白色固态G3O3(SO3Na)48,93(0.26g,63%)。
1H-NMR(D2O):-0.13(s.a.,207H,MeSi和Me2Si),0.41(s.a.,222H,SiCH2),1.15-1.60(s.a.,144H,CH2),2.40(s.a.,48H,CH2N),2.90(s.a.,192H,CH2N和CH2S),未观察到OCH2和C6H3的对应信号;13C-NMR{1H}(D2O):-4.4(MeSi),-3.3(Me2Si),12.5(SiCH2),18.0-21.0(CH2),46.7(NCH2),48.5(CH2S),57.2(NCH2),未观察到OCH2CH2CH2CH2或C6H3的碳原子。
实施例3:本发明所述树枝状化合物的生物活性。
下文对根据本发明合成的新阴离子树枝状化合物在不同细胞系(阴道细胞和淋巴细胞)、不同生理群(外周血单核细胞、红血球、巨噬细胞和树突状细胞)及细菌培养基中的细胞毒性、丝裂原活性以及杀微生物/微生物抑制作用进行了评估。
材料和方法
1.细胞
人子宫内膜癌细胞(HEC-1A):来自人子宫内膜腺癌的人子宫内膜细胞系是由美国标准生物品收藏中心(AmericanType Culture Collection,简称ATCC)提供的。HEC-1A保存在完全培养基中[添加10%胎小牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(1%氯唑西林、1%氨苄西林和0.32%庆大霉素)的RPMI1640(Gibco)],采用24或96孔板或带孔径为0.4微米的通透性聚碳酸酯支架的12孔Transwell板(Costar,Cambridge,MA),培养条件为37°C的环境温度,5%的CO2和95%的相对湿度。
外周血单核细胞(PBMC):外周血单核细胞来自马德里输血中心(Transfusion Centre of Madrid)的健康献血者血液的白细胞层。用6.7mM磷酸盐缓冲盐水(PBS,Bio-)将血液稀释1/2,然后进行密度梯度离心(Ficoll-)。离心后回收含PBMC的晕圈,然后用加入PBS进行两个洗涤—离心周期(10分钟,1500rpm)。将所得PBMC重新混悬于完全培养基中,在培养条件下培养。
MT-2:人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)转化细胞系。来自美国标准生物品收藏中心。用完全培养基培养,采用不同板格式(6、24或96孔)和不同培养条件。
树突状细胞(DC):通过密度梯度分离出PBMC,如上文所述。通过免疫磁性分离法获得单核细胞,通过分离柱(Miltenyi Biotec,德国)获得抗人单克隆抗体CD14(MicroBeads)。将纯化的单核细胞混悬于平底6孔板中的完全培养基中,使其浓度为2*106个细胞/孔,最终体积为3mL。在培养条件下用50ng/ml rh GM-CSF和20ng/ml rh IL-4(ImmunoTools,德国)培养细胞。第3天时,向未成熟细胞(CDi)中加入半孔完全新鲜的含50ng/ml rh GM-CSF和20ng/ml rh IL-4的培养基。第6天时,用20ng/ml LPS(Sigma)处理成熟细胞2天(CDM)。使用4色Beckman-细胞计数仪和Beckman-专用的软件分析CDI和CDM标记物。
巨噬细胞:通过密度梯度法和免疫磁性分离法,用抗人单克隆抗体CD14(MicroBeads)分离出PBMC,如上文所述。将提纯的单核细胞混悬于平底6孔板中的RPMI 1640(Gibco)中,该培养基中添加了10%人血清AB、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(1%氯唑西林,1%氨苄西林和0.32%庆大霉素),使其浓度为2*106个细胞/孔,最终体积为3mL。用50ng/ml rh M-CSF培养,3天后添加含50ng/ml rh M-CSF的新鲜培养基。第7天时,使用4色Beckman-细胞计数仪和Beckman-专用的软件分析巨噬细胞标记物。
T细胞系Jurkat E6克隆(ATCC;T淋巴细胞系)通常在RPMI1640(Biochrom KG Seromed,德国柏林)中生长,该培养基中混悬添加有5%热灭活胎小牛血清(FCS),1%青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺(ICNPharmaceuticals,Costa Mesa,美国加利福尼亚洲),培养条件为37°C,5%CO2。
2.树枝状化合物
具有硫酸酯(G1SF8、G2SF16和G3SF32)和羧酸酯端基(G1COO8、G2COO16、G3COO32)的碳硅烷树枝状化合物的合成方法已在上一节中描述过(参照第15至19页)。除树枝状化合物和G2CKP32G2CKCOO16以外(参照第21至23页)。
树枝状化合物G1SF8、G2SF16、G3SF32分别对应树枝状化合物G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]4 n=0,x=4(18);G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]8 n=1,x=8(19);G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2SO3Na)2]16n=2,x=16(20),它们的合成方法和表征已在上一节中描述过。树枝状化合物G1COO8、G3COO32、G2COO16以相同形式分别对应树枝状化合物G0-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]4 n=0,x=4(10);G1-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]8 n=1,x=8(11);G2-[Si(CH2)3N(CH2CH2COONa)2]16 n=2,x=16(12)。树枝状化合物G2CKCOO16和G2CKP32以相同方法分别对应ck-ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2CH2COONa)2]8(43)和ck-G1-[Si(CH2)4(N3C2H)CH2N(CH2PO(OMe)2)2]8(51)。
具有磺酸酯端基的碳硅烷树枝状化合物(G1O3SF12、G2O3SF24和G2O3SF48)的合成方法已在上一节描述过。树枝状化合物G1O3SF12、G2O3SF48、G2O3SF24分别对应分别具有12、24和48个端磺酸基的G1O3(SO3Na)12(92)、G2O3(SO3Na)24(93)、G3O3(SO3Na)48(94)。
用于本发明这一部分的这种新命名系统已被用于简化这些树枝状化合物在生化研究中的表达,有利于进一步展开结果讨论。
3.毒性评估
使用不同技术检测在不同方面的生存力:检测膜破裂(台盼蓝染色和LDH检测、线粒体活性(MTT试剂)和细胞增殖(BrdU掺入法)。这些技术被用于研究各代树枝状化合物在HEC-1A和人PBMC中的毒性。此外,已使用血凝和溶血存在试验研究树枝状化合物对人红血球的毒性。
3.1台盼蓝染色
制备浓度为0.8%的台盼蓝溶液。离心分离用树枝状化合物处理过的细胞,缓缓倒出所得上清液,将细胞团块重新混悬后,用台盼蓝溶液处理30秒,然后离心分离细胞团块并用PBS洗两次。在光学显微镜下观察细胞,并计算被台盼蓝染色的阳性细胞(蓝色细胞,死细胞)相对于阴性细胞(活细胞)的百分比。我们选择了较大视野,每次至少100个细胞。
3.2.MTT检测。
选择此方法分析对线粒体和代谢活性的有害细胞内作用。MTT比色法检测以活细胞选择性还原MTT为紫色甲簪的能力为基础,依赖正常代谢活性,常用于细胞毒性筛选。将不同细胞和不同浓度的树枝状化合物置于96孔板中(各100,000个细胞/孔)培养所需时间后,将3个孔作为细胞失活[20%二甲基亚砜(DMSO,)]阳性对照物,移出含树枝状化合物的上清液,并用200mL不含血清或酚红(Opti-)的培养基替代。除了200μLOpti-再以5mg/mL的浓度将先前为实现无菌而过滤的20mL MTT(噻唑蓝,)添加到PBS中(最终浓度为0.5孔mg MTT/mL)。在培养条件下培养4小时后,我们继续以200rpm的转速将孔板离心分离10分钟,然后移出含过量未反应MTT的上清液。接着在570nm(检测)及690nm(对照)波长处,在酶标仪中用分光光度法测定甲簪浓度。使用不含细胞的Optimem培养基将分光光度计校准到零吸光度。通过([A]检测/[A]控制)T100计算相对于对照板(含细胞,不含树枝状化合物)的细胞生存力百分数。根据美国标准生物品收藏中心(ATCC)的指示,针对树枝状化合物的每种浓度检测三次。
3.3.LDH检测
此技术(CytoTox非放射性细胞毒性检测)被用来检测树枝状化合物表面的阴离子外围基团对细胞膜表面造成的损害。乳酸脱氢酶(LDH)是一种由于细胞溶解而被释放到细胞质中的酶。因此LDH检测可测定细胞膜的完整性,测定依据为LDH被氧化为丙酮酸,丙酮酸再将四唑盐还原为甲簪晶体。
向圆底96孔板的每个孔中分配10L完全培养基,使每个孔含有1*105个细胞,然后向每个孔加入100μL树枝状化合物,使每个孔中的液体的最终体积为200μL。对照:1.200L不含细胞的完全培养基(背景对照),2.100μL细胞+100μL完全培养基,3.100μL细胞+100μL Triton X-1000.2%,4.100μL细胞+100μL所需浓度的树枝状化合物。先在培养条件下培养24小时。
以1500rpm转速将孔板离心分离10分钟,然后移出100μL上清液,小心不要带出细胞。将临时制备的100μL反应液加入100μL上清液,然后在室温避光的条件下培养30分钟。最后在490nm和690nm(对照)波长处测量。用以下公式算出细胞毒性:细胞毒性(%)=(4-2)/(3-2)*100
3.4溶血试验
通过上文所述的相同形式的Ficoll梯度法从PBMC中分离出红血球。用适量PBS稀释红血球,直到可以看到每一个红血球。然后将红血球重新混悬于500L PBS中,并在24孔板中培养(300,000/孔)。对于阳性对照,用0.2%的Triton X-100处理细胞。阴性对照:仅用PBS处理细胞。用不同浓度的树枝状化合物培养红血球。我们收集了100μL上清液,并使用酶标仪,用分光光度法测定吸光度,以此来评估凝血情况、细胞数和血红蛋白释放情况。
4.-淋巴细胞增生检测
为了评估树枝状化合物的丝裂原活性,我们进行了细胞增殖检测。实验在平底96孔板中重复进行了三次(每孔200μL完全培养基,其中含100,000个细胞)。此实验包含一个阴性增殖对照(细胞未处理),用不同浓度树枝状化合物处理的孔,和一个用2mg/mL植物血凝素(PHA)处理的阳性增殖对照。在培养条件下培养4天后,我们移出上清液,并制备用于细胞增殖BrdU试剂盒(溴脱氧尿苷细胞增殖检测,Chemicon International)的试样。按试剂盒的试验方案,将BrdU掺入新合成的DNA中。BrudU掺入越多,细胞增殖越快。
5.-HIV抑制检测
5.1制备X4HIV-1NL4-3毒株。
分离的X4HIV-1NL4-3病毒为实验室标准病毒株,MT-2细胞用于病毒传播。洗涤2x106个MT-2细胞,然后将其转移到一个15mL的锥形管中,完全培养基中的细胞浓度为2x106个细胞/mL。接下来,以1个颗粒/细胞或1M.O.I(感染复数)的相同浓度添加HIV-1NL4-3。在培养条件下将MT-2细胞和病毒一起培养2小时,每15-30分钟摇一次。最后将细胞培养物(细胞-病毒)洗涤两次以清除未整合到细胞基因组中的病毒。将3-4mL细胞转移到一个6孔板的孔中培养2-3天,观察孔中是否存在合胞体。当合胞体的存在量达到产量的80-90%时,加入12mL含20*106个MT-2的完全培养基,并使其分散在培养皿中。2-3天后,离心分离培养基,收集上清液。将12mL含20*106个MT-2细胞的的完全培养基加入到先前的细胞中(受感染的MT-2细胞),并使其分散在培养皿中。重复此过程3次。移出上清液,并将其储存在液氮罐中,等候滴定。
5.2.制备R5HIV-1Ba-L毒株。
分离出的病毒R5HIV-1Ba-L是一种标准实验室病毒株,此病毒的传播过程与HIV-1NL4-3相似,但要用此病毒感染受刺激的PBMC。移出上清液,并将其储存在液氮罐中,等候滴定。
5.3.病毒滴定。
在MT-2细胞系中滴定分离出的HIV-1NL4-3和HIV-2CBL23病毒。在96孔板中用完全培养基培养2x104MT-2细胞,然后加入40μL不同浓度的病毒制备物,再进行充分稀释。将稀释液平均分为八份,在培养条件下静置一周。然后通过观察细胞病变效应获得效价值。运用Spearman-Karber公式计算效价。还可通过p24蛋白质酶免疫检测(ELISA p24.NNOTESTTMHIV抗原mAB,)来定量测定效价,并通过mL关系来确定每mL和每μg病毒的颗粒数。通过ELISA检测,用p24蛋白质定量法滴定分离出的HIV-1Ba-L病毒。为确保病毒纯度,定量测定前先用0.22μm的筛子过滤融化部分。
5.4.不同细胞群的体外感染。
用2μg/mL PHA和50UI IL-2PBMC刺激PBMC 48小时以诱导出多克隆活性。然后,用PBS洗涤细胞。在培养条件下在完全培养基中培养目标浓度的细胞和目标数目的HIV颗粒2小时。然后收集细胞培养物中的细胞,并用PBS洗三次以除去未整合到细胞基因组中的病毒,在24孔或96孔板(具体取决于试验)中沉淀后,在实验当天从完全培养基中获得浓度为50IU/mL的IL-2、MT-2、HEC-1A、ILC、CDm和巨噬细胞,用PBS洗两次,然后再用HIV感染2或3小时,具体取决于实验。
5.5.粘附/内化检测。
对于这些检测,在24孔板中使用融合HEC-1A。在500μL完全培养基中将3*105个细胞培养3天。在粘附检测中,先用树枝状化合物预处理细胞2小时、1小时和30分钟,再用HIV-1NL4-3感染。然后用HIV-1NL4-33将每个孔感染3小时。接着,用PBS将单细胞层洗三次,在培养条件下静置。24小时和72小时后,通过ELISA用p24抗原定量测定上清液。对于内化检测,第一步如前文所述。感染3小时后,用PBS将单细胞层洗3次,然后用0.2%的Triton x-100在37°C下处理45分钟,引发细胞溶解。通过ELISA用p24抗原对收集的上清液进行定量测定。
5.6.碳硅烷树枝状化合物的作用机理。
在本实验中使用平底96孔板,用多聚-L-赖氨酸(PLL,)覆盖孔底。为了达到此目的,将50uL PLL在37°C下培养一小时。用PBS洗孔板三次,在4°C下培养4ng HIV过夜,以确保病毒颗粒粘附到孔底。用PBS将每个孔洗三次,以除去未粘附到板上的HIV,然后用不同浓度的树枝状化合物将每孔培养物处理1小时。接着有必要用PBS洗涤产物,并加入先前刺激的PBMC。4天后回收此细胞培养物的上清液,并通过ELISA用p24抗原进行定量测定,以评估PBMC在不同处理条件下产生的HIV的量。使用Tritonx-100(1%)作为病毒颗粒的阳性溶解对照。
5.7.HEC-1A单细胞层。
为了获得完美的极化上皮细胞单细胞层,在孔径为0.4μm的通透性聚碳酸酯支架(Costar,Cambridge,MA)上用完全培养基培养HEC-1A。然后将2*105个细胞在孔中培养7天,每2-3天换一次培养基。在感染前一小时加入树枝状化合物。将病毒颗粒加入单细胞层(100ng)的上室,24/48小时后从下室收集上清液。通过ELISA定量测定病毒浓度。
5.8.PBMC的预处理。
我们将分散于200μL完全培养基中的2*105个刺激PBMC细胞加到圆底96孔板中。对于预处理实验,先将50ng的HIV-1NL4-3用树枝状化合物处理1小时,然后在培养条件下用经过上述处理的病毒将细胞感染3小时。接着用PBS洗孔板两次,再在培养条件下进行培养。3天后通过ELISA用p24定量测定病毒浓度。
5.9.CDi、CDm和巨噬细胞的预处理
细胞分化后,用PBS将细胞洗涤两次,然后将2*105CDi、2*105CDm和105巨噬细胞分散96孔板中的200μL完全培养基中。在感染前一小时加入树枝状化合物。加入病毒颗粒(50ng)后,在培养条件下进行培养,3小时后取出上清液并用PBS洗4次。4天后收集上清液。通过ELISA定量测定病毒浓度。
6.碳硅烷树枝状化合物的杀菌/抑菌作用
金黄色葡萄球菌。菌株和培养条件。
使用FDA209(ATCC 6538)菌株研究树枝状化合物的杀细菌能力。每次实验前用Mueller Hinton琼脂平板(SigmaTM)在37°C下将细菌培养过夜。
生物质实验:在实验当天,用15mL的Mueller Hinton培养基将金黄色葡萄球菌落培养5小时。然后计算金黄色葡萄球菌的数目,并在每个点接种105个金黄色葡萄球菌(在U形底96孔板的每个孔中加入100μL MuellerHinton培养基)。加入树枝状化合物的连续稀释液,每个点共加入200μL。将氨苄西林(Normon laboratories)用作杀菌剂的阳性对照。用树枝状化合物处理24小时后,用酶标仪(Biowhittaker酶标仪2001,λ=550nm)通过分光光度法定量测定生物质的量。
增殖实验:为了评估在存在树枝状化合物的情况下金黄色葡萄球菌的增殖性,处理后24小时使用细胞增殖试剂盒(溴脱氧尿苷细胞增殖检测Chemicon International)。Biowhittaker酶标仪2001,λ=450,对照波长λ=550nm)。细胞数、树枝状化合物处理和接触时间已在生物质实验中描述过。
白色念珠菌。菌株和培养条件。
用分离出的临床SC5314(ATCC MYA-2876)研究树枝状化合物的杀真菌能力。每次实验前在30°C下用YED琼脂平板(1%D-葡萄糖,1%Difco酵母提取物(BD Diagnostic Systems,USA)和2%琼脂)将这种酵母菌培养过夜。
生物质实验:在实验当天,用15mLYED琼脂培养基将分离出的酵母菌落培养5小时。然后计算白色念珠菌的数目,并在每个点接种105个金黄色葡萄球菌(在U形底96孔板的每个孔中加入100μLYED琼脂平板培养基)。加入待评估树枝状化合物的连续稀释液,每个点共加入200μL。将两性霉素B (Duchefa Biochemie)用作杀真菌剂的阳性对照。用树枝状化合物处理24小时后,用酶标仪(Biowhittaker酶标仪2001,λ=550nm)通过分光光度法定量测定生物质的量。
增殖实验:为了评估在存在树枝状化合物的情况下白色念珠菌增殖性,提前3小时使用细胞增殖试剂盒(溴脱氧尿苷细胞增殖检测,ChemiconInternational。Biowhittaker酶标仪2001,λ=450,对照波长λ=550nm),然后再处理24小时,通过这种方式研究BrdU对新合成DNA的掺入情况。细胞数、树枝状化合物处理和接触时间已在生物质实验中描述过。
7.碳硅烷树枝状化合物的抗炎作用。
发炎实验:使用质粒指示物pTNF-luc和在启动子的NF-κB位点含有先后3个拷贝的pNF-κB-luc通过瞬时转染进行此实验。按照商品“细胞系转染辅助用试剂盒V”的方案和X-005中使用的具体程序,用AMAXA核转染仪对Jurkat细胞系进行核转染。用图中所示的不同刺激物(TNF-α、抗TNF-α单克隆抗体和不同浓度(5和10微摩尔)的阴离子磺酸酯树枝状化合物)将转染的细胞刺激16小时。用不同刺激物处理后,通过离心分离收集转染的细胞并根据制造商的建议,用溶解缓冲液商品“双荧光素酶监测系统试剂盒”(Promega)溶解细胞。用BSA-BCA法(Pierce,Rockford,USA)测定5μl溶解的细胞中的蛋白质含量。定量测定后,将所有试样的值标准化为20微克,以测定用光度计1450Microbeta Luminiscence Counter(Walax,Trilux)检测10秒左右时,荧光素酶的活性。萤火虫的荧光素酶活性值用相对于对照细胞的诱导倍数表示。
7.1用TNF-α(促炎细胞因子)进行转染实验。将被pTNF-α转染的JurkatE6克隆细胞作为TNF转录活性抑制的阳性对照,用抗TNF单克隆抗体对其进行处理。在5和10微摩尔剂量(比三个独立实验中未受刺激的对照细胞低二至三倍)下,磺酸酯树枝状化合物能够降低pTNF-luc质粒的启动子活性。阴离子树枝状化合物可降低TNF-α的转录活性。
7.2用质粒pNF-kB-luc进行转染实验。用pNF-kB-luc质粒转染Jurkat细胞,在磺酸酯(10微摩尔)的存在下培养16小时,并测定荧光素酶活性。将TNF(20ng/ml)用作阳性对照。实验表明,在存在磺酸酯的情况下,pNF-kB-luc质粒的活性明显下降,此结果与用10微克ml抗TNF-α抗体处理细胞得到的结果相似。此外,用磺酸酯+TNF-α处理细胞时,观察到NF-kB-luc的诱导结果发生了逆转。试验结果表示为标准化诱导指数,包含细胞对照的值,不包含处理对照,代表三个独立实验。
具有硅原子核的树枝状化合物的实验结果:
树枝状化合物的细胞毒性
为了对每一种新合成的树枝状化合物的三代化合物进行完整的表征,我们设计了一种筛选系统来确定生物兼容浓度,这需要更详细的研究。首先,确定每一代在水中的溶解度边界值。将树枝状化合物溶解到3mM、2mM和1mM的浓度,在不借助其它可提高溶解性的物理因素(回流,加热等)的情况下,最后一代的溶解性较好。确定所有待测树枝状化合物的初始浓度后,逐渐增大树枝状化合物的浓度,以研究它们在靶细胞阴道上皮细胞(HEC-1A)和PBMC中的细胞毒性。24小时后用台盼蓝技术计算死细胞数。
树枝状化合物的浓度为20μM时,被染成蓝色细胞数超过对照样,因此决定针对特定浓度,10μM,进行可行性研究。为了评估对细胞膜的伤害,这种伤害可使外层带有负电荷(由于各种细胞受体间的相互作用或与细胞膜带正电区域的静电作用而形成小孔),对上清液进行乳酸脱氢酶释放检测。这些研究还进行了线粒体细胞活性检测作为补充,在该检测中,因还原四唑盐产生的甲簪盐晶体是细胞代谢正常的间接反映。见图1,我们先对两类具有硅核的树枝状化合物的三代化合物进行了评估,结果显示其生物兼容性为可接受水平且始终在两项检测的可接受范围内(上清液中的LDH不超过10%,且细胞活性的下降度不超过20%)。
此实验在将与树枝状化合物接触更长时间的细胞中进行,即阴道子宫内膜上皮细胞(HEC-1A)。通过LDH检测可确定,此细胞膜在接触时间较短的情况下具有良好生存力,因为与细胞接触一小时后,树枝状化合物造成的LDH释放均不超过10%。苏拉明是一种由6个萘二磺酸基团和一个尿素核组成的分子,即使高浓度的苏拉明也未表现出毒性。处理24小时后,用葡聚糖等惰性分子处理的细胞对照的上清液中出现浓度近10%的LDH。外层具有磺酸酯基团的葡聚糖(DxS)表现出类似毒性。通过这种方式,将10%的24小时LDH浓度视为可接受值,因为外来分子的存在似乎会造成细胞内部的轻微失调。尽管第二代和第三代羧酸酯树枝状化合物未表现出明显的LDH值,但是羧酸酯和磺酸酯树枝状化合物得到相似结果。
同时通过定量测定用树枝状化合物处理24小时的HEC-1A线粒体对四唑盐(MTT)还原结果来确定细胞生存力。所得的甲簪晶体的产生水平超过80%,因此确定浓度为10μM的树枝状化合物对HEC-1A的细胞代谢具有生物兼容性。
为了扩展此研究,我们设计了一项实验来评估这些树枝状化合物在一种传染治疗模型中可能造成的细胞受损情况,以及预防PBMC (CD4+细胞)感染的可能性,其中PBMC位于阴道上皮的复层鳞状上皮中以及阴道上皮下方。
为了更好地再现生理方面的毒性,我们评估了树枝状化合物在PBMC中的毒性。在所有情况下,此处的可行性均下降,最可见的临界点在10μM的情况下变得比较可见。请参照图2。
24小时后,与对照样相比,观察到膜仍具有良好完整性。其它因素可能改变分光光度法的测量结果,由于树枝状化合物的存在所导致的生存力的略微提高是可以接受的。两项实验中均采用LDH释放阳性对照,即0.2%的Tx-100,代表0%生存力和对照。毒性从10μM开始出现,但是具有端碳酸酯基团的树枝状化合物除外。浓度为10μM时,线粒体的活性稳定。浓度为10μM时,对PBMC等生理细胞的细胞膜造成的损害较小且细胞线粒体的活性最高,所以决定选择G2SF16对上皮细胞和PBMC进行HIV病毒-细胞的粘附、内化和感染抑制试验。为了看出在有效浓度下这种树枝状化合物产生的损害,用不同浓度的树枝状化合物处理红血球。
用0.2%的Tritón X-100处理的红血球全部溶解(细胞被杀死并破裂),仅用PBS处理的阴性细胞对照中有5%发生溶解。用相对于0.2%的TritonX-100的O.D(光学密度)的百分比表示每一个孔的溶解程度,0.2%的TritonX-100的O.D被视为100%。此外还要从该百分比中减去5%,这5%代表未被树枝状化合物处理的阴性细胞对照溶解度,结果发现10μM具有良好的生物兼容性,且在光学显微镜下看不到红血球凝集。参照图3.
淋巴细胞增生
当您想了解某种新分子的生物兼容性情况时,不论它是否可能是一种非特异性抗原刺激物,了解淋巴细胞增生情况都非常重要。这会是一种不利情况,因为免疫系统细胞可能将这种分子识别为异物,从而触发很可能对生物体有害的反应。因此,为了对比此类系统与植物血凝素(PHA)之类的经典促有丝分裂刺激物对淋巴细胞的刺激能力,我们研究了不同树枝状化合物的淋巴细胞增生情况。在p96孔板中培养PBMC,并用不同刺激物处理4天。我们根据所有HIV感染实验结果,选择使用浓度为10μM的树枝状化合物。
用掺入已增殖细胞的BrdU与对照样的百分比表示实验结果。在图4A中,由于PHA的存在,由分裂中的细胞新合成的DNA中的BrdU渗入量增加。仅浓度为10mM树枝状化合物不会对PBMC产生促有丝分裂作用。同时用树枝状化合物和PHA处理,会使促有丝分裂作用稍稍下降。为了检查在丝裂原存在的情况下,树枝状化合物G2SF16是否会延迟细胞增殖,在图4B中,我们使用了事先用PHA刺激了3天的PBMC。第四天,用等量PHA、PHA和G2SF16、仅G2SF16处理细胞,结果发现经过4天处理,BrdU掺入量下降。这表明,树枝状化合物抑制了促有丝分裂刺激,对于在体内使用这类树枝状化合物的情况下进行的局部炎症研究,这是项有趣的发现。参照图4。
粘附/内化检测。
浓度为10μM的树枝状化合物在与单层上皮细胞接触时未表现出毒性或促有丝分裂能力。对于用作杀微生物剂的可能性,我们决定评估该化合物在病毒接近细胞膜表层的过程中与病毒发生相互作用的能力。在预防HIV感染子宫内膜细胞以及进入子宫腔方面,树枝状化合物分子可起到物理屏障的作用。
为了评估该化合物削弱病毒的细胞表面粘附能力以及减缓病毒在HEC-1A中的内化的能力,我们用末端单元为羧酸酯和磺酸酯基团的第二代树枝状化合物设计了一套实验。为了使此分子达到理想的局部使用效果,有必要评估感染前的处理时间(预处理)是否会限制其效力。
下图显示了对HEC-1A进行不同时长的预处理不会显著改变对HIV-1NL4.3的60%粘附抑制有效性。感染后在两个不同时间收集培养物上清液以验证此数据。预处理30分钟、1小时、2小时后,用HIV感染并培养24小时(图5A),然后收集上清液,并测定Agp24,再感染72小时(图5B),最后收集上清液,并定量测定Agp24的量。选择苏拉明作为阳性粘附抑制对照,因为这种物质与HIV gp120V3区域的静电结合已得到证明,这种结合可阻止感染机制正常运行。p24代表用ELISA试剂盒(INNOTESTTM HIV抗原mAb,)在细胞培养物上清液中检测到的p24抗原(病毒遗传材料)。参照图5。
通过以下实验定量测定先前用树枝状化合物处理的细胞内的病毒颗粒数。据发现,在3小时感染期间,用ELISA检测到的病毒数比对照细胞少70%,这使先前的数据得到进一步证实,并强化了这一理论,即,聚阴离子树枝状化合物可在病毒侵入前起到细胞屏障的作用。所有试剂均采用10μM的浓度。参照图6。
作用机理。
验证树枝状化合物在阻止病毒颗粒粘附和内化方面的效力后,我们继续尝试了解其作用机理。为此,我们设计了一套实验,该实验包括使病毒颗粒接触树枝状化合物,然后将该组合物用于受刺激PBMC培养物中(为病毒感染而制备)。我们使用HIV-1NL4.3(X4嗜性)和HIV-1BaL(R5嗜性)分析聚阴离子树枝状化合物对这两种病毒类型的gp 120V3的作用,以及使用一种不同的共受体是否可能改变抑制效力。培养4天后,用ELISA进行的p24定量测定结果表明,用10μM G2SF16树枝状化合物处理过的PBMC的上清液中的HIV感染率较低。这一结果说明,树枝状化合物可以将HIV包裹起来,或干扰HIV正常感染PBMC的能力。参照图7。
抑制检测。
为了以最佳可能方式再现阴离子树枝状化合物在子宫内膜细胞表面的作用,并研究病毒粒子穿过复层阴道上皮粘膜的通道,我们使用穿透小室装置重现转胞吞现象(通过内吞泡将大分子从细胞外空间经细胞质运输到另一空间),因为可在内侧形成完美的粘附细胞单细胞层并从单细胞层顶部和基底侧的上清液收集信息。下图显示了树枝状化合物对病毒颗粒穿过单细胞层的通道的作用。
在两种情况中,这种作用均下降40%,但作为相对数据,这说明我们的阳性对照(苏拉明)对R5-嗜性病毒没有抑制作用。因此,树枝状化合物的内部结构与分子的抗病毒能力有关(参照图8)。在HEC-1A单细胞层上,将G2SF16浓度从10μM减少到5μM,以免损伤穿透小室膜内形成的完美单细胞层。下图显示了树枝状化合物对HIV颗粒穿过单细胞层的通道的作用。在感染后24小时和48小时从基底侧区域收集上清液。
我们评估了第二代磺酸酯树枝状化合物在疾病预防和治疗方面对PBMC的可能效果,评估结果表明,在用树枝状化合物预处理细胞的试验中,此类化合物表现出80%抑制,在后处理试验中表现出60%抑制,该结果更好地从生理方面肯定了这种树枝状化合物的两种应用,因为PBMC是一种主要的淋巴细胞系。我们分别将T-20(Fuzeon)和AZT用作病毒融合抑制对照和逆转录酶对照。参照图9。G2SF16在预处理试验(先用树枝状化合物预处理再用HIV-1 NL4.3感染)中表现出80%抑制,在后处理试验中为60%抑制,这一结果更好地从生理方面肯定了这种树枝状化合物的两种应用,因为这种细胞是一种主要的淋巴细胞系并支持了这种化合物在预防HIV感染和抑制已感染HIV的细胞中病毒复制的作用。
我们对树突状细胞和巨噬细胞的病毒颗粒释放能力进行了评估。将葡聚糖、苏拉明和甘露聚糖作为树突状细胞的试验对照。将Bal和NL4.3用于在存在纳米颗粒抑制剂情况下的病毒内化试验。在存在G2SF16的情况下,巨噬细胞上清液中的p24明显减少。在未成熟树突细胞中,苏拉明、甘露聚糖和G2SF16的p24抗原减少效果较明显。参照图10,如上文所述,我们对受感染细胞的病毒颗粒释放能力进行了评估,并用50ng病毒感染细胞,以获得较好的定量测定结果。将葡聚糖、苏拉明和甘露聚糖作为树突状细胞的试验对照。
用NL4.3(黑条)和Bal(白条)检测在存在纳米颗粒抑制剂的情况下病毒的内化能力。在存在G2SF16的情况下,巨噬细胞上清液中的p24明显减少。在未成熟树突细胞中,苏拉明、甘露聚糖和G2SF16的p24抗原减少效果较明显。
我们还确定了这些树枝状化合物在存在细菌情况下的抗菌效果。我们选择金黄色葡萄球菌作为实验模型。我们在这些实验中观察到,浓度为10μM的树枝状化合物具有约50%的杀菌效果(图11)和85%的抑菌效果(图12)。我们还观察到末端为磺酸酯的树枝状化合物的杀菌能力比末端为羧酸酯的树枝状化合物类似物的更强。
另一方面,应注意到我们进行的初步实验表明,本发明所述的树枝状化合物具有抗炎作用。在存在阴离子树枝状化合物G2SF16的情况下,用TNF-luc质粒(图14)和PNF-kB-luc(图15)转染Jurkat细胞的实验结果明显表明,阴离子树枝状化合物可降低NF-kappa的转录活性,因此可抑制炎性过程。
通过点击偶联获得的阴离子树枝状化合物的生物兼容性和抑制进入作用。
我们还对末端为羧酸酯和磷酸酯基团的新型点击树枝状化合物(G2CKCOO16和G2CKP32)在最易受其影响的细胞群,子宫内膜上皮细胞中的生物兼容性。在图13A中,浓度高达10μM时细胞仍具有良好生存力,图13B表现的是在VIHNL4-3感染前一小时用树枝状化合物进行了预处理之后的抑制进入细胞的能力。这种抑制作用依赖于树枝状化合物的浓度,当浓度为10μM时得到50%抑制结果。
这些结果表明,通过基于“点击化学”方法的合成路线获得的阴离子碳硅烷树枝状化合物也表现出强大的杀微生物能力,与上文所述的磺酸酯和羧酸酯树枝状化合物相似。
如前文所述,本发明的树枝状化合物已表现出抑制病毒感染、干扰病毒进入细胞和后续步骤中的病毒复制能力。对于单纯性疱疹病毒实施例也是如此,经过修饰的聚赖氨酸树枝状化合物可在体外抑制其感染。这种树枝状化合物还可在HIV进入细胞时和在后续复制步骤中抑制HIV复制,在这种情况中,通过使用共价修饰的PAMAM树枝状化合物可干扰病毒的逆转录酶和整合酶。利用这些性质开发出的以树枝状化合物为配方基础的阴道凝胶可预防性传播疾病,如VivaGelTM(Starpharma),其活性成分为一种聚赖氨酸树枝状化合物,这种化合物用萘二磺酸酯单元进行了功能化,可以与病毒表面的糖蛋白gp120结合,因此在预防HIV感染方面表现出有效性。虽然我们在设计抗病毒树枝状化合物的基团时偏好模拟细胞表面上的基团,使树枝状化合物可以与细胞竞争病毒结合位点,但我们也设计了表面具有氨基的树枝状化合物,这类化合物可用作呼吸道合胞病毒抑制剂。我们认为,由于树枝状化合物外围基团与病毒融合蛋白之间可形成氢键,预计能够与参与细胞表面相互作用的病毒蛋白形成氢键的用基团功能化的树枝状化合物也可以与不同病毒相互作用,抑制这些病毒引起的感染。
在其它情况中,已将所述树枝状化合物用作抗菌剂,或用于破坏一些真菌的细胞壁。出于这种目的设计树枝状化合物时,我们偏向于表面具有胺或四烷基铵基等基团的阳离子树枝状化合物,这类基团有利于树枝状化合物粘附到细菌细胞膜上,导致细菌溶解。例如表面具有叔烷基基团的聚(丙烯亚胺)(PPI)树枝状化合物,此化合物表现出对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的普遍抗细菌活性,[Chen,CZ and SL Cooper,Biomaterials,2002,23,3359-68,CZ Chen et.al.,biomacromolecules,2000,1,473-80]。这些树枝状化合物比其它高度枝杈化的聚合物的抗细菌活性更强大。对于用阴离子基团功能化的树枝状化合物,我们正在研究此类树枝状化合物在细胞水平可以产生的抑制细菌和抑制真菌作用。与各种病原体结合并抑制其生长的能力可能有利于通过免疫系统的多形核细胞清除微生物。
本发明的树枝状化合物用包括羧酸酯基团和磺酸酯基团在内的阴离子残基进行了功能化,可作为微生物抑制剂的一种选择。
本发明所述的树枝状化合物是相关生物医药领域的有趣替代物,本文描述了树枝状化合物的化学性质、生物兼容性研究(针对细胞系、外周血单核细胞(PBMC)和红血球),丝裂原活性研究、针对损害HIV颗粒在细胞表面的粘附和内化能力进行的研究、以及对穿过阴道上皮单细胞层的转胞吞抑制作用的研究。除了疾病预防应用,还对治疗作用进行了评估,因为树枝状化合物可以防止感染发展到受感染者体内的健康细胞。
酚核树枝状化合物的结果
树枝状化合物的细胞毒性评估
为了对新合成的树枝状化合物的三代化合物进行完整的表征,制定了一种筛选系统来确定生物兼容浓度,该体系需要更详细的研究。
首先确定每一代树枝状化合物在水中的溶解度极限。将树枝状化合物溶解到3mM、2mM和1mM的浓度,在不借助其它可提高溶解性的物理因素(回流,加热等)的情况下,最后一代的溶解性最好。确定所有待测树枝状化合物的起始浓度后,我们继续评估它们对我们的研究中的靶细胞(阴道上皮细胞(HEC-1A)和PBMC)的细胞浓度。对不同浓度的树枝状化合物进行研究,通过台盼蓝染色评估3代树枝状化合物的生物兼容性。为了评估对细胞膜的伤害,这种伤害可使外层带有负电荷(由于各种细胞受体间的相互作用或与细胞膜带正电区域的静电作用而形成小孔),对上清液进行乳酸脱氢酶释放检测。结果发现浓度低于10μM时,树枝状化合物在淋巴细胞系(图17)或PBMC(图18)中没有毒性。
通过线粒体细胞活性检测来完善这些研究,在该检测中,因还原四唑盐产生的甲簪盐晶体是正常细胞代谢的间接反映。
对具有酚核的三代树枝状化合物进行了评估,结果显示其生物兼容性为可接受水平且始终在两项检测的可接受范围内(上清液中的LDH不超过10%,且细胞活性的下降度不超过20%)。结果表明,浓度为50μM时不会对MT-2之类的细胞系的细胞膜造成明显的伤害。
通过一项详细研究评估树枝状化合物在对PBMC代谢的影响。我们检测了第二代树枝状化合物,未发现线粒体活性显著下降(图19)。
考虑到这些结果,我们决定选择G2O3SF24来检测树枝状化合物对HIV对上皮细胞和PBMC的粘附、内化和感染能力的抑制作用。
粘附/内化检测。
浓度为10μM的树枝状化合物在与单层上皮细胞接触时为表现出毒性或促有丝分裂能力。它可以用作一种杀微生物剂,因此决定评估其在病毒粘附到细胞膜表面的过程中与病毒相互作用的能力。在抑制HIV感染子宫内膜细胞以及进入子宫腔方面,树枝状化合物分子起到一种物理屏障的作用。
为了评估树枝状化合物在损害细胞表面粘附方面的效力及减缓病毒内化到HEC-1A中的能力,我们用G2O3SF24设计了一套实验。为了使此分子达到理想的局部使用效果,有必要评估感染前(预处理)的处理时间是否会限制其效力。在不同时间进行试验,并在所有实验中确定一次1小时预处理。苏拉明是多磺酰萘酰尿素化合物,其端磺酸酯基团与G2O3SF24相同,但内部结构不同。选择这种分子作为阳性粘附抑制对照,因为这种物质与HIV的gp120V3区域的静电结合已得到证实,这种结合可阻止体外感染机制的正常运行。
抑制检测
为了以最佳可能方式再现阴离子树枝状化合物在子宫内膜细胞上的作用,并研究病毒粒子穿过复层阴道上皮粘膜的通道,我们使用穿透小室装置重现转胞吞现象(通过内吞泡将大分子从细胞外空间经细胞质运输到另一空间),因为可在内侧形成完美的粘附细胞单细胞层并从单细胞层的顶部和基底侧的上清液收集信息。图20显示了树枝状化合物对病毒颗粒穿过单细胞层的通道的作用。这种作用减少了40%,而我们的阳性对照缺乏抑制作用。因此,树枝状化合物的内部结构与分子的抗病毒能力有关。
对第二代磺酸酯树枝状化合物在PBMC中的可能的疾病预防和治疗作用进行了评估结果表明,在用树枝状化合物预处理细胞的试验中,此类化合物表现出60%抑制,这一结果更好地肯定了这种树枝状化合物在一种作为主要淋巴细胞系的更为生理化的系统中的两种应用,见图21。
目前正在评估此类化合物对树突状细胞和巨噬细胞的作用,因为与淋巴细胞实验相比,这些细胞系不太容易受到感染,在不同细胞群中下降50%至70%的结果与和这些细胞接触的病毒的有效性有关。见图22。
抗细菌和抗真菌应用检测
在存在细菌的情况下评估这些树枝状化合物的抗细菌和抗真菌作用。分别选择金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为细菌和真菌检验的模型。在这些实验中观察到,所用浓度为10μM时,树枝状化合物具有40%杀细菌和90%细菌抑制作用,参照图23-24。所用浓度下未表现出杀真菌和真菌抑制作用,参照图25-26。
Claims (38)
2.根据权利要求1所述的树枝状化合物,其中核为硅或多酚。
3.根据权利要求2所述的树枝状化合物,其中多酚核为1,3,5-三羟基苯。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的树枝状化合物,其中p为1。
5.根据权利要求1至4中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R为甲基。
6.根据权利要求1至5中的任意一项所述的树枝状化合物,其中E选自烷基(C1-C10)或基团-(CH2)x-R3,其中R3为一种三唑或酚盐基团,x为1至6之间的一个整数。
7.根据权利要求6所述的树枝状化合物,其中E的烷基基团为丙基。
8.根据权利要求1至7中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R2为氢原子或甲基。
9.根据权利要求1至8中的任意一项所述的树枝状化合物,其中E为基团-(CH2)x-R3,R3为三唑,x的定义如权利要求6所述。
10.根据权利要求9所述的树枝状化合物,其中x为4。
11.根据权利要求1至10中的任意一项所述的树枝状化合物,其中E为基团-(CH2)x-R3,R3为酚盐,x的定义如权利要求6所述。
12.根据权利要求11所述的树枝状化合物,其中x为1。
13.根据权利要求1至12中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R1为基团–COOR2。
14.根据权利要求1至12中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R1为基团–SO3R2。
15.根据权利要求1至12中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R1为基团-PO3(R2)2。
16.根据权利要求1至14中的任意一项所述的树枝状化合物,其中z为2。
17.根据权利要求15所述的树枝状化合物,其中z为1。
18.根据权利要求1至17中的任意一项所述的树枝状化合物,其中所述树枝状化合物为一种阴离子盐。
19.根据权利要求18所述的树枝状化合物,其中所述的盐为Na+。
24.根据权利要求20至23中的任意一项所述的树枝状化合物,其中Ra、Rb、Rc和Rd为相同或不同基团,代表一种烷基(C2-C4)。
25.根据权利要求20至24中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R″、R″′或RIV为甲基。
26.一种如下结构式代表的化合物:
Et3-R
其中:Et为一个乙基,且
R为权利要求1至19的任意一项所述的结构式(I)的端基,基团-Si(R’)3-p[(CH2)4-N3]p,或基团-Si(R’)3-p[E-NH2]p,其中R'为烷基(C1-C4),p的值介于1至3之间,E为上述权利说明中所述的一种结合基团。
27.碳硅烷树枝状化合物,其包含:
一个多官能核和
一个外层,其全部或部分存在于基团-Si(R’)3-p[(CH2)4-N3]p,或基团-Si(R')3-p[E-NH2]p的相同或不同单元中;其中R'为烷基(C1-C4),p的值介于1至3之间,E为上述权利说明中所述的一种结合基团。
28.根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求25所述的树枝状化合物,其中p为1。
29.根据权利要求24或26中的任意一项所述的化合物或根据权利要求25或26中的任意一项所述的树枝状化合物,其中R'为甲基。
30.根据权利要求24或26至27中任意一项所述的化合物或根据权利要求25至27中的任意一项所述的树枝状化合物,其中E为基团-(CH2)x-R3,R3为三唑,x的定义如权利要求6所述,x优选为4。
31.根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物的制备方法,其包含:
一种含多价核和端-NH2基团的树枝状化合物与一种含磺酸酯或羧酸酯基团的烯烃发生的Michael型加成反应或者一种含多价核和端-NH2基团的树枝状化合物与甲醛和磷酸二甲酯发生的两步反应。
32.根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物的制备方法,其包含:
一种含端-Si-H基团的树枝状化合物与一种用羧酸基团、磷酸基团或磺酸基团进行了功能化的烯丙基胺的衍生物发生的硅氢加成反应。
33.根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物在制备一种药剂中的用途。
34.根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物在制备一种用于预防和/或治疗病毒、细菌或真菌所致疾病的药剂中的用途。
35.根据权利要求34所述的用途,其中所述疾病由HIV引起。
36.一种药物组合物,其包含至少一种根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物和一种药学上可接受的载体。
37.根据权利要求36所述的药物组合物,还包含另一种试剂(有效成分)。
38.根据权利要求1至25中的任意一项所述的树枝状化合物作为分子运输载体的用途。
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