CN102590525A - 分子结构和功能的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述测量细胞膜或脂双层的转运性质的方法，包括至少提供具有顶面和背面和多个纳米孔或微孔的基底和从细胞膜的两面均可进入以供测量的覆盖所述多个孔隙的细胞膜、位于基底顶面或背面上的至少在孔隙区域中的材料层以在孔隙处支承该细胞膜但不阻碍穿过该细胞膜和孔隙转运，将含有至少一种分子的流体施加至该膜的顶面以使该分子或离子穿过该膜、孔隙之一和该材料层移动；和使用光学检测法监测已穿过该材料层的分子。本发明能够监测长效被动扩散过程或对功能膜转运蛋白的动力学和毒理学研究。

Description

分子结构和功能的测定方法
本发明涉及测量跨过细胞膜或脂双层(lipid bilayer)的转运过程的方法，其至少包含具有顶面和背面和多个纳米孔或微孔的基底和从细胞膜的两面均可进入的覆盖所述多个孔的细胞膜。
多种重要的生物反应，如能量转换、储存、免疫反应和信号传递在细胞膜处发生并通过膜蛋白进行。另一方面，药物透过膜本身的渗透性是制药工业中的重要问题，因为许多药物必须渗透该膜才能到达它们在细胞内的靶。但是，研究这些膜蛋白（全细胞膜片钳法(whole cell patch-clamp methods)）和膜渗透性（Caco-2或PAMPA渗透性检测法）的传统方法具有许多缺点，这使它们作为药物筛选法的标准工具的应用复杂化。
芯片可用于监测膜转运过程，尤其是跨过生物膜的药物渗透或跨过含离子通道的膜的离子转运。这种芯片从WO 2005/064342中获知，其详细描述了这种芯片的使用背景和益处。其还描述了作为生物有效层的膜，其是细胞膜或脂双层，以及该芯片的功能和结构。
一类重要的膜蛋白是G-蛋白偶联受体（GPCR），其构成细胞膜受体的最大亚类。这些受体的大约一半被视为药物的靶。GPCR充当从细胞外部向内部传送信号（如光子、气味剂、激素和神经递质）的信号转导蛋白，其中通过相应的G-蛋白引发各种类型的反应级联。G-蛋白共价锚定到脂双层且目前根据α-亚基的性质分成四族，它们与不同的靶膜蛋白（target membrane proteins），如酶或离子通道相互作用。在G-蛋白离解后，α-亚基在脂双层内侧向扩散，键合到靶蛋白上并激活该靶蛋白。在下面略述的体外检测系统的几乎所有情况下，组成未知的生物膜固定在固体载体上，这通常造成脂双层的有限流动性和膜蛋白的结构扰动（structural disturbance）。因此，在大量药物筛选活动中非常不希望遇到这些情况，因为在检测过程中，可能极大干扰蛋白质的天然功能。
第二类重要的膜蛋白是离子通道。这些电压-或配体-门控的通道以下述事实为特征：它们将沿它们的电化学梯度向下（down to their electrochemical gradient）跨膜传送大量离子（达到108个离子/秒）。这通过这些蛋白质的构象变化实现，其可以在数毫秒内打开和关闭它们的通道结构。许多已知疾病，如心力衰竭，与特定离子通道的功能障碍相关联，这因此也被踊跃研究。对离子通道的功能和结构研究的选择方法是膜片钳技术。这种技术由通过在膜各侧上放置电极来利用这些蛋白质的高离子转运速率的电化学测量构成。通过使用该提出的高度复杂的检测系统，实现对相关膜蛋白的功能的更深入洞悉。学术研究和药物发现都获益于这种认识。
第三类重要的膜蛋白是转运蛋白。与离子通道相反，它们能在能量消耗下逆着电化学梯度跨过生物膜主动转运离子或其它分子。但是，与离子通道相比，这些蛋白质的转运速度（速率）远低于离子通道（转运蛋白(transporter)最多104 /秒 vs. 通道108 /秒），使得主动转运蛋白不适合电化学测量。
除蛋白质介导的信号转导和转运过程外，另一可能是分子有可能穿过脂双层：简单（被动）扩散。这一方面对必须以高速率穿过膜但由于小且溶剂化差而可以独力完成这一点的分子如O2和CO2而言是重要的，另一方面对不存在特异性载体以促进细胞渗透的许多药物是重要的。药物通过穿透肠内侧（lining）的细胞而吸收到血流中的能力因此代表制药公司的药物剖析法（drug profiling process）中的重要参数。由于大部分药物（>80%）通过被动扩散穿过肠上皮来进入血流，预测口服药物的被动渗透的检测法变得越来越重要。
通常通过经UV-分光光度检测或在这些化合物不吸收紫外线的情况下经LC-MS（液相色谱-质谱法）分析测量各化合物的浓度来进行药物候选物的被动扩散的测定。对UV-分光光度分析而言，上文提到的人工膜检测和Caco-2细胞基检测都没有提供在线测定浓度的可能性，因为浸渍的过滤器在光学上不适合透射测量。任选地，也可以使用任何其它不常见的已知测定方法。
上文提到的现有技术芯片用于穿过膜孔的电化学测量。被动扩散法尤其需要在多个小时的总测量期间稳定的膜。已知的膜在孔区域中缺乏充足的稳定性，这以不合意的方式影响测量结果。基底至少包含氮化硅表面。
因此，本发明的目的是提供在用于生物传感器和药物筛选应用的芯片基膜系统中的改进的光学测量方法，其适用于工业生产和通用用途。
通过如权利要求1中所述的方法解决该问题。在从属权利要求中要求保护进一步有利的实施方案。
根据本发明，该方法包括
提供至少具有具有顶面和背面和至少一个纳米孔或微孔的基底和覆盖所述至少一个孔的膜的芯片；
至少在所述至少一个孔的区域中提供材料层以在所述至少一个孔处支承该膜以允许穿过该膜和该孔转运；
将含有至少一种分子或离子的流体施加至该膜的顶面以使该分子或离子穿过该膜、所述至少一个孔和该材料层移动；和
使用光学检测监测已穿过该膜、所述至少一个孔和该材料层的分子或离子。该纳米孔基底可能由含硅和碳的材料制成，但也可以由聚合物、金属、电介质、玻璃或陶瓷制成。至少在所述至少一个孔的区域中提供该材料层以在所述至少一个孔处支承和稳定该膜，但不阻碍穿过该膜和该孔转运。该材料层通常置于基底的背面或顶面上。在基底背面上提供材料层在制造过程中具有一些优点，但是，也可以提供具有在基底顶面上的该材料层的工作芯片。通过监测分子，检测施加至膜顶面并到达背面的流体中的分子浓度。通常，光学检测提供候选物是否能穿过该膜的信息和相应的动力学数据。尤其可通过光谱学方法，尤其通过UV/VIS吸收或荧光光谱学进行光学检测。对后者而言，受分析的分子可以是自体荧光或带有特异性荧光标记。测得的荧光信号也可能受跨膜分子的转运影响（放大或淬灭）。特别有意义的是候选物穿过该膜所需的时间。根据机制（被动扩散、离子通道或主动转运蛋白），穿过时间在宽范围内变动。由于该稳定的材料层，本发明的方法能够实时测量可能花费例如48小时或更久的长效扩散过程。
该方法提供所述材料层，其由充分支承细胞膜但足够多孔以便允许穿过该细胞膜的物质也能穿过该材料层的任何种类的多孔材料制成。本领域技术人员已知的具有这种特征的所有材料，优选例如聚合物、凝胶或多孔疏松材料（ porous bulk material），都适合在孔区域中支承和稳定该膜。该聚合物材料层可包括不带电的聚合物，如藻酸盐，或带电聚合物，如聚合电解质多层（PEM）。后者可通过逐层法（layer-by-layer method）用不同的聚合电解质制造。例如，聚合电解质可选自聚醚酰亚胺（PEI）、聚烯丙胺（PAH）、聚谷氨酸（polyglutamatacid，PGA）或聚苯乙烯磺酸钠（polystyrolsulfonat，PSS）。重要的是，PEM膜通过将该PEM用于融合或通过利用芯片的SiN表面来促进脂双层形成。在后一情况下，PEM应不干扰SiN囊泡相互作用。此外，PEM膜必须是离子可穿透的并且不干扰通道转运测量，也与离子通道相容。
该聚合物优选是用公知的逐层法制造的聚合电解质或亲水聚合物；该凝胶是水凝胶，该疏松材料是微米-/纳米-多孔硅或金属或陶瓷。
该材料层有利地通过公知的旋涂或喷涂技术沉积或是烧结层。
根据一个优选实施方案，该方法提供被带有所述材料层的所述纳米孔芯片隔开的两个隔室，优选为微量滴定板格式的孔，其在水平（在一个孔内）或垂直（在两个孔之间）方向，在后一情况下能通过UV/VIS吸收或荧光光谱法直接测量化合物浓度并因此也能在线测定动力学数据。具有分子的流体经过孔从一个隔室移动到另一隔室。通过用转运分子进行荧光光谱法，另一隔室中的荧光受到影响，通过引发荧光而提高或通过淬灭该隔室中现有的荧光而降低。
本发明能够监测长效被动扩散过程或对功能膜转运蛋白的动力学和毒理学研究。因此，就响应要筛选的潜在药物化合物的膜蛋白的完整功能性而言，本发明的方法可用于药物发现法（drug discovery process）。本发明适用于如上提到的所有种类的膜蛋白。
下面联系附图联系优选实施方案详细描述本发明。本发明的单个特征可以单独实现或与说明书或权利要求的其它特征联合实现。附图示意性描绘了
在图1中描绘了在基底背面上带有材料层的通过本发明的方法提供的芯片的横截面视图，
在图2中描绘了在基底顶面上带有材料层的通过本发明的方法提供的芯片的横截面视图，且
在图3中描绘了使用两个隔室和UV分光光度法的本发明的一个实施方案的示意图。
这些图显示具有基底2的芯片1，该基底2具有孔3。芯片1包含多个这样的孔3，并在根据WO 2005/064342的一个实施方案中包含100平方毫米总面积的可由含硅和碳的材料也可由聚合物、金属、电介质、玻璃或陶瓷制成的阵列基底(array substrate)。合适的据此是指该载体材料的性质允许膜4与基底的粘合。例如400 x 400 μm的孔阵列段（pore array section）包含直径为50至2000 纳米的孔。选择孔3相互之间的距离（间距）以在它们直径的范围内。这确保膜蛋白和要筛选的化合物的相当高的分子密度，也彻底减少了膜蛋白和要筛选的化合物的量。
在图1中，膜4直接粘附到基底2的顶面上。膜4也是从WO 2005/064342中公知的，分子5示例性穿过膜4和孔3。在基底2背面上是通过公知沉积技术沉积的材料层6，其覆盖背面并在孔3（和所有其它孔）中穿透以在孔3的区域中支承和稳定膜4。材料层6是充分支承细胞膜4但足够多孔以便允许穿过细胞膜4的物质也能穿过材料层6的任何种类的多孔材料。在该情况中，其是由PSS/PAH制成的PEM。这一对促进囊泡融合。但是，其它配对也可行。
图2显示置于基底2与膜4之间的材料层6。在这些图的这两种实施方案中，在施加膜4之前在基底2上沉积材料层6。
图3以示意性方式描绘纳米孔芯片1，其在壁7中分离两个隔室A和B，优选为微量滴定板格式的孔，以水平（在一个孔内）或垂直（在两个孔之间）方向分离，在后一情况下能通过UV分光光度法直接测量化合物浓度并因此也能在线测定动力学数据。隔室A中的流体8中分子5的浓度开始时高于隔室B中的浓度。在这两个隔室中的被动扩散程序结束时，理想地，浓度相同。通过监测动力学数据，测定渗透系数。

Claims (10)

1.测量细胞膜或脂双层的转运性质的方法，包括
提供芯片（1），其至少具有具有顶面和背面和至少一个纳米孔或微孔（3）的基底（2）和覆盖所述至少一个孔（3）的膜（4）；
至少在所述至少一个孔（3）的区域中提供材料层（6）以在所述至少一个孔（3）处支承该膜（4）以允许穿过该膜（4）和所述至少一个孔（3）转运；
将含有至少一种分子（5）或离子的流体（8）施加至该膜（4）的顶面以使该分子（5）或离子穿过该膜（4）、至少一个孔（3）和该材料层（6）移动；和
通过使用光学检测法监测已穿过该材料层（6）的该分子（5）或离子。
2.权利要求1的方法，其特征在于通过UV/VIS吸收或荧光光谱学进行光学检测。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于提供材料层（6），其由充分支承该膜（4）但足够多孔以允许穿过该膜（4）的物质也穿过该材料层（6）的任何种类的多孔材料，如聚合物、凝胶或多孔疏松材料制成。
4.权利要求3的方法，其特征在于该聚合物是聚合电解质或亲水聚合物。
5.权利要求3的方法，其特征在于该凝胶是水凝胶。
6.权利要求3的方法，其特征在于该疏松材料是微米-/纳米-多孔硅或金属或陶瓷。
7.前述权利要求任一项的方法，其特征在于通过旋涂或喷涂沉积该材料层（6）。
8.前述权利要求1至6任一项的方法，其特征在于通过烧结制造该材料层（6）。
9.前述权利要求任一项的方法，其特征在于提供被该芯片（1）隔开的两个隔室（A，B）以直接测量一个隔室（B）中的化合物浓度、用于研究或宏观检测所述两个隔室（A，B）之间的分子过程（molecular processes）。
10.前述权利要求任一项的方法，其特征在于在短和长持续时间内光学实时测量穿过该芯片（1）的分子（5）或离子。
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