EP1244630A1 - Amphiphile chinolylpolyamine als transfermittel für biologisch aktive makromoleküle - Google Patents

Amphiphile chinolylpolyamine als transfermittel für biologisch aktive makromoleküle

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EP1244630A1
EP1244630A1 EP00993406A EP00993406A EP1244630A1 EP 1244630 A1 EP1244630 A1 EP 1244630A1 EP 00993406 A EP00993406 A EP 00993406A EP 00993406 A EP00993406 A EP 00993406A EP 1244630 A1 EP1244630 A1 EP 1244630A1
Authority
EP
European Patent Office
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group
alkyl
biologically active
reagent
radical
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00993406A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver Keil
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Got Gesellschaft fur Therapieoptimierung und Targeting Entwicklungs Mbh
Original Assignee
Got Gesellschaft fur Therapieoptimierung und Targeting Entwicklungs Mbh
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Publication date
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Publication of EP1244630A1 publication Critical patent/EP1244630A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
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    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • C07D215/42—Nitrogen atoms attached in position 4
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    • C07J—STEROIDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • Amphiphilic polyamines their applications and processes for their synthesis
  • the present invention relates to amphiphilic polyamines and their salts which are able to introduce biologically active macromolecules (in particular DNA and RNA) into eukaryotic cells.
  • Retroviruses also have the disadvantage that they integrate non-specifically stably into the host genome and can therefore trigger potentially malignant mutations. Because of these properties, it is understandable that these methods have extremely high security requirements and can only be carried out with great financial outlay. Biophysical methods such as the bombardment of cells with DNA-loaded gold particles (“biolistics”) or electroporation are also only applicable ex vivo for obvious reasons.
  • cationic lipids such as DOTMA or DLRIE
  • DOTMA or DLRIE lipopolyamine derivatives
  • the previously known cationic amphiphiles have no functionalities which have a sufficient buffer capacity at a physiological pH (approx. PH 7.4) to prevent the acidification of the endocytotic vesicles.
  • a disadvantage of the production of the lipopolyamine compounds is that they are multifunctional molecules in which the functionalities hardly differ in their chemical reactivity. Therefore, they have to be synthesized in a multistage process using orthogonal protecting group strategies.
  • the activity of many previously known cationic lipids is inhibited by the presence of even small amounts (> 5%) of serum in the surrounding medium.
  • the invention was therefore based on the object of providing new amphiphilic polyamines for the transfer of biopolymers (in particular of DNA and RNA) into eukaryotic cells which are • easily metabolizable and have low cell toxicity,
  • R] to R independently of one another are a radical hydrogen, halogen, -C ⁇ N, -NO2, -SO3H,
  • R7 represents a hydrogen radical or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, m and k independently of one another are an integer from 1 to 6, n is an integer from 1 to 3,
  • A means a group N + RgR RioY " , where Rg to RJQ independently one
  • R ⁇ has the meaning given for R7 and r can be an integer from 1 to 6,
  • Z is a steroid bound via the C atom 3 (of the sterane backbone), a radical R12 or a group
  • R12 is a saturated or unsaturated alkyl or acyl radical having 8 to 24 carbon atoms and E is a group O-R13 or CH2-O-R13, in which R13 is the for R j 2 has the meaning given and can be identical or different from Rj 2, and wherein the nitrogen atom of the quinoline skeleton can additionally be protonated by an acid H + V, where Y "is a pharmaceutically acceptable anion.
  • R, R, R4, R and R7 represent a hydrogen atom
  • R5 is hydrogen or an alkyl radical
  • R3 is a halogen atom, in particular chlorine.
  • m and k are 1 to 3
  • n is one and A is a dimethylammonium or diethylammonium group.
  • B is a group O
  • ⁇ represents and Z represents a membrane-associated steroid or a 1,2-diglyceride-like residue.
  • Molecules in which Z denotes a cholesteryl radical or a 1,2-dioleoyloxyethyl radical and in which the pharmaceutically acceptable anion Y- is halide, acetate or phosphate are very particularly preferred.
  • the lipids according to the invention are used in a mixture with other lipids already known to the person skilled in the art, such as phospholipids, in particular DOPE, or with membrane-associated steroids, in particular cholesterol, for introducing biologically active biomolecules, in particular DNA and RNA.
  • the lipids can be present in an aqueous (liposomal) dispersion or as a solution in water-miscible solvents, and the DNA (RNA) can be precomplexed with polycations, in particular with protamine sulfate.
  • RNA DNA
  • the former functionality is thus almost completely protonated at a physiological pH of 7.4 and therefore forms strong electrostatic interactions with negatively charged biomolecules.
  • the positive charge is almost independent of the pH of the environment.
  • the quinoline base is deprotonated at a pH of 7.4 to about 20% and is therefore very well suited to buffer the falling pH after absorption in the endosomes.
  • Another important advantage is that some quinoline bases are able to inhibit vacuolar (H + ) - ATPases.
  • the compounds on which the invention is based can additionally also prevent the acidification of the endosomes and thus the transport of the aggregates into the lysosomes and their degradation. Due to the aromatic nature of the quinoline structure, ⁇ -electron interactions with the nucleotide bases of DNA or RNA are also possible - an additional advantage over the previously known reagents in terms of complex formation.
  • the transfection reagents used to date have no strong chromophores and are therefore very difficult to detect in HPLC-based analysis and purification processes by means of UV detection. Because of the strong UV absorption of the quinoline scaffold in the wavelength range of 200-3 OOnm, the compounds according to the invention are easily detectable and thus also offer decisive advantages in analysis and drug-compatible preparation.
  • the compounds are prepared in a few steps from inexpensive starting chemicals using the methods familiar to those skilled in the art [Methods of Organic Chemistry (Houben-Weyl) 4th ed. Thieme Verlag (Stuttgart) 1952; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, John-Wiley & Sons, Inc, Vol.32 part I (1977)].
  • the corresponding reaction schemes are shown in Fig. 1-4.
  • the transfection and cell-toxic properties of the lipids according to the invention were tested on various tumor cell lines and compared with those of previously known reagents (FIGS. 5 and 6).
  • GFP or ⁇ -galactosidase coding plasmids served as reporter systems.
  • the lipids # 2, # 7, # 9 were mixed with the phospholipid l, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE). Aqueous liposomal formulations as well as ethanolic solutions of the lipids proved equally suitable for the transfections. With lipids # 2, # 7 and # 9 it is possible to transfect all investigated cell lines with greater efficiency than with the known lipids Transfectam®, Lipofectamine TM and DC-Chol.
  • the cell-toxic properties of the lipids according to the invention (FIG. 7) and the insensitivity of the reagents to high serum fractions in the cell culture medium (FIG. 8) are also surprisingly favorable.
  • connection can be used to represent # 7 without further purification.
  • Analytically pure substance is obtained by preparative column chromatography on silica gel 60 (70-230 mesh) (eluent: step gradient consisting of CH 2 Cl 2 / MeOH 3: 1 (0.1% triethylamine) on CH 2 Cl 2 / MeOH 1: 3 (0.1% triethylamine )).
  • Solutions of the amphiphiles # 2, # 3, # 7, # 9 in chloroform are mixed with a solution of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) in chlorine form in various molar percentages and in vacuo to a lipid film dried. 5 The last solvent residues are removed in a high vacuum. The lipid films are then rehydrated in sterile water and the liposomes are generated by ultrasound treatment. The total lipid concentration of the resulting dispersion is 1 mg / ml.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the cationic lipids are mixed in different mole percentages with DOPE and dissolved in anhydrous ethanol.
  • the total lipid concentration of the resulting solution is 1 mg / ml.
  • aqueous liposome dispersion 30 On the day before the transfection, 40-50000 cells (approx. 70% confluence) are sown per well of a 24-well cell culture plate. For transfection, 2 ⁇ g of the plasmid (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories, Inc; catalog no. 6085-1) are placed in 300 ⁇ l FCS-free medium, with 3 ⁇ l (SKBR3, MCF-7, Hey) or 6 ⁇ l ( HeLa, Hecla, SKOV3) of the aqueous lipid reagent (30 mol% lipid # 2 or # 7 or # 9; 70 mol% DOPE) were added and the mixture was incubated at RT for 30 min.
  • the medium is removed shortly before the transfection and replaced by 700 ⁇ l fresh medium (14.3% FCS).
  • 700 ⁇ l fresh medium 14.3% FCS.
  • the mixture is incubated for 48 hours and then the proportion of the GFP-expressing, fluorescent cells is determined by FACS analysis.
  • the cells are washed with PBS and trypsinized.
  • the cells are transferred to an Eppendorf reaction vessel and centrifuged.
  • the cell pellet is then taken up in 500 ⁇ l PBS and the proportion of fluorescent cells is determined on a FACS device (Becton Dickinson, FACScan).
  • lacZ was excised from the commercially available vector pSVbetaGal (Promega; cat. no. E1081) using the restriction enzymes Hindill and Xbal and cloned into the expression plasmid pRc / CMV (Invitrogen; Hindlll and Xbal).
  • the day before the transfection 12-15000 cells are sown per well of a 96-well cell culture latte. Shortly before the transfection, the medium is replaced by 80 ⁇ l / well fresh medium (20%> FCS). To investigate the inhibition of transfection efficiency by FCS (Fig. 8) medium with a share of 20-100%) FCS is presented. Then 80 ⁇ l of the lipid-DNA complex, made from 0.5-1 ⁇ g DNA in 40 ⁇ l
  • FCS-free medium 0.5-2 ⁇ l of the aqueous lipid dispersion (20-60 mol% lipid # 2 or
  • the simultaneous determination of reporter gene expression and cell vitality is carried out using a method known from the literature [D. Groth, O. Keil et al .; Anal. Biochem. 258 (1998) 141-143] and provides the total beta-galactosidase expression in mU / well and the cell vitality in percent relative to untreated cells.

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Abstract

The invention relates to amphiphilc amines and the salts thereof, which may complex with biopolymers such as DNA, RNA, anti-sense oligonucleotides, ribozymes, proteins and peptides and transfer them into eucaryotic cells. Polyaminochinoline derivatives, which are modified with lipophilic groups are a particularly suited substance class. According to the invention, due to the property of forming aggregates with biologically active molecules such as, for example, DNA or RNA, said compounds are particularly suitable for use in gene therapy and, equally, for diagnostic purposes.

Description

Amphiphile Polyamine, deren Anwendungen und Verfahren zu ihrer Synthese
Die vorliegende Erfindung betrifft amphiphile Polyamine und deren Salze, die in der Lage sind biologisch aktive Makromoleküle (insbesondere DNA und RNA) in eukaryotische Zellen einzuschleusen.
In den letzten 10 Jahren hat sich der Transfer von Biopolymeren, insbesondere von DNA, RNA und Oligonukleotiden, in eukaryotische Zellen zu einem fundamentalen Arbeitsgebiet in der Molekularbiologie und der molekularen Medizin entwickelt[P.A. Martin, S.M. Thomas; Human Gene Therapy 9 (1998) 87-1 14]. Hierbei sind vor allem gentherapeutische Ansätze, aber auch diagnostische Methoden von besonderem Interesse. Heute bereits teilweise etablierte Verfahren zur Einbringung von DNA in eukaryotische Zellen beruhen darauf, die betreffende DNA-Sequenz mit Hilfe von replikationsdefizienten, rekombinanten Retro-, Adeno- oder adenoassoziierten Viren einzuschleusen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß sie bislang nahezu ausschließlich auf ex vivo Anwendungen beschränkt sind, da die viralen Proteine mitunter zu heftigen Immunreaktionen fuhren und replikationskompetente Viren nicht immer ausgeschlossen werden können. Retroviren weisen zudem den Nachteil auf, daß sie unspezifisch stabil in das Wirtsgenom integrieren und somit potentiell maligne Mutationen auslösen können. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es verständlich, daß diese Verfahren extrem hohe Sicherheitsanforderungen stellen und sich nur mit großem finanziellen Aufwand ausführen lassen. Biophysikalische Methoden wie zum Beispiel der Beschüß von Zellen mit DNA-beladenen Goldpartikeln („Biolistik") oder die Elektroporation sind aus offensichtlichen Gründen ebenfalls nur ex vivo anwendbar. Die seit langem bekannte Calciumphosphat-Copräzipitation und die DEAE-Dextran Methode erscheinen wegen ihrer geringen Effizienz als wenig geeignet. Eine weiteres in den letzten Jahren entwickeltes Verfahren zur Einschleusung von biologisch aktiven Makromolekülen in eukaryotische Zellen verwendet kationische Polymere wie Poly- L-lysin, Polyethylenimin oder PAMAM-Dendrimere. Polyanionen wie DNA, RNA oder Oligonukleotide bilden mit diesen über elektrostatische Wechselwirkungen Aggregate und werden in dieser Form von den Zellen vermutlich über Endocytose aufgenommen. Poly-L-lysin muß jedoch zuvor durch chemische Reaktion mit Rezeptorliganden (z.B. Transferrin, Glycoproteine)[E. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 3410- 3414] oder endosomolytischen Peptiden [E. Wagner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 7934-7938] modifiziert werden um eine hinreichende Effizienz aufzuweisen. Deshalb und aufgrund ihres polymeren Charakters sind Verbindungen dieses Typs sehr heterogen zusammengesetzte Substanzgemische und lassen sich daher nur mit großem Aufwand in definierter Form produzieren.
Ein weiteres Verfahren, welches in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen hat, basiert auf den grundlegenden Arbeiten von Feigner et al.. Dabei werden aus kationischen, lipidischen Amphiphilen, pur oder in Mischung mit neutralen Phospholipiden wie Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), liposomale oder auch micellare Strukturen generiert. Diese bilden aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen mit anionischen Biopolymeren (wie DNA oder RNA) Aggregate, welche daraufhin effizient von eukaryotischen Zellen aufgenommen werden. DNA kann so in den Zellkern transportiert werden und fuhrt dann zur Expression des entsprechenden Proteins. Obgleich der Mechanismus hierfür bislang noch nicht aufgeklärt ist, herrscht doch inzwischen Einigkeit darüber, daß die Aggregate durch endocytotische Prozesse über Endosomen in das Zellinnere gelangen. Auch ist bekannt, daß der pH- Wert innerhalb der Endosomen, bedingt durch sog. vacuoläre H+- ATPasen, im zeitlichen Verlauf auf ca. pH 5-6 absinkt. Es gibt Hinweise darauf, daß diese Erhöhung der Protonenkonzentration für die anschließende Verschmelzung der Endosomen mit Lysosomen verantwortlich ist [A.K. Fok et al., Eur. J. Cell Biol. 43(3) (1987) 412-420]. Damit die internalisierten Biopolymere in andere Zellkompartimente (z.B. Cytoplasma oder Zellkern) gelangen können, müssen sie aus den Endosomen ausbrechen, da sie anderweitig in den Lysosomen enzymatisch abgebaut werden. Dieses wird in den meisten Fällen durch die Zumischung des Phospholipids DOPE erreicht, welches aufgrund seiner konischen Form in der Lage ist, invertierte hexagonale flüssigkristalline Phasen zu induzieren [J.O. Rädler et al., Science 281 (1998) 78-81]. Diese weisen eine hohe Tendenz zur Verschmelzung mit Doppelschichtstrukturen (z.B. biologische Membranen) auf. Aus den oben genannten Gründen ist es auch von entscheidender Bedeutung, die endosomale Acidifizierung zu verhindern, um ein Verschmelzen der Endosomen mit den Lysosomen hinauszuzögern. Dieser Sachverhalt wird auch dadurch bestätigt, daß ein 10-100 μM Zusatz von Chloroquin - einer schwachen Base - im Zellkulturmedium die Effizienz der kationischen Amphiphile signifikant steigert [P.L. Feigner et al., J. Biol. Chem. 269(4) (1994) 2550-2561; A.K. Tanswell et al. Am. J. Physiol. 275 (3 Pt 1) (1998) L452-L460]. Die Zugabe von schwachen, puffernden Basen sorgt auch dafür, daß die Aktivität der lysosomalen, abbauenden Enzyme, welche ein pH-Optimum im sauren pH-Bereich aufweisen, stark herabgesetzt wird. Nachteiligerweise läßt sich dieser Effekt jedoch nicht in vivo anwenden. Seit der erstmaligen Beschreibung durch Feigner ist eine Vielzahl, zumeist empirisch gefundener, kationischer Amphiphile für den Transfer von anionischen Makromolekülen wie z.B. DNA synthetisiert worden [A.D. Miller, Angew. Chem. 110 (1998) 1862-1880; L. Huang, X. Gao; Gene Therapy 2 (1995) 710-722]. Viele dieser kationischen Lipide, wie z.B. DOTMA oder DLRIE, haben den Nachteil, daß sie nur schwer metabolisierbar sind und daher deutliche zelltoxische Eigenschaften aufzeigen. Mit Ausnahme der Lipopolyaminderivate (Lipospermine u.a.) [Blagbrough et al., Chem. Commun. 13 (1998) 1403 -1404] weisen die bislang bekannten kationischen Amphiphile keine Funktionalitäten auf, die bei einem physiologischen pH-Wert (ca. pH 7.4) eine hinreichende Pufferkapazität besitzen, um die Acidifizierung der endocytotischen Vesikel zu verhindern. Nachteilig bei der Herstellung der Lipopolyamin- Verbindungen ist, daß es sich um multifunktionelle Moleküle handelt, bei denen sich die Funktionalitäten kaum in ihrer chemischen Reaktivität unterscheiden. Sie müssen daher unter Verwendung orthogonaler Schutzgruppenstrategien aufwendig in vielstufigen Verfahren synthetisiert werden. Außerdem wird die Aktivität vieler bislang bekannter kationischer Lipide durch die Anwesenheit schon geringer Anteile (>5%) an Serum im umgebenden Medium inhibiert.
Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, neue amphiphile Polyamine für den Transfer von Biopolymeren (insbesondere von DNA und RNA) in eukaryotische Zellen zur Verfügung zu stellen, die • leicht metabolisierbar sind und eine geringe Zelltoxizität aufweisen,
• die auch in Gegenwart hoher Serumanteile eine hohe Transfer-Effizienz zeigen,
• die leicht und kostengünstig in großen Mengen produziert werden koennen
• und die in einem Molekül sowohl Funktionalitäten für eine effiziente Komplexierung anionischer Makromoleküle als auch solche, die bei physiologischen pH-Werten eine sehr gute Pufferkapazität aufweisen, vereinen. Ein im Hinblick auf die genannten Anforderungen überraschend effizienter Transfer von Biomolekülen, insbesondere von DNA und RNA, in eukaryotische Zellen (Transfektion) läßt sich erreichen, durch die erfindungsgemäßen amphiphilen Polyamine der allgemeinen Formel I,
wobei
R] bis R unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, Halogen, -C≡N, -NO2, -SO3H,
-COOH, -N(Alkyl)2, -NH(Alkyl), -NH2, -Alkyl, -OH, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Hetaryl,
-O(C=O)Alkyl, -(C=O)Alkyl, -SH, -S-Alkyl bedeuten,
R7 einen Rest Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen bedeutet, m und k unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 sind, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
A eine Gruppe N+RgR RioY" bedeutet, wobei Rg bis RJQ unabhängig voneinander einen
Rest Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH2)j-OH oder eine Gruppe -(CH2)j-NH2 mit i=2-6 bedeuten und Y- ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt,
B eine Gruppe
— CH2— oder
bedeutet, in der R \ die für R7 angegebene Bedeutung hat und r eine ganze Zahl von 1 bis 6 sein kann,
Z ein über das C-Atom 3 (des Steran-Grundgerüstes) gebundenes Steroid, einen Rest R12 oder eine Gruppe
bedeutet, wobei j eine ganze Zahl von 0 bis 4 sein kann, R12 einen gesättigten oder ungesättigten Alkyl oder Acylrest mit 8 bis 24 C-Atomen darstellt und E eine Gruppe O-R13 oder CH2-O-R13 bedeutet, bei der R13 die für Rj2 angegebene Bedeutung hat und gleich oder von Rj 2 verschieden sein kann, und wobei das Stickstoff- Atom des Chinolin-Gerüstes zusätzlich von einer Säure H+V protoniert sein kann, wobei Y" ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt.
Bevorzugt sind dabei solche Verbindungen in denen R , R , R4, R und R7 ein Wasserstoffatom darstellen, R5 Wasserstoff oder ein Alkylrest ist und R3 ein Halogenatom, insbesondere Chlor, bedeutet. Weiterhin sind solche Verbindungen von Vorteil, in denen m und k gleich 1 bis 3 sind, n gleich eins ist und A eine Dimethylammonium- oder Diethylammonium-Gruppe bedeutet. Darüber hinaus sind Verbindungen bevorzugt, bei denen B eine Gruppe O
CH2 oder Q
Ό repräsentiert und Z ein membranenassoziiertes Steroid oder einen 1,2-diglyceridartigen Rest darstellt. Ganz besonders bevorzugt sind solche Moleküle, bei denen Z einen Cholesterylrest oder einen 1,2-Dioleoyloxyethylrest bezeichnet und in denen das pharmazeutisch akzeptable Anion Y- gleich Halogenid, Acetat oder Phosphat ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Lipide in Mischung mit anderen, dem Fachmann schon bekannten Lipiden, wie Phospholipiden, insbesondere DOPE oder mit membranassoziierten Steroiden, insbesondere Cholesterol zur Einschleusung von biologisch aktiven Biomolekülen, insbesondere von DNA und RNA angewendet. Dabei können die Lipide in wäßriger (liposomaler) Dispersion oder als Lösung in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln vorliegen, und die DNA (RNA) kann mit Polykationen, insbesondere mit Protaminsulfat vorkomplexiert sein. Gegenüber den bislang bekannten Transfektionsreagenzien weisen die erfindungsgemäßen
Verbindungen eine Reihe entscheidender Vorteile auf. Moleküle der beschriebenen Art besitzen in der hydrophilen Kopfgruppe gleichzeitig mindestens zwei basische Funktionalitäten mit deutlich unterschiedlichen pKs- Werten, welche durch das nicht lipophil modifizierte, aliphatisch-gebundene Stickstoffatom und durch das aromatisch-gebundene Stickstoffatom (Chinolinring) gebildet werden. Die pKs-Werte der entsprechenden
Gruppierungen betragen etwa pKs=10.2 (für Diethylamino) bzw. pKs=8.06 (Chinolin).
Erstere Funktionalität ist somit bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 nahezu vollständig protoniert und bildet daher starke elektrostatische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Biomolekülen aus. In den Fällen, in denen die aliphatische Stickstoffgruppe quaternisiert ist, ist die positive Ladung nahezu unabhängig vom pH-Wert des Milieus. Die Chinolin-Base ist dagegen bei einem pH- Wert von 7,4 zu ca. 20% deprotoniert und daher sehr gut geeignet, den sinkenden pH-Wert nach Aufnahme in die Endosomen zu puffern. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, daß manche Chinolin-Basen in der Lage sind, vakuoläre (H+)- ATPasen zu inhibieren. Die der Erfindung zugrunde liegenden Verbindungen können zusätzlich auch hierdurch die Acidifizierung der Endosomen und somit den Transport der Aggregate in die Lysosomen und deren Abbau verhindern. Aufgrund des aromatischen Charakters des Chinolingerüstes sind außerdem π-Elektronen-Wechselwirkungen mit den Nucleotidbasen der DNA oder RNA möglich-ein zusätzlicher Vorteil gegenüber den bislang bekannten Reagenzien in Hinsicht auf die Komplexbildung.
Die bisher verwendeten Transfektionsreagenzien weisen keine starken Chromophore auf und sind daher bei HPLC-basierten Analysen- und Reinigungsverfahren mittels UV-Detektion nur sehr schwer detektierbar. Aufgrund der starken UV-Absorption des Chinolingerüstes im Wellenlängenbereich von 200-3 OOnm sind die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht detektierbar und bieten somit auch bei der Analytik und der arzneimittelgerechten Präparation entscheidende Vorteile.
Die Herstellung der Verbindungen erfolgt in wenigen Stufen aus preiswerten Ausgangschemikalien unter Anwendung der dem Fachmann geläufigen Methoden [Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl) 4. Aufl. Thieme Verlag (Stuttgart) 1952; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, John-Wiley & Sons,Inc, Vol.32 part I (1977)]. Die entsprechenden Reaktionsschemata sind in den Abb. 1-4 dargestellt. Die Transfektions- und zelltoxischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide wurde auf verschiedenen Tumorzellinien getestet und mit denen bislang bekannter Reagenzien verglichen (Abb. 5 und 6). Als Reportersysteme dienten GFP bzw. ß-Galactosidase codierende Plasmide. Bei den Untersuchungen wurden die Lipide #2, #7, #9 mit dem Phospholipid l,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) gemischt. Wäßrige liposomale Formulierungen wie auch ethanolische Lösungen der Lipide erwiesen sich dabei gleichermaßen für die Transfektionen als geeignet. Mit den Lipiden #2, #7 und #9 ist es möglich, alle untersuchten Zellinien mit höherer Effizienz zu transfizieren als mit den bekannten Lipiden Transfectam®, Lipofectamine™ und DC-Chol. Überraschend günstig sind auch die zelltoxischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide (Abb. 7) und die Unempfindlichkeit der Reagenzien gegenüber hohen Serumanteilen im Zellkulturmedium (Abb. 8). Selbst in Gegenwart von 50% fetalem Kälberserum verbleibt noch über 50% der Gentransfereffizienz, die sich unter Standardbedingungen (10% FCS) erzielen läßt. Die Transfektionseffizienz der Lipide #2 und #7 (Mischung mit 70mol% DOPE) in ethanolischer Lösung ist in Abbildung 9 dargestellt. Auch mit diesen Reagenzien läßt sich beispielsweise die Mamma-Tumorzellinie MCF7 deutlich effizienter mit dem pEGFP-Nl- Plasmid transfizieren als mit dem bekannten Reagenz Transfectam. Die Komplexierung der DNA mit dem polykationischen Protein Protaminsulfat führt zwar nicht zu einer signifikanten Steigerung des Anteils an transfizierten Zellen. Überraschenderweise wird jedoch eine deutliche stärkere Expression des Reportergens ermöglicht. Der Mediän der Fluoreszenzintensität der transfizierten Zellen liegt bei Verwendung der mit Protaminsulfat vorkomplexierten DNA um mehr als 50% höher als bei der Verwendung der nicht vorkomplexierten DNA (Abb. 9).
Die Erfindung soll exemplarisch anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert sein. Obwohl die Beispiele bevorzugte Ausführungsformen repräsentieren, soll der Umfang der Erfindung durch sie nicht eingeschränkt werden. Beispiel 1
Synthese von 7-Chlor-4-[N1-(N4-H)-(N7-diethyl)-l,4,7-triaza-xheptyl]-chinolin (#1)
In einem verschlossenen 25 ml Rundkolben werden 1.39 g (7 mmol) 4,7-Dichlorchinolin und
1.32 g (14 mmol) Phenol in einer Argonschutzgasatmosphäre unter Rühren für eine Stunde auf 120°C erhitzt. Die Schmelze wird daraufhin auf ca. 60°C abgekühlt, mit 1.115 g (7 mmol) Diethylaminoethylethylendiamin versetzt und für 24 Stunden unter Rühren auf 125°C erhitzt, wobei sie sich rötlich-dunkelbraun verfärbt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird der Rückstand in 30 ml 2N Essigsäure gelöst und mit konz. Essigsäure auf pH 4-5 angesäuert. Die Lösung wird 4 x mit je 25 ml CΗCI3 extrahiert und die wäßrige Phase anschließend mit konz. wäßrigem Ammoniak auf pH 8-9 eingestellt (ca. 7-8 ml). Die trübe Lösung wird daraufhin 4 x mit je 25 ml CHCI3 extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen werden noch ein mal mit 10 ml ges. NaHCθ3 -Lösung gewaschen, über Na2Sθ4 getrocknet und das Lösungsmittel dann am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man 1.94 g (6.1 mmol) = 87% d. Th. eines bräunlichen, zähen Öls, welches über Nacht kristallin erstarrt. Die Verbindung kann ohne weitere Aufreinigung zur Darstellung von #2 verwendet werden. Analytisch reine Substanz wird durch präparative
Säulenchromatographie auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) erhalten (Eluent: Stufengradient aus CH2Cl2/MeOH 3 : 1 (0.1 % Triethylamin) auf CH2Cl2/MeOH 1:3 (0.1 % Triethylamin)).
DC (Kieselgel 60) [CHCl3/MeOH 4:1]; Rr0.04; UV-Detektion
Beispiel 2
Synthese von 7-Chlor-4-[N1 -(N4-carboxycholesteryl)-(N7-diethyl)- 1 ,4,7-triaza-heptyl]- chinolin hydrochlorid (#2)
In einem 50 ml Rundkolben mit seitlichem Gaseinlaß werden unter einer Argonatmosphäre 614 mg (1.91 mmol) #1 in 15ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin wird bei Raumtemperatur eine Lösung von 853 mg (1.90 mmol) Cholesterylchlorformiat in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan innerhalb von 15 min unter Rühren zugetropft. Nach einer Reaktionszeit von 2 h wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand für weitere 2 h im Vakuum getrocknet. Man erhält 1.45 g eines gelbbraunen amorphen Feststoffs. Weitere säulenchromatographische Aufreinigung auf Kieselgel 60 (70-230 mesh)(Eluent CH2Cl2/MeOH 7: 1) liefert die reine Verbindung als einen farblosen, amorphen Feststoff.
DC (Kieselgel 60) [CH2Cl2/MeOH 4:1]; R =0.24; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure
Beispiel 3
Synthese von 7-Chlor-4-[N1 -(N^-carboxycholesterylHN^-diethyl-hydroxyethyl)- 1 ,4,7-triaza- heptylj-chinolin hydrobromid (#3)
In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden unter einer Argonatmosphäre 40 mg (52 μmol) in 500 μl wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit 30 mg trockenem Νatriumcarbonat sowie mit 300 μl 2-Bromethanol versetzt. Die Mischung wird unter Rühren 16 Stunden bei 65°C erwärmt, danach mit 10 ml Dichlormethan versetzt und filtriert. Die flüchtigen Bestandteile werden daraufhin bei 60°C im Hochvakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) mit Dichlormethan/Methanol 5:1 als Eluent erhält man 25 mg (29.1 μmol)= 56% d.Th. eines farblosen, glasartigen Feststoffs.
DC (Kieselgel 60) [CH2Cl2/MeOH 3:1]; Rf=0.25; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure Beispiel 4
Synthese von N^V-Dimethyl-N'-cyanoethyl-ethylendiamin (#4)
In einem 500 ml Rundkolben werden 10.9 ml (100 mmol) 2-Dimethylaminoethylamin, gelöst in 150 ml 2-Propanol, vorgelegt. Daraufhin werden unter Kühlung im Eisbad 6.91 ml (105 mmol) Acrylonitril zugefügt und die Mischung für 72 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird das Lösungsmittel im Vakuum (7 mbar) bei 40-50°C entfernt und der Rückstand anschließend im Vakuum destilliert. Man erhält 9.80 g (69 mmol)= 69% d.Th. einer farblosen Flüssigkeit mit einem Sdp. von 135°C (7mbar).
IR ( Film, [cm"1] ): v = 3500-3150 (m,b) [v N-H]; 2930 (s), 2840 (s), 2810 (s), 2750 (s) [vaS;S CH2, CH3]; 2240
(s) [v CN]; 1460 (m), 1440 (m,sh) [δas,s CH2, δas CH3]
!H-NMR ( 400.132 MHz, CDC13 [ppm] ): δ = 1.35-1.6 (s(b), 1H, NH); 2.13 (s, 6 H, N(CH3)2); 2.17, 2.42, 2.62, 2.85 (4 x t, 8H, 4 x
CH2)
13C{!H}-NMR ( 100.625 MHz, CDCI3 [ppm] ): δ = 18.5, 45.1, 46.4, 58.7 (4 x CH2); 45.25 (N(CH3)2); 118.5 (C.N)
Beispiel 5
Synthese von N8-Dimethyl-l,5,8-triazaoctan (#5)
In einem 250 ml Dreihalskolben mit Rührfisch, Magnetrührer, Rückflußkühler, Septum und Argonzuleitung werden unter einer Argonatmosphäre 90 ml einer IM Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Diethylether vorgelegt. Über eine Einwegspritze werden dann 9.93 g (70 mmol) #4 vorsichtig zugetropft, so daß der Ether nur leicht siedet. Die Mischung wird daraufhin noch 5 h unter Rückfluß erhitzt. Danach werden 15 ml einer 20%igen Natronlauge sehr vorsichtig zugetropft. Die entstehenden Hydroxide fallen dabei als sehr grober Niederschlag an, der sich leicht abdekantieren läßt. Die Hydroxidrückstände werden noch 5 x mit je 40 ml Diethylether aufgekocht. Die vereinigten Etherphasen werden filtriert und das Lösungsmittel daraufhin am
Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in 150 ml Dichlormethan aufgenommen und einmal mit 5 ml 5N NaOH-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Na2Sθ4 wird das
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und die leicht ölige Flüssigkeit im Feinvakuum fraktionierend destilliert. Man erhält 3.96 g (27.3 mmol)= 39% d.Th. einer farblosen Flüssigkeit mit einem Sdp. von 65°C (0.1 mbar).
IR ( Film, [cm"1] ): v = 3600-3100 (s,b) [v N-H]; 2920 (s), 2800 (s), 2750 (s) [vaS)S CH2, CH3]; 1445 (s) [δas>s
CH2, δas CH3]
Beispiel 6
Synthese von 7-Chlor-4-[N1-(N5-H)-(N8-dimethyl)-l,5,8-triaza-octyl]-chinolin (#6)
In einem verschlossenen 25 ml Rundkolben werden 812 mg (4.1 mmol) 4,7-Dichlorchinolin und 1.16 mg (12.3 mmol) Phenol in einer Argonschutzgasatmosphäre unter Rühren für eine Stunde auf 125-130°C erhitzt. Die Schmelze wird daraufhin auf ca. 60°C abgekühlt, mit 596 mg (4.1 mmol) N°-Dimethyl-l,5,8-triazaoctan (#5) versetzt und für 24 Stunden unter Rühren auf 130°C erhitzt. Nach dieser Zeit läßt man die Mischung erkalten und setzt 20 ml 5 N NaOH-Lösung hinzu. Die Lösung wird in einen Scheidetrichter überführt und 2 x mit je 60 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 10 ml 5 N NaOH-Lösung gewaschen, über Na2Sθ4 getrocknet und das Lösungsmittel anschließend am
Rotationsverdampfer entfernt. Man erhält 1.37 g eines gelbbraunen, zähen Öls. Die
Verbindung kann ohne weitere Aufreinigung zur Darstellung von #7 verwendet werden. Analytisch reine Substanz wird durch präparative Säulenchromatographie auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) erhalten (Eluent: Stufengradient aus CH2Cl2/MeOH 3:1 (0.1% Triethylamin) auf CH2Cl2/MeOH 1:3 (0.1% Triethylamin)). DC (Kieselgel 60) [CH2Cl2/MeOH 3:1 (0.1% Triethylamin)]; R =0.07; UV-Detektion [80% Ethanol (2%Triethylamin)]; R =0.11; UV-Detektion
Beispiel 7
Synthese von 7-Chlor-4-[N1 -(N5-carboxycholesteryl)-(N8-dimethyl)- 1 ,5,8-triaza-octyl]- chinolin hydrochlorid (#7)
In einem 50 ml Rundkolben mit seitlichem Gaseinlaß werden unter einer Argonatmosphäre
580 mg (1.89 mmol) #6 in 40ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin werden unter
Kühlung im Eisbad 850 mg (1.89 mmol) Cholesterylchlorformiat zugesetzt. Die Mischung wird für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt wird. Anschließende säulenchromatographische Aufreinigung des Rohproduktes auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) mit CH2Cl2/MeOH 7: 1 als Eluent liefert die reine Verbindung als einen farblosen, amorphen Feststoff.
DC (Kieselgel 60) [CH2Cl2/MeOH 7: 1]; Rf=0.19; UV-Detektion und Detektion mit
Vanilin/konz. Schwefelsäure
Beispiel 8
Synthese von 7-Chlor-4-[N1-(N5-(2(R),3-dihydroxy)propyl)-(N8-dimethyl)-l,5,8-triaza- octyl]-chinolin (#8)
In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden 244 mg (795 μmol) #6 in 2 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Die Lösung wird für 72 Stunden bei 0-4°C gerührt, wobei in gleichmäßigen Zeitabständen jeweils Portionen von 10 μl (S)-Glycidol (insgesamt 100μl=1.51 mmol) zugefügt werden. Daraufhin werden die flüchtigen Bestandteile am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf 20 g Kieselgel 60 (70-23 Omesh) gereinigt. Als Eluent verwendet man dabei einen Stufengradienten aus C^C^/MeOH 3:1 (0.1 % Triethylamin) auf CH2Cl2/MeOH 1:1 (0.1% Triethylamin). Man erhält 24.5 mg (64 μmol)= 8.1% d.Th. eines farblosen, sehr zähen Öls.
DC (Kieselgel 60) [80% Ethanol (2%Triethylamin)]; R =0.27; UV-Detektion
Beispiel 9
Synthese von 7-Chlor-4-[N1-(N5-(2(R),3-dioleoyloxy)propyl)-(N8-dimethyl)-l,5,8-triaza- octyl]-chinolin (#9)
In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden 24.5 mg (64 μmol) #8 in 1.5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin werden 36 μl (256 μmol) Triethylamin, 41 μl (128 μmol) Ölsäure und 34 mg (131 μmol) N,N-Bis-[2-oxo-3-oxazolidinyl]- phosphorsäurediamidchlorid (BOP-Cl) zugefügt. Die Mischung wird für 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei der Umsatz mittels Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol 7:1) verfolgt wird. Nach dieser Zeit wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf 20 g Kieselgel 60 (70-230 mesh) gereinigt. Als Eluent dient dabei Dichlormethan/Methanol 7:1. Man erhält 24 mg (26 μmol)= 41% d.Th. eines farblosen, wachsartigen Feststoffs.
DC (Kieselgel 60) [Dichlormethan/Methanol 7:1]; R =0.30; UV-Detektion und Detektion mit
Vanilin/konz. Schwefelsäure
Beispiel 10
Formulierung der erfindungsgemäßen amphiphilen Polyamine für die Transfektionsexperimente a) Liposomale Formulierung
Lösungen der Amphiphile #2, #3, #7, #9 in Chloroform werden mit einer Lösung von 1,2- Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) in Chlorform in unterschiedlichen molprozentualen Verhältnissen gemischt und im Vakuum zu einem Lipidfilm eingetrocknet. 5 Letzte Lösungsmittelreste werden dabei im Hochvakuum entfernt. Daraufhin werden die Lipidfilme in sterilem Wasser rehydratisiert und durch Ultraschallbehandlung die Liposomen generiert. Die Gesamt-Lipidkonzentration der resultierenden Dispersion beträgt dabei 1 mg/ml.
10 b) Ethanolische Formulierung
Die kationischen Lipide werden in unterschiedlichen molprozentualen Verhältnissen mit DOPE gemischt und in wasserfreiem Ethanol gelöst. Die Gesamt-Lipidkonzentration der resultierenden Lösung beträgt 1 mg/ml.
15
Beispiel 11
Transfektion von adhärenten Zellinien
20 Allgemeines: Verwendete Zellinien HeLa, Hecla, SKOV3, MCF-7, Hey, SKBR3, T47D, 293 werden unter Standardbedingungen (gemäß ATCC-Angaben) kultiviert. Die kommerziellen Transfektionreagenzien Transfectam®, Lipofectamine™ und Superfect wurden gemäß der Herstellerangaben verwendet. DC-Chol wurde entsprechend der Literaturvorschrift [L. Huang et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179(1) (1991) 280-
25 285] synthetisiert, mit DOPE formuliert und zur Transfektion eingesetzt.
a) Transfektion mit pEGFP-Nl -Plasmid
a.l)Verwendung der Reagenzien als wäßrige Liposomen-Dispersion 30 Am Tag vor der Transfektion werden pro well einer 24-well-Zellkulturplatte 40-50000 Zellen (ca. 70%o Konfluenz) ausgesät. Zur Transfektion werden 2 μg des Plasmids (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories,Inc; Katalog-Nr. 6085-1) in 300μl FCS-freiem Medium vorgelegt, mit 3 μl (SKBR3, MCF-7, Hey) bzw. 6 μl (HeLa, Hecla, SKOV3) des wäßrigen Lipidreagenzes (30 mol% Lipid #2 bzw. #7 bzw. #9; 70 mol% DOPE) versetzt und die Mischung für 30min bei RT inkubiert. Kurz vor der Transfektion wird das Medium entfernt und durch 700μl frisches Medium (14,3% FCS) ersetzt. Nach Zugabe des Lipid-DNA-Komplexes wird für 48 Stunden inkubiert und daraufhin der Anteil der GFP-exprimierenden, fluoreszierenden Zellen durch FACS-Analyse bestimmt. Hierzu werden die Zellen mit PBS gewaschen und abtrypsinisiert. Die Zellen werden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und abzentrifugiert. Daraufhin wird das Zellpellet in 500μl PBS aufgenommen und der Anteil fluoreszenter Zellen an einem FACS-Gerät (Becton Dickinson, FACScan) bestimmt.
a.2) Verwendung der Lipide in ethanolischer Lösung
Am Tag vor der Transfektion werden pro well einer 24-well-Zellkulturplatte 40-50000 Zellen (ca. 70%) Konfluenz) ausgesät. Zur Transfektion werden 2 μg des Plasmids (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories,Inc; Katalog-Nr. 6085-1) in 300μl FCS-freiem Medium vorgelegt, mit 4 μl des ethanolischen Lipidreagenzes (30 mol% Lipid #2 bzw. #7; 70 mol% DOPE) versetzt und die Mischung für 30min bei RT inkubiert. Bei der Transfektion in Gegenwart von Protaminsulfat werden 2 μg des Plasmids in 300 μl FCS-freiem Medium vorgelegt und mit 2 μg Protaminsulfat komplexiert. Nach einer Inkubationszeit von 10 min werden 4 μl des Lipidreagenzes zugesetzt. Kurz vor der Transfektion wird das Medium entfernt und durch 700μl frisches Medium (14,3% FCS) ersetzt. Nach Zugabe des Lipid-DNA-Komplexes wird für 48 Stunden inkubiert und daraufhin der Anteil der GFP-exprimierenden, fluoreszierenden Zellen durch FACS-Analyse, wie unter a.1 beschrieben, bestimmt.
b) Transfektion mit pRc/CMVlacZ-Plasmid
pRc/CMVlacZ-Plasmid: lacZ wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme Hindill und Xbal aus dem kommerziell verfügbaren Vektor pSVbetaGal (Promega; Kat.-Nr. E1081) herausgeschnitten und in das Expressionsplasmid pRc/CMV (Invitrogen; Hindlll und Xbal geschnitten) einkloniert. Am Tag vor der Transfektion werden 12-15000 Zellen pro well einer 96-well-Zellkultu latte ausgesät. Kurz vor der Transfektion wird das Medium durch 80μl/well frisches Medium (20%> FCS) ersetzt. Zur Untersuchung der Inhibition der Transfektionseffizienz durch FCS (Abb. 8) wird Medium mit einem Anteil von 20-100%) FCS vorgelegt. Daraufhin werden 80μl des Lipid-DNA-Komplexes, hergestellt aus 0,5- lμg DNA in 40 μl
FCS-freiem Medium und 0,5-2 μl der wäßrigen Lipiddispersion (20-60mol% Lipid #2 oder
#7; 80-40mol% DOPE) in 40 μl FCS-freiem Medium, hinzupipettiert und die Zellen für 48 Stunden im Cθ2-Inkubator inkubiert. DC-Chol wird entsprechend den in der Literatur (s.o.) beschriebenen Bedingungen verwendet.
Die gleichzeitige Bestimmung der Reportergen-Expression und der Zellvitalität erfolgt nach einem literaturbekannten Verfahren [D. Groth, O. Keil et al.; Anal. Biochem. 258 (1998) 141-143] und liefert die Gesamt-beta-Galactosidase Expression in mU/well und die Zellvitalität in Prozent relativ zu unbehandelten Zellen.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
wobei R\ bis R unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, Halogen, -C≡N, -NO2, -SO3H, -COOH, -N(Alkyl)2, -NH(Alkyl), -NH2, -Alkyl, -OH, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Hetaryl,
-O(C=O)Alkyl, -(C=O)Alkyl, -SH, -S-Alkyl bedeuten,
R7 einen Rest Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen bedeutet, m und k unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 sind, n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
A eine Gruppe bedeutet, wobei Rg bis Rio unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH2)j-OH oder eine Gruppe -(CH2)j-NH2 mit i=2-6 bedeuten und Y" ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt, B eine Gruppe
-CH2—
bedeutet, in der R\ \ die für R7 angegebene Bedeutung hat und r eine ganze Zahl von 1 bis 6 sein kann,
Z ein über das C-Atom 3 (des Steran-Grundgerüstes) gebundenes Steroid, einen Rest Rj2 oder eine Gruppe bedeutet, wobei j eine ganze Zahl von 0 bis 4 sein kann, Rj2 einen gesättigten oder ungesättigten Alkyl oder Acylrest mit 8 bis 24 C-Atomen darstellt und E eine Gruppe O-R13 oder CH2-O-R13 bedeutet, bei der R13 die für Rj2 angegebene Bedeutung hat und gleich oder von RT 2 verschieden sein kann, und wobei das Stickstoff-Atom des Chinolin-Gerüstes zusätzlich von einer Säure H^Y" protoniert sein kann, wobei Y" ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste R , R2, R4, Rß und R7 ein Wasserstoffatom darstellen, R5 ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen ist und R3 ein Halogenatom bedeutet.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß m und k gleich 1 bis 3 sind, n gleich 1 ist und A eine Dimethylammonium- oder Diethylammonium-Gruppe bedeutet.
4. Verbindungen nach Anspruch 1,2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß B eine Gruppe -CH2- oder -C(O)O- repräsentiert und Z einen Cholesterylrest oder einen 1,2-
Dioleoyloxyethylrest darstellt.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y" ein Halogenid-, Acetat- oder Phosphat-Anion darstellt.
6. Pharmazeutische oder diagnostische Verwendung eines Reagenzes für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Reagenz, welches mindestens eine Verbindung der Ansprüche 1 bis 5 enthält, wobei zusätzlich weitere lipidische Verbindungen in unterschiedlichen Anteilen beigemischt sein können, und den biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen Aggregate gebildet werden und diese in vivo oder in vitro mit den Zellen in Kontakt gebracht werden.
7. Pharmazeutische oder diagnostische Verwendung eines Reagenzes für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen um DNA, RNA, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Ribozymen, Peptiden oder Proteinen handelt.
8. Pharmazeutische oder diagnostische Verwendung eines Reagenzes für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzlich beigemischten lipidischen Verbindungen der Phospholipid- oder Steroidklasse angehören, wobei 1 ,2-Dioleoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamin besonders geeignet ist.
9. Pharmazeutische oder diagnostische Verwendung eines Reagenzes für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz als Dispersion in wäßrigen Medien oder als Lösung in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel vorliegt, wobei im Falle einer wäßrigen Dispersion gleichzeitig Kryo-Schutzmittel aus der Gruppe Lactose, Trehalose, Sucrose, Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannitol oder Polyethylenglykol gelöst sein können.
10. Pharmazeutische oder diagnostische Verwendung eines Reagenzes für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven, anionischen Makromoleküle als Komplexe mit polykationischen Molekülen aus der Gruppe Spermin, Spermidin, Protaminsulfat, Histon Hl, Histon H2A, Histon H2B, Histon H3, Histon H4, HMG1 oder HMG17 Protein vorliegen können.
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