CN110721320B - 一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110721320B
CN110721320B CN201810702649.6A CN201810702649A CN110721320B CN 110721320 B CN110721320 B CN 110721320B CN 201810702649 A CN201810702649 A CN 201810702649A CN 110721320 B CN110721320 B CN 110721320B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
liver
gene
pdpia
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810702649.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110721320A (zh
Inventor
鞠佃文
陈伟
宰文静
范佳君
章旭耀
栾静韵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN201810702649.6A priority Critical patent/CN110721320B/zh
Publication of CN110721320A publication Critical patent/CN110721320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110721320B publication Critical patent/CN110721320B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途，本发明由聚酰胺‑胺型树状大分子(PAMAM 3.0)、DSPE‑PEG2000、穿膜素为载体，同阴离子治疗基因通过自组装形成纳米基因药物。该纳米基因药物可以靶向肝脏实质细胞，并通过过表达或者干扰某些蛋白质的合成产生治疗作用。本发明还提供了该纳米基因药物的制备方法。该纳米基因药物具有稳定性高、质量可控和相对安全的特点。该纳米基因药物可以显著的保护肝细胞损伤，有望成为保护肝细胞损伤的药物。

Description

一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属生物制药领域，涉及一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法，以及在治疗药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝癌、病毒性肝炎、酒精肝等肝脏疾病及糖尿病中的应用。
背景技术
现有技术公开了肝炎严重的威胁着人类的生命健康，然而针对这一类疾病的药物却非常有限[Saito，C.；Zwingmann，C.；Jaeschke，H.Novel mechanisms of protectionagainst acetaminophen hepatotoxicity in mice by glutathione and N-acetylcysteine.Hepatology 2010，51，246-254]。研究显示，肝炎的危险因素包括感染、药物滥用、慢性酒精中毒、高脂饮食等，均会加重肝细胞的损伤。研究表明肝实质细胞的损伤是肝炎最重要的病理特征，因此开发一类精准靶向保护肝实质细胞的药物具有十分重要的意义[Cubero，F.J.；Zoubek，M.E.；Hu，W.；Peng，J.；Zhao，G.；Nevzorova，Y.A.，etal.Combined Activities of JNK1 and JNK2 in Hepatocytes Protect Against ToxicLiver Injury.Gastroenterology 2016，150，968-981]。
科学家提出“魔术子弹”的概念，期待开发一种只攻击病变组织或病原体而不攻击正常细胞的药物。该一概念促进了非病毒载体纳米基因药物技术的发展，有研究投入了大量的资本用于开发更有效的纳米基因药物[Kim，B.Y.；Rutka，J.T.；Chan，W.C.Nanomedicine.N.Engl.J.Med.2010，363，2434-2443.]；但是，纳米基因药物至今还没有在临床上得到广泛的应用，其中包括脱靶效应、单核巨噬系统清除、难以透过细胞膜、溶酶体清除等递送问题是其中最为关键的阻碍[Wilhelm，S.；Tavares，A.J.；Dai，Q.；Ohta，S.；Audet，J.Analysis of nanoparticle delivery to tumours.Nat.Rev.Mater.2016，1，16014]。
穿膜素是一类具有高效穿透细胞膜的多肽，近年来被广泛应用到纳米技术上用以帮助纳米粒穿透靶细胞膜和逃逸溶酶体的清除；但研究显示，穿膜素缺少足够的正电荷来压缩带负电荷的治疗基因；不仅如此，带负电荷的治疗基因可中和穿膜素的正电荷，从而降低穿膜素的穿膜和转染效率[Meade，B.R.；Dowdy，S.F.Exogenous siRNA Delivery UsingPeptide Transduction Domains/Cell Penetrating Peptides.Adv.Drug DeliveryRev.2007，59，134-140]。PAMAM3.0作为非病毒基因递送载体，具有较强的正电荷、逃逸溶酶体清除、规则的纳米形状等优点[Figueroa，E.R.；Lin，A.Y.；Yan，J.；Luo，L.；Foster，A.E.；Drezek，R.A.Optimization of PAMAM-gold nanoparticle conjugation for genetherapy，Biomaterials 2014，35，1725-1734]。DSPE-PEG2000可以降低非特异结合、增加纳米基因药物的体内循环时间、帮助纳米分布[Suk，J.S.；Xu，Q.；Kim，N.；Hanes，J.；Ensign，L.M.Pegylation as a Strategy for Improving Nanoparticle-Based Drug and GeneDelivery.Adv.Drug Delivery Rev.2016，99，28-51]。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物，并能在肝脏相关疾病的治疗得到应用，其将具有重大临床的意义。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种用于治疗肝脏相关疾病的新型纳米基因药物及制备方法，本发明的另一目的在于提供该用于肝脏相关疾病的新型纳米基因药物在治疗药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝癌、病毒性肝炎、酒精肝等肝脏疾病及糖尿病中的应用。
本发明所要解决的关键技术问题是如何实现纳米基因药物的肝实质细胞靶向性，如何降低单核巨噬系统系统对纳米基因药物的清除，如何增强纳米基因药物穿透肝实质细胞的效率，如何实现纳米基因药物对肝脏相关疾病的精准高效治疗。
具体的，本发明提供了一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物，该纳米基因药物由PAMAM 3.0、DSPE-PEG2000、穿膜素为载体，同阴离子治疗基因通过自组装形成的纳米构成；通过静脉注射该纳米基因药物可以高效靶向肝细胞并过表达或者干扰某些蛋白质的合成。
本发明中，穿膜素和阴离子治疗基因的质量比为4∶1至30∶1。
本发明中，PAMAM 3.0和阴离子治疗基因的质量比为2∶1至20∶1。
本发明中，PAMAM 3.0和DSPE-PEG2000的质量比为2∶1至20∶1。
本发明中，所述的穿膜素的氨基酸序列包括RQIKIWFQNRRMKWKKK和RQIKIWFQNRRMKWKK。
本发明中，所述的阴离子治疗基因为siRNA或DNA构成。
本发明提供了所述的纳米基因药物的制备方法，其包括步骤：
1)将PAMAM 3.0、DSPE-PEG2000、穿膜素溶解于超纯水中使其充分分散；
2)将治疗基因的水溶液缓慢的滴加入1)所述的溶液中混匀，通过静电吸附作用形成纳米；
3)将步骤2)中的溶液置于37度条件下孵育一个小时，最终形成稳定的纳米基因药物。
本发明制得的纳米基因药物其粒径在30-500nM之间。
本发明进一步提供制得的纳米基因药物用于制备治疗肝脏相关疾病的基因药物中的用途，所述肝脏相关疾病包括药物性肝损伤、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝癌、病毒性肝炎、酒精肝等肝脏疾病及糖尿病。
本发明提供一种由聚酰胺-胺型树状大分子(PAMAM 3.0)、DSPE-PEG2000、穿膜素为载体，同阴离子治疗基因通过自组装形成的纳米基因药物，该纳米基因药物可以靶向肝脏实质细胞，并通过过表达或者干扰某些蛋白质的合成产生治疗作用；本发明制备的纳米基因药物具有稳定性高、质量可控和相对安全的特点，该纳米基因药物可以显著的保护肝细胞损伤，有望成为保护肝细胞损伤的药物。
本发明的用于肝脏相关疾病的纳米基因药物将具有下列优势：
1)该新型纳米基因药物由PAMAM 3.0、DSPE-PEG2000、穿膜素为载体，同阴离子治疗基因通过自组装形成的纳米具有较好的肝实质细胞靶向分布效应。
2)该新型纳米基因药物稳定性高、质量可控和相对安全的特点。
3)该新型纳米基因药物具有高穿透肝细胞膜效率、逃逸溶酶体清除、逃逸单核巨噬细胞系统清除的特点。
4)该新型纳米基因药物具有对肝脏相关疾病高效的治疗作用。
附图说明
图1：纳米基因药物(PDPIA)的制备及表征。
图2：肝细胞对PDPIA的摄取情况。
图3：PDPIA能够逃逸肝细胞溶酶体的清除和具有较低的细胞毒。
图4：PDPIA的细胞摄取机制研究。
图5：PDPIA可以靶向肝脏实质细胞。
图6：PDPIA可以显著的保护ConA诱导的自身免疫性肝炎。
图7：PDPIA可以显著的降低ConA诱导的肝脏炎症细胞的浸润和促进肝脏细胞的再生。
图8：PDPIA可以显著促抑制肝细胞ROS产生和线粒体功能紊乱。
图9：PDPIA对免疫系统和组织器官没有明显的毒副作用。
具体实施方式
以下结合实施例和附图，对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂盒、原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、纳米基因药物(PDPIA)的制备及表征
首先，将治疗基因(pIA质粒)溶解于质量百分数为五的葡萄糖溶液中，并把不同质量比的PAMAM3.0阳离子聚合物迅速加入，该混合物涡旋60秒，并在37度条件下孵育一小时，含不同组分的阳离子聚合物葡聚糖凝胶电泳如图1A、B所示，表明PAMAM3.0：pIA质量比为2时可以充分的包裹治疗基因；
然后，将带正电荷的穿膜素、PAMAM3.0、DSPE-PEG2000溶解于质量百分数为五的葡萄糖溶液中，并把带负电荷的治疗基因滴加入混合溶液中，该混合物涡旋60秒，并在37度条件下孵育一小时，保持PAMAM3.0：DSPE-PEG2000的比例为10，调整穿膜素：pIA的质量比，形成不同比例组分的纳米复合物，利用马尔文粒径仪测量纳米药物的粒径、Z电位和PDI值，如图1C、D和E所示；
进一步评价该纳米基因药物(PDPIA)的稳定性，分别取含有相同质量、不同组分比例的PDPIA在4度条件下保存，与此同时，在不同时间点分别用马尔文粒径仪测量PDPIA的粒径和PDI值，如图1F、G所示，PDPIA具有相对较好的稳定性，如图图1H、I所示，利用透射电镜观察PDPIA的形态和粒径表明PDPIA具有较好的形态且粒径大小在150nM左右。
实施例2、肝细胞对PDPIA的摄取实验
利用流式细胞技术和荧光共聚焦显微镜观察肝细胞对纳米基因药物(PDPIA)的摄取情况：首先，用荧光染料TOTO-3标记治疗基因pIA和FAM标记穿膜素，通过自主装的方法制备具有荧光探针标记的纳米基因药物(PDPIA)，然后将1×105的HepG 2细胞和Huh 7细胞接种在六孔板中，带细胞长至70％，向细胞中加入带荧光标记的pIA、DPIA、PDPIA作用4小时，用细胞刮刀收集好细胞并用PBS洗涤2遍后，在流式细胞仪下检测肝细胞对纳米基因药物(PDPIA)的摄取，结果表明(如图2A所示)，肝细胞对通过穿膜素修饰并自主装形成的纳米基因药物(PDPIA)的摄取率高达80％左右，而未加穿膜素修饰的纳米基因药物的摄取率只有14％左右；荧光共聚焦显微镜结果显示，经过穿膜素修饰的纳米基因药物在肝细胞质内的摄取率显著提高(如图2B所示)；
结果表明该种具有穿膜素修饰的纳米基因药物(PDPIA)在肝细胞的摄取率得到了显著的提高。
实施例3、PDPIA能够逃逸肝细胞溶酶体的清除并具有较低的细胞毒实验
依据有好的溶酶体逃逸能力的纳米基因药物具有可以抵抗核酶分解的能力，因此这种特性是纳米基因药物具有优良的转染效率的前提，文献报道指出磷脂化的PEG和PAMAM都具有优良的溶酶体逃逸能力，因此本申请推测由穿膜素、DSPE-PEG2000、PAMAM 3.0、治疗基因组成的纳米基因药物同样具有优秀的溶酶体逃逸能力：本申请用YOYO染料标记PDPIA，用LysotrackerRed染料标记溶酶体，观察PDPIA和溶酶体的定位情况，将1×105的HepG 2细胞和Huh 7细胞接种培养皿中，待细胞长至融合率为70％加入PDPIA，然后在不同时间点观察PDPIA和溶酶体的定位情况，如图3A所示，试验结果表明PDPIA在2个小时内被肝细胞摄取且部分纳米粒和溶酶体共定位(黄色)，4小时后红色的溶酶体和绿色的纳米基因药物分离，证明PDPIA逃逸了溶酶体的吞噬，结果表明纳米基因药物PDPIA具有逃逸溶酶体吞噬的功能；
非病毒基因治疗载体的最大障碍之一是细胞毒性，因此开发一类安全低毒的纳米基因药物具有非常大的临床应用意义，本申请中用MTT法检测不同浓度的PDPIA对肝细胞的细胞毒作用，结果表明(如图3B所示)，PDPIA几乎对肝细胞没有杀伤作用，证明PDPIA具有较高的细胞安全性。
实施例4、PDPIA在肝细胞中的递送机制试验
详细的了解纳米基因药物的递送机制，将有助于避免细胞和组织的副作用；因此，本发明进一步进行验证PDPIA的递送机制的试验，纳米载体介导的治疗基因递送主要有胞吞作用和细胞膜融合作用两种方式，将1×105的HepG 2细胞和Huh 7细胞接种培养皿中，待细胞长至融合率为70％，加入胞吞作用抑制剂(氯丙嗪和渥曼青霉素)或者细胞膜融合抑制剂(Mβ-CD，genistein，monensin和Cyto-D)，待抑制剂作用一定时间后，向细胞中加入PDPIA培养4小时，用PBS洗3遍后，收集细胞并用流式细胞检测PDPIA在细胞内摄取的情况，结果表明(如图4A、4B所示)，Mβ-CD和Cyto-D可以显著的抑制肝细胞对PDPIA的摄取，该种结果与荧光显微镜观察的结果一致(如图4C、4D所示)，结果表明，纳米基因药物PDPIA通过细胞膜融合作用进入肝细胞质，因此本发明提供了一种直接进入细胞质的纳米基因药物方案，并导致PDPIA具有较高的转染效率。
实施例5、PDPIA体内分布研究实验
纳米基因药物在体内的分布情况直接决定了该药物的治疗效果，因此，本申请利用TOTO-3标记治疗基因并用活体成像系统观察PDPIA在小鼠体内的分布情况，如图5A、5B所示，尾静脉注射PDPIA在6小时后肝脏开始摄取该纳米药物并在12小时达到最大浓度，同时，也在肾脏发现了部分的TOTO-3-pIA，可能是该纳米基因药物部分分解并沉积在肾脏的基底膜上，和对照组(DPIA)相比，PDPIA具有明显的肝靶向性，这与纳米的粒径、组成、摄取率有关，没有穿膜素修饰的纳米基因药物(DPIA)，在24小时后可以显著的被肺部摄取，可能引起不必要的副作用；
基于大部分纳米药物进入体内后不能到达理想的用药部位，主要是因为单核巨噬细胞系统的清除作用，这也是阻碍纳米基因药物临床转化的最大的障碍；本申请假设PDPIA可以避免单核巨噬细胞系统的清除(肝脏中是Kuffer细胞)，并导致PDPIA在肝脏中高浓度聚集，本申请中猜测纳米药物被Kuffer细胞摄取后并快速清除体内，PDPIA具有较低的Kuffer细胞摄取率会更多的纳米基因药物聚集在肝细胞，继而分离了肝脏中的肝实质细胞和肝非实质细胞并用流式抗体标记F4/80以区分Kuffer细胞，如图5D和图5E所示，试验结果表明肝实质细胞摄取的PDPIA的数量远远多于肝非实质细胞的摄取(包括Kuffer细胞)，该现象进一步在免疫荧光试验中得到验证，如图5F所示，用绿色荧光标记Kuffer细胞(F4/80+)后，可以清晰的看到PDPIA没有被Kuffer细胞所摄取，而相反的，DPIA被Kuffer细胞摄取率远多于PDPIA，结果不仅证明PDPIA在体内靶向肝细胞的机制而且进一步验证了它的优越性。
实施例6、PDPIA可以显著的抑制刀豆蛋白诱导的自身免疫性肝炎
自身免疫性肝炎是一种不明原因、高死亡率的进展性肝炎，最近的研究表明，白介素22融合载脂蛋白AI可以显著的延长白介素22的半衰期和提高它的治疗效果，基于PDPIA递药系统优越的体外和体内作用，本申请将该系统应用到递送白介素22融合载脂蛋白AI治疗基因上(pIA)，并进一步验证该药物对自身免疫性肝炎的保护作用(如图6A所示)，小鼠注射刀豆蛋白后(20mg/kg)，肝损伤指标(ALT、AST)显著升高(如图6B所示)；HE病理结果显示肝细胞坏死、充血(如图6C所示)；免疫组化结果显示，炎症细胞显著升高(如图7A所示)；作为对照组，pIA、DPIA、空载体组(DPIM)治疗后没有显著的治疗效果；PDPIA治疗小鼠后，可以检测到ALT、AST显著降低；HE染色结果表明肝切片鲜红且坏死细胞较少(如图6B，C所示)，免疫组化染色结果表明炎症细胞浸润(中性粒细胞Gr-1+，巨噬细胞F4/80+，T细胞CD3+)显著降低(如图7A所示)；
白介素22发挥其治疗效果的主要机制为白介素22和其受体结并激活STAT3信号通路，进一步产生一系列保护细胞机制，本申请进一步研究PDPIA的作用机制，如图6D所示，PDPIA治疗后可以显著的激活肝脏中STAT3/Erk3通路并产生抗凋亡CyclinD-1，不仅如此PDPIA治疗后还可以显著的激活肝细胞的增殖(Ki67+，如图7B所示，结果证明PDPIA治疗后，自身免疫性肝炎得到显著的改善且明显优于商业转染试剂PAMAM。
实施例7、PDPIA可以显著的抑制ROS产生和线粒体膜电位的崩塌
在炎症因素的刺激下，巨噬细胞可以通过线粒体或NADPH氧化酶2复合体产生活性氧(ROS)，有研究表明多余的ROS可以引起组织损伤和炎症反应，因此ROS的多少需要受到严格的控制；本申请的研究表明刀豆蛋白可以显著的激活肝脏中的ROS(红色)产生，而用PDPIA治疗后多余的ROS得到有效的控制(如图8A所示)；线粒体作为重要的ROS产生的细胞器，功能的好坏决定了肝细胞的凋亡和坏死，本申请用JC-1染料标记线粒体膜电位的情况，红色荧光表示线粒体功能完好，绿色荧光表示线粒体功能损坏，和预期一样，PDPIA可以显著的抑制肝细胞的功能紊乱(如图8B所示)，同时自身免疫性肝炎小鼠经过PDPIA治疗后可以显著的降低p-JNK、iNOS的水平，进一步证明了PDPIA的良好抗肝炎效果。
实施例8、PDPIA治疗未发现副作用和全身系统毒性
副作用的发生和全身性的系统毒性是阻碍纳米基因药物进入临床的最大障碍之一，研究报道指出，纳米粒如QD或胶束容易在心、肝、肺、肾等脏器里聚集，这些非特异性的聚集常常会引起肝、肾等脏器的损伤并引起炎症反应；本申请研究了静脉注射PDPIA后是否能引起副作用和全身系统毒性，如图9A所示，PDPIA不会引起ALT、AST、BUN、Cr水平的升高，说明PDPIA几乎没有肝和肾毒性，同时，小鼠血液系统的炎症因子也没明显升高，且HE染色结果表明，PDPIA对小鼠的各主要脏器没有损伤，实验结果表明，PDPIA作为一类治疗肝脏相关疾病的药物没有显著的副作用和全身系统毒性。

Claims (4)

1.一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物，其特征在于：该纳米基因药物由PAMAM3.0、DSPE-PEG2000、穿膜素为载体，同阴离子治疗基因通过自组装形成的纳米构成；
所述的穿膜素与阴离子治疗基因的质量比为4：1至18：1
所述的PAMAM 3.0与阴离子治疗基因的质量比为2：1；
所述的PAMAM 3.0与DSPE-PEG2000的质量比为10：1
所述的穿膜素的氨基酸序列如RQIKIWFQNRRMKWKKK或RQIKIWFQNRRMKWKK所示；
所述的阴离子治疗基因为siRNA或DNA构成。
2.权利要求1所述的用于肝脏相关疾病的纳米基因药物的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
1）将PAMAM 3.0、DSPE-PEG2000、穿膜素溶解于超纯水中使其充分分散；
2）将治疗基因的水溶液缓慢的滴加入1）所述的溶液中混匀，通过静电吸附作用形成纳米；
3）将步骤2）中的溶液置于37度条件下孵育一个小时，最终形成稳定的纳米基因药物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所制得的纳米基因药物其粒径大小为150nM。
4.权利要求1所述的用于肝脏相关疾病的纳米基因药物在用于制备治疗自身免疫性肝病药物中的用途。
CN201810702649.6A 2018-06-28 2018-06-28 一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途 Active CN110721320B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810702649.6A CN110721320B (zh) 2018-06-28 2018-06-28 一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810702649.6A CN110721320B (zh) 2018-06-28 2018-06-28 一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110721320A CN110721320A (zh) 2020-01-24
CN110721320B true CN110721320B (zh) 2022-11-08

Family

ID=69216822

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810702649.6A Active CN110721320B (zh) 2018-06-28 2018-06-28 一种用于肝脏相关疾病的纳米基因药物及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110721320B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101190335A (zh) * 2006-11-21 2008-06-04 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种纤维化疾病的基因治疗药物
CN103203026A (zh) * 2012-01-14 2013-07-17 复旦大学 Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途
CN103536934A (zh) * 2013-09-06 2014-01-29 苏州大学 一种基于pamam的自组装纳米基因载体复合物及其制备方法
CN106729755B (zh) * 2016-12-31 2020-08-04 中山大学肿瘤防治中心 一种miR-214纳米基因复合物及其制备方法、应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110721320A (zh) 2020-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gu et al. A polyamidoamne dendrimer functionalized graphene oxide for DOX and MMP-9 shRNA plasmid co-delivery
Xue et al. Delivery of microRNA-1 inhibitor by dendrimer-based nanovector: An early targeting therapy for myocardial infarction in mice
Lin et al. Polycation-detachable nanoparticles self-assembled from mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA for in vitro and in vivo siRNA delivery
CN106177975B (zh) 具有不对称膜结构的可逆交联生物可降解聚合物囊泡及其制备方法与在核酸药物中的应用
Sun et al. Codelivery of sorafenib and GPC3 siRNA with PEI-modified liposomes for hepatoma therapy
EP3030244B1 (en) Polyconjugates for delivery of rnai triggers to tumor cells in vivo
CN103764153A (zh) 用于体内核酸递送的聚(丙烯酸酯)聚合物
Cheng et al. The effect of guanidinylation of PEGylated poly (2-aminoethyl methacrylate) on the systemic delivery of siRNA
CN111632153B (zh) 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN107184987B (zh) 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用
CN108143718B (zh) 一种抗肿瘤纳米基因药物及其制备方法和应用
Han et al. pH-Sensitive tumor-targeted hyperbranched system based on glycogen nanoparticles for liver cancer therapy
CN111481679B (zh) siRNA纳米胶囊及其制备方法和应用
Wang et al. A tumor-activatable particle with antimetastatic potential in breast cancer via inhibiting the autophagy-dependent disassembly of focal adhesion
CN110478322A (zh) 一种核酸药物复合物及其制备方法和应用
Liufu et al. Echogenic PEGylated PEI-loaded microbubble as efficient gene delivery system
Bai et al. CXCR4 and CD44 dual-targeted Prussian blue nanosystem with daunorubicin loaded for acute myeloid leukemia therapy
CN107998082A (zh) 一种还原响应聚合物囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
CN111135312B (zh) 一种基于肿瘤泛代谢调控的混合纳米制剂的制备与应用
Shao et al. Tumor-triggered personalized microRNA cocktail therapy for hepatocellular carcinoma
Yang et al. “Star” miR-34a and CXCR4 antagonist based nanoplex for binary cooperative migration treatment against metastatic breast cancer
Zhang et al. Tumor-targeting gene-photothermal synergistic therapies based on multifunctional polydopamine nanoparticles
Peng et al. A double DNAzyme-loaded MnO2 versatile nanodevice for precise cancer diagnosis and Self-Sufficient synergistic gene therapy
CN104725478B (zh) 多肽化合物、多肽化合物与siRNA的组装体及其应用
Lin et al. Water-soluble polymers bearing phosphorylcholine group and other zwitterionic groups for carrying DNA derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant