CN114469861B - 一种可逆转酒精性肝病的维生素e纳米载体的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可逆转酒精性肝病的维生素E纳米载体的构建与应用。本发明所述的纳米制剂载有氯甲基噻唑CMZ和维生素E,用具有内质网趋向性的小分子或多肽修饰该纳米系统以实现载体的内质网靶向,CMZ被递送至肝细胞内质网进行CYP2E1的位点特异性抑制来限制活性氧自由基ROS的产生,同时维生素E中和已有的ROS,从而减轻酒精刺激下肝脏的氧化应激损伤,逆转酒精性肝病。本发明所述的纳米载体可以是纳米乳、脂质体或脂质纳米粒等载药系统,CMZ可由其它CYP2E1抑制剂替代,维生素E可由其它抗氧化成分替代。该纳米制剂通过静脉注射或口服使用,可在CYP2E1表达异常引起的相关疾病中发挥保肝护肝作用。
Description
技术领域
本发明属于制药领域,涉及一种可逆转酒精性肝病的维生素E纳米载体的构建与应用, 是一种能缓解肝细胞氧化应激损伤的纳米载体的构建,以及该纳米载体在酒精性肝病、脂肪 肝、非酒精性脂肪肝、糖尿病和药物中毒等疾病或病理状态下的保肝护肝作用。
背景技术
饮酒是文化和餐桌礼节的重要环节,也是物质精神文明的重要媒介。然而,过量饮酒 是一种上瘾行为,近年来,全球人均饮酒量迅速增加[Nat Rev Dis Primers 4,16(2018)] [Gastroenterology 150,1786-1797(2016)],酒精滥用相关的发病率和死亡率逐年攀升,带来了 沉重的社会和经济负担[W.H.O.Global status report on alcohol andhealth 2018]。
摄入的乙醇可被胃(30%)和小肠(70%)迅速吸收,约2%-10%不经转化从肺呼出 或随尿排出,其余在肝脏进行氧化代谢。不当的饮酒模式几乎会损害机体的所有器官,并与 感染、癌症、心血管疾病和神经系统疾病等的发展息息相关。肝脏是乙醇代谢的主要部位, 也是酒精刺激最主要的损伤位点[J Hepatol 32,113-128(2000)]。慢性和/或过量饮酒被认为是 酒精性肝病(ALD)的主要病因,也是酒精性肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化,甚至 肝硬化发展的重要诱因[Drug Alcohol Rev 29,437-445(2010)]。
目前,ALD的治疗原则主要包括酒精戒断(即戒酒)和营养支持[J Hepatol 65,618-630 (2016)]。其中戒酒是最有效且最基本的措施,主要依靠患者自主的行为约制和/或药物的干预 来纠正不健康的饮酒模式并减少饮酒量[Sci Adv 5,eaax4043(2019)][JAMA 295,2003-2017 (2006)]。例如,阿坎酸、巴氯芬、戒酒硫和纳曲酮等药物可帮助患者建立对饮酒的厌恶反应, 减少对酒精的依赖性,从而治疗酒精使用障碍(AUD)。早期戒酒可以逆转ALD。然而,持 续过量饮酒是一种成瘾性行为障碍,患者很难戒除。另一方面,营养支持是一种辅助性的治 疗手段,主要用于改善ALD相关的继发性营养不良。ALD患者通常伴有肠道菌群紊乱(包 括肠道渗漏和肠道失调)、维生素和核黄素缺乏等病状[Gastroenterology 148,30-36(2015)] [Gut 65,830-839(2016)][Nature 575,505-511(2019)][J Clin Invest 127,2829-2841(2017)]。因 此,使用不可吸收的抗生素、益生菌和营养补剂等改善肠道内稳态和胃肠壁的完整性[Aliment Pharmacol Ther 18,357-373(2003)][Liver Res 1,197-207(2017)][Proc Natl Acad Sci U S A 111, E4485-4493(2014)],或补充透明质酸和维生素B/C/K来促进乙醇代谢等策略也可以缓解ALD。 此外,氧化应激清除剂(包括抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸、维生素E/C和还原型谷胱甘肽)和 炎症抑制剂(包括糖皮质激素和抗肿瘤坏死因子(TNF)或白细胞介素-1(IL-1)的单克隆抗 体)等也被证实在ALD的治疗中部分有效[Cell Mol Immunol 18,73-91(2021)]。然而,营养 支持并不能从根本上逆转持续酗酒造成的器质性损伤。到目前为止,还没有FDA批准的用于 治疗ALD患者的药物或营养疗法[Nat Rev Gastroenterol Hepatol 8,491-501(2011)]。此外,随 着ALD的进一步发展,以上治疗策略在晚期,尤其是酒精性肝纤维化和肝硬化时效果甚微, 肝移植仍然是终末期酒精性肝病患者的救生选择[Alcohol Res 38,147-161(2017)][Immunity 51,573(2019)][Nat Rev Gastroenterol Hepatol 11,300-307(2014)]。然而,肝脏移植受外科手术 的高成本、侵入性、适配移植物短缺等情况的制约[Gut 55,1529-1531(2006)]。因此,迫切 需要一种高效安全的治疗新靶点、新策略,能够在ALD的早期有效逆转肝损伤,避免疾病发 展到难治性和不可逆的晚期状态。
饮酒期间,乙醇的毒性代谢中间产物/代谢物在肝脏大量产生和积累,导致肝氧化应激 水平激增,这是ALD起始和病理性进展的一个重要原因[Alcohol Res Health 27,277-284 (2003)]。实质肝细胞(HCs)是构成肝脏的主体细胞(约占肝脏重量的80%),主要负责乙醇 的代谢和解毒,也是酒精性肝损伤的主要靶点。通常,HCs通过乙醇脱氢酶(ADH)介导的 氧化系统催化乙醇的氧化代谢,此时代谢中间产物/代谢物的产生和清除达到平衡,肝脏处于 稳态。然而,在慢性和/或过量饮酒者中,CYP2E1介导的微粒体乙醇氧化系统(MEOS)逐 渐成为乙醇代谢的主要途径[Biochem Biophys Res Commun 40,858-865(1970)]。CYP2E1是一 种位于滑面内质网(sER)的细胞色素P450单加氧酶,在肝脏,尤其是HCs中大量表达[J Biol Chem 275,17130-17135(2000)]。虽然CYP2E1的催化效率远远低于ADH,但CYP2E1与乙 醇的结合能力是ADH的10倍。此外,CYP2E1受慢性乙醇刺激的高度诱导,可通过增加 CYP2E1的基因转录,mRNA的翻译效率或稳定翻译后蛋白来实现表达上调[JBiochem 110, 559-565(1991)][J Hepatol 36,47-52(2002)],加速乙醇的氧化代谢,导致乙醛和活性氧自由基 (ROS,包括羟乙基自由基、超氧阴离子和羟基自由基等)的堆积[Hepatology 23,155-163 (1996)],打破肝脏氧化还原稳态,诱导肝损伤的发展。乙醛具有高活性和致癌作用,可通过 共价键结合破坏大分子的结构和功能,诱导DNA和蛋白加合物的产生[Nat Rev Cancer 7, 599-612(2007)];而活性氧与蛋白质和不饱和脂质发生二次反应,形成过氧化物[Hepatology 50,453-461(2009)],进一步加剧氧化应激并使肝脏损伤永久化。简单来说,位于内质网的 CYP2E1的活性与酒精诱导的肝损伤呈正相关,并在ALD的发展中起到关键作用。
越来越多的研究显示,基因敲除或药物抑制CYP2E1可有效改善酒精介导的肝损伤[Free Radic Biol Med 49,1406-1416(2010)][J Hepatol 50,572-583(2009)][J PinealRes 68, e12638(2020)],说明CYP2E1可能是ALD的潜在治疗靶点。氯甲基噻唑(CMZ)是一种镇 静、催眠和抗惊厥药,在临床上常用于治疗躁动、不安和失眠。据报道,CMZ是CYP2E1的选择性和有效抑制剂[Drug Metab Dispos 44,1424-1430(2016)],可用于治疗急性酒精戒断 [Experimental Biology and Medicine 224,302-308(2010)]。一项开放、随机的对照临床试验 (EudraCT编号2012-005730-11)首次证实了CMZ可加速ALD患者的早期康复[Gut2021doi: 10.1136/gutjnl-2021-324727]。然而,在用CMZ治疗ALD时,为了避免药物进入其它器官、 组织或亚细胞结构引起的毒副作用(例如,CMZ进入大脑会引起镇静和催眠作用),需要采 用合适的递送系统来装载CMZ并将其递送到肝脏,尤其是HCs的ER中,以实现位点特异 性抑制。然而,抑制CYP2E1虽然可以限制氧化应激的进一步加剧,但对已经产生的ROS无效,因此在治疗中需要联合其它的ROS中和剂/清除剂。
基于以上介绍,目前急需一种可逆转酒精性肝病的生物安全性高的载体材料。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可逆转酒精性肝病的维生素E纳米载体构建方法,具 体步骤如下:
(1)维生素E纳米载体的构建:
本发明所述的纳米载体以维生素E、中链甘油三酯、磷脂酰胆碱、CMZ(氯甲基噻唑)和内质网靶向修饰的脂质作为油相,水溶液或含泊洛沙姆188的水溶液作为水相,通过乳化法制备得到水包油型(O/W)纳米乳。
油相中的维生素E占载体结构脂质总质量的1%-80%,可以是维生素E醋酸酯、琥珀 酸酯或α-生育酚等形式,也可由还原型谷胱甘肽等其它抗氧化成分替代。
油相中的中链甘油三酯和磷脂酰胆碱可以包含或由其他油性成份替代,如大豆油、橄 榄油、硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、角鲨烯等。
油相中的CMZ可由其它CYP2E1(细胞色素P450 2E1)抑制剂替代,包括4-甲基吡唑(Fomepizole)、烯丙基化硫(DAS)和CYP2E1的siRNA(小干扰核糖核酸)等药物。
(2)纳米载体的内质网靶向性修饰:
在步骤(1)纳米乳中掺入具有内质网趋向性的小分子化合物或与脂质化学键合的多肽, 得到具有内质网靶向性的纳米载体,其中,具有内质网靶向作用的成分占总脂质质量的 0.1%-30%。
本发明所述的纳米载体具有内质网靶向能力。通过在维生素E纳米载体中加入具有内 质网趋向性的小分子化合物或与脂质化学键合的多肽,实现该纳米系统在亚细胞结构内质网 的选择性积累。
本发明所述的纳米载体中具有内质网靶向作用的成分占总脂质质量的0.1%-30%,可 以是与内质网受体相互作用的磺酰胺或磺酰脲类合成小分子化合物或含有内质网定位/驻留 序列的多肽分子。
本发明所述的纳米载体中内质网靶向性的磺酰胺或磺酰脲类合成小分子化合物采用 十二烷基苯磺酰胺或N-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺。
本发明所述的纳米载体中内质网靶向性的定位/驻留序列的多肽分子以Pardaxin多肽、 KDEL信号肽或Eriss肽为代表。
本发明所述的纳米载体不限于纳米乳,还可以扩展至脂质体和脂质纳米粒等,分别可通过旋转蒸发-超声法和微流控芯片技术制备。
本发明目的之二是提供所述纳米载体在制备抗酒精性肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪 肝、糖尿病和药物中毒等肝脏疾病或病理状态药物中的应用。这些疾病是由CYP2E1表达异 常引起的肝脏氧化应激损伤所导致。
本发明所构建的纳米载体可同时递送抗氧化剂和CYP2E1抑制剂来限制肝脏氧化损伤。 其中,维生素E等抗氧化剂可以中和已有的ROS(活性氧自由基),而CMZ等CYP2E1抑制剂可限制ROS的进一步产生和放大。
本发明所述的纳米载体可通过静脉注射或口服灌胃给药,静脉注射时通过血液循环到 达肝脏原位发挥作用(直接)或利用肠道-肝脏间的相互交流同时保护胃肠道和肝脏(间接), 从而缓解氧化应激,发挥保肝护肝作用。
本发明所述的纳米载体可用于治疗酒精性肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪肝、糖尿病和 药物中毒等由CYP2E1和氧化应激介导的肝脏疾病或肝功能紊乱。其分子机制为:CYP2E1可代谢内源性底物(如,多不饱和脂肪酸和类固醇)和外源性物质(如,对乙酰氨基酚、乙醇、苯、丙酮和四氯化碳),其表达受多种病理条件诱导,如饮酒、糖尿病、肥胖和高脂饮食。CYP2E1在药物解毒和致癌物代谢中的催化活性需要氧气,从而产生活性氧和有毒代谢物。当活性氧的产生超过细胞的清除阈值时,细胞内稳态被破坏,导致细胞损伤甚至凋亡。因此抑制CYP2E1的过度表达并缓解氧化应激可以解救酒精性肝病、脂肪肝、非酒精性脂肪肝、糖尿病和药物中毒等病理情况。
本发明构建了一类可逆转酒精性肝病的维生素E纳米载体,由生物安全性高、容易获 得且生产成本低的脂质作为主要的载体材料,用具有内质网趋向性的小分子或多肽修饰该纳 米系统以实现载体的内质网靶向,该纳米载体负载CMZ和维生素E,利用维生素E的抗氧化 特性中和已有的ROS,并通过CMZ靶向抑制CYP2E1来限制ROS的进一步产生。这类载体 制备方便、成本低廉、性质稳定,可通过静脉注射或口服灌胃给药,通过随静脉循环到达肝 脏(直接)或利用肠道-肝脏间的相互交流(间接)缓解肝氧化应激,发挥保肝护肝作用,具 有良好的生产和应用前景。
附图说明
图1是p-DBSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳及其对照组乳剂(表1)在透射电子显微镜(TEM)下的形态。
图2是p-DBSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳及其对照组乳剂在4摄氏度下存放一个月的粒径变化。
图3是不同剂量下p-DBSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳及其对照组乳剂处理24 h对不同肝细胞系的活力的影响,用CCK-8细胞活力试剂盒检测。
图4是以肝细胞(AML-12和L-O2)、巨噬细胞(RAW264.7)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模式细胞考察非靶向乳剂DiD@NEs和p-DBSN修饰的内质网靶向乳剂DiD@ER-NEs在 48h内的细胞摄取,利用图像处理软件Image J对图片进行荧光半定量分析。
图5是肝细胞AML-12和L-O2分别受非靶向乳剂NEs和p-DBSN修饰的内质网靶向 乳剂ER-NEs处理6h或12h后代表性的高分辨共聚焦成像图(A)及纳米乳与内质网的共定 位系数(B)。图片显示细胞核(通道1,蓝色)、纳米乳(通道2,红色)、内质网ER(通道 3,绿色)及共定位情况(合并通道1,2,3)。利用图像处理软件Image J对图片进行分析图 像,根据Pearson相关系数计算纳米乳和内质网的共定位系数。比例尺,25μm。
图6是N-DMSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳及其对照组乳剂的粒径、表面电位(A)和细胞毒性(B)。
图7是以肝细胞(AML-12和L-O2)、巨噬细胞(RAW264.7)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模式细胞考察非靶向乳剂DiD@NEs和N-DMSN修饰的内质网靶向乳剂DiD@ER-NEs 在48h内的细胞摄取,利用图像处理软件Image J对图片进行荧光半定量分析。
图8是非靶向乳剂NEs和N-DMSN修饰的内质网靶向乳剂ER-NEs处理肝细胞 AML-12和L-O2分别受6h或12h后代表性的高分辨共聚焦成像图。图片显示细胞核(通道 1,蓝色)、纳米乳(通道2,红色)、内质网ER(通道3,绿色)及共定位情况(合并通道1, 2,3)。利用图像处理软件Image J对图片进行分析图像,根据Pearson相关系数计算纳米乳 和内质网的共定位系数。比例尺,25μm。
图9是Western Blot法考察肝细胞AML-12中CYP2E1和XBP-1s的表达。
图10是免疫荧光染色法考察肝细胞AML-12中炎症转录因子NF-κB(p65)和AP-1(c-JUN)的表达(A-B,B为用Image J图像处理软件对图A进行灰度分析后获得的半定量结果)。
图11是BODIPY 493/503(A)和DCFH-DA(B)染色法检测肝细胞AML-12中脂质 堆积和ROS的产生情况。
图12是ELISA法测定原代肝Kupffer细胞分泌促炎因子TNF-α(A)和IL-1β(B)的 情况以及原代实质肝细胞胞内脂质过氧化物MDA(C)和4-HNE(D)的堆积情况。
图13是各组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)的含量。
图14是各组小鼠的肝脏指数。
图15是ELISA法检测肝脏炎症因子TNF-α(A)和IL-1β(B)和脂质过氧化产物MDA(C)和4-HNE(D)的含量。
图16是各组小鼠肝脏的苏木精-伊红(H&E)、天狼星红染色(Sirius Red)、CYP2E1免疫荧光染色情况。
图17是小鼠静脉注射或口服灌胃的DiR@ER-NEs的组织分布结果,其中A为4、12、24、48h时的小动物活体成像结果;B为48h时小鼠心、肝、肺、脾、肾、胃及十二指肠、 脑的组织分布结果;C是对B中肝和脾的荧光定量结果。
图18是各组小鼠的体重变化情况。
图19是各组小鼠的脾脏、肾脏、胃和十二指肠的H&E切片结果。
具体实施方式
本发明结合附图和实施实例作进一步说明。
实施例1对十二烷基苯磺酰胺(p-DBSN)修饰的维生素E纳米乳的制备与理化性质表征
磺酰类配体与内质网膜上丰富的钾离子通道(磺酰脲受体)具有高度亲和力和特异性 选择,在配体-受体介导的内质网靶向中得到了广泛的研究和应用。在此,使用两种磺酰类配 体制备相应的内质网靶向纳米制剂,即对十二烷基苯磺酰胺(p-DBSN)和N-十二烷基-4-甲 苯磺酰胺(N-DMSN)。
表一:p-DBSN修饰的维生素E纳米乳的处方组成
首先,通过超声乳化法制备载CMZ、p-DBSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs)及其对照纳米乳:NEs(无CMZ非靶向)、CMZ@NEs(载CMZ非靶向) 和ER-NEs(无CMZ靶向)。该制剂处方下的纳米乳在透射电子显微镜(TEM)下呈现典型 的乳剂形态(见图1);粒径约80-180nm,电位约-20mV(动态光散射法检测),且载药乳剂 CMZ的包封率大于80%(紫外分光光度法检测)(见表二);稳定性高且易于储存,在4度存 放一个月粒径无明显变化(见图2);具有较好的生物安全性,在较高给药剂量下处理24h, 对多数肝细胞(包括AML-12,L-O2和小鼠原代肝实质细胞)仍无显著细胞毒性(见图3)。
用荧光探针DiD作为模型药物,分别制备非靶向乳剂DiD@NEs和p-DBSN修饰的内质网靶向乳剂DiD@ER-NEs,考察制剂在肝细胞(AML-12和L-O2)、巨噬细胞(RAW264.7) 和脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的体外摄取情况。荧光倒置显微镜成像结果发现,在48小 时内,两种乳剂在不同细胞系中的摄取逐渐增加,其中细胞对内质网靶向乳剂DiD@ER-NEs 的摄取相比非靶向的DiD@NEs显著更多(见图4),但这种p-DBSN修饰带来的促摄取作用 的潜在机制仍不清楚。同时,高分辨共聚焦成像结果表明,p-DBSN的加入的确促进了纳米 乳的内质网选择性积累,在制剂处理细胞12h时较为显著(见图5),这可能有助于CMZ发 挥位点特异性的CYP2E1抑制作用。
表二:p-DBSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳的粒径、多分散系数(PDI)、表面电位和CMZ的包封率
实施例2N-十二烷基-4-甲苯磺酰胺(N-DMSN)修饰的维生素E纳米乳的制备与理化性质表征
表三:N-DMSN修饰的维生素E纳米乳的处方组成
通过超声乳化法制备载CMZ、N-DMSN修饰的内质网靶向维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs)及其对照组纳米乳NEs、CMZ@NEs和ER-NEs。该制剂处方下的纳米乳 粒径约120-180nm,电位约0到-15mV(动态光散射法检测),使用剂量较高时具有一定细 胞毒性(见图6)。
用荧光探针DiD作为模型药物,分别制备非靶向纳米乳DiD@NEs和N-DMSN修饰的内质网靶向纳米乳DiD@ER-NEs,考察制剂在肝细胞、巨噬细胞和脐静脉内皮细胞中的体外摄取。结果表明,48小时内,这两种乳剂在不同细胞系中摄取逐渐增加,但内质网靶向乳剂和非靶向乳剂的细胞摄取没有显著差异(见图7)。高分辨共聚焦成像结果显示,N-DMSN的加入促进了纳米乳的内质网选择性积累,其中N-DMSN的脂质占比为5%时乳剂的内质网靶向能力高于10%(见图8)。
考虑到相比p-DBSN,N-DMSN修饰的内质网靶向纳米乳的细胞毒性更高,或许需要进 一步优化处方,后续主要采用p-DBSN修饰的乳剂进行实验考察。
实施例3p-DBSN修饰的载药维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs)体外缓解乙醇诱导 的肝细胞应激的考察
用100mM乙醇体外刺激肝细胞(AML-12)12h,加入不同的乳剂(1mL培养液对应 加入10μL乳剂)继续培养24h,随后用western bolt法考察细胞氧化应激关键蛋白CYP2E1 和内质网应激响应蛋白XBP-1s的表达(见图9),或用免疫荧光染色法考察炎症转录因子 NF-κB(p65)和AP-1(c-JUN)的表达(见图10)。结果表明乙醇刺激可显著上调CYP2E1、 XBP-1s和炎症转录因子的表达,而维生素E纳米乳,尤其是载药的CMZ@NEs和 CMZ@ER-NEs可显著抑制乙醇刺激下这些应激相关蛋白的高表达,说明具有较好的应激缓 解能力。
用100mM乙醇体外刺激肝细胞(AML-12)12h,加入不同浓度(100μL培养液对应 加入0、0.1、0.5、1或2μL乳剂)的四种乳剂(NEs、ER-NEs、CMZ@NEs和CMZ@ER-NEs) 继续培养24h,随后分别用BODIPY 493/503染料和DCFH-DA染料对细胞染色,考察肝细 胞脂质堆积和ROS产生的情况。结果表明,在一定使用浓度下(100μL培养液对应加入0.5、 1或2μL乳剂),纳米乳的后处理可有效抑制乙醇刺激下肝细胞的脂质堆积和氧化应激,其 中载CMZ的内质网靶向纳米乳表现最佳(见图11),显示出优异肝保护作用。
肠源性内毒素激活肝Kupffer细胞并大量释放以TNF-α和IL-1β为主的促炎细胞因子是 酒精性肝病发病机制中的重要中间环节。用Percoll密度梯度分离液分离原代肝细胞以及单核 细胞,用相应的肝细胞培养液和巨噬细胞培养液分别培养至细胞贴壁。用100ng/mL LPS刺 激原代肝Kupffer细胞24h或用100mM乙醇刺激原代肝实质细胞24h,随后加入不同乳剂 (1mL培养液对应加入10μL乳剂)继续培养48h,用ELISA试剂盒分别检测Kupffer细胞 的培养液中促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌情况以及实质肝细胞胞内的脂质过氧化物4- 羟基壬醛(4-HNE)和丙二醛(MDA)的堆积情况(见图12)。结果表明,载CMZ的维生素 E纳米乳,尤其是内质网靶向修饰的载药纳米乳CMZ@ER-NEs,可显著抑制LPS刺激下肝Kupffer细胞分泌炎症因子的能力,并限制乙醇刺激下肝实质细胞胞内脂质过氧化产物的堆积, 说明该乳剂在肠道-肝脏的器官间交流相关的促酒精性肝损伤的通路中也有良好的保护作用。
实施例4p-DBSN修饰的载药维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs)缓解小鼠慢性酒精 性肝病的考察
ICR小鼠分别用Lieber De Carli(LD)酒精饲料(3.5%乙醇)或对照饲料(不含乙醇, 相同热量)喂食30天,作为ALD小鼠和正常小鼠使用。其中,ALD小鼠分组(n=4)如下:
造模完成后不再饮酒:生理盐水组、ER-NEs(静脉注射i.v.)组、CMZ@ER-NEs(i.v.)组、CMZ@ER-NEs(口服灌胃oral)组。
造模完成后持续喂养LD酒精饲料:ER-NEs(i.v.)+EtOH组、CMZ@ER-NEs(i.v.)+EtOH组、CMZ@ER-NEs(oral)+EtOH组。
从第31天起,通过静脉注射或口服灌胃对小鼠给药4次,每次间隔5天(每次给药前小鼠禁食12小时,CMZ使用剂量为50mg/(kg,body weight))。最后一次给药后的第三天, 处死所有小鼠,收集血清用于肝功能相关的生化指标的评估,包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天 冬氨酸转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)(见图13)。同时,取出肝脏称重,计算肝脏指数(肝 脏指数=(肝脏重量/体重)×100%)(见图14)。然后,取部分肝脏研磨,超声破碎细胞,离 心后分离上清,通过ELISA试剂盒检测肝脏炎症因子(TNF-α和IL-1β)和脂质过氧化产物 (MDA和4-HNE)的含量(见图15)。另一部分肝脏通过苏木精-伊红(H&E)和天狼星红 染色(SiriusRed)观察肝脏组织病理学特征,并通过免疫荧光染色分析肝脏原位CYP2E1的 表达(见图16)。结果表明,慢性饮酒诱导肝损伤,与肝功能受损相关的指标(包括血清ALT, AST和TG、肝脏指数、肝炎症因子和脂质过氧化产物、肝脂质堆积、肝纤维化、肝原位CYP2E1 的表达)均显著提高,尤其是在持续摄入酒精饮食的小鼠中,而载药乳剂能显著缓解酒精性 肝损伤,其中以静脉给药的载CMZ、内质网靶向维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs,i.v.)的 保肝护肝作用最佳,在持续饮酒时仍然具有较好的治疗效果。
实施例5p-DBSN修饰的载药维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs)的生物安全性考察
用疏水荧光染料DiR作为模型药物标记纳米乳ER-NEs来评估不同给药途径下纳米制 剂的生物分布。ICR小鼠禁食12h(只能自由饮水),随后静脉注射或口服灌胃(200μL)DiR@ER-NEs。在给药后第6、12、24和48h分别用小动物活体成像系统观察制剂的在体分 布情况。在48h时处死小鼠,收集主要器脏(心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和大脑) 进行荧光成像观测以进一步考察纳米乳的组织分布(见图17)。结果表明,静脉注射的纳米 乳在给药后48h内主要积聚在肝脏,在脾脏有部分分布。而口服灌胃的纳米乳可通过胃肠道 快速代谢排泄(4-12h),48h后几乎完全从体内排出。这两种给药方式下,小鼠脑中几乎没 有观察到任何制剂的荧光信号,这或许能减少CMZ非特异性组织分布引起的不良副作用, 包括镇静和催眠作用。
在酒精性肝病小鼠模型中,通过监测小鼠体重的变化可以发现,给药乳剂(尤其是静 脉给药的CMZ@ER-NEs),可显著缓解因长期饮酒导致的小鼠体重骤降,说明具有一定的系 统性保护作用(见图18)。由于在生物分布实验中观察到部分静脉给药的乳剂堆积在小鼠脾 脏,因此对脾脏进行了组织切片观察,同时考察了另一个重要的代谢器官肾脏(负责药物的 肾脏代谢)的组织病理学特征(见图19)。H&E切片结果显示,各组小鼠的脾脏和肾脏均未 见病理损伤,说明小鼠对纳米乳的组织积累和体内代谢具有良好的耐受性,CMZ@ER-NEs 在两种给药途径下均表现出高度的生物相容性。
乙醇具有一定的促渗作用,过量饮酒会破坏胃肠道的完整性,导致刺激性胃炎和肠炎。 通过H&E染色考察小鼠胃和十二指肠的组织形态发现,持续饮酒组小鼠的胃壁和肠壁显著变 薄,出现粘膜受损和组织形态破坏,而造模完成后不再饮酒的小鼠显示出正常的胃和肠结构, 可能是在戒酒期间通过机体自主的恢复作用和/或药物的保护作用重构了胃肠道的稳态。尽管 静脉注射的CMZ@ER-NEs整体显示出最优的保肝护肝效果,这种给药方式对胃和肠没有显 著的保护作用。相反,口服给药的CMZ@ER-NEs具有良好的胃肠组织保护作用,可能是通 过在胃肠道表面形成保护层,同时原位释放药物,抑制局部ROS,从而减少酒精刺激下的胃 肠道损伤(见图19)。这些结果说明了载CMZ的内质网靶向维生素E纳米乳(CMZ@ER-NEs) 在静脉注射和口服给药下均可减轻慢性饮酒导致的组织损伤,或许可以为治疗酒精性肝功能 异常或肝脏疾病提供一定指导。
Claims (2)
1.一种可逆转酒精性肝病的维生素E纳米载体在制备治疗酒精性肝病药物中的应用,其特征在于,所述疾病是由CYP2E1表达异常引起的肝脏氧化应激损伤所导致,所述的维生素E纳米载体通过以下方案获得:
(1)维生素E纳米载体的构建:
以维生素E、中链甘油三酯、磷脂酰胆碱、氯甲基噻唑和内质网靶向修饰的脂质作为油相,水溶液或含泊洛沙姆188的水溶液作为水相,制备水包油型纳米乳,其中维生素E占载体结构脂质总质量的1%-80%,所述油相中的维生素E为醋酸酯、琥珀酸酯或α-生育酚形式,或由还原型谷胱甘肽其它抗氧化成分替代;
(2)纳米载体的内质网靶向性修饰:
在步骤(1)纳米乳中掺入具有内质网趋向性的小分子化合物或与脂质化学键合的多肽,得到具有内质网靶向性的纳米载体,其中,具有内质网靶向作用的成分占总脂质质量的0.1%-30%。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(1)所述的纳米载体包括纳米乳、脂质体或脂质纳米粒。
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