KR101437885B1 - Ｐｃｒ 기반의 유전자 전달체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자를 세포독성 없이 효과적으로 세포 내로 전달하기 위한 유전자 전달체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 중성 리포좀으로 이루어진 외피; 및 상기 외피에 의해서 한정되는 내부 공간에, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 기반의 유전자 전달체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포독성 없이 유전자 로딩 효율이 향상된 유전자 전달체 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

ＰＣＲ 기반의 유전자 전달체 및 그 제조방법 {Gene delivery carrier based on PCR and method for preparing the same}
본 발명은 유전자를 세포독성 없이 효과적으로 세포 내로 전달하기 위한 유전자 전달체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
지난 수십 년간에 걸쳐서, 지질 수용기로 구성되며 마이크로 및 나노 크기를 갖는 생반응기 (bioreactor)는 기초 생명과학 분야에서 세포의 기원을 이해하기 위한 필수적인 도구로서 주목할 만한 관심을 받아왔다. 리포좀은 그 형태 및 구조에 있어서 세포막과 매우 유사하기 때문에, 리포좀 기반의 전구세포 (protocell) 시스템은 폐쇄된 생체 구획 내에서 복잡한 생화학적 반응 네트워크를 수행하도록 폭 넓게 연구되고 있다.
최근에, 전구세포용으로서 몇몇 리포좀 기반의 모델들이 보고된 바 있으며, 이들은 광합성, 게놈 복제, 및 단백질 합성과 같은 다양한 생화학 반응들을 성공적으로 수행하는 것으로 보고된 바 있다. 예를 들어, Luisi 등은 DNA 증폭이 PCR 기술을 통해서 리포좀 내부에서 발생될 수 있다는 사실을 보고한 바 있다. 상기 연구에서는 고온 (95℃) 하에서 리포좀을 안정화시키고 DNA 산물의 일체성을 유지하면서 리포좀 내부에서 PCR 활성을 증가시키기 위한 몇몇 중요한 패러미터들 및 조건들을 확립하였다.
생화학적 반응들의 구획화는 또한 진단 및 치료를 포함하는 생체공학적 응용에 있어서도 유용할 것으로 기대되고 있다. 거대 소포 (giant vesicle) 기반의 생반응기 (직경 > 1 ㎛)에 비해서, 특히 나노 크기 전구세포 시스템 (이하, '나노팩토리'도 동일한 의미로 사용된다)은 생활성 분자들의 약제학적 약물 개발에 대해서 더욱 많은 기회 및 혜택을 가져다줄 수 있는데, 이는 이러한 시스템이 단일 세포 수준으로 더욱 용이하게 접근할 수 있기 때문이다. 리포좀 기반의 나노팩토리는 DNAs, RNAs 및 단백질을 포함하는 다양한 생활성 분자들을 국소적으로 증폭시킬 수 있기 때문에, 다량의 치료적 산물들이 이러한 전구세포 기술을 사용하여 폐쇄된 소포 내로 로딩될 수 있다. 확실히, 캡슐화된 생체 물질들은 세포외 환경에서 보호성 지질 장벽을 통해서 보호되며 안정화된다. 이러한 높은 안정성으로 인해서, 리포좀은 다양한 치료제의 체계적인 투여를 위한 전도유망한 캐리어 시스템으로서 광범위하게 연구되어 왔다.
한편, 최근까지 리포좀 내에서 올리고핵산을 합성하기 위한 몇몇 접근 방법들이 보고된 바 있으나, 이러한 연구들은 주로 생명의 기원을 연구하기 위한 것들이었으며, 중성 지질을 유전자 전달 시스템으로 사용하여 제조된 PCR 기반의 나노팩토리를, 특히 인 비보 적용을 위해서, 사용한 연구는 보고된 바가 없다. 일반적으로, 리포좀을 포함하는 통상적인 유전자 전달체는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 플라스미드 DNA (pDNA) 및 소규모 방해성 RNA (siRNA)와 같은 음이온성 유전 약물들을 효과적으로 로딩하기 위해서 강한 양이온 전하를 갖는다. 유전자 전달체들의 양이온성 표면 전하는 또한 음이온성 세포막들과의 상호작용을 강화시킴으로써, 세포 흡수를 증가시키기도 한다. 그러나, 불행하게도, 이러한 양이온성은 또한 세포막의 불안정화를 야기하며, 심각한 세포독성을 야기한다. 그러므로, 양이온 전하를 함유하는 유전자 전달체는 기본적으로 세포독성 문제로부터 자유로울 수 없으며, 이는 그들의 임상적 적용에 있어서 해결해야 할 중요한 과제이기도 하다.
관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2007-36055호는 약물 전달에 유용한 리포좀을 개시하고 있으며, 구체적으로는 치환된 암모늄 및/또는 다중음이온을 함유하고, 목적하는 치료제 또는 영상화 물질을 함유하는 리포좀 조성물을 개시하고 있으나, 리포좀 내에서 PCR 반응 등을 통한 올리고핵산 합성용 리포좀에 관해서 개시하고 있지는 않다.
따라서, 본 발명에서는 세포독성 문제를 야기하지 않으면서도, DNA 로딩 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 유전자 전달체 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,
중성 리포좀으로 이루어진 외피; 및
상기 외피에 의해서 한정되는 내부 공간에, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 기반의 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 중성 리포좀은 양이온 전하를 나타내지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 중성 리포좀은 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 PCR 기반의 유전자 전달체는 상기 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 형광 염료는 SYBR Green I 염료일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 PCR 기반의 유전자 전달체는 50 내지 1000 nm의 직경을 갖는 구형일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 외피 표면에 항체, 앱타머 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성 표적 잔기들이 부착될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 두 번째 과제를 해결하기 위해서,
건조 지질을 유기용매 중에 혼합하고 상기 유기 용매를 증발시킴으로써 지질 필름을 제조하는 단계;
상기 지질 필름을, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 용액 중에 수화 및 분산시킴으로써 다중벽 소포체를 제조하는 단계;
상기 다중벽 소포체의 모폴로지를 안정화시킨 후, 동결 및 해동을 반복하여 분쇄함으로써 거대 단일벽 소포체를 제조하는 단계;
상기 거대 단일벽 소포체를 필터에 통과시킴으로써 그 크기를 균질화시키는 단계; 및
상기 균질화된 거대 단일벽 소포체에 대하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 기반의 유전자 전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 건조 지질은 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 균질화 단계 이후에 DNA 분해효소를 더 첨가해줄 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 균질화 단계 이후에 상기 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 첨가해줄 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 동결 및 해동은 5 내지 30 사이클 반복 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 필터는 직경 0.1 내지 0.8 ㎛의 기공을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 PCR 반응은
i) 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 배양하는 단계; 및
ii) 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양한 후, 50 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 단계를 포함하며,
상기 ii) 단계는 10 내지 40회 반복 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 PCR 반응은
i) 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 배양하는 단계; 및
ii) 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양한 후, 50 내지 70℃에서 10초 내지 5분 배양하고, 60 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 단계를 포함하며,
상기 ii) 단계는 10 내지 40회 반복 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포독성 없이 유전자 로딩 효율이 향상된 유전자 전달체 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 유전자 전달체의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 유전자 전달체에 있어서, 중성 리포좀을 구성하는 성분들의 일 예로서, 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)의 화학식을 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명에 따른 유전자 전달체에 있어서, PCR 증폭 이전과 이후의, DLS에 의해서 측정한 입자 크기 분포 그래프 (삽입도면은 CryoTEM 영상)이다.
도 3b는 본 발명에 따른 유전자 전달체에 있어서, 20회의 PCR 열적 사이클을 수행하기 이전 (1)과 이후 (2)에 대한 사진이다.
도 3c는 본 발명에 따른 유전자 전달체 내에서 증폭된 선형 DNA 올리고머들에 대한 아가로오스 겔 영상이다 (1: PCR 혼합된 리포좀, 2: pDNA 주형을 갖는 PCR 증폭된 리포좀, 3: pDNA 주형을 갖지 않는 PCR 증폭된 리포좀).
도 3d는 본 발명에 따른 유전자 전달체 내에서 DNA를 증폭하기 위해서 사용된 주형 플라스미드 DNA 및 프라이머 서열을 나타낸 도면이다.
도 3e는 본 발명에 따라서 증폭된 선형 DNA 올리고머들을 Lipo2K를 사용하여 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션시킨 후, 48시간이 경과된 시점에서, 트랜스펙션된 세포들을 관찰한 사진들이다.
도 4a는 본 발명에 따른 유전자 전달체 농도에 따른 세포 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 다양한 DNA 제제로 트랜스펙션된 이후의 CHO-K1 세포들의 유전자 트랜스펙션 효율을 나타낸 그래프이다.
도 4c는 다양한 DNA 제제로 eGFP 유전자 트랜스펙션된 세포들에 대한 대표적인 형광 현미경 영상들이다.
도 5a 내지 5e는 2가지 다른 DNA 로딩 기술에 대한 비교분석 데이터로서, 5a는 아가로오스 겔 영상이다.
도 5b는 CHO-K1 세포들에서의 유전자 트랜스펙션 효율 (1 및 2: 수성 상 중에서 일반적 PCR 증폭 이후에 중성 리포좀들 중에서 선형 DNA 올리고머들의 캡슐화, 3 및 4: 본 발명에 따른 유전자 전달체를 통한 중성 리포좀 내에서의 DNA 증폭, 한편, 1 및 3은 DNA 로딩된 리포좀들을 DNase로 처리하지 않았으며, 2 및 4는 DNase로 처리하였음. M은 DNA 크기 마커)을 나타낸 그래프이다.
도 5c 내지 5e는 DsRed2를 표적 유전자로서 포함하는 본 발명에 따른 유전자 전달체의 인 비보 유전자 발현을 관찰한 사진이다.
본 발명에서는 리포좀 기반의 전구세포 (protocell) 시스템을 사용하여 PCR 반응을 기반으로 한 유전자 전달체를 제조하고자 하였으며, 특히 세포막 불안정화 또는 세포독성 등의 문제를 전혀 야기하지 않으면서도, 효율적인 유전자 로딩이 가능한 유전자 전달체를 제공하고자 한다.
이를 위해서, 본 발명은 중성 리포좀으로 이루어진 외피; 및 상기 외피에 의해서 한정되는 내부 공간에, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 기반의 유전자 전달체를 제공한다.
도 1에는 본 발명에 따른 유전자 전달체의 개략도가 도시되어 있다. 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 유전자 전달체는 중성 리포좀으로 이루어진 외피의 내부 공간에 PCR 증폭 반응에 있어서 증폭 대상이 되는 주형 DNA (template DNA), PCR 증폭 반응을 촉매하기 위한 중합효소 (polymerase), 중합효소에 의한 증폭 반응의 원료 기질이 되는 dNTP 및 중합반응의 개시를 위한 프라이머가 포함된 구조를 갖는다.
상기 중성 리포좀은 양이온 전하를 나타내지 않는 것임이 바람직한데, 이는 전술한 바와 같이, 양이온 전하를 갖게 되는 경우 세포막의 불안정화를 야기하며, 심각한 세포독성을 야기하는 문제점이 있기 때문이다.
구체적으로, 이러한 중성 리포좀은 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함하는 중성 리포좀일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 PCR 기반의 유전자 전달체는 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 포함할 수 있는데, 이 경우, DNA-형광 염료 복합체에 의한 형광 발광으로 인해서, 유전자 전달체의 인 비트로 및/또는 인 비보 모니터링이 가능해지는 장점이 있으며, 형광 염료의 구체적인 예로는 SYBR Green I 염료 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예로부터도 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 PCR 기반의 유전자 전달체는 50 내지 1000 nm의 직경을 갖는 구형의 형상을 가지며, 구체의 외피 표면에는 항체, 앱타머 및 펩티드와 같은 다양한 활성 표적 잔기들을 부가하여 중성 리포좀들의 표면을 변형시킴으로써, 인 비트로 및 인 비보에서 트랜스펙션 효율을 더욱 향상시키는 것도 가능하다.
한편, 본 발명은 또한 상기 PCR 기반의 유전자 전달체의 제조방법을 제공하며, 이는, 건조 지질을 유기용매 중에 혼합하고 상기 유기 용매를 증발시킴으로써 지질 필름을 제조하는 단계; 상기 지질 필름을, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 용액 중에 수화 및 분산시킴으로써 다중벽 소포체를 제조하는 단계; 상기 다중벽 소포체의 모폴로지를 안정화시킨 후, 동결 및 해동을 반복하여 분쇄함으로써 거대 단일벽 소포체를 제조하는 단계; 상기 거대 단일벽 소포체를 필터에 통과시킴으로써 그 크기를 균질화시키는 단계; 및 상기 균질화된 거대 단일벽 소포체에 대하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 건조 지질은 전술한 바와 같이, 양이온 전하를 갖지 않는 중성 지질로서, 구체적으로는 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)의 혼합물을 예로 들 수 있다.
또한, 상기 균질화 단계 이후에는 DNA 분해효소가 더 첨가될 수도 있는 바, 이는 원치 않는 DNA 올리고머들이 리포좀 외부에서 증폭될 가능성을 배제하기 위함이며, 구체적인 DNA 분해효소로는 DNase I 등을 예로 들 수 있다.
또한, 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달체의 인 비트로 및/또는 인 비보 모니터링을 위해서는, 상기 균질화 단계 이후에 상기 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 첨가해줄 수도 있다.
한편, 상기 동결 및 해동 과정은 지질 필름을 PCR 용액 중에 수화 및 분산시킴으로써 형성된 다중벽 소포체 (multilamellar vesicles, MLVs)를 거대 단일벽 소포체 (large unilamellar vesicles, LUVs)로 분쇄하기 위한 과정으로서, 동결 과정은 액체 질소 등을 사용하여, 해동 과정은 지질의 전이 온도 이상으로 가열해 줌으로써 수행될 수 있고, 5 내지 30 사이클 반복 수행될 수 있다. 이러한 동결 및 해동 과정의 사이클 수가 5 사이클 미만인 경우에는 충분한 정도로 다중벽 소포체를 분쇄할 수 없다는 문제점이 있고, 30 사이클을 초과하는 경우에는 다중벽 소포체가 대부분 분쇄되므로 그 이상의 동결 및 해동 과정은 무의미하다.
이어서, 제조된 거대 단일벽 소포체는 다양한 크기를 갖는 소포체들의 혼합물 형태로 존재하므로, 필터를 이용한 여과 과정을 통해서 크기의 균질화를 도모하는 것이 바람직한데, 이때 사용되는 필터는 직경 0.1 내지 0.8 ㎛의 기공을 포함할 수 있다. 필터의 직경이 0.1 ㎛ 미만인 경우 대부분의 소포체들이 필터를 통과하지 못하여 거대 단일벽 소포체의 수율이 너무 낮아진다는 문제점과, 만들어진 소포체들의 크기가 너무 작다는 문제점이 있고, 0.8 ㎛를 초과하는 경우에는 매우 다양한 크기의 소포체들이 필터를 통과하여 원하는 크기 균질화를 도모할 수가 없다는 문제점이 있기 때문에 바람직하지 않다.
마지막으로, PCR 반응을 수행하기 위한 반응물들이 중성 리포좀 내부에 담지된 형태의 거대 단일벽 소포체가 제조된 다음에는, 상기 소포체 내부에서 PCR 반응을 수행함으로써 리포좀 내부의 DNA를 증폭시키는 과정이 수행된다. 이때, PCR 반응의 조건은, 예를 들면, 먼저 상기 거대 단일벽 소포체를 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 동안 1회 배양한 다음, 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양하는 과정과, 50 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 과정을 10 내지 40회 반복 수행하는 조건일 수 있다. 또 다른 형태로서, 상기 PCR 반응의 조건은, 예를 들면, 먼저 상기 거대 단일벽 소포체를 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 동안 1회 배양한 다음, 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양하는 과정, 50 내지 70℃에서 10초 내지 5분 배양하는 과정, 및 60 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 과정을 10 내지 40회 반복 수행하는 조건일 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이다.
재료
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리스아민로다민 B 술포닐) 암모늄 염 (DOPE-Rhod), 콜레스테롤 (CHOL)은 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)로부터 구입하였다. 주형 플라스미드 DNA (pCMV-EGFP, pCMV-DsRed2, pGL3-Luciferase)는 Clontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA)와 Promega (Madiso, WI, USA)로부터 구입하였다. DNA 프라이머는 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. HiPiTM 열안정성 DNA 중합효소 및 DNase I은 각각 ElpisBio (Daejeon, Korea) 및 Takara (Kyoto, Japan)로부터 구입하였다. SYBR Green I 염료 및 LipofectamineTM2000은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. 겔 추출 키트 및 PCR 정제 키트는 Qiagen (Chatsworth, CA, USA)으로부터 구입하였다. 평균 분자량 25 kDa을 갖는 분지형 폴리에틸렌이민 (BPEI)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 모든 다른 화학 물질들은 분석급이었으며, 더 이상의 정제 없이 사용하였다.
PCR 용액
PCR 용액 (1 ml)은 탈이온수 (720 μl), PCR 완충용액 (10x HiPiTM 완충용액, 100 μl), dNTP 혼합물 (TE 완충용액, 100 μl 중의 각각의 2 mM dNTP), 21-mer 프라이머들 (5'-Cy5 형광 염료 변형, 각각 10 μM, 20 μl), 플라스미드 DNA 주형 (10 nM, 20 μl), HiPiTM 열안정성 DNA 중합효소 (1 U μl-1, 20 μl), 및 0.5 x SYBR Green I 염료 (상업적 제품을 TE 완충용액 중에 10,000 x로 희석, 10 μl)를 포함하였다.
리포좀의 제조 ( 나노팩토리 시스템)
필름 하이드레이션 방법을 사용하여 리포좀을 제조하였다. 건조 지질을 하기 조성으로 유리 바이알 내의 클로로포름 중에 혼합하였다 (DPPC:CHOL:DOPE-Rhod = 13:6:1 몰비율, 지질의 총량은 2 μmole/샘플). 유기 용매를 회전 증발기에 의해서 증발시킴으로써 유리 바이알 벽 상에 얇은 지질 필름을 적층시켰다. 지질 필름은 밤새도록 동결건조시킴으로써 미량의 잔류 유기 용매를 제거하였으며, 교반 혼합에 의해서 PCR 용액 (1ml) 중에 수화 및 분산시켰다. 가볍게 피펫 조작을 한다음, PCR 시약들을 캡슐화하는 다중벽 소포체를 형성하였고 (multilamellar vesicles, MLVs), 이러한 MLVs 분산액을 실온에서 30분 동안 방치함으로써 MLVs의 모폴로지를 안정화하였다. MLVs를 거대 단일벽 소포체 (large unilamellar vesicles, LUVs)로 분쇄하기 위해서, 동결 (액체 질소) 및 해동 (지질의 전이 온도 이상으로)을 10 사이클 반복하였다. 리포좀의 크기는 사출에 의해서 균질화하였는데, 이는 200 nm 기공을 갖는 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 10배의 샘플을 통과시킴으로써 수행하였다. 0.5 x SYBR Green I 염료를 함유하는 1 x PCR 완충용액 중의 0.002 U/μl의 DNase I을 상기 리포좀 분산액에 첨가함으로써 리포좀 외부의 DNA 주형 및 프라이머들을 분해하였다 (5 분, 실온).
열적 사이클링의 프로토콜
나노팩토리 시스템은 하기 열적 조건 하에서 열적 순환기 ((Veriti
Figure 112012099062913-pat00001
thermal cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 처리하였다: 94℃에서 2분, [94℃에서 15초 및 68℃에서 1.5분] x 20 사이클.
리포좀의 특성화 ( 나노팩토리 시스템)
리포좀의 모폴로지는 극저온 투과 전자현미경 (cryo-TEM)을 사용하여 관찰하였다. 각각의 샘플은 다공성-카본 격자 상에 지지된 박형 수성 필름으로 제조되었다. Cryo-TEM 영상들은 대략 -170℃의 온도에서 200 kV Tecnai F20 (FEI, Netherlands)을 사용하여 얻었다. 리포좀의 평균 직경, 크기 분포 및 표면 전하는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK)를 사용하여 결정하였다.
증폭된 선형 DNA 올리고머의 검출
PCR-혼합된 리포좀 분산액 및 PCR-증폭된 리포좀 분산액을 96-well 플레이트 상으로 옮기고, PCR에 의한 DNA의 증폭을, FITC 및 TRITC에 세팅된 특수 C-마운트 렌즈 및 필터를 구비한 12-bit CCD 카메라 (Kodak Image Station 4000 MM, New Haven, CT, USA)로 형광에 의해서 분석하였다.
리포좀 분산액의 증폭된 선형 DNA 올리고머를 하기 단계에 의해서 회수하였다. 150 μl의 TE-포화된 페놀-클로로포름-iso-아밀알코올 (25/24/1, v/v/v) 혼합물을 DNase I 처리 (150 μl) 이후에 PCR-증폭된 리포좀 분산액에 첨가하고, 증폭된 선형 DNA 올리고머들을 함유하는 완충용액으로부터 지질 및 효소들을 제거하였다. 결과물인 수성 용액 중의 증폭된 선형 DNA 올리고머들을 제조사 프로토콜에 따라서 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 올리고머들을 아가로오스 겔 (1.0 %) 전기영동법에 의해서 분석하였다.
세포 배양
중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hamster Ovary cells, CHO-K1, ATCC, Manassas, VA, USA로부터 구입)를, 37℃, 가습 5% 이산화탄소 분위기 중의, 10% 우태아 혈청 (FBS; Welgene, Daegu, Korea), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (Welgene, Daegu, Korea)으로 보충된 DMEM (Welgene, Daegu, Korea) 중에 보관하였다.
증폭된 선형 DNA 올리고머에 대한 유전자 발현 테스트
증폭된 선형 DNA 올리고머들은 겔 추출 키트 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 정제하였고, LipofectamineTM2000 (Lipo2k)을 포함하는 DNA 복합체를 제조사 프로토콜에 따라서 제조하였다. CHO-K1 세포들을 35 mm 유리-바닥 접시에, 2 ml 무혈청 배지 중 5 x 104 세포의 밀도로 접종하고, 60% 컨플루언스 (confluence)에 도달하도록 배양하였다. 배양 배지는 Lipo2k를 포함하는 DNA 복합체를 함유하는 2 ml의 트랜스펙션 (transfection) 배지로 치환하였고, 이어서 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다음으로, 트랜스펙션 배지를 신선한 완전 DMEM 배지 (10% FBS)로 치환하였으며, 세포들을 48시간 동안 성장시켰다. 배양 이후에, 세포들을 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하고, 포름알데히드-글루타르알데히드 조합 고정제로 실온에서 15분 동안 고정시켰으며, 이후 DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 염색하여 핵을 표지하였다. 모든 세포 영상들은 IX81-ZDC 포커스 드리프트 보상 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었다
나노팩토리 시스템의 세포 흡수
CHO-K1 세포들을 35 mm 유리-바닥 접시에 접종하고, 60-80% 컨플루언스가 될 때까지 배양하였다. 이어서, 세포들을 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하여 잔류 배양 배지를 제거하였다. 세포들을 나노팩토리 시스템으로 200 μg/ml의 농도에서, 37℃, 2ml 무혈청 배지 중에서 4시간까지 배양하였다. 이어서, 세포들을 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 포름알데히드-글루타르알데히드 조합 고정제로 실온에서 15분 동안 고정한 다음, DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 염색하여 핵을 표지하였다.
세포독성 분석
본 발명에 다른 나노팩토리 시스템의 세포독성을 MTT 분석법에 의해서 평가하였다. CHO-K1 세포들을 96-웰 플레이트 중에 웰 당 5 x 103 세포의 초기 밀도로 200 μl의 완전 배지 중에서 접종하였다. 24시간 경과 후, 배지를 200 μl의 신선한 완전 배지로 치환하고, 여기에 BPEI (25 kDa), LipofectamineTM2000 (Lipo2k) 또는 본 발명에 따른 나노팩토리 시스템을 첨가함으로써 전달체 농도가 1 μg/ml 내지 200 μg/ml가 되도록 하였다. 24시간 동안 배양한 다음에, 25 μl의 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드) (MTT) 시약 (배지 중 5 mg/ml)을 각각의 웰에 첨가하고, 광이 없는 상태에서, 세포들을 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다음으로, 200 μl의 DMSO를 각각의 웰에 첨가하였다. 570 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (VERSAmax™,Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
인 비트로 유전자 트랜스펙션
대조를 위해서, Lipo2k와의 DNA 복합체를 제조사의 프로토콜에 따라서 제조하였으며, BPEI (25 kDa)를 N/P 비율 20/1로 제조하였다. CHO-K1 세포들을 35 mm 유리-바닥 접시 상에, 2 ml 무혈청 배지 중의 5 x 104 세포의 농도로 접종하고, 60% 컨플루언스가 될 때까지 배양하였다. 배양 배지를 BPEI, Lipo2k, 및 본 발명에 따른 나노팩토리 시스템 (100 ng 주형 플라스미드 DNA에 해당)을 함유하는 2 ml의 트랜스펙션 배지로 치환한 다음, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 트랜스펙션 배지를 신선한 완전 DMEM 배지 (10% FBS)로 치환하고, 세포들을 48시간 동안 배양하였다. 배양 이후에, 세포들을 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하고, 포름알데히드-글루타르알데히드 조합 고정제로 실온에서 15분 동안 고정시켰다.
정량분석은 하기와 같이 수행하였다: 세포들을 6-웰 플레이트 상에 2 mL 배지 중의 5 x 105 세포 밀도로 접종하고, 60-80%의 컨플루언스가 될 때까지 배양하였다. 배양 배지를 BPEI, Lipo2k, 및 본 발명에 따른 나노팩토리 시스템 (100 ng 주형 플라스미드 DNA에 해당)을 함유하는 2 ml의 트랜스펙션 배지로 치환한 다음, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 트랜스펙션 배지를 신선한 완전 DMEM 배지 (10% FBS)로 치환하고, 세포들을 48시간 동안 배양하였다. 세포들을 PBS (pH 7.4)로 세척하고, 세포 용균 (lysis) 완충용액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 용균시켰다. 총 가용성 단백질 농도는 바이신코니닉산 (bicinchoninic acid, BCA) 단백질 분석법 (Pierce, IL, USA)에 의해서 결정하였다. 샘플들의 형광 강도는 형광 스펙트로미터 (Hitachi F-7000, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 형광 강도는 BCA 분석법에서 결정된 단백질 함량으로 나눔으로써 정규화하였다. PCR 기반 나노팩토리를 통해서 향상된 중성 리포좀의 향상된 DNA 로딩 용량을 평가하기 위해서, 동일한 방법을 사용하였다.
결과 및 고찰
본 발명에서는, pDNA 주형, 그리고 중합효소, 프라이머 및 dNTP들을 포함하는 PCR 성분들을 캡슐화하고 있는 나노 크기의 리포좀을 제공한다. 상기 리포좀은 필름 수화 (film hydration) 및 동결-해동 방법에 이은 사출 과정을 수행한 다음, 직후에 통상적인 20 PCR 사이클을 수행함으로써 제작하였다 (도 1).
인 비트로 및 인 비보 각각에서 외래 유전자의 발현을 가시화하기 위해서, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP), 적색 형광 단백질 (DsRed2) 및 인광 발현 효소 단백질 (Luciferase)을 리포터 표적 유전자로 사용하였다. 각각의 표적 pDNA 주형을 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC) (도 2)로 구성되는 중성 리포좀 내에 로딩하였다.
PCR-기반의 나노팩토리를 제작하기 위해서, 먼저 전술한 양친매성 물질들의 혼합물로 구성된 지질 필름을 수화시키고, pDNA 주형, 중합효소, 프라이머 및 dNTP들을 포함하는 PCR 용액으로 분산시켰다. 특히, 제작된 표적 DNA 올리고머를 PCR 증폭 이후에 SYBR Green I 염료/DNA 복합체로부터의 형광을 통해서 가시화하기 위해서 SYBR Green I 염료를 PCR 용액 중에 포함시켰다.
10회에 걸친 동결-해동 사이클을 통해서 거대 단일벽 소포체를 제조한 이후에는, 리포좀들의 불균질한 집합체를 직경 200nm를 갖는 셀룰로오스 아세테이트 막 필터를 통해서 통과시킴으로써 균질한 리포좀 집합체를 얻었다. 또한, 원치 않는 DNA 올리고머들이 리포좀 외부에서 증폭될 가능성을 배제하기 위해서, 외부 수성상 중에 잔류하는 pDNA 주형을 DNase I 분해를 통해서 제거하였다.
DNA 증폭 이후에, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리는 입자 크기에 있어서 150 내지 250nm를 갖는 구형 리포좀 형태를 나타내었다 (도 3a). 이러한 리포좀들의 형태 및 크기는 PCR 증폭 이전과 이후에 별 다른 차이가 없었으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리가 고온 PCR 단계 동안에 안정적으로 유지될 수 있다는 점을 의미하는 것이다.
한편, 속이 빈 리포좀들은 중성 표면 전하를 나타내었지만, pDNA 주형을 캡슐화하고 PCR 반응을 수행한 이후에는, 결과물인 리포좀들이 약간 음의 표면 전하를 나타내었는데 (각각 ζ-포텐셜 = - 3 내지 8 및 - 3 내지 10 mV), 이는 아마도 리포좀 표면으로 스며든 음이온성 pDNA 때문인 것으로 판단된다.
이러한 결과는 중성 리포좀-DNA 조성을 사용한 본 발명의 PCR 기반 나노팩토리가 반대 전하와 정전기적 상호작용 없이 양이온성 전하를 함유하지 않는다는 점을 뒷받침한다. 그러나, 중성 리포좀은 전하-전하 상호작용이 존재하지 않기 때문에 DNA 포획 효율이 자연스럽게 감소한다. 따라서, 중성 지질은 독성을 나타내지 않는다는 장점이 있지만, DNA 로딩 효율이 낮다는 단점이 존재한다.
그러므로, 본 발명에서는 PCR 증폭을 통해서 리포좀 내부에서 DNA 농도를 증가시키고자 하였으며, 이러한 DNA 농도 증가는 중성 리포좀의 DNA 로딩 효율성 저하를 극복하는 방안이 될 수 있다. PCR 방법에 의한 DNA 올리고머들의 증폭은 SYBR Green I 염료/DNA 복합체로부터의 형광 신호를 사용하여 확인할 수 있었다. PCR을 수행한 이후에 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리는 강한 녹색 형광을 나타내었으며 (도 3b), 이러한 사실로부터 DNA 단편들이 본 발명에 따른 인공 세포 모델 중에서 성공적으로 증폭되었음을 알 수 있다.
더 나아가, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리로부터 제조된 DNA 단편들의 정확한 길이를, 아가로오스 겔 전기영동법을 사용하여 조사하였다 (도 3c). CMV 프로모터 및 eGFP/DsRed2 또는 SV40 프로모터 및 Luciferase 유전자 서열을 포함하는 pDNA 주형에 기초하여 증폭된 DNA 올리고머들은 통상적으로 고안된 프라이머 (도 3d)를 사용한 일반적인 PCR 증폭 조건 하에서 1.6 kb의 길이를 갖는 것으로 예상되었으며, 실제로, 결과물로서 1.6 kb 길이의 선형 DNA 산물이 얻어졌다.
또한, 리포좀 내부에서 증폭된 DNA 산물들은 DNase 분해 이후에도 여전히 잔류하였지만, 일반적인 PCR 증폭을 통해서 제조된 DNA 올리고머들은 DNase 처리 동안 완전히 분해되었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 나노팩토리 기법에 의해서 증폭된 DNA 올리고머가 혈액 조건 중에서 혈청 안정성을 유지할 수 있도록 한다는 사실을 뒷받침한다.
증폭된 선형 DNA 올리고머들의 유전자 발현 능력을 검증하기 위해서, 이들을 통상적인 유전자 전달체인 LipofectamineTM2000 (Lipo2K)을 사용하여 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간이 경과된 시점에서, 트랜스펙션된 세포들에서 강한 녹색 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 증폭된 DNA 올리고머에 의해서 유전자 발현이 유도되었음을 확실히 보여주는 것이다 (도 3e).
또한, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리를 유전자 치료법에 적용가능한지를 평가하기 위해서, 그 세포독성 및 인 비트로 유전자 전달 효율을 PCR 증폭 이전 및 이후에 대해서 평가하였다. 비교 자료로는, BPEI 및 Lipo2K와 같은 통상적인 양이온 유전자 전달체들을 사용하였다.
예상한 대로, 통상적인 트랜스펙션 전달체인 BPEI 및 Lipo2K는 CHO-K1 세포들에 대해서 심각한 세포독성을 나타내었으며 (IC50 수치: 각각 5 내지 10 및 10 내지 15 ㎍/mL, 도 4a 참조), 이는 주로 그들의 강한 양이온 전하 때문인 것으로 판단된다. 반면에, PCR 증폭이 있거나 또는 없는 중성 지방 기반의 리포좀들은 매우 높은 전달체 농도에서도 (≥200 ㎍/mL) 무시할 만한 수준의 세포독성을 나타내었다. 상기 결과들은 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 시스템의 우수한 안전성을 보여주는 것으로서, 이는 그 중성 특성에 기인한 것으로 판단된다.
또한, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리의 인 비트로 유전자 트랜스펙션 효율을, GFP 유전자를 포함하는 pDNA 주형을 사용하여 CHO-K1 세포들 내에서 평가하였다 (도 4b 및 4c). 사전혼합물-리포좀 제제 (premixture-liposome formulation)의 경우에는 매우 약한 녹색 형광 신호를 나타내었으며, 이는 비록 표적 유전자들의 함량이 효율적인 트랜스펙션을 하기에는 명백히 불충분함에도 불구하고, 리포좀-포획된 pDNA 주형으로부터 야기된 신호인 것으로 보인다. 그러나, PCR 증폭 이후에는, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리에 의해서 트랜스펙션된 세포들은 분명한 녹색 형광을 나타내었다.
흥미롭게도, 본 발명에 따른 나노팩토리는 높은 수준의 트랜스펙션 효율을 나타내었는데, 이는 통상적인 트랜스펙션 수단인 PBEI 및 Lipo2K에 상응하는 수준이었다. 이러한 사실은, 중성 리포좀들의 트랜스펙션 효율 강화는 pDNA 주형이 아닌, 증폭된 선형 DNA 올리고머들에 의해서 야기된다는 사실을 의미한다. 구체적으로, PCR 혼합물, PCR 증폭된 리포좀들, BPEI 및 Lipo2K의 상대적 형광 강도 수치는 각각 40 내지 70, 820 내지 930, 920 내지 1100 및 1100 내지 1150이었다. 비록 양이온성 지질 전달체들이 높은 트랜스펙션 효율을 지닌 유전자 전달체로서 잠재적 성능을 갖는 것으로 보이지만, 전술한 바와 같이 세포독성 문제로 인하여 그 임상적 적용에는 분명한 제한점이 있다.
PCR 기반의 나노팩토리를 통한 중성 리포좀의 향상된 DNA 로딩 효율을 분석하기 위해서, 표적 DNA 분자들이 PCR 증폭 이전 및 이후에 중성 리포좀들 내부로 로딩된 경우에, 2개의 다른 DNA 캡슐화 방법의 트랜스펙션 효율에 대한 효과를 직접적으로 비교하였다 (도 5a 및 5b 참조).
예상한 대로, 수성 상에서 PCR 증폭 이후에 얻어진 DNA 산물들을 나중에 캡슐화한 경우에 비해서, PCR 기반의 나노팩토리 제제가 훨씬 더 높은 DNA 로딩 효율을 나타내었다. 반대 전하를 갖는 분자들의 정전기적 상호작용이 존재하지 않기 때문에, 증폭된 DNA 산물들은 중성 리포좀들 내부로 효과적으로 캡슐화되지 않았으며 리포좀 외부에 존재하였고, 이는 DNA 올리고머들의 효소적 분해에 의해서 신속하게 분해되었다. 그러나, 리포좀 내부에서 증폭된 DNA 분자들은 심지어 DNase 공격 이후에도 온전한 상태로 남을 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 방법이, 독성을 갖는 양이온성 지질 없이도, 음으로 대전된 DNA 약물들을 중성 리포좀들 내부로 캡슐화함에 있어서, 종래 통상적인 리포좀 트랜스펙션 방법에 비해서 더욱 효과적이라는 점을 명백히 보여준다. 결과적으로, 표적 DNA 캡슐화 방법에 따라서 유전자 트랜스펙션 효율에 있어서 큰 차이가 있었다. 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 시스템 (840 내지 920)은 상대 형광 강도에 있어서 증폭된 DNA 올리고머들을 중성 리포좀 내에 나중에 캡슐화한 경우 (130 내지 360)에 비해서 4배 증가된 수치를 나타내었으며, 이러한 수치는 DNA 로딩 효율과 밀접하게 연관된 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 기법은 음으로 대전된 DNA 약물들을 중성 리포좀들 내에 효과적으로 캡슐화하는 대안적 접근 방법이 된다는 사실을 알 수 있다.
마지막으로, 본 발명에서는 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 시스템에 대한 인 비보 유전자 발현을 평가하였다. 인 비보 평가를 위해서, 본 발명에서는, A549 세포들을 피하주사함으로써 양쪽 옆구리에 종양을 갖는 이종이식 마우스 모델을 제조하였다. 이어서, PCR 기반의 나노팩토리를 종양내부주사에 의해서 하루에 한 번씩 2일 동안 오른쪽 종양에 투여하였으며, 반면에 왼쪽 종양에는 대조군으로서 식염수를 주사하였다. 종양에서의 나노팩토리 시스템에 대한 인 비보 유전자 발현은 인광 (luminescence)에 의해 관찰하였다 (도 5c 및 5d 참조). 종양 조직들에 대한 형광 현미경 영상들을 관찰한 결과, PCR 기반의 나노팩토리의 경우에는 강한 적색 형광이 관찰되었다 (도 5e 참조).
종합하면, 본 발명에서는 안전한 유전자 전달 시스템으로서 PCR 기반의 나노팩토리를 개발하였다. 몇몇 주형 플라스미드 DNA가 리포좀 내부에서 PCR에 의해서 증폭될 수 있으며, 로딩된 유전자들의 함량은 큰 폭으로 증가하였다. 껍질 리포좀은 양이온 전하를 띄지 않는 중성 지질들로 구성된다. 결과적으로, 본 발명에 따른 시스템은 다른 통상적인 양이온성 유전자 전달체들과는 달리 비독성이었다. 또한, CHO 세포들에서 관찰되는 강한 GFP 발현으로부터, 증폭된 유전자들이 성공적으로 세포들에 트랜스펙션된다는 사실을 알 수 있었다.
그러므로, 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 시스템은 종래 유전자 전달체의 임상적 적용에 있어서 가장 큰 걸림돌이었던 독성 문제를 극복할 수 있다. 더 나아가, 항체, 앱타머 및 펩티드와 같은 다양한 활성 표적 잔기들을 부가하여 중성 리포좀들의 표면을 변형시킴으로써, 인 비트로 및 인 비보에서 본 발명에 따른 PCR 기반의 나노팩토리 시스템의 트랜스펙션 효율을 더욱 향상시키는 것도 가능하다.

Claims (15)

  1. 중성 리포좀으로 이루어진 외피; 및
    상기 외피에 의해서 한정되는 내부 공간에, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는, 150 내지 250 nm의 직경을 갖는 구형의, PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중성 리포좀은 양이온 전하를 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중성 리포좀은 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형광 염료는 SYBR Green I 염료인 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 외피 표면에 항체, 앱타머 및 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성 표적 잔기들이 부착된 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체.
  8. 건조 지질을 유기용매 중에 혼합하고 상기 유기 용매를 증발시킴으로써 지질 필름을 제조하는 단계;
    상기 지질 필름을, 주형 DNA와, 상기 주형 DNA를 PCR 반응에 의해서 증폭하기 위한 중합효소, dNTP 및 프라이머를 포함하는 PCR 용액 중에 수화 및 분산시킴으로써 다중벽 소포체를 제조하는 단계;
    상기 다중벽 소포체의 모폴로지를 안정화시킨 후, 동결 및 해동을 반복하여 분쇄함으로써 거대 단일벽 소포체를 제조하는 단계;
    상기 거대 단일벽 소포체를 필터에 통과시킴으로써 그 크기를 150 nm 내지 250 nm로 균질화시키는 단계; 및
    상기 균질화된 거대 단일벽 소포체에 대하여 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 건조 지질은 콜레스테롤, 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC)의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 균질화 단계 이후에 DNA 분해효소를 더 첨가해주는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 균질화 단계 이후에 상기 PCR 반응에 의해서 증폭된 DNA 산물과 결합하는 형광 염료를 더 첨가해주는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 동결 및 해동은 5 내지 30 사이클 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 필터는 직경 150 nm 내지 250 nm의 기공을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 PCR 반응은
    i) 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 배양하는 단계; 및
    ii) 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양한 후, 50 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 ii) 단계는 10 내지 40회 반복 수행되는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 PCR 반응은
    i) 90 내지 100℃에서 0.5 내지 5분 배양하는 단계; 및
    ii) 90 내지 100℃에서 10초 내지 3분 배양한 후, 50 내지 70℃에서 10초 내지 5분 배양하고, 60 내지 80℃에서 10초 내지 5분 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 ii) 단계는 10 내지 40회 반복 수행되는 것을 특징으로 하는 PCR 기반의 유전자 치료용 유전자 전달체의 제조방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017039074A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 한국과학기술원 금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1656234B (zh) * 2002-03-20 2012-02-01 创新生物公司 包囊化核酸扩增反应混合物的微胶囊及其作为反应隔间进行平行反应的用途
WO2005014810A1 (ja) * 2003-08-08 2005-02-17 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology ダンベル型ｄｎａの効率的な製造方法
US20060159738A1 (en) * 2004-12-14 2006-07-20 Applera Corporation Cationic liposomes and methods of use
CA2588442A1 (en) * 2004-12-14 2006-06-29 Transave, Inc. Lipid particles comprising bioactive agents, methods of preparing and uses thereof
US9795693B2 (en) * 2008-09-10 2017-10-24 Koninklijke Philips N.V. Drug carrier providing MRI contrast enhancement
US8802138B2 (en) * 2009-10-12 2014-08-12 Jessie L.-S. Au Methods and compositions for improved deliver, expression or activity of RNA interference agents

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
M. TAMURA et al, Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicles, The royal society of chemistry, 2011, Vol. 7, pp. 3750-3753 *
M. TAMURA et al, Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicles, The royal society of chemistry, 2011, Vol. 7, pp. 3750-3753*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017039074A1 (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 한국과학기술원 금 나노입자의 광열효과를 이용한 효율적인 세포내 유전자 전달방법

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