CN116270534A - 一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，该类脂质纳米颗粒按质量百分比计，组分如下可电离两亲性聚合物30～80％，辅助脂质5～60％，生物稳定增强剂5～40％，所述的可电离两亲性聚合物是由头部富含胺基的聚合物与尾链含疏水烃基的脂质通过加成反应得到，所述辅助脂质为类固醇或类固醇与永久阳离子脂质的混合，所述生物稳定增强剂为聚乙二醇化脂质。本发明的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，是基于可电离两亲性聚合物，用于递送治疗药物时，通过调节聚合物自身的固有特性实现了核酸药物在受试生物体内的组织选择性递送，而不需要使用生物分子靶向技术或改变材料本身外助剂组分。

Description

一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，属于生物医药领域。
背景技术
基因治疗作为一种新型的疾病治疗方式，在治疗遗传性疾病、癌症以及开发疫苗等方面被广泛应用。基因治疗的基本原理是将功能性的正常基因导入目标细胞中，对异常基因进行纠正或补偿缺陷进而实现疾病治疗。目前，常用于基因治疗的核酸药物主要包括质粒DNA(pDNA)、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)及GRISPR-Cas9基因编辑系统等。与小分子药物和抗体类药物相比，核酸药物表现出显著优势，例如作用范围广、对细胞内外均可发挥调节作用、易于设计等。然而，目前核酸药物的发展仍面临重重障碍：1)分子量比较大且常带负电荷使其无法顺利通过细胞膜导致细胞摄取效率低；2)稳定性差，易被体内外的酶降解；3)具有免疫原性，被免疫系统识别后激发免疫反应；4)进入生物体内后易被肝脏肾脏清除；5)进入细胞后内涵体逃逸效率低。因此，研发安全高效的递送载体以弥补核酸药物的固有缺陷对于实现基因疗法至关重要。
近年来，各种天然或合成材料形成的纳米颗粒，如脂质及类脂质、聚合物、多肽、蛋白质、细胞外囊泡和无机纳米粒子等，已被设计用于核酸药物的体内外递送。其中，基于脂质及类脂形成的纳米颗粒(LNP)由于具备良好的生物相容性、低免疫原性以及易于批量制备等优势，目前已被广泛用于核酸药物体内外递送并对其优化方案进行了深入研究。最近，辉瑞和Moderna研发的基于LNP的COVID-19mRNA疫苗获得使用许可，这再次引起了研究者们对LNP作为基因递送载体的关注，成为目前最热门的递送系统。此外，聚合物及其衍生物形成的纳米颗粒因易于合成已成为核酸药物体内外递送载体的重要组成部分。用于基因递送的聚合物应易于在体内降解且不会产生有毒成分。其中，线型或支状聚乙烯亚胺(PEI)是一种广泛用于体内外核酸递送的经典阳离子聚合物，可以单独使用也可以通过修饰提高转染效率，例如：TarN3C10，DD90-C12-122和氨基聚酯(APE)在联合其他脂质后能够将mRNA传递到体内并达到理想的转染效率和安全性结果。
基于核酸药物的治疗方式在应对遗传病、癌症、传染病以及其他疾病方面有着光明的应用前景，目前在相关技术上也实现了一定的突破。然而，在基因递送、脱靶和免疫原性这些关键问题上依旧存在重大挑战。在基因递送方面，与其他递送方式相比，基于纳米颗粒的各种制剂介导的转染表现出明显的优势，例如易于制造，不同批次重复性好，良好的生物相容性，能够增强核酸药物在体内的稳定性进而提高药物的生物利用度等，尤其是脂质纳米颗粒已成为最先进的核酸非病毒递送系统之一。然而，目前核酸药物递送系统面临的一个巨大挑战是其组织选择性。已研发的常用纳米颗粒通过静脉注射后倾向于在肝脏中聚集，最终被肝细胞吸收，易被肝脏清除，导致效果变弱，虽然已有研究解决了易被肝脏清除的难题，但均是采用联合生物靶向分子或者调节助剂组分来实现核酸药物的组织选择性递送。
因此，设计优化纳米递送系统，在不使用生物分子靶向技术或不改变材料本身外助剂组分的前提下，将核酸药物通过全身递送后选择性地转移至非肝脏组织，是当前的一个难题。
发明内容
为克服当下核酸药物递送系统的局限性，无法实现体内组织选择性递送，尤其是需要借助联合生物靶向分子或者调节助剂组分，完成全身递送后的组织选择性富集与转染的难题，本发明提供一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，所述的类脂质纳米颗粒按质量百分比计，是由如下组分组成：
可电离两亲性聚合物30～80％，辅助脂质5～60％，生物稳定增强剂5～40％，
所述的可电离两亲性聚合物是由头部富含胺基的聚合物与尾链含疏水烃基的脂质通过加成反应得到，所述辅助脂质为类固醇或类固醇与永久阳离子脂质的混合，所述生物稳定增强剂为聚乙二醇化脂质。
根据本发明优选的，头部富含胺基的聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)。
进一步优选的，聚乙烯亚胺(PEI)为线性PEI(LPEI)或支状PEI(BPEI)。
最为优选的，聚乙烯亚胺(PEI)为支状PEI(BPEI)。
根据本发明优选的，聚乙烯亚胺(PEI)的分子量为0.3kDa-20kDa。
进一步优选的，聚乙烯亚胺(PEI)的分子量为0.3kDa-10kDa。
根据本发明优选的，尾链含疏水烃基的脂质为丙烯酸酯、丙烯酰胺或环氧化物。
进一步优选的，尾链含疏水烃基的脂质为丙烯酸酯，丙烯酸酯为含直链烷基尾链的丙烯酸酯，直链烷基碳原子数为C1～C18。
最为优选的，直链烷基碳原子数为C10～C14。
根据本发明优选的，所述的可电离两亲性聚合物是由头部富含胺基的聚合物与尾链含疏水烃基的脂质通过加成反应得到，尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比为0.1-14:1。
进一步优选的，尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比为6-12:1。
尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比越高，可电离两亲性聚合物的修饰度越高，不同修饰度可电离两亲性聚合物得到的类脂质纳米颗粒作用及效果不同。
根据本发明优选的，加成反应为80℃-100℃，反应时间为24-72小时。
进一步优选的，加成反应为85℃-95℃，反应时间为48-72小时。
根据本发明优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、岩皂甾醇、豆甾醇、麦角固醇或豆甾烷醇。
根据本发明优选的，永久阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)或1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(DOTMA)。
根据本发明优选的，当辅助脂质为单独的类固醇时，类固醇的质量百分比为5～20％。
根据本发明优选的，当辅助脂质为类固醇与永久阳离子脂质的混合物时，类固醇的质量百分比为5～20％，永久阳离子脂质的质量百分比为5～40％。
根据本发明优选的，单独的类固醇与类固醇、永久阳离子脂质的混合物中类固醇的用量相同。
根据本发明优选的，聚乙二醇化脂质选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000(DMG-PEG)、d-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯(TPGS)、2-豆蔻酸锡酰-3-磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000(DMPE-PEG)、L-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DPPE-PEG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-聚乙二醇2000(DPG-PEG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-聚乙二醇2000(DSG-PEG)。
本发明选自的各种聚乙二醇化脂质均为现有技术，参见文献：Surface De-PEGylation Controls Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery In Vitro and InVivo，Xi Zhu等。
根据本发明优选的，聚乙二醇化脂质为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG)或1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000(DMG-PEG)。
根据本发明优选的，所述的类脂质纳米颗粒按质量百分比计，是由如下组分组成：
可电离两亲性聚合物36～58％，辅助脂质10～40％，生物稳定增强剂18～38％。
上述组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤如下：
1)将可电离两亲性聚合物、辅助脂质和生物稳定增强剂溶解在有机溶剂中，形成脂质预混液，
2)将脂质预混液滴加到缓冲液中，形成类脂质纳米颗粒。
根据本发明优选的，所述有机溶剂为无水乙醇。
根据本发明优选的，所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5.2-7.2。
根据本发明优选的，有机溶剂的用量为溶解量。
根据本发明优选的，缓冲液的用量为使所得混合物为胶状分散体。
上述组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的应用，用于递送治疗药物。
根据本发明优选的，所述治疗药物为小分子、蛋白和核酸其中的一种或几种混合。
根据本发明优选的，所述治疗药物为核酸。
根据本发明优选的，核酸选自反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)、规律成簇间隔短回文重复序列(GRISPR)相关核酸、单向导RNA(sgRNA)以及质粒DNA(pDNA)。
根据本发明优选的，具体应用方法如下：
将治疗药物与上述类脂质纳米颗粒混合，形成类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物，将类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物施用至生物体上，在生物体内实现递送，进行生物组织选择性富集并发挥效用。
根据本发明优选的，治疗药物与类脂质纳米颗粒的质量比为1：(0.5-50)。
进一步优选的，治疗药物与类脂质纳米颗粒的质量比为1：(7-15)。
根据本发明优选的，所述施用方式包括静脉注射、肌肉注射、鼻腔吸入、口服、皮下注射、气管给药。
本发明的类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物可在心、肝、脾、肺、肾生物体组织上选择性富集并发挥效用。
本发明的技术特点及优点：
1、本发明的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，是基于可电离两亲性聚合物，用于递送治疗药物时，通过调节聚合物自身的固有特性实现了核酸药物在受试生物体内的组织选择性递送，而不需要使用生物分子靶向技术或改变材料本身外助剂组分。
2、本发明的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，无需采用联合生物靶向分子或者调节助剂组分来实现核酸药物的组织选择性递送，不容易被肝脏清除，在肝脏富集可以发挥效用以抑制肝纤维化的发展。
3、本发明的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，实现核酸药物在受试生物体内的组织选择性递送的关键是尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比，特定的摩尔比范围内，得到的类脂质纳米颗粒中可电离两性聚合物具有不同的选择性，在其高修饰度时容易携带核酸药物在肝脏富集并发挥效用以抑制肝纤维化的发展，而在低修饰度时更倾向于将核酸药物递送至肺部并发挥效用以抑制肿瘤的肺部转移。
4、本发明尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比为6-10:1，可电离两亲性聚合物的修饰度低，低修饰度可电离两亲性聚合物得到的类脂质纳米颗粒对肺选择性强，高选择的富集在肺部用以抑制肿瘤的肺部转移。
5、本发明能够激发核酸药物递送领域的进一步突破，促进基因疗法等多种创新治疗模式的开发。
附图说明
图1为具有不同疏水碳链修饰度的可电离两亲性聚合物的核磁氢谱图。
图2A、2B、2C为类脂质纳米颗粒的制备流程图、外观图、表征图。图2A为类脂质纳米颗粒的制备流程示意图；图2B为类脂质纳米颗粒的外观图，图2C类脂质纳米颗粒的物理化学性质表征，a为水合粒径，b为ζ电势，c为多分散系数，d为形貌图。
图3A和3B为实验例1、实验例2类脂质纳米颗粒-核酸复合物在体外对Hela细胞的转染效果图。图3A为类脂质纳米颗粒-增强绿色荧光蛋白mRNA(mEGFP)复合物在体外对Hela细胞的转染效率，其中包括荧光显微镜成像及流式细胞仪定量分析；图3B为类脂质纳米颗粒-靶向增强绿色荧光蛋白mRNA的siRNA(siEGFP)复合物在体外对Hela-EGFP细胞的基因敲除效率，其中包括荧光显微镜成像图片及流式细胞仪定量分析。
图4A-4D为实验例3静脉注射后类脂质纳米颗粒-mRNA复合物在体内各组织中选择性的富集与转染效果图，其中，类脂质纳米颗粒被DiR或DiO荧光染料标记。图4A为静脉注射DiR标记的类脂质纳米颗粒-mRNA复合物6小时后，小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的离体荧光成像图片及其定量分析；图4B为静脉注射类脂质纳米颗粒-荧光素酶mRNA(mLuc)复合物6小时后，小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的离体生物发光成像图片及其定量分析；图4C为静脉注射DiO标记的类脂质纳米颗粒-mRNA复合物6小时后，用荧光标记的抗体对肺组织中的三种细胞(内皮细胞、表皮细胞、免疫细胞)进行标记，并用流式细胞仪对上述三种细胞进行荧光定量分析；图4D为静脉注射DiR标记的类脂质纳米颗粒-(mLuc+siTie2)和DiR标记的类脂质纳米颗粒-(mLuc+siItgb1)复合物6小时后，小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的离体荧光成像图片及其定量分析和肺的基因敲除定量分析，其中，siTie2和siItgb1分别为肺内皮细胞和肺表皮细胞中特异性基因的siRNA。
图5A-5C为实验例3静脉注射后类脂质纳米颗粒-siRNA复合物在体内各组织中选择性的富集与基因敲除效果图，其中，类脂质纳米颗粒被DiR或DiO荧光染料标记。图5A为静脉注射DiR标记的类脂质纳米颗粒-siRNA复合物4小时后，小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的离体荧光成像图片及其定量分析；图5B为静脉注射类脂质纳米颗粒-siRNA复合物48小时后，小鼠肝和肺的基因敲除定量分析，其中所述siRNA为特异性siRNA，包括肺内皮细胞中特异性基因的siRNA(siTie2、siCD31)、肺表皮细胞中特异性基因的siRNA(siItgb1)、肝细胞中特异性基因的siRNA(siF7)；图5C为静脉注射DiO标记的类脂质纳米颗粒-siRNA复合物4小时后，用荧光标记的抗体对肺组织中的三种细胞(内皮细胞、表皮细胞、免疫细胞)进行标记，并用流式细胞仪对上述三种细胞进行荧光定量分析；
图6A-6B为类脂质纳米颗粒-功能性siRNA复合物对肿瘤的肺转移模型及肝纤维化模型的治疗效果图。图6A为对静脉注射黑色素瘤细胞(B16F10)诱导的肿瘤肺转移模型进行持续性静脉注射肺选择性类脂质纳米颗粒-siCD31复合物一段时间后，检测肿瘤肺转移的抑制效果，其中包括肺部图片及其表面黑色素瘤的定量以及小鼠体重变化曲线；图6B为对腹腔注射CCl4诱导的肝纤维化模型进行持续性静脉注射肝选择性类脂质纳米颗粒-siCol1α1复合物一段时间后，检测肝纤维化的抑制效果，其中包括对目标基因的敲除效率进行定量分析以及肝组织中胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫组化结果分析。
图7A-7B为类脂质纳米颗粒-核酸复合物在体内外的生物相容性。图7A为不同浓度下类脂质纳米颗粒-核酸复合物在体外对Hela细胞活性的影响；图7B为在实现有效转染的浓度下类脂质纳米颗粒-核酸复合物对体内各组织的病理学影响。
具体实施方式
以下内容为结合具体实施例对本发明进行的进一步阐述，但本发明并不局限于以下所述实例。
实施例1
可电离两亲性聚合物的制备方法，步骤如下：
将分子量为0.6kDa的支状PEI与含12个碳原子直链烷基尾链的丙烯酸酯分别以1：6、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12的摩尔比混合，在90℃且避光条件下，加热搅拌48小时，将所得粗产物在无水乙醇中透析，烘干除去乙醇，得到不同疏水链修饰度的聚合物并将其命名为nC12，其中n表示丙烯酸酯与PEI的摩尔比。将所得聚合物进行核磁氢谱分析并计算烷基链的修饰度，不同的丙烯酸酯与PEI的摩尔比得到的聚合物修饰度见下表1所示：
表1
Figure BDA0003995947590000081
不同可电离两亲性聚合物的核磁氢谱图如图1所示。
实施例2
组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，制备流程如图2A所示，步骤如下：
将实施例1制得的不同可电离两亲性聚合物nC12、辅助脂质胆固醇及生物稳定增强剂DSPE-PEG2000分别以58％、14％、28％的质量比例混合，然后溶解在无水乙醇中，得到脂质预混液，将该预混液滴加至pH为5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液中，形成胶状分散体(如图2B所示)，得到6种不同类脂质纳米颗粒，将其命名为nC12-NP。
类脂质纳米颗粒的表征见图2C所示，所得复合物为球形结构，其水合粒径在100nm-230nm范围内且较为均一，此外，其ζ电势均为正值。
实施例3
将实施例2制得的6种不同类脂质纳米颗粒nC12-NP分别与mRNA以15：1的质量比混合，形成类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物，得到6种不同组织选择性递送核酸药物用复合物。
实施例4
将实施例2制得的6种不同类脂质纳米颗粒nC12-NP分别与siRNA以7.5：1的质量比混合，形成类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物，得到6种不同组织选择性递送核酸药物用复合物。
实验例1
将实施例3得到的6种不同复合物按mRNA 0.4μg/ml的用量与Hela细胞共同孵育，其中所述mRNA确定为mEGFP，在37℃的二氧化碳培养箱中共同孵育24小时后，并做空白对照，用荧光显微镜观察EGFP在Hela细胞中的表达并用流式细胞仪进行定量分析。结果如图3A所示，说明复合物对Hela细胞的转染效率随烷基链修饰度的增加而增强，尤其是10C12-NP、11C12-NP、12C12-NP相应的三个复合物表现出优异的转染效率。
实验例2
将实施例4得到的6种不同复合物按siRNA 50nM的用量与Hela-EGFP细胞共同孵育，其中所述siRNA确定为siEGFP，在37℃的二氧化碳培养箱中共同孵育48小时后，并做空白对照，用荧光显微镜观察Hela-EGFP细胞中EGFP的敲除并用流式细胞仪进行定量分析。结果如图3B所示，说明该复合物对Hela-EGFP细胞中EGFP的敲除效率随烷基链修饰度的增加而增强，尤其是10C12-NP、11C12-NP、12C12-NP相应的三个复合物表现出优异的基因敲除效率。
实验例3
依据实验例1的结果，选取实施例2中所得10C12-NP和12C12-NP所对应的复合物，按mRNA0.2μg/g的用量通过静脉注射注入小鼠体内，注射完成6h后观察复合物在小鼠各组织中的选择性富集与转染。图4A中所示类脂质纳米颗粒已被DiR标记，通过对主要器官进行离体荧光成像，观察复合物在小鼠体内的组织选择性富集。明显地，在肝部，12C12-NP/mRNA复合物的富集量明显高于10C12-NP/mRNA复合物，而在肺部，10C12-NP/mRNA复合物的富集量则明显高于12C12-NP/mRNA复合物。图4B中所示复合物中所含mRNA确定为mLuc,通过对主要器官的荧光素信号进行离体生物发光成像，评价复合物在小鼠体内各组织的转染效率。如图所示，12C12-NP/mLuc对肝脏的转染效率明显高于10C12-NP/mLuc，而10C12-NP/mLuc对肺的转染效率明显高于12C12-NP/mLuc。在此基础上，用荧光标记的抗体对肺组织中的三种细胞(内皮细胞、表皮细胞、免疫细胞)进行标记，并用流式细胞仪对上述三种细胞进行荧光定量分析以此确定10C12-NP/mLuc在肺部转染的主要细胞类型，其中，类脂质纳米颗粒已被DiO标记。图4C表明，10C12-NP/mLuc在肺部聚集后主要转染肺内皮细胞。更进一步地，用10C12-NP同时负载siRNA与mRNA进行静脉注射后，通过检测siRNA对肺中内皮细胞的特异性基因敲除验证10C12-NP/mRNA对肺内皮细胞的特异性转染(图4D)，而肺表皮细胞几乎未被转染。
实验例4
依据实验例2的结果，选取实施例2中所得10C12-NP和12C12-NP所对应的复合物，按siRNA0.6μg/g的用量通过静脉注射注入小鼠体内，注射完成4h后观察复合物在小鼠各组织中的选择性富集效果。如图5A所示，类脂质纳米颗粒已被DiR标记，通过对主要器官进行离体荧光成像，观察复合物在小鼠体内的组织选择性富集。明显地，在肝部，12C12-NP/siRNA复合物的富集量明显高于10C12-NP/siRNA复合物，而在肺部，10C12-NP/siRNA复合物的富集量则明显高于12C12-NP/siRNA复合物。选取肝细胞的特异性基因F7、内皮细胞的特异性基因Tie2与CD31、表皮细胞的特异性基因Itgb1所对应的siRNA与类脂质纳米颗粒形成复合物，通过静脉注射48小时后检测肝和肺中各基因的mRNA水平评价各复合物的基因敲除效率。如图5B所示，12C12-NP/siRNA对肝中肝细胞的基因敲除效率明显高于10C12-NP/siRNA，而10C12-NP/siRNA对肺中内皮细胞的基因敲除效率明显高于12C12-NP/siRNA。此外，10C12-NP/siRNA对肺中表皮细胞的基因敲除效率极低。图5C进一步证明了10C12-NP/siRNA主要在肺部内皮细胞聚集。
实验例5
依据实验例4的结果，选取肺选择性富集并转染的10C12-NP/siRNA和肝选择性富集并转染的12C12-NP/siRNA分别递送功能性siRNA(siCD31和siCol1α1)进行肿瘤的肺转移模型和肝纤维化模型的治疗。
选取实施例2中所得10C12-NP/siRNA复合物，其中siRNA确定为siCD31且其用量为1.0mg/kg。根据图6A中的实验流程示意图，通过静脉注射黑色素瘤细胞(B16F10)构建肿瘤的肺转移模型，按照图中所示时间点进行多次10C12-NP/siCD31静脉注射。最后一次复合物注射72小时后取完整肺部，观察肺表面黑色素瘤的生长情况并进行定量。结果表明，具有肺选择性的10C12-NP负载siCD31能够有效抑制肿瘤的肺转移。选取12C12-NP/siRNA复合物并将其质量比确定为15：1，其中siRNA确定为siCol1α1且其用量为0.8mg/kg。根据图6B中的实验流程示意图，通过定期腹腔注射CCl4构建肝纤维化模型，通过静脉注射多次注射12C12-NP/siCol1α1进行治疗。治疗周期结束后取肝，对肝组织中Col1α1的mRNA水平进行定量，并对纤维化指标(胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA))进行免疫组化分析。结果表明，具有肝选择性的12C12-NP负载siCol1α1能够有效抑制肝纤维化的发展。
实验例6
将实施例2得到的6种不同复合物分别按mRNA 0.2、0.4、0.6μg/ml的用量与Hela细胞共同孵育，并做空白对照。在37℃的二氧化碳培养箱中共同孵育24小时后，用MTT法检测Hela细胞的存活率。结果如图7A所示，表明复合物在3种不同mRNA用量下对Hela细胞的生长活性均无显著影响，说明本发明的类脂质纳米颗粒在体内外的生物相容性好。
依据实验例3的结果，选取实施例3中所得10C12-NP和12C12-NP所对应的复合物，按mRNA0.2μg/g的用量通过静脉注射注入小鼠体内，并做空白对照。注射完成24h后，提取小鼠的心、肝、脾、肺、肾并用苏木精/伊红(H&E)染色法进行病理学检查。结果如图7B所示，表明复合物在实现体内有效转染的剂量下对小鼠体内各组织无明显毒性。
实施例3
同实施例2所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，不同之处在于：
将实施例1制得的不同可电离两亲性聚合物nC12、辅助脂质胆固醇及生物稳定增强剂DSPE-PEG2000分别以50％、14％、36％的质量比例混合，其他按实施例1进行。
可电离两亲性聚合物36～58％，辅助脂质10～40％，生物稳定增强剂18～38％。
实施例4
同实施例2所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，不同之处在于：
将实施例1制得的不同可电离两亲性聚合物nC12、辅助脂质β-谷甾醇及生物稳定增强剂1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000(DMG-PEG)分别以58％、14％、28％的质量比例混合，其他按实施例1进行。
实施例5
同实施例2所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，不同之处在于：
将实施例1制得的不同可电离两亲性聚合物nC12、胆固醇、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)及生物稳定增强剂DSPE-PEG2000分别以50％、14％、20％、16％的质量比例混合，其他按实施例1进行。

Claims (10)

1.一种组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，所述的类脂质纳米颗粒按质量百分比计，是由如下组分组成：
可电离两亲性聚合物30～80％，辅助脂质5～60％，生物稳定增强剂5～40％，
所述的可电离两亲性聚合物是由头部富含胺基的聚合物与尾链含疏水烃基的脂质通过加成反应得到，所述辅助脂质为类固醇或类固醇与永久阳离子脂质的混合，所述生物稳定增强剂为聚乙二醇化脂质。
2.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，头部富含胺基的聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)，优选的，聚乙烯亚胺(PEI)为线性PEI(LPEI)或支状PEI(BPEI)，最为优选的，聚乙烯亚胺(PEI)为支状PEI(BPEI)，聚乙烯亚胺(PEI)的分子量为0.3kDa-20kDa。
3.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，尾链含疏水烃基的脂质为丙烯酸酯、丙烯酰胺或环氧化物，优选的，尾链含疏水烃基的脂质为丙烯酸酯，丙烯酸酯为含直链烷基尾链的丙烯酸酯，直链烷基碳原子数为C1～C18。
4.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，所述的可电离两亲性聚合物是由头部富含胺基的聚合物与尾链含疏水烃基的脂质通过加成反应得到，尾链含疏水烃基的脂质与头部富含胺基的聚合物的摩尔比为0.1-14:1，反应温度为80℃-100℃，反应时间为24-72小时。
5.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、岩皂甾醇、豆甾醇、麦角固醇或豆甾烷醇，永久阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)或1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(DOTMA)。
6.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，当辅助脂质为单独的类固醇时，类固醇的质量百分比为5～20％；当辅助脂质为类固醇与永久阳离子脂质的混合物时，类固醇的质量百分比为5～20％，永久阳离子脂质的质量百分比为5～40％。
7.根据权利要求1所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒，其特征在于，聚乙二醇化脂质选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000(DMG-PEG)、d-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯(TPGS)、2-豆蔻酸锡酰-3-磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000(DMPE-PEG)、L-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DPPE-PEG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-聚乙二醇2000(DPG-PEG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-聚乙二醇2000(DSG-PEG)。
8.权利要求1-7任一所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤如下：
1)将可电离两亲性聚合物、辅助脂质和生物稳定增强剂溶解在有机溶剂中，形成脂质预混液，
2)将脂质预混液滴加到缓冲液中，形成类脂质纳米颗粒；
所述有机溶剂为无水乙醇，
所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5.2-7.2，
有机溶剂的用量为溶解量，
缓冲液的用量为使所得混合物为胶状分散体。
9.权利要求8所述的组织选择性递送核酸药物的类脂质纳米颗粒的应用，用于递送治疗药物；
所述治疗药物为小分子、蛋白和核酸其中的一种或几种混合，核酸选自反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(microRNA)、规律成簇间隔短回文重复序列(GRISPR)相关核酸、单向导RNA(sgRNA)以及质粒DNA(pDNA)。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体应用方法如下：
将治疗药物与上述类脂质纳米颗粒混合，形成类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物，将类脂质纳米颗粒-核酸药物复合物施用至生物体上，在生物体内实现递送，进行生物组织选择性富集并发挥效用，治疗药物与类脂质纳米颗粒的质量比为1：(7-15)，所述施用方式包括静脉注射、肌肉注射、鼻腔吸入、口服、皮下注射、气管给药。
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