WO2022260367A1 - 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 비바이러스성 유전자/전달체 복합체 - Google Patents

급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 비바이러스성 유전자/전달체 복합체 Download PDF

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WO2022260367A1
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tkpr
complex
sitace
sirna
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김용희
이지은
홍주형
양철수
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한양대학교 산학협력단
한양대학교 에리카산학협력단
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24086—ADAM 17 endopeptidase (3.4.24.86), i.e. TNF-alpha converting enyzme

Definitions

  • the present invention relates to a non-viral gene/transporter complex for preventing or treating acute inflammatory diseases.
  • Inflammation is an innate response to pathogens or tissue damage caused by pathogens, and when the inflammatory response is not controlled, harmful effects to the host can become very serious, so more thorough research is needed.
  • Acute inflammation causes symptoms such as pain, fever, redness, and abscess due to the invasion of external infectious agents (bacteria, fungi, viruses, and various types of allergens).
  • an inflammatory response induced when a stimulus that causes any organic change is applied to cells or tissues of a living body is a defense system for protecting the living body.
  • phagocytosis which inhibits the growth of invading bacteria or activates macrophages that phagocytose foreign substances, thereby enhancing the function of macrophages that digest and excrete the foreign substances. It is a function of doing, etc.
  • acute inflammatory reactions such as sepsis and endotoxemia are caused by excessive activation of macrophages by bacterial by-products such as lipopolysaccharide (LPS).
  • LPS lipopolysaccharide
  • ILs interleukins
  • TNF tumor necrosis factor
  • TACE tumor necrosis factor-alpha converting enzyme
  • the present inventors have prepared a new gene therapy product by modifying the sequence of siRNA that inhibits the expression of existing tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TNF- ⁇ converting enzyme, TACE), and a new gene delivery system that can stably deliver it was synthesized to complete the present invention by developing a non-viral gene/transporter complex targeting acute inflammatory macrophages.
  • TNF- ⁇ converting enzyme TACE
  • an object of the present invention is to provide a gene/delivery complex comprising a siRNA that inhibits the expression of TNF- ⁇ converting enzyme (TACE) and a non-viral gene delivery system.
  • TACE TNF- ⁇ converting enzyme
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating acute inflammatory diseases comprising the gene/transporter complex as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an acute inflammatory disease, comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the gene/transporter complex according to claim 1 to a subject.
  • the present invention relates to a gene/delivery complex comprising a siRNA that inhibits the expression of tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE) and a non-viral gene delivery system.
  • TACE tumor necrosis factor-alpha converting enzyme
  • TACE factor-alpha converting enzyme
  • treatment can be performed by targeting the overexpressed inflammatory macrophages in the disease organ.
  • the gene/transporter complex according to the present invention can be administered when a clear diagnosis cannot be made in acute inflammation due to penetration of microorganisms, bacteria, viruses, etc., or when an immediate anti-inflammatory effect is expected.
  • shTACE it takes time for the gene to be expressed after the gene passes through both the cell membrane and the nuclear membrane, but in the case of siTACE, anti-inflammatory effects can be expected through mRNA interference immediately after cell membrane penetration.
  • Figure 1 shows the physicochemical characterization of the siTACE/TKPR-9R complex
  • Figure 1a Gel retardation assay. siTACE was conjugated with various weight ratios of the TKPR-9R peptide-based transporter by incubation at room temperature for 30 minutes
  • Figure 1b surface zeta potential
  • Figure 1c average diameter of siTACE/TKPR-9R complexes determined by dynamic light scattering
  • Figure 2 shows the in vitro anti-inflammatory effect of the siTACE/TKPR-9R complex [After lipopolysaccharide (LPS) activation in macrophages, cells were transfected with the siTACE/TKPR-9R complex (weight ratio 4) for 24 hours.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Fig. 2B Down-regulation of pro-inflammatory cytokine TNF- ⁇ protein level
  • Fig. 2C IL-6 protein level
  • '+' in row 2 is 1 ⁇ g
  • '++' and '+++' are 2 ⁇ g and 3 ⁇ g of siTACE in the complex
  • '+' in line 4 is 4 ⁇ g
  • '++' and '++++' are complex and 8 ⁇ g and 12 ⁇ g of TKPR-9R in B, C and D, respectively.
  • Figure 3 shows the in vivo combination therapy for systemic sepsis using siTACE/TKPR-9R and antibiotics
  • Figure 3a Cecal ligation and puncture (CLP) induced sepsis model, I.V. siTACE/TKPR-9R complex (siTACE gene: 1 mg/kg) and I.P. Gentamicin (8 mg/kg) injection and cephalosporin (8 mg/kg).
  • Figure 3c Hematoxylin and eosin (H&E) staining and histopathology scores of lung and liver tissue sections at day 1 after siTACE/TKPR-9R combined treatment in septic mice.
  • E. coli and FIG. 3f P. aeruginosa were treated with C57BL/6 mice, siTACE/TKPR-9R (siTACE: 1 mg/kg, IV) and antibiotics (Gentamycin 8 mg/kg, IP and Cephalosporin 8 mg). /kg, IP) was injected.
  • FIG. 5 shows the macrophage-targeting effect of the siTACE/TKPR-9R complex [(a) in vivo biodistribution image.
  • Normal mice and mice with CLP-induced sepsis were intravenously injected with the siRNA-Cy5/TKPR-9R complex and sacrificed at 1 hour, 6 hours and 24 hours after treatment.
  • Fluorescence intensity and relative mean fluorescence intensity (MFI) values of primary macrophages (f4/80+) (b) and non-macrophages (f4/80 ⁇ ) (c). Macrophages positive for F4/80 in the peritoneal cavity showed high cellular uptake of the siRNA-FAM/TKPR-9R complex (n 3)].
  • Figure 6 shows the macrophage-targeting effect in vitro, and is the result of an uptate experiment on human THP-1.
  • a competition assay in LPS-induced inflammatory THP-1 macrophages between free TKPR-9R and human siRNA/TKPR-9R (weight ratio 4) complexes was performed by flow cytometry using FAM-conjugated siRNA.
  • Figure 7 shows the in vitro anti-inflammatory effect of the human siTACE/TKPR-9R complex [after lipopolysaccharide (LPS) activation in THP-1 macrophages, the cells were incubated for 24 hours for free human siTACE, human siTACE/PEI complex, human Transfected with siTACE/TKPR-9R complex (weight ratio 1/4).
  • siRNA that inhibits the expression of a new tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE) that can act directly in the cytoplasm of cells. developed.
  • TACE tumor necrosis factor-alpha converting enzyme
  • the siRNA against TACE may be a nucleotide having at least one nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1 or 2 and a sequence complementary thereto.
  • Antisense sequence SEQ ID NO 3
  • Antisense sequence SEQ ID NO 4
  • siRNA is a double-stranded RNA composed of sense/anti-sense RNA, and can be expressed from a recombinant circular or linear DNA plasmid using any suitable promoter.
  • Promoters suitable for expressing the siRNA of the invention from a plasmid include, for example, the U6 or H1 RNA pol III promoter sequences and the cytomegalovirus promoter. A person skilled in the art will be able to select other suitable promoters.
  • the recombinant plasmid of the present invention may contain an inducible or regulated promoter for expressing siRNA in a specific tissue or in a specific intracellular environment.
  • siRNAs expressed from recombinant plasmids can be isolated from cultured cell expression systems by standard techniques or expressed intracellularly in or near the angiogenic region in vivo.
  • siRNAs of the invention can be expressed from recombinant plasmids as two separate complementary RNA molecules or as a single RNA molecule with two complementary regions.
  • plasmids for expressing the siRNA of the present invention methods for inserting nucleic acid sequences to express siRNAs in plasmids, and methods for delivering recombinant plasmids to desired cells are known to those skilled in the art. See, eg, the following documents, which are incorporated herein by reference in their entirety: Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; and Paul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508].
  • the siRNA of the present invention can be expressed intracellularly from a recombinant viral vector at or near the angiogenic region in vivo.
  • the recombinant viral vector of the present invention comprises a sequence encoding the siRNA of the present invention and any promoter suitable for expressing the siRNA sequence. Suitable promoters include, for example, the U6 or H1 RNA pol III promoter sequences and the cytomegalovirus promoter. A person skilled in the art will be able to select other suitable promoters.
  • the recombinant viral vector of the present invention may include an inducible or regulated promoter for expressing siRNA in a specific tissue or a specific intracellular environment.
  • siRNAs of the invention can be expressed from recombinant viral vectors as two separate, complementary nucleic acid molecules, or as a single nucleic acid molecule with two complementary regions.
  • Any viral vector capable of accepting the coding sequence for the siRNA molecule to be expressed may be used, for example adenovirus (AV), adenovirus-associated virus (AAV), retrovirus (e.g. lentivirus (LV), There are vectors derived from rhabdovirus, murine leukemia virus), herpes virus, and the like.
  • the tropism of viral vectors can be modified by pseudomorphing the vectors with envelope proteins or other surface antigens of other viruses.
  • the AAV vector of the present invention can be pseudotyped with surface proteins such as vesicular stomatitis virus (VSV), rabies virus, Ebola virus, and Mokola virus.
  • siRNA of the present invention can be transfected into somatic cells using a delivery buffer in the form of an oligonucleotide.
  • a gene Since the gene itself is negatively charged in its phosphate structure, it is not easy for the gene itself to penetrate the cell membrane that is negatively charged through electrical repulsion. Therefore, a gene reacts with a substance that exhibits a positive charge to form a complex, and then the total charge must show a positive charge to enter the cell more easily and to improve the expression of the gene within the cell.
  • a substance that enhances the delivery of genes into cells is called a carrier. It refers to a substance that binds to a gene to help deliver a gene for improved delivery and high expression of a gene.
  • Such a gene transporter is mainly a positively charged substance, and the electrical interaction between a negatively charged gene and a positively charged gene transporter results in gene/transportation. form transporter complexes.
  • the non-viral gene delivery system containing Tuftsin-oligoarginine (hereinafter referred to as TKPR-9R) is used to target inflammatory macrophages.
  • can Inflammatory macrophage-targeting peptides include tuftsin (TKPR peptide sequence) capable of selectively targeting macrophages in organs (liver, lung, kidney, spleen) and peritoneal fluid, and nine arginine sequences ( RRRRRRRRR, 9R).
  • the TKPR-9R contains both terminal cysteines.
  • the TKPR-9R refers to the 'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys' peptide [Cys Thr Lys Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys: SEQ ID NO: 5]. At this time, arginine was used in its D form.
  • the 'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys' peptide can use the solid-phase Fmoc peptide synthesis method, which is a synthesis method in which each amino acid is extended one by one according to the sequence sequence, and the ⁇ -amino group is Fmoc (Fluoreonylmethoxycarbonyl, An amino acid protected with a 9-fluororenylmethoxycarbonyl) group is used.
  • Fmoc Fluoreonylmethoxycarbonyl
  • An amino acid protected with a 9-fluororenylmethoxycarbonyl is used.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • siTACE therapeutic gene
  • TKPR-9R gene delivery system as a delivery system targeting macrophages.
  • the human siTACE and the TKPR-9R form a complex through electrical interaction, and in order to form a gene/transporter complex (Peptoplex) with excellent therapeutic effect, an optimal ratio of the gene forming the complex and the gene transporter is required.
  • ratios such as a weight ratio, a charge ratio, and a nitrogen/phosphorus ratio (N/P ratio), but the weight ratio is used in the present invention.
  • TACE tumor necrosis factor-alpha converting enzyme
  • TKPR-9R are preferably formed in a weight ratio of 1:1.2 to 5 or 1:3 to 4.5.
  • the present invention provides a method for preparing a gene/delivery complex comprising mixing and incubating siRNA that inhibits the expression of TNF- ⁇ converting enzyme (TACE) and a non-viral gene delivery system.
  • TACE TNF- ⁇ converting enzyme
  • the incubation is preferably performed at 20 to 40° C. for 20 to 40 minutes for the reason of forming an optimal gene/transporter complex.
  • a high temperature of more than 40 ° C the interaction between bases in DNA is dissolved, and as a result, DNA is denatured.
  • the delivery system consists of a polymerization reaction of peptides, and since this is also denatured at high temperatures, it is preferable to proceed at a temperature of 40 ° C. or less.
  • the incubation time exceeds 40 minutes, the gene and delivery agent form a precipitate, so it is preferable not to exceed 40 minutes.
  • siTACE is negatively charged, and non-viral carriers are positively charged.
  • a gene/transporter complex can be formed by electrostatic attraction. After complex formation, adjust the final volume equally for each group with 3DW, PBS, etc.
  • the respective concentrations of the gene and the gene transporter must first be obtained. Since the amount of UV radiation absorbed is proportional to the amount of DNA, the gene concentration is measured with a UV spectrophotometer. It is usually desirable to make the gene concentration below 1 mg/ml to prevent precipitation of the gene/transporter complex.
  • the gene carrier is synthesized at a final concentration of 1 mg/ml by adjusting the amount of HEPES buffer.
  • the gene/transporter complex according to the present invention was shown to selectively enhance macrophage-targeting effects by binding to the NRP-1 receptor on the surface of macrophages.
  • the gene/transporter complex according to the present invention was shown to selectively enhance macrophage-targeting effects by binding to the NRP-1 receptor on the surface of macrophages.
  • mice showed targeted effects on macrophages in peritoneal macrophages and inflamed tissues of the lung, liver, kidney, and spleen, respectively.
  • the present invention includes a composition for preventing or treating an acute inflammatory disease comprising the gene/transporter complex as an active ingredient.
  • the acute inflammatory disease may be, for example, acute sepsis, acute lung injury, acute liver injury, acute inflammatory bowel disease, etc., but is not limited thereto.
  • the acute lung injury may include acute pneumonia caused by viruses, bacteria, etc.
  • the acute liver injury may include acute hepatitis caused by viruses, bacteria, etc.
  • the acute inflammatory bowel disease includes infectious enteritis. can do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered together with a pharmaceutically acceptable carrier, and upon oral administration, in addition to the above active ingredients, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, and a pigment , Spices, etc. may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used by mixing a buffer, a preservative, an analgesic, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, and the like.
  • the composition of the present invention may use a base, an excipient, a lubricant, a preservative, and the like.
  • the dosage form of the composition of the present invention may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. It can be formulated into other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, preservatives, and the like may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but for example, oral cavity, aerosol, buccal, skin, intradermal, inhalation, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonary, intravenous, peritoneal It may be administered via intranasal, nasal, ocular, oral, otic, injection, patch, subcutaneous, sublingual, topical, or transdermal routes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a suitable dosage form using known techniques.
  • it may be administered by mixing with an inert diluent or an edible carrier, sealing in a hard or soft gelatin capsule, or pressing into a tablet.
  • the active ingredient may be mixed with an excipient and used in the form of ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like.
  • various formulations for injection, parenteral administration, etc. can be prepared according to known techniques or commonly used techniques in the art.
  • the effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies in its range depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease, etc. It can be easily determined by experts.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the drug type, the route of administration, and the period, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, it is preferably administered at 0.001 to 100 mg/kg of body weight per day, more preferably at 0.01 to 30 mg/kg of body weight per day. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses.
  • the gene delivery system complex of the present invention may be present in an amount of 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes.
  • the administration method is not limited, and may be administered, for example, by oral, rectal, or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine, or intracerebral vascular (intra cerbroventricular) injection.
  • the present invention includes a method for preventing or treating an acute inflammatory disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of the complex.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present invention comprises administering a therapeutically effective amount of a composition of the present invention.
  • the therapeutically effective amount means an amount that enhances the acute inflammation inhibitory effect. It is obvious to those skilled in the art that an appropriate total daily amount can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient depends on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition including whether other agents are used as the case may be, the patient's age, weight, general health condition, sex and diet, time of administration, It is preferable to apply differently according to the route of administration and secretion rate of the composition, treatment period, and various factors and similar factors well known in the medical field.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above.
  • the treatment effect of the related disease may be increased by co-administering the composition of the present invention with a known therapeutic agent for related diseases.
  • subject of the present invention includes mammals or humans, such as horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, etc., whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. do.
  • the therapeutic gene (siTACE) of the gene silencing system targeting RNA molecules is based on the mouse TACE (NM_001277266) sequence, a total of 19 base sequences 5'-ACACCTGCTGCAATAGTGA-3' (Sense sequence) [SEQ ID NO: 1], 5'-TCACTATTGCAGCAGGTGTT-3' (Antisense sequence) [SEQ ID NO: 3] was prepared, and TT, an overhang sequence, was added to the 3' end to efficiently suppress gene expression. It is made through the oligonucleotide chemical synthesis process of siTACE.
  • oligonucleotide is synthesized through four steps of de-blocking reaction, coupling reaction, capping reaction, and oxidation reaction. Thereafter, oligonucleotides are recovered by reacting with aqueous ammonia, and the synthesized oligonucleotides are purified using a chromatographic principle using a reverse phase silica resin. Next, the quantification process is obtained by measuring the absorbance of the purified oligonucleotide using a UV spectrophotometer and calculating the number of moles of the synthesized oligonucleotide therefrom.
  • the therapeutic gene (siTACE) of the gene silencing system targeting RNA molecules is based on the human TACE (NM_003183.5) sequence, a total of 21 base sequences 5'- GCTCTCAGACTACGATATTCT-3' (Sense sequence) [SEQ ID NO: 2 ], 5'-AGAATATCGTAGTCTGAGAGC-3' (Antisense sequence) [SEQ ID NO: 4] was prepared, and TT, an overhang sequence, was added to the 3' end to efficiently inhibit gene expression. It is made through the oligonucleotide chemical synthesis process of siTACE.
  • oligonucleotide is synthesized through four steps of de-blocking reaction, coupling reaction, capping reaction, and oxidation reaction. Thereafter, oligonucleotides are recovered by reacting with aqueous ammonia, and the synthesized oligonucleotides are purified using a chromatographic principle using a reverse phase silica resin.
  • the quantification process is obtained by measuring the absorbance of the purified oligonucleotide using a UV spectrophotometer and calculating the number of moles of the synthesized oligonucleotide therefrom.
  • experiments in human cell lines must be preceded.
  • the anti-inflammatory effect of this gene therapy product should be verified in human-derived cells (THP-1), and in this case, the human siTACE gene should be used instead of the mouse siTACE gene.
  • Inflammatory macrophage-targeting peptides include a TKPR peptide sequence (TKPR) that can selectively target macrophages in organs (liver, lung, kidney, spleen) and peritoneal fluid, and nine arginine sequences (RRRRRRRRRR) that facilitate entry into cells with a positive charge. , 9R). At this time, arginine was used in its D form.
  • TKPR TKPR peptide sequence
  • RRRRRRRRRRRRRRRRRR nine arginine sequences
  • a 'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys' monomeric peptide was synthesized using the solid-phase Fmoc peptide synthesis method.
  • This is a synthesis method in which each amino acid is extended one by one in accordance with a predetermined sequence sequence, and an amino acid whose ⁇ -amino group is protected by Fmoc (Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-fluororenylmethoxycarbonyl) group was used.
  • Fmoc Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-fluororenylmethoxycarbonyl
  • siRNA inhibiting the expression of tumor necrosis factor-alpha converting enzyme (TACE) and a non-viral gene delivery system (TKPR-9R) were prepared at a concentration of 1 mg/ml. Genes and peptides were administered in a PBS solution four times the total volume of genes and carriers, and incubation was performed at room temperature (25° C.) for 30 minutes. If the incubation time exceeds 40 minutes, the gene and delivery agent form a precipitate, so it is preferable not to exceed 40 minutes.
  • TACE tumor necrosis factor-alpha converting enzyme
  • TKPR-9R non-viral gene delivery system
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • WELGENE WELGENE (Seoul, Korea).
  • LPS Lipopolysaccharide
  • LA lactic acid
  • PEI polyethyleneimine
  • MTT MTT
  • Antibodies (Anti-TACE, Anti-GAPDH) were purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA).
  • PVDF Poly(vinylidene fluoride) transfer membranes were purchased from Millipore Sigma (Burlington, MA, USA).
  • Mouse ELISA kits (TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , MCP-1) were purchased from Thermofisher Scientific (USA) and mouse ELISA kits (IL-6) were purchased from eBioscience (USA).
  • siTACE therapeutic gene 1 ⁇ g of siTACE therapeutic gene (siRNA) was incubated with various amounts (0.5, 1, 2, 3, 4 ⁇ g) of TKPR-9R carrier at room temperature for 30 minutes to form a gene therapy complex. Thereafter, electrophoresis was performed on a 0.8% (w/v) agarose gel in 0.5 ⁇ TBE buffer solution at 100 V for 20 minutes to confirm the formation of complexes according to charge comparison.
  • siTACE therapeutic gene 5 ⁇ g of siTACE therapeutic gene at various weight ratios (TKPR-9R/siRNA Weight ratio 1, 2, 3, 4) of siTACE/TKPR-9R complexes were incubated at room temperature for 30 minutes to form complexes, and then the third The total volume was adjusted to 800 ⁇ l with distilled water. The surface charge and size of the composites were measured using a Zeta sizer-ZS (Malvern) machine.
  • Free-TKPR-9R peptide was first treated for 2 hours at room temperature for the competitive binding ability analysis experiment by TKPR peptide. Thereafter, the FAM fluorescence-coupled siRNA gene (FAM-siRNA) and the TKPR-9R peptide were reacted at room temperature for 30 minutes, and the degree of complex incorporation into macrophages was analyzed by FACS. In addition, the degree of macrophage introduction by the gene was analyzed by FACS through the group (Naked-siRNA-FAM) in which macrophages were treated with only the siRNA-FAM gene without the TKPR-9R peptide.
  • FAM-siRNA FAM fluorescence-coupled siRNA gene
  • TKPR-9R peptide the degree of complex incorporation into macrophages was analyzed by FACS.
  • the degree of macrophage introduction by the gene was analyzed by FACS through the group (Naked-siRNA-FAM) in which macrophages were treated with only the siRNA-FAM gene without
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS Fetal bovine serum
  • RAW 264.7 mouse-derived macrophages were purchased from the Korean Cell Line Bank and subcultured in a fresh medium every other day. In complete medium supplemented with 10% FBS, penicillin (100 IU/ml) and streptomycin (100 ⁇ g/ml), they were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 atmosphere.
  • Mouse-derived macrophages (RAW 264.7 macrophages) of 4 ⁇ 10 ⁇ 4 cells per well of a cell culture plate were cultured for 24 hours. Then, inflammatory state of macrophages was induced by treatment with 1 ⁇ g/ml of LPS (Lipopolysaccharide) per well for 1 hour, except for the positive control LA (Lactic acid) treatment group.
  • the LA (Lactic acid) treatment group is to activate M2 type macrophages.
  • Inflammatory macrophages were treated with the siTACE/TKPR-9R gene/transporter complex for 48 hours.
  • the medium of the cells was obtained from each well, and the supernatant of the medium was used as a sample through centrifugation at 4 ° C., 13000 rpm, and 5 min.
  • the amount of soluble TNF- ⁇ inflammatory mediators (cytokines) from media samples was measured by sandwich ELISA.
  • Gene/transporter complex (siTACE/TKPR -9R complex) was injected into the tail vein.
  • the CLP (Cecal ligation and puncture) method is anesthetized with 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg), tied 1 to 1.5 inches from the end of the cecum with 4-0 black silk suture in the abdominal area, and then with a syringe needle.
  • the peritoneum was sutured with 4-0 black silk suture.
  • the amount of gene therapy applied to the experimental animals was about 1 mg/kg.
  • Gentamicin (8 mg/kg, I.P.) and Cephalosporin (8 mg/kg, I.P.), among antibiotics, are injected together after injection of gene therapy in a sepsis model induced by the surgical method of CLP (Cecal ligation and puncture) for concomitant administration Changes in survival rate due to the effect were confirmed for 5 days.
  • a mouse experimental animal was dissected and PBS was injected into the peritoneal cavity to obtain macrophages in the peritoneal fluid.
  • the peritoneal fluid was centrifuged at 300 g for 3 minutes, and then the primary macrophages were cultured in a 12-well plate at 37°C and 5% CO 2 atmosphere for 24 hours. Thereafter, the gene/transporter complex (FAM-siRNA/TKPR-9R complex) was treated for 4 hours, washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 30 minutes, and macrophage-targeted Anti-F4/80 antibody The degree of gene therapy introduction into macrophages was analyzed using FACS Calibur (BD bioscience).
  • TACE protein with anti-TACE antibody After boiling the protein sample with Laemmli buffer for 10 minutes, run 10% SDS-PAGE gel electrophoresis, polyvinylidene fluoride membrane (Millipore) and Trans-blot turbo transfer system (Bio-rad), TACE protein with anti-TACE antibody The expression level was measured.
  • RLT buffer Qiagen
  • RNA was obtained and cDNA was synthesized with iScript cDNA synthesis kit, and the relative amount of TNF- ⁇ mRNA relative to GAPDH, an endogenous control, was measured by real-time PCR.
  • the forward primer for TNF- ⁇ is 5'-TCTCATGCACCACCATCAAGGACT-3' [SEQ ID NO: 10] and the reverse primer is 5'-ACCACTCTCCCTTTGCAGAACTCA-3' [SEQ ID NO: 11]; for human The forward primer for TNF- ⁇ is 5'-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3' [SEQ ID NO: 12], and the reverse primer is 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3' [SEQ ID NO: 13].)
  • 30 Incubation at room temperature for 15 minutes to form a blood clot, centrifugation at 1500 g for 10 minutes at 4°C to separate serum, and to analyze the levels of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, MCP-1 inflammatory cytokines and chemokines in the blood. Mediators were analyzed by ELISA.
  • RPMI Dynamic Hostenediol
  • FBS Fetal bovine serum
  • THP-1 human-derived macrophages were purchased from the Korean Cell Line Bank and subcultured in a fresh medium every other day. In complete medium supplemented with 10% FBS, penicillin (100 IU/ml) and streptomycin (100 ⁇ g/ml), they were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 atmosphere.
  • Free-TKPR-9R peptide was first treated for 2 hours at room temperature for the competitive binding ability analysis experiment by TKPR peptide. Thereafter, the FAM fluorescence-coupled siRNA gene (FAM-siRNA) and the TKPR-9R peptide were reacted at room temperature for 30 minutes, and the degree of complex incorporation into macrophages was analyzed by FACS. In addition, the degree of macrophage introduction by the gene was analyzed by FACS through the group (Naked-siRNA-FAM) in which macrophages were treated with only the siRNA-FAM gene without the TKPR-9R peptide.
  • FAM-siRNA FAM fluorescence-coupled siRNA gene
  • TKPR-9R peptide the degree of complex incorporation into macrophages was analyzed by FACS.
  • the degree of macrophage introduction by the gene was analyzed by FACS through the group (Naked-siRNA-FAM) in which macrophages were treated with only the siRNA-FAM gene without
  • the therapeutic gene For effective gene therapy, the therapeutic gene must be delivered. expressed in target cells. However, both therapeutic siRNA and cell membrane are negatively charged, making it difficult to introduce genes into macrophages. Therefore, characterization experiments were performed to optimize the weight ratio of the siTACE/TKPR-9R complex. After incubating siTACE and TKPR-9R in deionized water for 30 min, an agarose gel retardation test was performed to determine whether the siTACE/TKPR-9R complex had condensed and stabilized (Fig. 1a). Stable formation of the siTACE/TKPR-9R complex was confirmed at a ratio of TKPR-9R/siTACE 1 or greater.
  • siRNAs of the group having a weight ratio of less than 1 migrated downward from the top of the agarose gel due to ion repulsion.
  • the siTACE/TKPR-9R complex was positive. It has a zeta potential of 32.2 ( ⁇ 7.2) mV and a nanocomposite size of 313.7 nm ( ⁇ 72.45) and a polydispersity index (PDI) value of 0.208 (FIGS. 1b and 1c).
  • TKPR-9R TKPR-9R
  • Raw264.7 was activated by LPS for 2 hours.
  • free TKPR peptide was incubated for 1 hour to block receptors on macrophages.
  • siRNA alone showed no change in fluorescence intensity when the NRP-1 receptor was blocked.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • activated macrophages with NRP-1 receptors in inflamed tissue can be specifically targeted through the peptide's TKPR sequence.
  • the siTACE/TKPR-9R complex was efficiently internalized into the cytoplasm of Raw 264.7 cells.
  • TKPR-mediated delivery of siTACE showed inhibition of TACE in inflammatory macrophages.
  • the transcription of the Tace gene was significantly suppressed when cationic polymers or peptides were used (FIG. 2a).
  • PEI showed high cytotoxicity, and PEI was off target. effect can lead to serious failure in sepsis treatment.
  • TKPR-9R exhibited better transcriptional repression of TACE without toxicity and higher viability in Raw 264.7 macrophages (Fig. 2d).
  • the expression of TNF- ⁇ was also decreased in a dose-dependent manner (FIG. 2b).
  • LA was used as an M2 type macrophage polarization.
  • siTACE/TKPR-9R complex High doses of the siTACE/TKPR-9R complex upregulated the degradation of TNF- ⁇ protein, resulting in similar protein levels to LA-treated groups that differentiate monocytes into M2 phenotype macrophages.
  • siRNA without the TKPR-9R transporter also showed inhibition of TNF- ⁇ in a dose-dependent manner, but not as efficiently as the siTACE/TKPR-9R complex.
  • cytokines and chemokines showed downregulated levels in the group treated with siTACE/TKPR-9R complex (Fig. 2c, d).
  • LPS activates macrophages to secrete various pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-6 and MCP-1, whereas LA attenuates cytokine and chemokine levels.
  • TKPR-9R can be expected to increase the gene suppression effect in vivo than siRNA alone.
  • this anti-inflammatory effect was further increased when the siTACE gene was combined with the TKPR-9R carrier, but the gene or carrier alone was insufficient.
  • the therapeutic effect of the siTACE/TKPR-9R complex was investigated in a mouse model of severe sepsis by CLP surgery.
  • This CLP modeling method is most pathologically similar to human clinical disease (polymicrobial sepsis) because it contaminates the abdominal cavity with feces and bacteria from the cecum.
  • siTACE/TKPR-9R complex (siTACE gene: 1 mg/kg) into septic mice
  • the survival rate was monitored for 5 days in a CLP-induced sepsis model to investigate the protective effect (FIG. 3a).
  • the PBS-injected control group showed a survival rate of 7%
  • the siTACE/TKPR-9R-injected group showed a significant improvement to 53% by attenuating the lethal inflammatory cascade (Fig. 3b).
  • the difference in survival rate between the antibiotic-treated group and the siTACE/TKPR-9R-treated group was only 7%.
  • the synergistic effect of the combined treatment of antibiotics and siTACE/TKPR-9R complex was confirmed with a high survival rate of 73%.
  • siTACE/TKPR-9R siTACE gene: 1 mg/kg
  • the protective effect of the siTACE/TKPR-9R (siTACE gene: 1 mg/kg) complex was demonstrated in bacteria-induced septic mice injected with E. coli and P. aeruginosa (Fig. 3e).
  • siTACE/TKPR-9R combination was administered with antibiotics, the survival rate was significantly increased compared to the administration of antibiotics alone.
  • the survival rate of 2 injections was higher in the group in which siTACE/TKPR-9R (siTACE gene: 1 mg/kg) and antibiotics (gentamycin: 8 mg/kg, cephalosporin: 8 mg/kg) were administered simultaneously. It took longer than a single injection (Fig. 3e, f).
  • TACE levels were measured in tissues to confirm the anti-inflammatory effect of the siTACE/TKPR-9R complex by breaking the positive feedback chain reaction of TNF- ⁇ .
  • Tissues were obtained from each mouse after 24 hours when the complexes were intravenously injected into CLP-induced mice.
  • the protein level of TACE was significantly decreased in the siTACE/TKPR-9R combination treatment group, but not in the antibiotic alone administration group (FIG. 4a).
  • the group administered with both combination drug and antibiotic showed a more significant decrease in TACE level.
  • the complex also affected transcription of the Tnf- ⁇ gene in lung, kidney, spleen and liver (Fig. 4b). Since antibiotics alone did not reduce the level of TNF- ⁇ mRNA, the soluble TNF- ⁇ protein itself appeared to be the main molecule involved in the promotion. Reduced TACE protein in the combined treatment group disrupted the positive feedback loop of inflammation.
  • the siTACE/TKPR-9R complex suppressed circulating cytokine levels in mice (FIG. 4c).
  • a decrease in soluble TNF- ⁇ can alleviate NF- ⁇ B activation that promotes IL-6 secretion. Because TNF- ⁇ is an early cytokine of inflammatory stimulation that induces the release of other pro-inflammatory cytokines such as IL-6.
  • This group showed a significant decrease in the level of TNF- ⁇ in serum compared to the control and antibiotic-treated groups.
  • IL-1 ⁇ and IL-6 decreased in the antibiotic group, indicating that antibiotics act synergistically with the complex in the treatment of septic inflammation.
  • the chemokine (MCP-1) level was decreased in the combined treatment group, which may explain that the downregulation of TNF- ⁇ reduced the infiltration of inflammatory macrophages in the lung and liver (Fig. 3c, Fig. 4c).
  • the spleen of septic mice was enlarged due to severe inflammation in the PBS or antibiotic treatment group, whereas the spleen size was decreased in the siTACE/TKPR-9R treatment group.
  • siTACE/TKPR-9R successfully interferes with TACE in tissue macrophages and inhibits the expression of inflammation-related cytokines and chemokines and TNF- ⁇ that can cause tissue damage.
  • the group treated with the siTACE/TKPR-9R complex and antibiotics significantly reduced the protein levels of pro-inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ ) in the serum of septic mice injected with E. coli and P. aeruginosa. showed a down-regulating anti-inflammatory effect (Fig. 4d).
  • the siRNAFAM/TKPR-9R complex was significantly internalized by F4/80-positive primary macrophages. Compared to the naked siRNA-FAM group, the fluorescence intensity of the siRNA-FAM/TKPR-9R complex increased 9.7 times in F4/80-positive macrophages.
  • the experimental process was performed in the same manner as in FIG. 1e.
  • Human monocyte (THP-1) was activated by LPS for 2 hours. After activation, free TKPR peptide was incubated for 1 hour to block receptors on macrophages.
  • siRNA alone showed no change in fluorescence intensity when the NRP-1 receptor was blocked.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • cellular uptake of siRNA was mediated by TKPR directly binding to macrophage receptors. Consequently, activated macrophages with NRP-1 receptors in inflamed tissue can be specifically targeted through the peptide's TKPR sequence.
  • the human siTACE/TKPR-9R complex was efficiently internalized into the cytoplasm of THP-1 cells.
  • TKPR-mediated delivery of siTACE showed inhibition of TACE in LPS-induced THP-1 inflammatory macrophages. Transcription of the Tace gene was significantly suppressed (FIG. 7). The expression of pro-inflammatory cytokine markers TNF-a and IL-1beta was also decreased. Therefore, human siTACE/TKPR-9R can enhance gene suppression effect in in vivo experiments than siRNA alone.
  • TACE plays a key role in the severe inflammatory response in tissue and peritoneal fluid macrophages by causing excessive conversion of inactive membrane-bound TNF- ⁇ to soluble form.
  • TACE inhibitors presented a risk of liver toxicity and fibrosis due to lack of recognition of matrix metalloproteinases (MMPs).
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • the peptide-based siRNA delivery system was shown to enhance the macrophage targeting effect by binding to the NRP-1 receptor on the surface of macrophages.
  • Intravenously injected siRNA-FAM/TKPR-9R and siRNA-Cy5/TKPR-9R complexes showed targeting effects in peritoneal macrophages and tissue-resident macrophages in lung, liver, kidney and spleen, respectively (Fig. 5a, b).
  • the goal was to identify the siTACE/TKPR-9R complex as a novel anti-inflammatory platform for the treatment of sepsis induced by CLP surgery or by E. coli and P. aeruginosa bacterial injection methods.
  • siTACE/TKPR-9R complex downregulates pro-inflammatory cytokines and chemokines by inhibiting transcription of TACE at the molecular level, and that treatment with the complex reduces TACE and cytokine levels in septic mouse tissues. Confirmed. In addition, these results demonstrated that the anti-inflammatory effect of the siTACE/TKPR-9R complex improved survival rate and histological organ damage. In addition, anti-inflammatory and antibacterial effects were shown as a result of the combined administration of two types of antibiotics used in patients with sepsis and the siTACE/TKPR-9R complex.
  • siTACE/TKPR-9R complex is not only effective in relieving symptoms, but also as a fundamental molecular-level solution to sepsis.
  • the siTACE/TKPR-9R platform aims not to completely replace antibiotics, but to find a synergistic treatment that can be administered in combination with existing antibiotic therapies to overcome the limitations of antibiotic monotherapy.
  • Antibiotics such as gentamicin can reduce the amount of bacteria by blocking the synthetic cell membrane of bacteria, but it is difficult to directly prevent organ damage caused by endotoxins.
  • the present inventors developed a macrophage-targeted therapeutic agent to fundamentally improve the inflammatory pathway mediated by soluble TNF-a protein while supplementing the therapeutic effect of antibiotics.
  • siTACE/TKPR-9R combination and antibiotics were administered simultaneously, it was confirmed that the inflammatory response and organ damage to the lungs and liver were reduced (Fig. 3c, d) and the survival rate increased (Fig. 3b, e and f) compared to the administration of antibiotics alone. .
  • non-viral gene therapy using the siTACE/TKPR-9R complex has proven to be an innovative sepsis treatment method using macrophage-targeted gene transfer to treat severe inflammatory responses.
  • Combination treatment of anti-inflammatory gene therapy with antibiotics has been demonstrated as a promising drug combination for acute and systemic inflammation in sepsis through downregulation of excessive inflammatory mechanisms in organs, serum and peritoneal fluid.
  • the present invention shows a selective disease cell targeting effect and an anti-inflammatory effect that overcomes the limitations of antibiotic treatment.

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Abstract

본 발명은 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 효과가 있는 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE) siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체를 포함하되, 상기 비바이러스성 유전자 전달체는 TKPR-올리고-아르기닌의 TFA 염을 포함하는 유전자/전달체 복합체에 관한 것이다.

Description

급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 비바이러스성 유전자/전달체 복합체
본 발명은 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 비바이러스성 유전자/전달체 복합체에 관한 것이다.
염증은 병원체 또는 병원체의 의한 조직 손상에 대한 선척적인 반응으로서, 염증반응이 조절되지 않을 때는 유해 영향이 숙주 에게 매우 심각해질 수 있기 때문에 보다 철저한 연구가 필요하다.
급성염증은 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 통증, 열, 홍조, 농양 등의 증상이 나타나게 된다. 일반적으로 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 자극이 가해질 때 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템이다.
이러한 염증에 의한 치료는 대식 작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 대식 작용이란 침입균의 증식을 억제하거나 이물질들을 탐식하는 대식세포 (macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 대식세포의 기능을 항진시키는 등의 작용이다. 하지만 패혈증 및 내독소혈증과 같은 급성 염증반응에서는 리포 폴리 사카 라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 박테리아 부산물에 의한 대식세포의 과도한 활성화로 인해 발생함. 과도한 대식세포의 활성화는 인터루킨(interleukins, ILs) 및 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor, TNF)와 같은 사이토카인(cytokines)들이 후속적으로 증가하여 결국 장기의 기능정지로 이어지게 된다.
패혈증 및 내독소혈증과 같은 전신성 염증 반응은 30 ~ 60%의 사망률을 나타내기 때문에 중요한 임상적 문제를 제시한다. 높은 사망률의 주된 원인은 복수 개 장기의 기능 장애와 그에 따른 기능 정지의 결과이다. 따라서 급성 염증성 질환을 치료할 수 있는 항염증제 및 치료법이 절실하게 요구된다.
본 출원인에 의해 이전에 보고된 "한양대학교 대학원 석사학위논문, 김소미 (2014.02) 염증성 질환 치료를 위한 비바이러스성 TACE (Tumor necrosis factor-α converting enzyme) 간섭 유전자 전달 시스템 개발에 관한 연구" 문헌에 의한 종양괴사인자-알파 전환효소(TACE)의 shRNA(이하, "shTACE"라 명명함) 치료유전자 자체로는 인체 내에서의 안정성이 낮기 때문에 인체로의 적용에 한계가 있다. 더불어 shRNA의 작용은 핵막을 통과한 이후에 이루어지기에 급성 염증반응 치료시기를 놓칠 수 있어 세포질에서 RNA 간섭이 가능한 siRNA의 전달이 필요함. 유전자 치료에서 극복해야 하는 하나는 유전자 치료제가 세포막을 통과하여 효율적인 유전자 전달을 달성하는 것이다. 따라서 유전자 치료에 있어 효율적으로 siRNA 유전자를 전달하는 시스템에 대한 연구가 필수적이다.
또한, 기존 전달체의 경우에는 세포특이적 타겟 전달이 어려운 문제가 제기되었다.
이에, 본 발명자들은 기존 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA의 서열을 변형한 새로운 유전자 치료제를 제조하고, 이를 안정하게 전달할 수 있도록 하는 새로운 유전자 전달체를 합성하여, 급성 염증성 대식세포 표적 비바이러스성 유전자/전달체 복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체를 포함하는 유전자/전달체 복합체를 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자/전달체 복합체를 유효성분으로 포함하는 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 치료적 유효량의 청구항 1에 따른 유전자/전달체 복합체를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
본 발명은 종양괴사인자-알파 전환 효소(TACE)의 발현을 억제하는 siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체를 포함하는 유전자/전달체 복합체에 관한 것이다.
급성 패혈증, 급성 폐손상(Acute lung injury), 급성 간손상(Acute liver failure), 급성 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease) 등 다양한 급성 염증성 질환에서 대식세포의 질환장기에 침투가 증가하게 되고 이때 종양괴사인자-알파 전환효소(TACE)의 발현이 증가하다.
본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체를 투여 시 해당 질환장기 내 과발현된 염증성 대식세포를 표적하여 치료가 가능하다.
특히, 본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 미생물, 세균, 바이러스 등의 침투로 인한 급성 염증에서 뚜렷한 진단을 내릴 수 없거나, 즉발적인 항염증 효과를 기대하고 할 때 투여가 가능하다. 기존 shTACE의 경우 유전자가 세포막과 핵막을 모두 통과한 이후 유전자가 발현될 때까지 시간이 걸리나 siTACE의 경우 세포막 투과이후 즉각적인 mRNA 간섭을 통해 항염증 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 siTACE/TKPR-9R 복합체의 물리화학적 특성화를 나타낸 것이다 [도 1a: 겔 지연 분석. siTACE는 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 다양한 중량비의 TKPR-9R 펩타이드 기반 전달체와 결합되었다; 도 1b: 표면 제타 전위, 도 1c: 동적 광산란에 의해 측정된 siTACE/TKPR-9R 복합체의 평균 직경; 도 1d: 세포 생존율은 Raw 264.7 세포(n = 8)에서 siTACE/TKPR-9R 복합체(TKPR-9R/siRNA 1, 2, 3, 4의 중량비)를 처리한 후 MTT 분석에 의해 측정되었다. 데이터는 평균±SㆍD로 표시된다. 도 1b, c, d에서 3번째 행의 '+'는 1μg, '++' 및 '+++'는 각각 TKPR-9R 1.5μg 및 2μg을 나타낸다; siTACE의 경우 +(1ug), ++(2ug), +++(3ug)이며, TKPR의 경우 +(4ug), ++(8ug), +++(12ug)이다. 도 1e: TKPR-9R의 시험관내 대식세포 표적 효과 연구. 유리 TKPR-9R과 TKPR-9R/siRNA (중량비 4) 복합체 사이의 LPS 유도 염증성 Raw 264.7 대식세포에서의 경쟁 분석은 FAM-접합 siRNA를 사용하여 유세포 분석에 의해 수행되었다.
도 2는 siTACE/TKPR-9R 복합체의 시험관내 항염증 효과를 나타낸 것이다 [대식세포에서 지질다당류(LPS) 활성화 후, 세포를 24시간 동안 siTACE/TKPR-9R 복합체(중량비 4)로 형질감염시켰다.
도 2a: GAPDH와 비교한 상대 Tace mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)로 측정하고 비처리 LPS 그룹(n = 10)으로 정규화하였다. 도 2b: 전염증성 사이토카인 TNF-α 단백질 수준의 하향 조절, 도 2c: IL-6 단백질 수준 및 도 2d 각 그룹의 처리된 세포 배지에서 분비되는 케모카인 MCP-1 단백질 수준은 ELISA를 사용하여 정량화되었다(n = 8). 데이터는 평균 ± SD로 표시됨. 2행의 '+'는 1μg, '++' 및 '+++'는 복합체 내 2μg 및 3μg의 siTACE, 4행의 '+'는 4μg, '++' 및 '++++'은 복합체 및 각각 B, C 및 D에서 8 μg 및 12 μg의 TKPR-9R을 나타냄. LPS 그룹과 비교한 통계적 차이는 Dunnett's test, *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, n.s와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 계산되었다. = A, B, C 또는 D에서 중요하지 않음].
도 3은 siTACE/TKPR-9R 및 항생제를 사용한 전신 패혈증에 대한 생체내 병용 요법을 나타낸 것이다[도 3a: 맹장 결찰 및 천자(CLP) 유도 패혈증 모델, I.V. siTACE/TKPR-9R 복합체(siTACE 유전자: 1 mg/kg) 및 I.P. 겐타마이신(8 mg/kg) 주사 및 세팔로스포린(8mg/kg). 도 3b: 각 그룹의 CLP 유발 패혈증 마우스의 생존율을 5일 동안 모니터링하였다(n = 15-16). CLP + PBS 마우스와 비교하여 통계적 차이가 표시되었다(장기 순위 테스트). CLP+PBS 그룹에서는 4일 동안 15명 중 1명만이 생존했고 14명은 사망하였다. 도 3c: 패혈증 마우스에서 siTACE/TKPR-9R 복합 처리 후 1일째의 폐 및 간 조직 절편의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 조직병리학 점수. 도 3d: 병리학자는 조직학적 점수와 염증 중증도를 등급화하였다(척도 막대: 폐 = 500 μm, 간 = 200 μm). (도 3e) E. coli 및 (도 3f) P. aeruginosa를 C57BL/6 마우스, siTACE/TKPR-9R(siTACE: 1 mg/kg, IV) 및 항생제(Gentamycin 8 mg/kg, IP 및 Cephalosporin 8 mg/kg, IP)를 주사했다. 패혈증 마우스는 E에 siTACE/TKPR-9R 복합체와 항생제를 한 번 주사하고 F에 두 번 주사하였다. 각 그룹의 세균 유발 패혈증 마우스의 생존율을 5일 및 10일 동안 모니터링하였다(n = 8). 통계적 차이는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 표시되었다(장기 순위 테스트)].
도 4는 조직 및 혈청에서 siTACE/TKPR-9R 복합체의 생체외 항염증 효과를 나타낸 것이다[(a) 폐, 비장, 신장 및 간의 조직 균질물에서 TACE 단백질 발현 수준의 하향 조절. (a), (b), (c) CLP 수술 후 패혈증 마우스에 siTACE/TKPR-9R 복합체(siTACE 유전자: 1 mg/kg, I.V.)를 처리했다. (a) TACE 단백질 수준 및 (b) Tnf-α mRNA 수준은 액틴 및 GAPDH를 대조군으로 사용하여 측정되었다(n = 4). PBS 그룹과 비교한 통계적 차이는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었다. (c) 혈청으로부터의 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6) 및 케모카인(MCP-1) 수준을 ELISA로 측정하였다(n = 6). PBS 그룹과의 통계적 차이는 Dunnett's test, *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, n.s와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 계산되었다. = 중요하지 않음. (d), (e) E. coli 및 P. aeruginosa를 마우스에 세균 주입한 후, siTACE/TKPR-9R(siTACE: 1 mg/kg, I.V.) 및 항생제(Gentamycin: 8 mg/kg, I.P., Cephalosporin: 8 mg/kg, I.P.)를 치료제로 사용하였다. (d) 혈청 내 염증성 사이토카인 수준(n = 7). 혈청 내 전염증성 사이토카인 TNF-α 단백질 수준, IL-6 단백질 수준 및 IL-1β 단백질 수준의 하향 조절을 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 데이터는 평균 ± S.D., *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001로 표시됨. PBS 그룹과의 통계적 차이는 Dunnett's test, *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, n.s와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 계산되었다. n.s= 중요하지 않음. (e) 혈청(왼쪽)과 복막액(오른쪽)의 세균 부하를 측정하였다. 항생제의 항균 효과는 siTACE/TKPR-9R 복합체(n = 7)와 함께 투여된 경우에도 LB 플레이트에서 그람 음성 박테리아 E. coli DH5a에 대해 유지되었다. 살아남은 박테리아 콜로니를 계수하였다. PBS 그룹과 비교한 통계적 차이는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산되었다].
도 5는 siTACE/TKPR-9R 복합체의 대식세포 표적 효과를 나타낸 것이다[(a) 생체 내 생체 분포 이미지. 정상 마우스와 CLP-유도 패혈증 마우스에 siRNA-Cy5/TKPR-9R 복합체를 정맥 주사하고 처리 후 1시간, 6시간 및 24시간에 희생시켰다. 1차 대식세포(f4/80+)(b) 및 비대식세포(f4/80-)(c) 의 형광 강도 및 상대 평균 형광 강도(MFI) 값. 복강에서 F4/80에 대해 양성인 대식세포는 siRNA-FAM/TKPR-9R 복합체의 높은 세포 흡수를 나타냄(n = 3)].
도 6는 시험관내 대식세포 표적 효과를 나타낸 것으로, 인간 THP-1에 업테이트 실험 결과이다. 유리 TKPR-9R과 인간 siRNA/TKPR-9R(중량비 4) 복합체 사이의 LPS 유도 염증성 THP-1 대식세포에서의 경쟁 분석은 FAM-접합 siRNA를 사용하여 유세포 분석에 의해 수행되었다.
도 7는 인간 siTACE/TKPR-9R 복합체의 시험관내 항염증 효과를 나타낸 것이다[THP-1 대식세포에서 지질다당류(LPS) 활성화 후, 세포를 24시간 동안 유리 인간 siTACE, 인간 siTACE/PEI 복합체, 인간 siTACE/TKPR-9R 복합체(중량비 1/4)로 형질감염시켰다. GAPDH와 비교한 상대 Tace, Tnf-α, Il-1β mRNA 수준은 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)로 측정하고 비처리 LPS 그룹(n = 5)으로 정규화하였다.
이하, 본 발명에 대한 구체적인 설명은 다음과 같다.
빠른 염증반응의 억제를 위해 발현이 느린 shRNA 형태 대신 본 발명자들은 세포의 세포질에서 바로 작용이 가능한 새로운 종양괴사인자-알파 전환 효소(TACE)의 발현을 억제하는 siRNA (이하, siTACE로 명명함)를 개발하였다. 기존 shTACE의 경우 빠른 발현을 위해서는 세포질로 원하는 양만큼 계속 넣어줘야 하지만 상기 신규 siTACE는 많은 양을 넣어줄 필요가 없으므로 기존 유전자 치료제에 비해 경제적인 장점이 있다. 따라서, 세포질 내 TACE의 빠른 억제를 위해 siRNA(즉, siTACE)를 사용하여, 단시간 이내 항염증을 유도할 수 있다.
본 발명에서 TACE에 대한 siRNA은 SEQ ID NOS: 1 또는 2로 표시되는 하나 이상의 염기서열 및 이의 상보적인 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다.
마우스 siTACE
센스 서열: SEQ ID NO 1
안티센스 서열: SEQ ID NO 3
인간 siTACE
센스 서열: SEQ ID NO 2
안티센스 서열: SEQ ID NO 4
siRNA는 sense/anti-sense RNA로 구성된 이중나선 RNA 형태이며, 임의의 적합한 프로모터를 사용하여 재조합 원형 또는 선형 DNA 플라스미드로부터 발현시킬 수 있다. 플라스미드로부터 본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 프로모터에는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 프로모터가 포함된다. 당분야에서 숙련가라면 적합한 다른 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 재조합 플라스미드는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 플라스미드로부터 발현되는 siRNA는 표준 기술에 의해 배양된 세포 발현 시스템으로부터 분리시키거나 생체내 혈관신생 영역 또는 그 근처에서 세포내적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 siRNA는 2개의 별개의 상보적인 RNA 분자로서 또는 2개의 상보적인 영역이 있는 단일 RNA 분자로서 재조합 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 siRNA를 발현시키는데 적합한 플라스미드, siRNA을 플라스미드에서 발현시키기 위해 핵산 서열을 삽 입하는 방법, 및 목적하는 세포에 재조합 플라스미드를 전달하는 방법의 선택은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들을 참조한다[참조문헌: Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20 : 446-448; Brummelkamp TR et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; and Paul CP et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505-508].
또한, 본 발명의 siRNA는 생체내 혈관신생 영역 또는 그 근처에서 재조합 바이러스 벡터로부터 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 siRNA을 암호화하는 서열 및 siRNA 서열을 발현하는 데 적합한 임의의 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 사이토메갈로바이러스 프로모터가 포함된다. 당분야의 숙련가라면 다른 적합한 프로모터를 선택할 수 있 을 것이다. 또한 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 siRNA를 발현시키기 위한 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 2개의 별개의 상보적인 핵산 분자로서, 또는 2개의 상보적인 영역이 있는 단일 핵산 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현시킬 수 있다.
발현될 siRNA 분자에 대한 암호화 서열을 수용할 수 있는 어떠한 바이러스 벡터도 사용할 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스(AV), 아데노바이러스-수반 바이러스(AAV), 레트로바이러스(예: 렌티바이러스(LV), 라브도바이러스, 쥐 백혈병 바이러스), 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 있다. 또한, 바이러스 벡터의 친화성은, 다른 바이러스의 외피 단백질 또는 기타 표면 항원으로 벡터를 가성형태화시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터는 소수포구내염 바이러스(VSV), 광견병 바이러스, 에볼라 바이러스, 모콜라 바이러스 등의 표면 단백질로 가성형태화시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 재조합 바이러스 벡터, siRNA을 발현시키기 위해 핵산 서열을 벡터에 삽입하는 방법 및 목적하는 세포에 바이러스 벡터를 전달하는 방법의 선택은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 다음 문헌들을 참조한다[참조문헌: Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis MA 1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller AD (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; and Anderson WF (1998), Nature 392: 25-30]. 또한, 본 발명의 siRNA는 올리고뉴클레오타이드 형태로서 딜리버리 버퍼 (Delivery Buffer)를 이용하여 체세포에 트랜스펙션시킬 수 있다.
이러한 유전자 자체는 인산 구조로 음전하를 나타내기 때문에 유전자 자체로는 전기적 반발로 음전하를 나타내는 세포막을 관통하기 쉽지 않다. 따라서 유전자는 양전하를 나타내는 물질과 반응하여 복합체를 형성한 뒤 전체 전하가 양전하를 나타내야 세포 안으로 좀 더 쉽게 들어가고, 세포 내에서 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다. 이처럼 유전자를 세포 안으로의 전달을 높여주는 물질을 유전자 전달체(Carrier)라 부른다. 유전자의 향상된 전달과 높은 발현을 위해 유전자와 결합하여 유전자의 전달을 도와주는 물질을 의미하며, 이러한 유전자 전달체는 주로 양전하를 띄는 물질이며, 음전하의 유전자와 양전하의 유전자 전달체 간의 전기적 상호작용으로 유전자/전달체 복합체를 형성한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 비바이러스성 유전자 전달체로 터프트신(Tuftsin)-올리고아르기닌을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달체(이하, TKPR-9R로 명명함)를 이용하여 염증성 대식세포 표적할 수 있다. 염증성 대식세포 표적 펩타이드는 장기(간, 폐, 신장, 비장) 및 복강액 내 대식세포에 대한 선택적 표적이 가능한 터프트신(TKPR 펩타이드 서열)과 양전하로 세포 내 도입을 용이하게 하는 9개의 아르기닌 서열 (RRRRRRRRR, 9R)로 구성되어 있다.
상기 TKPR-9R은 양 말단 시스테인을 포함한다.
상기 TKPR-9R은'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys' 펩타이드 [Cys Thr Lys Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys: SEQ ID NO: 5]를 의미한다. 이때 아르기닌은 D form의 상태로 사용되었다.
먼저 'Cys- TKPR-(9Arg)-Cys' 펩타이드는 고상(固相) Fmoc 펩타이드 합성법을 이용할 수 있으며, 이는 정해진 서열 순서에 맞게 각각의 아미노산을 하나씩 신장하는 합성법으로 α-아미노기가 Fmoc(Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-풀루오레닐메톡시카르보닐)기로 보호된 아미노산을 사용한다. 펩타이드 사슬의 신장이 끝나면 TFA(Trifluoroacetic acid)로 처리하여 유리 형태의 펩타이드를 얻는다.
치료 유전자, 즉 siTACE로는 짧은 반감기와 낮은 세포 표적성 및 투과성으로 임상 적용에 한계가 있다. 효과적인 유전자 치료를 위해 siTACE는 세포막을 통과하여 표적 세포 내 세포질에서 효율적으로 TACE mRNA를 침묵시켜야 한다. 따라서, 본 발명에서는 대식세포 표적 전달체로 TKPR-9R 유전자 전달체를 이용하여 치료유전자의 생체 내 안정성을 높였다.
상기 인간 siTACE 및 상기 TKPR-9R은 전기적 상호작용으로 복합체를 형성하며, 우수한 치료 효과를 지닌 유전자/전달체 복합체(Peptoplex)를 형성하기 위해서는 복합체를 형성하는 유전자와 유전자 전달체의 최적 비율이 필요하다. 비율에는 중량 비율(weight ratio), 전하 비율(charge ratio), 질소/인 비율(N/P ratio) 등 여러 종류가 있으나, 본 발명에서는 중량 비율(weight ratio)를 사용한다. 본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 종양괴사인자-알파 전환 효소(TACE) siRNA와 TKPR-9R이 1: 1.2~5 또는 1:3~4.5의 중량 비율로 형성되는 것이 바람직하다.
감염에 의한 패혈증에서 체내 대식세포는 TACE를 과발현하게 되고 이로 인해 TNF-α가 방출되며 염증반응을 촉발해 장기에 극심한 손상을 초래한다. 따라서 siTACE를 대식세포에 특이적으로 전달하면 부작용 없이 효과적인 염증반응의 억제가 가능하다.
또한, 본 발명은 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체를 혼합하고 인큐베이션하는 단계를 포함하는 유전자/전달체 복합체의 제조방법을 포함한다.
상기 인큐베이션은 20 내지 40 ℃에서 20 내지 40분간 실시하는 것이 최적의 유전자/전달체 복합체를 형성하기 위한 이유로 바람직하다. 40 ℃ 초과의 고온에서 DNA는 염기끼리의 상호작용이 해소되고 그 결과 DNA는 변성된다. 전달체는 펩타이드의 중합반응으로 이루어져 있고, 이 또한 고온에서는 변성되므로 40 ℃ 이하의 온도에서 진행하는 것이 바람직하며, 복합체를 세포에 처리할 때에는 체온과 비슷한 온도에서 복합체 형성을 진행하는 것이 바람직하다. 한편, 인큐베이션 시간이 40분을 넘어가면 유전자와 전달체가 침전물을 형성하므로, 40분을 넘기지 않는 것이 바람직하다. 또한, 전기적 인력으로 유전자와 전달체의 혼합 후 복합체의 안정한 상태를 유지하기 위해 최소 20분 정도 인큐베이션 하는 것이 바람직하다.
siTACE는 음전하를, 비바이러스성 전달체는 양전하를 띄고 있다. 이 둘을 혼합하고 상온에서 20분 내지 40분 정도 인큐베이션하면 정전기적 인력으로 유전자/전달체 복합체를 형성할 수 있다. 복합체 형성 후 최종 부피를 그룹별로 동일하게 3DW, PBS 등으로 맞춰준다.
유전자/전달체 복합체의 최적의 중량 비율을 구하기 위해서는 먼저 유전자와 유전자 전달체 각각의 농도를 구해야 한다. 자외선 흡수 복사량은 DNA 양에 비례하므로, 자외선 분광광도계로 유전자 농도를 측정한다. 유전자/전달체 복합체의 침전을 막기 위해 보통 유전자 농도를 1 mg/ml 이하로 만드는 것이 바람직하다. 유전자 전달체는 HEPES 완충용액의 양을 조절하여 최종 농도를 1 mg/ml로 합성한다.
상기에서 유전자/전달체 복합체와 관련하여 기술한 모든 내용이 유전자/전달체 복합체의 제조방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 대식세포 표면의 NRP-1 수용체에 결합함으로써 선택적으로 대식세포 표적 효과를 향상시키는 것으로 나타났다.
특히, 본 발명에 따른 유전자/전달체 복합체는 대식세포 표면의 NRP-1 수용체에 결합함으로써 선택적으로 대식세포 표적 효과를 향상시키는 것으로 나타났다.
또한, 마우스 실험 동물에 대한 siTACE/TKPR-9R 유전자/전달체 복합체의 정맥주사는 각각 폐, 간, 신장, 비장의 복막 대식세포와 염증이 일어난 조직 내 대식세포에서 표적 효과를 보였다.
현재 급성 염증성 질환(예, 패혈증) 치료에 사용되는 항생제와 병용 투여하였을 때, 장기 별 염증 신호 체계가 완화되었으며, 생존율 개선의 유전자치료 결과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 유전자/전달체 복합체를 유효성분으로 포함하는 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 포함한다.
상기 급성 염증성 질환는 예를 들면 급성 패혈증, 급성 폐손상(Acute lung injury), 급성 간손상, 급성 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다
상기 급성 폐손상에는 바이러스, 세균 등에 의해서 생기는 급성 폐렴 등을 포함할 수 있고, 상기 급성 간손상에는 바이러스, 세균 등에 의해서 생기는 급성 간염 등을 포함할 수 있으며, 상기 급성 염증성 장질환은 감염성 장염을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막 내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여될 수 있다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 여러 번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 유전자 전달체 복합체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료적 유효량의 상기 복합체를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 급성 염증 억제 효과를 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 약학적 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 조성물과 함께 공지의 관련 질환 치료제를 병용 투여하여 관련 질환의 치료 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명의 용어 "대상체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 관련 질환을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유동물 또는 인간을 포함한다.
이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
제조예 1: 마우스 siTACE 벡터 제조
RNA 분자를 표적으로 하는 유전자 침묵 시스템의 치료유전자(siTACE)는 마우스 TACE (NM_001277266) 서열을 기반으로, 총 19개의 염기 서열 5’-ACACCTGCTGCAATAGTGA-3’(Sense sequence)[SEQ ID NO: 1], 5'- TCACTATTGCAGCAGGTGTT-3' (Antisense sequence)[SEQ ID NO: 3]을 제작하였으며 3‘ 말단 끝에 Overhang 서열인 TT를 추가하여 효율적으로 유전자 발현을 억제한다. siTACE의 올리고뉴클레오티드 화학 합성 공정을 통해 이루어진다. 고체 실리카 지지체를 이용하여 유전자를 구성하는 기초 염기 물질인 아데노신 (adenosine), 구아노신(guanosine), 시티딘(cytidine), 우라실(Uracil)을 순차적으로 붙여가며 합성하게 된다. 한 개의 염기를 순차적으로 붙일 때마다 디블로킹(de-blocking) 반응, 커플링(coupling) 반응, 캐핑(capping) 반응 및 산화 반응의 4단계를 거쳐 올리고뉴클레오티드를 합성하게 된다. 이후 암모니아수와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 회수하고, 합성된 올리고뉴클레오티드를 역상 실리카 수지를 사용하여 크로마토그래피 원리를 이용하여 정제하게 된다. 다음으로 정량 공정은 정제된 올리고뉴클레오티드를 UV 장비(UV spectrophotometer)를 사용하여 흡광도를 측정하고 이로부터 합성된 올리고뉴클레오티드의 몰수를 계산하여 얻어낸다.
한편, 본 발명의 유전자 치료제 시스템의 치료 효과는 마우스 동물 실험을 통해 검증되었다.
제조예 2: 인간 siTACE 벡터 제조
RNA 분자를 표적으로 하는 유전자 침묵 시스템의 치료유전자(siTACE)는 인간 TACE (NM_003183.5) 서열을 기반으로, 총 21개의 염기 서열 5’- GCTCTCAGACTACGATATTCT-3’(Sense sequence)[SEQ ID NO: 2], 5'-AGAATATCGTAGTCTGAGAGC-3' (Antisense sequence)[SEQ ID NO: 4]을 제작하였으며 3‘ 말단 끝에 Overhang 서열인 TT를 추가하여 효율적으로 유전자 발현을 억제한다. siTACE의 올리고뉴클레오티드 화학 합성 공정을 통해 이루어진다. 고체 실리카 지지체를 이용하여 유전자를 구성하는 기초 염기 물질인 아데노신 (adenosine), 구아노신(guanosine), 시티딘(cytidine), 우라실(Uracil)을 순차적으로 붙여가며 합성하게 된다. 한 개의 염기를 순차적으로 붙일 때마다 디블로킹(de-blocking) 반응, 커플링(coupling) 반응, 캐핑(capping) 반응 및 산화 반응의 4단계를 거쳐 올리고뉴클레오티드를 합성하게 된다. 이후 암모니아수와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 회수하고, 합성된 올리고뉴클레오티드를 역상 실리카 수지를 사용하여 크로마토그래피 원리를 이용하여 정제하게 된다. 다음으로 정량 공정은 정제된 올리고뉴클레오티드를 UV 장비(UV spectrophotometer)를 사용하여 흡광도를 측정하고 이로부터 합성된 올리고뉴클레오티드의 몰수를 계산하여 얻어낸다. 본 시스템을 임상으로 적용하기 위해서는 인간세포주에서의 실험이 선행되어야 한다. 인체 유래 세포 (THP-1)에서 본 유전자치료제의 항염증 효과 등을 검증해야 하며, 이때에는 마우스 siTACE 유전자 대신 인간 siTACE 유전자를 사용해야 한다.
제조예 3: 유전자 전달체(TKPR-9R)의 제조
염증성 대식세포 표적 펩타이드는 장기(간, 폐, 신장, 비장) 및 복강액 내 대식세포에 대한 선택적 표적이 가능한 TKPR 펩타이드 서열 (TKPR)과 양전하로 세포 내 도입을 용이하게 하는 9개의 아르기닌 서열 (RRRRRRRRR, 9R)로 구성되어 있다. 이때 아르기닌은 D form의 상태로 사용되었다.
먼저, 고상(固相) Fmoc 펩타이드 합성법을 이용하여 'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys'단량체 펩타이드를 합성하였다. 이는 정해진 서열 순서에 맞게 각각의 아미노산을 하나씩 신장하는 합성법으로 α-아미노기가 Fmoc(Fluoreonylmethoxycarbonyl, 9-풀루오레닐메톡시카르보닐)기로 보호된 아미노산을 사용하였다. 펩타이드 사슬의 신장이 끝나면 TFA로 처리하여 유리 형태의 펩타이드를 얻었다. 그 후 TFA 염 형태의 'Cys- TKPR-(9Arg)-Cys'단량체 펩타이드를 아세트산 염 형태로 치환하였다. AG1-X8 레진을 매개로 한 이온교환 크로마토그래피 방법을 통해 염 형태를 아세트산 염으로 치환하였다.
'Cys-TKPR-(9Arg)-Cys'= Cys Thr Lys Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys [SEQ ID NO: 5]
제조예 4: siTACE/TKPR-9R 복합체 제조
(마우스 siTACE가 인간 siTACE으로 변경된 것 외에는 siTACE/TKPR-9R 복합체 제조방법은 동일하게 진행되었다.)
종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체(TKPR-9R)은 1mg/ml의 농도로 준비되었다. 유전자 및 전달체 총 부피의 4배의 PBS 용액 내에 유전자와 펩타이드를 투여하고 상온(25 ℃)에서 30분간 인큐베이션을 진행하였다. 인큐베이션 시간이 40분을 넘어가면 유전자와 전달체가 침전물을 형성하므로, 40분을 넘기지 않는 것이 바람직하다.
실시예: 유전자/유전자 전달체 복합체 형성 및 효능 확인
[실험과정]
<재료>
FBS(Fetal bovine serum)와 고포도당을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)은 WELGENE(Seoul, Korea)에서 구입하였다.
지질다당류(LPS), 젖산(LA), 폴리에틸렌이민(PEI, 분지형 25kDa 형태) 및 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드) 용액은 Sigma-Aldrich(미국 세인트루이스)에서 구입하였다.
항체(Anti-TACE, Anti-GAPDH)는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다.
폴리(비닐리덴 플루오라이드)(PVDF) 전달 멤브레인은 Millipore Sigma(Burlington, MA, USA)에서 구입하였다.
마우스 ELISA 키트(TNF-α, IL-1β, MCP-1)는 Thermofisher Scientific(USA)에서 구입했으며 마우스 ELISA 키트(IL-6)는 eBioscience(USA)에서 구입하였다.
<아가로스 겔 전기영동>
1 μg의 siTACE 치료유전자(siRNA)를 다양한 양 (0.5, 1, 2, 3, 4 μg)의 TKPR-9R 전달체와 상온에서 30분 동안 incubation하여 유전자치료제 복합체를 형성하였다. 그 후 0.5 × TBE 완충용액의 0.8% (w/v) agarose gel에서 100 V로 20분 동안 전기영동을 내려 전하 비교에 따른 복합체 형성 여부를 확인하였다.
<복합체의 표면전하 및 크기 측정>
5 μg의 siTACE 치료유전자를 다양한 중량비율에서 (TKPR-9R/siRNA Weight ratio 1, 2, 3, 4)의 siTACE/TKPR-9R 복합체를 상온에서 30분 간 incubation하여 복합체를 형성한 후, 3차 증류수로 전체 부피를 800 μl로 맞추었다. Zeta sizer-ZS (Malvern) 기계를 통해 복합체의 표면전하와 크기를 측정하였다.
<Raw 263.7 Macrophage (대식세포)에 대한 TKPR 펩타이드의 결합능 분석>
LPS(lipopolysaccharide)에 의해 M1 type의 염증성 대식세포로 분화시킨 후, TKPR 펩타이드에 의한 경쟁적 결합능 분석 실험을 위해 Free-TKPR-9R 펩타이드를 상온에서 2시간 동안 먼저 처리하였다. 그 후 FAM 형광이 결합된 siRNA 유전자(FAM-siRNA)와 TKPR-9R 펩타이드와 상온에서 30분 반응하고 대식세포로의 복합체 도입 정도를 FACS로 분석하였다. 또한 TKPR-9R 펩타이드 없이 siRNA-FAM 유전자만 대식세포에 처리한 그룹(Naked-siRNA-FAM)을 통해 유전자에 의한 대식세포 도입 정도를 FACS로 분석하였다.
<세포 배양>
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 FBS (Fetal bovine serum)을 WelGENE (한국)으로부터 구입하여 배지를 형성하였다. RAW 264.7 마우스 유래 대식세포 (Mouse macrophage)를 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 이틀에 한 번씩 새로운 배지로 계대배양하였다. 10% FBS, 페니실린 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml) 보충된 완전 배지에서 37℃, 5% CO2 대기 조건의 incubator에서 배양하였다.
< TACE mRNA 측정 (세포 내 RNA 분리 및 Real-time PCR)>
세포 배양 플레이트 (Cell culture plate)의 한 웰 (well) 당 세포 4 × 10^4 개수의 마우스 유래 대식세포 (RAW 264.7 macrophage)를 12-well plate에 24 시간 동안 배양하였다. LPS (Lipopolysaccharide)를 1μg/ml의 농도로 1시간 동안 대식세포에 처리한 후, siTACE/TKPR-9R 유전자/전달체 복합체를 24 시간 동안 처리했다. 그 후 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포를 균일하게 깨준 뒤 RNA만을 분리하였다. 분리한 RNA는 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)로 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 반응시켜 그룹별 RNA 1 μg 각각에 대한 상보적인 cDNA를 합성하였다. 그 후 Cyber premix Ex taq RT-PCR kit를 이용하여 endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 TACE mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다. (마우스의 경우 TACE에 대한 Forward primer는 5’-GTACGTCGATGCAGAGCAAA-3’[SEQ ID NO: 6]이며, Reverse primer는 5’-AAACCAGAACAGACCCAACG-3’ [SEQ ID NO: 7]이고; 인간의 경우 TACE에 대한 forward primer는 5'-TGAAGAGCTTGTTCATCGAG-3' [SEQ ID NO: 8]이며, reverse primer는 5'-CCATGAAGTGTTCCGATAGATGTC-3'[SEQ ID NO: 9]이다.)
<수용성 (염증성) TNF-α 측정 (ELISA)>
세포 배양 플레이트 (Cell culture plate)의 한 웰 (well) 당 세포 4 × 10^4 개수의 마우스 유래 대식세포 (RAW 264.7 macrophages)를 24시간 동안 배양하였다. 그 후 양성 대조군 LA (Lactic acid) 처리 그룹을 제외하고, 한 웰 (well) 당 1μg/ml의 LPS (Lipopolysaccharide)를 1시간 동안 처리해서 대식세포의 염증 상태를 유도하였다. LA (Lactic acid) 처리 그룹은 M2 type 대식세포로 활성화시키기 위함이다. 염증상태의 대식세포에 siTACE/TKPR-9R 유전자/전달체 복합체를 48 시간 동안 처리했다. 그 후 각각의 웰 (well)에서 세포의 배지를 얻어 4 ℃, 13000 rpm, 5min 원심분리를 통해 배지의 상층액을 샘플로 이용하였다. 배지 샘플로부터 수용성 TNF-α 염증성 매개물질 (사이토카인) 양을 샌드위치 ELISA를 통해 측정하였다.
<패혈증 동물 모델링 및 유전자/전달체 유전자치료제 주입>
C57BL/6 실험 동물에 CLP(Cecal ligation and puncture)의 수술적 방법으로 패혈증 모델링을 진행한 24시간 후 20 ㎍의 siTACE 치료 유전자와 80 ㎍의 TKPR-9R 전달체로 형성된 유전자/전달체 복합체(siTACE/TKPR-9R 복합체)를 꼬리 정맥으로 주입하였다. 이때 CLP(Cecal ligation and puncture)방법은 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg)으로 마취 후, 복부 부위의 4-0 black silk suture으로 맹장 말단에서 1~1.5츠 묶은 후, 주사기 바늘로 2개의 puncture을 내고 수술용 집게로 압력을 가해 맹장 내 대변을 puncture 밖으로 유도한 후, 복막을 4-0 black silk suture로 꿰맸다. 실험동물에 처리한 유전자 치료제 양은 약 1 mg/kg였다.
<Survival rate 측정>
CLP(Cecal ligation and puncture)의 수술적 방법으로 유도한 패혈증 모델에서 유전자치료제 주입 후, 항생제 중 Gentamicin(8 mg/kg, I.P.)과 Cephalosporin(8 mg/kg, I.P.)를 함께 주입하여, 병용투여 효과에 의한 생존율 변화를 5일 동안 확인했다.
<복강액 내 대식세포 결합능 측정>
마우스 실험동물이 해부되어 복강에 PBS를 주입하여, 복강액 내 대식세포를 얻었다. 대식세포만을 분리하기 위해, 복강액을 300g에서 3분 동안 원심분리한 후 primary macrophage를 12-well plate에 37℃, 5% CO2 대기 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 유전자/전달체 복합체(FAM-siRNA/TKPR-9R 복합체)를 4시간 동안 처리한 후, PBS로 세척하고 4% paraformaldehyde(PFA)로 30분 동안 고정한 후, 대식세포 표적 Anti-F4/80 항체를 사용해 대식세포에 대한 유전자치료제 도입 정도를 FACS Calibur(BD bioscience)로 분석하였다.
<Ex vivo sampling>
CLP(Cecal ligation and puncture)의 수술적 방법으로 유도한 패혈증 모델에서 유전자치료제 처리가 완료된 후 실험동물은 해부되어 각 장기(간, 폐, 신장, 비장)와 혈청을 얻었다. 장기 조직 샘플은 물리적으로 분쇄한 뒤 Reporter lysis 5X buffer(Promega)와 0.1mM PMSF(Protease inhibitor)를 처리하였고, 16,800rpm, 4도씨에서 30분 동안 원심분리로 단백질 함유 상층액을 얻었다. 단백질 샘플을 Laemmli buffer와 10분 동안 끓인 후, 10% SDS-PAGE 겔 전기영동을 내린 후, Polyvinylidene fluoride membrane(Millipore)와 Trans-blot turbo transfer system(Bio-rad), Anti-TACE 항체로 TACE 단백질 발현량을 측정하였다. 또한 일부 장기 샘플을 RLT buffer(Qiagen)으로 균질하게 깬 뒤 RNA를 얻어 iScript cDNA synthesis kit로 cDNA를 합성하여, endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 TNF-α mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다. (마우스의 경우 TNF-α에 대한 Forward primer는 5'-TCTCATGCACCACCATCAAGGACT-3'[SEQ ID NO: 10]이며, Reverse primer는 5'-ACCACTCTCCCTTTGCAGAACTCA-3’[SEQ ID NO: 11]이고; 인간의 경우 TNF-α에 대한 Forward primer는 5'-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3' [SEQ ID NO: 12]이며, Reverse primer는 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3' [SEQ ID NO: 13]이다.) 마지막으로 채혈 후, 30분 동안 상온에서 incubation하여 blood clot을 형성하고, 1500g, 4℃ 10분 동안 원심분리하여, 혈청을 분리하고 혈중 TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1 염증성 사이토카인 및 키모카인의 매개물질을 ELISA로 분석하였다.
<세포 배양>
RPMI (Dulbecco's Modified Eagle Medium)와 FBS (Fetal bovine serum)을 WelGENE (한국)으로부터 구입하여 배지를 형성했다. THP-1 사람 유래 대식세포 (human macrophage)를 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 이틀에 한 번씩 새로운 배지로 계대배양하였다. 10% FBS, 페니실린 (100 IU/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml) 보충된 완전 배지에서 37℃, 5% CO2 대기 조건의 incubator에서 배양하였다.
<THP-1 (대식세포)에 대한 TKPR 펩타이드의 결합능 분석>
LPS(lipopolysaccharide)에 의해 M1 type의 염증성 대식세포로 분화시킨 후, TKPR 펩타이드에 의한 경쟁적 결합능 분석 실험을 위해 Free-TKPR-9R 펩타이드를 상온에서 2시간 동안 먼저 처리하였다. 그 후 FAM 형광이 결합된 siRNA 유전자(FAM-siRNA)와 TKPR-9R 펩타이드와 상온에서 30분 반응하고 대식세포로의 복합체 도입 정도를 FACS로 분석하였다. 또한 TKPR-9R 펩타이드 없이 siRNA-FAM 유전자만 대식세포에 처리한 그룹(Naked-siRNA-FAM)을 통해 유전자에 의한 대식세포 도입 정도를 FACS로 분석하였다.
< TACE mRNA 측정 (세포 내 RNA 분리 및 Real-time PCR)>
세포 배양 플레이트 (Cell culture plate)의 한 웰 (well) 당 세포 4 × 10^4 개수의 마우스 유래 대식세포 (THP-1 macrophage)를 12-well plate에 24 시간 동안 배양하였다. LPS (Lipopolysaccharide)를 1μg/ml의 농도로 1시간 동안 대식세포에 처리한 후, siTACE/TKPR-9R 유전자/전달체 복합체를 24 시간 동안 처리했다. 그 후 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 세포를 균일하게 깨준 뒤 RNA만을 분리하였다. 분리한 RNA는 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)로 역전사효소 (Reverse transcriptase)와 반응시켜 그룹별 RNA 1 μg 각각에 대한 상보적인 cDNA를 합성하였다. 그 후 Cyber premix Ex taq RT-PCR kit를 이용하여 endogenous 대조군인 GAPDH에 대한 상대적인 TACE, TNF-alpha, IL-1beta mRNA 양을 Real-time PCR을 통해 측정하였다. (마우스의 경우 TACE에 대한 Forward primer는 5’-GTACGTCGATGCAGAGCAAA-3’[SEQ ID NO: 6]이며, Reverse primer는 5’-AAACCAGAACAGACCCAACG-3’ [SEQ ID NO: 7]이고; 인간의 경우 TACE에 대한 forward primer는 5'-TGAAGAGCTTGTTCATCGAG-3' [SEQ ID NO: 8]이며, reverse primer는 5'-CCATGAAGTGTTCCGATAGATGTC-3'[SEQ ID NO: 9]이다.) (마우스의 경우 TNF-α에 대한 Forward primer는 5'-TCTCATGCACCACCATCAAGGACT-3'[SEQ ID NO: 10]이며, Reverse primer는 5'-ACCACTCTCCCTTTGCAGAACTCA-3’[SEQ ID NO: 11]이고; 인간의 경우 TNF-α에 대한 Forward primer는 5'-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3' [SEQ ID NO: 12]이며, Reverse primer는 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3' [SEQ ID NO: 13]이다.) (마우스의 경우, IL-1beta 에 대한 Forward primer는 5'-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3' [SEQ ID NO: 14]이며, Reverse Primer는　5'-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3' [SEQ ID NO: 15]이고, 인간의 경우 IL-1beta 에 대한 Forward primer는 5'-GGACAAGCTGAGGAAGATGC-3' [SEQ ID NO: 16]이며, Reverse Primer는　5-TCCATATCCTGTCCCTGGAG-3' [SEQ ID NO: 17]이다.)
[실험 결과]
1. siTACE/TKPR-9R 복합체의 물리화학적 특성 및 시험관내 대식세포 표적화 가능성
효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자가 전달되어야 한다. 표적 세포에서 발현된다. 그러나 치료용 siRNA와 세포막은 모두 음전하를 띠고 있어 대식세포에 유전자를 도입하기 어렵다. 따라서, siTACE/TKPR-9R 복합체의 중량비를 최적화하기 위해 특성화 실험을 수행하였다. siTACE와 TKPR-9R을 탈이온수에서 30분 동안 배양한 후, siTACE/TKPR-9R 복합체가 응축 및 안정화되었는지 여부를 결정하기 위해 아가로스 겔 지연 테스트를 수행하였다(도 1a). TKPR-9R/siTACE 1 이상의 비율에서 siTACE/TKPR-9R 복합체의 안정적인 형성을 확인하였다. 반면, 중량비가 1 미만인 그룹의 siRNA는 이온 반발력으로 인해 아가로스 겔 상부에서 아래로 이동하였다. TKPR-9R/siTACE 중량비가 4에서 siTACE/TKPR-9R 복합체는 양성을 보였다. 32.2(±7.2) mV 제타 전위 및 313.7 nm(±72.45)의 나노복합체 크기 및 0.208의 다분산 지수(PDI) 값을 갖는다(도 1b 및 도 1c).
마우스 siTACE/TKPR-9R의 24시간 배양 후 (TKPR-9R/siRNA의 최적 중량비 4)평균직경과 표면 제타전위가 유지되었고 TKPR-9R/siRNA의 최적 중량비 4에서 PDI값이 0.158로 크기가 잘 분산되었다. 또한, TKPR-9R/siRNA의 최적 중량비 4는 Raw264.7 세포에 대한 무독성 효과를 나타내어 TKPR-9R 펩타이드가 PEI 보다 더 안전함을 나타내었다(도 1d). siRNA-FAM/TKPR-9R 복합체(1:4의 중량비)의 세포 흡수는 1:3의 중량비에서 복합체의 세포 흡수보다 높았다. 또한, TKPR-9R의 대식세포 특이적 표적화 능력을 검증하기 위해 유리 TKPR 펩타이드를 이용한 경쟁 분석을 수행하였다(도 1e). Raw264.7은 2시간 동안 LPS에 의해 활성화되었다. 활성화 후, 유리 TKPR 펩티드를 1시간 동안 배양하여 대식세포의 수용체를 차단했다. siRNA 단독은 NRP-1 수용체가 차단되었을 때 형광 강도의 변화를 나타내지 않았다. 그러나, 복합체의 평균 형광 강도(MFI)는 수용체가 유리 TKPR로 채워졌을 때 유의하게 감소했다. 그 결과, siRNA의 세포 흡수는 대식세포의 수용체에 직접 결합하는 TKPR에 의해 매개되었다.
결과적으로, 염증 조직에 NRP-1 수용체를 갖는 활성화된 대식세포는 펩티드의 TKPR 서열을 통해 특이적으로 표적화될 수 있다. 또한, siTACE/TKPR-9R 복합체는 Raw 264.7 세포의 세포질에 효율적으로 내재화되었다.
(이후 실험에 나타낸 TKPR-9R/siRNA 복합체의 최적 중량비는 4/1(유전자:전달체=1:4의 중량비)로 사용되었다.)
2. 마우스 대식세포 원시 264.7 세포주에서 siTACE/TKPR-9R 복합체의 시험관 내 Tace 유전자 억제 효과
siTACE의 TKPR 매개 전달은 염증성 대식세포에서 TACE의 억제를 보여주었다. Tace 유전자의 전사는 양이온성 고분자나 펩타이드를 사용할 때 유의하게 억제되었다(도 2a). 그러나 PEI는 높은 세포 독성을 나타내었으며, PEI는 표적을 벗어났다. 효과는 패혈증 치료에 심각한 실패를 초래할 수 있다. 대조적으로, TKPR-9R은 Raw 264.7 대식세포에서 높은 생존율과 독성 없이 TACE의 더 나은 전사 억제를 나타냈다(도 2d). TNF-α의 발현도 용량 의존적으로 감소하였다(도 2b). 염증유발 대식세포와 항염증 대식세포 간의 TNF-α 발현 정도를 비교하기 위해 LA를 M2형 대식세포 분극화로 사용하였다. 고용량의 siTACE/TKPR-9R 복합체는 TNF-α 단백질의 분해를 상향 조절하여 단핵구를 M2 표현형 대식세포로 분화시키는 LA 처리군과 유사한 단백질 수준을 초래하였다. TKPR-9R 운반체가 없는 siRNA도 용량 의존적 방식으로 TNF-α의 억제를 나타내었지만 siTACE/TKPR-9R 복합체만큼 효율적이지 않았다.
또한, 사이토카인 및 케모카인의 정량적 단백질 수준 분석은 siTACE/TKPR-9R 복합체로 처리된 그룹에서 하향 조절된 수준을 보여주었다(도 2c, d). LPS는 대식세포를 활성화하여 IL-6 및 MCP-1과 같은 다양한 전염증성 사이토카인 및 케모카인을 분비하는 반면 LA는 사이토카인 및 케모카인 수준을 약화시킨다.
LPS로 활성화된 대식세포로부터의 사이토카인 방출은 siTACE/TKPR-9R 복합체로 처리함으로써 용량 의존적 방식으로 억제되었다. siTACE 단독은 Tace mRNA 및 염증성 사이토카인에 약한 간섭 효과를 나타내었지만 siTACE/TKPR-9R 복합체는 그 효능을 극적으로 증가시켰다. 따라서 TKPR-9R은 siRNA 단독 보다 생체 내 실험에서 유전자 억제 효과를 높일 것으로 예상할 수 있다. 또한, 이러한 항염증 효과는 siTACE 유전자를 TKPR-9R 운반체와 결합했을 때 더욱 증가하였지만, 유전자 또는 운반체 단독으로는 불충분하였다.
3. 패혈증 마우스에서 siTACE/TKPR-9R 복합체 및 항생제 병용
siTACE/TKPR-9R 복합체의 치료 효과는 CLP 수술에 의해 중증 패혈증 마우스 모델에서 조사되었다. 이 CLP 모델링 방법은 복강을 맹장에서 나오는 대변과 세균으로 오염시키기 때문에 인간의 임상 질환(다균성 패혈증)과 가장 병리학적으로 유사하다.
패혈증 마우스에 siTACE/TKPR-9R 복합체(siTACE 유전자: 1 mg/kg)를 정맥 주사한 후, CLP 유도 패혈증 모델에서 5일 동안의 생존율을 모니터링하여 보호 효과를 조사하였다(도 3a). PBS 주입 대조군은 7%의 생존율을 보인 반면, siTACE/TKPR-9R 주입군은 치명적인 염증 캐스케이드를 약화시켜 53%로 유의한 개선을 나타냈다(도 3b). 항생제 투여군과 siTACE/TKPR-9R 투여군의 생존율 차이는 7%에 불과하였다. 항생제와 siTACE/TKPR-9R 복합체의 병용 치료의 시너지 효과는 73%의 높은 생존율로 확인되었다. 생존율 데이터와 일치하게, siTACE/TKPR-9R 복합체의 임상적 개선은 CLP로 유도된 패혈증 마우스의 폐 및 간의 조직 섹션에서 조직학적 분석에 의해 입증되었다(도 3c, d). 각 장기를 수확하고 섹션을 H&E로 염색하였다. 병리학자들은 조직학적 점수를 매겼고, 패혈증 중증도는 siTACE/TKPR-9R 그룹이 PBS 그룹보다 현저히 낮았다.
또한, siTACE/TKPR-9R(siTACE 유전자: 1 mg/kg) 복합체의 보호 효과는 E. coli 및 P. aeruginosa를 주사한 세균 유발 패혈증 마우스에서 입증되었다(도 3e). siTACE/TKPR-9R 복합제와 항생제를 병용 투여했을 때 항생제 단독 투여 시보다 생존율이 유의하게 증가하였다. 또한 siTACE/TKPR-9R(siTACE 유전자: 1 mg/kg)과 항생제(젠타마이신: 8 mg/kg, 세팔로스포린: 8 mg/kg)를 동시에 투여한 군에서 2회 주사의 생존율이 더 높았다. 단일 주입 보다 시간이 더 오래 걸렸다(도 3e, f).
4. 패혈증의 중증 염증에 대한 siTACE/TKPR-9R 복합체의 항염증 효과
TNF-α의 양성 피드백 체인 반응을 깨뜨려 siTACE/TKPR-9R 복합체의 항염증 효과를 확인하기 위해 조직에서 TACE 수치를 측정하였다. 복합체가 CLP로 유도된 마우스에 정맥내 주사되었을 때 24시간 후에 각 마우스로부터 조직을 얻었다.
TACE의 단백질 수준은 siTACE/TKPR-9R 복합 처리군에서 유의하게 감소했지만 항생제 단독 투여군에서는 그렇지 않았다(도 4a). 또한, 복합제와 항생제를 모두 투여한 그룹은 TACE 수준에서 더 유의한 감소를 보였다. 또한, 복합체는 폐, 신장, 비장 및 간에서 Tnf-α 유전자의 전사에 영향을 미쳤다(도 4b). 항생제 단독으로는 TNF-α mRNA 수준을 감소시키지 않았기 때문에 용해성 TNF-α 단백질 자체가 촉진에 관여하는 주요 분자로 보였다. 복합 치료 그룹에서 감소된 TACE 단백질은 염증의 양성 피드백 루프를 방해하였다.
따라서, siTACE/TKPR-9R 복합체는 마우스에서 순환하는 사이토카인 수준을 억제하였다(도 4c). 가용성 TNF-α의 감소는 IL-6 분비를 촉진하는 NF-κB 활성화를 완화할 수 있다. 왜냐하면 TNF-α는 IL-6과 같은 다른 전염증성 사이토카인의 방출을 유도하는 염증 자극의 초기 사이토카인이기 때문이다.
이 그룹은 대조군 및 항생제 처리 그룹과 비교하여 혈청 내 TNF-α 수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 그러나 항생제군에서 IL-1β와 IL-6이 감소하여 패혈성 염증 치료에 있어 항생제가 복합체와 상승작용을 하는 것으로 나타났다. 케모카인(MCP-1) 수준은 복합 처리군에서 감소했으며, 이는 TNF-α의 하향 조절이 폐 및 간에서 염증성 대식세포의 침윤을 감소시키는 것을 설명할 수 있다(도 3c, 도 4c). 또한, 패혈증 마우스의 비장은 PBS 또는 항생제 처리군에서 심한 염증으로 인해 비대해진 반면, siTACE/TKPR-9R 처리군에서는 비장 크기가 감소하였다.
이러한 발견은 siTACE/TKPR-9R이 조직의 대식세포에서 TACE를 성공적으로 방해하고 조직에 손상을 줄 수 있는 염증 관련 사이토카인 및 케모카인과 TNF-α 발현을 억제한다는 것을 보여준다.
게다가, siTACE/TKPR-9R 복합체와 항생제로 치료한 그룹은 E. coli 및 P. aeruginosa를 주사한 패혈증 마우스의 혈청에서 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β) 단백질 수준을 하향 조절하는 항염증 효과를 나타냈다(도 4d).
또한, 병용 투여군(siTACE/TKPR-9R 및 항생제)은 세균 유발 패혈증 마우스에서 항균 효과를 나타냈다(도 4e). 이러한 결과에 따르면 항생제와 복합체는 항염 효과에서 다른 역할을 한다.
5. siRNA/TKPR-9R 복합체의 대식세포 표적 효과
장기의 대식세포로의 표적 유전자 전달을 확인하기 위해, Cy5-conjugated-siRNA/TKPR-9R 복합체를 정상 및 CLP 유도 패혈증 마우스에 정맥 주사하였다(도 5a).
생체 외 생체 분포 이미지는 주사 후 1시간에 간, 폐, 신장 및 비장에 축적된 총 형광 강도를 나타낸다. Cy5 형광은 24시간 후 정상 마우스의 비장과 신장에서 대부분 제거되었지만, 패혈증 마우스에서의 축적은 간, 비장 및 신장에서 더 높은 국소화를 나타냈다. 이것은 조직 상주 대식세포의 모집이 패혈증에서 치명적인 염증 동안 증가한다는 것을 나타낸다. 그러나 나노 크기의 복합체는 간 축적에서 표적 및 비 표적 메커니즘을 가지고 있다. 따라서, siRNA/TKPR-9R 복합체를 사용한 대식세포 내재화를 정상 마우스에서 조사하였다(도 5b, 도 5c).
복강에서 siRNAFAM/TKPR-9R 복합체는 F4/80 양성 1차 대식세포에 의해 상당히 내재화되었다. 네이키드 siRNA-FAM 그룹과 비교하여 siRNA-FAM/TKPR-9R 복합체는 F4/80 양성 대식세포에서 형광 강도가 9.7배 증가하였다.
6. 인간 대식세포 원시 264.7 세포주에서 인간 siTACE/TKPR-9R 복합체의 시험관 내 Tace 유전자 억제 효과
TKPR-9R의 인간 대식세포 특이적 표적화 능력을 검증하기 위해 유리 TKPR 펩타이드를 이용한 경쟁 분석을 수행하였다(도 6).
실험과정은 상기 도 1e와 동일하게 진행하였다. Human monocyte (THP-1)은 2시간 동안 LPS에 의해 활성화되었다. 활성화 후, 유리 TKPR 펩티드를 1시간 동안 배양하여 대식세포의 수용체를 차단하였다. siRNA 단독은 NRP-1 수용체가 차단되었을 때 형광 강도의 변화를 나타내지 않았다. 그러나, 복합체의 평균 형광 강도(MFI)는 수용체가 유리 TKPR로 채워졌을 때 유의하게 감소했하였다. 그 결과, siRNA의 세포 흡수는 대식세포의 수용체에 직접 결합하는 TKPR에 의해 매개되었다. 결과적으로, 염증 조직에 NRP-1 수용체를 갖는 활성화된 대식세포는 펩티드의 TKPR 서열을 통해 특이적으로 표적화될 수 있다. 또한, 인간 siTACE/TKPR-9R 복합체는 THP-1 세포의 세포질에 효율적으로 내재화되었다.
siTACE의 TKPR 매개 전달은 LPS로 유도된 THP-1 염증성 대식세포에서 TACE의 억제를 보여주었다. Tace 유전자의 전사는 유의하게 억제되었다(도 7). 전염증성 사이토카인 마커인 TNF-a와 IL-1beta 발현도 감소하였다. 따라서 인간 siTACE/TKPR-9R은 siRNA 단독 보다 생체 내 실험에서 유전자 억제 효과를 높일 수 있다.
[결론]
이전 연구에서 박테리아 주입에 의해 손상된 기관에서 림프구 및 대식세포의 모집은 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인이 상향 조절될 때 더 악화되었다. TACE는 비활성 막 결합 TNF-α의 가용성 형태로의 과도한 전환을 유발하여 조직 및 복막액의 대식세포에서 심각한 염증 반응에 핵심 역할을 한다고 보고되었다.
따라서 급성 염증성 패혈증의 치료를 위해서는 염증 신호 전달 경로를 억제하는 근본적인 치료법이 필수적이다. 여러 제약 회사에서 TACE 억제제 약물 개발을 시도했다. 그러나 펩타이드 TACE 억제제는 기질 메탈로프로테이나제(MMP)에 대한 인식 부족으로 간 독성과 섬유화 위험을 나타냈다.
따라서 TACE를 방해하기 위해서는 새로운 저독성 접근법이 필요하다.
본 발명에서 펩타이드 기반 siRNA 전달 시스템은 대식세포 표면의 NRP-1 수용체에 결합하여 대식세포 표적 효과를 향상시키는 것으로 나타났다. 정맥 주사된 siRNA-FAM/TKPR-9R 및 siRNA-Cy5/TKPR-9R 복합체는 각각 폐, 간, 신장 및 비장의 복막 대식세포 및 조직 상주 대식세포에서 표적화 효과를 나타내었다(도 5a, b). 목표는 CLP 수술 또는 E. coli 및 P. aeruginosa 박테리아 주입 방법에 의해 유도된 패혈증 치료를 위한 새로운 항염증 플랫폼으로서 siTACE/TKPR-9R 복합체를 확인하는 것이었다. 이러한 결과는 siTACE/TKPR-9R 복합체가 분자 수준에서 TACE의 전사를 억제하여 전염증성 사이토카인과 케모카인을 하향 조절함을 시사하며, 복합체로 치료하면 패혈증 마우스 조직에서 TACE와 사이토카인 수준이 감소함을 확인하였다. 또한, 이러한 결과는 siTACE/TKPR-9R 복합체의 항염증 효과가 생존율과 조직학적 기관 손상을 개선한다는 것을 입증했다. 또한 패혈증 환자에서 사용하는 2가지 종류의 항생제와 siTACE/TKPR-9R 복합제를 병용 투여한 결과 항염 효과와 항균 효과가 나타났다.
이는 siTACE/TKPR-9R 복합체가 증상 완화에 효과적일 뿐만 아니라 패혈증에 대한 분자 수준의 근본적인 해결책으로 효과적이라는 것을 보여준다.
본 발명에서 siTACE/TKPR-9R 플랫폼은 항생제를 완전히 대체하는 것이 아니라 항생제 단독요법의 한계를 극복하기 위해 항생제를 통한 기존 요법과 병용 투여할 수 있는 시너지 치료제를 찾는 것을 목표로 한다. 겐타마이신과 같은 항생제는 균의 합성 세포막을 차단하여 균의 양을 감소시킬 수 있지만 엔도톡신에 의한 장기 손상을 직접적으로 예방하기는 어렵다.
따라서 본 발명자들은 항생제의 치료 효과를 보완하면서 가용성 TNF-a 단백질에 의해 매개되는 염증 경로를 근본적으로 개선하기 위해 대식세포 표적 치료제를 개발하였다. siTACE/TKPR-9R 복합제와 항생제를 동시에 투여했을 때 항생제 단독 투여 시보다 염증 반응과 폐 및 간의 장기 손상이 감소하고(도 3c, d) 생존율이 증가함을 확인하였다(도 3b, e 및 f).
요약하면, siTACE/TKPR-9R 복합체를 사용한 비바이러스성 유전자 요법은 심각한 염증 반응을 치료하기 위해 대식세포 표적 유전자 전달을 사용하는 혁신적인 패혈증 치료 방법임이 입증되었다.
항염증 유전자 요법과 항생제의 병용 치료는 장기, 혈청 및 복막액의 과도한 염증 기전의 하향 조절을 통해 패혈증의 급성 및 전신 염증에 대한 유망한 약물 조합으로 입증되었다.
결과적으로 본 발명은 항생제 치료의 한계를 극복한 선택적 질병 세포 표적 효과와 항염 효과를 나타낸다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University
<120> Composite containing gene and gene delivery system for prevent or
treatment of acute inflammatory disease
<130> P21U10C1311
<150> KR 10-2021-0073528
<151> 2021-06-07
<160> 17
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse siTACE Sense sequence
<400> 1
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<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human siTACE Sense sequence
<400> 2
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse siTACE antisense sequence
<400> 3
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human siTACE antisense sequence
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<211> 24
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<220>
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse TNF-alpha reverse primer
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<211> 22
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<220>
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human TNF-alpha reverse primer
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<211> 22
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<220>
<223> mouse IL-1beta forward primer
<400> 14
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<210> 15
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse IL-1beta reverse primer
<400> 15
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<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human IL-1beta forward primer
<400> 16
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<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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Claims (18)

  1. 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA; 및
    비바이러스성 유전자 전달체를 포함하되,
    상기 비바이러스성 유전자 전달체는 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌을 포함하는 유전자/전달체 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    TACE에 대한 siRNA은 SEQ ID NOS: 1 또는 2로 표시되는 하나 이상의 염기서열 및 이의 상보적인 서열을 갖는 유전자/전달체 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌은 양 말단 시스테인을 포함하는 유전자/전달체 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌은 Cys-TKPR-(9Arg)-Cys를 포함하는 유전자/전달체 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    터프트신 펩타이드-올리고아르기닌은 대식세포를 표적하는 유전자/전달체 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    종양괴사인자-알파 전환 효소 siRNA와 유전자 전달체가 1: 2 내지 5의 중량 비율인 유전자/전달체 복합체.
  7. 종양괴사인자-알파 전환 효소(TNF-α converting enzyme, TACE)의 발현을 억제하는 siRNA 및 비바이러스성 유전자 전달체를 혼합하는 단계를 포함하되,
    상기 비바이러스성 유전자 전달체는 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌을 포함하는 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    TACE에 대한 siRNA은 SEQ ID NOS: 1 또는 2로 표시되는 하나 이상의 염기서열 및 이의 상보적인 서열을 갖는 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌은 양 말단 시스테인을 포함하는 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 터프트신 펩타이드-올리고아르기닌은 Cys- TKPR-(9Arg)-Cys를 포함하는 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    종양괴사인자-알파 전환 효소 siRNA와 유전자 전달체가 1: 2 내지 5의 중량 비율인 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 20 내지 40 ℃에서 20 내지 40분간 실시하는 유전자/전달체 복합체의 제조방법.
  13. 제 1 항의 유전자/전달체 복합체를 유효성분으로 포함하는 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 급성 염증성 질환은 패혈증, 급성 폐손상, 급성 간손상 및 급성 염증성 장 질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 조성물이 구강, 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막 내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여되는 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 치료적 유효량의 청구항 1에 따른 유전자/전달체 복합체를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 급성 염증성 질환은 패혈증, 급성 폐손상, 급성 간손상 및 급성 염증성 장 질환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 조성물이 구강, 에어로졸, 협측, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복막 내, 비강, 안구, 경구, 귀, 주사, 패치, 피하, 혀 밑, 국소, 또는 경피 경로를 통하여 투여되는 급성 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2022/007935 2021-06-07 2022-06-03 급성 염증성 질환 예방 또는 치료용 비바이러스성 유전자/전달체 복합체 WO2022260367A1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20240124199A (ko) 2023-02-07 2024-08-16 한양대학교 산학협력단 암세포 및 암 주위 지방세포 내 항암유전자 동시 전달용 혼합세포막 코팅 나노입자

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101998169B1 (ko) * 2016-09-30 2019-07-10 한양대학교 산학협력단 염증성 질환 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체
KR20190113508A (ko) * 2018-03-27 2019-10-08 한양대학교 산학협력단 염증성 질환 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101998169B1 (ko) * 2016-09-30 2019-07-10 한양대학교 산학협력단 염증성 질환 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체
KR20190113508A (ko) * 2018-03-27 2019-10-08 한양대학교 산학협력단 염증성 질환 예방 또는 치료용 유전자／전달체 복합체

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DATABASE NUCLEOTIDE 23 September 2008 (2008-09-23), ANONYMOUS: "Mus musculus mRNA for TNF-alpha converting enzyme (TACE)", XP093015229, retrieved from GENBANK Database accession no. AJ007365 *
LEE JIEUN; SON WOOIC; HONG JUHYEONG; SONG YOONSUNG; YANG CHUL-SU; KIM YONG-HEE: "Down-regulation of TNF-α via macrophage-targeted RNAi system for the treatment of acute inflammatory sepsis", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, vol. 336, 18 June 2021 (2021-06-18), AMSTERDAM, NL , pages 344 - 353, XP086732080, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2021.06.022 *
XU XIN; YANG WEIJING; LIANG QIUJUN; SHI YANAN; ZHANG WENXIN; WANG XIAO; MENG FENGHUA; ZHONG ZHIYUAN; YIN LICHEN: "Efficient and targeted drug/siRNA co-delivery mediated by reversibly crosslinked polymersomes toward anti-inflammatory treatment of ulcerative colitis (UC)", NANO RESEARCH, vol. 12, no. 3, 9 January 2019 (2019-01-09), CN , pages 659 - 667, XP036705746, ISSN: 1998-0124, DOI: 10.1007/s12274-019-2274-2 *

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