KR101480496B1 - 도파-함유 접착제를 이용한 미세유체 칩 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감응성 고분자 기판상에 도파민-함유 접착제를 코팅하고, 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 포함하는 미세유체 칩을 제조하는 방법, 및 제조된 미세유체 칩에 관한 것으로서, 이들 미세유체 칩을 사용하여 진단, 세포배양 또는 단백질 패터닝 등에 적용함으로써, 복합적 생물분석과 기초 세포 생물학 연구에 사용될 다성분 분석 바이오칩 제작에 응용될 수 있다.

Description

도파-함유 접착제를 이용한 미세유체 칩 및 이의 제조방법 {microfluidic CHIP and method of preparing the same}

본 발명은 도파민-함유 접착제를 이용하여 미세유체 칩을 제조하는 방법, 더욱 자세하게는 감응성 고분자 기판상에 도파민-함유 접착제를 코팅하고, 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 포함하는 미세유체 칩을 제조하는 방법, 및 제조된 미세유체 칩에 관한 것으로서, 이들 미세유체 칩을 사용하여 진단, 세포배양 또는 단백질 패터닝 등에 적용함으로써, 복합적 생물분석과 기초 세포 생물학 연구에 사용될 다성분 분석 바이오칩 제작에 응용될 수 있다.

단백질 패터닝 표면과 미세유체 채널이 통합된 바이오 칩 시스템은 복합적 생분자 분석, 세포의 분리 그리고 세포의 기초연구와 같은 생물학적 분석 분야에서 다양하게 응용될 수 있다. 한편 미세유체 채널을 기판과 부착 시킨 다음 채널 내에 단백질 패터닝을 시도하게 되면 단백질의 기능은 잃지 않게 할 수 있지만 수많은 패터닝 방법들의 적용에 제한을 받게 되며, 미세유체 채널에 맞추어 기판바닥으로 광을 조사해주는 포토패터닝 (photo-patterning)법이 그 중 가장 유용하게 사용될 수 있다.

지난 십 수 년간 광범위한 단백질 마이크로패터닝 기법이 개발되어 왔지만, 이것을 미세유체 채널과 통합시켜 적용하는 데는 다음과 같은 어려움이 따랐다. 미세유체 채널의 재료로 주로 사용되는 PDMS (poly(dimethylsiloxane))는 대표적으로 표면이 불활성 (inert)인 물질이며 미세유체 칩의 기판을 구성하는 성분들도 대부분이 플라스틱으로 매우 불활성적인 성격을 띠고 있다. 이 둘을 조립하기 위해서는 접착이 가능한 표면의 활성기 (activated groups)들이 필요한데 이것의 생성과정에 쓰이는 방법이 주로 탈수화 (dehydration)나 플라즈마 처리와 같이 표면에 가혹한 처리과정을 요구하기 때문에 기판에 패터닝된 단백질의 기능을 망가트리는 원인이 된다.

기존에 개발되어 온 부착법은 일반적으로 부착이 이루어지는 두 표면에 앞서 언급한 플라즈마 처리나 이것에 순차적으로 실란화 (silanization)과정을 삽입하는 화학적 개질과정을 필요로 하는데, 이 방법은 표면 성질에 상당한 변질을 야기하며, 본 발명에서 사용되는 PDMP와 같이 특수 기능을 가진 기판과 부착시엔 시스템의 질적인 저하가 발생하게 된다.

따라서, 상기 문제는 PDMS 미세유체 채널과 기판의 부착과정이 포토패터닝에 중요하게 기여하는 기능기들을 손상시키지 않는 접착법을 개발함으로써 해결할 수 있다.

본 발명은 광반응성 포토레지스트 기판의 성질을 크게 변화시키지 않으면서 미세유체 채널을 부착시키기에 충분한 접착력을 가지는 폴리도파민 코팅을 이용한 PDMS 접착법을 적용시켜 다성분 단백질 패터닝이 가능한 미세유체 채널을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리도파민으로 접착된 광반응성 포토레지스트 기판과 미세유체 채널의 조합체를 이용하여, 다성분의 단백질 패터닝을 미세유체 채널 내에서도 성공적으로 수행할 수 있으며, 농도구배 형성이 가능한 미세유체 채널에서 다양한 밀도의 단백질 마이크로스팟 (microspots) 들이 한 번에 채널 내에서 형성할 수 있는 단백질 패터닝 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 달성하고자, 본 발명의 일 구현예는 광민감성 고분자층이 형성된 기판과 실란 미세유체 채널 사이에 도파(DOPA)-함유 접착제층 포함하는 미세유체 칩(microfluidic chip)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 (a) 광민감성 고분자층이 형성된 기판에 도파(DOPA)-함유 접착제를 처리하고, (b) 실란 미세유체 채널의 표면을 활성화시키고, (c) 상기 폴리도파민 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 포함하는, 미세유체 칩(microfluidic chip)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 미세유체 칩은 진단, 세포 배양, 또는 단백질 패터닝 등에 이용될 수 있으며, 특히 단백질 표면 패터닝이 가능한 미세유체 칩은 다양한 생물학적 분석과 생물학적 응용 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명자들은, 도파-함유 접착제 코팅으로 실란 미세유체 채널을 기판상의 광민감성 고분자, 바람직하게는 PDMP 박막에 부착시킬 수 있는 미세유체 칩의 제조방법과 도파-함유 접착제층의 양면에 각각 실란 미세유체 채널과 광민감성 고분자가 고팅된 기판이 배치된 미세유체 칩을 제공하여, 단백질 패터닝에 필수적인 PDMP의 성질을 보존함과 동시에 폴리도파민에 의해 표면의 활성이 높아지면서 PDMS 미세유체 채널과 부착이 가능하도록 해줄 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 광민감성 고분자층이 형성된 기판과 실란 미세유체 채널 사이에 도파(DOPA)-함유 접착제층 포함하는 미세유체 칩(microfluidic chip)을 제공한다. 본 발명에 따른 미세유체 칩은 도파-함유 접착제층을 포함함으로써 atechol/quinone 그룹들이 증가하면서 표면 에너지가 상당히 증가한다. 본 발명에 따른 미세유체 칩은 상기 기판과 실란 미세유체 채널간 접착력은 50 내지 100 kPa이고, 물과의 표면 접촉각이 36도 내지 63도이다.

또한 본 발명의 미세유체 칩의 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 광민감성 고분자층이 형성된 기판에 도파(DOPA)-함유 접착제를 처리하는 단계,

(b) 실란 미세유체 채널의 표면을 활성화시키는 단계, 및

(c) 상기 폴리도파민 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계.

더욱 자세하게, 상기 (a) 광민감성 고분자층이 형성된 기판에 도파(DOPA)-함유 접착제를 처리하는 단계에서, 상기 광민감성 고분자층이 형성된 기판은, 예를 들면 생물친화적 고분자를 처리한 기판일 수 있으며, 상기 기판은 통상의 바이오칩 제조에 사용되는 재질의 기판이면 특별히 한정되지 않는다. 상기 광민감성 고분자층은 poly(2,2-dimethoxy nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate(PDMP), poly(2-nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate(PNMP) 또는 다양한 광응답 작용기를 가진 고분자로 제조될 수 있다.

구체적인 일예에서, 본 발명에서 미세유체 칩의 기판으로 사용한 박막 형태의 random terpolymer인 poly(2,2-dimethoxy nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate) (PDMP)는 생물 친화적 포토레지스트이다. 위 고분자가 포함하는 poly(ethylene glycol)(PEG) 반복단위 (repeated unit)에 의해 단백질 부착 저항능력을 가지며, 2,2-dimethoxy nirobenzyl ester 그룹은 광 (λ = 365 nm)에 반응할 수 있어 광 조사 후 중성에 가까운 수용액에 PDMP 고분자가 녹아나갈 수 있게 한다. 이 모든 성질을 조합해 microscope projection photolithography (MPP)를 적용함으로써, 다양한 이차원적 면적범위의 다성분 단백질 패턴과 다양한 세포 어레이 (cellular array)를 성공적으로 PDMP 기판위에 형성할 수 있다.

도파-함유 접착제는 화학적으로 합성된 폴리도파민, 또는 홍합 접착제로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 홍합 접착제일 수 있다. 홍합은 수중 접착할 수 있게 기능적으로 분화된 접착제를 생산하여 분비한다. 홍합의 족사 단백질은 폴리페놀 산화제(polyphenol oxidase)를 이용해 타이로신(tyrosine) 기를 수화(hydroxylation) 시켜 얻어지는 아미노산인 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)를 많이 포함한다. 도파의 곁가지에 있는 3,4-디하이드록시페닐 카테콜)은 친수성 표면과 매우 강한 수소결합을 형성할 수 있으며, 금속이온, 금속산화물(Fe3+, Mn3+ 등), 반금속(실리콘 등) 등과 강한 결합을 이룰 수 있다. 홍합 유래 접착제의 예는 한국특허 10-1004745, 및 한국공개특허 10-2002-0114072 에 개시되어 있으나 특별히 한정되지 않는다.

(a)단계의 도파-함유 접착제 처리는, 스프레이코팅, 스핀코팅, 딥코팅 또는 롤코팅 등의 화학적 습식공정으로 도파-함유 접착제 용액을 기판에 코팅하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 딥코팅이다. 예를 들면, 상기 광민감성 고분자층이 형성된 기판을 도파-함유 접착제 용액에 침지하는 딥코팅법으로 수행할 수 있다. 상기 코팅시간은, 일부 표면이 노출되어야 함을 고려할 때 0.5 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 시간일 수 있다.

본 발명에서는 기판상에 형성된 광민감성 고분자의 고유 성질 변화는 최소한으로 하면서 실란 미세유체 칩을 부착시키기 위해, 홍합 단백질 유래의 폴리도파민 자가 중합을 기반으로 한 표면 코팅 법을 응용하였다. 이 방법은 바람직하게는 도파-함유 접착제 수용액에 기판을 담가두는 아주 간단한 과정만으로 거의 모든 종류의 기판을 도파-함유 접착제로 쉽게 개질할 수 있다. 게다가 표면이 개질되는 범위를 코팅 용액에 담가두는 시간으로 조절할 수 있고, 도파-함유 접착제 코팅으로 인해 catechol/quinone 그룹들이 증가하면서 표면 에너지가 상당히 증가한다. 잠재적으로 이것이 플라즈마 처리를 통해 hydroxyl group이 생성된 PDMS 표면과 분자 간 이차 상호작용에 의한 부착을 유도하게 된다. 이러한 가능성을 알아보기 위한 첫 번째 단계로 PDMP의 표면 성질이 폴리도파민이 코팅됨에 따라 어떻게 변화하는지 측정해보았다.

상기 (a)단계의 도파-함유 접착제가 처리된 기판의 물에 대한 접촉각이 36° 내지 63° 로서 처리전 기판에 비해서 친수성이 증가된다. 접촉각은 폴리도파민이 코팅되면서 증가하는 catechol/quinone 그룹에 의해 hydrophilicity가 변화되는 것을 측정하는 것으로 폴리도파민이 코팅이 되었는지 여부를 알 수 있게 해주는 지표이다.

성공적인 단백질의 포토패터닝을 위해서는 단백질이 광으로 활성화된 지역에만 붙도록 하고 그 외의 지역은 단백질 부착에 대한 저항성을 가지도록 해야 한다. 본 발명은, 도파-함유 접착제 코팅으로 PDMS 미세유체 채널을 PDMP 박막의 기판위에 부착할 수 있는 새로운 부착법을 제시하려고 한다. 기존에 개발되어 온 부착법은 일반적으로 부착이 이루어지는 두 표면에 앞서 언급한 플라즈마 처리나 이것에 순차적으로 실란화 (silanization)과정을 삽입하는 화학적 개질과정을 필요로 하는데, 이 방법은 표면 성질에 상당한 변질을 야기하며, PDMP와 같이 특수 기능을 가진 기판과 부착시엔 시스템의 질적인 저하가 발생하게 된다.

이 같은 문제점을 해결하기 위해 도파민 (dopamine) 수용액로 PDMP 기판을 코팅 (dip-coating)을 하는 방법을 사용하면 단백질 패터닝에 필수적인 PDMP의 성질을 보존함과 동시에 폴리도파민에 의해 표면의 활성이 높아지면서 PDMS 미세유체 채널과 부착이 가능하도록 해줄 수 있다.

상기 (b) 실란 미세유체 채널의 표면을 활성화시키는 단계를 통해 실란 미세유체 채널을 활성하시켜 기판과 결합을 용이하게 한다. 예를 들면, 상기 활성화 단계는 플라즈마 처리를 통해 히드록시기(hydroxyl group)이 생성된 PDMS 표면과 분자 간 이차 상호작용에 의한 부착을 유도하게 된다. 상기 플라즈마 처리는 산소 혹은 공기 조건으로 수행할 수 있다.

미세유체(Microfluidic) 채널 또는 미세유체 칩은 낮은 제조비용 및분석시간 단축, 휴대성, 분석 물질량 및 부산물 양의 최소화 등 많은 장점이 있다. 여기에서 미세 유체 채널은 함은 일반적으로 마이크론 수준의 미세한 크기의 유체채널을 구비하며, 이러한 크기의 유체채널을 통하여 유체가 흐르면서 다양한 생물학적, 화학적 반응기로 기능할 수 있는 소자를 의미한다. 이러한 미세유체 소자는 화학물질 검출 센서(이하 화학센서), 생물학적 물질 검출 센서(이하 바이오 센서), 그리고 시료 제조/여과 등의 다양한 목적으로 활용된다. 화학공정 처리, 생물학적 분리 및 분석, 그리고 물의 정제 과정 등에 미세유체 소자가 활용될 수 있다.

상기 미세유체채널은 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxan, PDMS) 기판, 유리 기판 및 실리콘 기판 등에 리쏘그래피 공정 등의 방법을 이용하여 제작될 수 있으며, 채널의 폭은 50 내지 500㎛, 깊이는 10 내지 200㎛로 제작되어질 수 있다. 바람직한 미세유체 채널은 PDMS 미세유체 채널일 수 있다.

상기 (c) 도파-함유 접착제로 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 수행하여, 미세유체 칩을 제조한다. 부착단계는 바람직하게는 폴리도파민 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하고, 40 내지 90 ℃ 온도, 더욱 바람직하게는 70 내지 90 ℃ 온도 에서, 1 내지 4 시간, 더욱 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 방치하여 수행할 수 있다.

본 발명에서는. 생물 친화적 포토레지스트 박막과 PDMS 미세유체 채널을 부착한 뒤, 현미경 투영 포토리소그래피 (Microscope projection photolithography, MPP)를 시행하여 미세유체 채널 내에서 복합 단백질 패터닝을 성공적으로 수행하였다. 홍합으로 부터 유래된 폴리도파민 (polydopamine)이라는 물질의 코팅법이 생물 친화적 고분자인 poly(2,2-dimethoxy nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate) (PDMP)와 PDMS 미세유체 채널의 부착에 사용되었다. 폴리도파민 코팅 시간을 조절하여 단백질 마이크로패터닝에 필수적인 PDMP의 성질 변화를 최소화 한 상태에서 PDMS 미세유체 채널을 강한 접착력으로 부착할 수 있었다. 이러한 새로운 접착 전략을 사용함으로써, 다성분 단백질 패터닝과 농도 구배를 이룬 단백질 마이크로패터닝을 미세유체 채널 내부에서 성공적으로 형성 시킬 수 있었다. 본 발명에서 개발된 기술은 복합적 생물분석 과 기초 세포 생물학 연구에 사용될 다성분 분석 바이오칩 제작에 응용되어 발전을 도모할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 미세유체 칩 제조방법에 따라, 다성분의 단백질 패터닝을 미세유체 채널 내에서도 성공적으로 수행할 수 있었으며, 농도구배 형성이 가능한 미세유체 채널을 사용했을 때 다양한 밀도의 단백질 마이크로스팟 (microspots) 들이 한 번에 채널 내에서 형성되는 결과도 보일 수 있었다. Microscope projection photolithography (MPP)를 적용함으로써, 다양한 이차원적 면적범위의 다성분 단백질 패턴과 다양한 세포 어레이 (cellular array)를 성공적으로 PDMP 기판위에 형성할 수 있다.

본 발명은 감응성 고분자 기판상에 도파민-함유 접착제를 코팅하고, 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 포함하는 미세유체 칩을 제조하는 방법, 및 제조된 미세유체 칩을 제공함으로써, 광반응성 포토레지스트 기판의 성질을 크게 변화시키지 않으면서 미세유체 채널을 부착시키기에 충분한 접착력을 가지는 폴리도파민 코팅을 이용한 PDMS 접착법을 적용시켜 다성분 단백질 패터닝이 가능한 미세유체 채널을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따라 상기 미세유체 칩을 이용하여 다성분의 단백질 패터닝을 미세유체 채널 내에서도 성공적으로 수행할 수 있으며, 농도구배 형성이 가능한 미세유체 채널에서 다양한 밀도의 단백질 마이크로스팟 (microspots) 들이 한 번에 채널 내에서 형성할 수 있는 단백질 패터닝 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 폴리도파민의 다양한 코팅시간에 따른 PDMP 표면의 성질 변화로서, (가)는 폴리도파민 코팅 시간에 따른 PDMP 기판의 접촉각 변화와, (나) Streptavidin-Cy5의 비특이적 표면흡착 (non-specific binding)의 상대적 정량 값.
도 2는 (가) Biotin 그룹을 사용한 glass coverslip의 기능화 (나) Microscope Projection Photopatterning (MPP)법을 사용한 PDMP 기판 위 단백질 패터닝 모식도
도 3은 폴리도파민이 코팅된 PDMP를 사용한 단백질 마이크로패터닝 (가) 다양한 시간으로 폴리도파민이 코팅된 PDMP에 실시한 streptavidin-Cy5 마이크로 스팟의 DIC 와 형광 이미지 (나) 다양한 시간으로 폴리도파민이 코팅된 PDMP 에 패터닝된 streptavidic-Cy5 마이크로스팟의 상대적인 형광 세기 (S/N) (다) 잔여층으로 남은 폴리도파민의 DIC 이미지 (흰색 화살표)
도 4는 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판과 PDMS 미세유체 채널의 부착과정
도 5는 미세유채 채널 내 다성분 단백질의 마이크로패터닝 (가) 미세유체 채널 내 다성분 streptavidin 마이크로패터닝 과정 모식도 (나) 다성분의 streptavidin이 마이크로패터닝된 미세유체 채널 표면의 형광의 overlay 이미지 (왼쪽) 그리고 형광과 DIC의 overlay 이미지 (오른쪽). Pseudo color : FITC (green), Rhodamine (red), Cy5 (blue)
도 6은 복합적 표면밀도 구배의 단백질 마이크로패터닝 (가) 로그 미세유체 채널의 디자인 (나) 로그 미세유체 채널을 사용해서 복합적 표면밀도 구배로 다중 패터닝 된 streptavidin-Cy5의 형광 이미지. 그래프는 형광이미지의 흰색 라인 구간의 형광 세기를 나타낸 것임. (scale bar = 100 μm)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PDMP 기판의 폴리도파민으로 코팅

1-1. PDMP 기판위 폴리도파민의 코팅

PDMP 기판은 PDMP 고분자 파우더를 3% (w/w)로 1,4 Dioxane에 녹여 만들어 2000 rpm에 2분 동안 스핀코팅 하였다. PDMP로 코팅된 coverslip은 80 °C 오븐에서 하룻밤 동안 처리하여 남아 있는 용매를 제거하였다. Baked-PDMP 표면은 도파민 용액 (Sigma, 2 mg/mL, 10 mM Tris-HCl 버퍼, pH 8.5)에 담가서 딥코팅을 실시하였다. 폴리도파민이 코팅된 기판을 정제수로 충분히 세척한 뒤에, 질소 분위기로 건조하였다. 상기 기판을 도파민 용액에 담기는 시간 (코팅시간)은 0, 1, 3, 6, 18시간동안 각각 수행하여 5가지의 폴리도파민이 코팅된 기판을 얻었다.

1-2. 코팅-PDMP 기판의 접촉각 측정

상기 기판 표면이 개질되는 범위를 코팅 용액에 담가두는 시간으로 조절할 수 있고, 폴리도파민 코팅으로 인해 catechol/quinone 그룹들이 증가하면서 표면 에너지가 상당히 증가한다. 잠재적으로 이것이 플라즈마 처리를 통해 hydroxyl group이 생성된 PDMS 표면과 분자 간 이차 상호작용에 의한 부착을 유도하게 된다. 이러한 가능성을 알아보기 위한 첫 번째 단계로 PDMP의 표면 성질이 폴리도파민이 코팅됨에 따라 어떻게 변화하는지 측정해보았다.

접촉각은 폴리도파민이 코팅되면서 증가하는 catechol/quinone 그룹에 의해 hydrophilicity가 변화되는 것을 측정하는 것으로 폴리도파민이 코팅이 되었는지 여부를 알 수 있게 해주는 지표이다.

실시예 1-1에서 제조된 폴리도파민이 코팅된 기판에 대해서, 정제수를 사용한 접촉각을 Surface Analyzer DSA-100 (Kruss Co.)를 사용하여 측정하였다. 각 샘플 당 5번 이상의 각기 다른 지역의 접촉각을 측정하여 평균하였다. 폴리도파민 용액에 기판을 담가 코팅하는 시간에 따른 접촉각을 도 1에 나타냈다. 도 1은 폴리도파민의 다양한 코팅시간에 따른 PDMP 표면의 성질 변화로서 (가) 폴리도파민 코팅 시간에 따른 PDMP 기판의 접촉각 변화을 나타내었다.

접촉각 값은 코팅 시간이 증가함에 따라 (0 시간에서부터 18 시간까지) 62.82 ± 1.61°에서 35.86 ± 1.75° 로 점차 감소하였고, 이것은 표면이 점점 폴리도파민으로 코팅되어 친수성이 커지고 있다는 것을 보여주는 증거이다.

1-3. 폴리도파민으로 코팅된 PDMP 표면에 대한 단백질 비특이적 흡착 분석

폴리도파민으로 표면이 점점 지배될수록 PDMP 표면의 고유 기능기들은 가려지는 영향을 받게 되는데, 이 때 기능기의 소실여부를 확인해보기 위해 PDMP 의 side chain인 PEG brush들이 코팅시간이 증가함에 따라 얼마나 가려지는 지를 측정해 보았다. 이를 위해 PDMP의 단백질 저항능력을 비특이적 단백질 흡착 (non-specific binding)정도로 정량화해 보았다.

마이크로패터닝된 형광 이미지를 촬영하기 위하여 개조된 Zeiss Axio Observer.Z1 epi-fluorescence microscope를 사용하였다. 이것에서 10×(Plan-Neofluar, NA = 0.3) 그리고 40×(Plan-Neofluar, NA = 1.30) 랜즈룰 사용하였고 CoolSNAP HQ2 (Photometrics) CCD camera를 통해 형광 이미지를 얻을 수 있었다. XBO 75 W/2 Xenon lamp (75 W, Osram) 와 DAPI (EX. 365, BS 395, EM BP 445/50), eGFP (EX BP 470/40, BS 495, EM BP 525/50), Cy3 (EX BP 550/25, BS 570, EM BP 605/70) 그리고 Cy5 (EX BP 620/60, BS 660, EM BP 770/75) excitation/emission filter sets 이 형광이미지를 얻기 위한 광원과 필터로 사용되었다. 현미경은 Axiovision 4.6 (Carl Zeiss)을 통해 자동으로 조절할 수 있으며 이것으로 얻은 이미지는 Methamorph (Universal Imaging, Molecular Devices)를 통해 분석하였다.

단백질의 비특이적 흡착 분석을 위하여, 상기 단백질의 비특이적 흡착 정도를 정량화하기 위해, 실시예 1-1과 같이 PDMP 기판을 코팅시간 0, 1, 3, 6, 18시간동안 각각 수행하여 5가지의 폴리도파민이 코팅된 기판을 얻었다. 상기 폴리도파민 코팅된 PDMP 기판을, 형광이 표지된 단백질 일종인 streptavidin-Cy5 용액 (2 μg/mL, PBS)에 상온에서 15분 담가 두었다. 상기 기판을 꺼내어 PBS로 잘 씻어준 다음 형광현미경으로 표면에서 나오는 형광세기를 측정하였다.

같은 노출시간으로 streptavidin-Cy5의 흡착이 없는 기판에서 나오는 형광 세기 (background fluorescence signal)와, 상기 얻어진 streptavidin-Cy5 용액에 담가두었던 기판에서 나오는 형광 세기의 비율을 signal-to-noise (S/N)로 계산된 상대적인 값으로 도 1(나)에 그래프로 나타내었다. 도 1은 폴리도파민의 다양한 코팅시간에 따른 PDMP 표면의 성질 변화로서 (나) Streptavidin-Cy5의 비특이적 표면흡착 (non-specific binding)의 상대적 정량 값을 나타내었다.

폴리도파민이 코팅되지 않은 PDMP 기판에서 측정된 S/N 값은 거의 '1'에 가까웠다. 이것의 의미는 PDMP 표면에 흡착된 streptavidin-Cy5가 거의 없다는 것이고 PDMP의 단백질 저항 능력이 크다는 것을 보여주는 것이다. 그리고 도파민 용액에 1, 3 및 6 시간 동안 담가둔 PDMP 표면에서도 거의 ‘1’에 가까운 S/N 평균값이 나왔다. 이것은 폴리도파민 코팅을 6시간 정도 까지 해도 PDMP 기판의 단백질 저항 능력은 감소하지 않는다는 것을 의미한다. 18시간 정도 코팅을 진행하였을 때는 S/N 평균값이 약 3까지 증가 하였지만 이것은 bare glass 가 가지는 값 (~10)에 비하면 여전히 낮은 값을 가지고 있었다.

실시예 2: 폴리도파민으로 코팅된 PDMP 를 사용한 단백질 마이크로패터닝 분석

Microscope projection photolithography (MPP)법을 사용한 단백질 패터닝은, 폴리도파민이 코팅된 PDMP 박막 기판에 단백질 마이크로패터닝 (micropatterning)을 시도하였다.

2-1. Biotin으로 기능화된 glass를 PDMP 용액으로 코팅

구체적으로, 도 2. (가)에서 도식적으로 보여주고 있는 것과 같이 glass coverslip을 biotin 그룹으로 기능화 해주었다. Biotin으로 기능화된 glass를 PDMP 용액으로 스핀코팅하고, 이것을 다양한 시간 (1, 3, 6 그리고 18 시간)으로 폴리도파민 코팅하였다. 도 2의 (가)는 Biotin 그룹을 사용한 glass coverslip의 기능화을 나타내는 모식도이다.

2-2. PDMP 표면에 대한 단백질 비특이적 흡착 분석

상기 Biotin으로 기능화된 glass를 PDMP 코팅 기판을 현미경 재물대에 맞춰 제작된 마그네틱 챔버에 고정시키고 이것에 PBS를 채워 현미경에 고정시켰다. 그 다음 단백질 마이크로패터닝을 도 2(나)에서 도식화한 것과 같이 진행하였다. 도2의 (나) Microscope Projection Photopatterning (MPP)법을 사용한 PDMP 기판 위 단백질 패터닝 모식도이다.

PBS로 채워진 챔버는 현미경 재물대에 고정되고, miroscope projection photopatterning (MPP)는 40× 렌즈를 사용해 진행하였다. Photomask에 패터닝된 투명한 circle에 의해서 PDMP 표면엔 24 μm 의 circle array가 형성되며, PDMP가 녹아나간 자리엔 glass의 biotin 그룹들이 노출되게 된다. 이를 streptavidin-Cy5 용액 (2 μg/mL, PBS)에 15 분 담가서 biotin 그룹과 서로 결합이 일어나도록 하였다.

상기 방법으로 실시한 단백질 패터닝 결과를 도 3에 DIC (differential interference contrast)이미지와 형광 이미지로 나타내었다. 도 3은 폴리도파민이 코팅된 PDMP를 사용한 단백질 마이크로패터닝 (가) 다양한 시간으로 폴리도파민이 코팅된 PDMP에 실시한 streptavidin-Cy5 마이크로 스팟의 DIC 와 형광 이미지 (나) 다양한 시간으로 폴리도파민이 코팅된 PDMP 에 패터닝된 streptavidic-Cy5 마이크로스팟의 상대적인 형광 세기 (S/N) (다) 잔여층으로 남은 폴리도파민의 DIC 이미지 (흰색 화살표)이다.

DIC 이미지는 UV조사에 의해 PDMP가 녹아나가는 것에 (도 2. (나)의 (i)단계) 폴리도파민 코팅의 영향이 거의 없음을 보여주는 증거이다. 그러나 폴리도파민 코팅이 streptavidin과 biotin 그룹의 결합에 있어서는 (도 2. (나)의 (ii)단계)상당한 감소를 일으킨다는 것을 Cy5의 형광이미지를 통해 알 수 있었다. 마이크로 패터닝된 streptavidin spot의 S/N 값을 UV가 조사된 지역의 biotin과 결합한 streptavidin-Cy5에 의해서 나오는 형광 시그널과 패터닝 되지 않은 PDMP에서 나오는 시그널 (background signal)의 비율로 계산해 도 3(나)에 그래프로 나타내었다. S/N 값은 폴리도파민의 코팅시간이 증가함에 따라 점차 감소하였으 며, 이것은 폴리도파민 코팅 층이 UV로 조사된 PDMP가 PBS에 녹아나가도 그대로 남아있다는 것을 보여주는 결과이다. 게다가 PDMP 필름에 스크래치를 낸 후 그 지역에 MPP를 실시하여 (도 2. (나) (i)과 (ii)과정) 얻은 DIC 이미지는 폴리도파민으로 3시간 이상 코팅되면서부터 PDMP가 녹아나간 자리에 폴리도파민의 잔여 층 (residual layer)이 (도 3의 (다)의 흰색 화살표) 존재함을 보여주고 있다. 하지만 PDMP를 폴리도파민으로 1시간 코팅했을 때 이것에 마이크로 패터닝한 spot에서 나오는 상대적 형광시그널이 이론적으로 합리적인 높은 S/N 비율 (~4)의 값을 가지고 DIC 이미지로 보이는 폴리도파민의 잔여층도 거의 없으며, 도 1(나)에서 보여준 단백질 저항능력의 값도 훌륭하므로 이 모든 결과를 종합하여 본 발명의 목적에 가장 부합하는 PDMP 기판의 폴리도파민 코팅 시간을 ‘1시간’ 으로 정할 수 있었다.

실시예 3: 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판과 PDMS 미세유체 채널의 부착

3-1. PDMS 미세유체 채널 제조

PDMS 미세유체 채널을 제작하기 위하여 실리콘 마스터 (silicon master)는 SU-8을 사용한 일반 포토리소그래피 방법으로 POSTECH National Center for nanomaterials Technology (NCNT)에서 제작 하였다. Sylgard 184 (Dow Corning)를 제작된 실리콘 웨이퍼에 casting 한 뒤 80 °C 오븐에서 굳혀 사용해 미세유체 채널을 완성하였다.

3-2. 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판과 PDMS 미세유체 채널의 부착

상기 제조된 PDMS 미세유체 채널과 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판을 부착하기 위해서, 우선 glass를 PDMP로 스핀코팅 하고 이것을 도파민 용액에 1 시간동안 담가둔 뒤 정제수 (D.I water)로 충분히 헹구어 진공 환경에서 1 시간 정도 건조하였다. 그 다음 PDMS 미세유체 채널 표면이 플라즈마 처리로 활성화 되자마자 폴리도파민이 코팅된 PDMP 표면에 즉시 부착시켰다. 접착된 상태의 조립체를 80 ℃ 오븐에 1 시간 두면 성공적으로 부착하였다.

3-3. 조립체의 부착력 측정

상기 3-2에서 제조된 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판와 PDMS 미세채널의 조립체에서 두층 사이의 부착력 (bonding strength)을 측정하기 위해, 1 cm² 면적으로 절단한 PDMS 육면체를 사용해 폴리도파민이 코팅된 PDMP 표면에 부착시키고 이것을 보편적인 인장 강도 측정기 (Instron, model 3343, Instron Corp)를 사용하여 양극으로 당겨 접착력을 측정하였다. 상기 방법으로 부착된 폴리도파민이 코팅된 PDMP와 PDMS 미세유체 채널 조립체를 인장강도 측정기를 이용해 서로 분리가 되는 때에 측정된 힘 (N)을 접착된 면적 (m2)으로 나누어 정규화해줌으로써 접착력(Pa)을 계산할 수 있었다.

상기 방법으로 얻어진 접착력은 60.13 ± 7.67 kPa 정도되었고 이것은 PDMS 접착에 사용되는 상용화된 접착제가 가지는 접착력과 비슷했다. 또한 pulling test에 의해 PDMS 육면체가 떨어져 나가고 기존의 폴리도파민이 코팅된 PDMP 표면이 그대로 노출되었는데, 이것은 두 표면의 접착이 공유결합 보다는 수소결합과 같은 이차결합에 의해 이루어져 있었음을 보여주는 것이다. 이 모든 결과들을 종합해 봤을 때, 본 발명에서 개발한 접착 전략은 고압 (high-pressure)의 작동을 요구하지 않는 미세유체 진단칩이나 세포 배양칩과 같은 다양한 바이오 미세유체 칩 제작에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

실시예 4: 미세유체 채널 내 다성분 단백질 패터닝

Microscope projection photolithography (MPP)법을 사용한 다성분 단백질 패터닝을 하고자, Biotin으로 기능화된 glass coverslip을 PDMP로 스핀코팅하고 폴리도파민으로 1시간 코팅한 뒤 이것을 1 mm (width) × 75 μm (height) × 10 mm (length) 의 직사각형 PDMS 미세유체 채널과 부착시켜 조립체(미세유체 칩)를 제조하였다.

상기 미세유체 칩의 채널 속을 PBS로 채워서 현미경 재물대에 장착시켰다. 다성분 단백질 패터닝 과정은 도 5의 (가)에 나타내었다. 도 5의 (가)는 미세유채 채널 내 다성분 단백질의 마이크로패터닝 (가) 미세유체 채널 내 다성분 streptavidin 마이크로패터닝 과정 모식도이다. 공정을 간단히 설명하자면 photomask를 현미경의 필드 다이어프램 (field diaphragm)에 삽입시키고 첫 번째 MPP를 수행한다. 다음으로 형광이 표지된 streptavidin의 용액으로 채워 넣고 15 분 동안 둔 뒤 PBS를 통과시키며 충분히 헹군다. 이어서 앞서 실시된 MPP 지역과 다른 곳에 현미경으로 초점을 맞추어 MPP를 동일하게 실시하고 다른 종류의 형광이 표지된 streptavidin을 넣어 결합시켜주면 미세유체 채널 내에 서로 다른 형광이 표지된 streptavidin의 마이크로패터닝이 완성된다. 상기 방법을 통해 성공적으로 PDMS 미세유채 채널 내 서로 다른 형광(Pseudo color : FITC (green), Rhodamine (red), Cy5 (blue)) 표지된 세 종류의 streptavidin을 마이크로패터닝 할 수 있었다.

미세유체 채널이 없는 환경에서 PDMP 기판만을 사용해 성공적으로 구현한 다성분 단백질 패터닝을, 미세유체 채널을 부착한 뒤 채널 내에서도 이것이 가능한지 알아보기 위해 도 4에서 제시한 방법으로 조립체를 완성하고 채널 내에서 패터닝을 시도하였다. 도 4는 폴리도파민이 코팅된 PDMP 기판과 PDMS 미세유체 채널의 부착과정을 나타낸다.

PDMS 미세유체 채널 내에서 촬영한 대표적인 세 가지 형광의 overlay 이미지와 DIC 이미지를 도 5의 (나)에서 보여주었다. 도 5의 (나)는 미세유채 채널 내 다성분 단백질의 마이크로패터닝에 관하여, 다성분의 streptavidin이 마이크로패터닝된 미세유체 채널 표면의 형광의 overlay 이미지 (왼쪽) 그리고 형광과 DIC의 overlay 이미지 (오른쪽). Pseudo color : FITC (green), Rhodamine (red), Cy5 (blue)것이다.

도 5의 (나)에 나타낸 바와 같이, 세 가지 서로 다른 형광 시그널이 PDMS 미세유체 채널 내에서만 나오고 있으며 이것이 PDMS 와 폴리도파민/PDMP 경계 밖의 부착지점에서 부터는 관찰되지 않는다는 것이다. 즉 다성분 단백질 마이크로 패터닝을 수행하는 동안 채널 내 유체의 누출 (leakage)이 발생하지 않았으며, 미세유체 칩으로 사용하기에 충분한 접착력이 폴리도파민 코팅을 통해 제공되었음을 한번 더 증명하는 결과로 볼 수 있다.

실시예 5: 미세유체 채널 내 복합적 표면밀도구배 패턴 형성

로그 미세유체 채널을 사용한 복합적 표면밀도 구배 패턴 형성 과정으로서, 상기 복합적 표면밀도 구배 패턴을 형성하게 위해, 도 6의 (가)의 디자인을 갖는 로그 미세유체 채널을 사용하였다. 본 실험을 위해서 두 개의 주입구 (inlet) 중 한쪽엔 streptavidin-Cy5 (5 μg/mL, PBS), 다른 한쪽엔 PBS 버퍼를 한 방울씩 떨어뜨린 뒤 유출구 (outlet)에 음압을 가해 주입구에 있는 용액들이 채널 속으로 흐를 수 있게 해주었다. 최종적으로 마이크로패터닝이 이루어질 reservoir 에서는 two-fold serial dilution으로 streptavidin-Cy5의 농도 구배가 생성되게 된다. 이렇게 생성된 유체 속 농도 구배를 바닥으로 옮겨와 패터닝 해보기 위해, 우선 reservoir 속 패터닝을 하고 싶은 위치에 PDMP를 원하는 패턴모양으로 녹여두고 위에서 설명한 대로 streptavidin-Cy5와 PBS를 각 주입구에 떨어뜨려 tow-fold serial dilution으로 농도 구배가 형성되도록 했다. 이 과정에서 미리 PDMP로 패턴을 만들어둔 곳에서 노출된 biotin 바닥과 농도 구배를 이룬 streptavidin-Cy5가 각 위치에서 결합하게 되고, 붙지 않은 streptavidin-Cy5를 제거하기 위해 두 주입구엔 PBS만 떨어뜨려 1 분 동안 충분히 헹궈주었다. 도 6의 (나)에서 보여주는 것과 같이 위 과정을 통해 two-fold로 농도 구배를 이룬 단백질 마이크로패터닝을 채널 내부에서 성공적으로 형성할 수 있었다.

복합적 표면밀도구배 패턴 (complex surface density gradient pattern)을 형성하기 위해, 미세유체 채널에서 생성된 농도구배를 그대로 표면으로 옮기는 패터닝방식을 적용해 보았다. 도 6의 (가)는 농도구배 형성을 위해 실험에 사용된 미세유체 채널인 로그 미세유체 채널 (logarithmic microchannel)의 디자인 그림이다. 상기 로그채널 내 단백질 패터닝 법을 사용하여 복합적 표면밀도 구배의 단백질 마이크로 패터닝을 성공적으로 수행하였고 결과를 도 6의 (나) 에 나타내었다. 도 6의 (나)는 로그 미세유체 채널을 사용해서 복합적 표면밀도 구배로 다중 패터닝 된 streptavidin-Cy5의 형광 이미지. 그래프는 형광이미지의 흰색 라인 구간의 형광 세기를 나타낸 것이다 (scale bar = 100 μm)

도 6의 (나)에 나타낸 바와 같이, 아래 그래프는 하나의 라인으로 전체 패터닝된 구역을 설정하여 형광 세기를 플랏한 그래프로이다. 농도가 가장 높게 패터닝된 마이크로 스팟의 형광세기에서 다음 마이크로 패턴으로 넘어갈수록 그 세기가 약 1/2로 줄어들고 있음을 확인할 수 있다.

Claims (12)

1. (a) 광민감성 고분자층이 형성된 기판에 도파(DOPA)-함유 접착제를 처리하고,
   (b) 실란 미세유체 채널의 표면을 활성화시키고,
   (c) 상기 도파(DOPA)-함유 접착제 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하는 단계를 포함하는, 미세유체 칩(microfluidic chip)을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a)단계의 도파-함유 접착제 처리는, 스프레이코팅, 스핀코팅, 딥코팅 또는 롤코팅으로 도파-함유 접착제 용액을 기판에 코팅하여 수행되는 것인 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 (a)단계의 도파-함유 접착제 처리는, 도파-함유 접착제 용액에 기판을 0.5 내지 8시간 동안 담지하여 수행되는 것인 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 도파-함유 접착제는 폴리도파민 또는 홍합 접착제인 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 광민감성 고분자는 poly(2,2-dimethoxy nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate(PDMP)인 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 (b)단계에서 실란 미세유체 채널 표면은 플라즈마 처리로 활성화시키는 것인 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계에서, 상기 도파(DOPA)-함유 접착제 처리된 기판과 표면이 활성화된 실란 미세유체 채널을 부착하고, 40 내지 90 ℃ 온도범위에서, 1 내지 4 시간동안 유지시키는 것인 방법.
8. 광민감성 고분자층이 형성된 기판과 실란 미세유체 채널 사이에 도파(DOPA)-함유 접착제층을 포함하는 미세유체 칩(microfluidic chip).
9. 제 8 항에 있어서, 상기 기판과 실란 미세유체 채널간 접착력은 50 내지 100 kPa 인 미세유체 칩.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 도파-함유 접착제는 폴리도파민 또는 홍합 접착제인 미세유체 칩.
11. 제 8 항에 있어서, 상기 광민감성 고분자는 poly(2,2-dimethoxy nirobenzyl methacrylate-r-methyl methacrylate-r-poly(ethylene glycol) methacrylate(PDMP) 인 미세유체 칩.
12. 제 8 항에 있어서, 상기 미세유체 칩은 진단, 세포 배양, 또는 단백질 패터닝에 사용되는 것인 미세유체 칩.
    

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