KR102007715B1 - 코드화된 고분자 미세입자 - Google Patents

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Abstract

코드화된 고분자 미세입자 코어; 및 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자 및 이를 이용한 다중 바이오 분석방법이 제공된다. 또한 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계; 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법이 제공된다.

Description

코드화된 고분자 미세입자{Encoded polymeric microparticles}
본 명세서에 개시된 기술은 코드화된 고분자 미세입자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화학적 및 물리적 안정성이 뛰어나고 양산이 가능한 코드화된 고분자 미세입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 다중 바이오 분석방법에 관한 것이다.
최근에 코드화된 고분자 미세입자는 제조가 간단하고 코드를 많이 넣기 쉬운 특성을 가지고 있어 바이오 분석물 (단백질, DNA 등) 탐지에 널리 이용되고 있다. 그러나 이 고분자 물질 자체는 물리적·화학적 내구성이 떨어져 쉽게 변형이 올 수도 있고 분석물들을 흡수해 분석 오류를 일으키는 단점이 있다. 또한, 이들과 바이오 물질과의 결합은 몇 가지 특수한 화학결합 방법으로 제한되기 때문에 다양한 화학적 결합 방법을 적용하는 데에 한계가 있다. 따라서, 코드화가 가능하며, 화학적 및 물리적 안정성이 뛰어나고 다양한 작용기의 도입과 양산이 가능한 미세입자의 개발이 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 코드화된 고분자 미세입자 코어; 및 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자가 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계; 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 코드화된 고분자 미세입자 코어, 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘, 및 상기 실리카 쉘에 결합된 바이오 물질을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자를 이용한 다중 바이오 분석방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 다른 코드화된 고분자 미세입자를 나타낸다.
도 2는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법을 나타낸 공정 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자를 만드는 과정을 나타낸다.
도 4는 실제 입자 표면에 실리카 쉘이 자라는 과정을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 5는 EPMA(electron probe micro-analyzer)로 실리카 코팅된 미세입자와 실리카 코팅되지 않은 미세입자의 스펙트럼을 비교 분석한 것이다.
도 6은 실리카 쉘을 구비하지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 쉘을 구비한 고분자 미세입자(원 모양)의 특성을 비교한 사진이다.
도 7은 실리카 코팅된 고분자 미세입자 표면 위에 올리고뉴클레오타이드를 고정하여 다중 DNA 혼성화 에세이를 행하는 과정을 나타낸다.
도 8은 실리카코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 사용한 다중 HPV 지노타이핑을 나타낸다.
도 9는 실리카 코팅된 코드화된 "자성" 미세입자의 제조 및 취급을 나타낸다.
이하 도면을 참조하여 본 발명의 다양한 구현예에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되어지는 것이다. 따라서 개시된 기술은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 일 구성요소가 다른 구성요소 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 "바로 위에"에 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 다른 코드화된 고분자 미세입자를 나타낸다. 도 1에 있어서, 도 1A, 도 1B 및 도 1C의 아래쪽 그림들은 각각 A-A', B-B', 및 C-C'선을 따라 절단한 단면도들이다. 도 1의 A를 참조하면, 코드화된 고분자 미세입자(100)는 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)과 이를 둘러싼 실리카 쉘(120)을 포함한다. 코어(110)은 공지된 다양한 방식으로 코드화될 수 있다. 예를 들어 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)는 그래피컬 코드, 형광 코드, 또는 컬러 코드를 구비할 수 있다.
한편, 고분자 미세입자 코어(110)를 이루는 상기 고분자는 광학적 리소그래피에 의해 다양하게 패터닝될 수 있다는 면에서 광경화성 고분자인 것이 바람직하다. 상기 광경화성 고분자는 아크릴계 경화성 물질을 주로 함유할 수 있다. 바람직하게는 상기 광경화성 고분자는 아크릴계 광경화성 물질 외에도 상기 광경화성 물질과 반응 및 광경화가능한 작용기와 실리카 형성이 가능한 작용기를 동시에 구비한 링커 물질이 혼합될 수 있다.
광경화에 의해 만들어진 고분자 미세입자 코어(110)의 형태는 디스크형, 구형을 포함한 다양한 형상을 가질 수 있다. 코어(110)의 크기는 수 ㎛ 내지 수 mm의 범위를 가질 수 있다.
코드화된 고분자 미세입자(100)는 자성 물질을 더 구비할 수 있다. 구체적으로 미세입자 코어(110)는 내부에 자성 나노입자들(130)을 더 함유할 수 있다(도 1의 B). 다르게는 미세입자 코어(110)와 실리카 쉘(120) 사이에 자성 나노입자들(130)의 층이 개재될 수 있다(도 1의 C). 코어(110)와 쉘(120) 사이에 자성 나노입자들(130)의 층이 개재되는 경우, 상대적으로 자성 나노입자(130)의 양이 적어 추후 미세입자(100) 제어시 더 강한 자장을 필요로 하지만 코어(110) 내부에 자성 나노입자들(130)이 함유되는 경우에 비해 광경화를 통한 패터닝 과정에서 자성나노입자들(130)에 의한 광산란 영향이 없기 때문에 미세구조 패터닝에 유리한 장점이 있다. 코드화된 고분자 미세입자(100)가 자성 나노입자들을 구비함으로써 외부 자기장으로 미세입자(100)를 제어할 수 있다. 그 결과 추후 바이오 에세이의 용액 교환 과정에 효율적으로 이용될 수 있으며, 미세입자(100)의 분리가 가능하여 바이오 어세이의 정확도 및 편리성이 증가할 수 있다.
실리카 쉘(120)은 미세입자 코어(110)를 둘러싸며 보호하고, 탐지를 원하는 외부 물질이 미세입자 코어(110)의 고분자 내로 흡수되어 분석 오류가 발생하는 것을 방지한다. 실리카 쉘(120)은 코드화된 고분자 미세입자(130)의 화학적, 기계적 안정성을 부여하여 미세입자(130)가 다양한 환경 및 용액에서 사용될 수 있도록 도와준다. 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)와 실리카 쉘(120)은 -Si-O-Si- 결합으로 연결될 수 있다. 그리하여 코어(110)와 쉘(120) 사이의 견고한 화학결합에 의해 안정한 구조가 형성될 수 있다. 실리카 쉘(120)의 존재에 의하여 고분자 미세입자(100)의 표면은 불특정 물질의 결합성이 낮으며 바이오 물질과의 결합특성이 향상된다. 또한 실리카 쉘(120) 표면에 카르복실기(carboxyl group) 또는 아민기(amine group)와 같은 작용기가 도입될 수 있다. 상기 작용기의 도입에 의해 생물의학분야나 임상진단 분야에서 광범위하게 사용되는 다양한 생체분자들과 공유결합할 수 있다. 예를 들어 실리카 쉘(120) 표면에 항원, 항체, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 바이오 물질이 도입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자는 하기의 방법으로 제조될 수 있다. 도 2는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법을 나타낸 공정 흐름도이다. 도 2를 참조하면, 단계 S1에서 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공한다.
상기 광경화성 물질은 에너지의 인가에 따른 경화에 의해 미세입자의 기본 골격 구조를 만드는 물질이다. 상기 광경화성 물질은 에톡시화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 알릴아민, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 광경화성 물질인 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트는 폴리에틸렌글리콜 양 말단에 아크릴레이트 작용기가 있어서 자유라디칼 중합이 일어날 경우 3차원 구조의 하이드로젤로 가교될 수 있다. 기타, 광경화성 물질은 외부 광에 의해 액체에서 고체로 변할 수 있는 어떠한 형태의 물질도 가능하다.
상기 링커는 광경화성 물질과 반응하여 공중합체를 형성하면서 미세입자의 골격을 이루는 동시에 상기 코드화된 미세입자 코어의 표면에 알콕시실릴기가 그라프트되도록 한다. 광경화성 물질로만 미세입자를 제조할 경우 이후 실리카 코팅을 통한 실리카 쉘의 형성이 용이하지 않다. 반면, 본 발명의 일 구현예에 따른 제조방법과 같이 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 동시에 구비한 링커를 상기 광경화성 물질과 섞어 혼합물을 만들어 이를 경화시키면 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 알콕시실릴기를 통해 실리카 쉘을 코팅하는 것이 가능해진다.
상기 링커는 예를 들어, 하기 화학식 1로 표현되는 화합물일 수 있다.
(화학식 1)
Figure 112015114553379-pat00001
상기 화학식 1에서 R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고, R2는 C1 내지 C8의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬일 수 있다. 또한 L은 C1 내지 C12를 갖는 알킬렌 또는 아릴렌이거나 상기 알킬렌과 상기 아릴렌이 임의로 연결된 구조일 수 있다. 구체적으로 상기 화학식 1은 3-(트리메톡시실릴)프로필아크릴레이트(TMSPA)일 수 있다.
상기 혼합물은 개시제를 더 포함할 수 있으며 외부의 에너지원에 의해 자유라디칼 중합을 유발할 수 있다. 개시제는 아조계 화합물 또는 과산화물이 될 수 있다. 상기 혼합물은 적당한 가교제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드, 메틸렌비스메타크릴아마이드 및 에틸렌글리콜디메타크릴레이트 등을 들 수 있다.
코드화된 고분자 미세입자를 제어하기 위해 필요에 따라 상기 혼합물에 자성 나노입자를 추가하는 단계가 더 포함될 수 있다. 그 결과 상기 고분자 미세입자 코어 내부에 자성 나노입자가 도입될 수 있다.
단계 S2에서 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는다. 상기 패턴화된 에너지로서 자외선, 가시광선, 적외선 및 전자빔 등이 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 패턴화된 에너지의 조사는 자외선을 이용하여 물리적 마스크 또는 디지털 마이크로미러 장치(DMD)에 의해 수행될 수 있다.
상기 코드화는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일 구현예에 의하며면, 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 일 예로서, 광학적 리소그래피 방법을 적용하여 그래피컬 코드를 패터닝하는 방법을 적용할 수 있다. 그래피컬 코드의 형태는 미세입자 자체의 형상(예를 들어, 별 모양, 원 모양 등)일 수도 있고, 미세입자에 새겨진 바이너리 코드 형태일 수도 있다. 그래피컬 코드의 코드화는 상술한 바와 같이 상기 입자의 제조에 광경화성 고분자를 적용하고, 이를 광학적 리소그래피 방법으로 패터닝하는 방식으로 수행될 수 있다.
일 예로서, 한국등록특허 제1004769호의 광유체적 리소그래피 방법, 미국등록특허 제7709544호의 유체 리소그래피 법 및 중합법을 적용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 공지의 다양한 리소그래피법이 적용될 수 있다. 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 일 예로서, 상기 광경화성 고분자 상에, 광경화의 정도에 따라 서로 구분되도록 '1' 및 '0'을 의미하는 표지를 각각 패터닝함으로써 상기 입자 상에 코드를 형성할 수 있다. 상술한 광학적 리소그래피 방법은 일 예로서, 마스크를 사용하지 않는 디지털 마이크로미러 장치 등을 이용하는 경우, 상기 타겟물질을 포함하는 입자에 대하는 많게는 백만 개 이상의 다양한 종류의 코드를 형성할 수 있는 장점을 가질 수 있다.
다른 구현예에 의하면, 상기 미세입자 코어의 코드화는 서로 구분되는 다양한 색상의 형광물질을 상기 미세입자 코어 내에 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 다양한 형광물질을 상기 미세입자 코어 내에 포함시키기 위해 공지된 다양한 기술이 적용될 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면, 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 자성 잉크를 이용하여 컬러 코드를 형성하는 방법을 적용할 수 있다. 상기 자성 잉크를 이용하는 방법은 일 예로서, 한국특허출원 제10-2010-0029613호에 개시된 바는 이하와 같다. 먼저 자성 나노 입자를 포함하는 광경화성 물질을 제공하고 외부 자기장을 인가하여 상기 광경화성 물질 내의 상기 자성 나노 입자를 정렬시킨다. 그리고, 외부로부터 광을 인가하여 상기 광경화성 물질을 경화시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 외부 자기장의 세기에 의하여 자성 나노 입자들 간의 배열이 변화하여 서로 다른 색상을 발현할 수 있다. 이러한 기술을 적용하여 광경화성 고분자로 이루어진 미세입자 코어 내에 자성 나노 입자들을 서로 차별되도록 배열시킴으로써 상기 미세입자 코어를 컬러 코드화할 수 있다. 상기 특허의 내용은 본 명세서에 인용됨으로써 병합될 수 있다.
일 구현예에서, 코드화된 고분자 미세입자를 제어하기 위해 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 친수성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 부착시키는 단계가 더 포함될 수 있다.
다음 단계 S3에서 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성함으로써 코드화된 고분자 미세입자가 제조된다. 상기 실리카 쉘의 형성은 다양한 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 수정된 Stober 방법이 사용될 수 있다.
먼저 알콕시실릴기가 그라프트된 상기 미세입자를 증류수, 에탄올 및 NH4OH의 용액에 투입한다. 다음 실리카 전구체로서 테트라에틸오르토실리케이트(TEOS)를 상기 용액에 주입하고 반응시켜 실리카 쉘을 형성한다. 그 결과 상기 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 상기 알콕시실릴기와 상기 실리카 전구체의 반응에 의해 코어-쉘 계면에 -Si-O-Si- 결합이 형성될 수 있다.
고분자 미세입자는 유연하고(flexible), 연질이며(soft) 다양한 구조 및 형태로 제작하기 쉽다. 그러나 동시에 기계적, 화학적으로 쉽게 손상이 된다. 또한 바이오 에세이에서 작은 분자들이 고분자 매트릭스로 흡수될 경우 검출 에러로 이어질 수 있다. 이와는 대조적으로 티타니아나 실리카 같은 무기물질은 일반적으로 고분자 유기물에 비해 훨씬 더 단단하고 내화학성이 뛰어나다. 하지만 이 또한 깨지기 쉬우며 다양한 형태로 성형하는 것이 어려운 문제를 가지고 있다. 따라서 고분자 미세입자 위에 실리카 쉘을 코팅함으로써 두 물질의 장점이 합쳐져, 강하고, 단단하며 화학적으로 안정하고 내구성이 좋은 동시에 다양한 형태로 성형하기 쉬운 특징을 한꺼번에 가질 수 있다.
상술한 실리카 코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 다중(multiplexed) 바이오분석에 이용할 수 있다. 최근의 다중 생체분석(바이오분석) 분야에서, 코드화된 고분자 미세입자가 DNA나 단백질 같은 생체분자(biomolecules)분석에 사용되고 있다. 이 방법은 거의 무한정의 코드를 사용할 수 있고 높은 분석처리량을 제공하기 때문에 강력하고 적용성이 높은 방법이다. 따라서 본 발명의 일 구현예에 따르면, 이러한 다중 바이오분석의 응용을 위해 상기 실리카 쉘 표면을 개질하여 카르복실기 또는 아민기를 도입할 수 있다. 이러한 작용기들의 존재로 다양한 바이오 물질과 공유결합할 수 있다. 또한 상술한 제조방법에는 바이오 물질을 상기 실리카 쉘 표면에 결합시키는 단계가 더 포함될 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자를 만드는 과정을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 그래피컬 코드(graphical code)를 가진 고분자 미세입자를 제작하기 위해, 먼저 광경화성 물질인 ETPTA(ethoxylated trimethylopropane triacrylate)와 링커인 TMSPA(3-(trimethoxysilyl)propylacrylate), 및 광개시제로서(2-hydroxy-2-methylpropiophenone)를 적정 비율(ex. 10:1:1)로 섞어 광경화성 혼합물을 만든다. TMSPA의 아크릴레이트 그룹은 고분자 매트릭스를 형성하는 광경화 반응에 참여한다. TMSPA는 이 뿐만 아니라 실리카를 형성할 수 있는 실리콘을 구비한 실란(silane) 그룹을 가지고 있어 차후 실리카를 코팅하기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 이 화합물에 도 3의 광유체적 무마스크 리소그래피를 포함한 공지된 다양한 리소그래피 방법을 사용하여 패턴화된 UV광을 조사함으로써 그래피컬 코드를 가진 알콕시실란 함유 공중합체(copolymer) 미세입자를 만든다. 광유체적 무마스크 리소그래피(OFML)를 이용하면 미세유체 채널을 통해 원료 물질을 도입하고 패턴화된 에너지를 인가함으로써 인-시튜 광중합에 의해 연속적으로 자유부유 입자들이 제조될 수 있으며, 디지털 마이크로 미러 디바이스(DMD)를 이용한 무마스크 방식에 의해 마스크를 쓰는 다른 리소그래피 방법에 비해 간편하게 다양한 형상의 코드화된 입자들을 얻을 수 있다.
형성된 공중합체 미세입자에 수정된 스토버 방법(Stober method)을 적용해 실리카 코팅을 하여 실리카 쉘을 형성한다. 이 간단한 코팅 과정은 매우 빠르며, 실란기 함유의 미세입자에 실리카를 직접적이고 효율적으로 코팅하는 방법이다. 또한 이 방법은 수백만의 실리카 코팅 미세입자를 한번에 처리할 수 있는 방법이다. 상기 실리카 쉘의 두께는 반응속도 혹은 실리카 전구체의 농도를 조절함으로써 수백 나노미터부터 수 마이크로미터까지 조절이 가능하다. 이렇게 생성된 실리카 쉘을 구비한 미세입자에 기존의 다양한 실리카 표면처리 방법을 그대로 사용하여 여러 가지 작용기의 도입이 가능하다.
도 4는 실제 입자 표면에 실리카 쉘이 자라는 과정을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다. 도 4를 참조하면, 코팅이 진행되는 정도에 따라 실리카가 표면을 덮고 있는 정도가 다르다. 처음에는 시드가 되는 실리카 나노입자들이 표면에 생성된다. 이후 실리카 나노입자들이 표면에 연속적인 실리카 껍질을 형성할 때까지 합쳐진다. 도 4의 D가 완전히 실리카 껍질을 형성한 이미지이다. 여기서 실리카층의 두께는 약 150nm이다.
도 5는 EPMA(electron probe micro-analyzer)로 실리카 코팅된 미세입자와 실리카 코팅되지 않은 미세입자의 스펙트럼을 비교 분석한 것이다. 도 5를 참조하면, 실리카 코팅이 되지 않는 고분자 미세입자는 TMSPA(시드물질) 없이 ETPTA와 광개시제만으로 제작되었다. 코팅 않된 미세입자의 EPMA 스펙트럼 결과 강한 C와 약한 O만 검출되어 순수 유기 고분자임이 확인된다. Pt 신호도 약간 검출되었으나 이것은 스퍼터로 Pt 코팅을 해주었기 때문이다. 도 5의 아래쪽 그림을 보면 순수한 실리카 껍질이 고분자 미세입자 위에 잘 생성되었음을 확인할 수 있다. 여기서는 Si, O, C의 세가지 신호가 잡히며, 실리카(SiO2) 때문에 O신호가 C보다 훨씬 크게 잡힌다. C 신호가 잡힌 이유는 EPMA의 빔 투과 깊이는 1㎛이고 실리카 껍질의 두께는 그 미만이기 때문이다.
도 6은 실리카 쉘을 구비하지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 쉘을 구비한 고분자 미세입자(원 모양)의 특성을 비교한 사진이다.
실리카 코팅된 미세입자의 내화학성을 테스트하기위해 0.1M의 로다민(Rhodamine) B 수용액(적색 형광)을 사용했다. 도 6의 A는 로다민 수용액이 코팅되지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 코팅된 고분자 미세입자(원 모양)에 각각 어떻게 흡수되는지를 보여준다. 도 6의 A를 참조하면, 별 모양의 고분자 미세입자의 경우 형광이미지에서 명확히 보이듯이 로다민 수용액이 미세입자를 이루는 고분자 하이드로젤 물질에 잘 흡수되었다. 고분자 하이드로젤 물질은 어떠한 화학적 물리적 처리 없이도 액체를 잘 흡수한다는 것은 익히 알려져 있다. 그러나, 실리카 쉘(shell)을 구비한 원 모양의 미세입자의 경우, 로다민 수용액이 고분자 하이드로젤 내부로 흡수되는 것을 실리카 쉘이 막았음을 확인할 수 있다. 이는 실리카 코팅된 미세입자가 바이오 분석에 응용될 때 더 안정적이고 정확한 결과를 제공할 수 있다는 증거이다. 왜냐하면 항원이나 올리고뉴클레오티드 같은 물질들이 고분자 매트릭스 안으로 흡수되어 버린다면 이것이 분석 결과의 오류 원인이 될 수 있기 때문이다. 또한 코팅된 입자의 이미지에서 형광이 전혀 나오지 않는 이러한 결과에서, 실리카 표면의 낮은 비특이적 결합성(non-specific binding) 때문에 약간의 염료(dye)의 흡수도 실리카 표면에서 일어나지 않았음을 확인할 수 있다.
한편 두 종류(코팅된, 코팅되지 않은)의 미세입자의 팽창과 수축 특성을 물과 공기에 대한 접촉 실험을 통해 확인해보았다. 일반적으로 고분자 하이드로젤 물질은 많은 양의 물을 흡수하기 때문에 물속에서 팽창하게 된다. 도 6의 B에서 볼 수 있듯이 코팅되지 않은 미세입자는 물속에서 공기로 나왔을 때 많이 수축하지만, 실리카가 코팅된 미세입자는 물속에서 공기로 나와도 그 구조와 부피를 유지함을 확인할 수 있다.
두 종류(코팅된, 코팅되지 않은)의 미세입자의 화학적 안정성을 확인하기위해, 미세입자들을 1M의 아세트산 수용액에 넣고 교반하였다. 24시간이 지난 후 실리카 코팅된 미세입자의 표면은 안정된 상태를 유지하였으나, 코팅되지 않은 미세입자의 표면은 산성용액에 의해 심하게 손상을 입었다(도 6의 C). 일반적으로 고분자 하이드로젤은 pH, 온도 등의 외부 환경에 매우 민감하다. 이와는 반대로 실리카는 일반적으로 유기 고분자보다 훨씬 견고하고 좋은 화학적 안정성을 가지고 있다. 그렇기 때문에 이 실리카 코팅된 미세입자는 유기 용제나 건조 환경을 포함한 다양한 화학 반응에서 고분자 미세입자보다 잘 견딜 수 있다. 따라서 입자에 다양한 작용기를 적용하는 데에 제한요소가 적다.
실리카 코팅된 고분자 미세입자의 표면을 적절히 개질함으로써 특이적 작용기를 도입하여 바이오 물질과 공유결합시킬 수 있다. 그 결과 미세입자가 높은 안정성을 가지면서도 낮은 비특이적 결합성을 갖도록 할 수 있다.
도 7은 실리카 코팅된 고분자 미세입자 표면 위에 올리고뉴클레오타이드를 고정하여 다중 DNA 혼성화 에세이를 행하는 과정을 나타낸다. 도 7을 참조하면, 실리카 코팅된 미세입자가 말단의 하이드록실 그룹의 축합을 통해 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)와 일차 아민과 용이하게 반응한다. 이러한 아민을 곧이어 숙신산과 반응시켜 카르복실화된 표면으로 만들면 DNA의 아미노 그룹과 반응이 가능해진다. 5' 아미노 말단의 DNA들은 카르복실화된 실리카 표면 위에 DNA들을 고정시키는 데 사용된다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 N-하이드록시설포숙시닉이미드(sulfo-NHS)를 사용한 가교 결합에 의해 실리카 표면의 카르복실 그룹과 아미노-말단의 DNA의 아미노 그룹 사이에 아마이드 결합이 형성된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자는 다중 바이오 에세이(multiplexed bioassay)에 유용한 이점을 제공한다. 이를 확인하기 위해 실리카 코팅된 미세입자를 사용하여 10개의 구성 단위를 갖는(10-plex) in vitro 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 지노타이핑(genotyping)을 실증하였다. 타겟 HPV 유전자를 2단계 PCR 프로세스로 준비하였다. 도 8은 실리카코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 사용한 다중 HPV 지노타이핑을 나타낸다. 도 8의 A는 증폭 및 라벨링 PCR의 개략도이다. 증폭 PCR 이후, 바이오틴(biotin) 부착된 dCTP를 사용하여 라벨 탐침-상보적 HPV 유전자 시퀀스를 라벨링하기 위한 라벨링 PCR을 수행한다. 도 8의 B는 탐침 부착된 미세입자를 사용한 10-plexed HPV 지노타이핑의 개략도이다. 10가지 유형의 HPV 타입 특이적 올리고뉴클레오타이드 타침들을 미세입자들의 실리카 표면에 커플링시킨다. 각각의 타겟 HPV 유전자는 서로 다른 탐침들 중 하나에 상보적이다. 미세입자 구조물 내의 중합되지 않은 구멍들로 이루어진 그래피컬 코드(shape code)는 미세입자의 실리카 표면 위의 탐침을 식별하기 위한 것이다. 다중 분석 용량(multiplexing capacity)은 그래피컬 코드를 변경함으로써 용이하게 증가될 수 있다. 타겟 HPV 시퀀스로 혼성화 에세이 후, 형광 염료 라벨링된 스트렙타비딘(streptavidin)들을 도입하여 형광 시그널을 얻는다.
자성 물질을 상기 미세입자에 도입하면 캐리어 용액으로부터 원하는 입자를 자기장을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다. 도 9는 실리카 코팅된 코드화된 "자성" 미세입자의 제조 및 취급을 나타낸다. 도 9의 A는 실리카 코팅된 자성 미세입자의 제조 단계를 나타낸다. 도 9의 B는 실리카 코팅 공정 전(B1) 및 후(B2)의 자성 미세입자의 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 이미지이다. 도 9의 A 및 B를 참조하면, 상기 자성 미세입자는 실란 그라프트된 미세입자의 표면 위에 폴리아크릴산(PAA) 코팅된 Fe3O4 나노입자를 부착하여 얻어진다. PAA 코팅된 Fe3O4 나노입자는 예를 들어 80±10nm의 크기를 가질 수 있다.
도 9의 C는 캐리어의 자성 분리를 통한 용액 교환 공정을 나타낸다. 외부 자기장을 용액에 인가함으로써 실리카 코팅된 자성입자 및 이러한 실리카 코팅된 자성입자에 결합된 생체분자를 함유한 혼합물을 용액 혼합물로부터 선택적으로 분리할 수 있다.
도 9의 D는 자성 입자의 자기적 취급을 나타내는 광학 현미경 이미지들이다. 자유 부유하는 자성 미세입자들이 인가된 외부 자기장의 방향에 따라 용이하게 움직이는 것을 알 수 있다. 따라서 자유 부유(free-floating)하는 자성 미세입자의 자기적 취급은 용액 교환을 포함하는 바이오에세이에 유용하다. 더욱이 자기적 분리는 입자들에 결합되었던 분리된 타겟의 세척 및 농축이 가능하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상술한 제조방법에 따르면, 광경화성 물질과 이와 중합가능하며 알콕시실릴기를 갖는 링커의 혼합물을 사용하여 코드화된 고분자 미세입자를 제조한다. 이렇게 제조된 코드화된 고분자 미세입자를 실리카 전구체 용액에 넣는 방식으로 수 백만개의 코드화된 고분자 미세입자를 간단한 공정으로 한꺼번에 실리카 코팅할 수 있다. 또한 상술한 자성 나노입자를 고분자 미세입자에 도입함으로써 바이오에세이 시에 입자의 취급이 용이해진다. 본 발명의 일 구현에에 따른 코드화된 미세입자는 실리카 쉘을 구비함으로써 화학적 및 물리적 안정성을 가지며 외부 생체분자를 흡수하지 않기 때문에 정확한 분석을 가능하게 한다. 따라서 상술한 코드화된 고분자 미세입자는 DNA나 단백질에 기반한 진단 등을 포함한 다양한 적용분야에 유용하게 이용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 다양한 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. 코드화된 고분자 미세입자 코어; 및
    상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하며,
    상기 고분자 미세입자 코어와 상기 실리카 쉘이 -Si-O-Si- 결합으로 연결된 구조를 가지며, 상기 실리카 쉘은 상기 고분자 미세입자 코어를 연속적으로 둘러싼 형태를 갖는 코드화된 고분자 미세입자.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 고분자는 광경화성 고분자인 코드화된 고분자 미세입자.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 미세입자 코어에 자성 나노입자들을 더 함유하는 코드화된 고분자 미세입자.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 미세입자 코어와 상기 실리카 쉘 사이에 자성 나노입자들의 층이 개재된 코드화된 고분자 미세입자.
  5. 삭제
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면에 카르복실기 또는 아민기가 도입된 코드화된 고분자 미세입자.
  7. 제1 항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면에 항원, 항체, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 바이오 물질이 도입된 코드화된 고분자 미세입자.
  8. 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계;
    패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및
    상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하되,
    상기 고분자 미세입자 코어와 상기 실리카 쉘이 -Si-O-Si- 결합으로 연결된 구조를 가지며, 상기 실리카 쉘은 상기 미세입자 코어를 연속적으로 둘러싼 형태를 갖는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계는 광유체적 무마스크 리소그라피에 의해 수행되는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 코드화된 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 상기 알콕시실릴기와 상기 실리카 전구체의 반응에 의해 상기 코어와 상기 실리카 쉘 계면에 -Si-O-Si- 결합이 형성된 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 혼합물에 자성 나노입자를 추가하는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  12. 제8 항에 있어서,
    상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 친수성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 부착시키는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  13. 제8 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면을 개질하여 카르복실기 또는 아민기를 도입하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  14. 제8 항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이오 물질을 상기 실리카 쉘 표면에 결합시키는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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